CN111044494B - 一种猪瘟的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪瘟的快速检测方法，涉及家禽危害检测技术领域，解决了因检测过程中样品内存在少量的脂肪和蛋白质杂质，而导致检测容易产生较多误差的问题。一种猪瘟的快速检测方法，其包括以下步骤：步骤一，破碎研磨；步骤二，离心过滤；步骤三，沉淀除杂；步骤四，接种培养；步骤五，荧光抗体染色；步骤六，观察对比。本发明中猪瘟的快速检测方法在实际应用过程中，其能够有效排除检测过程中脂肪和蛋白质杂质的干扰，具有检测速度快、准确度高、误差小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及家禽危害检测技术领域，更具体地说，它涉及一种猪瘟的快速检测方法。
背景技术
介绍猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性，且本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。
在公开号为CN108441581A的中国发明专利申请文件中公开了一种检测猪瘟病毒的方法，可有效的检测猪群中猪瘟病毒病原体的分布情况，而其中使用的检测猪瘟病毒的引物组，所述的引物组包含有用于第一次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1、下游引物序列为SEQ ID NO:2；第二次扩增的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3、下游引物序列为SEQ ID NO:4；并通过筛选了用于检测CSFV的引物组，建立CSFV的检测方法。特异性试验结果表明本发明筛选的引物组对PRV、PRRSV、PEDV、CSFV、TGEV、PCV2 6种病原不敏感，具有良好的特异性。敏感性实验结果表明能检出CSFV的cDNA的最低浓度为1.35×10-6ng/mL，比普通RT-PCR的灵敏度高出1000倍，敏感性较高，能满足临床上CSFV感染检测的要求，可以用于临床检测。
上述申请文件中，可以有效检测猪群中猪瘟病毒病原体的分布情况，从而为猪瘟早期预防诊断上起到重要作用。但在实际检测过程中，样品中容易存在少量的脂肪和蛋白质杂质，而脂肪和蛋白质可干扰机体对猪瘟病毒病原体的免疫应答，导致检测过程中容易产生较多误差，因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术中因检测过程中样品内存在少量的脂肪和蛋白质杂质，而导致检测容易产生较多误差的问题，本发明的目的一在于提供一种猪瘟的快速检测方法，以解决上述技术问题，其能够有效排除检测过程中脂肪和蛋白质杂质的干扰，具有检测速度快、准确度高、误差小的优点。
为实现上述目的一，本发明提供了如下技术方案：
一种猪瘟的快速检测方法，包括以下步骤：
步骤一，破碎研磨：取待测猪组织样品，充分剪碎后置于乳锅中研磨，随后加入5-8倍体积的PBS溶液，搅拌混合后，得到乳液；
步骤二，离心过滤：将乳液移入离心管中进行离心，然后取离心管中上层清液，过滤膜除菌后得到无菌滤液；
步骤三，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，除去脂肪层，得到浸出液；
步骤四，接种培养：将浸出液接种于长成单层的PK15细胞，35-40℃下吸附1.5-2h后，加入含有2-3％胎牛血清的DMEM维持液，培养24-72h，得到检样；
步骤五，荧光抗体染色：在检样中加FITC标记的抗CSFV多抗，在35-40℃下温育1-1.5h，用PBS溶液冲洗后，取洁净玻片用封片液封片，得到标样；
步骤六，观察对比：设正常PK-15细胞为阴性对照，设接种CSFV石门株病毒的PK-15细胞为阳性对照，然后将标样在荧光倒置显微镜下观察，对照后得到检测结果。
通过采用上述技术方案，将待测猪组织样品破碎研磨后，加入PBS溶液配制成乳液，能够保证病毒的活性，且进行除菌得到无菌滤液，有利于排出杂质菌的干扰。用三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，能够将无菌滤液中少量的脂肪和蛋白质杂质沉淀析出，其中三氯乙酸能使蛋白质带正电荷，并与三氯乙酸的负离子结合成不溶性盐类，并伴随发生蛋白质分子变性，能够发挥出良好的脱蛋白效果,而醋酸锌和亚铁氰化钾能够使蛋白质进一步沉淀，再用无菌离心管中进行离心脱脂处理，能够大大减少无菌滤液中的脂肪含量，从而得到低蛋白和低脂肪的浸出液。然后在接种培养和荧光抗体染色后，仅在荧光倒置显微镜下观察，并与阳性对照和阴性对照进行对比即可得到测试结果。上述测试过程中，能够有效排除检测过程中脂肪和蛋白质杂质的干扰，具有检测速度快、准确度高、误差小的优点。
进一步优选为，所述步骤二中，离心速度为12000-14000rpm，离心时间为8-10min，且离心温度设置为3-4℃。
通过采用上述技术方案，控制离心速度为12000-14000rpm，离心时间为8-10min，不仅能够起到良好的离心效果，且能够节省操作时间，提高检测效率，并有利于后续起到良好的沉淀除杂效果。而离心温度设置为3-4℃，能够使保留猪瘟病毒的活性，且不易在检测过程中滋生较多的细菌，有利于保证检测结果的准确性。
进一步优选为，所述步骤二中，过滤膜的孔径大小为0.2-0.24μm。
通过采用上述技术方案，选用孔径大小为0.2-0.24μm的过滤膜，能够对上层清液中的杂菌和悬浮杂质起到良好的滤除效果。
进一步优选为，所述步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为(2-6):1:(3-5)。
通过采用上述技术方案，选用上述比例混合的三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾，能够形成品质良好稳定的沉淀助剂，对无菌滤液中的蛋白质起到良好的沉淀效果，有利于降低检测结果的误差，并在处理过程中保证猪瘟病毒的生理活性，提高检测结果的准确性。
进一步优选为，所述步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为6:1:4。
通过采用上述技术方案，上述比例的三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾为沉淀助剂的最优配比，使检测过程更加稳定、蛋白质的沉淀效果最优、检测结果更加准确。
进一步优选为，所述步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为(3-5):1。
通过采用上述技术方案，选用上述和无菌滤液体积比的沉淀助剂，便能够将蛋白质完全析出，且不会对猪瘟病毒的活性产生不利影响，能够保证检测过程的稳定，并得到准确的检测结果。
进一步优选为，所述步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
通过采用上述技术方案，体积比为4:1的沉淀助剂和无菌滤液为最优的配合比，且检测效果最好。
进一步优选为，所述步骤三中，离心脱脂过程中，依次控制离心转速为3000-5000rpm、6000-9000rpm、12000-15000rpm，分别控制时间为5-10min、12-16min、18-20min。
通过采用上述技术方案，上述离心脱脂操作，采用多级离心，能够对无菌滤液中的脂肪起到良好的脱离效果，得到品质良好的浸出液，有利于保证检测结果的稳定性和准确性。
进一步优选为，所述步骤一和步骤五中，PBS溶液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH值为7-7.5。
通过采用上述技术方案，选用浓度为0.01-0.02mol/L的PBS溶液，且pH值为7-7.5，有利于维持生物蛋白的结构及生物特性，对完整的、具有活性的物质能保证其在最适条件下参与生物反应，进而有利于保证检测结果的准确和稳定性。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)利用三氯乙酸、醋酸锌和亚铁氰化钾组成的沉淀助剂，能够使蛋白质沉淀，并发挥出良好的脱蛋白效果，而再用无菌离心管中进行离心脱脂处理，能够大大减少无菌滤液中的脂肪含量，从而得到低蛋白和低脂肪的浸出液。进而在测试过程中，能够有效排除检测过程中脂肪和蛋白质杂质的干扰，具有检测速度快、准确度高、误差小的优点；
(2)选用沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为(2-6):1:(3-5)，能够形成品质良好稳定的沉淀助剂，对无菌滤液中的蛋白质起到良好的沉淀效果，有利于降低检测结果的误差，并在处理过程中保证猪瘟病毒的生理活性，提高检测结果的准确性，且最优混合比为6:1:4；
(3)选用沉淀助剂和无菌滤液的体积比为(3-5):1，便能够将蛋白质完全析出，且不会对猪瘟病毒的活性产生不利影响，能够保证检测过程的稳定，并得到准确的检测结果，且最优体积比为4:1。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：一种猪瘟的快速检测方法，通过如下步骤制备获得：
步骤一，破碎研磨：取待测猪组织样品，充分剪碎后置于乳锅中研磨，随后加入6.5倍体积的PBS溶液，搅拌混合后，得到乳液；
步骤二，离心过滤：将乳液移入离心管中进行离心，离心速度为13000rpm，离心时间为9min，且离心温度设置为3.5℃，然后取离心管中上层清液，用孔径大小为0.22μm的过滤膜除菌后得到无菌滤液；
步骤三，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，离心脱脂过程中，依次控制离心转速为4000rpm、7500rpm、13500rpm，分别控制时间为7.5min、14min、19min，除去脂肪层，得到浸出液；
步骤四，接种培养：将浸出液接种于长成单层的PK15细胞，37.5℃下吸附1.75h后，加入含有2.5％胎牛血清的DMEM维持液，培养48h，得到检样；
步骤五，荧光抗体染色：在检样中加FITC标记的抗CSFV多抗，在37.5℃下温育1.25h，用PBS溶液冲洗后，取洁净玻片用封片液封片，得到标样；
步骤六，观察对比：设正常PK-15细胞为阴性对照，设接种CSFV石门株病毒的PK-15细胞为阳性对照，然后将标样在荧光倒置显微镜下观察，对照后得到检测结果(细胞内有亮绿色荧光斑，判为阳性，细胞内无亮绿色荧光斑，判为阴性)。
注：上述步骤中PBS溶液的浓度为0.015mol/L，pH值为7；沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为6:1:4；沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
实施例2：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，具体包括如下步骤：
步骤一，破碎研磨：取待测猪组织样品，充分剪碎后置于乳锅中研磨，随后加入5倍体积的PBS溶液，搅拌混合后，得到乳液；
步骤二，离心过滤：将乳液移入离心管中进行离心，离心速度为12000rpm，离心时间为10min，且离心温度设置为4℃，然后取离心管中上层清液，用孔径大小为0.2μm的过滤膜除菌后得到无菌滤液；
步骤三，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，离心脱脂过程中，依次控制离心转速为3000rpm、6000rpm、12000rpm，分别控制时间为10min、16min、20min，除去脂肪层，得到浸出液；
步骤四，接种培养：将浸出液接种于长成单层的PK15细胞，35℃下吸附2h后，加入含有2％胎牛血清的DMEM维持液，培养72h，得到检样；
步骤五，荧光抗体染色：在检样中加FITC标记的抗CSFV多抗，在35℃下温育1.5h，用PBS溶液冲洗后，取洁净玻片用封片液封片，得到标样；
步骤六，观察对比：设正常PK-15细胞为阴性对照，设接种CSFV石门株病毒的PK-15细胞为阳性对照，然后将标样在荧光倒置显微镜下观察，对照后得到检测结果(细胞内有亮绿色荧光斑，判为阳性，细胞内无亮绿色荧光斑，判为阴性)。
实施例3：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，具体包括如下步骤：
步骤一，破碎研磨：取待测猪组织样品，充分剪碎后置于乳锅中研磨，随后加入8倍体积的PBS溶液，搅拌混合后，得到乳液；
步骤二，离心过滤：将乳液移入离心管中进行离心，离心速度为14000rpm，离心时间为8min，且离心温度设置为3℃，然后取离心管中上层清液，用孔径大小为0.24μm的过滤膜除菌后得到无菌滤液；
步骤三，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，离心脱脂过程中，依次控制离心转速为5000rpm、9000rpm、15000rpm，分别控制时间为5min、12min、18min，除去脂肪层，得到浸出液；
步骤四，接种培养：将浸出液接种于长成单层的PK15细胞，40℃下吸附1.5后，加入含有3％胎牛血清的DMEM维持液，培养24h，得到检样；
步骤五，荧光抗体染色：在检样中加FITC标记的抗CSFV多抗，在40℃下温育1h，用PBS溶液冲洗后，取洁净玻片用封片液封片，得到标样；
步骤六，观察对比：设正常PK-15细胞为阴性对照，设接种CSFV石门株病毒的PK-15细胞为阳性对照，然后将标样在荧光倒置显微镜下观察，对照后得到检测结果(细胞内有亮绿色荧光斑，判为阳性，细胞内无亮绿色荧光斑，判为阴性)。
实施例4：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为2:1:3。
实施例5：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为4:1:5。
实施例6：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为3:1。
实施例7：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为5:1。
实施例8：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤一和步骤五中，PBS溶液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.5。
实施例9：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤一和步骤五中，PBS溶液的浓度为0.02mol/L，pH值为7.25。
对比例1：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为1:1:2。
对比例2：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为7:1:6。
对比例3：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为1:1:6。
对比例4：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为7:1:2。
对比例5：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为2:1。
对比例6：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为1:1。
对比例7：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为6:1。
对比例8：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为8:1。
对比例9：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三具体设置为，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，除去脂肪层，得到浸出液；沉淀助剂中三氯乙酸、亚铁氰化钾的质量混合比为6:4；沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
对比例10：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三具体设置为，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，除去脂肪层，得到浸出液；沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌的质量混合比为6:1；沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
对比例11：一种猪瘟的快速检测方法，与实施例1的不同之处在于，步骤三具体设置为，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，除去脂肪层，得到浸出液；沉淀助剂中醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为1:4；沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
准确性测试
试验样品：准确称取患有猪瘟的猪肉170g，平均分成17组样品，每组样品10g，且为猪相同部位的组织肉。
试验方法：根据实施例1-9和对比例1-11中猪瘟的快速检测方法，分别对应17组样品进行测试，且每组样品检测100次，而在检测过程中若观察到细胞内有亮绿色荧光斑，判为阳性，即为检测准确，若观察到细胞内无亮绿色荧光斑，判为阴性，即为检测错误。然后对应实施例1-9和对比例1-11记录失误次数。
试验结果：实施例1-9和对比例1-11的测试结果如表1所示。由表1可知，由实施例1-3和对比例9-11的测试结果可得，选用三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合作为沉淀剂，能够降低检测过程中的失误次数。由实施例4-9和实施例1的测试结果可得，本发明所公开的PBS溶液、沉淀剂内各组分的质量混合比例、沉淀助剂和无菌滤液的体积比均适用于猪瘟的快速检测方法，能够保证检测结果的稳定性。由实施例1和对比例1-8的测试结果可得，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比范围为(2-6):1:(3-5)、沉淀助剂和无菌滤液的体积比范围为(3-5):1为最适应用范围，能够保证猪瘟的快速检测方法的准确性。
表1实施例1-9和对比例1-11的测试结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种猪瘟的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，破碎研磨：取待测猪组织样品，充分剪碎后置于乳锅中研磨，随后加入5-8倍体积的PBS溶液，搅拌混合后，得到乳液；
步骤二，离心过滤：将乳液移入离心管中进行离心，然后取离心管中上层清液，过滤膜除菌后得到无菌滤液；
步骤三，沉淀除杂：将无菌滤液加入容器中，并加入由三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾混合而成的沉淀助剂，超声振荡，静置分层，除去沉淀，将剩余液体在无菌离心管中进行离心脱脂，除去脂肪层，得到浸出液；
步骤四，接种培养：将浸出液接种于长成单层的PK15细胞，35-40℃下吸附1.5-2h后，加入含有2-3%胎牛血清的DMEM维持液，培养24-72h，得到检样；
步骤五，荧光抗体染色：在检样中加FITC标记的抗CSFV多抗，在35-40℃下温育1-1.5h，用PBS溶液冲洗后，取洁净玻片用封片液封片，得到标样；
步骤六，观察对比：设正常PK-15细胞为阴性对照，设接种CSFV石门株病毒的PK-15细胞为阳性对照，然后将标样在荧光倒置显微镜下观察，对照后得到检测结果；
所述步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为(2-6):1:(3-5)。
2.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤三中，沉淀助剂中三氯乙酸、醋酸锌、亚铁氰化钾的质量混合比为6:1:4。
3.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤二中，离心速度为12000-14000rpm，离心时间为8-10min，且离心温度设置为3-4℃。
4.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤二中，过滤膜的孔径大小为0.2-0.24μm。
5.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为（3-5）:1。
6.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤三中，沉淀助剂和无菌滤液的体积比为4:1。
7.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤三中，离心脱脂过程中，依次控制离心转速为3000-5000rpm、6000-9000rpm、12000-15000rpm，分别控制时间为5-10min、12-16min、18-20min。
8.根据权利要求1所述的猪瘟的快速检测方法，其特征在于，所述步骤一和步骤五中，PBS溶液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH值为7-7.5。
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2019
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Also Published As
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