CN106011248A - 一种用于检测肌萎缩的方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测肌萎缩的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明建立了一种用于检测肌萎缩的方法。本发明首次发现人体肌萎缩时血清miR‑23a表达显著升高，进一步通过肌萎缩的动物模型证明肌萎缩的发生与循环miR‑23a表达的动态相关性。本发明还提供了一种定量检测血清中miR‑23a的试剂盒，可用于无创检测人体肌萎缩。经实验证明，本发明的试剂盒检测结果准确，且简便可行，所用时间短。

Description

一种用于检测肌萎缩的方法及试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种用于检测肌萎缩的方法和试剂，尤其是涉及检测血清中miRNA-23a的试剂盒。
背景技术：
骨骼肌萎缩是一种临床常见疾病，目前临床常用的肌萎缩检测和诊断多采用有创损伤的肌肉手术活检取样，进行组织切片后分析。尽管核磁共振成像技术可用于肌萎缩的无创检查，但价格昂贵、操作繁琐且所需时间较长。
现有技术中尚无一种非手术创伤、简单可行的检测肌萎缩的方法。
miRNA是近年来非编码RNA研究的热点，这是一类内源的22nt大小的单链RNA，它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达，通过与靶mRNA3’非翻译区的不完全的碱基互补配对,在转录后水平上抑制基因翻译，从而起到对发育分化的调控作用。现有研究发现血清中也存在miRNA,被称之为循环miRNA。而循环miRNA的异常表达和多种疾病有相关性，被大量的用作疾病检测分子，具有准确性高，操作简单的特点。
有文献报道[Wada S,Kato Y,Okutsu M,Miyaki S,Suzuki K,et al.(2011)Translationalsuppression of atrophic regulators by microRNA-23a integrates resistance to skeletal muscleatrophy.J Biol Chem 286:38456-38465.]，小鼠骨骼肌中miR-23a能抑制肌萎缩基因Atrogin-1和MuRF1的表达，在胫骨前肌中过表达miR-23a的质粒能够抑制地塞米松导致的胫骨前肌萎缩。
迄今为止，未见有任何在血液中检测miR-23a的报道，而血液中检测是本领域最为方便简单的检测方法。
发明内容：
本发明的目的在于找到一种简单可行的检测肌萎缩的血液学方法，并开发出检测试剂。
本发明首次开展了循环miR-23a分析检测及其与肌萎缩相关性的研究，通过实验首次发现人体肌萎缩时血清miR-23a表达显著升高，进一步通过肌萎缩的动物模型证明肌萎缩的发生与循环miR-23a表达的动态相关性。
据此，本发明建立一种非手术创伤、简单可行的检测肌萎缩的新方法和新的检测试剂。具体如下所述：
用以下实验证实了miR-23a的新功能：
1、人体肌萎缩对血清中miR-23a表达的影响
本实验采用国际公认的头低位卧床方法(Gregory R.Adams,et al.J Appl Physiol 95:2185–2201,2003)，卧床45天诱导肌萎缩形成,制备人体骨骼肌萎缩模型。志愿者在卧床前5天(R-5；对照组)和卧床后45天(R+45；萎缩组)，在中国人民解放军第305医院核磁功能检查室进行双下肢核磁扫描，分析肌萎缩发生的典型指标：肌肉体积和肌肉横截面积的变化。
采用全身MRI扫描仪和标准体线圈对大腿横断面进行扫描以获得T1加权图像。使用系统自带图像处理软件包，将原始MRI图像转换成可以识别的图像文件，选定肌肉的灰度范围和边界，逐层测量肌肉面积，与层厚相乘得到体积数据，各层体积数据相加得到总的肌肉体积数据。实验结果表明，与对照组相比，肌萎缩组人体比目鱼肌体积总和及最大横截面积均显著下降(P<0.01)，见图1、图2。
采用实时定量real time PCR方法，分析了人体肌萎缩组及其对照组血清中miR-23a含量的改变。结果表明，与对照组相比，肌萎缩组血清中miR-23a的含量显著增高(P<0.01)，见图3、图4。
提示循环miR-23a水平的增高与肌萎缩相关。因此，可通过抽取血液，分析血清中miR-23a含量的这一简便易行方法检测人体肌萎缩。
详见实验一。
2、小鼠肌萎缩对血清中miR-23a表达的影响
本实验并采用国际公认的尾悬吊方法(Gregory R.Adams,et al.J Appl Physiol 95:2185–2201,2003)，尾悬吊3天、7天诱导肌萎缩形成,制备在体骨骼肌萎缩模型。采用组织学方法，分析了对照组(0天)和尾悬吊3天、7天的肌萎缩的典型指标：肌肉重量、肌肉横截面积的变化。实验结果表明，尾悬吊3天比目鱼肌重量和肌纤维横截面积开始下降，尾悬吊7天后比目鱼肌重量和肌纤维横截面积与对照组相比均显著下降，见图4、图5、图6。
用实时定量real time PCR方法分析了肌萎缩对血清中miR-23a含量的影响。实验结果表明，在诱导小鼠肌萎缩过程中，与对照组相比，肌萎缩3天和7天小鼠血清中miR-23a的含量逐渐增高(P<0.01)。见图7。
因此，小鼠肌萎缩的程度与血清miR-23a含量的增高程度的动态相关性，进一步印证了前述人体循环miR-23a含量与肌萎缩的相关性。可见，分析循环miR-23a含量的变化可作为检测人体肌萎缩的一种简便可行的方法和试剂。
详见实验二。
本发明的有益效果是：
首次检测了血清miR-23a，并首次发现人体肌萎缩的血清中miR-23a含量升高。循环miR-23a可作为诊断肌萎缩的检测分子，应用于临床肌萎缩诊断试剂的制备。
本发明设计了miR-23a的反转录引物(SEQ ID No.1)和正反向检测引物(SEQ ID No.2,3)。
本发明建立了一种用于检测肌萎缩的方法，其特征是检测血清中miR-23a的含量。
本发明建立了一种定量检测血清中miR-23a的方法，其特征是使用核苷酸序列为SEQID No.1的反转录引物和核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的正反向检测引物。
本发明还开发了一种用于检测肌萎缩的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本是血清，所述试剂盒用于检测血清中的miR-23a。
所述试剂盒中具有可检测miRNA-23a表达量的引物。
所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
所述试剂盒还包括检测试剂盒中常规成分，如标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水等，本领域人员根据实际需要可以进行增减。
经实验证明，本发明提供的试剂盒可用于无创检测人体肌萎缩，且简便可行，结果准确(详见实施例)。
相比核磁共振成像技术，本试剂盒价格低、操作简便，且所用时间短。
附图说明
图1是头低位卧床前和头低位卧床45天人体比目鱼肌总体积。
图2是头低位卧床前和头低位卧床45天人体比目鱼肌最大横截面积。
图3是实时定量real time PCR检测对照组及头低位卧床15天、30天和45天人体血清中miR-23a的含量。
图4是对照组及尾悬吊3天和7天小鼠比目鱼肌重量。
图5是对照组及尾悬吊3天和7天小鼠比目鱼肌冰冻切片。
图6是对照组及尾悬吊3天和7天小鼠比目鱼肌横截面积统计结果。
图7是实时定量real time PCR检测对照组及尾悬吊3天、7天小鼠血清中miR-23a的含量。
图8，9,10是实时定量real time PCR检测卧床前及头低位卧床45天人体血清中miR-23a的含量。
具体实施方式
以下实验中所用的实验动物及材料来源如下：
实验动物：雄性C57小鼠购自北京维通利华动物中心，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001；实验动物质量合格证号：0261086。
C2C12细胞系购于中国医学科学院。
肌管为本实验制备的单核细胞C2C12体外成肌分化后形成的多核合胞体。
miR-23a反转录和检测引物设计：
SEQ ID No.1反转录引物：CTCGTATGGAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTCCATACGAGGGAAATCC
SEQ ID No.2正向引物：ATCACATTGCCAGGGA
SEQ ID No.3反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT
其它材料来源：
Trizol、反转录酶购自Invitrogen公司；
引物合成服务由广州锐博生物公司提供；
SYBR购自ABI公司；
DMEM培养基购自美国GIBCO公司；
胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、胰蛋白酶购自HyClone公司；
谷氨酰胺购自Sigma公司；
青霉素和链霉素购自Sig ma公司；
细胞培养液：生长液为DMEM，加20％FBS，1％谷氨酰胺，1％青霉素和链霉素双抗；分化液为DMEM，加2％HS，1％谷氨酰胺，1％青霉素和链霉素双抗；
主要仪器设备：ABI Step-One Plus real time PCR仪，Format CO2孵箱，Format超净工作台；奥林巴斯倒置显微镜。
实验一：人体肌萎缩对血清中miR-23a表达的影响
1.实验目的：
本实验采用对照组和头低位卧床组，通过卧床15、30和45天诱导肌萎缩形成，用实时定量realtime PCR的方法，分析肌萎缩对血清中miR-23a含量的影响。
2.实验方法：
2.1人体头低位卧床诱导肌萎缩
8个人，保持头朝下-6度的姿势45天，模拟失重状态下头部充血的现象。于第0，15，30，45
2.2RNA的提取、检测与定量
A、裂解:对照组和肌萎缩组各取250ml上清，加入500ml Trizol LS到1.5ml的EP管中，每管加入1ul Cel-39mimics吹吸混匀，放置30min。
B、各相分离：按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。
C、沉淀RNA:按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到RNA沉淀。
D、漂洗RNA:弃去上清，按1ml75％乙醇/1ml Trizol的比例，加入75％的乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。
E、重溶RNA：室温空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC水溶解RNA沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。
F、RNA纯度检测及定量：取1μl RNA溶液加入99μl DEPC水中混匀，用紫外分光光度计测定A260/A280的比值和浓度。
2.3反转录反应
25μL反应体系操作步骤：
2.4引物设计
miR-23a反转录和检测引物设计：
SEQ ID No.1反转录引物：CTCGTATGGAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTCCATACGAGGGAAATCC
SEQ ID No.2正向引物：ATCACATTGCCAGGGA
SEQ ID No.3反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT
2.5real time PCR检测miR-23a的表达
50μL反应体系操作步骤：
PCR反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。
3.数据分析方法
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。p≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
如图3所示。可见，与对照组相比头低位卧床15天、30天和45天人体血清中miR-23a的含量显著增高(**P<0.01)。
5.实验结论
人体肌萎缩时血清中miR-23a含量显著上升可以用来检测人体肌萎缩的发生。
实验二：小鼠肌萎缩模型对血清中miR-23a表达的影响
1.实验目的：
本实验采用对照组和尾悬吊组小鼠，通过尾悬吊诱导小鼠骨骼肌萎缩，用实时定量realtime PCR的方法，分析肌萎缩对血清中miR-23a含量的影响。
2.实验方法：
2.1尾悬吊小鼠肌萎缩模型的制备
通过单笼尾悬吊装置将小鼠尾部悬吊起来与地面保持30度角，并保证自由饮食和活动。
2.2RNA的提取、检测与定量
A、裂解:对照组和肌萎缩组各取250ml血清，加入500ml Trizol LS到1.5ml的EP管中，每管加入1ul Cel-39mimics吹吸混匀，放置30min。
B、各相分离：按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。
C、沉淀RNA:按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到RNA沉淀。
D、漂洗RNA:弃去上清，按1ml75％乙醇/1ml Trizol的比例，加入75％的乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。
E、重溶RNA：室温空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC水溶解RNA沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。
F、RNA纯度检测及定量：取1μl RNA溶液加入99μl DEPC水中混匀，用紫外分光光度计测定A260/A280的比值和浓度。
2.3反转录反应
25μL反应体系操作步骤：
2.4引物设计
miR-23a反转录和检测引物设计：
SEQ ID No.1反转录引物：CTCGTATGGAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTCCATACGAGGGAAATCC
SEQ ID No.2正向引物：ATCACATTGCCAGGGA
SEQ ID No.3反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT
2.5real time PCR检测miR-23a的表达
50μL反应体系操作步骤：
PCR反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。
3.数据分析方法
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。p≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
如图4所示。可见，与对照组相比尾悬吊3天、7天和14天小鼠血清中miR-23a的含量显著增高(**P<0.01)。
5.实验结论
小鼠肌萎缩时血清中miR-23a含量显著上升可以用来检测小鼠肌萎缩的发生。
实验三：细胞肌萎缩模型对培养液中miR-23a表达的影响
1.实验目的：
本实验采用对照组和肌萎缩组肌管，通过体外诱导肌管萎缩，用实时定量realtime PCR的方法，分析肌萎缩对细胞培养液中miR-23a含量的影响。
2.实验方法：
2.1成肌细胞复苏、培养
A、从液氮罐中快速取出冻存的成肌细胞C2C12,将冻存管快速放于37℃水浴中,轻摇使其快速溶解。
B、转入15mL一次性灭菌离心管中,加入5mL细胞生长液,1000rpm,离心5min去除冷冻保护剂。
C、吸去上清,加入5mL细胞生长液,用吹打管轻轻吹打为细胞悬液,接种到75mm的培养瓶中。
D、5％CO2孵箱37℃条件下培养。
2.2成肌细胞实验
A、当复苏细胞生长密度达到80％时，弃去旧培养基,用PBS将细胞洗涤2次。
B、加入2mL0.25％胰蛋白酶-EDTA,在倒置显微镜下观察到细胞将要分离、呈现圆形时,加入3mL细胞生长液终止消化。
C、用吸管轻轻吹打培养瓶，使细胞脱落完全。吸出细胞悬液,放入15mL离心管中,以1000rpm的转速，离心5min。
D、吸掉上清液,加入细胞生长液5mL,并用拉制的细尖头吸管吹打细胞悬液，直至细胞均匀分散成单个细胞。
E、按照常规方法，用血细胞计数仪进行细胞计数，将细胞稀释为浓度：104/ML细胞悬液。
F、按照每60mm培养皿接种细胞悬液1mL，并加入2mL生长液，使每个60mm培养皿在3mL生长液下培养。
G、细胞生长约24小时，到达约80％生长密度。
H、将培养皿分组为：对照组和肌萎缩组各4皿，进行标注。
2.3肌管制备
A、去除对照组和肌萎缩组皿中生长液，更换为3ml/皿的分化液。
B、诱导成肌细胞分化，每24小时更换培养液。
C、分化72小时后，可见成肌细胞形成大于三个核的多核肌管。
2.4体外肌管萎缩实验
应用以上实验分化形成的肌管，采用国际公认的体外肌萎缩模型实验方法(Sandri Met al,Cell,30；117(3):399-412,2004)，吸去对照组和肌萎缩组皿中的培养液，对照组加入3mL分化液，肌萎缩组加入3mL PBS诱导肌管萎缩6小时，每组选取4皿，用于real time PCR分析。
2.5RNA的提取、检测与定量
A、裂解:对照组和肌萎缩组各取500ml上清，加入500ml Trizol LS到1.5ml的EP管中，每管加入1ul Cel-39mimics吹吸混匀，放置30min。
B、各相分离：按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。
C、沉淀RNA:按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到RNA沉淀。
D、漂洗RNA:弃去上清，按1ml75％乙醇/1ml Trizol的比例，加入75％的乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。
E、重溶RNA：室温空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC水溶解RNA沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。
F、RNA纯度检测及定量：取1μl RNA溶液加入99μl DEPC水中混匀，用紫外分光光度计测定A260/A280的比值和浓度。
2.6反转录反应
25μL反应体系操作步骤：
2.7引物设计
miR-23a反转录和检测引物设计：
SEQ ID No.1反转录引物：CTCGTATGGAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTCCATACGAGGGAAATCC
SEQ ID No.2正向引物：ATCACATTGCCAGGGA
SEQ ID No.3反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT
2.8real time PCR检测miR-23a的表达
50μL反应体系操作步骤：
PCR反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。
3.数据分析方法
数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。p≤0.01表示具有显著性统计学差异。
4.实验结果
如图5所示。可见，萎缩组肌管上清中miR-23a的含量是对照组的11.56倍(**P<0.01)。
5.实验结论
肌管萎缩时培养上清中miR-23a含量显著上升可以用来检测肌萎缩的发生。
实施例1肌萎缩检测试剂盒
成份：1.miR-23a反转录引物；2.miR-23a检测引物；3.反转录酶；4.dNTP；5.无RNA酶水；6.sybGreen；7.Trizol LS；8.氯仿；9.异丙醇；10.cel-mir-39mimics
操作方法：
1.取血清，每100ul血清加入1ul cel-mir-39mimics，随后加入等体积Trizol LS充分震荡混匀。
2.加入五分之一体积氯仿，充分混匀后12000rpm/min离心30分钟。
3.取上清加入等体积异丙醇，-20摄氏度冷藏2小时。
4. 12000rpm/min离心30分钟，倒掉液体。
5.加入75％乙醇，随后7500rpm/min离心5分钟。
6.重复5。
7.倒掉液体，晾干，加入无RNA酶的水稀释RNA。
8.取适量RNA加入反转录酶，dNTP，miR-23a反转录引物进行反转录。
9.加入miR-23a检测引物和sybGreen进行荧光定量PCR。
实施例2人体肌萎缩检测实验
实验用检测试剂：实施例1所述的试剂盒；
实验对象：3例卧床45天的肌萎缩患者的人体样本(肌肉显著萎缩)，取卧床前和卧
床45天后血清，用本试剂盒检测miR-23a的表达。
操作方法：
1.取血清200ul，加入2ul cel-mir-39mimics，然后加入等0.5ml Trizol LS充分震荡混匀。
2.加入100ul氯仿，充分混匀后12000rpm/min离心30分钟。
3.取200ul上清加入200ul异丙醇，-20摄氏度冷藏2小时。
4. 12000rpm/min离心30分钟，倒掉液体。
5.加入0.5ml 75％乙醇，随后7500rpm/min离心5分钟。
6.重复5。
7.倒掉液体，晾干，加入15ul无RNA酶的水稀释RNA。
8.取5ul RNA加入0.5ul反转录酶，1ul dNTP，SEQ ID No.1反转录引物进行反转录。
9.加入miR-23a检测引物和sybGreen进行荧光定量PCR。
10.检测结果如图8,9,10所示，通过本试剂盒能检测到，于卧床前相比卧床45天后人体血清中miR-23a的含量显著升高，因此本试剂盒可用于肌萎缩的检测。

Claims (5)

1.一种用于检测肌萎缩的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本是血清，所述试剂盒用于检测血清中的miR-23a。
2.权利要求1所述的试剂盒，具有可检测miRNA-23a表达量的引物。
3.权利要求2所述的试剂盒，所述引物是核苷酸序列为SEQ ID No.1的反转录引物和核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的正反向检测引物。
4.核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的引物在制备检测肌萎缩的试剂中的应用。
5.一种定量检测血清中miR-23a的方法，其特征是使用核苷酸序列为SEQ ID No.1的反转录引物和核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的正反向检测引物。
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CN108690846A (zh) * 2018-04-17 2018-10-23 上海大学 抑制MiR-29b基因表达的应用
CN109055545A (zh) * 2018-09-29 2018-12-21 中国航天员科研训练中心 预测失重肌萎缩小腿肌维度下降风险的方法与dna甲基化标志物

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