CN106033038A

CN106033038A - 鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法

Info

Publication number: CN106033038A
Application number: CN201510108487.XA
Authority: CN
Inventors: 宋新宇; 史淑艳; 刘兆霞; 宫晓; 马爽; 王红; 郭玉广
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2016-10-19

Abstract

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，具体的步骤如下：1）血清处理液配制：取高岭土25g，加0.85%生理盐水至100ml，2~8℃保存备用；2）取40μl待检血清，加入120μl血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液；3）上清液中加入约2μl鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清。用本发明中去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价均<1:4；用该方法处理过的传染性支气管炎阳性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价降低0.5~1个滴度，基本去除了非特异性反应。

Description

鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法

技术领域

本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理血清的方法。

背景技术

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征；患病的鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。传支抗原特性，病毒本身血凝性，须经特殊处理才能释放出凝集红细胞的受体，出现血凝性。目前传染性支气管苗的效力检验主要采用攻毒保护方法。攻毒保护存在散毒风险，因此找到血清学替代方法非常必要，血清学方法中血凝及血凝抑制最为简单可行，但传支血凝抑制试验存在一些非特异性反应会影响检测结果，因此去除血清中非特异性反应就显得尤为重要。

目前国内外研究的去除血清非特异性反应的方法很多，如加鸡红细胞处理、56℃加热处理和加聚丙二醇处理等，但这些方法处理结果均不佳。另外传染性支气管炎血凝抑制试验血清的非特异性反应本就偏高，去除它的非特异性反应相对更难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理血清的方法，针对去除传染性支气管炎血凝抑制试验血清中非特异性反应的方法，采用本发明去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价均<1:4。

本发明采用的技术方案是：

一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，使用高岭土悬液和鸡红细胞血球泥对血清进行处理。

优选的，所述的高岭土悬液和鸡红细胞血球泥按照体积比15:1混合。

优选的，所述高岭土悬液为：高岭土25g，加0.85％生理盐水至100ml制备成的悬液。

优选的，所述鸡红细胞血球泥的制备方法为：加抗凝剂采SPF鸡血，用PBS或生理盐水洗，轻轻混匀，3500r/min，吸去上清，如此反复洗3次，即得到鸡红细胞血球泥。

其中，所述抗凝剂为阿试液或肝素钠，均为市售产品。SPF指鸡的级别。

鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，具体的步骤如下：

1)取高岭土25g，加0.85％生理盐水至100ml，2～8℃保存备用；

2)取40μl待检血清，加入120μl步骤1)制备的血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液；

3)上清液中加入2μl鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清。

本发明的有益效果：

本发明中去除血清非特异性反应的方法，用本发明中去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价均<1:4；用该方法处理过的传染性支气管炎阳性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价降低0.5～1个滴度，基本去除了非特异性反应。

具体实施方式

实施例1

一、抗原制备

1、将呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株和肾型IBV-T株毒种分别用无菌生理盐水100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃鸡胚孵化箱孵化，24小时照胚1次，弃去死胚。直至48小时，不论死亡与否，全部取出，置4℃冰箱冷却。按此方法每种抗原制备3批。

其中，呼吸型IBV-M41株和肾型IBV-T株毒种，购于中国兽医药品监察所。腺胃型IBV-YBX株为本申请人自行采集。

2、收集尿囊液，装入500ml离心瓶中，3000rpm离心30分钟，取上清。

3、将上清装入40ml离心管中，经30000g，4℃离心3小时。

4、弃去上清，每管各加入1M pH6.5的Tris-HCL缓冲液，进行吹打，混匀，将病毒混悬液收集于一管内。

5、取病毒混悬液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合。

6、将病毒混合物37℃水浴2小时，每隔15分钟振荡混匀。最后4℃过夜，为IBV-HA抗原。

7、分别将IBV-HA抗原加入1％硫柳汞，终浓度为0.01％，边加边混匀，混匀后4℃保存。即得M41-1批、M41-2批、M41-3批；YBX-1批、YBX-2批、YBX-3批；T-1批、T-2批、T-3批。

将以上9种抗原分别与稳定剂混合冻干。

二、鸡传染性支气管炎血凝抑制试验

1.1鸡传染性支气管炎HI抗原血凝价测定

取96孔V型微量反应板对上述制备的抗原进行血凝效价检测，每孔加25μlPBS(0.01mol/L，pH值7.0～7.4)，第一排加25μl抗原，并做2～4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25μl PBS，最后再加入0.5％鸡红细胞悬液25μl，用微量振荡器混匀，2～8℃静置40分钟判定结果，以使100％红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。结果详见表1。

表1 抗原血凝效价检测结果

以上结果说明，自制的抗原均能达到了9Log2及以上，说明自制抗原效价较高，均已达到进口抗原标准。

1.2鸡传染性支气管炎4HA单位抗原的配制

根据测定的HI抗原HA效价，用PBS(0.01mol/L，pH值7.0～7.4)配制4HA单位抗原。将配制好的4HA单位抗原用PBS稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。在每一稀释度的25μl抗原中加入25μl PBS，再加入0.5％鸡红细胞悬液25μl，混匀，2～8℃静置40分钟判定结果。如果1:4稀释为100％红细胞凝集终点，表明配制的是4HA单位抗原；如果100％红细胞凝集终点是1:5或1:6，表明配制的4HA单位抗原实际上是高于4个单位；如果100％红细胞凝集终点是1:2或1:3，表明配制的4HA单位抗原实际上是低于4个单位。应根据检验结果适当调整，使抗原工作液确为4HA单位。

1.3待检血清的处理

1.3.1取高岭土25g，加0.85％生理盐水至100ml，即为25％的高岭土悬液，2～8℃保存备用。

1.3.2用25％的高岭土悬液作为血清处理液，操作时取40μl待检血清，加入120μl血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液。

1.3.3用血球泥处理，于1.3.2所得上清液中加入约2μl鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清。

1.4血凝抑制试验(HI)

1.4.1取96孔V型微量反应板，每孔加入25μl PBS(0.01mol/L，pH值7.0～7.4)；

1.4.2分别吸取25μl已处理待检血清，加至每块的第一排各相应孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释；

1.4.3分别向各孔内加入含4HA单位的抗原25μl，2～8℃静置30分钟；

1.4.4每孔中加入0.5％鸡红细胞悬液25μl，轻轻混匀，2～8℃静置40分钟；

1.4.5结果判定将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。当阴性血清HI效价≤2.0log₂、阳性血清HI效价与规定效价相比误差≤2.0log₂时，试验方可成立。以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。

三、方法验证

用本发明实施例制备的抗原和购买的进口IBV M41株抗原分别检测

表2 血凝抑制试验结果

从以上结果看，用实验室自制的抗原检测的血凝结果和进口抗原检测的血凝结果无差异；未处理的阳性血清、阴性血清的血凝抑制效价均高于已处理组的，未处理的阳性血清的血凝抑制效价较已处理的阳性血清的血凝抑制效价高0.5～1滴度；未处理的阴性血清的血凝抑制效价一般在3Log2～4Log2，已处理的阴性血清的血凝抑制效价均小于1:4。以上结果说明，本发明中去除血清非特异性反应的方法能够明显去除非特异性反应。提高了试验结果的准确性。

上述实施例是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，其特征在于，使用高岭土悬液和鸡红细胞血球泥对血清进行处理。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，其特征在于，所述的高岭土悬液和鸡红细胞血球泥按照体积比15:1混合。

3.根据权利要求1和2所述的一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，其特征在于：所述高岭土悬液为：高岭土25g，加0.85%生理盐水至100ml制备成的悬液。

4.根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，其特征在于：具体的步骤如下：

1）取高岭土25g，加0.85%生理盐水至100ml，2~8℃保存备用；

2）取40μl待检血清，加入120μl步骤1）制备的血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液；

3）上清液中加入2μl鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理方法，其特征在于：所述鸡红细胞血球泥的制备方法为：加抗凝剂采SPF鸡血，用PBS或生理盐水洗，轻轻混匀，3500r/min，吸去上清，如此反复洗3次，即得到鸡红细胞血球泥。