CN113533718A - 禽流感和新城疫的血凝试验检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法。本发明不进行禽流感、新城疫血凝试验，而是设定9log2、10log2分别为禽流感、新城疫血凝试验的参照血凝效价，按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制相应的4HAU抗原，直接进行回归检验试验，观察红细胞凝集孔的个数，根据回归检验试验的观察结果，按照禽流感血凝效价公式或新城疫血凝效价公式计算得到准确的禽流感血凝效价或新城疫血凝效价，无需反复试验验证，极大提高了禽流感和新城疫血凝试验的诊断效率。
Description
技术领域
本发明涉及禽类疫病检测技术领域，尤其是一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法。
背景技术
禽流感和新城疫是波及全世界的两种重大禽类传染病。两种病毒均可导致禽类严重的呼吸系统感染，导致禽类,死亡率较高。禽流感与新城疫病的暴发与野生禽类传播有关，能够导致人类感染，例如结膜炎和流感样综合征等。
目前对新城疫进行检测多采用GBT16550-2020新城疫诊断技术，对禽流感进行检测多采用GB-T18936-2020高致病性禽流感诊断技术。诊断技术中均需要进行血凝试验和血凝抑制试验。4单位抗原(4HAU)是血凝抑制试验的诊断液，配制4HAU是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对血凝抑制试验结果有决定影响，4HAU浓度高了，HI抗体效价就会降低，反之则会升高；血凝试验检测的准确性直接决定了配制而得的4HAU的准确性，为防止血凝试验检测不准确，需要进行回归检验试验验证血凝试验的结果。当通过回归检验试验证明血凝试验检测不准确时，表明配制而得的4HAU抗原不准确，需要重新进行血凝试验。因此现有的检测技术中往往需要进行多次血凝试验和多次回归检验试验，导致禽流感和新城疫血凝试验的诊断效率低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，克服前述现有技术的不足，不进行常规的血凝试验，而是直接设定禽流感血凝试验和/或新城疫血凝试验的参照血凝效价，根据设定的参照血凝效价直接进行回归检验试验，根据回归检验试验的观察结果，按照禽流感血凝效价公式或新城疫血凝效价公式计算求得禽流感血凝效价或新城疫血凝效价，其结果与正确禽流感血凝效价或新城疫血凝效价完全一致，经过大量试验检验，禽流感血凝效价公式和新城疫血凝效价公式具有实用性、准确性、普遍性，该种新检测方法简单直观，操作简便易行，既能缩短试验时间，又能节省诊断试剂的使用量，无需反复试验验证，极大提高了禽流感和新城疫的诊断效率。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝试验的参照血凝效价为9log2，设定新城疫血凝试验的参照血凝效价为10log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，配制参照血凝效价为9log2的禽流感4HAU抗原，或配制参照血凝效价为10log2的新城疫4HAU抗原，充分摇匀，进行回归检验试验，观察红细胞凝集孔的个数；
(3)禽流感血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2多X个时，禽流感血凝效价＝(9+X)log2，当红细胞凝集孔的个数比2少X个时，禽流感血凝效价＝(9-X)log2，其中X为0、1、2；
(4)新城疫血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2多X个，新城疫血凝效价＝(10+X)log2，当红细胞凝集孔的个数比2少X个，新城疫血凝效价＝(10-X)log2，其中X为0、1、2。
优选的，所述步骤(2)中的回归检验试验包括如下步骤：
①取96孔V型微量反应板，用微量移液器在1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头；
②吸取4HAU混匀的抗原0.025mL加入第1孔中，混匀，从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头；
③每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液；
④振荡混匀，在20℃—25℃室温下静置20min后观察结果，将反应板倾斜，观察红细胞凝集孔的个数并记录。
优选的，步骤①中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
优选的，步骤③中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。
优选的，阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
优选的，步骤③中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法具有以下优点：改进禽流感和新城疫的诊断技术，不进行常规的血凝试验，而是直接设定禽流感血凝试验和新城疫血凝试验的参照血凝效价分别为9log2和10log2，根据设定的参照血凝效价直接进行回归检验试验并观察红细胞凝集孔的个数，根据回归检验试验按照禽流感血凝效价公式或新城疫血凝效价公式计算得到准确的禽流感血凝效价或新城疫血凝效价，通过本发明的新血凝试验检测方法，无需反复进行血凝试验和回归检验试验验证，极大提高了禽流感和新城疫血凝试验的诊断效率。
具体实施方式
设定禽流感、新城疫血凝效价分别为9log2、10log2进行回归检验试验，通过血凝效价公式计算出血凝效价的检测方法于实施例2和实施例4的禽流感、新城疫血凝试验检测中，分别与高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)和新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)进行比对试验，用以检验新检测方法的实用性和准确性。
实施例1试剂制备
1％鸡红细胞悬液的制备：包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤三次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。
阿氏液的配制方法：包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备：包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》如表1所示：
实施例2一种禽流感的血凝试验检测方法
实施例2试验所用禽流感病毒抗原为哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415。
1、材料准备
(1)96孔V型微量反应板、微量移液器(配有滴头)、一次性使用移液槽。
(2)1％鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液。
(3)pH7.2、0.01mol/L PBS。
(4)禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原。
2、操作方法
(1)设定禽流感血凝试验的参照血凝效价为9log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，配制参照血凝效价为9log2的禽流感4HAU抗原，充分摇匀，进行回归检验试验，观察红细胞凝集孔的个数；具体为：
①在96孔V型微量反应板的1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头。
②吸取4HAU混匀的抗原液0.025mL加入第1孔，混匀。
③从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
④每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将1％鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
⑤振荡混匀，在室温(20℃—25℃)下静置20min后观察结果。
回归检验试验结果：观察到红细胞凝集孔的个数为1；
(3)禽流感血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2少1个时，禽流感血凝效价＝(9-1)log2＝8log2；
试验结果：实施例1检测禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原的血凝效价为8log2。
实施例3高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)检测方法
实施例3为实施例2的对照试验，试验所用禽流感病毒抗原为哈尔滨国生生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原，生产批号20190415。
1、材料准备
(1)96孔V型微量反应板、微量移液器(配有滴头)、一次性使用移液槽。
(2)1％鸡红细胞悬液。
(3)pH7.2、0.01mol/L PBS。
(4)禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原和标准阳性血清以及阴性血清。
2、操作方法
2.1血凝(HA)试验(微量法)
(1)在微量反应板的1孔—12孔均加入0.025mL PBS,换滴头。
(2)吸取0.025mL禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原液加入第1孔，混匀。
(3)从第1孔吸取0.025mL病毒抗原液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对被稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
(4)每孔再加入0.025mL PBS。
(5)每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将1％鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
(6)振荡混匀，在室温(20℃-25℃)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4℃环境下)，对照孔红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底。
(7)结果判定：将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。
血凝(HA)试验初步结果：禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原血凝效价为8log2。
按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制血凝效价为8log2的4HAU抗原进行回归检验试验。
2.2回归检验试验
①在96孔V型微量反应板的1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头。
②吸取4HAU混匀的抗原液0.025mL加入第1孔，混匀。
③从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
④每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将1％鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
⑤振荡混匀，在室温(20℃—25℃)下静置20min后观察结果。
回归检验试验结果：观察有2孔红细胞凝集，检验成功。
血凝(HA)试验最终结果：高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)检测方法检测禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原的血凝效价为8log2。
通过实施例2和实施例3的检测结果相比较，实施例2检测方法检测禽流感病毒H7N9(RE-2株)血凝抑制试验抗原的血凝效价准确。
实施例4一种新城疫的血凝试验检测方法
试验所用新城疫病毒抗原为青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901。
1、材料准备
(1)96孔V型微量反应板、微量移液器(配有滴头)、一次性使用移液槽。
(2)1％鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液。
(3)pH7.2、0.01mol/L PBS。
(4)新城疫血凝抑制试验抗原(青岛立见诊断技术发展中心生产，生产批号010131901)
2、操作方法
(1)设定新城疫血凝试验的参照血凝效价为10log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，配配制参照血凝效价为10log2的新城疫4HAU抗原，充分摇匀，进行回归检验试验，观察红细胞凝集孔的个数，具体为：
①在96孔V型微量反应板的1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头。
②吸取4HAU混匀的抗原液0.025mL加入第1孔，混匀。
③从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
④每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将1％鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
⑤振荡混匀，在室温(20℃—25℃)下静置20min后观察结果。
回归检验试验结果：观察到红细胞凝集孔的个数为3；
(4)新城疫血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2多1个，新城疫血凝效价＝(10+1)log2＝11log2。
试验结果：新检测方法检测新城疫血凝抑制试验抗原(青岛立见诊断技术发展中心生产，生产批号010131901)的血凝效价为11log2。
实施例5新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)检测方法
实施例5为实施例4的对照试验，试验所用新城疫病毒抗原为青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原，生产批号010131901。
1、材料与试剂
(1)器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V型微量反应板、一次性使用移液槽。
(2)pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
(3)1％鸡红细胞悬液。
(4)新城疫血凝抑制试验抗原(青岛立见诊断技术发展中心生产，生产批号010131901)
2、操作方法
2.1血凝试验操作过程
(1)取96孔V型微量反应板，为微量移液器在1孔—12孔每孔加0.025mL PBS；
(2)吸取0.025mL新城疫血凝抑制试验抗原加入第1孔中，吹打3次-5次充分混匀；
(3)从第1孔中吸取0.025mL混匀后的新城疫血凝抑制试验抗原加到第2孔，混匀后吸取0.025mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0.025mL弃之，设第12孔为PBS对照；
(4)每孔再加0.025mL PBS；
(5)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液；
(6)振荡混匀反应混合液，室温20℃-25℃下静置40min后观察结果，若环境温度太高，放4℃静置60min，PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
结果判定：
在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全血凝的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。
血凝(HA)试验初步结果：新城疫血凝抑制试验抗原血凝效价为11log2。
按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制血凝效价为11log2的4HAU抗原进行回归检验试验。
2.2回归检验试验
①在96孔V型微量反应板的1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头。
②吸取4HAU混匀的抗原液0.025mL加入第1孔，混匀。
③从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
④每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液(将1％鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
⑤振荡混匀，在室温(20℃—25℃)下静置20min后观察结果。
回归检验试验结果：观察有2孔红细胞凝集，检验成功。
血凝(HA)试验最终结果：新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)检测方法检测新城疫血凝抑制试验抗原(青岛立见诊断技术发展中心生产，生产批号010131901)的血凝效价为11log2。
通过实施例4和实施例5的检测结果相比较，实施例4检测方法检测青岛立见诊断技术发展中心生产的新城疫血凝抑制试验抗原的血凝效价准确。
综上所述，用实施例2的方法检测出的禽流感血凝抑制试验抗原血凝效价与用高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)检测出的禽流感血凝抑制试验抗原血凝效价完全一致；用实施例4的方法检测出的新城疫血凝抑制试验抗原血凝效价与用新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)检测出的新城疫血凝抑制试验抗原血凝效价完全一致。
经过实施例2-5后，更换试验人员，使用不同生产厂家的新城疫血凝抑制试验抗原；不同生产厂家，不同亚型、毒株的禽流感血凝抑制试验抗原进行了本发明提出的检测方法分别与新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)和高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)的比对试验，禽流感血凝试验案例如表2所示，新城疫血凝试验案例如表3所示。
表2禽流感血凝试验案例
表3新城疫血凝试验案例
经对表2和表3中的试验抗原进行试验验证，本发明提出的方法与用高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2020)检测出的禽流感血凝抑制试验抗原血凝效价完全一致，本发明提出的方法与用新城疫诊断技术(GB/T 16550-2020)检测出的新城疫血凝抑制试验抗原血凝效价完全一致。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。
Claims (6)
1.一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设定禽流感血凝试验的参照血凝效价为9log2，设定新城疫血凝试验的参照血凝效价为10log2；
(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，配制参照血凝效价为9log2的禽流感4HAU抗原，或配制参照血凝效价为10log2的新城疫4HAU抗原，充分摇匀，进行回归检验试验，观察红细胞凝集孔的个数；
(3)禽流感血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2多X个时，禽流感血凝效价＝(9+X)log2，当红细胞凝集孔的个数比2少X个时，禽流感血凝效价＝(9-X)log2，其中X为0、1、2；
(4)新城疫血凝效价公式：根据步骤(2)的回归检验试验观察结果，当红细胞凝集孔的个数比2多X个，新城疫血凝效价＝(10+X)log2，当红细胞凝集孔的个数比2少X个，新城疫血凝效价＝(10-X)log2，其中X为0、1、2。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的回归检验试验包括如下步骤：
①取96孔V型微量反应板，用微量移液器在1孔—4孔均加入0.025mLPBS，做4个平行样本，换滴头；
②吸取4HAU混匀的抗原0.025mL加入第1孔中，混匀，从第1孔吸取0.025mL加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025mL弃之，换滴头；
③每孔均加入0.025mL体积分数为1％鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液；
④振荡混匀，在20℃—25℃室温下静置20min后观察结果，将反应板倾斜，观察红细胞凝集孔的个数并记录。
3.根据权利要求2所述的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：步骤①中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。
4.根据权利要求2所述的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：步骤③中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。
5.根据权利要求2所述的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：步骤③中0.75％鸡醛化红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：将新鲜红细胞用0.1mol/L PBS液充分洗涤5次，每次以3000r/min离心4min，最后1次用红细胞压缩体积的10倍PBS液洗涤，且3000r/min离心10min，去上清；按沉积红细胞的8倍量加入冷至4℃的36％甲醛溶液混合均匀，放置4℃作用24h，其间不断轻摇振荡；取出后再按沉积红细胞1份加2份冷至4℃的30％甲醛溶液混匀，4℃作用24h，然后用PBS液洗涤5次，配制0.75％醛化红细胞液，加入终浓度0.1％叠氮钠4℃备用。
6.根据权利要求4所述的一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，其特征在于：所述阿氏液的配制方法包括如下步骤：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。
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