CN115656519B - 一种可降低非特异性影响流感疫苗血清效价的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可降低非特异性影响流感疫苗血清效价的评价方法。具体地，本发明涉及一种改善的血凝抑制试验方法以及其在检测受试者血清抗体中的用途。另一方面，本发明提供了一种评估流感疫苗血清效价的方法。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测的技术领域。具体地，本发明涉及一种改善的血凝抑制试验以及其在检测受试者血清抗体中的用途。
背景技术
血凝抑制试验是开展免疫程序制定及免疫效果监测等的主要手段之一。其免疫保护效果以血凝抑制(HI)抗体滴度作为免疫原性评价指标。血凝抑制试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法之一。
血凝抑制试验中由于涉及红细胞凝集及抗原-抗体的特异性反应，试验本身非特异性较差，而且多数动物血清、体液、组织液中均存在抑制素，与红细胞表面受体存在相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合，影响该方法用于评价血清中流感病毒特异性中和抗体，表现为未免疫疫苗的动物血清流感病毒中和抗体测值较高，严重干扰用该方法评价疫苗的有效性，使得血凝抑制试验方法可在非临床试验或临床试验研究评价中不能发挥其作用。所以必须将非特异性抑制素去除干净，才能准确地测定血清中流感病毒特异性抗体效价。血凝抑制(HI)试验本身由于步骤繁多，试验过程也常受多种因素影响，容易造成偏差。
为了克服现有技术中的缺陷，本发明旨在提供一种可降低非特异性影响的流感疫苗血清效价评价方法，实现该方法适用于不同物种免疫前后血清中流感病毒特异性抗体的检测。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种改善的血凝抑制试验方法，其包括以下步骤:
1)提供包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液，
2)去除待检测样品中的非特异性抑制素，优选地，通过加入霍乱滤液和白羽鸡红细胞去除非特异性抑制素；
3)使用步骤1)中的红细胞悬液制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原，和
4)进行红细胞凝集抑制试验。
在具体的实施方案中，本发明的红细胞悬液为1％的白羽鸡红细胞悬液。
在具体的实施方案中，所述红细胞悬液通过以下步骤制备：
1.1)获得来自白羽鸡的全血，
1.2)将步骤1.1)中获得的全血与阿氏液混合，所述阿氏液为包含葡萄糖2.05g/100ml、柠檬酸钠0.8g/100ml、柠檬酸0.055g/100ml和氯化钠0.42g/100ml的水溶液，pH6.1，经高压灭菌后2-8℃保存；
1.3)将步骤1.2)的混合物在2～8℃、2800rpm/分钟，离心10分钟，弃去上清后，加入0.9％氯化钠溶液，然后再在2～8℃、2800rpm/分钟，离心10分钟，弃去上清，重复该操作过程至少3次，得到白羽鸡红细胞；
1.4)将步骤1.3)中的白羽鸡红细胞加入到0.9％氯化钠溶液中。
在具体的实施方案，通过以下步骤去除待检测样品中的非特异性抑制素：
2.1)向1倍体积的待检测样品中加入3倍体积的霍乱滤液，在37℃条件下水浴18-20小时，然后置56℃水浴30～60分钟；
2.2)加入0.5倍体积的白羽鸡红细胞，混匀，在2-8℃反应过夜；和
2.3)2000rpm/分钟，离心5分钟，吸取上清液，获得去除非特异性抑制素的待检测样品。
在本发明的具体实施方案中，所述待检测样品为受试者体液或组织液，优选地，所述待检测样品为受试者血清或待分离血浆。
在本发明的具体实施方案中，所述受试者可以是任何哺乳动物，包括但不限于人、大鼠、小鼠、猪、豚鼠等。
在本发明的具体实施方案中，所述待检测样品是免疫前或免疫后的免疫动物血清。
在具体的实施方案中，通过以下步骤制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原：
3.1)在96孔板中用生理盐水对抗原或病毒液进行系列倍比稀释，并包括生理盐水的阴性对照；优选地，在稀释步骤中采用固定稀释混匀吹打至少15次，稀释时每更换一列即更换枪头的操作；
3.2)每孔加入等体积的1％包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液，使反应物混合均匀，20～25℃下静置45～55分钟，读取抗原的血凝滴度；
3.3)根据血凝滴度结果用生理盐水稀释为4个血凝单位病毒液，其中能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为该抗原的血凝滴度，设定为1个血凝单位，4倍最高稀释度即为4个血凝单位；和
3.4)对4个血凝单位的病毒液需按照血凝滴度法回滴，确定是否为4个血凝单位，若不足或高于4个血凝单位，则需补加或稀释直至病毒液经回滴为4个血凝单位为止。
在具体的实施方案中，用于制备红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原的抗原或病毒液为流感病毒的抗原或病毒液，包括H1N1、H3N2、Bv(B/Victoria)和By(B/Yamagata)中的一种或多种。
在本发明的具体实施方案中，对于一些分型的病毒，例如，甲型流感病毒，在用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原制备完成60分钟内进行红细胞凝集抑制试验；对于一些分型的病毒，例如，乙型流感病毒，在120分钟内进行红细胞凝集抑制试验。
在具体的实施方案中，在无菌级的一次性96孔微量反应板中使用包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液进行红细胞凝集抑制试验。
在另一方面，本发明提供了改善的血凝抑制试验用于检测受试者血清中流感病毒抗体效价中的用途，尤其是用于评估流感疫苗血清效价中的用途。
在具体的实施方案中，本发明的方法可用于评估二价、三价、或四价流感疫苗的血清效价。
在另一方面，本发明提供了一种评估流感疫苗血清效价的方法，所述方法包括：
1)获得流感疫苗免疫前、免疫后的受试者血清，优选地，所述受试者为人或非人哺乳动物，优选地，所述受试者为人、大鼠、小鼠、猪、豚鼠；
2)提供包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液；
3)去除步骤1)中获得的受试者血清中的非特异性抑制素；优选地，通过加入霍乱滤液和白羽鸡红细胞去除非特异性抑制素；
4)使用步骤2)中的红细胞悬液制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原，所述抗原为H1N1、H3N2、Bv和By中的一种或多种，和
5)在无菌级的一次性96孔微量反应板中使用包含白羽鸡红细胞的红细胞液进行红细胞凝集抑制试验；其中对于甲型流感病毒，在步骤4)完成60分钟内进行步骤5)；对于乙型流感病毒，在步骤4)完成120分钟内进行步骤5)。
附图说明
图1.样品A血凝滴度变化
图2.样品B血凝滴度变化
图3.样品C血凝滴度变化
图4.样品D血凝滴度变化
具体实施方式
具有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，其是一种测定抗原或抗体的技术。即加入特异性抗体或特异性抗原后，使原有的血凝反应被抑制。血凝抑制试验常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型，或者用于对一般人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。
示例性地，在目前本领域中通常使用的血凝抑制试验包括以下步骤：
S1.血清中非特异性抑制素的去除；
所谓非特异性抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合，必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净，才能准确地测定出的抗体效价。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液(RDE，受体破坏酶的一种)清除法，过碘酸钾清除法等。
S2.制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原；
在S2步骤中包括：
S2.1.在96孔板中用生理盐水对抗原或病毒液进行系列倍比稀释，并包括生理盐水的阴性对照；然后，每孔加入等体积的1％鸡红细胞，使反应物混合均匀，20～25℃下静置30分钟，读取抗原的血凝滴度。能使红细胞完全凝集(100％凝集，++)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝滴度，为1个血凝单位(HAU)。
S2.2.根据血凝滴度结果用生理盐水稀释为4个血凝单位病毒液待用(以出现++血凝的血凝素最高稀释度中所含病毒量为1个血凝单位，则4倍最高稀释度即为4个血凝单位)，4个血凝单位的病毒液需按照血凝滴度法回滴，确定是否为4个血凝单位，若不足或高于4个血凝单位，则需补加或稀释直至病毒液经回滴为4个血凝单位为止。
S3.红细胞凝集抑制试验具体步骤如下：
将96孔板U型微量反应板第2至11列中各加入25μl生理盐水，第12列加入50μl生理盐水。在第一列中再分别加入不同编号的待测动物血清25μl，由2至10列做2倍稀释血清处理，至第10列时，弃掉25ul混合液。第1至11列每孔加入4血凝单位病毒液25ul，混匀，室温孵育1小时。每孔加入25ul 1％红细胞悬液，混匀。室温孵育30分钟后，观察血凝抑制结果。
S4.结果判定：出现完全不凝集的血清最高稀释度为该血清凝集抑制效价。以“++++，+++，++，+，－”表示，结果判断标准见表1。
表1血凝抑制试验结果判断标准
为解决血凝抑制试验方法在本研究中存在的问题。分析问题产生的原因，该方法程序复杂，涉及因素较多，如用于结合血凝素的红细胞，其来源物种如受病原微生物感染则对检测结果的影响显著；同时检测过程需对血清样品进行前处理，前处理的方法不一，各有优劣；再者，方法所需的反应时间及测定效价用的标准抗原的配制及其配制后可存放的时间都对检测结果有影响。因此下列试验中分别从以下方面对血凝抑制实验进行了改进：
①使用不同物种来源的红细胞
②比较血清样品不同的前处理方法
③血凝效价测定结果的有效时间确认
④4单位抗原的稳定性研究
⑤不同级别反应板选择
⑥稀释操作
对上述诸多因素进行试验探究，摸索可最大限度影响该试验结果的主要因素，并且消除不同物种的血清基质干扰的影响，提高流感疫苗评价效价方法的适用性和可靠性。
实施例1.红细胞使用及血凝效价测定结果的孵育有效时间确认
根据《全国流感监测技术指南》(2017版)对季节性流感监测工作的指导建议，在监测工作中推荐使用火鸡红细胞、豚鼠红细胞及人“O”型血红细胞进行红细胞凝集抑制试验。在血凝抑制试验操作中，S2与S3中的4个血凝单位病毒液制备及血凝抑制试验均需使用到1％红细胞悬液，因各动物的红细胞的种属大小形态略有差异，故凝集速度时间均不一致，根据各红细胞在一定时间内凝集的变化趋势，探究其最稳定的凝集时间。
本研究选择来源不同的选用5种动物红细胞(种鸡、白羽鸡、SPF鸡、火鸡和豚鼠)悬液分别对流感4种型别的病毒液(H1N1、H3N2、Bv、By)进行血凝滴度试验。将5种动物血清按“试液准备”中3、4分别制备成5种不同来源的1％红细胞悬液，同时对4个型别的流感病毒液(H1N1、H3N2、Bv、By)按照S2制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原，血凝滴度试验中记录25min～55min内各红细胞的血凝滴度结果。
其中，试液制备步骤包括：
1)阿氏液：葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g于适量的纯化水中，溶解后，调pH值至6.1后定容至100ml，经高压灭菌后2-8℃保存；
2)生理盐水：称取0.9g氯化钠溶于纯化水中，待溶解充分后定容至100ml。
3)红细胞悬液预处理：取适量全血至阿氏液中充分混合，2～8℃2800rpm/分钟，离心10分钟，弃去上清后，补加0.9％氯化钠溶液，2～8℃，2800rpm/分钟，离心10分钟，弃去上清，重复该操作过程至少3次，将所得的鸡红细胞存于2～8℃保存。
4)1％红细胞悬液制备：取经上述3)洗涤后的红细胞压积悬液1ml，加入0.9％氯化钠溶液定容至100ml。在25～55min内发现豚鼠红细胞悬液的阴性对照孔均未凝集故不采纳豚鼠红细胞悬液的血凝结果，其余不同来源的红细胞均发生凝集反应，随着时间的推迟，红细胞凝集随之发生变化，统计各组红细胞变化的趋势，其中1％火鸡红细胞在孵育35～55min内、1％SPF鸡红细胞在孵育30～55min内、1％白羽鸡红细胞在孵育45～55min内、1％种鸡红细胞在孵育35～55min内均反应结果恒定，未再随反应时间延长而结果升高，4组样品在不同红细胞悬液变化趋势图见图1～图4。根据上述各不同来源的红细胞凝集时间确认研究固定各来源的红细胞悬液测定血凝抑制结果的有效时间，接下来的研究中固定4种不同来源的红细胞读数时间：1％火鸡红细胞在孵育至40min读数；1％SPF鸡红细胞在孵育至40min读数；1％白羽鸡红细胞在孵育至45min读数；1％种鸡红细胞在孵育至40min读数。
实施例2.血清前处理方法
抑制素存在于动物血清、体液、组织液中，所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。所以必须将非特异性抑制素去除干净，才能准确地测定出抗体效价，同时为血凝抑制试验选择最佳来源的红细胞。
本实验中选取Wistar大鼠、Balb/c小鼠免疫流感疫苗前、免疫28天后血清，其他条件不变，分别采用两种血清处理方法对动物血清中的非特异性抑制素去除。具体处理方法见表2。
表2.2种血清处理方法
采用血凝抑制试验方法检测上述处理后的血清，血凝抑制试验中使用经血凝滴度确认后的4种1％红细胞悬液(种鸡、白羽鸡、SPF鸡、火鸡)进行试验，结果见表3。
表3.2种血清处理方法检测血凝抑制试验结果比对
结果显示，不同种类的动物血清在改良前的方法处理后，动物血清中抑制素在经霍乱滤液处理后，霍乱滤液对血清中非特异性因素去除的效果不一致，部分动物血清中的非特异性抑制素并未完全去除彻底。采用改良后的方法处理后的动物血清，用4种来源不同的红细胞对其检测，其中1％白羽鸡红细胞悬液检测其免疫前的动物血清抗体效价最低，在＜1:8～1:16范围内，并且能准确的检测出免疫28天后的血清中H1N1型抗体效价。
结果表明，不同来源的动物血清在经改良后处理血清的方式，并结合采用白羽鸡红细胞悬液检测血凝抑制试验，能够有效的解决不同动物血清中非特异性干扰血凝试验结果的影响。
实施例3.4单位抗原(HAU)的稳定性研究
在血凝抑制试验中4单位抗原配制是极其重要的环节，其准确性对试验结果有重要的影响。4单位抗原需现用现配，而在配制完成后的单位浓度会随着时间的延长而改变，抗原浓度低时，HI抗体效价就会升高，反之则降低。所以4单位的抗原在配置完成后的单位浓度稳定性至关重要。可确保4单位抗原能在有效时间内使用，保证血凝抑制数据有效可控。4个血凝单位抗原的具体制备步骤如下详述：
在96孔板中用生理盐水对抗原或病毒液进行系列倍比稀释，并包括生理盐水的阴性对照；
每孔加入等体积的1％白羽鸡红细胞的红细胞悬液，使反应物混合均匀，20～25℃下静置45～55分钟，读取抗原的血凝滴度；
根据血凝滴度结果用生理盐水稀释为4个血凝单位病毒液，其中能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为该抗原的血凝滴度，设定为1个血凝单位，4倍最高稀释度即为4个血凝单位；和
对4个血凝单位的病毒液需按照血凝滴度法回滴，确定是否为4个血凝单位，若不足或高于4个血凝单位，则需补加或稀释直至病毒液经回滴为4个血凝单位为止。
本实验分别对流感疫苗中的H1N1型、H3N2型、Bv型、By型4个单位的抗原在完成配置，并经校对单位符合要求后监测其在2～8℃储存条件下保存的不同时间点的抗原单位变化，各型4单位抗原的稳定性数据结果见表4。
表4.各型4HAU抗原稳定性数据
结果表明，配置完成后不同型别的4单位的抗原在会随着时间延长，抗原单位有所下降，根据实验结果得出结论，H1N1型和H3N2型的4个血凝单位病毒液在配置完成后需在60min内使用，Bv型和By型的4个血凝单位病毒液在配置完成后需在120min内使用，超出该时间需再次对其浓度复核，符合单位要求后再使用。
实施例4.不同级别的反应板选择
血凝抑制试验中使用的96孔U型板分为2种洁净级别，普通级和无菌级，为排除由于反应板的洁净程度所带来的实验结果的偏差，现对2种不同洁净级别的反应板同时开展试验，取经改良方法处理后的动物血清，编号1-10为小鼠免疫前血清，11-15为小鼠免疫四价流感疫苗后28天血清。分别在普通级、无菌级的一次性96孔微量反应板中同时对血清血凝抑制抗体效价进行检测，将2组的数据结果进行统计学分析，组间无显著性差异(P＝0.93，P＞0.05)，结果见表5。
表5.不同级别的反应板血凝效价结果
结果表明，采用普通级的一次性96孔微量反应板与无菌级的一次性96孔微量反应板同时对一组动物血清样品检测，对小鼠免疫前血清检测后，普通级一次性96孔微量反应板的小鼠抗体滴度在＜1:8～1:16范围内，无菌级一次性96孔微量反应板的小鼠抗体滴度均在＜1:8，免疫后的血清抗体效价中，使用普通级的反应板检测血凝抑制抗体，在1:128～1:896范围内，使用无菌级的反应板检测血凝抑制抗体，在1:192～1:512范围内。统计学分析组间差异，无显著性差异(P＝0.64，＞0.05)。考虑到小鼠免疫前小鼠的抗体效价，无菌级的反应板在检测血凝抑制试验中相对稳定，所以在血凝抑制试验中需使用无菌级的一次性96孔反应板开展试验。
实施例5.稀释过程操作细节
在血凝抑制试验中，存在大量的稀释步骤，在4单位的抗原配制和测定血清样品抗体效价等均有稀释步骤，为确保稀释操作对试验的影响，本研究设计两种不同的稀释操作方法分别进行血凝抑制试验，结果见表6。
表6.不同稀释操作的血凝抑制结果
结果显示，小鼠免疫前的抗体效价均＜1:8，小鼠免疫后的血清在稀释步骤中运用“固定稀释混匀吹打至少15次，稀释时每更换一列即更换枪头”时的抗体效价在1:1792～1:2048范围内，而运用“固定稀释混匀吹打5次，稀释时不更换枪头”时的抗体效价在1:896～1:1792,，采用两种不同的稀释操作检测小鼠血清抗体效价中，在小鼠免疫前血清中影响不大，但在小鼠免疫后血清中抗体效价值高的情况下差异较大，吹打5次的抗体效价＜吹打15次的抗体效价，考虑到可能由于吹打5次的血清在稀释中并未混合均匀。故在稀释操作中采用“固定稀释混匀吹打至少15次，稀释时每更换一列即更换枪头”运用到血凝抑制试验操作中。在过程中必须确保样品混合均匀，同时稀释过程操作稳定，吹打时速度不可过快，防止稀释液溢出，导致结果异常。
实施例6.反应温度
在血凝抑制试验中，对血凝抑制试验方法S3中加入4单位血凝单位病毒液孵育反应及加入1％红细胞悬液反应温度进行研究，取不同组别的小鼠血清，经上述已摸索的最佳条件试验，分别在室温、20～25℃条件下分别孵育反应，结果见表7。
表7.不同反应温度的血凝抑制结果
在原有方法稀释操作中进行室温反应，其中小鼠在免疫前的血清效价在＜1:8～1:20范围内，免疫后在1:96～1:256范围内；经改良后在20～25℃的恒温箱中反应，小鼠在免疫前的血清效价均＜1:8，免疫后在1:112～1:128范围内。从小鼠免疫前的血清效价可以看出，在20～25℃条件下反应的结果更加稳定可靠，故在血凝抑制试验中反应孵育需在20～25℃条件下最佳。
实施例7.降低非特异性反应因素方法的验证
为验证以上改良节后试验得到的结果，采用以上经一系列实验摸索得到的方法分别对小鼠、大鼠、豚鼠、猪、人的血清免疫前及免疫后的血清进行血凝效价检测。小鼠免疫前H1N1型抗体效价均＜1:8，免疫28天后H1N1型抗体效价在1:256-1:512范围内；大鼠免疫前H1N1型抗体效价＜1:8-1：12，免疫28天后H1N1型抗体效价在1:256-1:448范围内；豚鼠免疫前H1N1型抗体效价均＜1:8，免疫28天后H1N1型抗体效价在1:64-1:256范围内；仔猪免疫前H1N1型抗体效价均1:12-1:32，免疫28天后H1N1型抗体效价在1:128-1:448范围内；成人免疫前H1N1型抗体效价＜1:8-1:16，免疫28天后H1N1型抗体效价在1:256-1:320范围内结果见表8。
表8.不同物种的免疫前、后血清采用改良后方法测定效价结果
结果表明，对研究后试验条件进行验证，结果与研究试验中的结论一致，采用以上经一系列摸索得到的实验方法检测不同物种的血清抗体效价，可有效的降低啮齿类、猪、人血清中的非特异性抑制素的影响，经改良后该方法可有效的评价流感疫苗的免疫原性，方法更加稳定可靠。
综上所述，在血凝抑制试验中使用采用白羽鸡红细胞悬液对经霍乱滤液和红细胞处理后的血清样品进行血凝抑制试验，能够有效的降低动物血清中的非特异性干扰，提高血清中抗体效价检测的准确度。而确保浓度为4单位抗原配制完成时间内的使用、对不同级别的反应板的选择、固定实验中的稀释操作、稀释过程的吹打次数、反应过程的温度，在规范运用该试验检测动物血清效价过程中，也能够规避并消除大多数的不利因素，减少误差，保证试验结果的准确性。
Claims (18)
1.一种改善的血凝抑制试验方法，其包括以下步骤：
1）提供包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液；
2）通过加入霍乱滤液和白羽鸡红细胞去除待检测样品中的非特异性抑制素；
3）使用步骤1）中的红细胞悬液制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原，和
4）进行红细胞凝集抑制试验。
2.根据权利要求1所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液为1%的红细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述红细胞悬液通过以下步骤制备：
1.1）获得来自白羽鸡的全血；
1.2）将步骤1.1）中获得的全血与阿氏液混合，所述阿氏液为包含葡萄糖2.05g/100ml、柠檬酸钠0.8g/100ml、柠檬酸0.055g/100ml和氯化钠0.42g/100ml的水溶液，pH6.1，经高压灭菌后2-8℃保存；
1.3）将步骤1.2）的混合物在2~8℃以2800rpm/分钟离心10分钟，弃去上清后，加入0.9%氯化钠溶液，然后再在2~8℃以2800rpm/分钟离心10分钟，弃去上清，重复该操作过程至少3次，得到白羽鸡红细胞；和
1.4）将步骤1.3）中的白羽鸡红细胞加入到0.9%氯化钠溶液中。
4.根据权利要求1所述的改善的血凝抑制试验方法，其中通过以下步骤去除待检测样品中的非特异性抑制素：
2.1）向1倍体积的待检测样品中加入3倍体积的霍乱滤液，在37℃条件下水浴18-20小时，然后置56℃水浴30~60min；
2.2）加入0.5体积的白羽鸡红细胞，混匀，在2-8℃过夜反应；和
2.3）2000rpm/分钟，离心5分钟，吸取上清液，获得去除非特异性抑制素的待检测样品。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述待检测样品为受试者体液。
6.根据权利要求5所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述待检测样品为受试者组织液。
7.根据权利要求5所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述待检测样品为受试者血清或待分离血浆。
8.根据权利要求5所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述受试者选自人、大鼠、小鼠、猪和豚鼠。
9.根据权利要求1所述的改善的血凝抑制试验方法，其中通过以下步骤制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原：
3.1）在96孔板中用生理盐水对抗原或病毒液进行系列倍比稀释，并包括生理盐水的阴性对照；
3.2）每孔加入等体积的1%包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液，使反应物混合均匀，20~25℃下静置45~55分钟，读取抗原的血凝滴度；
3.3）根据血凝滴度结果用生理盐水稀释为4个血凝单位病毒液，其中能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为该抗原的血凝滴度，设定为1个血凝单位，4倍最高稀释度即为4个血凝单位；和
3.4）对4个血凝单位的病毒液需按照血凝滴度法回滴，确定是否为4个血凝单位，若不足或高于4个血凝单位，则需补加或稀释直至病毒液经回滴为4个血凝单位为止。
10.根据权利要求9所述的改善的血凝抑制试验方法，其中用于制备红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原的抗原或病毒液为流感病毒的抗原或病毒液。
11.根据权利要求10所述的改善的血凝抑制试验方法，其中所述流感病毒的抗原为H1N1、H3N2、Bv和By中的一种或多种。
12.根据权利要求1所述的改善的血凝抑制试验方法，其中在无菌级的一次性96孔微量反应板中使步骤3）的4个血凝单位抗原与步骤1）的红细胞悬液在20~25℃的条件下孵育进行步骤4）的红细胞凝集抑制试验。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的改善的血凝抑制试验方法用于评估流感疫苗血清效价的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述流感疫苗为二价、三价或四价流感疫苗。
15.一种评估流感疫苗血清效价的方法，所述方法包括：
1）获得流感疫苗免疫前和免疫后的受试者血清；
2）提供包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液；
3）通过加入霍乱滤液和白羽鸡红细胞去除步骤1）中获得的受试者血清中的非特异性抑制素；
4）使用步骤2）中的红细胞悬液制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位抗原，所述抗原为H1N1、H3N2、Bv和By中的一种或多种，和
5）在无菌级的一次性96孔微量反应板中使用包含白羽鸡红细胞的红细胞液进行红细胞凝集抑制试验；其中对于甲型流感病毒，在步骤4）完成60分钟内进行步骤5）；对于乙型流感病毒，在步骤4）完成120分钟内进行步骤5）。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者为人或非人哺乳动物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者为人、大鼠、小鼠、猪和豚鼠。
18.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤5）中，在20~25℃的条件下使步骤4）中的4个血凝单位抗原与1%的步骤2）中的包含白羽鸡红细胞的红细胞悬液孵育进行红细胞凝集抑制试验。
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