CN115267203A - 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用 - Google Patents

一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115267203A
CN115267203A CN202210920368.4A CN202210920368A CN115267203A CN 115267203 A CN115267203 A CN 115267203A CN 202210920368 A CN202210920368 A CN 202210920368A CN 115267203 A CN115267203 A CN 115267203A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sheep
brucellosis
serum
positive
ielisa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210920368.4A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋卉
丁家波
张广智
范学政
沈青春
鑫婷
梁琳
李松励
秦彤
汤新明
梁瑞英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN202210920368.4A priority Critical patent/CN115267203A/zh
Publication of CN115267203A publication Critical patent/CN115267203A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/23—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Brucella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用。所述该检测方法由布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成。采用布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病补体结合试验(CFT)检测灵敏度一致，并最终以血清中羊布鲁氏菌病特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL作为阳性临界值判定标准。该方法对同一份羊血清分别用布病iELISA和cELISA检测，可准确将待检羊分为布病阴性羊、布病可疑羊和布病阳性羊，为实施布病净化提供便捷有效的方法。

Description

一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用，属免疫检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，可感染人、多种家畜和野生动物，主要表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损伤等。我国自2000年之后，不管是人间还是畜间的布病发生率均呈逐年上升趋势，流行病学调查显示目前我国布鲁氏菌流行菌株多为羊种布鲁氏菌，患病羊是布病的主要传染源之一。
布病防控面临主要难点在于不能精准剔除阳性动物，导致传染源在群体中的长期存在，布病净化难以实现，因此建立快速准确的诊断方法对于布病防控至关重要。现有的布病诊断方法中，间接ELISA(iELISA)可检测血清中布鲁氏菌特异性IgG抗体，适用于布病的确诊；竞争ELISA(cELISA)可同时检测血清中特异性IgM和IgG抗体，适用于布病的初筛。本发明利用上述两种方法检测抗体类型的差异，通过布病阳性血清国家标准品统一两种方法的检测灵敏度，建立一种通过检测布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量对布病非免疫羊实现准确判定的方法。
申请人已成功开发了羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒(专利号：ZL201611023727.7)和布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒(国家三类新兽药证书：(2016)新兽药证字6号)。以此为基础，通过布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)对两种试剂盒进行检测灵敏度定量，使两种检测方法的检测灵敏度均为血清中布鲁氏菌特异性抗体含量不低于50IU/mL为阳性。同时其检测灵敏度与布病诊断金标准补体结合试验(CFT)的检测灵敏度保持一致，保证检测结果的准确性。对于同一份血清样品同时进行iELISA和cELISA的检测，根据两者的检测结果最终判定阳性、可疑与阴性，从而便于精准剔除布病阳性羊，快速实现布病净化的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确性高、操作简便的检测布病阳性羊的方法。
本发明的技术方案为：
1.一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于该方法由特定布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成；采用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病诊断金标准CFT方法的检测灵敏度一致，均以血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL为阳性临界值判定标准。
2.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于采用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量。
3.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病阳性血清国家标准品制备与含量测定方法为：
用2mL布鲁氏菌疫苗株S2灭活抗原(4.0×1010CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的羊。初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用CFT试验测定其效价应不低于1000IU/mL。用布病阴性血清将阳性血清稀释至CFT效价为1000IU/mL，加入proclin300至终浓度为0.05％，无菌分装，冻干后置-20℃保存。
4.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量不低于50IU/mL为阳性。
5.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度的定量方法为：
用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μL/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30分钟。每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次。将鼠抗羊IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。在酶标仪下测定OD450nm值，计算P％值，确定iELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
6.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL为阳性。
7.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度的定量方法为：
用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μL/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μL，同时加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，振荡5分钟。37℃作用30分钟。每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次。将羊抗鼠IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。在酶标仪下测定OD450nm值，计算PI％值，确定cELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
8.本发明所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法在布病非免疫羊群中的应用，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品的处理：取羊全血，待血液凝固后，以4000r/分钟离心10分钟，收集上清，血清应清亮，无溶血。
(2)取处理好的血清样品分别按权利要求5和7所述方法进行iELISA和cELISA。
(3)结果判定规则为：当血清样品iELISA和cELISA检测均为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病阳性羊；当血清样品iELISA和cELISA检测均为阴性(－)时，其对应的羊判定为布病阴性羊；当血清样品iELISA检测为阳性(+)，cELISA检测为阴性(－)时，或者血清样品iELISA检测为阴性(－)，cELISA检测为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病可疑羊；可疑羊需在1个月后再次采样进行检测，最终以iELISA检测结果判定为布病阳性/阴性羊。
本发明的有益效果
本发明通过检测布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量实现对布病非免疫羊判定的方法，可用于布病阳性群体中阳性羊的准确剔除。本发明的优势在于通过布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病诊断金标准CFT方法的检测灵敏度一致，提高了方法的准确性。在同一检测灵敏度条件下，通过iELISA和cELISA同时检测血清样品中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM的含量，区分布病阳性羊、可疑羊和阴性羊。
附图说明
图1为本发明方法的结果判定示意图。
具体实施方式
1.本发明建立了一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法。
其核心是利用布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)将布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度定量为血清中布鲁氏菌特异性抗体含量不低于50IU/mL为阳性。将一份血清样品进行iELISA和cELISA试验，同时测定血清样本中布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量，用于区分布病阳性羊、可疑羊和阴性羊。
本发明所提供的上述通过检测布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量对布病非免疫羊实现准确判定的方法，包括以下步骤：
(1)所述布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)，其制备方法为：
1)用2mL布鲁氏菌疫苗株S2灭活抗原(4.0×1010CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的羊。
2)初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用CFT试验测定其效价应不低于1000IU/mL。
3)用布病阴性羊血清将阳性血清稀释至CFT效价为1000IU/mL，加入proclin300至终浓度为0.05％，无菌分装，冻干后置-20℃保存。
(2)所述布病iELISA方法及其检测灵敏度的定量方法为：
1)用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。
2)加入封闭液(含3％明胶的0.01MpH7.4的PBS)200μL，2～8℃封闭24小时。
3)以洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。
4)将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30分钟。
5)取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次，最后1次甩干或拍干。
6)将鼠抗羊IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟。洗涤3次，甩干。
7)加入底物显色液100μL/孔，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。
8)反应终止后，15分钟内在酶标仪下测定OD450nm值。
9)计算P％值，确定iELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
(3)所述布病cELISA方法及其检测灵敏度的定量方法为：
1)用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。
2)加入封闭液(含3％明胶的0.01MpH7.4的PBS)200μL，2～8℃封闭24小时。
3)以洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。
4)将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL，各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μL。加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，振荡5分钟。37℃作用30分钟。
5)取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次，最后1次甩干或拍干。
6)将羊抗鼠IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟。洗涤3次，甩干。
7)加入底物显色液100μL/孔，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。
8)反应终止后，15分钟内在酶标仪下测定OD450nm值。
9)计算PI％值，确定cELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
(4)所述检测布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量实现对布病非免疫羊准确判定的方法，按照如下步骤进行：
1)样品处理：取羊全血，待血液凝固后，以4000r/分钟离心10分钟，收集上清，血清应清亮，无溶血。
2)取处理好的血清样品分别按上述方法进行iELISA和cELISA。
3)结果判定规则为：当血清样品iELISA和cELISA检测均为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病阳性羊；当血清样品iELISA和cELISA检测均为阴性(－)时，其对应的羊判定为布病阴性羊；当血清样品iELISA检测为阳性(+)，cELISA检测为阴性(－)时，或者血清样品iELISA检测为阴性(－)，cELISA检测为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病可疑羊；可疑羊需在1个月后再次采样进行检测，最终以iELISA检测结果判定为布病阳性/阴性羊。
2.本发明的检测原理
当含有布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM的羊血清样品进行iELISA和cELISA时，如血清样品中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量≥50IU/mL，且IgG和IgM总含量≥50IU/mL时，iELISA和cELISA检测均为阳性(+)；如血清样品中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量＜50IU/mL，但IgG和IgM总含量≥50IU/mL时，iELISA检测为阴性(－)，cELISA检测为阳性(+)。当血清中不含有布鲁氏菌特异性抗体，或者IgG和IgM总含量＜50IU/mL，iELISA和cELISA检测均为阴性(－)。
具体实施方式
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——用布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)测定iELISA和cELISA方法的检测灵敏度
1.布病阳性血清标准品的稀释：用1mL生理盐水将布病阳性血清标准品复溶。再用生理盐水将血清进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL。
2.采用iELISA、cELISA和CFT分别检测5个不同稀释度布病阳性血清标准品，每个稀释度重复3次，结果取其平均值，确定各方法的检测灵敏度。检测方法的判定标准如下：羊布病iELISA判定标准为P％值≥15％时，为羊布病抗体阳性(+)；P％值＜15％时，为羊布病抗体阴性(－)。布病cELISA判定标准为PI％值≥30％时，为布病抗体阳性(+)；PI％值＜30％时，为布病抗体阴性(－)。CFT判定标准为100％溶血为布病抗体阴性(－)；50％～90％溶血为布病抗体可疑(+)；0～40％溶血为布病抗体阳性(+)。
3.检测方法灵敏度测定结果见表1。iELISA、cELISA和CFT方法的检测灵敏度结果一致，即布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50IU/mL)均检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)均检测为阴性。
表1检测方法灵敏度检测结果
Figure BDA0003777082910000061
Figure BDA0003777082910000071
实例2——检测布鲁氏菌特异性IgG和IgM含量对布病非免疫羊实现准确判定的方法之临床验证试验
1.2019年12月申请人实验室接受江苏某肉羊企业454只布病非免疫羊的确诊委托试验，实验室按本发明所述iELISA和cELISA方法进行检测，检测方法的判定标准如下：羊布病iELISA判定标准为P％值≥15％时，为羊布病抗体阳性(+)；P％值＜15％时，为羊布病抗体阴性(－)。布病cELISA判定标准为PI％值≥30％时，为布病抗体阳性(+)；PI％值＜30％时，为布病抗体阴性(－)。结果iELISA方法检出25份阳性，429份阴性；cELISA方法检出31份阳性，423份阴性。其中iELISA与cELISA共同检测的阳性样本为25份，cELISA阳性但iELISA阴性的样本6份，iELISA与cELISA共同检测的阴性样本为423份。进一步通过CFT对454份样本进行了确认检测，结果CFT同样检测到25份阳性样本，且编号与iELISA检测结果完全一致。本发明申请人做出了：25只阳性羊、423只阴性羊、6只可疑羊的检测结论。建议企业立即淘汰阳性羊，隔离可疑羊，做好日常消毒，可疑羊禁止配种的建议。同时要求企业2个月之后，待潜在的布病阳性羊暴露之后再次全群采样进行确诊。
2.2020年1月，企业将全群429份羊血清(包括第一次检测为阴性的423只羊及可疑的6只羊)送专利申请人实验室再次诊断。根据iELISA和cELISA检测结果，从423头阴性羊中再次检测出5只布病阳性羊，2只布病可疑羊；从6只第一次检测为可疑的羊中确诊了3只为布病阳性羊，3只阴性羊。申请人做出了：淘汰8只阳性羊及2头可疑羊的建议，做好日常消毒。要求3个月之后再次全群检测。第二次检测结果初步确定第一次诊断的准确性达到98.82％(418/423)。
3.2020年4月，企业将全群419份羊血清再次采用送专利申请人检测确认，本次检测结果为iELISA全部为阴性，cELISA全部为阴性。申请人认为该企业已经实现了布病净化，但需做好日常消毒，建议3个月之后再次全群采样，确认是否实现布病净化。
4.2020年7月，企业将全群419份羊血清采样送申请人再次检测。本次检测结果为iELISA全部为阴性，cELISA全部为阴性。申请人再次用CFT试验进行确认，结果同样为阴性。至此，该企业实现了布病净化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于该方法由特定布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成；采用布病阳性血清国家标准品(羊源，含量1000IU/mL)对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病CFT方法的检测灵敏度一致，均以血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL作为阳性临界值判定标准。
2.如权利要求1所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于采用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量。
3.如权利要求2所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病阳性血清国家标准品制备与含量测定方法为：
用2mL布鲁氏菌疫苗株S2灭活抗原(4.0×1010CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的羊；初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次；加强免疫后2周采血，用CFT试验测定其效价应不低于1000IU/mL；用布病阴性羊血清将阳性血清稀释至CFT效价为1000IU/mL，加入proclin 300至终浓度为0.05％，无菌分装，冻干后置-20℃保存。
4.如权利要求1和2所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量不低于50IU/mL为阳性。
5.如权利要求4所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度的定量方法为：
用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL；加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时，以洗涤液300μL/孔洗板1次；将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL；各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30分钟；每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次，将鼠抗羊IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟；再次洗涤3次，加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应；在酶标仪下测定OD450nm值，计算P％值，确定iELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
6.如权利要求1和2所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL为阳性。
7.如权利要求6所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度的定量方法为：
用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL；加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时，以洗涤液300μL/孔洗板1次；将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL；各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μL，同时加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，振荡5分钟，37℃作用30分钟；每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次；将羊抗鼠IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟，再次洗涤3次；加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应；在酶标仪下测定OD450nm值，计算PI％值，确定cELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
8.如权利要求1所述一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法在布病非免疫羊群中的应用，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)样品的处理：取羊全血，待血液凝固后，以4000r/分钟离心10分钟，收集上清，血清应清亮，无溶血；
(2)取处理好的血清样品分别按权利要求5和7所述方法进行iELISA和cELISA；
(3)结果判定规则为：当血清样品iELISA和cELISA检测均为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病阳性羊；当血清样品iELISA和cELISA检测均为阴性(－)时，其对应的羊判定为布病阴性羊；当血清样品iELISA检测为阳性(+)，cELISA检测为阴性(－)时，或者血清样品iELISA检测为阴性(－)，cELISA检测为阳性(+)时，其对应的羊判定为布病可疑羊；可疑羊需在1个月后再次采样进行检测，最终以iELISA检测结果判定为布病阳性/阴性羊。
CN202210920368.4A 2022-08-02 2022-08-02 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用 Pending CN115267203A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210920368.4A CN115267203A (zh) 2022-08-02 2022-08-02 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210920368.4A CN115267203A (zh) 2022-08-02 2022-08-02 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115267203A true CN115267203A (zh) 2022-11-01

Family

ID=83747585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210920368.4A Pending CN115267203A (zh) 2022-08-02 2022-08-02 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115267203A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115166238A (zh) * 2022-08-02 2022-10-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278635A (zh) * 2013-05-31 2013-09-04 中国兽医药品监察所 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒
CN106556701A (zh) * 2016-11-14 2017-04-05 中国兽医药品监察所 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN106771182A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 中国兽医药品监察所 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278635A (zh) * 2013-05-31 2013-09-04 中国兽医药品监察所 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒
CN106556701A (zh) * 2016-11-14 2017-04-05 中国兽医药品监察所 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN106771182A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 中国兽医药品监察所 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
马贵达等: "奶牛布鲁氏菌病6 种血清学检测方法对比试验" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115166238A (zh) * 2022-08-02 2022-10-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kolski et al. Etiology of acute childhood encephalitis at The Hospital for Sick Children, Toronto, 1994–1995
Chan et al. Early molecular correlates of adverse events following yellow fever vaccination
CN115267203A (zh) 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用
Lapić et al. Assessment of salivary antibody response to BNT162b2 mRNA COVID‐19 vaccination
De Klerk et al. Comparative evaluation of the enzyme-linked immunosorbent assay in the laboratory diagnosis of brucellosis
CN106771182A (zh) 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒
Abraha et al. Temporal trends and differences of SARS-CoV-2-specific antibody responses in symptomatic and asymptomatic subjects: a longitudinal study from Umbria in Italy
Dub et al. High secondary attack rate and persistence of SARS-CoV-2 antibodies in household transmission study participants, Finland 2020–2021
CN106191286A (zh) 布鲁氏菌的检测方法、试剂盒及其应用
Raja et al. Humoral response to viral vector COVID-19 vaccine in hemodialysis patients
CN107144694A (zh) 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用
CN111983236A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒SARS-COV-2感染的γ干扰素释放方法
Hassan et al. Serological detection of the latent infection of Brucellosis in calves in Mosul city, Iraq
Vanto et al. RAST in the diagnosis of dog dander allergy: a comparison between three allergen preparations using two variants of RAST
Araj Brucella
CN115541887A (zh) 一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用
Sharififar et al. Comparison of the polymerase chain reaction method with serological tests in the diagnosis of human brucellosis
Gharavi et al. Evaluation of HBs-Ag and anti-HBc levels in serum and saliva of patients with hepatitis B
JP2618629B2 (ja) 特異的な免疫学的定量方法
CN113624977A (zh) SARS-CoV-2感染诊断方法
Candelaria 251. Implementation of the Sōna Coccidioides Antibody Lateral Flow Assay in the Clinical Laboratory Proves to Reduce Cost and Decrease Turnaround Time When Compared with Send out Immunodiffusion and Complement Fixation Testing.
Meyer et al. Rheumatoid factor in congenital syphilis.
CN107976543A (zh) 一种结核病检测试剂盒及检测方法
WO2024029523A1 (ja) コロナウイルス感染症の評価項目を判断するための情報を提供する方法
US20220323345A1 (en) HUMANIZED ANTIBODY FOR SARS-CoV-2 SPIKE PROTEIN INFUSION

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination