CN107976543A - 一种结核病检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测结核病的试剂盒及检测方法,该试剂盒包括ESAT‑6与CFP‑10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。本发明应用基于IFNg相关的TNFa释放,建立一种区分活动性与潜伏性结核感染的方法,通过TNFa‑ELISA定量检测结核特异性抗原ESAT‑6/CFP‑10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNFa,在IFNg抗体存在情况下结核特异性抗原ESAT‑6/CFP‑10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNFa,以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNFa,通过比较不同条件下TNFa值,从而对活动性结核病进行直接诊断。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫学领域,涉及结核病人以及结核杆菌感染的快速特异性检测的方法。具体涉及的是IFNg抗体在抗原特异性TNFa检测试剂盒的应用,特别是在结核病检测中的应用以及新型的结核病检测试剂盒的制作和应用方法。
背景技术
结核病是重要的全球公共卫生问题,严重危害人类健康,每年导致世界上约2百万人的死亡。结核病的早期诊断及有效治疗是结核病防治工作的重中之重,对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前在临床上对结核病的诊断主要依据临床症状,胸部X光片及细菌学检查,例如结核菌涂片检查虽然简单易行且准确性高,但阳性率低。而结核菌培养检测结果可信度高,但耗时较长,不能满足临床需求。
g-干扰素(IFNg)释放试验分析技术IGRA是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的新方法。通过定量检测受检者外周血单个核细胞在结核分枝杆菌特异抗原刺激下释放的Y-1FN,从而对潜伏和活动性结核感染进行诊断。其基本原理是:结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,通过结核分枝杆菌特异性重组抗原刺激感染者效应T淋巴细胞增殖,并释放IFNg,通过检测IFNg水平,从而判断其是否具有针对结核分枝杆菌特异性的T细胞反应。该方法不受卡介苗(BCG)及非结核分枝杆菌影响,且其检测灵敏度和特异性均高。特异性好,同时灵敏度高,不受卡介苗接种和环境分枝杆菌的影响。但是,基于g-干扰素释放试验的方法虽然能对结核分枝杆菌感染进行快速诊断,但该方法却不能用于区分活动性与潜伏性结核感染。
结核潜伏感染是指体内存在结核杆菌,无症状且痰中也无结核菌。结核病是指相关出现症状,X检查出现相应表现、曼托试验呈阳性或痰中检出结核菌。活动性结核患者应尽早给予治疗。中国是结核病大国,存在大量的潜伏性结核感染者,这类潜伏性结核感染人群可能终生都没有临床症状,也不需要进行任何治疗。由于g-干扰素释放试验的高灵敏性,除了活动性结核感染者之外,应用此方法检测潜伏性结核感染者也均为阳性,因此给临床用药带来困难。诊断如果能开发出只有活动性结核患者才表现为阳性,而潜伏性结核患者表现为阴性的检测方法,将对我国结核病诊断及治疗具有重要意义。
外周血淋巴细胞受结核特异抗原刺激后产生的细胞因子也包括TNFa,申请公布号为CN103604933A公开基于抗原特异性TNF-a-ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用,该专利声称基于其试剂盒,可以建立一种区分活动性和潜伏性结核感染的方法,通过ELISA技术定量检测结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNF-a,以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNF-a,通过以上两者相减得到抗原特异性TNF-a值,从而对活动性结核病进行直接诊断。但是,业界以及本申请人多次重复该专利的方法并不能够很好的区分潜伏性和活动性结核感染,因此,单一的TNFa释放的指标是否可以作为活动性结核的标志还存在争议。
本申请人利用ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液分别对健康人群(Healthy),潜伏感染人群(LTB),以及活动性结核人群(TB)的外周血单个核细胞样本进行诱导后检测对应人群的TNF-a值,结果参见图1,从图1可见,LTB和TB人群的抗原特异性TNFa值明显高于健康人群,但是LTB和TB人群无显著差异。因此,单一的TNFa释放指标不能区分潜伏性和活动性结核。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够区分潜伏性和活动性结核感染的试剂盒及检测方法。
本发明的一个目的是提供一种结核病检测试剂盒,其包括ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。
根据一个实施方式,所述的结核病检测试剂盒还包括培养液。
根据一个实施方式,所述的结核病检测试剂盒还包括植物凝集素、人TNFa检测试剂、TNFa蛋白标准品、生物素化的TNFa抗体、链亲核素-藻红蛋白交联物、样品稀释液。
优选地,所述的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液中ESAT-6与CFP-10的浓度分别为9~11微克/毫升。
优选地,所述的抗人IFNg抗体的浓度为0.9~1.1毫克/毫升。
优选地,所述的植物凝集素的浓度分别为9~11微克/毫升。
本发明中,人TNFa检测试剂可以是ELISA试剂,可以化学发光检测试剂,也可以是其他试剂,在我们的优选例中,使用的是来自美国Biolegend的抗TNFa抗体荧光微球。
本发明的第二个目的是提供一种所述的结核病检测试剂盒在检测结核病中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种所述的结核病检测试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
步骤(1)、向待测样本中加入培养液,得到阴性对照组;
步骤(2)、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液,得到第一检测组;
步骤(3)、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及抗人IFNg抗体,得到第二检测组;
步骤(4)、将所述的阴性对照组、所述的第一检测组和所述的第二检测组分别进行培养、检测得到各组待测样本中的TNFa浓度,其中,所述的阴性对照组的待测样本中的TNFa浓度记为A,所述的第一检测组的待测样本中的TNFa浓度记为B,所述的第二检测组的待测样本中的TNFa浓度记为C;
步骤(5)、计算(B-A)/A的值和(C-B)/A的值,并根据所述的(B-A)/A的值和所述的(C-B)/A的值进行结果的判定。
具体地,步骤(5)中进行结果判定的具体方法为:
当所述的(B-A)/A的值≤1.5时, 则结果判定为阴性无结核感染史;
当所述的(B-A)/A的值>1.5且≤2时,则结果判定为可疑结核感染;
当所述的(C-B)/A的值>2且所述的(B-A)/A的值>2时,且则结果判定为潜伏性结核感染;
当所述的(C-B)/A的值≤-2且所述的(B-A)/A的值>2时,且则结果判定为活动性结核。
优选地,所述的检测方法还包括向待测样本中加入植物凝集素得到阳性对照组,对所述的阳性对照组进行培养、检测得到阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度的步骤。
进一步优选地,当所述的阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度>50pg/mL时,则标本符合要求,能够进行检测结果的判定。
具体地,所述培养的条件为:在37℃、5% CO2的培养箱中培养16~20小时。
具体地,所述检测的具体方法包括依次进行的如下步骤:
步骤(1)、收集各组培养后的上清液,用样品稀释液进行稀释;用样品稀释液将TNFa蛋白标准品稀释至多个浓度梯度;然后分别加入人TNFa检测试剂,在24~26℃下密封混合50~70min;
步骤(2)、真空去除液体;
步骤(3)、加入所述的样品稀释液,继续真空去除液体;
步骤(4)、加入生物素化的TNFa抗体,在24~26℃下密封混合50~70min,然后加入链亲核素-藻红蛋白交联物,继续混合25~35min;
步骤(5)、重复进行步骤(3);
步骤(6)、加入所述的人TNFa检测试剂并进行悬浮后进行读数;
步骤(7)、通过多个浓度梯度的TNFa蛋白标准品的读数绘制标准曲线,并将各组的读数通过所述的标准曲线换算成各组的待测样本的TNFa浓度。
优选地,所述的阴性对照组中所述的待测样本与所述的培养液的投料体积比为1:0.5~0.6。
优选地,所述的第一检测组还添加有所述的培养液,其中,所述的待测样本、所述的ESAT-6和CFP-10蛋白混合液和所述的培养液的投料体积比为1:0.45~0.55:0.045~0.055。
优选地,所述的第二检测组中所述的待测样本、所述的ESAT-6和CFP-10蛋白混合液和所述的抗人IFNg抗体的投料体积比为1:0.45~0.55:0.045~0.055。
优选地,所述的阳性对照组还添加有所述的培养液,其中,所述的待测样本、所述的植物凝集素和所述的培养液的投料体积比为1:0.45~0.55:0.045~0.055。
本发明原理: 本发明根据结核感染患者体内特异性效应细胞再次受到结核抗原诱导时可迅速活化,并大量分泌炎性细胞因子TNFa (肿瘤坏死因子a ),且在不同刺激下受IFNg调节的结核特异性TNFa分泌在潜伏和活动性结核感染患者中存在显著差异,通过计算各不同条件下的TNFa值,从而区分潜伏性结核感染和结核病。所以,和γ-干扰素释放试验相比,针对检测抗原特异性TNF-a的方法,在区分潜伏性与活动性结核感染时具有优势。
由于以上技术方案的实施,本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明方法通过定量检测不同条件刺激下待测样本的TNFa值,并通过计算相应的比值,从而能够对无感染、可疑感染、潜伏性结核感染以及活动性结核感染进行区分。
本发明的试剂盒以及检测方法在区分潜伏性结核感染和活动性结核感染时具有良好的性能参数,诊断活动性结核感染以及潜伏性结核感染的敏感性达到90%以上,非结核患者及健康对照者时,绝大部分均为阴性,说明该试剂盒同样具有良好的特异性。以上说明本方法对结核病的早期诊断具有重要意义。
附图说明
图1为ESAT-6/CFP-10诱导的抗原特异性TNFa值分布图,包括健康人群(Healthy),潜伏感染人群(LTB),以及活动性结核人群(TB)。显示LTB和TB人群的抗原特异性TNFa值明显高于健康人群,但是LTB和TB人群无显著差异。
图2为LTB 人群在有无IFNg抗体下受ESAT-6/CFP-10诱导的后TNFa值分布图,包括未受抗原刺激(no antigen)时TNFa值,无IFNg抗体时TNFa值,有IFNg抗体TNFa值。
图3为TB 人群在有无IFNg抗体下受ESAT-6/CFP-10诱导的后TNFa值分布图,包括未受抗原刺激(no antigen)时TNFa值,无IFNg抗体时TNFa值,有IFNg抗体TNFa值。
图4 为LTB 人群和TB 人群的(C-B)/A的值的差异图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明,以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容,但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
—种基于抗原、IFNg抗体特异性的TNFa检测方法以及应用该方法检测活动性结核病的试剂盒,该试剂盒包括:
1) ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液;
2) 植物凝集素;
3) 抗人IFNg抗体;
4)人TNFa检测试剂:抗TNFa抗体荧光微球;
5)TNFa蛋白标准品;
6)生物素化的TNFa抗体;
7)链亲核素-藻红蛋白交联物(SA-PE);
8) 样品稀释液(PBS,1% BSA, 0.02% Tween 20, 0.1% NaN3);
9)培养液(RPMI1640,10%FBS)
ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液中ESAT-6和CFP-10蛋白的浓度均为10 μ g/ml,植物凝集素浓度为10 μ g/ml,抗人IFNg抗体的浓度为10 μ g/ml。
本试剂盒中所用原料均可市购获得。
试剂盒在检测活动性结核病中的应用,包括以下步骤:
1)在96孔细胞培养板中加入100 μl待测的外周血单个核细胞悬液;
2)在上述8个孔中分别加入如下试剂:两个阴性对照分别孔加入55μL培养液;两个阳性对照孔分别加入 50 μL植物凝集素+5μL培养液;两个检测孔分别加入50 μL的ESAT-6和CFP-10蛋白混合液和5μL培养液;两个检测孔分别加入50μL的ESAT-6和CFP-10蛋白混合液和5μL的抗人IFNg抗体;
3)将96孔板置于37℃、5% CO2的培养箱中培养16小时;
4)取出步骤3)中的96孔板,收集各孔培养液上清;用样品稀释液稀释2倍和8倍;
5)将TNFa蛋白标准品用样品稀释液溶解后进行连续稀释得到:2500pg/ml、625pg/ml、156.3pg/ml、39.1pg/ml 和 9.8 pg/ml 5个浓度梯度;
6)分别取25μl步骤4)得到稀释样品和步骤5)得到5个浓度梯度的溶液,分别加入含25μl抗TNFa抗体荧光微球的检测板孔内,然后在空白对照孔加入25 μL的样品稀释液;用封板胶条密封,25°C 混合1小时;
7)将96孔过滤板置于96孔板真空过滤装置上,利用真空,去除孔内液体;
8)往检测孔加入200μl的样品稀释液,继续用真空去除液体;
9)往对照,标准以及检测孔中加入25μl的生物素化的TNFa抗体,并用封板胶条密封,25°C 混合1小时后加入25μl的的SA-PE继续混合30min;
10)重复一次步骤8);
11)向对应的酶标板孔内分别加入200 μL抗TNFa抗体荧光微球,悬浮荧光微球;
12) 利用流失细胞仪读数,通过TNFa蛋白标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线,并将各检测样本吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNFa浓度;其中,阴性对照孔的TNFa浓度记为A,仅添加ESAT-6和CFP-10蛋白混合液的检测孔的TNFa浓度记为B,同时添加有ESAT-6和CFP-10蛋白混合液和抗人IFNg抗体的检测孔的TNFa浓度记为C;
13)结果判定:
如果阳性对照孔的TNFa 浓度> 50pg/ml,则标本符合要求。
当(B-A)/A的值≤1.5时, 则结果判定为阴性无结核感染史;当(B-A)/A的 值>1.5而且≤2时,则结果判定为可疑结核感染。
当(C-B)/A 的值>2,且(B-A)/A的值>2时候,且则结果判定为潜伏性结核感染。
当(C-B)/A的值≤-2,且(B-A)/A的>2时,且则结果判定为活动性结核。
实施例2
使用上述试剂盒和相对应的方法检测20例活动性结核患者、20例潜伏性结核对照者、15例非结核患者。
—、病例选取
三组人群的收录标准如下:
活动性结核患者(TB):有发热、盗汗或消瘦等临床症状,且临床涂片或培养阳性。
潜伏性结核对照者(LTB):无发热、盗汗或消瘦等临床症状,无结核影像学表现,但结核感染T细胞检测(T-SPOT)阳性。
非结核患者(Healthy):包括10例有发热、盗汗或消瘦等临床症状,但结核感染T细胞检测(T-SPOT)阴性;5例无发热、盗汗或消瘦等临床症状,无结核影像学表现,且结核感染T细胞检测(T-SPOT)阴性。
二、检测方法:
1、分离受检者外周血单个核细胞。
1) 采集3毫升血液到含有肝素的真空采集管中。加入3毫升PBS稀释。
2)在15毫升离心管中加入3毫升Ficoll-Hypaque,将稀释后的6毫升血液小心加在Ficoll-Hypaque上层。室温2000转在无离心刹车状态下离心20分钟。
3)吸出位于界面的云雾状层细胞加到含有10毫升无血清RPMI1640的15毫升离心管,1800转离心10分钟,弃上清。再加入10毫升无血清RPMI1640,小心吹打悬浮细胞,1500转离心5分钟,弃上清。再加入10毫升无血清RPMI1640重悬细胞,1500转离心5分钟,弃上清。
4)用R10培养基(即1640培养基+10%胎牛血清)将细胞浓度调至2.5*106个/mL待用。
2、抗原刺激,每位受检者的外周血单个核细胞悬液分别进行如下检测:
1)在96孔反应板的4个孔内加入100 μl待测的外周血单个核细胞悬液;
2)在4个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入55 μl的培养液(用于检测非刺激条件下的本底TNFa水平,即A);阳性对照孔加入50 μl植物凝集素(PHA)以及5μl培养液;其中一个检测孔加入50 μl的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及5μl培养液(用于检测无抗体存在,有蛋白刺激条件下的TNFa水平,即B);往另外一个检测孔加入50 μl的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及5μl 抗人IFNg抗体(用于检测有抗体存在,有蛋白刺激条件下的TNFa水平,即C);
3)将96孔板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养16小时;
3、检测
1)取出上述细胞诱导的步骤3)中的96孔板,收集各孔培养液上清;
2)按照实施例1的试剂盒操作步骤,进行TNFa浓度测定;
3)利用软件计算样品的TNFa浓度。
4)实验结果:三组受检者的ESAT-6/CFP-10的特异性TNFa分泌如下图1到图4所示。其中图1为三组受检者的ESAT-6/CFP-10诱导的抗原特异性TNFa值分布图,图2为LTB 人群在有无IFNg抗体下受ESAT-6/CFP-10诱导的后TNFa值分布图,图3为TB 人群在有无IFNg抗体下受ESAT-6/CFP-10诱导的后TNFa值分布图,图4 为LTB 人群和TB 人群的(C-B)/A的值的差异图。
其中根据实施例1列举的结果判断原则进行分类。入选的20例活动性结核患者中以及20例潜伏性结核感染者中,全部是(B-A)/A>2,判断为具有结核感染史,使用本方法检测的敏感性和T-SPOT的检测结果达到100%。入选的20例潜伏性结核感染者中,19例(C-B)/A的值>2,判定为潜伏性感染。入选的20例活动性结核患者中,12例(C-B)/A的值≤-2,判定为活动性感染。
入选的15例健康对照中,抗原特异性TNF-α值均小于70pg/ml ;15例健康对照者中,全部为(B-A)/A≤1,结果判定为阴性无结核感染史,与T-SPOT的检测结果达到100%。
以上结果表明,使用本发明检测活动性结核感染具有较高的敏感性及特异性,且实验操作简单,24小时即可报告结果,说明本发明的试剂盒可以作为辅助诊断活动性结核病的一种手段。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种结核病检测试剂盒,其特征在于:其包括ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。
2.根据权利要求1所述的结核病检测试剂盒,其特征在于:所述的结核病检测试剂盒还包括培养液。
3.根据权利要求1或2所述的结核病检测试剂盒,其特征在于:所述的结核病检测试剂盒还包括植物凝集素、人TNFa检测试剂、TNFa蛋白标准品、生物素化的TNFa抗体、链亲核素-藻红蛋白交联物、样品稀释液。
4.根据权利要求3所述的结核病检测试剂盒,其特征在于:所述的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液中ESAT-6与CFP-10的浓度分别为9~11微克/毫升;所述的抗人IFNg抗体的浓度为0.9~1.1毫克/毫升;所述的植物凝集素的浓度分别为9~11微克/毫升。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述的结核病检测试剂盒在检测结核病中的应用。
6.一种如权利要求1至4中任一项所述的结核病检测试剂盒的检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤(1)、向待测样本中加入培养液,得到阴性对照组;
步骤(2)、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液,得到第一检测组;
步骤(3)、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及抗人IFNg抗体,得到第二检测组;
步骤(4)、将所述的阴性对照组、所述的第一检测组和所述的第二检测组分别进行培养、检测得到各组待测样本中的TNFa浓度,其中,所述的阴性对照组的待测样本中的TNFa浓度记为A,所述的第一检测组的待测样本中的TNFa浓度记为B,所述的第二检测组的待测样本中的TNFa浓度记为C;
步骤(5)、计算(B-A)/A的值和(C-B)/A的值,并根据所述的(B-A)/A的值和所述的(C-B)/A的值进行结果的判定。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:步骤(5)中进行结果判定的具体方法为:
当所述的(B-A)/A的值≤1.5时, 则结果判定为阴性无结核感染史;
当所述的(B-A)/A的值>1.5且≤2时,则结果判定为可疑结核感染;
当所述的(C-B)/A的值>2且所述的(B-A)/A的值>2时,且则结果判定为潜伏性结核感染;
当所述的(C-B)/A的值≤-2且所述的(B-A)/A的值>2时,且则结果判定为活动性结核。
8.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:所述的检测方法还包括向待测样本中加入植物凝集素得到阳性对照组,对所述的阳性对照组进行培养、检测得到阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度的步骤。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于:当所述的阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度>50pg/mL时,则标本符合要求,能够进行检测结果的判定。
10.根据权利要求6或8所述的检测方法,其特征在于:所述检测的具体方法包括依次进行的如下步骤:
步骤(1)、收集各组培养后的上清液,用样品稀释液进行稀释;用样品稀释液将TNFa蛋白标准品稀释至多个浓度梯度;然后分别加入人TNFa检测试剂,在24~26℃下密封混合50~70min;
步骤(2)、真空去除液体;
步骤(3)、加入所述的样品稀释液,继续真空去除液体;
步骤(4)、加入生物素化的TNFa抗体,在24~26℃下密封混合50~70min,然后加入链亲核素-藻红蛋白交联物,继续混合25~35min;
步骤(5)、重复进行步骤(3);
步骤(6)、加入所述的人TNFa检测试剂并进行悬浮后进行读数;
步骤(7)、通过多个浓度梯度的TNFa蛋白标准品的读数绘制标准曲线,并将各组的读数通过所述的标准曲线换算成各组的待测样本的TNFa浓度。
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Cited By (1)
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2017
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