CN106996928A - 一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，包括：链霉亲合素磁珠混悬液、γ干扰素校准品、植物凝集素(PHA)、结核杆菌特异性抗原多肽、无血清培养液(AIM-V)、生物素标记的抗人γ干扰素单抗、碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗、发光底物液(APS 5)、校准品稀释液、抗体稀释液和洗涤液。本发明试剂盒使用不透明白色酶标板检测。与传统酶联免疫分析法比较，本发明的试剂盒具有更高的灵敏度，且操作简单，快速，成本低廉，易于实现自动化操作，有较好的临床应用前景。

Description

一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及生物医学检測技术，尤其涉及一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒及其应用。
背景技术
结核病是全球三大传染性疾病之一，中国结核患者数量居全球第二位，全国结核感染率为44.5％，平均每年新发病例91.2万，死亡4.7万人。结核病给人们带来了很大的经济和社会负担。随着研究的不断深入，结核病的临床诊断方法取得了较大的发展，免疫学检测方法是现阶段检测结核分枝杆菌感染的重要辅助方法之一，其中以抗原特异性刺激后的γ干扰素释放实验(IGRA)为主。IGRA方法通常采用结核分枝杆菌特异性的RD(Region of Difference)区基因编码抗原，因而较好的避免已接种BCG(卡介苗)的干扰。然而，现有报道表明人群存在较严重的非结核分枝杆菌感染情况，现有商用试剂盒T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-IT在结核病诊断应用中的效果不甚理想，表现为其检测的敏感性均为80％左右。其中主要原因是检测方法分别是ELISPOT和ELISA法，方法的灵敏度均有限，在诊断的特异性和敏感性方面还存在一些不足，需要加以改进。现有研究表明，酶促化学发光法通过酶和发光底物的放大途径，可达到数十倍至数百倍于ELISA法的灵敏度。目前尚未见有磁珠化学发光法检测结核感染试剂盒的报道，宜进一步研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，克服上述不足之处，研究设计利用化学发光与酶联免疫分析相结合，具有更高灵敏度的检测结核感染试剂盒。
本发明所述试剂盒
本发明提供了一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，所述试剂盒包括：链霉亲合素磁珠混悬液、γ干扰素校准品、植物凝集素(PHA)、结核杆菌特异性抗原多肽、无血清培养液(AIM-V)、生物素标记的抗人γ干扰素单抗、碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗、发光底物液(APS 5)、校准品稀释液、抗体稀释液和洗涤液。
具体的，本发明所述试剂盒由下列组分各一份组成：
(1)链霉亲合素磁珠混悬液，10ml/支；
(2)γ干扰素校准品，1μg/瓶；
(3)PHA植物凝集素，10ml/瓶；
(4)结核杆菌特异性抗原多肽,10ml/瓶；
(5)无血清细胞培养液(AIM-V),10ml/瓶；
(6)生物素标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管；
(7)碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管；
(8)发光底物液(APS 5)，25ml/瓶；
(9)校准品稀释液,10ml/瓶；
(10)抗体稀释液，10ml/瓶；
(11)洗涤液，20ml/瓶。
本发明试剂盒所述的链霉亲合素磁珠混悬液作为酶联免疫和固相分离载体，用于捕获抗原-抗体复合物；浓度为0.1mg/ml。
所述的γ干扰素校准品为白色冻干粉，浓度为1μg/ml。
所述的PHA植物凝集素作为阳性对照，浓度为100-200μg/ml。
所述的结核杆菌特异性抗原多肽，特异性刺激样本分泌γ干扰素，浓度为5-20μg/ml。
所述多肽是一种氨基酸聚合物
所述的无血清培养液(AIM-V)作为空白对照。
所述的二种抗人γ干扰素单抗分别为生物素标记单抗和碱性磷酸酶标记单抗，这两种单抗与抗原反应形成抗原-抗体复合物。
本发明试剂盒所述生物素标记的抗人γ干扰素单抗，稀释比为1:2000；碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗,稀释比为1:200。
所述抗原可以天然分离得到，也可以通过克隆技术和基因工程的方法获得融合蛋白，此为行业内所熟悉的公知技术。
本发明试剂盒所述的发光底物液APS 5为碱性磷酸酶的化学发光底物。
所述标准品稀释液含1％牛血清白蛋白，0.01M PH7.4的磷酸盐缓冲液及0.02％Procline-300。
所述抗体稀释液含1％牛血清白蛋白，0.01M PH7.4的磷酸盐缓冲液,1M NaCl及0.02％Procline-300。
所述洗涤液为三羟甲基氨基甲烷洗涤液pH值为7.4,含0.8gNaCl,0.02gKCL,0.3g Tris碱及0.05％吐温-20。
本发明试剂盒使用不透明白色酶标板进行检测。
所述的不透明白色酶标板为96孔可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。
本发明的检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒可用于临床检测结核分枝杆菌感染人群，包括有临床症状的活动性结核病人和无症状的潜伏感染者。此处临床症状包括但不限于发热，咳嗽，胸痛，咳血，胸片异常等。
本发明试剂盒与现有技术比较，通过检测校准品中γ干扰素的含量确定本试剂盒检测灵敏度为0.55pg/ml，市场上已有试剂盒的灵敏度为2-8pg/ml，结果说明本发明试剂盒的灵敏度高。
本发明检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒可用于临床检测结核分枝杆菌感染人群，包括有临床症状的活动性结核病人和无症状的潜伏感染者。此处临床症状包括但不限于发热，咳嗽，胸痛，咳血，胸片异常等。
本发明试剂盒利用磁珠的技术特点，结合生物素-亲和素酶联免疫放大作用及碱性磷酸酶标记的酶促化学发光体系检测结核抗原特异性T细胞分泌的γ干扰素水平，具有非常高的灵敏度。本发明能有效地检测活动性结核病人和潜伏感染者，与现有技术比较较更具技术和价格优势，灵敏度高，操作简单，省时，易于实现全自动化操作；无需昂贵的特殊仪器，对操作人员技术水平及实验室条件要求相对较低，适于基层医院推广使用，具有较大的临床应用价值。
附图说明
图1：实施例1以γ干扰素校准品系列浓度值为横坐标(x轴)，发光值为纵坐标(y轴)，建立标准曲线。
图2：实施例2受试者工作特性曲线(ROC)分析，横坐标为100％-特异性，纵坐标为敏感性(％)，得到曲线下面积(AUC)为91.3％，结核病人阳性检出率为91.5％，健康人群阴性检出率为89.8％，总符合率为90.6％。
具体实施方式
本发明所述实施方法，如无特别说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法，所用试剂市售得到。
不透明96孔白色酶标板，购自康宁公司
链霉亲合素磁珠混悬液，10ml/瓶,浓度为0.1mg/ml,购自罗氏
γ干扰素校准品，1μg/瓶，购自Mabtech公司
PHA植物凝集素，10ml/瓶,浓度为20μg/ml,购自Sigma公司
结核杆菌特异性抗原多肽,10ml/瓶,浓度为10ug/ml,由吉尔生化合成
无血清细胞培养液(AIM-V),10ml/瓶,购自Gibco公司
生物素标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管，稀释比为1:2000,购自生命科学公司
碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管,稀释比为1:200，购自Mabtech公司
发光底物液(APS 5)，25ml/瓶，购自美凯特科技有限公司
抗体稀释液：10ml/瓶，含1％牛血清白蛋白，PH7.4的磷酸盐缓冲液,1M NaCl及0.02％Procline-300。
自配制：取PH7.4的磷酸盐缓冲液10ml(购自上海百赛生物公司),与90ml去离子水充分混匀，得到100ml磷酸盐缓冲液，后加入牛血清白蛋白1g,搅拌器充分混匀后加NaCl5.8g，Procline-30020μl充分搅拌混匀得到抗体稀释液100ml,分装为10ml×10瓶。
校准品稀释液：10ml/瓶，含1％牛血清白蛋白，PH7.4的磷酸盐缓冲液及0.02％Procline-300。
自配制：取pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml(购自上海百赛生物公司),与90ml去离子水室温充分混匀，得到100ml磷酸盐缓冲液，后加入牛血清白蛋白1g，Procline-30020μl搅拌器充分混匀得到校准品稀释液100ml,分装为10ml×10瓶。
洗涤液为三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(TBST)：
自配制：80ml去离子水溶解8gNaCl,0.2gKCL,3g Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，用盐酸调整pH值至7.4，去离子水定容至100ml,再加入吐温-200.5ml,室温充分混匀，得到三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液100ml,分装为20ml×5瓶。每瓶与180ml去离子水室温混匀后得到200ml洗涤液。
检测样本来源：临床结核感染阳性样本47例，阴性样本49例，由上海市肺科医院提供。
实施例1：酶联化学发光法用于γ干扰素检测的灵敏度测定。
1.生物素标记的抗人γ干扰素单抗为一抗，用抗体稀释液(含1％牛血清白蛋白，0.1M PH7.4的磷酸盐缓冲液,1M NaCl及0.02％Procline-300)1/2000倍稀释。
2.碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗为二抗，抗体稀释液(含1％牛血清白蛋白，0.1M PH7.4的磷酸盐缓冲液,1M NaCl及0.02％Procline-300)1/200倍稀释。
3.将γ干扰素校准品用标准品稀释液(标准品稀释液,10ml/支，含1％牛血清白蛋白，0.1M PH7.4的磷酸盐缓冲液及0.02％Procline-300)作系列稀释，浓度依次为400、100、25、6.25、1.56、0pg/ml(皮克/毫升)。
4.96孔白色酶标板中分别加入50μl一抗，50μl二抗和100μlγ干扰素校准品。
5.振荡混匀后，37℃恒温箱温育60min。
6.每孔分别加入100ul磁珠，浓度为0.1mg/ml。
7.振荡混匀后，37℃恒温箱温育30min。
8.取出酶标板，于磁力板上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
9.用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗3次，每次300μl。
10.每孔加入200μl发光底物液(APS 5)，于Thermo发光仪(Thermo公司)中读取发光值。
建立标准曲线(图1)，利用本发明的试剂盒得到线性方程为y＝1.5899x-0.28821,相关系数r＝0.999,表明本试剂盒线性关系良好。结果如下：
表1标准品系列稀释后检测结果
校准品(pg/ml) 均值
400 252.05
100 61.70
25 16.82
6.25 4.29
1.56 1.01
0 0.35
平行测定十个空白孔，计算其平均值与2倍标准差(SD)之和为0.5518，代入线性方程计算本试剂盒检测灵敏度为0.53pg/ml。
表2
检测次数 空白检测值
1 0.4356
2 0.3152
3 0.5296
4 0.3455
5 0.4712
6 0.3006
7 0.3023
8 0.4368
9 0.2804
10 0.4451
均值 0.3862
标准差(SD) 0.0828
灵敏度(均值+2SD) 0.5518
实施例2：酶联化学发光法用于结核感染检测的灵敏度和特异性。
样本处理：按每个测定样本需细胞培养板3孔，每孔所需样本量1ml，即空白对照孔、测试孔、植物凝集素PHA阳性对照孔，每孔依次加入无血清培养液(AIM-V)0.1ml、在测试孔内加入结核杆菌特异性多肽抗原0.1ml、在PHA对照孔内加入植物凝集素PHA 0.1ml，各孔混匀后，置于37℃培养箱孵育20小时后，取上清液各0.1ml，待测。
1.取生物素标记的抗人γ干扰素单抗为一抗，抗体稀释液1/2000倍稀释。
2.取碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗为二抗，抗体稀释液1/200倍稀释。
3.96孔白色板中分别加入50ul一抗、50ul二抗和100ulγ干扰素校准品或样本。
4.振荡混匀后，37℃温育60min。
5.每孔分别加入100μl磁珠,浓度为0.1mg/ml。
6.振荡混匀后，37℃温育30min。
7.取出酶标板，于磁力板上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
8.用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗3次，每次300ul。
9.每孔加入200ul发光底物液(APS 5)，于Thermo发光仪中读取发光值。
10.根据标准曲线线性回归方程计算样本中γ干扰素含量中IFN-γ含量。
结果判定：测试孔值-空白孔值≥10(pg/ml)并且≥测试孔/4，此时判定为阳性，否则为阴性。
检测结果如下：
表3磁珠化学发光法检测正常人γ干扰素含量结果(pg/ml)
表4磁珠化学发光法检测结核病人γ干扰素含量结果(pg/ml)
使用GraphPad prism 5软件(医学统计网下载)对这两个人群检测结果进行受试者工作特性曲线(ROC)分析，如图2，得到曲线下面积(AUC)为91.3％，判定值为10pg/ml，此时结核病人阳性检出率为91.5％(43/47)，健康人群阴性检出率为89.8％(44/49)，总符合率为90.6％。因此表明本发明试剂盒敏感性91.5％，特异性为89.8％。
实施例3
用T-SPOT试剂盒检测相同样本进行对比试验，检测结核病人样本47例和健康人群样本49例，结果如下
表5 T-SPOT试剂盒检测正常人结果
表6 T-SPOT试剂盒检测结核病人结果
根据实验结果可知，T-SPOT试剂盒检测敏感性为85.1％(40/47)，特异性为87.7％(43/49),而本发明试剂盒检测敏感性为91.5％，因此具有更高的检测敏感性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则内所做的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：链霉亲合素磁珠混悬液、γ干扰素校准品、植物凝集素、结核杆菌特异性抗原多肽、无血清培养液、生物素标记的抗人γ干扰素单抗、碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗、发光底物液、校准品稀释液、抗体稀释液和洗涤液。
2.根据权利要求1所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由下列组分各一份组成：
(1)链霉亲合素磁珠混悬液，10ml/瓶；
(2)γ干扰素校准品，1μg/瓶；
(3)PHA植物凝集素，10ml/瓶；
(4)结核杆菌特异性抗原多肽,10ml/瓶；
(5)无血清细胞培养液,10ml/瓶；
(6)生物素标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管；
(7)碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗，0.5ml/管；
(8)发光底物液APS 5，25ml/瓶；
(9)标准品稀释液,10ml/瓶；
(10)抗体稀释液，10ml/瓶；
(11)洗涤液，20ml/瓶。
3.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲合素磁珠混悬液，10ml/瓶,浓度为0.1mg/ml。
4.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述的PHA植物凝集素作为阳性对照，浓度为10-20μg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述的结核杆菌特异性抗原多肽，特异性刺激样本分泌γ干扰素，浓度为1-2μg/ml。
6.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗人γ干扰素单抗，稀释比为1:2000；碱性磷酸酶标记的抗人γ干扰素单抗,稀释比为1:200。
7.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述的发光底物液APS 5为碱性磷酸酶的化学发光底物。
8.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液含1％牛血清白蛋白，0.01MPH7.4的磷酸盐缓冲液及0.02％Procline-300。
9.根据权利要求2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液含1％牛血清白蛋白，0.01M PH7.4的磷酸盐缓冲液,1M NaCl及0.02％Procline-300；所述洗涤液为三羟甲基氨基甲烷洗涤液pH值为7.4,含1.6gNaCl,0.04gKCL,0.6gTris碱及0.05％吐温-20。
10.根据权利要求1或2所述的一种检测结核感染的磁珠化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用不透明白色酶标板进行检测；所述的不透明白色酶标板为96孔可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。
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