CN109991417A - 一种结核病的免疫标志物及应用 - Google Patents

一种结核病的免疫标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种结核病的免疫标志物：IFNγ、GZMA双阳性的CD4T细胞。本发明还提供了上述免疫标志物在制备潜伏性结核和活动性结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒中的应用以及一种试剂盒。试剂盒的核心成分为下述三种物质的组合：检测CD4的物质、检测IFNγ的物质和检测GZMA的物质。将含有淋巴细胞的体液样本(含外周血液样本)，经过结核菌特异性抗原刺激后，采用流式细胞术及其类似方法检测其中的IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞含量，从而应用于活动性结核病包括肺结核和肺外结核的筛查或诊断、疗效评价、预后复发风险评估相关产品的制备中，具有优良的应用前景。

Description

一种结核病的免疫标志物及应用
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，具体地说，是一种结核病的免疫标志物及应用。
背景技术
结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，据世界卫生组织(WHO)估计，全球约有1/3的人口感染结核菌，每年新发病800万～1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病流行疫情非常严峻，每年新发病例约100万，是致死性排行第一的感染性疾病。结核病流行现状有多方面的原因，其中缺乏特异、有效的活动性结核病诊断技术是重要原因。
目前结核病诊断主要有影像学诊断、结核菌及其分子生物学诊断和免疫学诊断等方法。影像学诊断难以区分肺结核病和其他肺部疾病；结核菌诊断则包括痰涂片抗酸染色、痰培养、结核菌DNA或RNAPCR扩增等，但由于有效标本采集的困难，尤其对于儿童结核、肺外结核等，假阴性高，易形成漏诊；免疫学诊断主要分抗体检测和细胞免疫检测，血清学检测特异性低；PPD皮试是目前最常用的结核菌感染的细胞免疫检查方法，无法区分BCG接种和结核菌感染，IGRA是目前最好的细胞免疫学检测，但是无法有效区分活动性结核病和潜伏感染。因此研制特异有效的活动性结核病诊断试剂对结核病防治具有重要意义。
结核的免疫学诊断技术是基于检测外周血在结核抗原刺激下血清或免疫细胞γ干扰素(IFNγ)的释放，目前有两种体外IGRA结核诊断试剂被美国FDA批准，TB Gold In-Tube test(QFT–GIT，)和T–Spot(TB test)，QFT–GIT测定原理是采用结核抗原(如结核特异性蛋白ESAT-6、CFP-10、TB7.7等)刺激外周血，并采用ELISA方法测定血清中IFNγ的释放含量，而T–Spot则是刺激后采用ELI-SPOT等方法测定IFNγ单独阳性免疫细胞数量，通过设定特定的阈值，可以判断患者是否曾经或当前感染过结核菌，但这两种方法试剂均无法有效区分活动性结核病和潜伏结核感染。
GZMA(颗粒酶A)是颗粒酶家族的成员之一，主要在NK细胞和CD8细胞中表达，在NK细胞和CD8杀伤性T细胞对靶细胞的裂解杀伤中起重要作用。早在1997年，Cooper AM等(CooperAM,D'Souza C,FrankAA,Orme IM:The course ofMycobacterium tuberculosisinfection in the lungs of mice lacking expression of either perforin-orgranzyme-mediated cytolytic mechanisms.Infection and immunity,1997,65(4):1317-1320)曾采用穿孔素和颗粒酶B的基因敲除小鼠研究了结核菌感染病程的影响，认为穿孔素和颗粒酶B基因敲除并不影响结核菌感染的病程。2015年意大利学者Guggino G等(Guggino G,Orlando V,Cutrera S,La Manna MP,Di Liberto D,Vanini V,PetruccioliE,Dieli F,Goletti D,Caccamo N:Granzyme A as a potential biomarker ofMycobacterium tuberculosis infection and disease.Immunology letters,2015,166(2):87-91)报道在结核抗原刺激下，活动性结核患者的血清GZMA的含量低于潜伏性结核，因此认为结核抗原刺激后血清GZMA含量低是活动性结核患者的潜在标志物，但是2016年荷兰学者Garcia-Laorden MI等(Garcia-Laorden MI,Blok DC,Kager LM,HoogendijkAJ,vanMierlo GJ,Lede IO,RahmanW,Afroz R,GhoseA,Visser CE,Md ZahedAS,Husain MA,AlamKM,Chandra Barua P,Hassan M,Hossain A,Tayab MA,Day N,Dondorp AM,de Vos AF,vander Poll T:Increased intra-and extracellular granzyme expression in patientswith tuberculosis.Tuberculosis,2015,95(5):575-580)报道结核病人血清GZMA和GZMB含量却是升高的，二者之间的矛盾结果使血清GA含量单独测定是否真的有助于结核诊断变得模糊不清。
Garcia-Laorden MI等还研究了结核病人外周血免疫细胞GA的表达情况，同健康人相比，GA阳性的CD4，CD8，NK细胞数量与总淋巴细胞的比值在结核患者中均无升高，仅在CD56+T细胞中GZMA有具有统计学差异的升高。GZMA阳性细胞与CD8+T,CD4+T和CD56+细胞的比值则有升高，并认为GZMA和GZMB有可能参与了结核菌感染的免疫反应。但是本项研究仅仅研究了健康人和结核病人中GZMA阳性细胞的表达情况，并未研究GZMA阳性细胞在潜伏性和活动性结核中的是否存在差异，也未涉及到GZMA+IFNγ+双阳性CD4细胞的情况。另外Vidyarani M等(Vidyarani M,Selvaraj P,Raghavan S,Narayanan PR:Regulatory roleof 1,25-dihydroxyvitamin D3and vitamin D receptor gene variants onintracellular granzyme A expression in pulmonary tuberculosis.Experimentaland molecular pathology,2009,86(1):69-73)则报道结核病人CD8+和CD56+细胞在维生素D的作用下GZMA的表达受到抑制，未研究过CD4+细胞的GZMA的表达情况。
我们通过研究发现，无论是测定IFNγ单阳性的CD4+T和CD8+T细胞含量，还是测定GZMA+单阳性的CD4+T和CD8+T细胞含量，均无法区别活动性结核和潜伏性结核；只有GZMA+IFNγ+双阳性的CD4T细胞才能够作为活动性结核和潜伏性结核感染的鉴别指标，这一点未见文献公开报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种结核病的免疫标志物，IFNγ、GZMA双阳性的CD4T细胞。
本发明的又一目的，是提供一种上述免疫标志物在制备潜伏性结核和活动性结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒的核心成分为下述三种物质的组合：检测CD4的物质、检测IFNγ的物质和检测GZMA的物质。
优选地，所述检测CD4的物质、检测IFNγ的物质、检测GZMA的物质选自CD4阳性标记或CD8阴性标记、IFNγ、GZMA的抗体或标记抗体，并成为抗体组合。
进一步地，该试剂含有IFNγ-荧光抗体、CD4荧光抗体和GZMA荧光抗体的三者组合，应用于制备活动性和潜伏性结核病的鉴别诊断及疗效检测试剂。
更优选地，所述检测CD4的物质、检测IFNγ的物质和检测GZMA的物质采用流式细胞术进行检测。
优选地，试剂盒应用于经过结核抗原体外刺激后的外周血，检测其中的IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞含量。
其中，所述结核抗原为结核菌特异性蛋白抗原或多肽抗原。
优选地，所述试剂盒用来鉴别活动性和潜伏性结核病的指标为：IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度；其中，所述IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+的阈值为0.01％～0.05％、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+的阈值为0.05～0.30、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度的阈值为0.5×103～4.0×103。
更优选地，所述试剂盒用于区分活动性和潜伏性结核病，包括痰培养结核菌阳性和阴性，痰涂结核菌阳性和阴性，结核菌分子检测阳性和阴性的结核菌感染者。
优选地，所述试剂盒用来疗效预后监测的指标为：外周血中IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞量显著降低，说明药物起疗效、预后复发风险低，反之亦然。
优选地，所述结核包括肺结核和肺外结核。肺外结核包括淋巴结核、结核性胸膜炎、肠结核、肾结核、胃结核、肝结核、神经系统结核、生殖系统结核和骨结核等非肺部结核感染。
本发明的再一目的，是提供一种潜伏性结核和活动性结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种活动性结核病的诊断和/或疗效预后监测的试剂盒，所述试剂盒包括：检测物质和说明书；其中，所述检测物质包括检测CD4的物质、检测IFNγ的物质、检测GZMA的物质的三者组合；所述说明书记载了鉴别活动性和潜伏性结核病和疗效预后监测的流程和指标。
优选地，所述鉴别活动性和潜伏性结核病和疗效预后监测的流程为：将含有淋巴细胞的体液样本(含外周血液样本)，经过结核菌特异性抗原刺激后，采用流式细胞术及其类似方法检测其中的IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞含量。
优选地，所述鉴别活动性和潜伏性结核病的指标为：IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度；其中，所述IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+的阈值为0.01％～0.05％、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+的阈值为0.05～0.30、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度的阈值为0.5×103～4.0×103。所述疗效预后监测的指标为：外周血中IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞量显著降低，说明药物起疗效、预后复发风险低，反之亦然。
本发明检测的是来自人体液样本的总淋巴细胞在体外经过结核菌特异性抗原刺激后，其中GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞含量。采用结核菌特异性抗原对总淋巴细胞进行刺激是本领域通晓的方法，其中结核菌特异性抗原可以是来自结核菌的特异性蛋白或多糖，如ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、TB7.7蛋白等，也可以是这些结核特异性蛋白的多肽片段。
本发明涉及的GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞含量既可以是绝对含量(单位体积的细胞数)，也可以是相对含量(相对于某类免疫细胞的数量比值)，鉴于方便性和成本的考虑，相对含量更为经常采用。众所周知，采用多色荧光抗体进行细胞标记，并采用流式细胞术进行某种特定细胞的鉴定和分离是学术界通用的一种方法。因此检测CD4的物质、检测IFNγ的物质、检测CD4的物质通常是指抗CD4的荧光标记抗体，抗IFNγ的荧光标记抗体、GZMA的荧光标记抗体，这些抗体具有对其相应抗原的特异性识别能力。其中由于T淋巴细胞(CD3+细胞)包括了CD4和CD8细胞两大亚群，因此对于CD4抗原的检测既可以直接标记CD4，用CD4+来反映，也可以标记CD8，用CD8-来反映；或者采用CD3+CD4-,CD3+CD8-细胞来反映；这些不同的标记方式的目的都是为了标识CD4+细胞，也是本领域人员所公知的，因此也属于检测CD4的物质。为了能够区分不同的抗体，通常需要对各种抗体进行不同的荧光染料、同位素或酶标记，标记方法也是本领域通用的方法，标记的目的是为了能够在仪器(如流式细胞仪、质谱流式细胞仪等)上检测出不同的相关抗原。
采用流式细胞术对GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞量进行检测需要事先对GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞进行特异性标记。标记过程可采用本领域熟悉的方法，这些方法通常包括了去除红细胞，固定，透膜，抗体孵育，清洗等必要步骤。固定通常使用如甲醛等醛类溶液，而透膜通常使用非离子表面活性剂如Triton X100、NP40等。对于胞膜表达抗原如CD3、CD4、CD8等，透膜步骤通常可以省略，而对于胞内抗原的标记通常需要进行透膜处理。同时标记胞膜抗原和胞内抗原，既可以在固定透膜处理后一起标记抗体，也可以先标记胞膜抗原，然后固定透膜后标记胞内抗原。本发明所涉及GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞量的检测流程是可以依据目前公知的步骤方法进行修改和优化的。
本发明所涉及的活动性结核病的鉴别诊断和疗效监控应用，其中活动性结核病包括肺结核和肺外结核，肺结核最为常见，肺外结核则包括了其它器官的结核感染，如肾结核、骨结核、胃结核、肝结核、肠结核等。活动性结核病是指当前有临床症状和指标、处于结核菌感染活动期的、需要进行治疗处理的患者，而潜伏性结核感染者是指曾经潜在接触或感染过结核菌，但当前因免疫抵抗力强未发病或者发病但已治愈的人。判断活动性结核，尽管目前没有方法能够同时满足特异性和敏感性的要求，但临床上可以有多种方法提供参考，包括痰培养结核菌阳性和阴性，痰涂片结核菌阳性和阴性，结核菌PCR分子检测阳性和阴性的结核病。通常痰培养和痰涂片的特异性较好，但是敏感性低，造成漏检严重，结核菌PCR分子检测的敏感性优于痰培养和痰涂片，但是对于样本难以采集的肺外结核和儿童结核亦无能为力。对于结核这样一个传染病而言，漏检将会造成传染源在人群中自由传播，十分不利于结核病的防控。
除了鉴别诊断活动性结核病的应用外，由于GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞量反映了体内结核菌的活跃程度，因此检测GZMA+IFNγ+双阳性CD4+T细胞量还可以用于结核病治疗的疗效监控和预后判断。
本发明的有益效果是：目前临床上使用的结核细胞免疫学诊断方法和试剂，如T–Spot和IGRA等均无法鉴别活动性结核病和潜伏结核感染的人。本发明提供了一种新的活动性结核病的细胞免疫标志物，即GZMA+IFNγ+双阳性的CD4T细胞，实验发现结核抗原体外刺激下，IFNγ+T单阳性的CD4+T和CD8+T细胞含量、GZMA+单阳性的CD4和CD8T细胞含量均无法区别活动性结核和潜伏性结核，而本发明的IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量可用于活动性结核和潜伏性结核的鉴别，尤其是以IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度作为鉴别活动性和潜伏性结核病的指标，在两者中差异显著，具有很高的诊断价值。此外，本发明还发现动性结核病受试者经过抗结核药物治疗后，受试者的IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量显著性下降，证明IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量监测可用于结核病疗效监测和预后评估，具有优良的应用前景。
附图说明
图1是IFNγ+GZMA+双阳性CD4+T细胞的流式检测图。
图2是结核抗原体外刺激下，IFNγ+T单阳性的CD4+T和CD8+T细胞含量无法区别活动性结核和潜伏性结核。
图3是结核抗原体外刺激下，GZMA+单阳性的CD4和CD8T细胞含量无法区别活动性结核和潜伏性结核。
图4是结核抗原体外刺激下，IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量可以用于活动性结核和潜伏性结核的鉴别。
图5是结核抗原体外刺激下，IFNγ+GZMA+T双阳性的CD4+IFNγ+T细胞含量可以用于活动性结核和潜伏性结核的鉴别。
图6是结核抗原体外刺激下，IFNγ+CD4+T细胞中的GZMA的平均荧光强度(MFI)可用于鉴别活动性结核和潜伏性结核。IFNγ+CD8+T细胞中的GZMA的平均荧光强度(MFI)无法用于鉴别活动性结核和潜伏性结核。
图7是IFNγ+单阳性、GZMA+单阳性、IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量鉴别活动性结核和潜伏性结核的受试者工作特征(ROC)曲线的比较。
图8是IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量的三种指标鉴别活动性结核和潜伏性结核的受试者工作特征(ROC)分析。
图9是IFNγ+GZMA+CD4+T/IFNγ+CD4+T比值在结核患者接受抗结核治疗前后的差异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明未详细说明的试剂仪器均可市购获得，未详细说明的方法操作均按本领域常规操作或厂商说明书进行。
经《WS 288—2017肺结核诊断》确诊的活动性肺结核患者(ATB)67例和潜伏性结核感染(LTBI)22例，无结核感染的健康志愿者(NTB)19例；各组间在性别和年龄上无统计学差异。67例活动性结核患者血样来自上海市肺科医院的常规抗结核治疗前的结核患者。活动性肺结核(ATB)受试者至少一次痰标本的培养或者结核菌DNAPCR分子诊断为阳性。潜伏性结核感染(LTBI)则为所有痰标本的培养或者结核菌DNAPCR分子诊断和抗酸染色为阴性，但IGRA为阳性的受试者。无结核感染的健康志愿者(NTB)为所有痰标本的培养或者结核菌DNAPCR分子诊断、抗酸染色、IGRA均为阴性的受试者。
结核特异性抗原的合成和制备
采用多肽固相合成法制备下述结核特异性抗原ESAT-6的多肽，序列分别为MTEQQWNFAGIEAAAS、AGIEAAASAIQGNVTS、AIQGNVTSIHSLLDEG、KWDATATELN NALQNL、GQAMASTEGNVTGMFA；及CFP-10多肽，序列分别为MAEMKTDAATLAQEA GNF、QEAGNFERISGDLKTQ、VVRFQEAANKQKQELDEI、NIRQAGVQYSRADEEQQQ、RADEEQQQALSSQMGF。多肽采用HPLC纯化后进行质谱鉴定，纯度>95％。
各抗原肽用0.05M pH7.2磷酸缓冲液溶解为1mg/mL母液，并按等体积混合形成终浓度为100ug/mL的ESAT-6/CFP-10混合抗原液。
外周血结核抗原刺激
健康人、潜伏性结核和活动性结核的患者外周血肝素抗凝标本，取0.5mL全血，加入ESAT-6/CFP-10混合抗原液50μL，加入1μL 500ⅹMonensin，混匀后放置于37℃温箱孵育5-16小时。
IFNγ+GZMA+CD4T细胞的流式检测流程
1)加入红细胞裂解液5mL,室温放置10分钟，350g离心5分钟，倾去上清。
2)加入1％BSA-PBS 5mL清洗，350g离心5分钟，倾去上清。
3)加入1％BSA-PBS 0.2ml,并加入CD3+、CD4+荧光抗体进行胞膜染色，避光室温孵育45分钟。
4)加入1％BSA-PBS 1mL清洗，350g离心5分钟，倾去上清。
5)加入1mL 0.5％多聚甲醛固定10分钟后，1％BSA-PBS 1mL清洗，350g离心5分钟，倾去上清。
6)加入1mL 0.2％Triton X100透膜处理10分钟，1％BSA-PBS 1mL清洗，350g离心5分钟，倾去上清。
7)加入1％BSA-PBS 0.2ml,并加入IFNγ+和GZMA+荧光抗体进行胞内染色，避光室温孵育45分钟。
8)加入1mL 1％BSA-PBS，清洗，350g离心5分钟，倾去上清，并加入0.5mLPBS。
9)标记好的样品用流式细胞仪进行上机检测。设计方案如图1，为：在CD3～SS双参数图上选择CD3+T淋巴细胞，进而在CD4或CD8～IFNγ双参数图上选择出IFNγ+CD4+T淋巴细胞和IFNγ+CD8+T淋巴细胞，进而在IFNγ+GZMA+双参数图上，选择出CD4+IFNγ+GZMA+T细胞。分别求算IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值和IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度。
实例1结核抗原体外刺激下，IFNγ+单阳性CD4和CD8T细胞无法区分活动性结核和潜伏性结核
分别采用无结核感染的健康人(NTB)10例，活动性结核(ATB)67例和潜伏性结核感染(LTB)10例(下同)，采集外周血，经体外结核抗原刺激后，测定IFNγ+CD4+细胞占CD4+细胞的比例。
结果如图2A，同无结核感染的健康人(NTB)相比，活动性结核和潜伏性结核患者的IFNγ+CD4+/CD4+细胞的比例均有上升(p<0.05),但IFNγ+CD4+/CD4+比值在活动性结核和潜伏性结核患者之间无统计学差异，结果表明经体外结核抗原刺激后，IFNγ+单阳性CD4细胞确实可以区分无结核感染的健康人和结核感染(包括活动性结核和潜伏性结核)，但是IFNγ+单阳性CD4细胞无法区分活动性结核和潜伏性结核。
结果如图2B，同无结核感染的健康人相比，活动性结核和潜伏性结核患者的IFNγ+CD8+/CD8+细胞的比例均有上升(p<0.05),但IFNγ+CD8+/CD8+比例在活动性结核和潜伏性结核患者之间无统计学差异，结果表明经体外结核抗原刺激后，IFNγ+单阳性CD8细胞也可以区分非结核感染和结核感染(包括活动性结核和潜伏性结核)，但是IFNγ+单阳性CD8细胞也无法区分活动性结核和潜伏性结核。
实例2结核抗原体外刺激下，GZMA+单阳性的CD4和CD8T细胞含量无法区别活动性结核和潜伏性结核
分别采用无结核感染的健康人(NTB)，活动性结核(ATB)和潜伏性结核感染(LTBI)受试者外周血，经体外结核抗原刺激后，流式测定，计算GZMA+CD4+细胞占CD4+细胞的比例。
结果如图3A，3B。经体外结核抗原刺激后，测定GZMA+CD4+细胞占CD4+细胞的比例及GZMA+CD8+细胞占CD8+细胞的比例。结果表明，同潜伏性结核患者相比，活动性结核的GZMA+CD4+/CD4+细胞的比例、GZMA+CD8+细胞占CD8+的比例在ATB和LTBI组间无统计学差异(p>0.05)，表明GZMA+单阳性的CD4和CD8T细胞均无法区分活动性结核和潜伏性结核。
实例3结核抗原体外刺激下，IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量可以用于活动性结核和潜伏性结核的鉴别
分别采用无结核感染的健康人(NTB)，活动性结核(ATB)和潜伏性结核感染(LTBI)受试者外周血，经体外结核抗原刺激后，流式测定并计算表示IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量的3种指标，分别为IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞占CD4T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+)、IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞占IFNγ+CD4T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+)和IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均荧光强度(MFI)。
指标IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值的结果如图4A，4B。IFNγ+GZMA+双阳性CD4和CD8T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+和IFNγ+GZMA+CD8+/CD8+)在活动性结核和潜伏性结核之间的差异。结果如图4所示，IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值在活动性结核中明显升高(p<0.0001)，而IFNγ+GZMA+CD8+/CD8+比值则在两组间无统计学差异。结果表明，在体外结核抗原刺激下，IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞的含量在活动性结核中显著升高，可以作为鉴别活动性结核的指标。
指标IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值的结果如图5A，5B。IFNγ+CD4和IFNγ+CD8T细胞中的GZMA+细胞比例(IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+和IFNγ+GZMA+CD8+/IFNγ+CD8+)在活动性结核和潜伏性结核之间的差异。结果如图5所示，IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值在活动性结核中明显升高(p<0.0001)，而IFNγ+GZMA+CD8+/IFNγ+CD8+比值则在两组间无统计学差异。结果表明，在体外结核抗原刺激下，IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞在IFNγ+CD4+的含量在活动性结核中显著升高，可以作为鉴别活动性结核的指标，且其鉴别效能优于IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+。
指标IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均荧光强度(MFI)的结果如图6A，6B。IFNγ+CD4+T和IFNγ+CD8+T细胞中的GZMA的平均荧光强度(MFI)在活动性结核和潜伏性结核之间的差异。结果如图6所示，在CD4+T细胞中，GZMA的平均荧光强度(MFI)在活动性结核和潜伏性结核两组间有统计学差异(p<0.05)。而在CD8+T细胞中，GZMA的平均荧光强度(MFI)在活动性结核和潜伏性结核两组间无统计学差异。结果表明，在体外结核抗原刺激下，IFNγ+CD4+T细胞中的GZMA的平均荧光强度(MFI)可以作为鉴别活动性结核和潜伏性结核的指标。
实例4IFNγ+单阳性、GZMA+单阳性、IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量鉴别活动性结核和潜伏性结核的受试者工作特征(ROC)曲线的比较
绘制受试者工作特征(ROC)曲线，结果如图7所示，IFNγ+单阳性CD4T细胞含量(IFNγ+CD4+/CD4+)鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.597，GZMA+单阳性CD4T细胞含量(GZMA+CD4+/CD4+)鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.532，二者均无诊断价值。而IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量(GZMA+IFNγ+CD4+/CD4+)鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.928，具有较高的诊断价值。
实例5IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量的三种指标鉴别活动性结核和潜伏性结核的受试者工作特征(ROC)分析
测定并计算IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞的3种指标，分别IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞占CD4T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+)，IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞占IFNγ+CD4T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+)和IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均荧光强度(MFI)，比较这三种指标的诊断价值。结果如图8所示，指标IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均荧光强度(MFI)鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.604，指标IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.928，IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+鉴别活动性结核和潜伏性结核的曲线下面积(AUC)为0.988，因此，在IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞的3种指标中，IFNγ+GZMA+双阳性CD4T细胞占IFNγ+CD4T细胞的比例(IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+)具有最高的诊断价值。
实例6IFNγ+GZMA+CD4+T/IFNγ+CD4+T比值在结核患者接受抗结核治疗前后的差异
收集15例活动性结核病受试者的治疗前血样，测定IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量。随访，并于抗结核治疗3个月后，评估结核治疗效果，并重新采集血样测定IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量。结果如图9。结果表明，经过抗结核药物治疗后，受试者的IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量显著性下降，IFNγ+GZMA+双阳性的CD4T细胞含量监测可用于结核病疗效监测和预后评估。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种结核病的免疫标志物，其特征在于，所述的免疫标志物包括：IFNγ、GZMA双阳性的CD4 T细胞。
2.权利要求1所述的免疫标志物在制备潜伏性结核和活动性结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的核心成分为下述三种物质的组合：检测CD4的物质、检测IFNγ的物质和检测GZMA的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测CD4的物质、检测IFNγ的物质、检测GZMA的物质选自CD4阳性标记或CD8阴性标记、IFNγ、GZMA的抗体或标记抗体，并成为抗体组合。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒应用于经过结核抗原体外刺激后的外周血，检测其中的IFNγ+GZMA+双阳性CD4 T细胞含量。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用来鉴别活动性和潜伏性结核病的指标为：IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+比值、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+比值、IFNγ+CD4T细胞群的GZMA平均表达强度；其中，所述IFNγ+GZMA+CD4+/CD4+的阈值为0.01％～0.05％、IFNγ+GZMA+CD4+/IFNγ+CD4+的阈值为0.05～0.30、IFNγ+CD4 T细胞群的GZMA平均表达强度的阈值为0.5×103～4.0ⅹ103。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于区分活动性和潜伏性结核病，包括痰培养结核菌阳性和阴性，痰涂结核菌阳性和阴性，结核菌分子检测阳性和阴性的结核菌感染者。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用来疗效预后监测的指标为：外周血中IFNγ+GZMA+双阳性CD4 T细胞量显著降低，说明药物起疗效、预后复发风险低。
9.根据权利要求2～8任一所述的应用，其特征在于：所述结核病包括肺结核和肺外结核。
10.一种潜伏性结核和活动性结核鉴别诊断和/或疗效预后监测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测物质和说明书；其中，所述检测物质包括检测CD4的物质、检测IFNγ的物质、检测GZMA的物质的三者组合；所述说明书记载了鉴别活动性和潜伏性结核病和疗效预后监测的流程和指标。
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