KR20220018149A - 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법 - Google Patents

인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피검사자로부터 채혈된 혈액을 이용하여 잠복결핵 감염 여부를 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법에 관한 것으로서, 인라인 마이크로 튜브세트와 화학발광면역측정 장치를 이용함으로써, 종래에 비해 신속하면서도 정확한 잠복결핵 감염 여부를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법{DETECTION METHOD OF LATENT TUBERCULOSIS INFECTION USING INLINE MICROTUBE SET}
본 발명은 피검자의 채혈된 혈액을 이용하여 잠복결핵 감염 여부를 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법에 관한 것이다.
전 세계 인구의 3분의 1이 결핵균에 감염되어 있으며, 결핵이 발명하는 환자의 90% 이상이 이미 감염되어 있는 사람에게서 발병한다는 자료는 활동성 결핵 뿐 아니라 잠복결핵 환자의 올바른 진단 및 치료도 결핵의 조절 및 근절에 중요한 역할을 한다. 결핵은 결핵균((Mycobacterium tuberculosis complex)의 감염에 의해 생기는 전염성 질환으로써, 호흡기결핵을 앓는 환자로부터 비말핵(airborne droplet nuclei)을 통해 새로운 숙주로 퍼지게 된다. 새로이 감염된 개체는 수주에서 몇 개월 안에 결핵 증상이 나타나지만 대부분의 감염된 개체는 결핵 증상이 나타나지 않고 잠복성으로 남아있게 된다. 이렇게 결핵균에 감염되었지만 증상을 보이지 않는 상태를 잠복성 결핵 (Latent tuberculosis infection, LTBI)이라 하며 수주에서 수년 후에 발병할 수 있다. 잠복성 결핵을 진단하는 가장 큰 목적은 결핵 발병을 막기 위한 의학적 치료를 판단하기 위함이다.
잠복결핵은 결핵균에 감염이 되었으나 타인에게 위험이 없는 상태를 말하며, 정상인과 동일하게 아무런 증상이 없다. 그러나 잠복결핵 감염 상태에서 활동성 결핵으로 증가할 가능성은 존재하며, 특히 잠복결핵 감염자의 상태가 활동성 결핵으로 진행하게 되어 집단 내에 파급효과가 큰 경우, 국가결핵관리 지침 등에 따라 잠복결핵감염 검진을 권고하고 있다. 종래에 잠복결핵의 감염을 진단하기 위한 검사방법으로는 크게 투베르쿨린 검사(Tubercluin skin test, TST)와 인터페론감마 분비 검사(interferon-gamma release assay, IGRA) 등 2가지 방법이 존재하였다. 이 두가지 방법은 모두 간접적인 면역반응을 이용하기 때문에 그 결과가 양성이라면 치유된 결핵, 활동성 결핵, 및 잠복결핵 감염을 구분하지 못한다. 따라서 이전 결핵 치료의 과거력이 없는 사람에게서 검사 결과가 양성이라면 우선 활동성 결핵을 배제한 후 잠복결핵 감염으로 진단하였다.
투베르쿨린 검사의 경우 BCG 접종자에서 위양성이 발생하게 되며, 결핵항원 접종 후, 전문의의 육안 판독이 필요하여, 피검사자가 2회 이상 병원을 방문해야 하는 번거로움이 있었고, 판독과정 역시 주관적인 육안 판독에 의존하므로 검사 정확도가 낮은 문제가 있었다.
인터페론감마 분비 검사는 말초혈액을 채취하여 결핵균 항원으로 자극한 후 결핵균 항원을 인지할 수 있는 T 림프구에 의한 IFN-γ 생성능을 확인하는 검사이다. 즉 IFN-γ가 생성되면 체내에 결핵균 항원을 인지할 수 있는 T 림프구가 있으므로 결핵균에 감염되었음을 의미한다. 인터페론감마 분비 검사는 크게 T-SPOT 방식과 QFT(QuantiFERON®-TB) 방식으로 나뉘게 되며, 전혈사용으로 검사가 용이한 QFT 방식이 많이 이용되고 있다. 이러한 방식들은 결핵균 특이 항원을 사용하므로 BCG 접종이나 비결핵 항산균 감염에 의한 위양성을 줄여 특이도를 높일 수 있다는 점이다. 그러나 QFT 방식의 경우에도 많은 제한요소가 있어 전체 검사에 많은 시간이 소요된다. 특히 사용되는 피검사자의 4개의 튜브가 각각 이루어져 있어, 다른 피검사자의 튜브와의 구분이 용이하지 않으며, 여러 시험과정에서 뒤섞여서 잘못된 결과를 나타낼 가능성이 상존하며, 원심분리 시간이 오래 걸리는 문제가 있었다. 또한, QFT 방식에서 결과 분석에 사용하는 효소결합면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 시스템은 한 번에 최대 46명의 검사만 진행이 가능하며, 검체 수에 따라 시약의 로스가 발생하게 되며, 구동 범위가 넓지 않아 판독불가 발생율이 높은 문제가 있었다.
본 발명의 목적은 시약튜브의 부피가 작고, 피검사자의 혈액검사용 마이크로 튜브가 일렬로 연결되어, 기존의 QFT 방식에 비해 신속하고 정확한 잠복결핵의 진단이 가능한 잠복결핵 감염 검사방법을 제공하는데 있다.
상기 본 발명의 목적은, 잠복 결핵을 검사하는 방법으로서, 복수의 시약튜브가 일렬로 연결된 인라인 마이크로 튜브세트를 준비하는 튜브세트 준비단계, 피시험자의 혈액을 채혈하여 상기 인라인 마이크로 튜브세트에 인입하는 채혈단계, 상기 혈액이 인입된 인라인 마이크로 튜브세트를 인큐베이팅하는 인큐베이션 단계, 상기 인큐베이션 단계 이후, 상기 인라인 마이크로 튜브세트를 원심분리장치에 장착하여 혈액을 원심분리하는 원심분리 단계, 및 상기 원심분리 단계 이후, 상기 인라인 마이크로 튜브세트를 화학발광면역측정을 하는 화학발광면역측정 단계를 포함하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법에 의해 달성된다.
상기 시약튜브는 에펜도르프 튜브이며, 상기 마이크로 튜브세트는 상기 시약튜브를 인라인 상태로 연결하는 연결부를 포함하며, 상기 각 시약튜브는 뚜껑부를 포함할 수 있다.
상기 시약튜브는 제1튜브, 제2튜브, 제3튜브 및 제4튜브를 포함하여 이루어지며, 상기 제1튜브의 내부는 식염수가 코팅되어 있고, 상기 제2튜브의 내부는 결핵균 유래의 합성펩타이드가 코팅되어 있고, 상기 제3튜브의 내부는 상기 제2튜브에 코팅된 것과 동일한 합성펩타이드 및 추가펩타이드가 코팅되어 있고, 상기 제4튜브의 내부는 T세포 자극물질이 코팅되어 있을 수 있다.
상기 합성펩타이드는 ESAT6(early secretory antigenic target-6) 및 CFP10(culture filtrate protein-6)를 포함할 수 있다.
상기 추가펩타이드는 CD8+ T세포를 자극할 수 있는 펩타이드일 수 있다.
상기 추가펩타이드는 EsxJ(QTVEDEARRMW), PE9 (RLFNANAEEYHALSA), PE_PGRS42(SAAIAGLFG) 중 선택되는 적어도 하나 이상일 수 있다.
상기 T세포 자극물질은 파이토헤마글루티닌을 포함할 수 있다.
상기 원심분리하는 단계에서, 원심분리 속도는 5000 내지 14000 rpm이며 원심분리 시간은 20초 내지 120초일 수 있다.
상기 화학발광면역측정 단계는, 최대 검사 가능한 범위가 80 IU/ml일 수 있다.
상기 화학발광면역측정 단계 이후, 분석프로그램을 이용하여 검사 결과를 계산하는 검사결과 분석단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법은 시약튜브가 인라인으로 연결되어 피검사자의 시약튜브를 용이하게 관리할 수 있으며, 튜브의 용적이 적어 보관을 위한 공간을 줄일 수 있고, 정확한 혈액량 분주가 가능해져 검사 결과의 재현성이 상승하게 된다. 또한, 원심분리 시간을 종래에 비해 많이 감소시킬 수 있다.
본 발명의 검사방법은 화학발광면역측정 장치를 이용함으로써, 검사와 결과분석이 자동화되어 공간 및 노동력이 감소하게 되며, 시약의 손실이 발생하지 않으며, 분석이 완료된 피검사자의 튜브세트를 분석 중간에 새로운 피검사자의 튜브세트와 교체할 수 있어 검사 및 분석 시간을 크게 줄일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 인라인 마이크로 튜브세트의 정면도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법의 순서도이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 도시한 일 예에 불과하므로 본 발명의 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다.
효소결합면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)은 생물학적 시료들(혈액, 뇨, 조직, 세포 등)에 포함되어 있는 특정 항원 혹은 항체를 면역반응과 생화학 반응을 결합하여 측정하는 방법으로, 약 50년 전 개발된 이후 전 세계적으로 빠르게 급변하는 생명과학분야와 신약개발 분야에서 가장 널리 사용되고 있는 방법 중 하나이다. 효소결합면역분석법은 항체의 활용 방법에 따라 직접효소면역측정법(Direct ELISA), 간접효소면역측정법(Indirect ELISA), 그리고 샌드위치 효소면역측정법(Sandwich ELISA)의 3가지로 세분할 수 있다. 종래에 많이 사용되어 온 QFT 방식도 분석을 위해 효소결합면역분석법을 사용하고 있다.
본 발명에서 사용하는 화학발광면역측정(Chemiluminescent Immunoassay, CIA) 방식은 항원과 항체의 결합을 화학 발광 반응을 이용하여 측정하는 방식이다. 화학 발광 반응이란 화학 발광 물질이 여기상태로 되었다가 기저상태로 돌아오면서 빛을 발하는 현상으로, 분자를 여기상태로 만드는 에너지가 빛이 아닌 화학 반응이라는 점에서 형광과 다르다. 면역 측정에 이용할 때에는 다른 방법들과 마찬가지로 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 화학 발광 물질을 부착하거나, 또는 측정하고자 하는 물질에 반응하는 항체에 화학 발광 물질을 부착하여 항원-항체 반응을 일으킨다. 반응이 일어나고 필요한 화학 반응을 일으킨 후, 발산되는 발광의 정도를 측정하여 이로부터 측정 물질의 농도를 계산한다. 대표적인 발광 물질로는 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄에스터 등이 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명에서의 튜브세트는 채혈을 위한 4개의 마이크로 튜브가 나란히 배치되어 있으며, 인접하는 튜브와 연결된 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 이를 본 발명에서는 인라인 마이크로 튜브세트(10)로 정의하였다. 4개의 각 튜브는 제1튜브(100), 제2튜브(200), 제3튜브(300), 및 제4튜브(400)로 구분된다. 각 튜브와 인접하는 튜브는 연결부(500)를 통해 연결되어 있다. 또한, 각 튜브는 각각의 뚜껑부(110, 210, 310, 410)를 포함한다.
각 튜브는 에펜도르프 튜브인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 2.0 ml 용량의 에펜도르프 튜브인 것이 바람직하다. 이러한 소용량의 에펜도르프 튜브는 본 발명의 특징 중 하나인 원심분리 단계에서 고속 회전을 가능하게 해주어 원심분리 시간을 감소시켜 준다. 또한, 본 발명의 또 다른 특징 중의 하나인 화학발광면역측정(Chemiluminescent Immunoassay, CIA) 장비에의 적용이 용이해진다.
도 2는 본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법에 대한 순서도를 나타낸 것이다. 본 발명의 잠복 결핵을 검사하는 방법의 첫번째는 튜브세트를 준비하는 튜브세트 준비단계(S100)이다.
튜브세트 준비단계(S100)는 각 튜브에 채혈된 혈액과 결합하여 각각의 데이터를 얻을 수 있도록 튜브마다 다른 물질을 코팅된 인라인 마이크로 튜브세트를 준비하는 단계이다.
제1튜브(100)의 내부에는 식염수가 코팅되어 있다. 제1튜브에 코팅된 식염수는, 환자의 혈액 내에 존재하는 IFN-r 양의 기저값을 측정할 수 있게 해준다. 제2튜브의 내부에는 결핵균 유래의 펩타이드로서 ESAT6(early secretory antigenic target-6) 및 CFP10(culture filtrate protein-6)가 코팅되어 있다. 제2튜브의 ESAT6 및 CFP10의 코팅은, 결핵균의 자극에 의해 T 세포가 분비하는 IFN-r 양의 증가폭을 측정할 수 있게 해주며, 특히 주로 CD4+ T 세포의 활성 측정이 가능해진다. 제3튜브의 내부에는 제2튜브에 코팅된 것과 동일한 ESAT6, CFP10과 더불어 CD8+ T 세포를 자극할 수 있는 추가펩타이드가 소량 포함되어 코팅된다. 추가펩타이드는 EsxJ(QTVEDEARRMW), PE9(RLFNANAEEYHALSA), PE_PGRS42(SAAIAGLFG) 중 선택되는 적어도 하나 이상이 포함될 수 있다. 이를 통해 결핵균의 자극에 의해 T 세포가 분비하는 IFN-r 양의 증가폭을 측정함과 동시에, CD4+ T 세포의 활성 이외에 추가적으로 CD8+ T 세포에 의한 IFN-r 양의 증가폭도 반영할 수 있게 해준다. 제4튜브의 내부에는 T 세포의 자극물질로서 파이토헤마글루티닌(PhytoHemagglutinin, PHA)가 코팅되어 있다. 파이토헤마글루티닌은 환자의 T 세포의 활성을 보기 위해 사용하는 물질로서, 환자의 T cell의 활성이 낮은 경우 판독불가 판정을 내림으로서, 자칫 검사결과가 위음성으로 잘못 판정되는 것을 방지하는 목적으로 사용된다.
튜브세트 준비단계(S100) 이후에, 피시험자의 혈액을 채혈하여 인라인 마이크로 튜브세트에 인입하는 채혈단계(S200)를 수행한다. 인라인 마이크로 튜브세트(10)는 4개의 마이크로 튜브가 하나로 이어진 형태이므로, 피시험자의 튜브를 혼동할 가능성이 적으며, 일반 헤파린 시약튜브 하나로 채혈 후, 피펫팅으로 분주를 함으로써, 1ml의 정확한 혈액량 분주가 가능해져 검사 결과의 재현성이 상승한다. 또한, 하나의 헤파린 시약튜브를 통해 채혈하므로, 피검사자의 심적 부담을 완화시킬 수 있다.
채혈단계(S200) 이후, 채혈된 인라인 마이크로 튜브세트(10)를 흔들어 주어 각 튜브에 코팅된 물질과 혈액이 잘 혼합될 수 있도록 한다. 이후, 혈액이 인입된 인라인 마이크로 튜브세트를 인큐베이팅하는 인큐베이션 단계(S300)를 수행한다. 채혈한 인라인 마이크로 튜브세트(10)는 16시간 이내에 배양하는 것이 바람직하다. 인큐베이션은 37℃에서 16 내지 24시간 수행하게 된다. 본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트(10)를 이용함으로써, 기존의 QFT 방식에 비해 튜브용적이 최소화되어 동일 공간에 훨씬 더 많은 검체의 수납이 가능해진다.
인큐베이션 단계(S300) 이후, 인큐베이션된 혈액이 포함된 인라인 마이크로 튜브세트(10)를 원심분리장치에 장착하여 인큐베이션된 혈액을 원심분리하는 원심분리 단계(S400)을 수행한다. 원심분리 속도는 5000 내지 14000 rpm이며 원심분리 시간은 20초 내지 120초 인 것이 바람직하다. 원심분리 속도가 5000 rpm보다 낮을 경우 원심분리에 걸리는 시간이 크게 증가하게 되며, 각 튜브 혈액의 원심분리가 잘 되지 않는 문제가 있고, 원심분리 속도가 14000 rpm을 넘을 수 없는데, 이는 본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트(10)가 장착될 수 있는 원심분리 장치의 최고속도이기 때문이며, 장치의 개선이 이루어질 경우 더 높은 회전을 적용해도 될 것으로 판단된다.
원심분리 단계(S400) 이후에, 라인 마이크로 튜브세트를 화학발광면역측정을 하는 화학발광면역측정(Chemiluminescent Immunoassay, CIA) 단계(S500)를 수행한다. 화학발광면역측정 단계(S500)를 통해 각 튜브의 코팅물질에 따라 달라지는 IFN-r 분비량에 대한 정량분석이 이루어진다. 화학발광면역측정 방식에 필요한 시약은 항 Human IFN-r 항체, Enzyme-conjugated 항체, Magnetic nano particle, 세척액, 화학발광 기질 등이 있으며, 시중에서 용이하게 구할 수 있다. 본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트(10)를 기존 화학발광면역측정 장치에 적용하는 것 또한 용이하다. 기존의 검체 수납 파트를 본 발명의 인라인 마이크로 튜브세트(10)와 유사한 에펜도르프 튜브 형태로 교체가 용이하며, 탈착가능한 형태로서 전용튜브세트가 이미 판매되고 있다.
또한, 화학발광면역측정 단계(S500) 이후 분석소프트웨어를 통한 분석 단계가 포함될 수 있다. 화학발광면역측정 장치에서 도출된 값은 간단한 사칙연산을 통해 분석이 가능하다.
화학발광면역측정 장치를 이용한 분석 방법은 종래의 QFT 방식이 사용하던 효소결합면역분석법 방식이 분석시간이 약 2시간 정도 소요되던 것에 비해 약 30여분이 소요되어, 분석시간을 크게 줄일 수 있다. 또한, CIA 분석 특성 상 검사와 분석결과를 얻는 과정이 자동화되어 있고, 하나의 장비로 가능하여 공간이 절약되며, 노동력을 감소시킬 수 있다. 또한, 분석이 끝난 인라인 마이크로 튜브세트(10)부터 약 1분의 간격으로 교체해가면서 분석이 진행할 수 있어, 종래의 효소결합면역분석법방식이 최대 46명이 한계이며 모든 검체의 분석이 종료될 때까지 부분교체가 불가능하여 효율성이 떨어지는 부분을 개선하였다. 또한, 고전적인 효소결합면역분석법 방식은 특성상 10 IU/ml의 범위를 넘어서는 검체는 판독이 불가능했으나, 화학발광면역측정 방식은 최대 80 Ul/ml 까지 분석이 가능하여 판독불가 발생률이 높았던 문제도 해결하였다.
한편 본 발명은 결핵 검사를 위한 정보를 제공하는 방법에도 적용될 수 있다.
전술한 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 예시로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양하게 변형하여 본 발명을 실시하는 것이 가능할 것이므로, 본 발명의 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 잠복 결핵을 검사하는 방법으로서,
    복수의 시약튜브가 일렬로 연결된 인라인 마이크로 튜브세트를 준비하는 튜브세트 준비단계;
    피시험자의 혈액을 채혈하여 상기 인라인 마이크로 튜브세트에 인입하는 채혈단계;
    상기 혈액이 인입된 인라인 마이크로 튜브세트를 인큐베이팅하는 인큐베이션 단계;
    상기 인큐베이션 단계 이후, 상기 인라인 마이크로 튜브세트를 원심분리장치에 장착하여 혈액을 원심분리하는 원심분리 단계; 및
    상기 원심분리 단계 이후, 상기 인라인 마이크로 튜브세트를 화학발광면역측정을 하는 화학발광면역측정 단계; 를 포함하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  2. 제1항에서,
    상기 시약튜브는 에펜도르프 튜브이며,
    상기 마이크로 튜브세트는 상기 시약튜브를 인라인 상태로 연결하는 연결부를 포함하며,
    상기 각 시약튜브는 뚜껑부를 포함하는 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  3. 제1항에서,
    상기 시약튜브는 제1튜브, 제2튜브, 제3튜브 및 제4튜브를 포함하여 이루어지며,
    상기 제1튜브의 내부는 식염수가 코팅되어 있고,
    상기 제2튜브의 내부는 결핵균 유래의 합성펩타이드가 코팅되어 있고,
    상기 제3튜브의 내부는 상기 제2튜브에 코팅된 것과 동일한 합성펩타이드 및 추가펩타이드가 코팅되어 있고,
    상기 제4튜브의 내부는 T세포 자극물질이 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  4. 제3항에서,
    상기 합성펩타이드는 ESAT6(early secretory antigenic target-6) 및 CFP10(culture filtrate protein-6)를 포함하는 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  5. 제3항에서,
    상기 추가펩타이드는 CD8+ T세포를 자극할 수 있는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  6. 제3항에서,
    상기 추가펩타이드는 EsxJ(QTVEDEARRMW), PE9 (RLFNANAEEYHALSA), PE_PGRS42(SAAIAGLFG) 중 선택되는 적어도 하나이상인 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  7. 제3항에서,
    상기 T세포 자극물질은 파이토헤마글루티닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  8. 제1항에서,
    상기 원심분리하는 단계에서, 원심분리 속도는 5000 내지 14000 rpm이며 원심분리 시간은 20초 내지 120초 인 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  9. 제1항에서,
    상기 화학발광면역측정 단계는, 최대 검사 가능한 범위가 80 IU/ml 인 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
  10. 제1항에서,
    상기 화학발광면역측정 단계 이후, 분석프로그램을 이용하여 검사 결과를 계산하는 검사결과 분석단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인라인 마이크로 튜브세트를 이용한 잠복결핵 감염 검사방법.
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