RU2491551C1 - Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза - Google Patents

Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза Download PDF

Info

Publication number
RU2491551C1
RU2491551C1 RU2011153126/15A RU2011153126A RU2491551C1 RU 2491551 C1 RU2491551 C1 RU 2491551C1 RU 2011153126/15 A RU2011153126/15 A RU 2011153126/15A RU 2011153126 A RU2011153126 A RU 2011153126A RU 2491551 C1 RU2491551 C1 RU 2491551C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mycobacteria
blood
lymphocytes
mycobacterium tuberculosis
test
Prior art date
Application number
RU2011153126/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011153126A (ru
Inventor
Борис Евгеньевич Бородулин
Жанна Петровна Васнева
Елена Александровна Бородулина
Татьяна Ефимовна Ахмерова
Евгения Андреевна Амосова
Original Assignee
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России) filed Critical Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России)
Priority to RU2011153126/15A priority Critical patent/RU2491551C1/ru
Publication of RU2011153126A publication Critical patent/RU2011153126A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2491551C1 publication Critical patent/RU2491551C1/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза. Способ осуществляют путем определения в гепаринизированной венозной крови маркера, инкубируя кровь с антигенным материалом микобактерий (опытная проба) и физиологическим раствором (контрольная проба), затем в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченых флюороизотианатом, и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной заключают, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с кровью в опытной пробирке. Способ позволяет подтвердить факт инфицированности микобактериями, установить видовую принадлежность инфекционного агента, определить эффективность вакцинации и выполняется в короткие сроки в течение нескольких часов. Данный способ может применяться в диагностических лабораториях, в противотуберкулезных учреждениях, в общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма. 1 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.
Известен способ определения инфицирования микобактериями туберкулеза по внутрикожной пробе Манту 2ТЕ, суть которого заключается в том, что положительная проба Манту является фактом наличия в организме микобактерий туберкулеза (1).
Недостатком данного способа является сложность интерпретации положительного результата и невозможность идентифицировать микобактерий человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью внутрикожной пробы Диаскинтест. Проба Диаскинтест положительная только в случае активно размножающихся микобактерий человеческого типа (2).
Недостаток этого способа в том, что он идентифицирует микобактерий человеческого вида в фазе активного размножения и может быть сомнительным или отрицательным при доказанных случаях туберкулеза с бактериовыделением, при внелегочном туберкулезе.
Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью бактериологического метода, посева на твердые питательные среды (3).
Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале в большом количестве, длительность метода, ожидание результата до трех месяцев, низкая чувствительность метода, сложная последующая дифференцировка с дополнительными исследованиями.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью ниацинового теста (4).
Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза при культуральном исследовании, длительные и трудоемкие биохимические исследования. Методика позволяет идентифицировать микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий, но не позволяет дифференцировать микобактерий внутри комплекса.
Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (5). Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале, дорогостоящее оборудование, постоянная потребность в дорогостоящих расходных материалах.
Известен способ QuantiFERON-ТВ Gold in Tube, который является тестом для диагностики in vitro, содержащим коктейль пептидов ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7(р4) и стимулирующих клетки в гепаринизированной цельной крови. Для определения in vitro реакции на антигены к этим пептидам, образующейся при инфицировании микобактериями туберкулеза служит определение γ-интерферона с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA. Основой заявляемого способа является определение и последующее количественное определение γ-интерферона, пептидные антигены стимулируют образование γ-интерферона в Т-клетках пациентов, инфицированных микобактериями туберкулеза и не вызывают никакой реакции у неинфицированных людей. Значительный выброс интерферона-γ, регистрируемый после инкубации периферической крови с видовым антигеном микобактерий туберкулеза, является показателем присутствия в организме обследуемого пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к микобактериям туберкулеза человеческого вида и указывает на факт инфицирования этим видом микобактерий (6).
Недостатком данного способа является высокая стоимость, невозможность с его помощью оценить микобактерий бычьего типа вакцинного штамма и эффективность вакцинации. Данный метод и выбран как прототип.
Целью изобретения является создание способа видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченых флюороизотианатом и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы более чем на 20% судят о видовой идентификации микобактерий туберкулеза.
CD45+ - общий лейкоцитарный антиген - трансмембранный гликопротеин, выполняет важную функцию в передаче сигнала внутрь клетки с Т-клеточного рецептора и представлен на поверхности Т-клеток разными изоформами, относится к антигенраспознающим клеткам системы иммунитета, которые за счет морфо-функциональных особенностей молекулы CD45+ и кооперации CD45+ с мембранными антигенно-рецепторными комплексами лимфоцитов осуществляют процессы распознавания, инициации и регуляции развития ответных иммунологических реакций на антигены (7).
В основу способа положена дифференциация нативных CD45+ - лимфоцитов периферической крови от сенсибилизированных с использованием меченых флюороизотианатом методом лазерной проточной цитофлюориметрии по динамике уровня флюоресценции опытной и контрольных проб.
После инкубации периферической крови в трех пробирках, одна из которых является контрольной и содержит физиологический раствор, а две пробирки диагностические, при этом одна пробирка содержит 200 мкл раствора Диаскинтест, представляющая антигены ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7р4, позволяющая диагностировать заражение микобактериями человеческого вида, а другая пробирка содержит раствор вакцинного штамма, позволяющая диагностировать наличие микобактерий бычьего типа. Идентификация вида микобактерий устанавливается по снижению интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробирки. Снижение интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов менее чем на 20% относительно контрольной пробирки является возможной естественной флуктуацией в процессе постановки реакции.
В основе заявляемого способа находится положение о том, что снижение CD45+ - лимфоцитов после инкубации периферической крови с антигенами микобактерий человеческого вида или микобактерий бычьего типа вакцинного штамма являются показателем присутствия в организме обследованного пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к указанным антигенам микобактерий. Если в опытной пробирке регистрируется снижение CD45+ лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробы, то можно заключить, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с периферической кровью в опытной пробирке.
Методика обследования: У пациента в положении сидя берется 3 мл периферической венозной крови и разливается по 1 мл с антикоагулянтом гепарином в приготовленные пробирки №1, №2, №3
Пробирка №1, контрольная - содержит 200 мкл физиологического раствора + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Пробирка опытная №2 - содержит 200 мкл диаскинтест, представляющий антигены микобактерий человеческого вида + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Пробирка опытная №3 - содержит 200 мкл раствора вакцины, представляющая антигены микобактерий бычьего типа вакцинного штамма + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают, пробирки инкубируют в термостате при 37С° в течение 24 часов. После инкубации в каждой пробирке определяется показатель средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+.
Определение уровня интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в контрольных и опытных пробах проводят путем добавления к 100 мкл из каждой пробирки меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+. Далее все пробы инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все пробы обрабатывают гемолизирующей смесью, в результате чего получают взвесь лейкоцитов и лимфоцитов, меченных комплексом флюороизотианатом моноклональных антител. Каждую полученную лейковзвесь анализируют с помощью лазерного проточного цитофлюориметра в режиме лимфогейта и определяют уровень интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ лимфоцитов. Динамику интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы оценивают по формуле:
Figure 00000001
Снижение интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе с антигенами микобактерий относительно контрольной пробы более 20% рассматривают в качестве показателя инфицирования исследованным агентом. Заявляемый способ иллюстрируется примером.
Пациент П., 6 лет, направлен после очередной ежегодной пробы Манту для проведения дифференциальной диагностики послевакцинной и инфекционной туберкулиновой аллергии. Из анамнеза вакцинирован BCG в роддоме, поствакцинальный рубчик 8 мм. При оценке пробы Манту по годам: размер папулы по годам 10, 8, 7, 11, 11 мм, отмечается монотонный характер пробы. Решить инфицирован ребенок микобактериями туберкулеза или это поствакцинальная аллергия по пробе Манту не представляется возможным.
Целью лабораторного обследования является видовая идентификация микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
В соответствии с прилагаемой методикой у пациента взято 3 мл периферической венозной крови и разлили по 1 мл в 3 пробирки с антикоагулянтом (гепарином) в соответствие с изложенной методикой.
- Пробирка №1 контрольная - содержала 200 мкл физ. раствора.
- Пробирка опытная №2 - содержала 200 мкл диаскинтест.
- Пробирка опытная №3 - содержала 200 мкл раствора вакцины BCG, предварительно разведенной в 1 мл дистиллированной воды.
Получили результаты. Пробирка №1 контрольная - 67,0%
Пробирка опытная №2 - 34,6%
Пробирка опытная №3 - 66,8%
1. Расчет для пробирки №2
Д и н а м и к а  ИФ CD45 +   =   67,0 34,6 67,0 × 100 % = 48,4 %
Figure 00000002
2. Расчет для пробирки №3
Д и н а м и к а  ИФ CD45 +   =   67,0 66,8 67,0 × 100 % = 0,29 %
Figure 00000003
Регистрируется снижение ИФср CD45+ - клеток крови в пробирке №2 в тест-системе с антигенами микобактерий туберкулеза человеческого типа на 48,4%.
Заключение. Инфицированность микобактериями туберкулеза человеческого типа.
Преимущество заявляемого способа перед известными заключается в том, что он позволяет подтвердить факт инфицированности микобактериями, позволяет установить видовую принадлежность инфекционного агента, позволяет установить эффективность вакцинации, выполняется в короткие сроки в течение нескольких часов и является значительно дешевле прототипа QuantiFERON-ТВ Gold.
Данный способ может применяться в диагностических лабораториях, в противотуберкулезных учреждениях, в общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
Источники
1. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.184-195.
2. Кожная проба с препаратом «Диаскинтест» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции / Под ред. Академика РАН и РАМН М.А.Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. - С.40-96.
3. Приказ от 21 марта 2003 года №109 О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации. - Москва, 2003. - С.47-62.
4. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.165-166.
5. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.177.
6. Desem, N., Jones, S.L. // Development of a human interferon - y enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection / Clin. Diag. Lab. Immunol. 1998. - №5. - Р.5316.
7. Koretzky G.A. // Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system / FASEB J. - 1993. - №7. - P.420-426.

Claims (1)

  1. Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза, включающий определение в гепаринизированной венозной крови in vitro маркера путем инкубации крови с антигенным материалом микобактерий (опытная проба) и физиологическим раствором (контрольная проба), отличающийся тем, что в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченных флюороизотианатом, и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной заключают, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с кровью в опытной пробирке.
RU2011153126/15A 2011-12-26 2011-12-26 Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза RU2491551C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011153126/15A RU2491551C1 (ru) 2011-12-26 2011-12-26 Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011153126/15A RU2491551C1 (ru) 2011-12-26 2011-12-26 Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011153126A RU2011153126A (ru) 2013-07-10
RU2491551C1 true RU2491551C1 (ru) 2013-08-27

Family

ID=48787207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011153126/15A RU2491551C1 (ru) 2011-12-26 2011-12-26 Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2491551C1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2560679C1 (ru) * 2014-10-14 2015-08-20 Общество с ограниченной ответственностью "ПРИК" Способ диагностики туберкулезной инфекции
RU2648440C1 (ru) * 2016-11-17 2018-03-26 Ольга Викторовна Бердюгина Способ видового определения микобактерий туберкулеза у инфицированного пациента
RU2702609C1 (ru) * 2018-08-06 2019-10-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТ" Минздрава России) Способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2042134C1 (ru) * 1992-10-15 1995-08-20 Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ Способ идентификации микобактерий м. tuberculosis и м. bovis
RU2177507C1 (ru) * 2000-06-26 2001-12-27 Жуков Олег Валерьевич Способ идентификации микобактерий
RU2339700C1 (ru) * 2007-08-01 2008-11-27 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии) Способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий
RU2428484C2 (ru) * 2009-06-08 2011-09-10 Государственное научное учреждение Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ Российской академии сельскохозяйственных наук Способ видовой дифференциации микобактерий туберкулеза

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2042134C1 (ru) * 1992-10-15 1995-08-20 Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ Способ идентификации микобактерий м. tuberculosis и м. bovis
RU2177507C1 (ru) * 2000-06-26 2001-12-27 Жуков Олег Валерьевич Способ идентификации микобактерий
RU2339700C1 (ru) * 2007-08-01 2008-11-27 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии) Способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий
RU2428484C2 (ru) * 2009-06-08 2011-09-10 Государственное научное учреждение Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ Российской академии сельскохозяйственных наук Способ видовой дифференциации микобактерий туберкулеза

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RODRIGUES DS et.al. Immunophenotypic characterization of peripheral Т lymphocytes in Mycobacteriumtuberculosis infection and disease. // Clin Exp Immunol. - 2002 Apr - V.128(1) - P.149-154. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2560679C1 (ru) * 2014-10-14 2015-08-20 Общество с ограниченной ответственностью "ПРИК" Способ диагностики туберкулезной инфекции
RU2648440C1 (ru) * 2016-11-17 2018-03-26 Ольга Викторовна Бердюгина Способ видового определения микобактерий туберкулеза у инфицированного пациента
RU2702609C1 (ru) * 2018-08-06 2019-10-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТ" Минздрава России) Способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011153126A (ru) 2013-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7314358B2 (ja) 結核菌感染の診断及び防止のためのマイコバクテリウム・ツベルクローシス由来のアミノ酸配列又はその対応する核酸の使用、並びにそれらに由来する診断キット及びワクチン
Köhler et al. Immune reactions in cattle after immunization with a Mycobacterium paratuberculosis vaccine and implications for the diagnosis of M. paratuberculosis and M. bovis infections
Goosen et al. Agreement between assays of cell-mediated immunity utilizing Mycobacterium bovis-specific antigens for the diagnosis of tuberculosis in African buffaloes (Syncerus caffer)
AU2007297318A1 (en) Method and kit for detecting if an individual is susceptible to progress to an active mycobacterial disease
RU2491551C1 (ru) Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза
RU2503005C1 (ru) Способ диагностики туберкулеза легких
CN109813903A (zh) 基于流式细胞术检测结核特异性t细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法
RU2503006C1 (ru) Способ диагностики туберкулезного инфицирования
Gormley et al. Current Research at the Badger Vaccine Research Laboratory

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20141227