CN115436631A - 结核病诊断标志物及应用 - Google Patents
结核病诊断标志物及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115436631A CN115436631A CN202211062193.4A CN202211062193A CN115436631A CN 115436631 A CN115436631 A CN 115436631A CN 202211062193 A CN202211062193 A CN 202211062193A CN 115436631 A CN115436631 A CN 115436631A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mscs
- tuberculosis
- lymphocytes
- cell
- vitro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 73
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 206010056377 Bone tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009360 Osteoarticular Tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 201000009663 hepatic tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008267 intestinal tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038534 renal tuberculosis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 2
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 54
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 37
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 6
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 6
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 102000047688 human TG Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 description 2
- WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 4-aminosalicylic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C(O)=C1 WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 1
- 101100341519 Homo sapiens ITGAX gene Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004909 aminosalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091064378 miR-196b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091055929 miR-196b-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091042290 miR-196b-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL‑10和细胞因子TNF‑α作为结核病诊断的标志物以及CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL‑10和细胞因子TNF‑α作为结核病诊断的标志物在诊断结核病中的应用。
Description
技术领域
本申请属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种结核病诊断标志物及应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染性及肉芽肿性疾病。据WHO发布的《2020年全球结核病报告》显示中国仍是TB高负担国家之一，其发病数位居全球第二。2019年全球TB患者约有1000万，而中国TB患者就有约100万，这对我国经济社会发展造成了极大的影响。近年来，随着多重耐药Mtb的出现、艾滋病继发结核感染的病例增多，导致TB的发病率呈上升趋势，结核病现已成为全球公共卫生问题。研究发现多重耐药Mtb能通过调节自身苯丙氨酸代谢、能量代谢及脂肪酸代谢，增加其对抗痨药物卡普霉素和对氨基水杨酸的耐药性。Mtb还可通过上调巨噬细胞miR-196b-5p表达抑制巨噬细胞抗炎功能，并启动异常T细胞包括γδT细胞、MAIT细胞反应促使T细胞IL-22分泌和BTLA表达进行性丧失，以及上调T细胞miR-16表达促使抗原记忆性T细胞耗竭和功能弱化。因此，早期有效的治疗对TB病情的控制至关重要。这就要求提供快速，可靠和即时的诊断方法，以进行有效的病例管理。目前，筛查和诊断结核病的常用方法有影像学检查、内镜检查、活体组织检查和细菌培养，但这些方法仍不能准确诊断结核病。此外，细菌培养被认为是结核病诊断和耐药性测试的“金标准”，但此方法仍需要4到12周的时间才能获得最终的确认报告。因此，开发新型特异性TB诊断标志至关重要。
结核性肉芽肿(Tuberculous granuloma，TG)是TB的基本病理特征，也是宿主免疫与Mtb的“决战场”。TG的形成是一个动态的病理过程，需要多种组分参与，包括多核巨细胞(也称Langhans巨细胞)、类上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞、细胞因子和趋化因子等。然而，目前科学家仍在不断的研究与发现参与TG形成的组分。新近越来越多研究证实TB从潜伏感染者到活动性TB患者的进展主要取决于感染的局部，即TG。因此，全面了解TG结构对TB的诊断标志的开发具有较大意义。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种几乎存在于机体所有组织中的多能干细胞，它具有干细胞的共性，即自我更新和多向分化潜能。在某些生理和实验条件下，MSCs可分化成特定细胞，如成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等，还可在激活后募集到组织损伤部位，再生新的组织并修复缺损。MSCs亦可分泌大量细胞因子。近年来有研究发现骨髓来源MSCs可通过分泌IL-6激活鼻咽癌上皮细胞CD73/腺苷受体信号通路，进而促进细胞生长和耐药。MSCs也可迁移至TG，参与局部环境的免疫调节。
MSCs与Mtb感染存在关联性。新近研究发现MSCs可促进脾肉芽肿中Mtb生长，然而MSCs经poly(A:U)处理后可抑制脾肉芽肿中Mtb生长，提示MSCs对Mtb生长具有调节性。MSCs可通过清道夫受体(Scavenger receptor，SR)和甘露糖受体(Mannose receptor，MR)内化或吞噬Mtb，并通过自噬限制Mtb生长。同时，MSCs还可作为Mtb在TG中休眠的“壁龛”，并调节局部免疫和Mtb耐药过程。另外，Mtb还可募集MSCs到感染部位抑制T淋巴细胞反应，从而逃逸宿主免疫监视。
目前，TB研究受限于缺乏代表人类结核性肉芽肿(TG)的模型。当前使用最广泛的实验动物(小鼠和斑马鱼)在Mtb感染后不会形成真正的TG。非人类灵长类动物TG与人类TG最相似，但由于高昂的运营成本和道德问题，不能被广泛使用。人类TG是一个复杂的免疫过程，单纯或共培养的细胞缺乏3D环境和组织响应，无法模拟TG。因此，开发一种创新性体外TG模型极为重要。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺点，本申请提供了一种结核病诊断标志物及应用，以解决现有技术存在问题，具体采用如下的技术方案：
一种用于结核病诊断的标志物，标志物为CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α中的一种。
一种检测前述的标志物的物质在制备结核病诊断产品中的应用。
进一步地，产品基于ELISA检测法检测细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α的含量。
进一步地，产品基于流式细胞术检测法检测CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞的含量
进一步地，检测用于结核病诊断的标志物的物质用于检测基于MSCs体外新型TG模型中的CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α的含量。
进一步地，产品为试剂盒。
进一步地，所述物质用于检测取自受试者的样品。
进一步地，所述样品选自外周血、血浆或血清。
进一步地，结核病包括肺结核、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。
本申请的有益效果是：
本申请研究发现，基于构建出的基于MSCs体外新型TG模型，CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α的含量在结核病患者和健康人群之间存在差异表达，因此，可以将基于MSCs体外新型TG模型中的CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α作为结核病患者的诊断指标，并且应用到相关诊断产品的制备中，具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请的基于MSCs体外新型TG模型形态图；
图2是本申请的TB患者与HV来源PBMCs建立的体外新型TG模型中MSCs表型变化示意图；
图3是本申请的TB患者与HV来源PBMCs建立的体外新型TG模型中单核巨噬细胞表型变化示意图；
图4是本申请的TB患者与HV来源PBMCs建立的体外新型TG模型中T淋巴细胞表型变化示意图；
图5是本申请的TB患者与HV来源的PBMCs建立的体外新型TG模型中细胞因子变化示意图。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
可以理解的是，本申请未详细说明的试剂仪器均可从市面购买获得，未详细说明的操作方法均按本领域常规操作或厂商说明书进行。
在本申请中，20例来自佛山市第四人民医院的TB患者作为结核实验组。HV(Healthy volunteers，健康志愿者)为健康对照组。
搭建基于MSCs体外新型TG模型的构建方法如下：
1)培养结核分枝杆菌：
将BCG(Bacillus calmette guerin，卡介苗)菌株接种于7H9培养基中，在恒温振荡培养箱中培养一定时间。具体地，在37℃恒温振荡培养箱中培养4周～6周。
其中，7H9液体培养基配置方法为：Middlebrook 7H9粉末4.7g，2mL甘油，0.5mLTween-80，加水补至900mL，121℃高温灭菌10min。待培养基温度冷却50℃后加入100mLOADC增菌液混匀，4℃保存。
2)培养MSCs：
在本申请中，采用的MSCs为LR-MSCs(Lung resident mesenchymal stem cells，人肺间充质干细胞)。
具体而言，将LR-MSCs接种于含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM完全培养基，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内。
其中，α-MEM完全培养基配置方法为：将50mL胎牛血清(FBS)和5mL青霉素-链霉素(双抗)加入到445mL的α-MEM基础培养基中，颠倒混匀即为500mL α-MEM完全培养基。配好之后，贴上封口膜封闭，放在4℃冰箱中低温保存备用。
3)分离PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells，外周血单个核细胞)：
在本申请中，采用密度梯度离心法分离人PBMCs。
具体地，分离过程如下：
(1)取一支15mL无菌离心管，加入与血液样本体积相同的淋巴细胞分离液；
(2)用巴式管小心吸取血液样本缓慢倾斜加于分离液的液面之上，将离心机升降速度调至0，3400rpm/min，室温水平离心30min；
(3)用巴氏管小心吸取第二层白色淋巴细胞层(第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层)于另一无菌15mL离心管中，向离心管中加入10mL无菌PBS缓冲液，吹打混匀细胞悬液，1200rpm/min，室温水平离心10min，弃去上清；
(4)用适量红细胞裂解液重悬细胞，置于冰上裂解10min，1200rpm/min，室温水平离心10min，弃去上清；
(5)向离心管中加入10mL无菌PBS缓冲液，吹打混匀细胞悬液，1200rpm/min，室温水平离心10min，弃去上清；
(6)向离心管中加入10mL无菌PBS缓冲液，重复上一步；
(7)用1mL细胞冻存液重悬得PBMCs悬液，转移到冻存管。将细胞冻存管放置到程序降温盒，于-80℃冰箱过夜后，从程序降温盒中取出细胞冻存管，并转移至液氮罐中进行保存。
通过上述过程，分别分离出TB患者的PBMCs和HV对照组的PBMCs。
4)构建TG模型：
将1.5×105个PBMCs与1.5×105个LR-MSCs接种于低黏附6孔板中，在BCG感染复数为0.1的条件下进行3D体外共培养，从而建立基于MSCs体外新型TG模型。将建立好的基于MSCs体外新型TG模型在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱共培养7天。如图1A-C所示，随着培养时间的增加，细胞聚集越紧密越多，体积也越大。本研究将体外新型TG模型放置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养7天，然后通过HE染色分析其病理形态，结果显示培养体系出现了上皮样细胞放射状排列，并呈结节样结构，表明本申请的构建的基于MSCs体外新型TG模型具有结核性肉芽肿特征，该模型可以用于后续实验，见图1D。
在步骤4)中，采用的MSCs分别来自结核病患者和健康人群，从而分别建立基于结核病患者MSCs体外新型TG模型和基于健康人群MSCs体外新型TG模型。通过研究两个模型之间的区别，从而判断结核病患者和健康人群的差异。通过对模型的的研究，对于结核病的诊断、结核病早期预警、相关诊断产品、靶向药物的研制具有极大的指导意义。
1.TB患者与HV来源PBMCs建立的体外新型TG模型中MSCs表型的变化
分别分离20例TB患者和20例HV来源的PBMCs，将1×105个PBMCs与1×105个LR-MSCs在BCG感染复数为0.1条件下进行3D体外共培养，建立基于MSCs体外新型TG模型。体外TG模型在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养7天后，采用流式细胞术检测LR-MSCs细胞CD73和CD90表达(图2A和图2B)。结果显示，在TB患者来源的PBMCs建立的基于MSCs体外新型TG模型中CD73+LR-MSCs细胞含量(图2C)及CD73+LR-MSCs细胞中CD73表达的平均荧光强度(图2D)均显著高于HV来源的PBMCs建立的TG模型，差异有统计学意义(P<0.05)。另外，CD90+LR-MSCs细胞含量(图2E)及CD90+LR-MSCs细胞中CD90表达的平均荧光强度(图2F)均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示TB患者与HV来源PBMCs可影响体外新型TG模型中MSCs的表型，尤其是TB患者来源的PBMCs会影响新型TG模型中MSCs的功能和分化。
2.TB患者与HV来源PBMCs建立的体外新型TG模型中单核巨噬细胞和T淋巴细胞表型变化
分别分离20例TB患者和20例HV来源的PBMCs，将1×105个PBMCs与1×105个LR-MSCs在BCG感染复数为0.1条件下进行3D体外共培养，建立基于MSCs体外新型TG模型。体外TG模型在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养7天后，采用流式细胞术检测PBMC中CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞的表达(图3A、图4A和图4D)。结果显示，在TB患者来源的PBMCs建立的基于MSCs体外新型TG模型中CD11c+CD11b+单核巨噬细胞含量(图3B)及CD11c+CD11b+单核巨噬细胞中CD11c表达的平均荧光强度(图3C)均显著高于HV来源的PBMCs建立的TG模型，差异有统计学意义(P<0.05)。另外，在TB患者来源的PBMCs建立的基于MSCs体外新型TG模型中CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞(图4B)和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞含量(图4E)也均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞(图4C)和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞中CD161表达的平均荧光强度(图4F)则均无显著差异。以上结果显示TB患者与HV来源PBMCs可影响体外新型TG模型中单核巨噬细胞和T淋巴细胞的表型，尤其是TB患者来源的PBMCs会影响新型TG模型中CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞的功能和分化。
3.TB患者与HV来源的PBMCs建立的体外新型TG模型分泌的细胞因子的变化
分别分离20例TB患者和20例HV来源的PBMCs，将1.5×105个PBMCs与1.5×105个LR-MSCs在BCG感染复数为0.1条件下进行3D体外共培养，建立基于MSCs体外新型TG模型。体外TG模型在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养7天后，采用ELISA检测体外新型TG模型培养上清IL-10、TNF-α和IL-6含量。结果显示，在TB患者来源的PBMCs建立的基于MSCs体外新型TG模型中IL-10含量显著低于HV来源的PBMCs建立的TG模型(图5A)，差异有统计学意义(P<0.001)。而TNF-α含量则显著升高(图5B)，差异有统计学意义(P<0.05)。另外，IL-6含量在HV和TB患者来源的PBMCs建立的体外新型TG模型中无显著差异(图5C)。以上结果显示TB患者与HV来源的PBMCs可影响体外新型TG模型中培养上清IL-10和TNF-α的表达，尤其是TB患者来源的PBMCs可促进新型TG模型中TNF-α表达，而抑制IL-10表达。说明TB患者来源的PBMCs建立的TG模型具有较强的促炎作用。
本实验首次构建了基于MSCs体外新型TG模型，并通过加入TB患者与HV来源的PBMCs，发现TG模型的细胞表型和其产生的细胞因子可以成为新的TB诊断标志。具体地的，基于MSCs体外新型TG模型中的CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞，以及其分泌的细胞因子IL-10和TNF-α均可以成为新的TB诊断标志。
基于上述研究结果，本申请还提供：一种检测CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α中的至少一种的物质在制备结核病诊断产品中的应用。前述的结核病包括肺结核、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。
以上显示和描述了本申请的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本申请，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本申请的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于结核病诊断的标志物，其特征在于，标志物为CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α中的一种。
2.一种检测权利要求1的标志物的物质在制备结核病诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，
所述产品基于ELISA检测法检测细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α的含量。
4.根据权利要求2的应用，其特征在于，
所述产品基于流式细胞术检测法检测CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞和CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞的含量。
5.根据权利要求2的应用，其特征在于，
所述检测用于结核病诊断的标志物的物质用于检测基于MSCs体外新型TG模型中的CD73+MSCs细胞、CD90+MSCs细胞、CD11c+CD11b+单核巨噬细胞、CD161+CD8+CD3+T淋巴细胞、CD161+CD4+CD3+T淋巴细胞、细胞因子IL-10和细胞因子TNF-α的含量。
6.根据权利要求2的应用，其特征在于，
所述产品为试剂盒。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述物质用于检测取自受试者的样品。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述样品选自外周血、血浆或血清。
9.根据权利要求2-8任一的应用，其特征在于：
结核病包括肺结核、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211062193.4A CN115436631A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 结核病诊断标志物及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211062193.4A CN115436631A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 结核病诊断标志物及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115436631A true CN115436631A (zh) | 2022-12-06 |
Family
ID=84244426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211062193.4A Pending CN115436631A (zh) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 结核病诊断标志物及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115436631A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004055516A1 (en) * | 2002-12-18 | 2004-07-01 | Royal Free Hampstead Nhs Trust | Diagnostic method and assay kit |
| CN108845129A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-20 | 广东医科大学 | 一种活动性结核类疾病的生物标志物的应用 |
| CN109991417A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-09 | 上海市肺科医院 | 一种结核病的免疫标志物及应用 |
| US20190226011A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-25 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the detection of a latent tuberculosis infection |
-
2022
- 2022-08-31 CN CN202211062193.4A patent/CN115436631A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004055516A1 (en) * | 2002-12-18 | 2004-07-01 | Royal Free Hampstead Nhs Trust | Diagnostic method and assay kit |
| US20190226011A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-25 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the detection of a latent tuberculosis infection |
| CN108845129A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-20 | 广东医科大学 | 一种活动性结核类疾病的生物标志物的应用 |
| CN109991417A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-09 | 上海市肺科医院 | 一种结核病的免疫标志物及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10371696B2 (en) | Multiparametric method for assessing immune system status | |
| US20110195413A1 (en) | Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample | |
| Guo et al. | Immunomodulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes in patients with decompensated liver cirrhosis | |
| Solchaga et al. | Prostaglandin E2: a putative potency indicator of the immunosuppressive activity of human mesenchymal stem cells | |
| CN1878861B (zh) | 分离和培养来自冻存脐带血的间充质干细胞的方法 | |
| Hoseinzadeh et al. | Dysregulated balance in Th17/Treg axis of Pristane-induced lupus mouse model, are mesenchymal stem cells therapeutic? | |
| CN115436631A (zh) | 结核病诊断标志物及应用 | |
| US9274111B2 (en) | Method for the diagnosis of and/or monitoring mucormycosis | |
| WO2020122405A1 (ko) | 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN102168068A (zh) | 一种从外周血中扩增Vα24NKT细胞的方法 | |
| CN115418347A (zh) | Tg模型及构建方法 | |
| Bellanger et al. | Human monocyte-derived dendritic cells exposed to microorganisms involved in hypersensitivity pneumonitis induce a Th1-polarized immune response | |
| CN109609452A (zh) | 一种高效的巨噬细胞体外制备方法 | |
| CN113884682B (zh) | 检测巨核细胞或血小板表面标志分子的产品在制备检测感染的产品中的用途 | |
| Wirth et al. | The effect of particle size on the immunodepressive properties of silica | |
| JP2018046760A (ja) | 有用なイムノバイオティクスのスクリーニング方法 | |
| JP6732731B2 (ja) | プロバイオティクスの被貪食能の評価方法およびこれを利用したスクリーニング方法 | |
| CN117603909B (zh) | 高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用 | |
| CN114196629B (zh) | 一种高效培养nkt细胞的试剂及其应用和nkt细胞的培养方法 | |
| RU2791738C1 (ru) | Способ получения аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина | |
| CN117757733A (zh) | 一种综合评价人脐带间充质干细胞制剂生物学特性的方法 | |
| CN115248315A (zh) | 酶联免疫斑点实验在氨苯砜综合征诊断中的应用 | |
| Marković et al. | Mesenchymal stem cells from periapical lesions modulate cytokine production by local immune cells | |
| EP3422003A1 (en) | Method for determining if a patient is at risk of having or developing a colorectal cancer (crc) | |
| CN112858688A (zh) | Slamf7表达的cd4+t细胞在制备结核病诊断或治疗试剂中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |