CN108169484A - EV71病毒抗原多肽及其IgM抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种EV71病毒抗原多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该抗原多肽是根据多种EV71病毒流行株基因序列进行比对设计合成的，能够识别多种亚型EV71病毒感染产生的抗体。本发明还提供了一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其采用酶标记抗原是EV71病毒抗原多肽，可以针对多种亚型的EV71病毒株，识别多种亚型EV71病毒感染的病毒血清。本发明的检测试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高，有效检测EV71病毒感染的情况，在防控EV71病毒感染方面起到积极有效的作用。
Description
技术领域
本发明属于免疫生物学技术领域，具体涉及一种EV71病毒抗原多肽及其IgM抗体检测试剂盒。
背景技术
EV71病毒是单股正链RNA病毒，无囊膜病毒，被认为是引起手足口病的主要病原。EV71病毒主要发病人群年龄在5岁以下，比较容易在幼儿园、托儿所等场所流行病毒。EV71病毒通过粪口方式传播，通过儿童体液分泌物：比如鼻涕、唾液、水泡、粪便等接触后交叉传染。分泌物中的EV71病毒在儿童发病的第一周传染性最强。EV71病毒感染病人，常见的症状就是发热，手掌、脚掌、臀部、口腔处形成丘疹性水泡，呼吸道症状包括肺炎，消化道症状肠胃炎等。有些儿童感染EV71病毒没有典型的手足口病症状。一部分的EV71病毒感染患者会导致神经症状和系统性并发症，比如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹。另外少数病人会发展成为神经性肺水肿、心脏衰竭，甚至导致死亡。EV71病毒在中国大陆流行较广，每年的5-7月是流行的高峰期。目前有有效的抗病毒药物用于治疗EV71病毒，临床主要通过对症治疗的方式，一般采用激素和丙球蛋白对重症的病人进行治疗控制病情。因此，对EV71病毒的预防和控制较为有效的方式是通过早期诊断，隔离患者，及早干预治疗控制疫情。
EV71病毒的诊断主要有RT-PCR诊断、血清免疫学诊断。荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度较高，在省市级的三甲医院使用率较高。荧光RT-PCR检测试剂盒操作条件要求高，需要有专门认证的实验室，专业培训的技术人员。另外，该试剂需要昂贵的荧光定量检测仪。因此，基层条件有限的医疗单位没有能力开展PCR检测。血清免疫学诊断因为操作简单、检测时间短、成本低等特点，因此在基层医疗单位应用比较广泛。但是由于EV71病毒变异情况比较严重，因此临床所用的病毒蛋白无法检测到相关的病毒抗体，而造成了漏检现象发生。
因此，本发明开发一种多种EV71病毒的同源性高抗原多肽片段以及EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其具有极高检测的灵敏度，可以解决临床上存在的漏检问题，适合广泛推广。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种EV71病毒抗原多肽、一种EV71病毒抗原多肽偶联物及其制备方法，和EV71病毒IgM抗体检测试剂盒。EV71病毒抗原多肽是多种EV71病毒的同源性高抗原片段；检测试剂盒对EV71病毒具有极高检测的灵敏度，可以解决临床上存在的漏检问题，适合广泛推广。
为解决上述问题，采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种EV71病毒抗原多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该抗原多肽是根据多种EV71病毒流行株基因序列进行比对设计合成的，能够识别多种亚型EV71病毒感染产生的抗体。
本发明提供了一种EV71病毒抗原多肽偶联物，所述偶联物由EV71病毒抗原多肽与载体蛋白组成；化学偶联剂为EDC；所述载体蛋白包括BSA蛋白、OVA蛋白、KLH蛋白。
优选的，所述载体蛋白为BSA蛋白。
本发明提供了一种EV71病毒抗原多肽偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取EV71病毒抗原多肽和EDC.HCL分别溶于水中，混合，在温度为4℃的条件下，搅拌反应10-30分钟，然后向混合液中缓慢滴加入载体蛋白溶液，调pH值至7.4，搅拌反应16-24小时，反应物再透析20-30小时，隔3-5小时换一次透析液，共换液6次，制得EV71病毒抗原多肽偶联物。
优选的，所述载体蛋白溶液的浓度为2-20mg/ml。
特别优选的，所述载体蛋白溶液为BSA蛋白溶液，所述BSA蛋白溶液的浓度为2-20mg/ml。
优选的，所述EV71病毒抗原多肽和EDC.HCl的质量比为(1-5)∶(1-10)；所述EV71病毒抗原多肽和水的质量体积比g/L为(20-100)∶1，所述EDC.HCl和水的质量体积比g/L为(20-200)∶1。
优选的，所述透析液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，pH值为7.2。
本发明提供了一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，包括抗体包被酶标板和酶标记抗原液；所述抗体包被酶标板为包被有羊抗人IgM抗体的酶标板，所述酶标记抗原液为酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释液。
优选的，所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物由EV71病毒抗原多肽偶联物与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法交联获得的。
特别优选的，所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物的制备方法包括以下步骤：
S1：将EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1-5mg/ml，用碳酸盐缓冲液透析10-16小时；所述碳酸盐缓冲液摩尔浓度为50mM，pH值为9.6；
S2：将辣根过氧化物酶配置成浓度为10mg/ml的辣根过氧化物酶溶液，加入NaIO4溶液，室温反应10-45分钟；反应后，加入乙二醇，室温反应20-60分钟，制得辣根过氧化物酶反应液；所述辣根过氧化物酶溶液和NaIO4溶液的体积比为1∶2-10，所述辣根过氧化物酶溶液和乙二醇的体积比为1∶(5-20)；
S3：将辣根过氧化物酶反应液加入步骤S1透析后的EV71病毒抗原多肽偶联物中，在温度为4℃的条件下，透析反应4小时；EV71病毒抗原多肽偶联物和辣根过氧化物酶反应液的体积比1：(2-10)；
S4：将NaBH4配成浓度为2-100mg/ml的NaBH4溶液，将NaBH4溶液加入在步骤S3的混合液中，在温度为4℃的条件下，反应1-3小时，每半小时摇晃一次；NaBH4溶液和辣根过氧化物酶反应液的体积比1∶(1-10)；
S5：步骤S4的反应液中用PBS缓冲液透析24-30小时，透析期间换液5-8次，加入等量体积的甘油，混合均匀，制得酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物；所述PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，pH值为7.2。
优选的，所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释液为用酶标记抗原稀释液将酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1000-5000倍。
特别优选的，所述酶标记抗原稀释液包括PBS缓冲液、小牛血清、酪蛋白、氨基比林和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，小牛血清的体积浓度为为10％，酪蛋白的质量浓度为0.2％，氨基比林的质量浓度为0.1％，ProClin300的质量浓度为0.1％，pH值为7.2。
优选的，所述EV71病毒抗原多肽偶联物为EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白。
优选的，包被有羊抗人IgM抗体的酶标板的制备方法包括以下步骤：
1)包被：用摩尔浓度50mM、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释羊抗人IgM抗体至浓度为5μg/mL，加入酶标板，每孔加95-105μL，在温度为4℃的条件下包被16-24小时，然后用PBST洗涤1次；
2)封闭：每孔加封闭液150μL，在温度为4℃的条件下封闭16-20小时，甩去封闭液，干燥；所述封闭液包括PBS缓冲液、小牛血清、蔗糖和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，小牛血清的体积浓度为为5％，蔗糖的质量浓度为3％，ProClin300的质量浓度为0.05％，pH值为7.2。
特别优选的，所述酶标板为可拆卸酶标板。
最优选的，所述的酶标板为可拆卸的96孔高吸附力酶标板或者48孔高吸附力酶标板。
优选的，一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液底物A、底物B、终止液和洗涤液。本试剂盒是采用捕获法原理检测人血清中EV71病毒IgM抗体。
特别优选的，所述阴性对照血清为健康人血清；阳性对照血清为EV71病毒感染患者的血清。
特别优选的，所述样品稀释液包括PBS缓冲液、BSA、酪蛋白和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，BSA的质量浓度为0.5％，酪蛋白的质量浓度为0.1％，ProClin300的质量浓度为0.1％，pH值为7.2。
特别优选的，底物A为含有质量浓度为0.2％过氧化氢尿素的柠檬酸盐缓冲液；所述底物B为浓度为0.2mg/ml的TMB。
特别优选的，所述终止液为摩尔浓度为2M的硫酸溶液。
特别优选的，所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液和吐温-20，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2M，吐温-20的质量浓度为0.5％，pH值为7.2。所述洗涤液使用时按体积比1∶20稀释。
本发明提供了EV71病毒IgM抗体检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)平衡及配液：
取出试剂盒放置室温平衡30分钟以上；将洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释20倍。
(2)编号：
对血清标本进行编号，并加入相应的酶标板上，做好加样顺序记录。每板至少设2孔阴性对照，1孔阳性对照和1孔空白对照。
(3)加样：
阴性对照2孔，阳性对照1孔，各100ul对照血清。空白对照1孔空置。其余微孔加入100ul样品稀释液，再加入待检的样品10ul，将反应板轻轻震荡使样品混匀。
(4)温育：
用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。
(5)洗板：
将封板膜揭掉，用洗板机洗板5次，最后在吸水纸上扣干。
(6)加酶标抗原液：
每孔加入100ul酶标记抗原液，空白孔除外。
(7)温育：
用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。
(8)洗板：
将封板膜揭掉，用洗板机洗板5次，最后在吸水纸上扣干。
(9)显色：
先加入底物A液，每孔加入50ul，再加入底物B液，每孔加入50ul，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后，37℃避光显色15分钟。
(10)终止：
每孔加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。
(11)测定：
设定酶标仪检测波长为450nm(最好采用双波长450/630检测)，测定各孔A值。单波长检测：以空白孔调零，测试各孔450nm的A值。双波长检测：可不设空白孔，测试各孔450nm/630nm的A值。
(12)结果判定：
临界值：Cut off(C.0)＝0.10+阴性对照平均(NC)A值。
阴性判定：样本A值＜临界值(Cut off值)时判定为EV71病毒IgM抗体阴性。
阳性判定：标本A值≥临界值(Cut off值)时判定为EV71病毒IgM抗体阳性。
本发明还提供了EV71病毒IgM抗体检测试剂盒在检测样品中EV71病毒IgM抗体的应用，从而提供一种检测EV71病毒的途径。
优选的，所述样品为人血清或者人血浆。
本发明的有益效果：
1、本发明的EV71病毒抗原多肽根据多种EV71病毒流行株基因序列进行比对设计合成的，能够识别多种亚型EV71病毒感染产生的抗体；
2、本发明的检测试剂盒采用酶标记抗原是EV71病毒抗原多肽，可以针对多种亚型的EV71病毒株，识别多种亚型EV71病毒感染的病毒血清，可以减少检测假阴现象发生；
3、本发明的检测试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高，有效检测EV71病毒感染的情况，在防控EV71病毒感染方面起到积极有效的作用；
4、本发明的检测试剂盒操作简单，检测时间短，可以满足不同级别的医疗单位使用，在EV71病毒感染的早期诊断中起到较好的监测作用。
具体实施方式
本发明提出一种EV71病毒抗原多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明采用生物信息学方法对23株不同年份不同亚型的EV71病毒流行株基因组进行对比研究，筛选到一个基因序列相对保守的EV71病毒抗原多肽，该多肽能够识别多种亚型EV71病毒感染的血清抗体。将EV71病毒抗原多肽序列提供给吉尔生化上海有限公司公司进行合成，纯度为98％以上，通过质谱法验证合格。
本发明提出一种EV71病毒抗原多肽偶联物，由EV71病毒抗原多肽与载体蛋白组成。化学偶联剂为EDC，载体蛋白包括BSA蛋白、OVA蛋白、KLH蛋白。
以下实施例中各原料、试剂均可市购获得。
下面通过具体较佳实施例结合效果试验例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1
(一)EV71病毒抗原多肽
EV71病毒抗原多肽片段的序列如SEQ ID NO：1所示，总共21个氨基酸，委托吉尔生化上海有限公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。
(二)EV71病毒抗原多肽偶联物(EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白)
EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白的制备方法包括以下步骤：
取20mg EV71病毒抗原多肽和50mg EDC.HCL分别溶于0.5ml超纯水中，混合，在温度为4℃的条件下，搅拌反应30分钟，然后向混合液中缓慢滴加入浓度为10mg/ml的BSA蛋白溶液，调pH值至7.4，搅拌反应16-24小时，反应物再透析20-30小时，隔3-5小时换一次透析液(10mM PBS缓冲液，pH7.2)，共换液6次，制得EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白。
(三)一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒
一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒包括抗体包被酶标板、酶标记抗原液、阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液底物A、底物B、终止液、洗涤液和说明书。
在本实施例中：
抗体包被酶标板(包被有羊抗人IgM抗体酶标板)：8×12孔规格或者4×12孔规格。
酶标记抗原溶液(酶标记的EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白稀释液)：12ml/瓶或者6ml/瓶。1瓶。
阴性对照血清(健康人血清)：1ml/瓶，1瓶。
阳性对照血清(EV71病毒感染患者的血清)：1ml/瓶，1瓶。
样品稀释液(10mM PBS缓冲液，0.5％BSA，0.1％酪蛋白，0.1％ProClin300，pH7.2)：12ml/瓶或者6ml/瓶，1瓶。
底物A液(柠檬酸盐缓冲液，0.2％过氧化氢尿素)：6ml/瓶或者3m1/瓶，1瓶。
底物B液(0.2mg/ml TMB)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
终止液(2M硫酸溶液)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
洗涤液(0.2M磷酸盐缓冲液，0.5％吐温-20，pH 7.2)：50ml/瓶或者30ml/瓶，1瓶。
说明书：1份。
具体地，包被有羊抗人IgM抗体的酶标板的制备方法包括以下步骤：
1)包被：用碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6)稀释羊抗人IgM抗体至浓度为5μg/mL，加入酶标板，每孔加100μL，在温度为4℃的条件下包被16-24小时，然后用PBST洗涤1次；
2)封闭：每孔加封闭液150μL，在温度为4℃的条件下封闭18小时，甩去封闭液(10mM PBS缓冲液，5％小牛血清，3％蔗糖，0.05％ProClin300，pH 7.2)，干燥。优选的，酶标板为可拆卸的96孔高吸附力酶标板或者48孔高吸附力酶标板。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白的制备方法包括以下步骤：
S1：将EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白稀释至1-5mg/ml，取1ml EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白稀释液装入透析袋，放置碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6)透析10-16小时；
S2：将辣根过氧化物酶(HRP)配置成浓度为10mg/ml的HRP溶液，在4ml的HRP溶液中加入1ml的NaIO4溶液，室温反应30分钟；反应后，加入40ul 乙二醇，室温反应30分钟，制得HRP反应液；
S3：将4ml的HRP反应液加入步骤S1透析后的EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白中，在温度为4℃的条件下，透析反应4小时；
S4：将NaBH4配成浓度为10mg/ml的NaBH4溶液，将1500ul的NaBH4溶液加入在步骤S3的混合液中，在温度为4℃的条件下，反应1-3小时，每半小时摇晃一次；
S5：步骤S4的反应液中用PBS缓冲液(10mM，pH 7.2)透析24-30小时，透析期间换液5-8次，加入等量体积的甘油，混合均匀，制得酶标记的EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-BSA蛋白稀释液为用酶标记抗原稀释液(10mM PBS缓冲液，10％小牛血清，0.2％酪蛋白，0.1％氨基比林，0.1％ProClin300)将酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1000-5000倍。
实施例2
(一)EV71病毒抗原多肽
EV71病毒抗原多肽片段的序列如SEQ ID NO：1所示，总共21个氨基酸，委托吉尔生化上海有限公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。
(二)EV71病毒抗原多肽偶联物(EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白)
EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白的制备方法包括以下步骤：
取20mg EV71病毒抗原多肽和50mg EDC.HCL分别溶于0.5ml超纯水中，混合，在温度为4℃的条件下，搅拌反应30分钟，然后向混合液中缓慢滴加入浓度为10mg/ml的OVA蛋白溶液，调pH值至7.4，搅拌反应16-24小时，反应物再透析20-30小时，隔3-5小时换一次透析液(10mM PBS缓冲液，pH7.2)，共换液6次，制得EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白。
(三)一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒
一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒包括抗体包被酶标板、酶标记抗原液、阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液底物A、底物B、终止液、洗涤液和说明书。
在本实施例中：
抗体包被酶标板(包被有羊抗人IgM抗体酶标板)：8×12孔规格或者4×12孔规格。
酶标记抗原溶液(酶标记的EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白稀释液)：12ml/瓶或者6ml/瓶。1瓶。
阴性对照血清(健康人血清)：1ml/瓶，1瓶。
阳性对照血清(EV71病毒感染患者的血清)：1ml/瓶，1瓶。
样品稀释液(10mM PBS缓冲液，0.5％BSA，0.1％酪蛋白，0.1％ProClin300，pH7.2)：12ml/瓶或者6ml/瓶，1瓶。
底物A液(柠檬酸盐缓冲液，0.2％过氧化氢尿素)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
底物B液(0.2mg/ml TMB)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
终止液(2M硫酸溶液)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
洗涤液(0.2M磷酸盐缓冲液，0.5％吐温-20，pH 7.2)：50ml/瓶或者30ml/瓶，1瓶。
说明书：1份。
具体地，包被有羊抗人IgM抗体的酶标板的制备方法同实施例1。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白的制备方法包括以下步骤：
S1：将EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白稀释至1-5mg/ml，取1ml EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白稀释液装入透析袋，放置碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6)透析10-16小时；
S2：将辣根过氧化物酶(HRP)配置成浓度为10mg/ml的HRP溶液，在4ml的HRP溶液中加入1ml的NaIO4溶液，室温反应30分钟；反应后，加入40ul乙二醇，室温反应30分钟，制得HRP反应液；
S3：将4ml的HRP反应液加入步骤S1透析后的EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白中，在温度为4℃的条件下，透析反应4小时；
S4：将NaBH4配成浓度为10mg/ml的NaBH4溶液，将1500ul的NaBH4溶液加入在步骤S3的混合液中，在温度为4℃的条件下，反应1-3小时，每半小时摇晃一次；
S5：步骤S4的反应液中用PBS缓冲液(10mM，pH 7.2)透析24-30小时，透析期间换液5-8次，加入等量体积的甘油，混合均匀，制得酶标记的EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-OVA蛋白稀释液为用酶标记抗原稀释液(10mM PBS缓冲液，10％小牛血清，0.2％酪蛋白，0.1％氨基比林，0.1％ProClin300)将酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1000-5000倍。
实施例3
(一)EV71病毒抗原多肽
EV71病毒抗原多肽片段的序列如SEQ ID NO：1所示，总共21个氨基酸，委托吉尔生化上海有限公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。
(二)EV71病毒抗原多肽偶联物(EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白)
EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白的制备方法包括以下步骤：
取20mg EV71病毒抗原多肽和50mg EDC.HCL分别溶于0.5ml超纯水中，混合，在温度为4℃的条件下，搅拌反应30分钟，然后向混合液中缓慢滴加入浓度为10mg/ml的KLH蛋白溶液，调pH值至7.4，搅拌反应16-24小时，反应物再透析20-30小时，隔3-5小时换一次透析液(10mM PBS缓冲液，pH7.2)，共换液6次，制得EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白。
(三)一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒
一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒包括抗体包被酶标板、酶标记抗原液、阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液底物A、底物B、终止液、洗涤液和说明书。
在本实施例中：
抗体包被酶标板(包被有羊抗人IgM抗体酶标板)：8×12孔规格或者4×12孔规格。
酶标记抗原溶液(酶标记的EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白稀释液)：12ml/瓶或者6ml/瓶。1瓶。
阴性对照血清(健康人血清)：1ml/瓶，1瓶。
阳性对照血清(EV71病毒感染患者的血清)：1ml/瓶，1瓶。
样品稀释液(10mM PBS缓冲液，0.5％BSA，0.1％酪蛋白，0.1％ProClin300，pH7.2)：12ml/瓶或者6ml/瓶，1瓶。
底物A液(柠檬酸盐缓冲液，0.2％过氧化氢尿素)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
底物B液(0.2mg/ml TMB)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
终止液(2M硫酸溶液)：6ml/瓶或者3ml/瓶，1瓶。
洗涤液(0.2M磷酸盐缓冲液，0.5％吐温-20，pH 7.2)：50ml/瓶或者30ml/瓶，1瓶。
说明书：1份。
具体地，包被有羊抗人IgM抗体的酶标板的制备方法同实施例1。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白的制备方法包括以下步骤：
S1：将EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白稀释至1-5mg/ml，取1ml EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白稀释液装入透析袋，放置碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6)透析10-16小时；
S2：将辣根过氧化物酶(HRP)配置成浓度为10mg/m1的HRP溶液，在4ml的HRP溶液中加入1ml的NaIO4溶液，室温反应30分钟；反应后，加入40ul乙二醇，室温反应30分钟，制得HRP反应液；
S3：将4ml的HRP反应液加入步骤S1透析后的酶标记的EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白中，在温度为4℃的条件下，透析反应4小时；
S4：将NaBH4配成浓度为10mg/ml的NaBH4溶液，将1600ul的NaBH4溶液加入在步骤S3的混合液中，在温度为4℃的条件下，反应2小时，每半小时摇晃一次；
S5：步骤S4的反应液中用PBS缓冲液(10mM，pH 7.2)透析24-30小时，透析期间换液5-8次，加入等量体积的甘油，混合均匀，制得酶标记的EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白。
具体地，酶标记的EV71病毒抗原多肽-KLH蛋白稀释液为用酶标记抗原稀释液(10mM PBS缓冲液，10％小牛血清，0.25％胶原蛋白，0.1％氨基比林，0.1％ProClin300)将酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1000-5000倍。
效果试验例1：
EV71病毒IgM抗体检测试剂盒特异性实验
样品：临床病毒患者的血清标本，分别为分别为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、柯萨奇A16病毒、柯萨奇A10病毒、柯萨奇A8病毒感染患者。
诊断确证方法：荧光PCR方法。
实验方法：每种病毒感染患者选取2个，共采集14份病毒感染血清标本，选用实施例1制备的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒进行测试。
EV71病毒IgM抗体检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)平衡及配液：
取出试剂盒放置室温平衡30分钟以上；将洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释20倍。
(2)编号：
对血清标本进行编号，并加入相应的酶标板上，做好加样顺序记录。每板至少设2孔阴性对照，1孔阳性对照和1孔空白对照。
(3)加样：
阴性对照2孔，阳性对照1孔，各100ul对照血清。空白对照1孔空置。其余微孔加入100ul样品稀释液，再加入待检的样品10ul，将反应板轻轻震荡使样品混匀。
(4)温育：
用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。
(5)洗板：
将封板膜揭掉，用洗板机洗板5次，最后在吸水纸上扣干。
(6)加酶标抗原液：
每孔加入100ul酶标记抗原液，空白孔除外。
(7)温育：
用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。
(8)洗板：
将封板膜揭掉，用洗板机洗板5次，最后在吸水纸上扣干。
(9)显色：
先加入底物A液，每孔加入50ul，再加入底物B液，每孔加入50ul，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后，37℃避光显色15分钟。
(10)终止：
每孔加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。
(11)测定：
设定酶标仪检测波长为450nm(最好采用双波长450/630检测)，测定各孔A值。单波长检测：以空白孔调零，测试各孔450nm的A值。双波长检测：可不设空白孔，测试各孔450nm/630nm的A值。
(12)结果判定：
临界值：Cut off(C.0)＝0.10+阴性对照平均(NC)A值。
阴性判定：样本A值＜临界值(Cut off值)时判定为EV71病毒IgM抗体阴性。
阳性判定：标本A值≥临界值(Cut off值)时判定为EV71病毒IgM抗体阳性。
结果：EV71病毒IgM抗体检测试剂盒不能识别甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、柯萨奇A16病毒、柯萨奇A10病毒、柯萨奇A8病毒感染患者血清。
实施例2、3特异性实验的结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
由上述结果可见，EV71病毒IgM抗体检测试剂盒特异性为100％。
效果试验例2：
EV71病毒IgM抗体检测试剂盒与EV71病毒核酸荧光PCR方法对比实验
选取临床疑似病毒感染患者100例，分别采集患者的血液标本和咽拭子标本，分别用实施例1制备的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒与EV71病毒核酸荧光PCR方法进行测试，结果如表1：
表1EV71病毒IgM抗体检测试剂盒与荧光PCR方法比较结果
本发明实施例1制备的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒与EV71病毒核酸荧光PCR方法比较，灵敏度达到93.33％，特异性92.73％。
实施例2、3与EV71病毒核酸荧光PCR方法对比实验的结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
由上述结果可见，本发明EV71病毒IgM抗体检测试剂盒可以符合临床检测的条件。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
<110> 广州瑞辉生物科技股份有限公司
<120> EV71病毒抗原多肽及其IgM抗体检测试剂盒
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Amino Acid Sequence
<400> 1
Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp
5 10
Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met
15 20
Arg
21
Claims (10)
1.一种EV71病毒抗原多肽，其特征在于：具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种EV71病毒抗原多肽偶联物，其特征在于：所述偶联物由EV71病毒抗原多肽与载体蛋白组成；化学偶联剂为EDC；所述载体蛋白包括BSA蛋白、OVA蛋白、KLH蛋白。
3.一种EV71病毒抗原多肽偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取EV71病毒抗原多肽和EDC.HCL分别溶于水中，混合，在温度为4℃的条件下，搅拌反应10-30分钟，然后向混合液中缓慢滴加入载体蛋白溶液，调pH值至7.4，搅拌反应16-24小时，反应物再透析20-30小时，隔3-5小时换一次透析液，共换液6次，制得EV71病毒抗原多肽偶联物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述EV71病毒抗原多肽和EDC.HCl的质量比为(1-5)∶(1-10)；所述EV71病毒抗原多肽和水的质量体积比g/L为(20-100)∶1，所述EDC.HCl和水的质量体积比g/L为(20-200)∶1；所述载体蛋白溶液的浓度为2-20mg/ml。
5.一种EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：包括抗体包被酶标板和酶标记抗原液；所述抗体包被酶标板为包被有羊抗人IgM抗体的酶标板，所述酶标记抗原液为酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释液。
6.根据权利要求5所述的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物由EV71病毒抗原多肽偶联物与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法交联获得的。
7.根据权利要求6所述的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物的制备方法包括以下步骤：
S1：将EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1-5mg/ml，用碳酸盐缓冲液透析10-16小时；所述碳酸盐缓冲液摩尔浓度为50mM，pH值为9.6；
S2：将辣根过氧化物酶配置成浓度为10mg/ml的辣根过氧化物酶溶液，加入NaIO4溶液，室温反应10-45分钟；反应后，加入乙二醇，室温反应20-60分钟，制得辣根过氧化物酶反应液；所述辣根过氧化物酶溶液和NaIO4溶液的体积比为1∶(2-10)，所述辣根过氧化物酶溶液和乙二醇的体积比为1∶(5-20)；
S3：将辣根过氧化物酶反应液加入步骤S1透析后的EV71病毒抗原多肽偶联物中，在温度为4℃的条件下，透析反应4小时；EV71病毒抗原多肽偶联物和辣根过氧化物酶反应液的体积比1∶(2-10)；
S4：将NaBH4配成浓度为2-100mg/ml的NaBH4溶液，将NaBH4溶液加入在步骤S3的混合液中，在温度为4℃的条件下，反应1-3小时，每半小时摇晃一次；NaBH4溶液和辣根过氧化物酶反应液的体积比1∶(1-10)；
S5：步骤S4的反应液中用PBS缓冲液透析24-30小时，透析期间换液5-8次，加入等量体积的甘油，混合均匀，制得酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物；所述PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，pH值为7.2。
8.根据权利要求5所述的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释液为用酶标记抗原稀释液将酶标记的EV71病毒抗原多肽偶联物稀释至1000-5000倍；所述酶标记抗原稀释液包括PBS缓冲液、小牛血清、酪蛋白、氨基比林和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，小牛血清的体积浓度为为10％，酪蛋白的质量浓度为0.2％，氨基比林的质量浓度为0.1％，ProClin300的质量浓度为0.1％，pH值为7.2。
9.根据权利要求5所述的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：包被有羊抗人IgM抗体的酶标板的制备方法包括以下步骤：
1)包被：用摩尔浓度50mM、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释羊抗人IgM抗体至浓度为5μg/mL，加入酶标板，每孔加95-105μL，在温度为4℃的条件下包被16-24小时，然后用PBST洗涤1次；
2)封闭：每孔加封闭液150μL，在温度为4℃的条件下封闭16-20小时，甩去封闭液，干燥；所述封闭液包括PBS缓冲液、小牛血清、蔗糖和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，小牛血清的体积浓度为为5％，蔗糖的质量浓度为3％，ProClin300的质量浓度为0.05％，pH值为7.2。
10.根据权利要求5所述的EV71病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液底物A、底物B、终止液和洗涤液；
所述阴性对照血清为健康人血清；阳性对照血清为EV71病毒感染患者的血清；所述样品稀释液包括PBS缓冲液、BSA、酪蛋白和ProClin300，其中PBS缓冲液的摩尔浓度为10mM，BSA的质量浓度为0.5％，酪蛋白的质量浓度为0.1％，ProClin300的质量浓度为0.1％，pH值为7.2；所述底物A为含有质量浓度为0.2％过氧化氢尿素的柠檬酸盐缓冲液；所述底物B为浓度为0.2mg/ml的TMB；所述终止液为摩尔浓度为2M的硫酸溶液；所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液和吐温-20，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2M，吐温-20的质量浓度为0.5％，pH值为7.2。
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