CN1858594A - 人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法，涉及人类免疫缺陷病毒抗体检测技术。包括下列步骤：1.通过基因工程技术在大肠杆菌中表达五种HIV抗原蛋白片断——p24，gp41，gp36，gp120V3，gp120C；2.将上述五种抗原蛋白固定在硝酸纤维素膜上；3.然后滴加待测血清，其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合，再加纳米金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA)；4.待其渗过膜片后，洗涤；5.再加纳米金标记的抗SPA抗体加强放大即可形成肉眼可见的红色斑点。本发明检测灵敏度高、特异性强、成本低廉，全过程只需5分钟左右，适合疾病现场、基层医疗机构和中心城市大医疗机构使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒抗体检测技术，具体地说，涉及一种人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV，俗称艾滋病毒)是引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS，俗称艾滋病)的病原体。HIV感染早期可检测到病毒抗原(p24，gp41)，但检测到的时间非常短，通常不超过于2周，且抗原浓度很低，诊断难度较大。故大部分HIV血清学诊断依靠检测抗HIV抗原的抗体，大约感染后4～6周可测到抗-HIV。通常抗gag编码蛋白p24的抗体先出现，而针对env编码蛋白(gp41，gp120)和pol编码蛋白(p66，p51，p31)的抗体则稍微晚些出现。对大量HIV阳性样本的免疫印迹分析表明，在血清中抗包膜蛋白抗体和抗核心蛋白p24抗体与其他HIV抗体相比含量较高，是主要的HIV抗体。抗包膜蛋白抗体(抗gp41)反应在整个感染期间高水平出现，抗体稳定而持久，是当前抗体初筛试验的主要靶抗体。抗p24抗体浓度可能随着疾病的进展或因与p24形成抗原抗体复合物而降低。当AIDS相关综合症发展后，p24抗体下降，可测定的p24抗原又出现，在此阶段既可检测到gp41抗体，也可检测到p24抗原，是临近或进入AIDS恶性发展期的征兆。因此，对上述抗体的同步检测有助于医生对病人是否临近或已进入AIDS期做出大致的判断。
迄今为止，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2种类型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1与HIV-2核心蛋白有较强的交叉反应，但包膜蛋白有明显差别，如gp41与gp36。据此，可以通过同步检测核心蛋白和包膜蛋白抗体的组合实现对2种类型HIV的分型检测。IgG类抗体阳性的时间一般为感染后1～3个月内出现，IgM类抗体一般感染后2周出现，3个月后消失。检测IgM抗体有助于早期诊断。
目前常用的HIV抗体检测方法有：酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验(Western Blot，WB)、斑点免疫渗滤/层析试验。
ELISA、WB需要昂贵的仪器，且检测过程繁琐耗时。采用此类方法的实验室通常需要48小时至2周方能报告检测结果，因此病人须再次回到医院诊所取检验结果。对许多病人而言，这一等待过程常常令人焦虑不安，而有些人永远也不会再回去取他们的检验结果。
因此，对快速、廉价而且操作简便的HIV快速检测技术的需求日益扩大。因为HIV快速检测应使病人可以在初次就诊时就得到检测结果和医生的诊治及建议，从而大大减少病人的花费和等待的时间。但现有的HIV快速检测技术(主要指免疫渗滤/层析技术)检测指标较为单一，存在着灵敏度、准确性不高等问题。ELISA由于采用多种HIV抗原混合物，提高了灵敏度，但由于种种原因，其假阳性率也随之增高。特别在HIV感染的低危人群中，ELISA得到的阳性结果，其中50～90％可被确证试验鉴定为假阳性。因此，同步分片段区别检测多种标志物对提高检测的灵敏度和准确性有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法。
本发明的目的是这样实现的：
应用斑点金免疫渗滤试验(Dot Immunogold Filtration Assay，DIGFA)的基本原理，结合有自主知识产权的纳米生物探针制备和检测信号二次纳米放大技术建立的一种同步快速检测多种抗HIV-1/2IgG抗体的方法。
具体地说，包括下列步骤：
①通过基因工程技术在大肠杆菌中表达五种HIV抗原蛋白片段——p24，gp41，gp36，gp120V3，gp120C；
②将上述五种抗原蛋白固定在硝酸纤维素膜上；
③然后滴加待测血清，其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合，再加纳米金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA)；
④待其渗过膜片后，洗涤；
⑤再加纳米金标记的抗SPA抗体加强放大即可形成肉眼可见的红色斑点。
用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-2标准血清)和30份阴性血清进行了试验，结果表明该快速检测方法与ELISA方法在准确性和灵敏度上无显著差异。该检测方法不需任何仪器，仅凭肉眼即可判定结果，整个检测过程不过5分钟。
本发明与现有HIV诊断试剂相比具有如下特点或创新性：
(1)可以同步诊断和区分HIV1和HIV2型感染；
(2)引入P24抗体与其它抗体指标组合模式可用于指示病程发展；
(3)阳性信号由于使用了两种纳米金标记探针的二次放大效应使检测灵敏度达到ELISA水平；
(4)操作简便，检测耗时只有5分钟左右；
(5)结果目视化，无需配套仪器，适合各类诊疗机构；
(6)设置有阴阳性内控指标，使检测结果更加准确。
附图说明
图1—重组表达载体的构建。
图2—检测点模式图。
图3—重组质粒pET-p24，pET-41，pET-36，pET-120C和pET-120V3的双酶切分析图谱；
泳道1，DNA Marker DL 2000；2a，3a，4a，5a，6a分别为重组质粒pET-p24，pET-41，pET-36，pET-120C，pET-120V3的双酶切产物(EcoRI+XhoI)；2b，3b，4b，5b，6b分别为p24，gp41，gp36，gp120C，gp120V3的PCR产物；7，载体+EcoRI。
图4—重组蛋白表达图谱；
含有各重组质粒的BL21(DE3)诱导后全蛋白的SDS-PAGE分析。泳道1，pET-120V3；2，pET-120C；3，pET-36；4，pET-41；5，pET-p24；6，pET28a；7，蛋白分子量标准物。
图5—纯化蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析；
A，蛋白变性后经15％SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色；1～5依次为融合蛋白gp120V3，gp120C，gp36，gp41和p24；6，蛋白分子量标准；B，Western blot鉴定；1，蛋白分子量标准；2，p24；3，gp41；4，gp120V3；5，gp120C；6，gp36。
图6—胶体金和金标SPA的电镜照片；
a，胶体金(15nm)；b，金标SPA(磷酸钨染色)。
图7—胶体金(15nm)与SPA用量比确定曲线。
图8—HIV抗体快速检测结果
a，HIV-1阳性质控(检测点1，2，4显色分别表示抗gp41，p24，gp120抗体为阳性)；b，HIV-2阳性质控(检测点3显色表示抗gp36抗体为阳性)；c，阴性结果(仅点6显色)；d，e，HIV-1阳性结果。
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒 大肠杆菌(E.coli)DH5α(克隆宿主)，BL21(DE3)(表达宿主)及pNL4-3(含HIV-1的全基因组序列)，表达载体pET28-a均为本实验室保存。
1.1.2引物及工具酶 引物由上海生物工程公司合成。Taq酶购自promega公司。限制性内切酶，T4连接酶购自华美生物工程公司。
1.1.3主要试剂和材料 葡萄球菌蛋白A(SPA)及抗SPA抗体购自北京本元正阳基因技术股份有限公司。硝酸纤维素膜购自武汉生命科技有限公司。氯金酸购自上海试剂一厂。
1.2方法
1.2.1HIV抗原表达载体的构建
基因操作参照文献(Sambrook J and Russell D W.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.3rd.New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2000)。重组质粒的构建如图1所示。
1.2.2重组蛋白的表达、纯化与抗原性鉴定
按照常规方法进行IPTG诱导表达及纯化。重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)。按1∶100取过夜培养物转接至100mL含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至OD600nm约为0.6-0.8。加IPTG至浓度1mmol/L，37℃继续培养5h。。离心收获菌体，超声裂解，12000g离心20min，SDS-PAGE分析上清与沉淀，结果表明各表达蛋白均存在于沉淀中。将沉淀用PBS溶液洗涤2次，溶于含6mol/L盐酸胍的磷酸缓冲液(pH8.0)，12000g离心20min，取上清上镍离子亲和树脂柱。结合、洗涤后用pH值5.0～3.0的含8M尿素的磷酸缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析表达产物及纯化蛋白。以HIV阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗，用Western blotting和ELISA方法鉴定重组蛋白的抗原性。
1.2.3胶体金，金标SPA和金标抗SPA抗体的制备
参照Frens等人的方法(Frens G.Controlled nucleation for theregulation of the particle size in monodisperse gold solution.Nature，1973，241：20-22)分别制备粒径约在15nm和25nm的胶体金溶液。
取15nm胶体金溶液1ml，用0.1mol/L K2CO3调pH分别至6.0，加入已确定的SPA(1mg/ml)最佳标记量约14μl，混匀，室温静置15min后，加小牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1％，3000×g离心5min，取上清液20000×g离心45min，弃上清，沉淀用含1％BSA的PBS溶液重悬，4℃下避光保存。用25nm胶体金标记抗SPA抗体，方法同上。
1.2.4胶体金免疫渗滤检测试纸的制备
各取2μl不同HIV抗原蛋白(浓度约1mg/mL)及1mg/mL人IgG，BSA溶液按图2所示阵列点在1.5×1.5cm的硝酸纤维素膜上(其中gp120为蛋白gp120V3和gp120C的混合溶液)，分别作为检测点和质控点。室温下放置，待其干燥后用含5％脱脂奶粉的PBS溶液封闭45min。再用PBS溶液洗涤3次，每次5min。干燥后将其装入免疫渗滤装置板内。
1.2.4检测过程
取50μl PBST溶液(含有0.5％Tween 20的PBS溶液)滴加在检测膜上，润洗膜片。待溶液完全渗过后，均匀、缓慢滴加40μl待检血清(若有聚集物必须先离心除去)。待其渗过后，再加2～3滴PBST溶液洗膜。然后滴加50μl金标SPA溶液，待其渗过后，再加2～3滴PBST溶液洗膜。最后滴加50μl金标抗SPA抗体溶液，待其渗过后，加2～3滴PBST溶液洗膜，观察检测结果。检测点显红色者，其对应HIV抗体为阳性；只阳性质控点(人IgG)显色者为HIV抗体阴性。
2结果
2.1重组质粒的构建与鉴定
四种HIV-1基因片段来自质粒pNL4-3；HIV-2跨膜蛋白gp36基因来自HIV-2毒株(HIV-2 MVP-15132)cDNA。各基因片段通过PCR扩增得到，引物序列见表1。扩增产物及表达载体pET28-a用EcoRI和XhoI双酶切、回收和连接分别得到重组质粒pET-p24、pET-41、pET-120C、pET-120V3和pET-36。各重组质粒经EcoRI和XhoI酶切后，所得片段大小与预期结果相符(见图3)，证明载体构建成功。
Table 1 Primer sequences and their location in HIV-1/2 genomes
| Primer | Sequence(5’～3’) | Location in HIV-1(HBX2)and HIV-2(ROD)genome |
| P24aP24b | CAAGAATTCCCTATAGTGCAGAACCTCATTCTCGAGTTAGCTCATTGCTTCAGC | 1186～1203bp1879～1893bp |
| P41aP41b | GAAGAATTCGCAGTGGGAATAGGAGTTATCTCGAGCAGCCAATTTGTTATGTT | 7758～7773bp8244～8261bp |
| P120CaP120Cb | GACGAATTCACACTCCCATGCAGAATAAAAGCTCGAGAGCTCCTATTCCCACTGC | 7467～7485bp7758～7775bp |
| P120V3aP120V3b | ATTGAATTCCATTATTGTGCCCCGGTAGCTCGAGGTTATAAAGTGGCATTCC | 6870～6885bp7237～7250bp |
| P36aP36b | TTAGAATTCGTGTTCGTGCTAGGGTTCAATCTCGAGGACCCAGGAGGTTAAGTCA | 7683～7700bp8150～8168bp |
2.2各HIV基因片段在E.coli中的表达及纯化
对表达产物的SDS-PAGE分析结果(图4)表明各表达蛋白均存在于沉淀中。其中gp120V3表达菌体不能完全溶于SDS-PAGE上样缓冲液，但可溶于6M盐酸胍溶液。p24的纯化则还可采用柱上复性技术，最后用含250mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱，可得到无变性剂存在的可溶性蛋白溶液。纯化蛋白的SDS-PAGE分析见图5A。
2.3HIV基因表达产物的鉴定
Western blot结果表明5种重组蛋白与HIV阳性血清可发生特异性反应(图5B)。HIV-1的四种抗原中，以p24和gp41反应最强，gp120C次之，gp120V3反应最弱。gp36与gp41序列相当，也有较强的反应。
将各抗原稀释至10μg/ml包被酶标板，分别检测100倍稀释的四份HIV阳性血清和三份阴性血清，结果显示各融合蛋白均能与HIV阳性血清反应，但反应强度有所差异。
2.4胶体金及胶体金标记SPA的透射电镜鉴定结果
取10μl胶体金(15nm)滴于铜网上，滤纸吸干水分，在透射电镜(TEM)下进行观察(电镜照片见图6a)，所制胶体金大约为15nm±2nm，颗粒为圆形，较为均匀，且单分散性较好。
取10μl Au-SPA探针滴于铜网上，滤纸吸干水分，再滴加10μl磷钨酸复染处理，滤纸吸干水分，透射电镜观察。胶体金标记SPA的透射电镜照片(图6b)显示胶体金颗粒周围有明显的灰黑色晕环，表明颗粒表面吸附有蛋白质。此时胶体金的标记并未导致胶体金-SPA形成聚集，金颗粒仍然稳定存在，分散性较好。
同样方法鉴定25nm胶体金及金标物(结果未示出)。
2.5胶体金与SPA用量比的确定
以15nm胶体金为例，胶体金用0.1mol/L的K2CO3溶液调节pH值至6.0。取10管各加1ml的胶体金，分别加入系列体积的1mg/mL SPA，混匀，室温下静置15分钟后各加入100μl 10％NaCl溶液，混匀，分别测定A520nm(520nm为紫外可见分光光度计扫描得到的胶体金最大吸收波长)，以各管所加入SPA的体积数为横坐标，A520nm值为纵坐标作图(图7)。从图中可以看出，当SPA蛋白溶液的体积达到12μl时，此时胶体金颗粒已被饱和，加入高盐溶液后，胶体金颗粒不会产生聚沉。当加入的蛋白量进一步增加时，曲线基本趋于平和，吸收值改变不大。实际应用时，以此量增加10％-20％为实验用量。同样方法确定25nm胶体金与SPA抗体的用量比(结果未示出)。
2.6抗原最佳包被浓度的确定
用SPA模拟抗原，将不同浓度的SPA溶液(3，2，1，0.75，0.5，0.25mg/ml)固定在硝酸纤维素膜上，对梯度稀释的正常血清(含有不同浓度的IgG)进行胶体金免疫渗滤试验。结果显示当IgG浓度较高时，随抗原包被浓度的提高，其显色强度逐渐增加，当抗原浓度高于1mg/ml时，斑点颜色无明显加深；当IgG浓度较低时，随抗原浓度增加，各斑点显色强度无明显改变。
2.7DIGFA同步检测多种抗HIV-1/2抗体
我们对20份HIV-1阳性血清，1份HIV-2阳性血清和30份阴性血清进行了试验(所有血清已通过ELISA检测，阳性血清经W.B.确证)。所有阴性血清经此HIV快速诊断试验结果均为阴性，特异性为100％。HIV-1阳性结果的判定为抗gp41/gp120抗体阳性或与抗p24抗体同时阳性。HIV-2阳性结果的判定为抗gp36抗体阳性。其它非阴性结果则判为疑似。结果20份HIV-1阳性血清的检出率为100％。其中，抗gp41抗体的阳性率为100％(20/20)；抗p24抗体的阳性率为80％(16/20)；抗gp120抗体的阳性率为30％(6/20)。其中有5份HIV-1阳性血清与gp36有着不同程度的交叉反应。一份HIV-2阳性血清被HIV快速诊断试验检出为抗gp36抗体阳性，其他抗HIV-1抗体均为阴性(结果见表2)。对HIV-1，HIV-2标准阳性血清的检测结果表明，此检测试纸可以同步检测并区分HIV-1/2感染(见图8)。
Table 2 Comparison of HIV rapid assay with ELISA
| No.of positive results ofeach detection marker | Rapid anti-HIV antibodies detection assay | ||||
| gp41 | p24 | gp120 | gp36 | ||
| ELISA | HIV-1 positivesera(20) | 20 | 16 | 6 | 5 |
| HIV-2 positiveserum(1) | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| negative sera(30) | 0 | 0 | 0 | 0 | |
3优势
1、市场广阔。由于引入多个HIV检测标志物结合纳米放大技术提高了HIV感染检测的灵敏度和准确性，可以用于早期诊断、病程示踪、区分1/2型，解决了我国艾滋病毒感染的多指标快速检测难题，其产品市场容量巨大。
2、开发难度小。由于为体外诊断，虽然也划入新药的范畴，但不要求作药理、毒理试验，对临床试验的要求也较低，因此，比较容易取得新药证书，产业化门槛较低。
3、投入产出比高。投资回报非常高，投入300万元研发资金在2年左右时间内即可取得新药证书，部分产品还可以在临床研究阶段取得收益。
4、多项专利技术确保项目技术先进。本项目产品对抗体等蛋白质检测灵敏度高、特异性强、成本低廉，全过程只需5分钟左右，适合疾病现场、基层医疗机构和中心城市大医疗机构使用。
Claims (1)
1、一种人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法，其特征在于包括下列步骤：
①通过基因工程技术在大肠杆菌中表达五种HIV抗原蛋白片段——p24，gp41，gp36，gp120V3，gp120C；
②将上述五种抗原蛋白固定在硝酸纤维素膜上；
③然后滴加待测血清，其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合，再加纳米金标记的葡萄球菌蛋白A；
④待其渗过膜片后，洗涤；
⑤再加纳米金标记的抗葡萄球菌蛋白A抗体加强放大即可形成肉眼可见的红色斑点。
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| CN 200610018769 CN1858594A (zh) | 2006-04-14 | 2006-04-14 | 人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |