CN111454354B - 抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于医药技术领域，提供了一种抗2019‑nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用，该抗体特异性地与2019‑nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原结合；所述2019‑nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。包含该抗体的制剂的滴度较高，其与人源化单抗或多抗相比，具有产量大、生产工艺成熟、周期短、成本低、治疗效果明显等特点，不仅可有效中和重症患者体内高滴度的2019‑nCoV病毒颗粒，纯化后的IgG F(ab)2因不具有Fc片段，还可避免可能的抗体增强效应（ADE），为后续治疗赢得宝贵时间,同时对疑似与密切接触者可预防性治疗。

Description

抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用。
背景技术
2019-nCoV病毒是一种新型冠状病毒，可引起人类严重呼吸道疾病。被动免疫在注射后可立即提供保护，而且与被免疫者的自身免疫功能无关，因而特别适于接触病原体后的积极预防和治疗。在疾病暴露后短期内注射制剂可迅速中和体内病原体，及时挽救患者生命。因此制备2019-nCoV抗体将在新型冠状病毒肺炎COVID-19的治疗和预防中可以发挥重要的作用。
血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2，ACE2)为2019-nCoV病毒功能受体。在2019-nCoV的各结构蛋白中，spike蛋白(S蛋白)在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进入细胞的过程中起重要作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白，可以诱导中和抗体的产生。其中S蛋白的受体结合区(receptor binding domain，RBD)可以有效地结合机体细胞功能受体ACE2，因此，这一区是COVID-19亚基疫苗和抗体药物研究中的重要靶序列之一。
目前尚无市售针对2019-nCoV病毒的疫苗与特异性治疗药物，虽然从COV ID-19康复者获得含有高效抗体的血浆具有较好的治疗效果，但血浆来源有限，不能满足当前疫情防控的需求。因此，目前亟待开发一种具有安全、高效、特异性的2019-nCoV病毒抗体药物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种抗2019-nCoV的抗体，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种抗2019-nCoV的抗体，所述抗体特异性地与2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原结合；所述2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种制剂，所述制剂包含上述的抗体。
本发明实施例的另一目的在于提供上述制剂的制备方法，其包括以下步骤：
以2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原作为免疫原对马匹进行免疫；
采集免疫后的马匹的血样，并经分离，得到免疫血浆；
对所述免疫血浆进行提取，得到所述制剂。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述对所述免疫血浆进行提取，得到所述制剂的步骤，具体包括：
往所述免疫血浆中添加胃酶进行消化处理，得到消化样品；
往所述消化样品中添加硫酸铵，并将所述消化样品的pH调至5～6，进行沉淀后，再经固液分离，得到第一上清液；
将所述第一上清液的pH调至7～8，并往所述第一上清液中添加硫酸铵进行沉淀后，再经固液分离，得到沉淀物；
用水将所述沉淀物溶解后，再添加明矾进行吸附，并经固液分离，得到第二上清液。
将所述第二上清液进行浓缩和超滤脱盐处理，得到所述制剂。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述往所述免疫血浆中添加胃酶进行消化处理，得到消化样品的步骤中，具体包括：
将所述免疫血浆稀释2～4倍，并将其pH调至3～4，得到血浆稀释液；
往所述血浆稀释液中添加胃酶和甲苯进行消化处理后，再将其pH调至7～8，得到消化样品。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，每毫升所述血浆稀释液中胃酶的添加量为5～10U。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述用水将所述沉淀物溶解后，再添加明矾进行吸附，并经固液分离，得到第二上清液的步骤，具体包括：
用28～33倍质量的水将所述沉淀物溶解后，再添加明矾进行吸附，使明矾的终浓度为0.5％～1％，然后经固液分离，得到第二上清液。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的制剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制剂在制备抵抗2019-nCoV病毒的药物中的应用。
本发明实施例提供的一种制剂的制备方法，其制得的制剂的滴度较高，其与人源化单抗或多抗相比，具有产量大、生产工艺成熟、周期短、成本低、治疗效果明显等特点，已被实践证明是安全有效的抗体药物，尤其对COVID-19疾病的紧急预防与治疗有着不可替代的作用。该制剂的副作用低，且可以有效中和重症患者体内高滴度的2019-nCoV病毒颗粒，为后续治疗赢得宝贵时间，同时对疑似与密切接触者起到预防性治疗效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种抗2019-nCoV的抗体，该抗体特异性地与2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原结合；其中，2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。另外，含有该抗体的制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1、先依据2015版《中华人民共和国药典》(三部)“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”规定选择马匹。马匹具体可选用无任何传染病，体质健康，营养程度中等以上，年龄4～7岁，无青毛、全白等淡色的马匹，备用；接着，以2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原作为免疫原对上述马匹进行免疫；具体的，2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其为南京巴傲得生物科技有限公司市售的真核Sf9/SF 21昆虫表达系统获得的重组表达的SARS-CoV-2S蛋白受体结合区重组抗原(S-RBD)，浓度≥1.0mg/mL，纯度≥90％，-80℃冻存。免疫部位为：选双侧背部肌肉，肌肉丰满，无病变处。背部以30～45度用刺针3～4cm，多点注射(3～4点)，务必不要注射关节囊或肌腱韧带上。免疫程序如下：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与上述抗原按照等体积比进行充分乳化后，再对马匹进行2次注射(第一次注射4mg抗原，第二次注射5mg抗原)，2次注射间隔10天左右，在末次注射后15天采血测定基免效价，基础免疫完休息4周左右，可进行超免疫。
超免疫选用弗氏不完全佐剂与上述抗原按照等质量比进行充分乳化后，再对马匹进行5次注射(每次注射隔7天，每次抗原的注射量为6mg)，全程天数为40～42天，采血时间可在末次注射后12～14天。
S2、利用假病毒中和试验方法进行抗体效价检测，当免疫后的马匹的血浆中和抗体效价达到1:10000以上时，根据马匹体重按16mL/kg采集血样，在4℃、3000r/min的条件下离心20min，分离得到免疫血浆。免疫血浆短期内存放可置2～8℃冷藏，长期储存需置-20℃冷冻存放。免疫血浆应符合无溶血、无异味、无肉眼所见的染菌，且免疫血浆中和抗体效价为1:10000以上。其中，假病毒中和试验方法如下：
其所采用的试剂包括：DMEM(GIBCO)；0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO)；Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone)；胎牛血清(GIBCO)；PBS(Hy Clone)。所采用的设备、耗材及器具包括：超净工作台；CO2培养箱；倒置显微镜1台；96孔微量细胞培养板；8通道移液枪；已高压1、2、5、10mL刻度吸管；已高压EP管和100、1000μl的枪头。测定的方法包括以下步骤：
1、配液：
(1)细胞生长液的配制：将500mL的DMEM细胞培养液、50mL胎牛血清和5mL的青链霉素进行混合，得到细胞生长液。
(2)病毒稀释液(维持液)的配制：将500mL的DMEM细胞培养液、10mL胎牛血清和5mL的青链霉素进行混合，得到病毒稀释液。
2、将培养好的Vero细胞，用消化样品进行消化，加入一定量生长液做成均匀分散的细胞，进行计数，用细胞生长液稀释细胞浓度至1×105/mL，在中和后的各孔中加入细胞悬液，100μL/孔，混匀，在二氧化碳培养箱培养24小时。
3、样品的稀释：先将待检样品(上述实施例1提供的制剂)用稀释液稀释40倍(1:40)，并取一块96孔细胞培养板，在第1排加入待检样品(1:40)，每孔加入100μL，每个样品重复；其余每孔加入维持液50μL，做倍比稀释(1:40～5120)。排枪由第1排混匀后吸50μL至第2排混匀，依次混匀稀释至第8排弃取50μL(稀释度为1:5120)，病毒回滴孔(第10、11和12列)加入50μL稀释液。
4、攻击病毒毒力滴定：正式实验前先使用相同细胞、相同条件滴定攻击病毒6～10次，取其平均值，求出每0.05mL(50μL)中含100CCID50(细胞培养半数感染量)的病毒载量。(大量分装后直接取用)
5、病毒的稀释：根据事先测定好的攻击病毒滴度进行病毒的稀释，将攻击毒种系列稀释至100CCID50/0.05ml，在系列稀释好的样品孔中各垂直悬滴加入病毒液50μL经(细胞对照除外)，取1.5mL于小离心管中，4℃暂存。
6、中和实验：将细胞培养板混匀，于37℃培养箱中静置1小时中和，期间混匀3次。
7、回滴：待中和结束时取3支小管，加0.9mL稀释液，吸取0.1mL已经稀释好的攻击病毒，系列10倍稀释至1CCID50/0.05mL，分别回滴6孔/稀释度。
8、培养结果判定：接种好的细胞培养板于37℃，5％CO2的培养箱培养，使用倒置显微镜每天观察细胞病变(CPE)，并记录病毒滴定结果，以抑制50％细胞病变的血清最高稀释度为终点效价，3天初步判定中和效价，4天判定最终结果。
注意：细胞对照正常，病毒回滴应在32～320CCID50/50μL，其结果成立；若不在范围内，则实验无效，应重复实验。Reed-Muench法进行结果计算。
S3、将上述免疫血浆用注射用水稀释3倍，并将其pH调至3.2±0.2，得到血浆稀释液；接着，在30℃±1℃的温度下，往所述血浆稀释液中添加胃酶和甲苯进行消化处理90min后，再用0.4mol/L的NaOH溶液将其pH调至7.2±0.2，得到消化样品。其中，每毫升所述血浆稀释液中胃酶的添加量为8U，甲苯的添加体积为体系总体积的0.2％。
S4、往所述消化样品中添加硫酸铵，使得硫酸铵的终浓度为15％，并将所述消化样品的pH调至5.2±0.2，以及将其温度升至58℃±1℃，静止30分钟后启动搅拌进行沉淀，然后，将罐内液体温度尽速冷却至45℃以下，再经离心法(5000r/min离心30min)，弃去沉淀，收集上清，得到第一上清液。
S5、将所述第一上清液的pH调至7.2，并往所述第一上清液中添加硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为20％，充分混匀进行沉淀后，再经离心法(5000r/min离心20min)，弃去上清，收集沉淀，得到沉淀物。
S6、用30倍质量，温度为31℃±3℃的注射用水将上述沉淀物溶解后，再添加10％明矾溶液，使明矾的终浓度为0.8％，并用1M/L的氢氧化钠溶液调整pH值至7.8±0.1后，再进行搅拌吸附30分钟后，静止1小时，然后经固液分离，得到第二上清液。
S7、对上述第二上清液进行纯化处理，以使提高F(ab’)2的纯度。具体包括以下步骤：
1、DEAE-Sephadex A-50预处理：称取DEAE-Sephadex A-50 100g，悬于10000mL注射用水中，1h后倾去上层细粒，按每克DEAE-Sephadex A-50加0.5N NaOH 15mL的比例，将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)中抽滤，并反复用注射用水洗至pH显中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次；处理完后将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.1M，pH7.4 PBS中过夜。
2、纯化：将已预处理的DEAE-Sephadex A-50用布氏漏斗抽干，称重。按比例1:4(凝胶干重：蛋白克数)加入第二上清液中缓慢搅拌1.5h，搅拌结束装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)滤去DEAE-Sephadex A-50凝胶。纯化前后制品进行检测。
3、将DEAE-Sephadex A-50纯化所获的滤液与20mM PB溶液等体积混匀稀释后，再用Protein-A柱亲和层析。具体的，首先，将Protein-A柱与恒流泵和紫外检测仪连接，用20mM PB溶液(取24g NaH2PO4和71.6g Na2HPO4分别溶于1L ddH2O超纯水中，混匀。取95mLNaH2PO4液和405mL Na2HPO4液进行搅拌混匀，调pH至7.0后过0.22μm的滤膜)平衡5个柱体积(流速3mL/min)，稀释的样品液进行上样(流速2mL/min)并收集流穿过的液体，以移去残留的IgG，得到收集液。
S8、将上述收集液通过超滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，浓缩至原体积的1/8，并用6倍质量的注射用水进行超滤脱盐处理，然后将其pH值调为6.5，加入氯化钠使其最终含量为0.9％，，并经除菌过滤处理，即可得到制剂。上述得到的制剂可按《生物制品无菌试验规程》A项进行无菌实验，以及按《生物制品热原质试验规程》进行热源质试验。
实施例2
该实施例提供了一种制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1、取上述实施例1得到的免疫血浆，并用注射用水稀释2倍，并将其pH调至3，得到血浆稀释液；接着，在30℃±1℃的温度下，往所述血浆稀释液中添加胃酶和甲苯进行消化处理90min后，再用0.4mol/L的NaOH溶液将其pH调至7，得到消化样品。其中，每毫升所述血浆稀释液中胃酶的添加量为5U，甲苯的添加体积为体系总体积的0.2％。
S2、往所述消化样品中添加硫酸铵，使得硫酸铵的终浓度为15％，并将所述消化样品的pH调至5，以及将其温度升至58℃±1℃，静止30分钟后启动搅拌进行沉淀，然后，将罐内液体温度尽速冷却至45℃以下，再经5000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清，得到第一上清液。
S3、将所述第一上清液的pH调至7，并往所述第一上清液中添加硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为20％，充分混匀进行沉淀后，再使用压滤法，弃去上清，收集沉淀，得到沉淀物。
S4、用28倍质量温度为31℃±3℃的注射用水将上述沉淀物溶解后，再添加10％明矾溶液，使明矾的终浓度为0.5％，并用1M/L的氢氧化钠溶液调整pH值至7.8±0.1后，再进行搅拌吸附30分钟后，静止1小时，然后经固液分离，得到第二上清液。
S5、对上述第二上清液进行纯化处理，以使提高F(ab’)2的纯度。具体包括以下步骤：
1、DEAE-Sephadex A-50预处理：称取DEAE-Sephadex A-50 100g，悬于10000mL注射用水中，1h后倾去上层细粒，按每克DEAE-Sephadex A-50加0.5N NaOH 15mL的比例，将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)中抽滤，并反复用注射用水洗至pH显中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次；处理完后将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.1M，pH7.4 PBS中过夜。
2、纯化：将已预处理的DEAE-Sephadex A-50用布氏漏斗抽干，称重。按比例1:2(凝胶干重：蛋白克数)加入第二上清液中缓慢搅拌1h，搅拌结束装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)滤去DEAE-Sephadex A-50凝胶。纯化前后制品进行检测。
3、将DEAE-Sephadex A-50纯化所获的滤液与20mM PB溶液等体积混匀稀释后，再用Protein-A柱亲和层析。具体的，首先，将Protein-A柱与恒流泵和紫外检测仪连接，用20mM PB溶液(取24g NaH2PO4和71.6g Na2HPO4分别溶于1L ddH2O超纯水中，混匀。取95mLNaH2PO4液和405mL Na2HPO4液进行搅拌混匀，调pH至7.0后过0.22μm的滤膜)平衡5个柱体积(流速3mL/min)，稀释的样品液进行上样(流速2mL/min)并收集流穿过的液体，以移去残留的IgG，得到收集液。
S6、将上述收集清通过超滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，浓缩至原体积的1/6，并用5倍质量的注射用水进行超滤脱盐处理，然后将其pH值调为6，加入氯化钠使其最终含量为0.85％，并经除菌过滤处理，即可得到制剂。
实施例3
该实施例提供了一种制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1、取上述实施例1得到的免疫血浆，并用注射用水稀释4倍，并将其pH调至4，得到血浆稀释液；接着，在30℃±1℃的温度下，往所述血浆稀释液中添加胃酶和甲苯进行消化处理90min后，再用0.4mol/L的NaOH溶液将其pH调至8，得到消化样品。其中，每毫升所述血浆稀释液中胃酶的添加量为10U，甲苯的添加体积为体系总体积的0.2％。
S2、往所述消化样品中添加硫酸铵，使得硫酸铵的终浓度为15％，并将所述消化样品的pH调至6，以及将其温度升至58℃±1℃，静止30分钟后启动搅拌进行沉淀，然后，将罐内液体温度尽速冷却至45℃以下，再经5000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清，得到第一上清液。
S3、将所述第一上清液的pH调至8，并往所述第一上清液中添加硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为20％，充分混匀进行沉淀后，再经5000r/min离心20min，弃去上清，收集沉淀，得到沉淀物。
S4、用33倍质量，温度为31℃±3℃的注射用水将上述沉淀物溶解后，再添加10％明矾溶液，使明矾的终浓度为1％，并用1M/L的氢氧化钠溶液调整pH值至7.8±0.1后，再进行搅拌吸附30分钟后，静止1小时，然后经固液分离，得到第二上清液。
S5、对上述第二上清液进行纯化处理，以使提高F(ab’)2的纯度。具体包括以下步骤：
1、DEAE-Sephadex A-50预处理：称取DEAE-Sephadex A-50 100g，悬于10000mL注射用水中，1h后倾去上层细粒，按每克DEAE-Sephadex A-50加0.5N NaOH 15mL的比例，将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)中抽滤，并反复用注射用水洗至pH显中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次；处理完后将DEAE-Sephadex A-50浸泡于0.1M，pH7.4 PBS中过夜。
2、纯化：将已预处理的DEAE-Sephadex A-50用布氏漏斗抽干，称重。按比例1:5(凝胶干重：蛋白克数)加入第二上清液中缓慢搅拌2h，搅拌结束装入布氏漏斗(垫有2层尼龙绢丝)滤去DEAE-Sephadex A-50凝胶。纯化前后制品进行检测。
3、将DEAE-Sephadex A-50纯化所获的滤液与20mM PB溶液等体积混匀稀释后，再用Protein-A柱亲和层析。具体的，首先，将Protein-A柱与恒流泵和紫外检测仪连接，用20mM PB溶液(取24g NaH2PO4和71.6g Na2HPO4分别溶于1L ddH2O超纯水中，混匀。取95mLNaH2PO4液和405mL Na2HPO4液进行搅拌混匀，调pH至7.0后过0.22μm的滤膜)平衡5个柱体积(流速3mL/min)，稀释的样品液进行上样(流速2mL/min)并收集流穿过的液体，以移去残留的IgG，得到收集液。
S6、将上述收集液通过超滤装置，用3万分子量的滤膜，进行浓缩，浓缩至原体积的1/10，并用8倍质量的注射用水进行超滤脱盐处理，然后将其pH值调为7，以及加入氯化钠使其最终含量为0.95％，并经除菌过滤处理，即可得到制剂。
上述制剂经免疫组化检查表明，与人和猴各组织不存在交叉反应；经酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)表明，与牛和人血清不存在交叉反应。
实验例：
一、利用间接ELISA方法检测制剂抗体效价，其包括以下步骤：
1、包被抗原：用包被缓冲液将重组的2019nCoV S-RBD蛋白稀释至2.5μg/ml，在每个聚苯乙烯微量反应板的孔中加50μL，4℃过夜。次日，弃上清，用洗涤缓冲液洗3次。拍干孔内液体(简称洗涤，下同)。
2、封闭：每孔中加入100μL TSTA(含2％牛血清白蛋白的TST)，37℃封闭两小时。洗涤液洗涤3次。
3、孵一抗(F(ab’)2)：在EP管中将上述实施例1得到的制剂按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000，1:64000及1:128000进行稀释，将稀释好的制剂加入封闭好的微量反应板中，每孔100μL，37℃，孵育1小时，弃去上清，洗涤液洗涤3次。
4、孵二抗(HRP-羊抗马)：将羊抗马酶标二抗用TST稀释2000倍。每孔50μL，37℃孵育45分钟，弃去孔内溶液，洗涤液洗涤4次。
5、显色10分钟终止反应。
6、结果判定：在酶联读数仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD450nm值，若大于规定的阴性对照OD450nm值的2.1倍，即为阳性，以最高血清稀释度为IgG抗体效价。
上述实施例1得到的制剂经上述方法进行检测，其Cutoff值为：0.2054，F(ab’)2总ELISA效价为8000。
二、2019-nCoV抗体含量的测定(中和实验)：
在96孔细胞板中，连续倍比稀释血浆(即先加入50μL维持液，再加50μL待检血浆，混匀后吸50μL到下一孔)，每个稀释度有3个重复。将已稀释的病毒液以50μL/孔加入上述孔中，混匀。设待检血浆、阴性血浆、病毒和正常细胞对照，其中病毒对照设100、10、1CCID50/0.05mL三个不同浓度。阳性对照为病毒对照(只加2019-nCoV，不加抗体)，阴性对照分别为正常培养细胞对照(不含病毒和抗体)和抗Vero细胞抗体对照(加Vero细胞和针对病毒的抗体)。随后将96孔板置37℃、5％CO2培养箱中作用1h(期间每隔20min轻轻震荡)。随后作后每孔加100μL细胞悬液(1×105/ml，Vero细胞)，接种好的细胞培养板于37℃，5％CO2的培养箱培养，使用倒置显微镜每天观察细胞病变(CPE)，并记录病毒滴定结果，以抑制50％细胞病变的血清最高稀释度为终点效价，3天初步判定中和效价，4天判定最终结果。抗体中和滴度用Reed-Muench法进行计算。
上述实施例1提供的制剂经过上述方法测定，1:2560稀释度的疫球蛋白制剂能在体外培养的Vero细胞中完全中和100CCID50/0.05mL的2019-nCoV病毒，以阻止其感染VeroE6细胞，其说明本发明实施例制得的制剂的滴度较高。另外，经病毒中和试验结果表明，相同浓度下，本发明实施例制得的制剂的中和活性均高于与之相对应的血清总IgG。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
35 40 45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65 70 75 80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
85 90 95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
100 105 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
130 135 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
180 185 190
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
195 200

Claims (2)

1.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含抗2019-nCoV的抗体；所述抗体特异性地与2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原结合；所述2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
所述的制剂的制备方法包括以下步骤：
以2019-nCoV病毒的spike蛋白受体结合区域抗原作为免疫原对马匹进行免疫；
采集免疫后的马匹的血样，并经分离，得到免疫血浆；
将所述免疫血浆稀释2~4倍，并将其pH调至3~4，得到血浆稀释液；
往所述血浆稀释液中添加胃酶和甲苯进行消化处理后，再将其pH调至7~8，得到消化样品；其中，每毫升所述血浆稀释液中胃酶的添加量为5~10U；
往所述消化样品中添加硫酸铵，并将所述消化样品的pH调至5~6，进行沉淀后，再经固液分离，得到第一上清液；
将所述第一上清液的pH调至7~8，并往所述第一上清液中添加硫酸铵进行沉淀后，再经固液分离，得到沉淀物；
用28~33倍质量的水将所述沉淀物溶解后，再添加明矾进行吸附，使明矾的终浓度为0.5%~1%，然后经固液分离，得到第二上清液；
将所述第二上清液进行浓缩和超滤脱盐处理，得到所述制剂。
2.一种如权利要求1所述的制剂在制备抵抗2019-nCoV病毒的药物中的应用。
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