JPH06502764A - 多発性硬化症の診断および治療 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 多発性硬化症の診断および治療 本発明は多発性硬化症（ＭＳ）の診断に関し特に脳組織の免疫細胞化学的染色に よるＭＳの診断についての方法ならびにＭＳの血清診断についての方法に関する 。現在ＭＳの診断に有効な単一試験（ｓｉｎｇｌｅ　ｔｅｓｔ）はなく、診断は 神経学的試験（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔ　１ｏｎ）、　Ｃ ＡＴスキャン、ＮＭＲイメージングおよびＣＳＦ分析を含む種々の技術の結果に 通常基づいて成され、いずれもこれ自体で決定的なものではない。

また本発明はＭＳの治療に関する。この観点では、本発明はヒ１−Ｍ５脳組織か ら単離したウィルスに対する抗体を提供し、これら抗体をＭＳ患者の治療に直接 用いることができる。さらに、本発明はＭＳ脳組織から単離したウィルスに対す る免疫応答を産生ずるのに用いるワクチンをも提供する。

多発性硬化症の原因に関する２つの主要な理論がある。１つはＭＳが自己免疫型 疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ−ｔｙｐｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）であり実験的アレル ギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）のモデル動物に基づきさらに免疫抑制が若干のＭＳ患 者に有益な作用を有する事実である。しかし過去５０年にわたるＥＡＥの多数の 研究はＭＳの病因を説明できなかったが中枢神経系（ＣＮＳ）における免疫系の 役割を解明するのに役立った。第２の理論はＭＳがウィルス性の疾患であり疫学 研究およびいくつかのウィルス、特に麻疹ウィルス（ＭＹ）およびイヌジステン パーウィルス（ＣＤＶ）のようなモルビリウィルスの脱髄作用（ｄｅｍｙｅｌｉ ｎａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ）に基づくものである。

種々の研究は多発性硬化症がウィルス性の疾患であり１いくつかは麻疹ウィルス ２およびイヌジステンパーウィルス１を強調している。ＭＳ患者の組織から単離 した種々のウィルスか報告されているか４こわらのウィルスのいずれもこれら疾 患の原因病原体としては確立されていない。ネコの中枢神経系から単離したバラ ミクソウィルスに対するペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、以前の研究５はＭ Ｓプラークの食細胞においてウィルス様粒子およびヌクレオキャプシド様構造を 染色した。ヌクレオキャプシド様構造は以前「湾曲した、直線プロフィル（ｃｕ ｒｖｅｄ。

１ｉｎｅａｒ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ）」（ＣＬＰｓ）’　と称されていた。現在ネ コのウィルスに対する抗体はアフィニティクロマトグラフイに用いられて８種の 異なる確立された場合のＭＳの脳からウィルスを繰り返し単離したが４種の非Ｍ Ｓ脳（ｎｏｎ−ＭＳ　ｂｒａｉｎ）からは単離できなかった。予備的なウィルス 学的、免疫細胞化学的およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の研 究はこのウィルスがＭＶおよびＣＤＶに関連し、さらに現在この関係かＥＬＩＳ Ａ型アッセイにより確認されていることを示している。このウィルスと飼い馴ら されたネコおよびＭＳ患者のＣＮＳにおける脱髄障害の関連はこれらの動物とヒ トの疾病の間の可能な因果関係を示す７゜無症状の、原発性脱髄病（ｐｒｉｍａ ｒｙ　ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅ）は試験したネコの約７％ のＣＮＳに確認され１１、持続型の、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓ　１ｖｅ ）バラミクソウィルスを侵された脳組織から単離した１°。ネコのウィルスに対 して生じたペルオキシダーゼ標識抗体はＭＳプラーク内のウィルス様粒子および ヌクレオキャプシド様構造（ＣＬＰｓ）を染色する５゜染色反応はＭＳ脳組織を ＭＳ患者由来の血清で前処理することにより阻害され非ＭＳヒト血清での前処理 によっては阻害されない５゜この抗原性の関係に基づき、現在アフィニティクロ マトグラフィを用いてヒトＭＳ脳組織からＣＬＰｓおよびウィルス粒子か単離さ れている。ネコウィルスに対する抗体を、以前記載した免疫細胞化学的研究に用 い、種々の母体（ｍａｔｒｉｘ）の１種を含むアフィニティクロマトグラフイカ ラムに吸収させこれを介してＭＳおよび非ＭＳ患者由来の均質化脳組織を通した 。モルビリウィルスのものと同様なＣＬＰｓおよびウィルス粒子はＭＳ脳組織の 溶出液に存在するが非ＭＳ組織のものには存在しなかった。ＭＳ組織から単離し たウィルスを培養で増殖させ同様のアフイニテイクロマトグラフィ法を用いて収 集した。得られた結果はＭＳが持続型または潜伏ウィルス感染によるという強力 な証拠を提供すると考えられる。かかる病因は自己免疫型疾患の疫学よりこの疾 病の疫学と一致する。

ＭＳ脳組織から単離したウィルス、以下「多発性硬化症ウィルス」またはｒＭｓ Ｖ　Ｊと称する、はモルビリウィルスであり麻疹およびイヌジステンパーウィル スの両者に密接に関連する。単離したＭＳＶをインビトロ、例えばＣＶＩ細胞お よび稀突起神経膠細胞培養物中で増殖させ、さらにこれらの細胞の培養物から単 離することができる。

１つの観点では、本発明は単離した形態のＭＳＶ　、例えばＣｖ１細胞または初 代稀突起神経膠細胞培養物中の単離ＭＳＶの培養物を提供する。また単離形態の ＭＳＶの調製方法をも提供する。゛本発明の他の観点ではＭＳＶモルビリウィル ス、ＭＳＶの抗原またはその抗原性フラグメントを認識または結合する抗体を提 供する。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれでも よい。モノクローナル抗体の場合、さらに本発明はかかるモノクローナル抗体を 産生するハイブリッド細胞系またはハイブリドーマにまで達する。

本発明のこの観点の抗体はＭＳ脳組織または上述のようなインビトロ培養物から 単離した純化ＭＳＶを用いて当業者に良く知られた通常の方法により生産するこ とかできる。例として、ハイブリッド細胞系またはハイブリドーマ産生モノクロ ーナル抗体はケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ 口）により１９７５年に最初に記載された既知の融合方法１１．１１を用いて生 産することかできる。ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギのような実験動物 において、さらに既知の方法＋２により生産させることかできる。

上記概要を示した方法により生産した若干のモノクローナル抗体はＭＳＶに対し 極めて特異的であることが示された一方、他のモノクローナル抗体はＭＶおよび ＣＤＶと種々の程度の交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す 。

本発明の他の観点では試料、例えば、患者から採取した、組織試料中のＭＳＶを 検出する方法を提供し、この方法はＭＳＶまたはＭＳＶの抗原もしくはその抗原 性フラグメントを認識または結合する抗体と試料を接触させ、前記抗体の結合を 検出して試料中のＭＳＶの存在を示すことを含む。

この観点で、本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をＭＳ脳由来組 織の免疫細胞化学的染色に用いて疾病の診断を確実にすることができる。

本発明の他の観点ではＭＳの血清診断のための方法を提供する。

本発明のこの観点はＭＳ患者由来の血清がＭＳＶに対する循環抗体（ｃｉｒｃｕ ｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むという観察結果に基づいている。

免疫細胞化学的方法を用い、ＭＳ患者、特に最近再発した患者由来の血清でＭＳ 脳組織を前処理することが以前記載した脳組織の免疫細胞化学的染色を阻害する ことか示された。この阻害はＭＳ１者の血清かこのウィルスに対する抗体を含ん でいることを示す。

従って、本発明のこの観点において、患者から採取した流体試料（ｆｌｕｉｄ　 ｓａｍｐｌｅ）中の抗ＭＳＶ抗体を検出する方法を提供し、この方法はＭＳＶま たはその抗原もしくは抗原性フラグメントと前記流体試料を接触させ、さらに前 記ＭＳＶまたは抗原もしくはその抗原性フラグメントに結合した抗ＭＳＶ抗体を 検出することを含む。

流体試料は血液または髄液試料でよい。好ましくは、試料は血液試料であり、全 血またはその誘導体、たとえば血清または血清でよい。

本発明のこの観点の診断方法は既知の原理のエンザイムイムノアッセイまたはラ ジオイムノアッセイを利用して抗原を検出することにより結合した血清試料由来 の任意の抗ＭＳＶ抗体の存在を検出することができる。検出抗原（ＭＳＶまたは 抗原もしくはその抗原性フラグメント）は、例えば、固形支持体上に固定され、 結合した抗ＭＳＶ抗体の存在を適当に標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を用い て検出することができる。他の方法は当業者に良く知られている。

また、本発明のこの観点で、流体試料中の抗ＭＳＶ抗体を検出する診断試験キッ トを提供し、これは検出抗原として、好ましくは固形支持体に固定した、ＭＳＶ またはその抗原もしくは抗原性フラグメントを含むことを特徴とする。

さらにＭＳＶＯ単離体およびインビトロ培養物から生じる本発明の他の観点で、 ヒトまたは動物の患者のＭＳＶに対する免疫応答を刺激するためのワクチン組成 物を提供し、これは活性免疫原として、不活化もしくは弱毒化したＭＳＶ　、ま たはＭＳＶの抗原もしくはぞの抗原性フラグメントを含む。

また本発明のこの観点において、ヒトまたは動物の患者のＭＳＶに対する免疫応 答を産生ずる方法を提供し、これは前記患者に不活化もしくは弱毒化したＭＳＶ 　、またはＭＳＶの抗原もしくはその抗原性フラグメントを含む活性免疫原の効 果的な量を投与することから成る。

所望の場合、活性免疫原を担体分子に結合させてその免疫原性を改良することか できる。適当な担体分子には、例えば、キーホールリンヒト（ｋｅｙｈｏｌｅ　 Ｉｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンのようなヘモシアニン、ウシ血清アルブミンまたは 卵アルブミンを含む場合かある。さらに、ワクチン組成物には任意にアジュバン トを含めてよい。動物およびヒトワクチンに結合させる既知のアジュバントには 、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミョウバン、等が含ま れる。

現在不活化または弱毒化したウィルスを生産するための良く知られた方法があり 、また、特にＭＶおよびＣＤＶに密接に関連するＭＳＶの場合の、弱毒化ワクチ ンを前者の両ウィルスに対して開発した。同様に、サブユニットウィルスワクチ ンは良く知られており、免疫応答を刺激することかできるウィルスの抗原または 抗原性フラグメントの同定に基づいている。

ここに記載したＭＳＶワクチンの場合、ワクチンをネコで用いるために生産する ことかでき、イヌンステンバーワクチンは同様であり、および／またはヒト、特 にヒト幼児において、麻疹ワクチンも同様である。

さらに本発明の他の観点ては抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、Ｍ ＳＶまたはその抗原もしくは抗原性フラグメントを認識または結合する抗体の効 果的な量を患者に投与することを含むＭＳ患者の治療方法を提供する。

本発明のこの観点て用いる抗体は担体または標的分子（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｍ ｏｌｅｃｕｌｅ）、例えば抗体を補助し脳血液関門を通過させる細胞内接着分子 のような担体または標的分子と結合させるこ仁かできる。

さらに本発明の特徴は次の実施例の詳細な記載から明かとなる。

実施例１ ＭＳ脳組織からのＭＳＶの単離およびＣＶＩ細胞におけるそのインビトロ培養。

ネコ脳組織から単離した持続性の、非許容バラミクソウィルスに対するポリクロ ーナル抗体１０をウサギにおいて生じさせた。

接種した動物の血清から免疫グロブリンを精製し、ネコ肝臓粉末、アセトン乾燥 クランデル（Ｃｒａｎｄｅｌｌ）ネコ腎臓（ＣＲＦＫ）およびＶｅｒｏ細胞に対 し広範囲に吸着させさらに１ｍｌ当たり５ｍｇのタンパク質となるまで濃縮した 。次いで調製した抗体をアフイーゲルプロテインＡ（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ａ）　（バイオラッド）またはＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（フ ァルマシア）に吸収させた。８種の異なる、ＭＳが確認された場合および４種の 非ＭＳの場合由来の１〜２ｇの凍結した、解剖脳組織を均質化しアフイニテイ力 ラムに通した。溶出する前にカラムを大量のＴｒｉｓ　ＮａＣ１緩衝液て洗浄し た。溶出液を収集し、少量を電子顕微鏡で試験する前に３％リンタングステン酸 、ｐＨ７，２でネガティブ染色した。１２種の脳から得た溶出液をＣＶＩ細胞の 培養物に添加した。

ＭＳ脳組織をＣＮＢｒ活性化セファロースカラムに通した後に得たネガティブ染 色した溶出液の電子顕微鏡検査は多形態性の、約３００ｎｍの平均直径であるか いくらかはかなり大きい直径を有する球形プロフィルを示した。アワイーゲルプ ロティンＡカラムから得た溶出液は同様のサイズのプロフィルを示したかこれら は外膜を欠いておりしっかりコイル状に巻いた、管状の、直径約１８ｎｍの構造 から成っていた。この管状物は細い（ｔｈｉｎ）半透明の核を有しその壁はらせ ん構造に一致した「ヘリンボン（ｈｅｒｒ　ｉｎｇ−ｂｏｎｅ）Ｊ外観を有して いた。い（つかの画分はヌクレオキャプシド様構造またはＣＬＰｓの単離体６に 匹敵する管状構造を主として含んでいた。ウィルス様粒子を含む若干の溶出液を 遠心分離によりベレット化し、寒天中に包埋し固定して電子顕微鏡のために処理 した。３００ｎｍの直径までの、内部に管状プロフィル、直径約１８ｎｍを有す る、ピリオンを含むペレットを種々の平面で切断した。ＭＳ脳組織からのウィル スの単離を４Ｄ回以上繰り返した。

５回の通過後、ＭＳ脳由来の溶出液で感染させたＣＶＩ細胞は小さな合胞体（ｓ ｍａｌｌ　ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）およびわずかな細胞質空胞形成の形態で若干の 集中性細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した。これら培養物の微細構造試験は直径約 １８ｎｍの管状構造から成る細胞質含有物の存在を明らかにした。これら含有物 はネコバラミクソウィルスの初期単離体て観察されるものと形態学的に同様であ った１００ＭＳ脳から単離したものと同様の、ウィルス粒子はいくつかの培養物 中に存在しさらにアフィニティクロマトグラフィ法を用いることにより単離した 。

非ＭＳ脳組織をカラムに通した後に得た溶出液の微細構造試験は任意のウィルス 粒子を現さなかった。これらの溶出液を接種した培養物はＣＰＥを少しも示さず 電子顕微鏡で試験した際細胞質含有物またはウィルス粒子いずれも見出せなかっ た。さらに、ウィルス粒子はアフィニティクロマトグラフィを用いてこれら培養 物から得られることはなかった。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）研究は単離したウィルスのペプチ ドか若干の膜スパイクタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉ ｎ）を欠く以外はＭＶおよびＣＤＶのものに匹敵することを示した。この違いは おそら（チキン、雌ウシ、イヌ、モルモット：ウマ、ヒト０（ｈｕｍａｎ　Ｏ） 　、マウス、ウサギ、ラットおよびヒツジからの赤血球か感染ＣＶＩ培養物によ り血球吸着しない原因である。これら観察結果はＣＲＦＫおよびＶｅｒｏ細胞の 持続型の非許容感染として培養物中に存在するネコパラミクソウィルスの特性に 一致した＋００ Ｍ５脳から単離したヌクレオキャプシドおよびピリオンは形態学的な類似性を示 しＭＶおよびＣＤＶと若干の免疫学的交差反応性を示す。これは、初期のＰＡＧ Ｅ研究および組織培養中の小さな合胞体の形成に加え、ＭＳ脳から単離したウィ ルスがモルビリウィルスであり得ることを示している。

実施例２ ポリクローナル抗体の生産 ヌクレオキャプシド様構造（ＣＬＰｓ）および上記実施例１で記載したようなア フィニティクロマトグラフィ法を用いて得たウィルス粒子をポリクローナル抗Ｍ ＳＶ抗体の生産に用いた。１．５ｍｌの単離ＭＳＶ　（５μｇ／ｍｌ）を１．５ ｍｌのフロイントの完全アジュバントと良く混合して若い成体ウサギに種々の部 位で皮下注射することにより投与した。１０日後、このウサギに１ｍｌのウィル ス単離体および１ｍｌのフロイントの不完全アジュバントを含む同様の注射をし た。これを１４日の間隔てさらに５回繰り返し次いてこの動物を最後の接種後８ 日間採血した。さらにウサギに４２日間にわたり１４日毎に１ｍｌのウィルスを ３回接種し次いて３回目の接種後８日間採血した。これを６か月の期間にわたり 繰り返した。　採血と同時に、血液を凝固させて分離した。次いで試料を３．０ ００ｒｐｍて２０分間回転し純粋な血清を吸引除去し一２０°Ｃで保存した。血 清に等量の飽和硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２Ｓ０４を添加して血清中のタンパ ク質を沈殿させることにより免疫グロブリンＧを精製した。次いて試料を３．０ ００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈殿を保持し上清を（ＮＨ４）２ＳＯ，て 再処理し次いで再び遠心分離した。

保存していた沈殿を再懸濁し、溶液を３．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する 前に、さらに等量の５０１５０飽和硫酸アンモニウム／蒸留水で処理した。次い で沈殿を０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液に溶解した。

次いて種々に変化させたリン酸緩衝溶液に対して溶液中のグロブリンタンパク質 を４℃で一昼夜または２日間透析した。免疫グロブリンを５０ｃｃ容量のジエチ ルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥＣ）カラムに通し画分を収集した。画分の 光学密度を分光光度計を用いて決定しタンパク質画分をプールした。免疫グロブ リンをタンパク質が約５　ｍｇ／ｍｌ　となるまで濃縮し一２０″Ｃで保存した 。

免疫細胞化学的研究のために、ポリクローナル抗体をエイブレメアス（Ａｖｒａ ｍｅａｓ）およびテルニンク（Ｔｅｒｎｙｎｃｋ）の方法１２により西洋ワサビ ペルオキシダーゼと結合した。ＭＳＶ　、　ＭＹおよびＣＤＶ間の交差反応性を ＥＬＩＳＡ　Ｗアッセイを用いて証明し、その結果を図１に示す。

実施例３ モノクロ−カル抗体の生産 免疫処置法 ６〜８週齢のＢａ１ｂ／ＣマウスをＯ，１ｍｌの精製ＭＳＶ　（５μｇ／ｍｌ） および０．１ｍｌのフロイントの完全アジュバントから成るエマルジョンで免疫 化した。マウスの種々の部位に皮下注射した。０．１ｍｌのウィルスおよび０． １ｍｌのフロイントの不完全アジュバントから成る、ブースター免疫予防注射を ４週間後に種々の位置の皮下に接種した。生理学的食塩水中のウィルスの最初の 投与量の４倍の最後の注射は融合前３〜４日に与えられた＋４゜ミエローマ細胞 系 ミエローマ細胞系はＢａ１ｂ／ＣＰ３−ＮＳＩ−Ａｇ４−１細胞系（ＮＳ　ｌ　 ）を用いた。細胞をｌＯ％ウシ胎児血＃（ＦＣＳ）およびそれぞれ１２０μｇ／ ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの、０．２ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ Ｐ／Ｓ）を添加したダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。ミ エローマ細胞を５０ｍ１フラスコにおいて７％ＣＯ２加湿定温器中３７°Ｃでイ ンキュベーションし、さらに８−アザグアニン（８−ａｚａｑｕａｎｉｎｅＸ２ μｇ／ｍｌ）を含む培地を介して継代して任意の復帰突然変異体アミノプテリン （ａｍｉｎｏｐｔｅｒａｎ）耐性細胞を殺す。

ミエローマ細胞を融合前３日間、２４時間毎に継代培養（分割）した。培養物の 分割は、約５Ｘ１０’細胞を含む、５０％の培地を除去し、さらに新しいフラス コに置くことを伴った。次いで両フラスコを新鮮培地で最初の容量まで再び満た して各フラスコがｌｌＴ１１当たり２〜３ＸＩＯ’細胞を含むようにした。ミエ ローマ細胞は決して１ｍｌ当たり８Ｘ１０’細胞を超えて増殖させないようにし た。

リンパ球を得るための肺臓の潅流 免疫化したマウスを００２で窒息させて殺し、肺臓を無菌的に取り出し５ｍｌの 培地を含む滅菌ベトリ皿に置いた。肺臓莢膜中に培地を注入することにより肺臓 細胞をペトリ皿に押し流した。

次いて細胞の計数を実施した。

融合 融合を実施するために用いた方法はガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）およびミルシュタ インにより記載されたちの１ｓを改良した。１０ｇの分子量１．５００のポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）　（シグマケミカル社）を、溶かし予め秤量したボ トル中に０．５ｍｌのアリコートで配分してオートクレーブで処理した。次いて ボトルを秤量してＰＥＧの重量を計算した。約１０”個のマウス肺臓細胞（１つ の肺臓から得たもの）と１０７個のミエローマ細胞を混合し滅菌した５０ｍ１の コニカルボトムチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ−ｂｏｔｔｏｍ　ｔｕｂｅ）に配置し た。次いで血清を含まない培地を添加して全容量５０ｍ１とした。

次いて混合物を４００ｇで５分間遠心分離してＰＥＧの濃度か融合に絶対的であ るため、すへての培地を除去して希釈を防いだ。

ＰＥＧの０．５ｍｌアリコートを血清を含まない培地で４０％（Ｗ／Ｖ）の終濃 度に希釈し約４０°Ｃに維持した。ペレットを軽く叩き１分間にわたって１ｍｌ のＰＥＧを滴下して壊した。さらに１〜２分間これを振盪した。次いて、血清を 含まない１ｍｌの培地（予め３７°Ｃに温めた）を１分間にわたって添加した。

これを繰り返し２回以上行いその後３０秒間にわたって血清を添加した。連続し て振盪しなから、さらに７ｍｌの培地を２分間にわたって添加した。

最後に、１２〜１３ｍ１の培地を添加し細胞を４００ｇで５分間遠心分離した。

上清を吸引除去しペレットを１ｍｌ当たり１０５個の支持細胞を含む４０ｍ１の ＨＡＴ選択培地に再懸濁させた。（ＨＡＴ培地：２０％ＦＣ３を添加した５０ｍ １のＤＭＥＭ、０．４ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５ｍ１の ファンギゾンｒＦｕｎｇｉｚｏｎｅ　＠Ｊ　［タボ（ＴＡＧＯ）］、ヒボキサン チン（１３６ｇｇ／ｍｌ）　、アミノプテリン（０，１９ｇｇ／ｍｌ）　、チミ ジン（３，８８μｇ／ｍｌ）　、グルタミン（２ｍＭ）およびピルビン酸塩（１ ｍＭ）　）。次いて細胞を９６ウエルの培養プレート〔リンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ ））に１００μｌのアリコートで配分し、プレートを３７°Ｃの定温器中に配置 した。

融合後の細胞の維持 培養トレーを７％Ｃ０２加湿定温器中で３７°Ｃに維持した。プレートを肺臓細 胞の大量死が予期され観察される融合後５日まで毎日確認した。新鮮ＨＡＴ　（ ウェル当たり５０ｍ１）を添加した。融合後第７〜１４日で、２〜４日毎に培地 （ウェル当たり１００ｍ１）を除去し新鮮ＨＴ培地（ＨＴ培地はアミノプテリン を除いた以外はＨＡＴ培地と同様〕で置換した。ハイブリッドの多数が半集密（ ｈａｌｆ　ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した際、　１００μｍの上溝を除去し適 当な抗体について選抜した。肺臓または腹膜マクロファージ支持細胞を添加して 陽性クローンを新しいプレートに継代培養した。

陽性ハイブリッドのスクリーニング 陽性ハイブリッドをエンザイム結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を 用いて検出した。麻疹ウィルスのエドモンストン株（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ　５ｔ ｒａｉｎ）（５μｇ／ｍｌ）を１５ｍＭのＮａｚＣＯｉおよび３３ｍＭのＮａＨ ＣＯｓ溶液（コーティング緩衝液）を含むｐＨ９，６の溶液中で４０倍に希釈し １００μｌを９６ウエルの丸底マイクロタイタープレート〔ディスポーザブルプ ロダクツオーストラリア（ＤｉｓｐｏｓａｂｌｅＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ａｕ５ｔｒ ａｌｉａ）　）の各ウェルに添加した。用いた抗体のレベルはＥＬ［ＳＡチェッ カー盤法（ｃｈｅｑｕｅｒ　ｂｏａｒｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）＋４により至適 化した。プレートを４°Ｃて１８時間インキュベーションし次いて０．１５Ｍの リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）の０．５％のトウイーン２０溶液で３回洗浄した。次 いて２時間室温でＰＢＳ中の１０９６ＦｃＳを用いて阻害ししかる後プレートを ＰＢＳ　−トウィーン２０て３回洗浄した。組織培養プレートから上清（１００ μｌ）を無菌的に除去し、感作プレート（ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｄ　ｐｌａｔｅ） に添加して４°Ｃで１２時間インキュベーションした。次いてウェルを洗浄し１ ００μｌの１、０００倍希釈のアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ　（ 米国所在のＴａｇｏ社）を添加した。プレートを室温で２時間インキュベーショ ンし、洗浄後、　１００μＩの酵素基質４−ニトロフェノールホスフェ−ト（４ −ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅＸ４−ＮＰＰ）　（独国所在のベ ーリンガーマンハイム）を０．５ｍＭのＭｇＣ１２（基質緩衝液）を添加したｐ Ｈ９，８の１０％ジェタノールアミン（ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）中に１ 　ｍｇ／ｍｌで添加した。室温で３０分間インキュベーションした後、光学密度 を４０５μｍのフィルターを用いたｒＴｉｔｒｅｔｅｋ■」マルチストリームマ イクロタイタープレートリーダーで測定した。

ＣＤＶ　、ＭＶおよびＭＳＶの予備スクリーニング別個のＥＬ［ＳＡプレートを 以前記載した方法によりＣＤＶワクチン（Ｗｅｂｓｔｅｒｓ）、エドモンストン 麻疹ウィルスおよびＭＳＶを用いて感作した。ヒトポリクローナル抗麻疹抗体、 ロット２５７５４、（西オーストラリア所在のプリンセスマーガレットホスピタ ル）をＰＢＳて３２０倍に希釈した。抗ＣＤＶおよび抗ＭＳＶ抗体をＰＢＳで１ ００倍の濃度に希釈して用いた。用いた酵素結合物（ｅｎｚｙｍｅ　ｃ。

ｎｊｕｇａｔｅ）はＣＤＶおよびＭＳＶに対する抗ウサギ［ｇＧアルカリホスフ ァターゼ（ＴＡＧＯ）および麻疹ウィルスに対する抗ヒトアルカリホスファター ゼ（ＴＡＧＯ）であった。再構成後、細胞結合物をＰＢＳで１．０００倍の濃度 に希釈して用いた。ＥＬＩＳＡを上述した方法により実施しその結果を図Ｉに示 す。

モノクローナル抗体のスクリーニング また６種の陽性ハイブリドーマをＣＤＶ　、ＭＶおよびＭＳＶ　、ならびにニュ ーカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）（１０ｇｇ／ｍｌ）および３ｆｌのネコのウィ ルス；ネコ全白血球減少症、ネコ鼻腔気管炎およびネコカリシウィルス（ｃａｌ ｃｉｖｉｒｕｓ）　［ウェブスター３を１として（生存）］に対してスクリーニ ングして任意の非特異性を確認した。ネコのウィルスは１ｍｌの蒸留水およびそ の後にＰＢＳで２０倍に希釈して再構成した後に用いた。ＥＬ［ＳＡを以前記載 した方法により再び実施した。このスクリーニングの結果を図２に示す。

実施例４ 免疫細胞化学的染色 実施例２に記載したような、ＭＳＶに対して生じたポリクローナル抗体を免疫細 胞化学的研究に用いてＭＳ脳組織内、ＣＶｌ細胞およびＭＳＶを感染させた稀突 起神経膠細胞培養物内ならびにネコのウィルス単離体を感染させたＣＲＦＫ細胞 内のＭＳ■タンパク質を確認した。用いた染色法はネコの誘導した病原体に対す るポリクローナル抗体を用いるＭＳ脳組織の免疫ペルオキシダーゼ染色（ｉｍｍ ｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）においてタック（Ｃｏｏｋ） らにより記載されたものと本質的に同一であった。ＭＳＶに対するポリクローナ ル抗体を用いて得た染色反応生成物をＭＳプラーク中における食細胞内の細胞質 含有物と大部分結合させた。微細構造研究は染色した含有物が湾曲した直線プロ フィルと称する実際にはＭＳウィルス単離体のヌクレオキャプシドである管状構 造体であることを確認した。またこれらの細胞質含有物を西洋ワサビペルオキシ ダーゼ標識モノクローナル抗体Ｃ１およびＥｌて染色した（実施例３および図２ を参照）。これら含有物はＭＳ脳中の正常白質または非ＭＳ脳由来の白質には検 出されなかった。

ＭＳＶに対する西洋ワサビベルオキシダーセ標識ポリクローナル抗体を用いたＭ Ｓプラークにおける細胞質含有物の免疫細胞化学的染色は再発した２名のＭＳ患 者由来の血清と脳組織を予めインキュベージコンした際に阻害された。この阻害 反応は疾病の寛解状懸の患者由来の血清か用いられた場合効果的でなかった。

脳組織をＭＳの医学的証拠を示さない者由来の血清と予めインキュベージコンし た際には染色反応の強さは減少しなかった。さらに、２名のＭＳ患者の血清から 精製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識免疫グロブリンＧ（［ｇＧ）を用いて ＭＳプラーク内の細胞質含有物を染色した。得られた結果をＭＳＶに対する標識 ポリクローナル抗体を用いた場合に見出されるものに匹敵する。これらの結果は ＭＳ患者、特に臨床上の徴候（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ）により示されるよ うな疾病活性（ｄｉｓｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す者がＭＳＶに対する 循環抗体を有することを示した。

実施例５ ＭＳウィルスのための稀突起神経膠細胞培養系稀突起神経膠細胞の初代培養物を 増殖させ２種の症例のＭＳの脳組織から単離したウィルスに感染させた。結果は ウィルスが稀突起神経膠組織に親和性を有し星状膠細胞には感染しないことを示 した。さらに、明瞭な細胞変性効果（ＣＰＥ）が感染後６〜１４日以内に観察さ れる。これはウィルスをＣＲＦＫ、ＶｅｒｏまたはＣｖｌ細胞系で増殖させる場 合明白なＣＰＥを見出すことに要する６〜８週間と匹敵している。現在この培養 系によりウィルスの伝染力を迅速に評価することかてき弱毒化株の検出のために ウィルスの株を比較し得る。稀突起神経膠組織に対するウィルスの親和力はＭＳ における脱髄作用がこれらの細胞のウィルス感染のためであるという他の可能な 証拠を提供する。

稀突起神経膠細胞培養系はウィルスに対して生じたモノクローナル抗体のウィル スの増殖の阻害における有効性の評価を可能にする。

１〜２日齢のウィスターラットの子（Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔ　ｐｕｐ）をＣＯｔ 吸入の頚部脱臼により安楽死させた。脳組織を除去しサーリープ（Ｓａｒ　１１ ｅｖｅ）らにより用いられた方法１＠を改良して用いて分離した。安楽死させた 後直ちに、子をビーカーに移し７０％エタノールに浸漬して層流キャビネットに 配置した。無菌的に脳を除去し、ｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたダルベ ツコの最小培地（ＤＭＥＭ）で洗浄して滅菌したステンレススチールメツシュ（ メツシュサイズ約１００μｍ）の二重層を含むペトリ皿に移した。新鮮培地（Ｄ ＭＥＭ／ｌｏ％ＦＣ３）への分離はメツシュを介して組織を２０ｍ１の注射器に 繰り返し吸い込み排出して実施した。得られた組織の懸濁液を新鮮培地で希釈し ５０ｍ１／２５ｃｍのコスタ−組織培養フラス：１（Ｃｏｓｔａｒ　ｔｉｓｓｕ ｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌａｓｋ）にフラスコ当たり１〜１．５個の脳を１０ｍ １の培地と共にまたは３５ＸｌＯｍｍのベトリ皿のポリーＬ−リジンをコーティ ングしたカバーグラス上で皿当たり０．５個の脳を３＋ｎｌのＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳと共に接種した。培養物を３７°Ｃで５％ＣＯ□を用いてインキュベーシ ョンした。培地を最初の４〜７日後に交換し次いで週毎に交換した。

ＭＳ脳組織由来の単離体を用いた初代培養物への接種２種の単離体をアフィニテ ィクロマトグラフィ法を用いて脳Ａ８７／２９およびＭＳ−７から得た。これら の単離体を４日齢の初代ラット神経膠培養物に次のように接種した。新鮮ＤＭＥ Ｍで２回洗浄した培養物から培地を除去した。次いて培養物の１ｍｌの培地に１ ００μＩのウィルス懸濁液を接種した。フラスコを２時間インキュベーションし 、その後最初の培地をウィルス懸濁液を除去することなく培養物に戻した。

免疫細胞化学 培養物の固定 培養物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄して細胞の破片を除去しリン酸緩 衝液中に４％パラホルムアルデヒドおよびｔ　９＜グルタルアルデヒドを含む５ ｍｌ溶液を用いて１５分間固定した。

さらに２回ＰＢＳで洗浄し、固定液を除去し培養物を染色するまで新鮮ＰＢＳ中 に保存した。

組織培養物の免疫ペルオキシダーゼ標識培養物をＰＢＳで２回洗浄し氷のように 冷たい、７０％エタノールで２分間インキュベーションした。次いてこれを１５ 分間にわたりＰＢＳで２回洗浄し１０ｍ１の０．５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ２Ｏ２トリス 緩衝液て３０分間インキュベーションした。フラスコを４０ｍ１のトリス緩衝液 で洗浄し１ｍｌの一次抗体（２’、３’−サイクリックヌクレオチド３′−ホス ホジェステラーゼ［ＣＮＰａ５ｅｌまたはＭＳウィルス単離体に対して生じたＨ ＲＰ標識抗体のいずれか）をトリス緩衝液でｌ：３０に希釈したものと４５３分 間インキュベーションしあるいは対照として培養物をトリス緩衝液のみの中で放 置した。

インキュベーション後、１ｍｌのＤＡＢ溶液の添加および暗所で、１５分間の、 インキュベーションの前に各培養物を４０ｍ　ｌのトリス緩衝液で１０分間にわ たり３回洗浄することにより抗血清を除去した。さらに３回トリス緩衝液中で洗 浄した後、培養物を通常の方法の光学または電子顕微鏡用に調製した。

組織培養培地からのウィルス粒子の単離培地を少なくとも１１日間感染させた培 養物、すなわちこれら培養物は少なくとも１回培地交換をした、から収集した。

プールした培地を３５．０００ｒｐｍで３時間５Ｗ４０−ターを備えたベックマ ン超遠心分離機で遠心分離した。ペレットを０．５ｍｌのリンタングステン酸で 再懸濁しこの１滴を５分間ホルムバールグリッド（Ｆｏｒｍｖａｒ　ｇｒｉｄ） に配置し乾燥して電子顕微鏡試験を行った。

結果 初代ラット稀突起神経膠組織培養 円形細胞抗体（ｒｏｕｎｄ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびｌまたは２種 の極性突起（ｐｏｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓ）を有する稀突起神経膠細胞をインビ トロで３日後に同定した。これらの細胞は決して集密にはならないか、それらは 星状膠細胞のベッド層（ｂｅｄ　１ａｙｅｒ）上に増殖を示す。他の稀突起神経 膠細胞はクールマンクリーク（Ｋｕｈｌｍａｎｎ−Ｋｒｉｅｇ）らによりタイプ ■およびタイプ［１１１突起神経膠細胞として記載されたちの１７に匹敵した。

タイプ■細胞は２または３種の突起を持つ三角形または卵形でしかも扁平な細胞 体（ｆｌａｔｃｅｌｌ　ｂｏｄｙ）を有する。タイプＩＩの細胞は細胞体を取り 巻く種々の直径および長さの突起のネットワークを有する。これらの稀突起神経 膠細胞は星状膠細胞のベッド層上に広がる傾向があった。星状膠細胞は増殖が速 く細胞と細胞が接触した単層を形成した。

稀突起神経膠細胞の免疫細胞化学的同定稀突起神経膠細胞に特異的な酵素、ＣＮ Ｐａ５ｅに対するＨＲＰ標識抗血清のための反応生成物は稀突起神経膠細胞のよ うな上述の細胞中に位置していた。下にある星状膠細胞の層との染色反応は起こ らなかった。ＣＮＰａ５ｅに対する反応生成物を稀突起神経膠細胞の細胞質中に 配置しその位置は培養物の齢に関係なく同様であった。しかし、一層長い期間培 養したものは染色の強度かわずかに減少した。

対照 対照フラスコ中にＤＡＢ反応生成物があったとしても、極めて前記結果を電子顕 微鏡により確認した。ＣＮＰａ５ｅに対する抗体はこの酵素か稀突起神経膠組織 の微細構造上の特性を有する細胞中に存在し細胞質中に位置することを示す染色 反応を起こした。代表的な星状膠細胞の特徴を有する細胞は染色で陽性を示さな かった。

ＭＳウィルス単離体を用いた培養物の接種接種後６日（インビトロでｌＯ日日間 。

稀突起神経膠細胞のいくつかは膨張し濃縮した細胞質の中央リング（ｃｅｎｔｒ ａｌ　ｒｉｎｇ）から成り大きな膜質のシート様（ｍｅｍｂ　１ａｎｎｕｓ　５ ｈｅｅｔ−Ｈｋｅ）構造であると考えられた。これらの細胞のいくつかは２〜３ の核を含んでいた。これらの細胞は星状膠細胞の集密層上頂部でなくその中に存 在し稀突起神経膠細胞の回りの星状膠細胞が収縮した。

ＭＳウィルス単離体を用いた感染後９〜１４日感染後６日の培養物に比較して、 これら後者の培養物は極めて明白なＣＰＥを示した。各培養物内に種々の大型多 核神経膠細胞が存在した。これらの細胞のい（つかは３０個までの核を含み、細 胞質の外周の回りにリングとして配置された。これらの細胞は標識ＣＮＰａ５ｅ に対して陽性でありＭＳウィルスに対する標識抗体に陽性を示す細胞質含有物を 含んでいた。星状膠細胞のベッド層はこれらの細胞の周囲から相当な距離後退し ており多核細胞かサイトカインの場合かある可溶性物質を生産していることを示 した。

ＭＳウィルスを感染させた培養物由来の培地をプールした超遠心分離して得たペ レットの試験はウィルス粒子が存在することを示した。この観察結果はウィルス が感染細胞から生産されこれが大量のウィルスを得る一層便利で迅速な方法であ ることを示した。ウィルスは感染ＣＲＦＫ、　ＶｅｒｏおよびＣ■１細胞から得 られるか、このウィルスの生産は感染後５０日以上までは観察されなかった。培 養稀突起神経膠組織が麻疹ウィルスのＥｄｍｏｎｓｏｎ株に影響されやすいとは 考えられなかったことは注意する必要がある。このウィルスを感染させた培養物 は少しもＣＰＥを示さなかった。

実施例６ 血清または髄液中の抗ＭＳ抗体の検出 実施例４はＭＳ患者の血清中にＭＳＶに対する循環抗体が存在するという免疫細 胞化学的な証拠を提供する。純化ＭＳＶ　、純化ＭＳＶから誘導した抗原もしく は抗原性フラグメント、またはＭＳＶの抗原もしくは抗原性フラグメントとほと んど同一の配列を有する合成ポリペプチド（少なくとも７５％が同一、好ましく は少なくとも９０９６同一）を酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ［ＳＡ ）において検出抗原として用いた。既知の方法を用いて、検出抗原をマイクロタ イタープレートのウェルの表面のような固形支持体または担体上に、コーティン グ緩衝液を用いてコーティングすることにより固定した。洗浄処理の後、血清ま たは髄液試料をウェルに添加した。インキュベーション後、さらにウェルを洗浄 し、結合酵素を有する適当な検出抗体（例えばヤギ抗１ｇＧ−西洋ワサビペルオ キシダーゼ結合物）を添加する。固形支持体または担体に結合した酵素の活性は 適当な酵素基質〔例えば西洋ワサビペルオキシダーゼの場合には４−クロロナフ トール（４−ｃｈｌｏｒｏｎａｐｈｔｏｌ）またはジアミノベンジジン〕を用い て検出して試料中の抗ＭＳ抗体か存在することを示す。

実施例７ ＭＳを予防するためのワクチンの開発 モルビリウィルス属には麻疹およびイヌジステンパーならびに中空ウィルス、小 反羽動物のペスト、ウシ脳炎およびアザラシジステンパーウイルスのようなオー ストラリアでは見られなかった他のウィルスか含まれる。これらのウィルスは近 似した抗原性を示し若干のウィルスタンパク質の間で著しい免疫交差反応性を示 す。免疫学的、形態学的およびウィルス学的研究に基づき、ＭＳウィルスはこの 属の他のものであり麻疹およびイヌジステンパーウィルスに類似した特性を有す る。

生ウイルスワクチンは不活化または死菌ウィルスワクチンよりも好ましい免疫原 と考えられる。効果的な麻疹およびイヌジステンパーワクチンは生きたウィルス の使用に基づいておりこれらのワクチンの生産は好首尾に開発する。ＭＳＶが麻 疹およびイヌジステンパーウィルスに関連する証拠は、実施例３に記載した免疫 交差反応性に基づきＭＳＶを用いたワクチンの開発に同様の方法を用いることが できることを示す。

稀突起神経膠細胞培養系（実施例５参照）はＭＳＶの単離体または弱毒化株の伝 染力をアッセイする手段を提供する。ウィルスの単離体または株の組織培養物感 染投与量（ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ）（Ｔ ｃｒＤ）を評価し比較してウィルスの弱毒化株を同定する。ＶｅｒｏおよびＣＶ Ｉ細胞で数年間増殖させたＭＳウィルス、または実験動物を通じて継代したウィ ルスのＴＣ／ＩＤをＭＳ脳組織から直接得られる単離体のＴＣＩＤと比較して培 養物中の稀突起神経膠細胞の感染力が減少した形態においてウィルスの弱毒化が あるかどうかを決定した。

また稀突起神経膠組織培養系により培養物中のウィルスにおけるＭＳＶに対して 生じたポリクローナルおよびモノクローナル抗体の有効性を評価することができ る。弱毒化形態のウィルスに対して生じた抗体の有効性ならびに弱毒化形態が効 果的な免疫原として機能するのに十分な抗体応答を生ずるかどうかの問題を評価 する。

実施例８ ＭＳに対する治療の開発 本発明はＭＳの治療の形式を提供する。これらの第１はモノクローナル抗体、例 えばＣ６（図２）の接種物の使用であり、これはＭＳＶに対し明確な特異性を示 す、。種々の量でこの抗体を接種することはウィルスに対する患者の免疫応答を 高める助けをする。全てのＭＳ障害が組織のリンパ球浸潤物の形態で免疫応答を 示すのではなく１８これらの損傷においてウイルスタンノくり質が存在するにも かかわらず抗体産生形質細胞の欠損が起こることは良く知られている。しかし、 精製した、モノクローナル抗体は脳血液関門を通りこの関門が浮腫のために損傷 を受けたと考えられる場合でもウィルスに対して効果的な作用を提供することが ない場合がある１１゜その後抗体は担体分子、例えば細胞接着分子または稀突起 神経膠細胞特異的分子と結合することかでき、これらは抗体を標的にし得る。

またＭＳの治療は上述のような弱毒化ワクチンまたはＭＳＶの抗原もしくは抗原 性フラグメント（またはＭＳＶの抗原もしくは抗原性フラグメントとほとんど同 一な合成ポリペプチド）に基づくサブユニットワクチンの形態、例えばモノクロ ーナル抗体Ｃ６（図２）を産生させるエピトープのようなウィルスの特異的抗原 性フラグメントの接種を行い得る。この利点は免疫原が免疫系を刺激してＭＳＶ に対する特異的抗体を大量に生産するＢリンパ球を生じさせることである。また この方法における免疫系の刺激は障害において免疫応答を援助するＴヘルパーリ ンパ球の生産を増加させる。

髪米ス献： ６、　Ｐｒ１ｎａａｓ、　Ｊ＋醜工」亡ユ、　６．５３１−５５４　（１９７５ ）。

７、　Ｃ００ｋ、Ｒ−Ｄ、ｕ−２，１４７−１５４，（１９８１）。

８−　Ｃｏｏｋ、Ｒ−ｏ−Ｎｈ、＾　、Ｎｕｒｏｉｏ、互、　３９５−４０４、 （１９７９）。

９、Ｃｏｏｋ、　Ｒ，Ｄ、　ａｎｄ　Ｗ工１ｃｏｘ、　Ｇ、Ｅ、　Ｎｅｕｒｏ　 ａｔｈ、　Ａ　ｌｄ。

血葛丸江鯰、　！、　３６１−３６７、　（１９８５）。

１０、　ｗ工ＩＣｏｘ、Ｇ、Ｅ、ａｔ−ａｌ、Ｖ　Ｍ　ｒ　ｂｉ　１．　９．　 ３５５−３６６゜（１９８４）。

１１、Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉ工ｓｔ＠ｉｎ、　Ｃ，ａ−ａ、　’ ｊＪｆ１．４９５−４９７（１９７５）。

１３、ＡｖｒａＩ！Ｉａｕｇ、　５−ａｎｄ　Ｔａｒｎｙｎｃｋ、　Ｔ−Ｉｍｍ ｕ　ｈｅｍｉ　。

旦、１１７５−Ｌエフ９　（１９７１）。

１５、Ｇａ工ｆｒ＠、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉ工５ｔａｉｎ、Ｃ，Ｍ　Ｅｎ　Ｌ　 。

ヱＬ　３−４６　（１９８１）。

１６、　Ｓａｒ工１．ａｖ＠、　Ｌル、　ｅｔ、ａｌ、、社鉱り紐り、　」担、 　７９−９０（Ｌ９８０）。

１７、Ｋｕｈｌｍａｎｎ−Ｋｒｉａｇ、　Ｓ、　ｅｔ、ａＬ、　Ｄ　ｖ、Ｂｒａ ｉｎ　Ｒｅｓ、、　３９゜２６９−２８０　（１９８８）。

↑にｃｖｖホ０リク０−ナル抗イ末 才に麻±トオｅリクＤ−ナルキ九イ木 モノ７０−ナルレオ九イ本（Ａ　ｔツク０−ナル士πＡ本　ｃ６フロントページ の続き く５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｓ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５／１４　８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　５／２ ８ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　８３１０− ２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ Ｉ

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．単離形態のモルビリウイルス、多発性硬化症ウイルス（ＭＳＶ）。
2. ２．ＣＶｌ細胞における単離ＭＳＶの培養物。
3. ３．初代稀突起神経膠細胞における単離ＭＳＶの培養物。
4. ４．ネコの中枢神経系から単離したネコパラミクソウイルスに対して生じた固定 化抗体とＭＳＶ含有組織を接触させ、さらに前記固定化抗体により結合した単離 ＭＳＶを回収する段階を含むことを特徴とする単離形態のＭＳＶの調製方法。
5. ５．多発性硬化症（ＭＳ）脳組織から単離したＭＳＶに対して生じた固定化抗体 とＭＳＶ含有組織を接触させ、さらに前記固定化抗体により結合した単離ＭＳＶ を回収する段階を含むことを特徴とする単離形態のＭＳＶの調製方法。
6. ６．前記ＭＳＶ含有組織がＭＳ脳組織であることを特徴とする請求の範囲４また は５記載の方法。
7. ７．回収後前記単離ＭＳＶをＣＶｌ細胞または初代稀突起神経膠細胞物中で培養 することを特徴とする請求の範囲４または５記載の方法。
8. ８．ＭＳＶ、ＭＳＶの抗原、もしくはその抗原性フラグメントを認識または結合 することを特徴とする抗体。
9. ９．前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲８記載の 抗体。
10. １０．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲８記載 の抗体。
11. １１．請求の範囲８〜１０のいずれか１つの項記載の標識抗体を含むことを特徴 とする診断試薬。
12. １２．前記標識抗体が酵素抗体結合物を含むことを特徴とする請求の範囲１１記 載の試薬。
13. １３．前記結合物が西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体結合物を含むことを特徴と する請求の範囲１２記載の試薬。
14. １４．ＭＳＶ、ＭＳＶの抗原、もしくはその抗原性フラグメントを認識または結 合するモノクローナル抗体を生産することを特徴とするハイブリッド細胞系また はハイブリドーマ。
15. １５．患者から採取した試料を請求の範囲８〜１０のいずれか１つの項記載の抗 体または請求の範囲１１〜１３のいずれか１つの項記載の診断試薬と接触させ、 さらに前記抗体または診断試薬の結合を検出して前記試料中のＭＳＶの存在を示 すことを特徴とする前記試料中のＭＳＶの検出方法。
16. １６．前記試料が脳または他の組織試料であり、さらに前記検出工種が前記試料 に対する前記抗体または診断試薬の結合を検出して前記試料中のＭＳＶの存在を 示すことを特徴とする請求の範囲１５記載の方法。
17. １７．前記検出工程が前記試料の免疫細胞化学的染色を含むことを特徴とする請 求の範囲１６記載の方法。
18. １８．患者から採取した流体試料をＭＳＶ、その抗原もしくは抗原性フラグメン トまたはＭＳＶの抗原もしくは抗原性フラグメントとほとんど同一な合成ポリペ プチドと接触させ、さらに前記ＭＳＶまたはその抗原もしくは抗原性フラグメン トに結合した抗ＭＳＶ抗体を検出することを特徴とする前記試料中の抗ＭＳＶ抗 体を検出する方法。
19. １９．検出抗原が固形支持体に固定したＭＳＶまたはその抗原もしくは抗原性フ ラグメントを含むことを特徴とする請求の範囲１８記載の方法。
20. ２０．結合抗ＭＳＶ抗体を標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いて検出すること を特徴とする請求の範囲１８または１９記載の方法。
21. ２１．前記流体試料が血液試料を含むことを特徴とする請求の範囲１８〜２０の いずれか１つの項記載の方法。
22. ２２．前記流体試料が髄液試料を含むことを特徴とする請求の範囲１８〜２０の いずれか１つの項記載の方法。
23. ２３．試験キットに検出抗原として、ＭＳＶ、その抗原もしくは抗原性フラグメ ント、またはＭＳＶの抗原もしくは抗原性フラグメントとほとんど同一な合成ポ リペプチドを含むことを特徴とする患者から採取した流体試料中の抗ＭＳＶ抗体 を検出する試験キット。
24. ２４．検出抗原が固形支持体に固定したＭＳＶまたはその抗原もしくは抗原性フ ラグメントを含むことを特徴とする請求の範囲２３記載の試験キット。
25. ２５．活性免疫原として、不活化または弱毒化ＭＳＶ、ＭＳＶの抗原もしくはそ の抗原性フラグメント、あるいはＭＳＶの抗原もしくは抗原性フラグメントとほ とんど同一な合成ポリペプチドを含むことを特徴とするヒトまたは動物患者にお いてＭＳＶに対する免疫応答を刺激する組成物。
26. ２６．前記活性免疫原を担体分子に結合させたことを特徴とする請求の範囲２５ 記載の組成物。
27. ２７．前記担体分子をキーホールリンビドヘモシアニンもしくは他のヘモシアニ ン、ウシ血清アルブミンまたは卵アルブミンから選択したことを特徴とする請求 の範囲２６記載の組成物。
28. ２８．さらに組成物がアジュバントを含むことを特徴とする請求の範囲２５〜２ ７のいずれか１つの項記載の組成物。
29. ２９．前記アジュバントをフロイントの完全もしくは不完全アジュバント、また はミョウバンから選択したことを特徴とする請求の範囲２８記載の組成物。
30. ３０．請求の範囲２５〜２９のいずれか１つの項記載のワクチン組成物の効果的 な量をヒトまたは動物患者に投与することを含むことを特徴とする前記患者にＭ ＳＶに対する免疫応答を産生させる方法。
31. ３１．ＭＳＶ、ＭＳＶの抗原、もしくはその抗原性フラグメントを認識または結 合する抗体の効果的な量を前記患者に投与することを含むことを特徴とする患者 におけるＭＳの治療方法。
32. ３２．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲３１記 載の方法。
33. ３３．前記抗体を担体または標的分子と結合させることを特徴とする請求の範囲 ３０または３１記載の方法。