JPS6368076A - エイズ患者から単離された新規ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ。

エイズ）の患者から単離された新規ウィルス、並びにエ
イズおよびエイズ関連コンプレックス（ΔＲＣ，プレー
エイズと称されることもある。）の患者の血清中の抗体
の検出におけるその用途および該ウィルスによる感染に
対するワクチンとしてのその用途に関する。本発明は、
エイズ患者の感染組織中のウィルス性抗原を検出するの
に有用な、該ウィルスに対する抗体にも関する。

［従来技術］ 後天性免疫不全症候群（エイズ）は、世界中で２ｏ、ｏ
　ｏ　ｏ人を越える人々が患った新しい悲惨な病気であ
る［エイズ・ウィークリー・サーベイランス・レポート
ーユナイテッド・ステイン、センターズ・フォー・ディ
シーズ・コントロール（ＡＩ　Ｄ　Ｓ　　Ｗｅｅｋｌｙ
　　Ｓ　ｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　　Ｒｅｐｏｒｔ　−
Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ、　Ｃｅｎｔｅｒｓ　　
ｆｏｒ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ）、１９
８６年５月５日］。この疾病は、日和見感染、およびカ
ボジ肉腫またはＢ細胞リンパ腫のような悪性の症状によ
って臨床的に特徴付けられる［デュラック、ディー・テ
ィー、二ニー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデ
イシン（ＮＩ　ｎｇ、　Ｊ　、　Ｍｅｄ、　）、３０５
−１１４６５頁（１９８１年）；レイチャート、シー・
エムら、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（
Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈ、　）、１１２．３５７頁（１
９８３年）；ジ−グラ−、ジェイ・エルら、ニュー・イ
ングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３１１．
５６５頁（１９８４年）］。この疾病の原因はウィルス
性であることが提案されて久しいが、感染性ウィルス性
病原体の単離に関するこれまでの研究においては、芳し
い結果はもたらされていない。エイズ患者の末梢血球を
、分裂促進剤で刺激した正常ヒトリンパ球または永久ヒ
トＴセルラインと共に培養することによって、多くの研
究機関において、Ｔ細胞親和性ヒトレトロウィルス（Ｔ
−ＩＴ　Ｌ　Ｖ−１１１／ＬＡＶ）が単離されている［
バーレーシノウッシ、エフら、サイエンス（Ｓ　ｃ　１
ｅｎｃｅ）、２２０，８６８頁（１９８３年）；ガロ、
アール・シーら、サイエンス、λん先、５００頁（１９
８４年）］。疫学的に、このような新しく単離されたレ
トロウィルスが、エイズおよび／またはエイズ関連コン
プレックス（ＡＲＣ）の患者と関連が深いことがわかっ
た［シューバッチ、ジェイら、サイエンス、λλ上、５
０３頁（１９８４年）：ザーンガダラン、エム・ジー（
Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　　Ｍ、　Ｇ、　）ら、サ
イエンス、Ｉｌ１．５０６頁（１９８４年）］。ＨＴ　
Ｌ　Ｖ　−１／ＬＡＶを用いたイン・ビトロの研究によ
って、Ｔ細胞の親和性および細胞変性が証明された［バ
ーレーシノウッシ、エフ、前出：ボボヴイック、エムら
、サイエンス、λ１上、４９７頁（１９８４年）］。し
かし、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ’／ＬＡＶ（７）注射によって
エイズの動物モデルを確立することは成功していない［
ガジュセク、ディー・シーら、ランセット（■、ａｎｃ
ｅｔ）、上、１４１５頁（１９８４年）］。

Ｉ］ＴＬ■−■／ＬＡＶの注射に感受性のあることがわ
かっている霊長類は、ヒト以外にはチンパンジーだけで
ある。しかし、この動物を用いた実験において、永続的
な感染および／またはウィルス血症が確実に起こってい
るにもかかわらず、日和見感染および／または悪性症状
を特徴とする判然としたエイズは未だ見られていない［
ガジュセク、ディー・シーら、ランセット、上、５５頁
（１９８５年）］。すなわち、このヒトレトロウィルス
は、コツホ法則を満たしていない（すなわち、実験動物
において伝染性エイズ様疾病を起こすという条件を満た
していない）。

［発明の構成］ 本発明は、エイズ患者から単離された新規ウィルスに関
する。更に、本発明は、エイズ患者およびＡＲＣ患者の
血清中の抗体を検出するため、並びに該新規ウィルスに
対するワクチンを調製するための、該ウィルスの用途に
も関する。本発明は、該ウィルスに対する抗体、および
エイズ患者組織中のウィルス性抗原の検出におけるその
用途にも関する。

このウィルスは、エイズ患者の牌臓またはエイズ患者の
カボジ肉腫組織から単離される。このウィルスは、ＮＩ
Ｈ／３Ｔ３細胞を形質転換（トランスフェクションおよ
びトランスフォーメーション）し得る。形質転換細胞の
ＤＮＡは、ヒトの反復ＤＮＡ配列を有していない。２種
の形質転換細胞は、５ｂ５１およびＫｂ４３として同定
される。

これらの形質転換細胞は、ウィルスによって永続的に感
染されている。多数のウィルスヌクレオキャプシドが、
多くの形質転換細胞の核の中に存在する。このウィルス
を、形質転換細胞から単離する。

成熟ピリオンの多くは、約１４０〜２８０ｎｍの大きさ
であり、全体としては１００〜９００ｎｍの大きさであ
る。このウィルスをヌードマウスおよび免疫適格マウス
（Ｂａｌｂ／ｃ）に導入すると、感染した動物のり患率
および死亡率は非常に高く、エイズ患者に見られるのと
同様の多くの症状が現れる。

感染組織を動物から動物へ導入することによって、同様
の疾病が伝染する。この新規ウィルスにより、エイズま
たはＡＲＣ患者の血清中の抗体を検出することができる
。抗原−抗体反応を検出するための、固相酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、直接および
間接免疫蛍光アッセイ、ウェスタンプロット法などのい
ずれの方法を用いてもよい。更に、抗体は、実験動物に
おいて生じる抗体であるか、ウィルスに対するモノクロ
ーナル抗体であり、感染組織、例えばエイズ患者の末梢
血球および血清の中のウィルス関連抗原を検出し得る。

該ウィルスに対して抗体が生じるので、ウィルスまたは
ウィルス性抗原を用いて、ヒトを含む動物を該ウィルス
による感染から保護するワクチンを調製することができ
る。

［図面の説明］ 第１Ａ図は、エイズ患者のび臓組織から単離した核酸に
より形質導入された形質転換コロニー、第１Ｂ図は、上
記形質転換細胞の単層を示す。

第２Ａ図は、細胞変性変化の証拠をほとんど示さないＳ
ｂ５１細胞の単層、第２Ｂ図および第２Ｅ図は、高細胞
密度フォーカス部の中央における細胞変性、第２Ｃ図お
よび第２Ｆ図は、細胞溶解性プラーク（溶菌斑）、第２
Ｄ図は、Ｓ　ｂ　５１　ｒｌ”、Ｊｆｆｌにおける高細
胞密度フォーカス形成および多層細胞集積を示す。

第３Ａ図〜第３Ｅ図は、ウィルスで永続的に感染したＮ
Ｉ）（／３Ｔ３細胞におけるヌクレオカプシドの集合を
示し、第３Ａ図、第３Ｂ図、第３ｃ図ではヌクレオカプ
シドが核に見られ、第３Ｄ図では細胞質中の膜結合空所
（槽）に見られ、第３Ｅ図では膜から離れた細胞質内に
見られる。

第４Ａ図および第４Ｂ図は、細胞溶解性５ｂ５１細胞中
におけるウィルス成熟の超微細構造を示し、第４Ａ図は
核の場合、第４Ｂ図は細胞質の場合である。第４Ｃ図、
第４Ｄ図おにび第４Ｅ図は、分断されたＳｂ５１細胞の
細胞質中における成熟ピリオンを示す。

第５Ａ図、第５Ｂ図および第５Ｃ図は、５ｂ５１細胞の
培養上清中に放出されたウィルス粒子を示し、第５Ａ図
は膜結合ウィルス粒子を含むもの、第５Ｂ図は無傷の粒
子と部分的分断ピリオンを含むもの、第５Ｃ図は部分的
分断ピリオンを含むものである。

第６Ａ図、第６Ｂ図および第６Ｃ図は、免疫細胞化学的
染色を示し、第６Ａ図はＳｂ５１細胞と非エイズ血清、
第６Ｂ図はＮＩＨ／３Ｔ３細胞とエイズ血清、第６Ｃ図
はＳｂ５１細胞とエイズ血清によるものを示す。

［詳細な記載］ 本発明は、エイズ患者から単離された新規ライ。

ルスに関する。本発明のウィルスは、永続的に感染した
細胞に含まれ、１９８６年６月１７日に、寄託番号Ｃｒ
（Ｌ９１２７として、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託された
。このウィルスは、エイズ患者の組織、例えばカポジ肉
腫組織または牌臓組織から単離される。この組織を細か
くして、コラゲナーゼで処理する。次いで、組織懸濁液
を、プロテイナーゼ、例えばブロテイナーゼにで処理す
る。フェノール抽出、フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール抽出、およびクロロホルム／イソアミ
ルアルコール抽出によって遺伝物質が得られる。遺伝物
質のエタノール沈澱を行うと、高分子ｆｔＤＮＡが肉眼
で観察できる。高分子量ＤＮＡおよび種々の大きさのＲ
ＮＡを含有する遺伝物質を溶解する。

単離した遺伝物質を用いて、グラハム、エフ・エルら、
ヴアイロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、基ター、４５
６頁（１９７３年）の方法に従って、Ｎ１１ｌ／３Ｔ３
細胞を形質転換する。この方法において、核酸をリン酸
カルシウムを用いて沈澱させ、Ｎ　Ｔ　Ｔ−１／３Ｔ３
細胞と共にインキュベートする。沈澱した核酸を除去し
、細胞をトリプシン処理する。■・リプシン処理した細
胞を再接種し、分かれる前にグリセロールで処理する［
コープランド、エフ・ジーら、セル（Ｃｅｌｌ）、」、
３４７頁（１９７９年）］。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含
有ダルベツコ培地−１２＝ を用いて継代培養を行い、３〜４日毎に養分を供給する
。形態学的に形質転換した細胞のフォーカスが約２週間
以内に明らかになる。表現型形質転換は、形質転換細胞
が急速に過度に増殖し、多層に重なり、肉眼で見える大
きなフォーカスを形成することによって特徴付けられる
。形質転換率は、約０．０１〜０．０２（供与体核酸１
μｇ当たりの確認できるフォーカス数）である。形質転
換コロニーを３週間後に採り、単層に培養する。形質転
換細胞のＤＮＡは、ヒトの反復ＤＮＡ配列を持たない。

前記の第１次形質転換細胞から遺伝物質を単離し、新し
いＮＩＨ／３Ｔ３細胞の形質転換に使用する。この遺伝
物質を用いると、わずかに高い形質転換率で形質転換が
起こる。これにより、エイズ患者の組織から単離された
遺伝物質が活性形質転換要素を含有することが示される
。

ピリオンの多くは、・細胞と共に存在する。このウィル
スは、５ｂ５１のような形質転換細胞から単離される。

通例、Ｓｂ５１細胞ペレツトを凍結および解凍により溶
解し、ウィルス粒子を放出させる。大きなウィルス粒子
を、シコークロースバリアーを通してペレット化し、ン
ユークロース同密度勾配中に集める。ウィルス粒子その
ものは、約ｘ、＋７〜１．２０の密度を有する。この密
度で単離された主な遺伝物質は、ＲＮＡであると考えら
れる。

本発明の新規ウィルスは、広範な大きさく１００〜９０
０　ｎｍ、とりわけ約１４０〜２８０　ｎｍ）の成熟ピ
リオンによって特徴付けられる。

本発明の新規ウィルスをマウスに導入し得る。

通例、５〜１０８個のＳｂ５１細胞から単離されノこウ
ィルスを、生後６週間のマウスに静脈内または腹腔内注
射し得る。ヌードマウスまたは免疫適格マウス（Ｂａｌ
ｂ／ｃ）を感染することができる。ヌードマウスに本発
明の新規ウィルスを感染させた場合、感染した動物の死
亡率は非常に高い。エイズ患者に見られるのと同様の多
くの症状が、感染マウスに現れる。すなわち、感染マウ
スを剖検すると、しばしば、様々の程度の形質細胞増加
症と共に、顕著な全身性のリンパ節疾患、神経病または
リンパ球欠乏が見られる。顕著な皮膚感染を伴った免疫
不全の兆候が見られることもある。播種性痒疹も通例起
こる。皮膚組織および内臓には、紡錘細胞の増殖病変が
ある。ウィルス感染した免疫適格マウス（Ｂａｌｂ／ｃ
）は、後にニューモジステイス・カリニに感染したこと
がわかり、このことによって、感染動物が免疫不全状態
であることがわかる。

り患した動物の牌臓、リンパ節または全血の濾過溶解質
を注射することによって、動物から動物へ同じ疾病が伝
染する。感染組織の細胞核中に、ウィルスヌクレオキャ
プシドが多く集まっているのが見られる。変性細胞の細
胞質中にも成熟ピリオンが確認される。

本発明の新規ウィルスは、エイズまたはＡＲＣの患者の
血清中の抗体を検出するのに有用である。

一方法において、永続的にウィルス感染した細胞を、低
細胞密度で滅菌スライドガラス上で増殖させる。エイズ
患者、ＡＲＣ患者および正常人の血清ヲ、フス、ニス−
エムら、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・
パソロジー（Ａｍ、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、　）、８０，２１頁（１９８３
年）に記載のような免疫ペルオキシダーゼ染色法で試験
する。このアッセイによると、エイズ患者血清２４中２
３が強い陽性を示した。他の１人のエイズ患者からの血
清は弱い陽性を示した。正常人血清３０中２６は、永続
的に感染した細胞（Ｓｂ５１）と反応性を示さなかった
。正常人血清３０中４は、弱い反応性（弱い陽性）を示
したが、その染色は、エイズ患者の血清との反応による
染色よりも著しく弱かった。ＡＲＣ患者の検査血清はす
べて強い陽性を示した（すなわち、血清はＳｂ５１細胞
と反応する抗体を含有していた。）。更に、前記感染動
物の血清にも、このアッセイ法において、永続的にウィ
ルス感染した細胞と反応する抗体を含有するものがあっ
た。

この方法以外にも、エイズ患者またはΔＲＣ患者の血清
において本発明の新規ウィルスに対する抗体を検出する
ために、他の抗原−抗体反応検出１６一 方法を用いることができる。このような方法には、ＥＬ
ＩＳＡ、ウェスタンプロット法、直接または間接免疫蛍
光アッセイおよびラジオイムノアッセイがあるが、これ
らに限定されるものではない。

エイズ患者またはＡＲＣ患者の血清中の抗体を検出する
ためのこのようなアッセイ法は、米国特許第４．．５２
０，１１３号に記載されており、ここに引用する。該特
許においては、抗原としてＨＴＬＶ−Ｉ１１／ＬＡＶを
用いている。本発明のウィルスを用いて同様の方法を行
うことができる。エイズ特異性抗体の検出のための診断
用キットを、本発明のウィルスを用いて、従来の方法で
調製することができる。これらの方法、特にウェスタン
プロット法を用いるアッセイは、より良好な結果をもた
らす（とりわけ偽陽性を示すことが少ない）と考えられ
る。

本発明のウィルスに対する抗体は、マウス、ウサギおよ
びヤギのような実験動物を用いて、標準的な方法で製造
し得る。該ウィルスに対するモノクローナル抗体を従来
の方法で調製することもできる。抗体は、エイズ患者の
リンパ節、膵臓、カポジ肉腫、脳および末梢血球並びに
血清のような感染組織中のウィルス性抗原を検出するの
に有用である。エイズ患者の組織中のウィルス性抗原を
検出するために、前記のようないずれの抗原−抗体反応
検出方法を用いてもよい。

抗体は、ウィルスによって感染した細胞を検出するため
にも有用である。これににす、ウィルスを他の組織から
分離することができる。例えば、エイズ患者の感染組織
を適当な受容セルラインまたは細胞（例えば白血球）と
共に培養することによって、更にウィルスを単離するこ
とができる。感染細胞は、抗体によって測定または認識
され、前記のような感染細胞からウィルスが得られる。

抗体を用いてアフィニティーカラムを調製し、感染細胞
溶解質からウィルスを精製するのに使用することもでき
る。

従来の方法でウィルスまたはウィルス性抗原をらクチン
として使用して、保護抗体の生成を誘導することができ
る。ウィルス性抗原は、ウィルスから単離されるか、ま
たは従来のＤＮＡ組み替え技術によって得られる。ワク
チンは、既知の原理および国際的な標準の要求に従って
、通例の方法、例えばイン・ビトロ細胞培養、ＤＮＡ組
み替えおよびバクテリアおよび／またはウィルス感染を
無くす従来の調節方法に上って調製される。

好ましくは、不活性化（すなわち減毒または殺した）ワ
クチンを使用する。ウィルスは、既知の方法またはその
改良法によって、例えばβ−プロピオラクトン、ホルマ
リンもしくはアセチルエチレンイミンの添加によって、
紫外線照射によって、またはソラレンもしくはソラレン
誘導体処理おと長波長紫外線とによって殺される。ウィ
ルスを既知の方法で弱めて、単離してもよい。本発明の
ワクチンは、１種またはそれ以上の適当な安定剤、保存
剤、緩衝塩および佐剤を含有し得る。ワクチンは、経口
または非経口投与用に処方し得る。注射用溶液としての
組成物は、適当な力価のウィルスを活性成分として含有
し、１種またはそれ以」二のｐＨ調整剤、緩衝剤、安定
剤、賦形剤および等張化添加剤を含有し得る。注射用溶
液は、従来の方法で、皮下、筋肉内または静脈内投与の
ために調製し得る。要すれば、溶液を通例の方法で凍結
乾燥して、凍結乾燥注射剤を調製してもよい。

経口投与用固体組成物は、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散
剤およびカプセル剤であってよく、活性成分用賦形剤お
よび要すれば他の添加剤、例えば結合剤、崩壊剤、滑沢
剤、着色料、甘味料および香料を含有し得る。

ウィルスの投与量は、もちろん、投与方法および投与時
間間隔によって変わる。活性成分の適当な用量および投
与時間間隔は、既知の予備ルーヂン試験によって容易に
決定し得る。

以下の実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。

これらの実施例は、説明のためのものであって、本発明
を制限するものではない。

［実施例］ 実施例１ エイズ患者からの遺伝物質の単離 劇症のニューモジステイス・カリニ肺炎によって死亡し
たエイズ患者からカポジ肉腫組織を採った。剖検による
と、大きなカポジ肉腫が、皮膚、両肺、壁側胸膜、胃腸
管、膵臓、肝臓、腎臓およびリンパ節に見られた。遺伝
物質の抽出に用いた組織は、死後５〜６時間の患者の腹
膜後リンパ節のカポジ肉腫から採ったものであった。固
定パラフィン切片により、カボジ肉腫によって、リンパ
節構造のほとんど全部がなくなっていたことがわかった
。

やはりニューモジステイス・カリニ肺炎によって死亡し
た他のエイズ患者から膵臓組織を採った。

剖検によると、癌（すなわちカボジ肉腫またはリンパ腫
）は全く確認されなかった。遺伝物質の抽出に用いた膵
臓組織のパラフィン切片は、充血およびリンパ球欠乏を
示していた。

膵臓またはカボジ肉腫の組織（１〜２ｇ）を細かくし、
３７℃で１５分間、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）１
ｍｌ中のコラゲナーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）で処理した。次
いで、組織懸濁液を、１０容量倍の１５０ｍＭＮａＣσ
、１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、０４％ＳＤＳ中のプ
ロテイナーゼＫ（２５０ｌ１ｇ／ｍｌ）で、６５℃で３
０分間および３７℃で１０時間処理した。フェノール抽
出（２回）後、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５：２４：１）およびクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２４・ｌ）で抽出して、遺伝物質
を精製した。エタノール沈澱を行うと、肉眼で見える高
分子ｍのＤＮＡを容易に観察することができた。−晩風
乾後、遺伝物質を水相（１ｍＭ）リス、１ｍＭＥＤＴＡ
）に再溶解した。回収した遺伝物質は、高分子量ＤＮＡ
および種々の大きさのＲＮＡ３０〜４０％を含有してい
た。遺伝物質を第１の形質転換細胞および正常ヒト線維
芽細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＴ、。

−１５２１）の培地から単離する方法は同じてあった。

細胞１０〜２０ｘ１０８個のペレットを、コラゲナーゼ
処理を行わずに、１０容量倍の同じ緩衝液中のプロテナ
ーゼＫ（２５０μｓ／ｍｌ）と直接混合した。

実施例２ Ｎ　Ｔ　Ｉ−Ｉ／３　Ｔ　３細胞の形質転換形質転換は
、グラハムら（前出）の方法をわずかに改良して行った
。カポジ肉腫組織、膵臓組織、正常ヒト線維芽細胞また
はサケ精子から単離された核酸的３０μｇを、それぞれ
６０ｍｍのベトリ皿（約５Ｘ１０５ＮＩＨ／３Ｔ３細胞
含有）中でリン酸カルシウムで沈澱させた。細胞を３７
°Ｃで１２時間インキュベート後、ＤＮＡ沈澱を除去し
た。更に２４時間後、各プレートの細胞をトリプシン処
理し、４〜５個の６０ｍｍペトリ皿に再接種した。分け
る前に、ｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ（Ｇｉｂ
ｃｏ）社）ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中
の１５％グリセロールで細胞を５分間処理した（コープ
ランドら、前出）。継代培養は、５％ＦＢＳ含有ダルベ
ツコ培地を用い、３〜４日毎にこの培地を補給して行っ
た。形態学的に形質転換された細胞のフォーカスが、２
週間以内に明らかになつた。３週間後にコロニーを採っ
た。

エイズ患者の膵臓およびカボジ肉腫組織からの遺伝物質
で形質転換したＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、形態学的に形質
転換されたコロニーを形成し、これは２週間以内に肉眼
で見えるようになった。この表現型形質転換は、形質転
換細胞が急速に過度に増殖し、多層に重なり、肉眼で見
える大きなフォーカスを形成するということによって特
徴付けられる（第１　（Ａ）図、７５×）。形質転換率
は、約００１〜０．０２（供与体核酸１μｇ当たりの確
認できるフォーカス数）であった。対照的に、サケ精子
からのＤＮＡまたはヒト線維芽細胞からの核酸を用いた
同様の培養においては、形質転換フォーカスは確認され
なかった。形質転換細胞を、２週間後にこのような表現
型悪性フォーカスから回収し、単層に培養した。形質転
換細胞は、多層に重なる傾向を保持しており、正常ＮＩ
Ｉ−Ｔ／３Ｔ３線維芽細胞の３倍以上の細胞密度に達し
た。第１（Ｂ）図に示す、単層に増殖した形質転換細胞
の１種は、これらの培養において、ランダムな多層形成
＝２４− が顕著であり、細胞密度の高いフォーカスを形成してい
ることがわかる。

実施例３ ＮＴＨ／３Ｔ３細胞形質転換の確認 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の形質転換が活性形質転換遺伝要素
を介して起こったことを確認するために、形質転換の後
のサイクルにおいて、急速に細胞増殖し、高密度に重な
るという悪性表現型を伝染する、第１の形質転換細胞の
能力を試験した。すなわち、第１の形質転換細胞のいく
つかから前記のように単離した遺伝物質を用いて、前記
のように形質転換の第２のサイクルを行った。形質転換
アッセイの第２のサイクルにおいては、形質転換率はよ
り高かった（供与体核酸１μｇ当たりのフォーカス数０
．０５）。これらの結果は、エイズ患者の膵臓およびカ
ポジ肉腫組織から単離された遺伝物質が、表現型正常細
胞の形質転換および再形質転換において、急速な細胞増
殖という悪性形質転換を誘発する活性形質転換要素を含
有していたことを示す。活性形質転換遺伝要素は、形質
転換４サイクルを通して同じであった。更に研究するた
めに選択した第１および第２の段階の形質転換クローン
からのＤＮＡを、次いで、ｐ　３２ニツク翻訳ブルー　
（Ｂ　１．ｕｒ）　８−プラスミドでプローブして、ヒ
トＤＮＡ反復配列の存在に関して分析した。これらの形
質転換細胞には、ヒト反復ＤＮＡ配列は検出されなかっ
た。

実施例４ 形質転換細胞の分析 正常ＮＩＨ／３Ｔ３および形質転換細胞クローンを、す
べて同様に１０％ＦＢＳ含有ダルベツコ培地で単層培養
した。オートクレーブ処理可能なスライド（セルーライ
ン社（Ｃｅｌｌ−Ｌ　ｉｎｅ　　Ａｓｓ。

Ｉｎｃ、））を予め滅菌し、方形ペトリ皿中でトリプリ
ン処理した細胞懸濁液（ＩＸＩＯ５細胞／ｍ細胞７塗ｌ
した。これを、５％ＣＯ２インキユベーター内において
、３７℃で、４８〜７２時間インギコベートした。培養
スライドを冷ＰＢＳで３回洗い、風乾し、４℃で貯蔵し
た。これらの貯蔵スライドを、２〜３日中に免疫細胞分
析に（＝Ｊした。

単層をスライドから直接こすり落とした。１゜０００　
ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞を採った。

細胞ペレットを、リン酸緩衝液中の２゜５％ゲルタール
アルデヒド中で一晩４°Ｃで固定し、１％Ｏｓ　Ｏ４で
更に固定した。次いで、固定した組織を標準的な方法で
処理し、マラグラス（Ｍａｒａｇｌａｓｓ）６５５に載
せた。超薄切片を、ウラニルアセテートおよびクエン酸
鉛で二重染色した。次いで、試験片を、電圧６０〜１０
０ｋｖの電子顕微鏡で検査した。培養物上澄中のウィル
ス粒子をネガティブ染色した。培養物上澄中のウィルス
粒子を、ＳＷ４．１遠心チユーブ内で２０％シュークロ
ースバリアー５ｍＱを用いて、４０．００　Ｏｒｐｍで
１時間遠心してペレット化した。次いで、ペレットを、
１１５０〜Ｉ／１００容量のトリス−ノーマル生理食塩
液（ｐＨ７，４，０，０５Ｍトリス）に再懸濁させた。

懸濁液を、ホルムバー（ｆｏｒｍｖａｒ）被覆ブリッド
に直接のせ、２％ホスホタングステン酸（ＰＴＡＸｐＨ
７、２’）でネガティブ染色した。

２種の形質転換細胞（Ｓｂ５１およびＫｂ４３）に２７
一 ついて、詳細に研究した。これらの２種の形質転換細胞
は、膵臓およびカボジ肉腫組織からの遺伝物質を用いた
第２サイクル形質転換から得られた。

ウィルスで永続的に感染したＳｂ５１細胞は、寄託番号
ＣＲＬ９１２７で、１９８６年６月１７日にＡＴＣＣに
寄託された。これらは、顕著な細胞変性無く、非常に高
密度に増殖した（第２（Δ）図、１００ｘ）。しかし、
形質転換細胞が飽和密度に達した後は、細胞変性を示す
細胞の溶解プラークが見られる場合があった。多くの生
理学的因子、例えばインキュベーション温度および培地
が、溶解プラーク生成の度合に影響することがわかった
。

例えば、温度を３２℃に低くすると、溶解プラーク生成
は多くなる。第２図は、単層培養におけるＳｂ５１細胞
の重層を示す。急速に細胞が過度に増殖し、多層に重な
っているフォーカスは、暗い背景でローパワー光学顕微
鏡で最も良く観察できる（第２（Ｄ）図、４０×）。通
例、高細胞密度フォーカスの中央において細胞変性が起
こっており（第２（Ｂ）図、１００×および第２（Ｅ）
図、４．Ｏｘ）、＝２８− 縁が硬く見える溶解プラークが見られた（第２（Ｆ）図
、４０×）。高倍率の位相差顕微鏡でも同じプラークが
見られる（第２（Ｃ）図、２５０Ｘ）。増殖性フォーカ
スの中央において、溶解細胞の分離があきらかであった
。溶解プラークの辺縁において、高密度に集まった細胞
の変性作用が顕著であった。

これらの作用は集まっており、凝集しｔこ形でより小さ
く見えた。

少なくとも３０％の細胞において顕著な細胞変性の起こ
るＳｂ５１およびＫｂ４３の単層を、電子顕微鏡で観察
した。多くの形質転換細胞には、核およびいくぶん細胞
質中に大量のヌクレオキャプシドの形成が見られた。こ
の物質はすこししか成熟ピリオンの形成に用いられなか
ったように見えた。ヌクレオキャプシドは、豊富なヌク
レオキャプシドタンパク質で構成されたと思われる、柔
外被のある８〜９ｎｍの細い小管状であった。これらは
、通例、より電子密度の高い、より顆粒状の構造（直径
約１８〜２５ｎｍ）に組織されていた（第３図）。ウィ
ルスヌクレオキャプシドは、形質転換細胞の核の中に見
られた（第３（Ａ）図、１３，４００×および第３（Ｂ
）図、４．７，０ＯＯｘ）。第３（Ｃ）図（１４，７０
０ｘ）は、核全体がウィルスヌクレオキャプシドで置換
された溶解細胞を示す。この場合、成熟ピリオンは細胞
質にはほとんど見られない。ウィルス性遺伝物質を含有
する大きな細胞質のピロプラスト（ｖｉｒｏｐｌａｓｔ
）が、しばしば部分的に凝集しており、膜結合している
ことがわかった（第３（Ｄ）図、５２，２００ｘ）。こ
のようなピロプラストの早期形成が小胞体の槽中に見ら
れ、これらは著しく膨張しており、しばしば外膜」二に
リポソームを有していた。この小胞および小胞体槽中に
成熟ピリオンが存在する場合があった。ヌクレオキャプ
シドは、膜との相互作用無く、細胞質内にも形成され（
第３（Ｅ）図、５２，２００ｘ）、これは核のヌクレオ
キャプシドとは形態学的に見分けられた。

溶解変性細胞において、主に崩壊細胞の細胞質中に、多
くのピリオンが見られた（第４図）。核のクロメ−ジョ
ン縮合および辺縁趨向を示す初期の細胞変性が、第４（
Ａ）図（１５，０ＯＯＸ）に見られる。核内のウィルス
ヌクレオキャプシドの凝集が顕著である。種々の成熟段
階の多くのウィルス粒子が、細胞質中に見られる。これ
は、第４（Ｂ）図（４，５，８００ｘ）にも見られる。

しかし、ウィルスヌクレオキャプシドのマトリックス中
の植生に成熟ピリオンが確認される場合もあった。細胞
質中の成熟ピリオンの多くは、原形質膜に沿って並んで
おり、他のものは遊離している（第４（Ｃ）図、＋２．
８００ｘ；第４（Ｄ）図、４．５，８００Ｘおよび第４
（Ｅ）図、７６．７００ｘ）。ピリオンは、種々の大き
さの粗い球形の外包粒子であった。成熟ピリオンの多く
は１４０〜２８０ｎｍの大きさで、全体では１００〜９
００ｎｍの大きさであった。ウィルス粒子そのものは約
７ｎｍの厚さのはっきりした外膜を有し、ヌクレオキャ
プシドが内部に詰まっていた。しばしば、ヌクレオキャ
プシドがピリオン内部で凝集して高密度のコアになって
いた。ピリオンの外側のエンベロープは明確であり、厚
いが、硬くはなかった。ピリオンの中には、突起のある
、細長い形、卵形および多形態性のものがしばしばあっ
た（第４（Ｄ）図、４５，８００ｘ）。

ウィルスの超微構造および形態を更に確認するために、
２０％シュークロース勾配バリアーの５ｂ５１およびＫ
ｂ４３培養上澄からのウィルス粒子をペレット化するこ
とによって、切片にされていないピリオンを試験した。

粒子を、最初の１／＋００の容量でトリス−ノーマル生
理食塩液に再懸濁させた。沈澱した粒子を、ＰＴＡでネ
ガティブ染色後、電子顕微鏡で直接観察した。ウィルス
粒子のいくつかの標本を、０．５％ホルマリンで固定し
て、ピリオンの形態を保存し、かつ実験室内における感
染の問題を回避した。ピリオンのネガティブ染色標本で
は、通例、その内部構造と共に、表面がより詳細に見え
た。粗面ピリオンの典型的な標本を第５図に示す。粒子
の大きさも形も様々である。いくつかのピリオンは、し
ばしば長く、または不規則に膨れた突起を有するように
見えろ（第５（Ａ）図、ＩＱｌ、８００Ｘ）。内部成分
は、互いにおよび粒子長軸に対して多少とも平行に配−
′Ａ２− 列したストランドから成っていた。内部ヌクレオキャプ
シドストランドは、低濃度のホルマリンで固定した粒子
内によりよく保存されているように見えた（下方の粒子
、第５（Ｂ）図、４０．０００ｘ）。第５（Ｂ）図中の
下方の粒子中に見える破壊された外膜は、上方に飛んで
いた（矢印）。明確なエンベロープは、外表面にかすか
な突起を有していた（上方の粒子、第５（Ｂ）図）。高
倍率において、ピリオンが複雑な膜状エンベロープを有
することがわかった（第５（Ｃ）図、３７０，０ＯＯｘ
）。遊離したヌクレオキャプシドは、非螺旋状である。

実施例５ 感染性ウィルスの単離 単層として増殖したＳｂ５１細胞をトリプシン処理し、
１．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心することによってペレ
ット化した。細胞ペレットを、等容量のダルベツコ培地
に再懸濁させた。凍結・解凍サイクルを５回行って細胞
を溶かし、細胞中のウィルス粒子を遊離させた。ＳＷ／
ｌ　ｌ遠心チューブ中、２０％シュークロースバリアー
、４０．００Ｏｒｐｍで４５分間遠心することによって
粒子をペレット化した。粒子をＰＢＳに再懸濁し、シコ
ークロース同密度勾配中に集めた（２０〜６０％）。ウ
ィルス粒子は、約１．１７〜１．２０の密度で存在して
いた。ウィルス粒子を、ＰＴＡネガティブ染色を行って
、電子顕微鏡によって直接確認した。次いで、前記密度
のフラクションから単離されたこれらのウィルス粒子の
イン・ビトロおよびイン・ビボにおける感染性を調べた
。培養したヒト胚細胞を、イン・ビトロ感染性試験にお
いて、単離したウィルスによって直接感染した。実施例
６において調製する抗血清を用いて、この細胞をアッセ
イに付した。細胞がウィルスによって感染したことがわ
かった。

実施例６ 新規ウィルスに対する抗体の調製 実施例５に記載のように、５×ｌＯ°個の５ｂ５１細胞
からウィルス粒子を単離し、フロインドアジュバントと
混合した。ウサギに、２〜３箇月の間隔をおいて免疫原
を２回注射した。２回目の免疫感作後に、ウィルスに対
する良好な抗体応答が得られた。

１鼾 新規ウィルスによるマウスの感染 実施例５に記載のように５Ｘ１０６個のＳｂ５１細胞か
らウィルスを単離し、少量のＰＢＳに再懸濁させた。ウ
ィルス懸詞液を、生後６週間の雄ＮＴ　Ｉ−Ｉ（Ｎｕ　
Ｎｕ）マウスまたは生後６週間の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス
に注射した。注射は、静脈内または腹腔内に行った。ウ
ィルス液を静脈内または腹腔的注射したヌードマウスの
６０％に、ｌＯ〜１２日間で、紅斑のある皮疹および結
膜炎が見られた。

１匹には、顕著な眼窩骨膜浮腫も見られた。これらの症
状は、２〜３週間後には無くなった。どのマウスも、急
性感染から回復したように見えた。

次いで、６週間後に、２匹に痒疹が見られた。この２匹
および他の２匹は、死ぬか、非常に症状が重篤になり、
３箇月以内に層殺しなければならなかった。従って、ウ
ィルス感染以後の最初の３箇月間で、マウスの４０％が
死んだ。皮膚病変をあまり起こさなかった１匹には、全
身性リンパ腺腫および麻痺が見られた。このマウスは、
衰弱し、後足が完全に麻痺していた。１匹には、わずか
に隆起した幾つかの紫色ががった皮膚病変があった。

剖検によると、これらのマウスのすべてのリンパ節にリ
ンパ球欠乏が見られた。全体の検査において、非常に小
さいリンパ節だけが確認されノこ。また、１匹のマウス
には、播種性リンパ腺腫が見られた。鼠径部、腋、頚部
、縦隔洞および腸間膜のリンパ節は、著しく腫れていた
。このマウスは、発達した肝牌腫をも起こしていた。リ
ンパ節の組織切片には、顕著な形質細胞増加が見られた
。詞組織球増殖の起こっている部分もあった。血漿細胞
が正常なリンパ節構造を無くし、個に広がって浸透して
いた。他のどのマウスのリンパ節にも、リンパ球欠乏が
見られた。全体に、小さいリンパ節しか確認できなかっ
た。

紫色がかった皮膚病変の組織切片には、紡錘細胞増殖が
見られた。紡錘細胞は、皮膚脂肪組織およびその下の筋
肉に浸透しているように見えた。

＝３６− 赤血球の濡出の見られる部分もあった。有糸分裂像が確
認されたが、顕著ではなかった。このマウスの肝臓の組
織検査によっても、門脈周囲において紡錘細胞が増殖し
ていることがわかった。この同一種の癌細胞は、より上
皮様であった。多くの赤血球が細胞間隙に入り込んでい
た。皮膚病変中の浸透している紡錘細胞を電子顕微鏡で
観察すると、細胞変性していた。ウィルスのヌクレオキ
ャプシドの凝集が多くの核に見られ、細胞質にも幾分見
られた。これらのウィルスヌクレオキャプシドの形態お
よび性質は、前記Ｓｂ５１細胞中に見られるものと同様
であった。成熟ピリオンも、幾つかの破壊細胞中にも確
認された。ヌクレオキャプシドもピリオンも、滑面小胞
体の拡大槽中にしばしば見られた。電子顕微鏡で観察す
ると、肝臓の門脈周囲の紡錘細胞病変にも、顕著なウィ
ルス感染が見られた。

Ｂａｌｂ／ｃマウスも、ウィルス性病原体に対して感受
性であった。注射後の最初の３箇月間で、７匹中３匹が
死亡した。注射後４箇月目に更に２匹が死亡した。対照
の動物には、４箇月間に全く症状が現れなかった。これ
らの動物が生存している間に皮疹およびリンパ腺腫を臨
床的に評価することは非常に困難であった。剖検による
と、いずれのマウスにもリンパ球欠乏が見られた。これ
らのマウスのリンパ節および痺臓は非常に小ざくなって
いた。リンパ節を確認できない場合すらあった。

これらのマウスの肺は、重篤な肺炎を起こしていた。Ｍ
−Ａｇおよびトルレンドブルー（ｔｏｌｕｌｅｎＬｂｌ
ｕｅ）染色により、ニューモジステイス・カリニが検出
された。従って、これらのマウスは、重度の免疫不全で
あると考えられる。４箇月よりも長く生存した２匹は、
Ｓｂ５１細胞は認識するが、ＮｒＨ／３Ｔ３親細胞は認
識しない抗体を血清中に有していることがわかった。こ
の血清の免疫ベルオキンダーゼ反応は、５ｂ５１細胞の
核においても、細胞質においても陽性であった。

実施例８ 新規ウィルスに対する抗体の検出 エイズ患者および正常人の血清を、免疫ペルオキシダー
ゼ染色法（フスら、前出）により分析した。

すなわち、永続的に感染したＳｂ５１細胞または正常Ｎ
ＩＨ／３Ｔ３細胞を、滅菌スライドガラス上で低細胞密
度で増殖させた。培養スライドをアセトン中で室温で５
分間固定した。トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ、Ｉ）Ｈ
７，６，０，０５Ｍ）中で洗浄後、スライドをまずアビ
ジン１００μｓ／ｍη含有１％正常ウマ血清（シグマ（
Ｓ　ｉｇｍａ））と共に３０分間インキュベートし、次
いでＴＢＳ中のビオチン（シグマ）飽和溶液と共に更に
１５分間インキコ。

ベートした。この最初の段階で、工程によって、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）から
誘導される非特異的反応が最少限になる。次いで、エイ
ズ患者または正常人からのヒト抗「■清を１　：２００
希釈して使用した後、ビオチン標識ヤギ抗ヒトイムノグ
ロブリン（タボ（Ｔ　ａｇｏ））１：２００希釈および
ＡＢＣ（ベクター（Ｖ　ｅｃｔｏｒｒ、ａｂ、　））を
用いた。各インキュベート工程は、３０分間行い、各工
程間に充分な洗浄を行った。染色反応を、ＤＡＢ　　Ｎ
ｉ　ＨｔＯｔ溶液中で行い、メチルグリーンで対比染色
を行った。対照は、２次抗体を省略して行った。

エイズ患者の血清は、感染細胞とは陽性の免疫化学反応
を起こしたが、正常Ｎ　ｒ　Ｔ−Ｔ／３　Ｔ　３細胞と
は起こさなかった（第６（Ｃ）図および第６（Ｉ３）図
）。反応は、Ｓｂ５１細胞の核においても、細胞質にお
いても陽性であるように見えた。しかし、核の多くは、
細胞質よりも顕著に染色された。細胞突起の少ない、よ
り小さい丸い細胞が、最も顕著に染色していた。このア
ッセイによると、カボジ肉腫、カボジ肉腫と日和見感染
、または日和見感染のみのエイズ患者の血清２４中２３
が陽性であった（第１表）。カポジ肉腫と日和見感染の
両方があったエイズ患者の１人の血清は、弱い陽性を示
した。エイズにかかっていない正常人の血清３０中２６
は、感染Ｓｂ５１細胞に対して反応性を示さなかった。

このような陰性反応の一つを第６（Ａ）図に示す。他の
４血清は、感染Ｓｂ５１細胞と弱い反応性を示した。し
かし、染色強度は、エイズ患者血清の反応において見ら
れたものよりも著しく弱かった。

第１表 種々の病態のエイズ患者における、５ｂ５１細胞に対す
る血清抗体の存在 ＊　　女性−男性両性愛者のセックスパートナー＊＊　
エイズにかかっていない対照血清のうち４血清は弱い反
応を示し、他の対照血清は反応を起こさなさなかった。

Ａｒ（Ｃ患者の血清も同様に試験したところ、すべて陽
性であった。

実施例９ エイズ患者組織のウィルス感染細胞の同定エイズ弘者の
リンパ節、膵臓、カボジ肉腫および脳組織をホルマリン
中で固定し、パラフィン切片とした。エイズ患者の抗血
清の代わりに、実施例６に記載のように調製したマウス
またはウサギの抗血清を用いて、実施例８に記載のよう
な免疫ペルオキシダーゼアッセイを行った。実質的に、
すべての試験組織中にウィルス感染細胞か確認された。

本発明のウィルスによる感染を確認するために、電子顕
微鏡で観察した。前記組織中の変性細胞の核および細胞
質中にウイルスヌクレオギャブシドが見られた。感染組
織の細胞の幾つかには、成熟ピリオンも見られた。

一般的検討 ウィルス感染の動的プロセスにおいて、感染性ウィルス
粒子と宿主細胞表面との接触によって、複雑な一連の反
応が起こり、その結果、侵入および後のウィルス複製が
うまく起こるか否かが決まル［ハウ、シーら、コンプリ
ヘンシブ・パイロロジー、↓６，１頁、（１９８０年）
］。感染源の遺伝物質を、対応する完全なウィルスに対
して通常感受性があるか、または無い細胞に直接導入す
ると、ピリオンが細胞質中に侵入するために相互作用す
べき多数の成分をさけて通る（ガジュセクら、前出：ハ
ウら前出）。２人のエイズ患者の膵臓お、】；びカボジ
肉腫組織から得られる遺伝物質は、形質転換する遺伝要
素を含むことがわかった。この遺伝物質で正常ＮＩＨ／
３Ｔ３細胞を形質転換すると、表現型形質転換フォーカ
スが見られた。急速な細胞増殖および多層への重層を特
徴とする悪性表現型は、形質転換の後のサイクルにおい
て伝染し得る。これらの形質転換細胞（Ｓｂ５１および
Ｋｂ４．３）を注意深く調べると、細胞が新規ウィルス
に永続的に感染していることがわかった。この培養物に
は、溶解プラークは殆ど見られない。このような永続的
に感染した細胞の植生に、多くのヌクレオキャプシドの
密集がしばしば見られた。

膜結合をしているか、またはしていないヌクレオキャプ
シドの細胞質封入体もあった。小胞体は、ウィルスの成
熟および／または集合において重要な役割を有するよう
に見える。植生にピリオンが確認されるが、成熟ピリオ
ンは通例細胞質中に見られるか、または溶解細胞の血漿
膜に付若している。ピリオンは粗面法である。しかし、
球形および大きさは種々であることがわかった。該粒子
の直径は、１４０〜２８０ｎｍである。ピリオン内部の
小さいヌクレオキャプシドは、約８〜９ｎｍである。核
および細胞質中の、より電子密度の高い、部分的に顆粒
状のヌクレオキャプシドは、約１８〜２５ｎｍである。

ホウツ、ジー・イーら、ジャーナル・オブ・パイロロジ
ー（Ｊ　、　ｏｆ　　Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、２９，５
１７頁（１９７９年）の方法に従って、ウィルス感染細
胞の細胞溶解物または培養上澄を用いて、逆転写酵素活
性のアッセイを行った。ヌクレオチド合成は見られなか
った。更に、このウィルスの形態、大きさ、集合プロセ
スおよび成熟は、レトロウィルスのものではなかった。

また、このウィルスの超微構造研究によると、これは、
従来の分類の特定のウィルス群に属さないことがわかっ
た。しかし、その複製および成熟プロセスは、ヘルペス
ウィルスのような、ＤＮＡの大きいウィルスのそれと同
様であった［ロイズマン、ビーら、−β−１２２９〜３
８２頁（１９７４年）］。モノクローナル抗体（バイオ
チク社（Ｂ　１ｏｔｈｃｈ　　Ｉ　ｎｃ、　））および
免疫ペルオキシダーゼ法を用いて、以下のウィルス抗原
を試験し、Ｓｂ５１細胞において陰性であることがわか
った：（ａ）ニブシュタイン−バール・ウィルス（Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　　Ｖｉｒｕｓ、　ＥＢＶ）初期
抗原り成分、初期抗原Ｒ成分、膜抗原およびキャプシド
抗原；（ｂ）サイトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａ
ｌｏｖｉｒｕｓＳＣＭＶ）初期および後期抗原；（Ｃ）
ヘルペス・シンプレックス（Ｈｅｒｐｅｓ　　Ｓ　ｉｍ
ｐｌｅｘ）　Ｉおよび■（クーパー・バイオメト（Ｃｏ
ｏｐｅｒ　　Ｂｉｏｍｅｄ。

））。更に、エイズにかかっていない２人の患者のＣＭ
Ｖ感染血清は、Ｓｂ５１細胞と相互作用を起こさなかっ
た。

このウィルスは、実験小動物において病原性である。ウ
ィルスの感染によって、１０〜１２日間で急性疾患が起
こる。急性感染の症状がほとんど無くなっても、３箇月
間の動物のり患率および死亡率は高い。ヌードマウスの
４０％以上がこの期開山に死亡する。試験した動物を剖
検すると、リンパ球欠乏または全身性リンパ腺腫が起こ
っていたことがわかった。リンパ腺腫の動物には、顕著
な形質細胞増加が起こっていた。すべての組織像は、エ
イズ患者（ヒト）に見られるものであった。

実験動物には、皮下組織および肝臓における紡錘細胞増
殖も起こっていた。病変は、エイズ患者（ヒト）におけ
る紡錘細胞癌、カボジ肉腫と明確に一致していた。ウィ
ルスヌクレオキャプシドおよび成熟ピリオンが、感染動
物の病変部分に認められた。ウィルスの感染は、免疫不
全を起こすと考えられる。潰瘍および唾液腺感染のある
大きな皮膚感染が、これらの動物に通例見られた。

免疫適格マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）がニューモジステイス
・カリニに感染したことにより、免疫不全状態が明白に
なる。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、感染に対して等しく感受
性であるようにみえ、非常に短期間で死亡した。リンパ
球欠乏の事実と一致して、感染動物の免疫機能は顕著に
抑制されていた。ウィルス感染が他のマウスに伝染する
ことを示すには、感染動物膵臓をホモジナイズし、他の
マウスに再導入する。これらのマウスは、ウィルスによ
って感染される。

免疫化学的方法によって、エイズ患者の血清のほとんど
すべて（２４中の２３）およびＡＲＣ患者血清すべてが
、正常ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を認識しないが、ウィルス感
染細胞の中の新しく得られた抗原は認識する独特の抗体
を有することがわかった。エイズ患者におけるこのウィ
ルス感染は、顕著であるようにみえる。同じ方法によっ
て、該ウィルスに対する抗体を用いると、ウィルス抗原
がエイズ患者の感染組織中に見られた。

本発明を特定の態様に関して記載したが、更に改良をな
し得るものと理解される。本発明は、本発明の関連分野
における既知の方法による本発明の改良を含む、本発明
の原理に基づくいかなる変化、用途または適用をも包含
することを意図しているものである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、エイズ患者のひ臓組織から単離した核酸に
より形質導入された形質転換コロニー、第１Ｂ図は、上
記形質転換細胞の単層を示す。 第２Ａ図は、細胞変性変化の証拠をほとんど示さないＳ
ｂ５１細胞の単層、第２Ｂ図および第２Ｅ図は、高細胞
密度フォーカス部の中央における細胞変性、第２Ｃ図お
よび第２Ｆ図は、細胞溶解性プラーク（溶菌斑）、第、
２Ｂ図は、Ｓｂ５１単層における高細胞密度フォーカス
形成および多層細胞集積を示す。 第３Ａ図〜第３Ｅ図は、ウィルスで永続的に感染したＮ
ＩＨ／３Ｔ３細胞におけるヌクレオカプシドの集合を示
し、第３Ａ図、第３Ｂ図、第３Ｃ図ではヌクレオカプシ
ドが核に見られ、第３Ｄ図では細胞質中の膜結合空所（
槽）に見られ、第３Ｅ図では膜から離れた細胞質内に見
られる。 第４Ａ図および第４Ｂ図は、細胞溶解性５ｂ５１細胞中
におけるウィルス成熟の超微細構造を示し、第４Ａ図は
核の場合、第４Ｂ図は細胞質の場合である。第４Ｃ図、
第４Ｄ図および第４Ｅ図は、分断されたＳｂ５１細胞の
細胞質中における成熟ピリオンを示す。 第５Ａ図、第６Ｂ図および第５Ｃ図は、５ｂ５１細胞の
培養上清中に放出されたウィルス粒子を示し、第５Ａ図
は膜結合ウィルス粒子を含むもの、第５Ｂ図は無傷の粒
子と部分的分断ピリオンを含むもの、第５Ｃ図は部分的
分断ピリオンを含むものである。 第６Ａ図、第６Ｂ図および第６Ｃ図は、免疫細胞化学的
染色を示し、第６Ａ図は５ｂ５１細胞と非エイズ血清、
第６Ｂ図はＮＩＨ，／３Ｔ３細胞とエイズ血清、第６Ｃ
図はＳｂ５１細胞とエイズ血清によるものを示す。 特許出願人　アメリカン・レジストリー・オブ・パソロ
ジー 代理　人　（弁理士）青　山　葆　ほか１名昭和　６２
年特許願第　　１５３２２９　　号３．補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国ワシントン、ディー、シー、　２
０３０６、アームド・フォースイズ・インスティヂュー
ト・オブ・パソロジー　（番地の表示無し）名称　アメ
リカン・レジストリー・オブ・パソロジー４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市東区域見２丁目１番６１
号６　補正の対象　：明細書の図面の簡単な説明の欄お
よび図面（浄書）７、補正の内容 （１）　　明細書５０頁１２行の後に次の文を挿入する
。 「なお、上記第１Ａおよび１８図、第２Ａ−２Ｆ図、第
３Ａ−３Ｆ図、第４　Ａ　−４Ｅ図、第５Ａ−５Ｃ図並
びに第６Ａ−６Ｃ図は、何れも生物の形態を示す写真で
ある。」 （２）別紙の通り、図面の浄書を提出する（内容に変更
なし）。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を形質転換することができ、ヌ
   ードマウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスを感染してエイズ
   様症状を起こすことができる、密度約１．１７〜１．２
   ０および大きさ１００〜９００ｎｍの、エイズ患者の組
   織から単離されたウィルス。 ２、セルラインＡＴＣＣ第ＣＲＬ９１２７号によって産
   生されたウィルスの性質を有する、エイズ患者の組織か
   ら単離されたウィルス。 ３、セルラインＡＴＣＣ第ＣＲＬ９１２７号によって産
   生されたウィルスを含んで成る、エイズ患者の組織から
   単離されたウィルス。 ４、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の
   ウィルスを単離する方法であって、（ａ）エイズ患者の
   組織を採り、 （ｂ）前記組織から遺伝物質を単離し、 （ｃ）前記遺伝物質でＮＩＨ／３Ｔ３細胞を形質転換し
   、および （ｄ）感染したＮＩＨ／３Ｔ３細胞から前記ウィルスを
   単離することを含んで成る方法。 ５、特許請求の範囲第１項または第２項記載のウィルス
   を単離する方法であって、 （ａ）エイズ患者の組織を採り、 （ｂ）前記組織を、受容セルラインまたは受容細胞と共
   に培養し、 （ｃ）形質転換細胞を識別し、および （ｄ）感染細胞から前記ウィルスを単離することを含ん
   で成る方法。 ６、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の
   ウィルスと特異的に反応する抗体。 ７、エイズまたはＡＲＣの患者の体液試料中における、
   特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のウィ
   ルスの抗原決定部位に特異的に結合する抗体を検出する
   方法であって、前記ウィルスを前記試料と接触させ、抗
   原−抗体複合体の生成を測定することを含んで成る方法
   。 ８、エイズまたはＡＲＣの患者の感染組織の試料中にお
   ける、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載
   のウィルスのウィルス性抗原を検出する方法であって、
   前記ウィルスに特異的な抗体を前記試料と接触させ、抗
   原−抗体複合体の生成を測定することを含んで成る方法
   。 ９、エイズ特異性抗体の検出に用いるための、容器、ウ
   ィルスおよび抗原−抗体複合体検出手段を含んで成る診
   断用キットであって、特許請求の範囲第１〜３項のいず
   れか１項に記載のウィルスを含むことを特徴とする診断
   用キット。 １０、エイズまたはＡＲＣ患者の組織中における、特許
   請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のウィルス
   のウィルス性抗原を検出するために用いる、容器、抗体
   および抗原−抗体複合体検出手段を含んで成る診断用キ
   ットであって、前記ウィルスと特異的に反応する抗体を
   含むことを特徴とする診断用キット。 １１、不活性化した特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か１項に記載のウィルスの有効量および生理学的に許容
   し得るワクチン用担体を含んで成るワクチン組成物。 １２、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載
   のウィルスのウィルス性抗原の有効量および生理学的に
   許容し得るワクチン用担体を含んで成るワクチン組成物
   。 １３、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を形質転換し得、ヌードマウ
   スおよびＢａｌｂ／ｃマウスを感染してエイズ様症状を
   起こし得、密度約１．１７〜１．２０および大きさ１０
   ０〜９００ｎｍの、エイズ患者の組織から単離したウィ
   ルスで永続的に感染したセルライン。 １４、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞から誘導された特許請求の範
   囲第１３項記載のセルライン。 １５、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９１２７号として同定された特
   許請求の範囲第１４項記載のセルライン。 １６、エイズまたはＡＲＣ患者の体液試料中における、
   特許請求の範囲第１３〜１５項のいずれか１項に記載の
   セルラインに含まれるウィルスの抗原決定部位に特異的
   に結合する抗体を検出する方法であって、前記セルライ
   ンを前記試料と接触させ、抗原−抗体複合体の生成を測
   定することを含んで成る方法。 １７、容器、抗原−抗体複合体検出手段および特許請求
   の範囲第１３〜１５項のいずれか１項に記載のセルライ
   ンを含んで成る、エイズ特異性抗体の検出に用いる診断
   用キット。