JPH01501205A - 非ａ非ｂ型肝炎由来の新規ウイルス因子及びそれに結合した抗原の単離方法、この方法で得られたウイルス因子及び抗原、この抗原の検出方法並びに非ａ非ｂ型ウイルス性肝炎検出用免疫試薬、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非Ａ非Ｂ型肝炎由来の新規ウィルス因子及びそれに結合した抗原の単離方法、こ の方法で得られたウィルス因子及び抗原、この抗原の検出方法並びに非Ａ非Ｂ型 ウィルス性肝炎検出用免疫試薬、その製造法及び用途 この発明は、流行性および散発性または輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎由来のウィルス 因子（ｖｉｒａｌ　ａｇｅｎｔ）の単離法と特性決定法に関する。

ウィルス性肝炎は、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ） およびまだ確認されていない未知数の非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）ウィルスによって 起こるものである。現在、ＨＢＶの予防が実施されている先進国では、ＮＡＮＢ 型肝炎が、入院に至る感染性肝炎の主要原因である。ウィルス性肝炎には、少な くとも３つのウィルスに由来すると考えられている。すなわちその中の２つは、 汚染血液および汚染血液製剤によって伝染されるものであり、第３番目のものは 、流行性ＮＡＮＢ肝炎の原因となっているものであり、入院を要する肝炎患者の ５０〜６０％の原因になっているということが本願発明者によって確認され、西 欧諸国で報告されているが、その伝染のしかたは知られていない。後進図では、 ＮＡＮＢ型肝炎は、水系・糞便−経口伝染による大規模な流行をおこすようであ る。１９８０年から現在までに、この種の５つの流行が、インド、シベリャ、ネ バール、アルジェリアおよび最近ではアイボリイ　コーストで報告されている。

これらの場合ではすべて、妊娠女性に高い死亡率が認められた。

ＮＡＮＢ型肝炎の起源についてのウィルスに関する我々の現在の知識は、思わし くない不正確なものであって、臨床データと疫学的なデータに限定されている。

輸血後ＮＡＮＢ型肝炎に罹患している患者由来の血液もしくは血液製剤を接種す ることによって、濾過可能な因子が明らかに単離され、感染性の血液製剤が得ら れたのである。流行性ＮＡＮＢ型肝炎については、実験的感染はごく少数しか行 われていない。この感染は、マーモセット（ｍａｒａｏｓｅｔＸｓｏｇｕｉｎｕ ｓ　＠ｙｓｔａｘ）、マカク　モンキイ（ｓａｃａｑｕｅ　ｍｏｎｋｅｙ）（Ｍ ａｃａｃｕｓ　ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）およびヒトのボランテイヤーに、および 最近ではアフリカグリ、−ンモンキイ（ＣｅｒｃｏｐｉＬｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈ ｏｐｓおよびεｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ　ｐａｔａｓ）にも伝染することが確認 された。しかしいかなる決定的な感染性製剤も示唆されていない。

輸血後肝炎については、ＮＡＮＢ抗原・抗体系、超微細構造の変種およびウィル スに似た粒子について多くの報告があるにもかかわらず、これらの報告はすべて 可能性として予想はしているものの、この発明でなされた研究より前に、特異的 な原因結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃａｕｓａｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に対 する血清学的基準を満たすいかなる原因因子、系またはウィルスも同定されてい ない。

流行性肝炎については、球形で直径が２７ｎｍのウィルスに類似した粒子がごく まれに糞便中に見出されたので、その免疫特性の決定を、電子顕微鏡を用いて、 通常の凝集法によって実施した。どんなＮＡＮＢ型ウィルスも、細胞培養物には 、ウィルスの複製はいままで得られていない。

出願人がインスティティ　パスツールで発明者がビロー氏のフランス特許願第８ ６０５３４７号は、流行性ＮＡＮＢ型ウィルつ性肝炎を検出するのに適切な試薬 と、この試薬を用いる診断方法を開示している。そしてこの特許願の試薬は、流 行性ＮＡＮＢ型肝炎に罹患していることが知られている患者から得た糞便エキス によって人工的に感染させたモンキイの血清から単離された抗−１ｉＡＮＢ　Ｉ ｇＭ”ｉ’構成サす、ソノ抗−ＮＡＮＢ　ＩｇＭＩｉ、特ｉ、−Ｐ　Ｖ　Ｃ板の ような固体担体に有利に固着される。

前記発明者は、前記特許願の発明に続いて研究を行った結果、次のような目的を 達成した。

ｌ）この発明者は、モンキイに感染させ、その抗体（Ａｃ）と回復期の患者のＡ ｃとを用いて、ウィルスと結合する抗原（Ａｇ）の特異的検出および抗−ウィル スＡｃの検出のためのＥＬＩＳＡ法を開発した。

２）この発明者は、抗原物質を十分に産生ずる無限増殖性肝細胞系中にウィルス を複製するのに成功した。

３）この発明者は、糞便試料の精製薬剤および感染させた肝細胞系中のウィルス 粒子を目視可能にした。

４）この発明者は、流行性と散発性の両者のＮＡＮＢウィルス性肝炎に、同じ原 因因子が含有されていることを確認できた。

５）散発性肝炎における流行性ＮＡＮＢ肝炎の因子の役割を検討することによっ て、この発明者は、前記因子が水で運ばれるだけでなく、水辺外のルート特に輸 血ルートによって伝染されるということを確認することができた。

この発明の目的は、新規なウィルス因子およびこのウィルス因子と結合している ＮＡＮＢ抗原（Ａｇ）の同定と特性決定ならびに前記のインスティティ　パスツ ールの特許願のサブジェクトの抗体（Ａｃ）または患者のＡｃの研究によって得 た抗体（Ａｃ）を用い、ウィルスもしくは適切な担体に吸着させたそのウィルス のフラクションを用いて、ＮＡＮＢウィルスと結合したＡｇを検出することによ る流行性と散発性の両者のＮＡＮＢ肝炎と輸血後のＮＡＮＢ肝炎の診断法である 。

またこの発明の目的は、この発明のＮＡＮＢ肝炎診断法に有用な免疫診断用試薬 と、面記診断法を実施するのに用いるキットとを提供するにある。

この９発明の目的は、流行性、散発性または輸血後のウィルス性ＮＡＮＢ肝炎由 来の新規な精製ウィルス因子であって、その抗原活性の分布形態が密度が１．２ ８−１．３２９／　ｃｍ”の少なくとも一つのバンドおよび／または密度が１． １２−１．１９９／　ｍ”の少なくとも一つのバンドからなることを特徴とする ものである。

流行性、散発性または輸血後のＮＡＮＢ肝炎由来の精製ウィルス因子の実施態様 によれば、このウィルス因子はＮＡＮＢ肝炎に罹患している患者の糞便から、遠 心分離し次いで多孔度が約０．２２μ烏であるフィルターで濾過することによっ て単離される。

流行性、散発性または輸血後のＮＡＮＢ肝炎由来のウィルス因子の他の実施態様 によれば、ウィルス因子は、ＮＡＮＢ肝炎に罹患している患者の糞便エキスまた は感染させたサル由来の肝臓エキスを接種された肝細胞または無限増殖性肝細胞 系から得られる。

流行性、散発性または輸血後ＮＡＮＢ肝炎由来のウィルス因子のさらに他の実施 態様によれば、特異的抗原が結合している前記ウィルス因子が、２つの主要タイ プ、すなわち約７５ｒ＋ｇ＋の直径の粒子および約２５〜３０ｎａの直径の粒子 の球形ウィルス粒子であり、第１のタイプのものは、１．１〜１．６９／ＩＩ（ ２間で変化する塩化セシウム（Ｃ５ＣＩ）密度勾配のフラクション中に主として 存在し、その密度が１．２８〜１．３２９／ｃｍ″であり、およびｌＯ〜６０１ （量／容量％間で変化するシタ糖濃度勾配の４０〜４１．５％のフラクション中 に主として存在する。′また第２のタイプのものは、１．１２〜１．１９９／ｃ ♂のＣｓＣ１密度勾配と前記ショ糖の勾配の２６〜２８％フラクションとに主と して存在する。

さらにこの発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎のウィルスを感染させた肝細胞上で培養 された患者の糞便から単離されたウィルス因子を物理的または化学的分解手段で 処理することによって得られることを特徴とする前記定義のＮＡＮＢウィルスと 結合した抗原を提供するにある。

前記ＮＡＮＢウィルスと結合した抗原の有利な実施態様によれば、前記抗原は、 ＮＡＮＢ肝炎ウィルスを感染させた無限増殖性肝細胞系から単離されたウィルス 因子を超音波で処理することによって得られる。

ＮＡＮＢウィルスと結合している抗原の他の実施態様によれば、そのＣｓＣｌ勾 配における分布形態は、密度が１．１２−１．１９９７ｃｍ”、のバンドおよび ／または密度が１．２８−１．３２９７　ｃｍ’のバンドの形態であり、その抗 原は、このＣｓＣｌフラクションを超遠心分離後、ショ糖勾配中に、はじめのバ ンドはショ糖勾配の２６〜２８％フラクションに、２番目のバンドはショ糖勾配 の４０−４１．５％フラクションに存在する。

またこの発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎患者の糞便を遠心分離処理に付し、次いで 多孔度が約０．２２μｍの濾過材によって濾過処理して、前記ウィルス因子を糞 便から抽出することを特徴とする、流行性、散発性または輸血後のウィルス性肝 炎由来のウィルス因子の単離方法を提供するにある。

前記ウィルス因子の単離法の実施態様によれば、遠心分離は約５０００〜１ｌ１ ００ｈで約１０分間行うのが有利である。

前記ウィルス因子の単離方法の他の実施態様によれば、前記遠心分離を行う前に 、糞便エキスは超音波で処理するかまたは化学的分解処理に付される。

この発明の目的は、肝細胞または無限増殖性肝細胞系に、ＮＡＮＢ肝炎の患者由 来の糞便エキスまたはＮＡＮＢ肝炎患者の糞便エキスを接種されたサル［好まし くはサイミリ（Ｓａｉｉｉｒｉ）モンキイ］由来の肝臓エキスを接種し、培養物 が集密するまで培養し、培養物から継代培養を行い、いくつかの工程を経た後遠 心分離して所望のウィルス因子を収集することを特徴とする前記ウィルス因子を 得る他の方法を提供するにある。

この方法の有利な実施態様によれば、遠心分離されたベレットは、適切な緩衝液 によって取出し、上澄液中にＮＡＮＢ　Ａｇを放出する超音波処理に付される。

さらにこの発明の目的は、回復期の患者の血清または予めＮＡＮＢ肝炎ウィルス に感染させたサルから単離した免疫グロブリンを、ウィルス性ＮＡＮＢ肝炎に罹 患していると推定される哺乳動物の糞便エキスとともに培養して抗原抗体免疫複 合物を形成させ、これをＥＬＩＳＡ試験法または放射性同位元素標識免疫試験法 のような前記糞便中のＮＡＮＢ抗原の存在を検出する適切な検出試験法によって 分析することを特徴とする、流行性、散発性または輸血後のウィルス性ＮＡＮＢ 肝炎の患者の糞便中に存在するＮＡＮＢ抗原の検出法を提供するにある。

ＮＡＮＢ肝炎の患者の糞便中のＮＡＮＢ抗原の検出法の有利な実施態様は、ＮＡ ＮＢウィルスに感染していると推定される哺乳動物の糞便を遠心分離し濾過して 得られたエキスを、患者の血清、またはＮＡＮＢ肝炎にかかつていることがわか っているヒトの患者の糞便エキスを人工的に感染させたサルの血清から単離され 、固体担体に固定された抗ＮＡＮＢ　１８Ｍフラクションとともに培養し、次い で同一種もしくは近縁種の哺乳動物由来で、Ｂ−ガラクトシダーゼまたはペルオ キシダーゼのような酵素のラベルで標識化された、この発明によって精製された 精製ＮＡＮＢ　１４Ｇ免疫抗ウイルスフラクシヨンとともに培養し、反応を酸性 緩衝液中のオルトニトロフェニル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはオルトフ ェニル−ジアミンのような適切なデベロッパー基質によってデベロップされるこ とを特徴とするものである。またこの標識付けは、当該技術分野の当業者に公知 の方法によって発蛍光体もしくは放射性元素によつて行われる。

この発明によれば、この発明のウィルス因子のウィルス株は、前記および後記の ようにして単離され、下記の特徴を有し、１９８６年１０月３０日にインスティ ティ　パスツールが保持する微生物培養物国立コレクシジン（ｔｈｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　ｌ１ａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅＣｕｌｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｇ＋ｅｓ）に寄託された。すなわち、クラマート（Ｃ１ａ−訂ｔ ）株と呼称され、指定寄託番号が１−６１７の、散発性ＮＡＮＢ肝炎の患者の糞 便から単離されたウィルス因子のウィルス株およびアイポリ−コースト（Ｉｖｏ ｒｙ　Ｃｏａｓｔ）株と呼称され、指定寄託番号が１−６１６である流行性ＮＡ ＮＢ肝炎の患者の糞便から単離されたウィル因子のウィルス株である。

罹患中の患者もしくは回復期の患者の血液、輸血に用いられる製剤または血液由 来のフラクションに存在する抗体の検出方法の実施態様は、ｌ−６１７およびｌ −６１６の株およびこの２つの基準体と免疫交差反応する株を含む、この発明で 定義されている非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウィルス因子と、接触させる方法であり、 罹患患者または回復期の患者の血清を精製ウィルス製剤と接触させるか、または この製剤を前記条件下で遠心分離後単離して得た密度１．３０に対応するバンド のフラクションと接触させる方法である。

前記ウィルス製剤は、例えば公知の技術によってマイクロプレートの壁に固定さ れる。

複合体Ａｇ／ＡＣは、適切なラベル例えば酵素で標識をつけたヒト抗免疫グロブ リン製剤によってデベロップされる。

同様のシステムは、ヒト抗１ｇＭを用いるかまたは好ましくはこのＩｇＭをウィ ルスもしくはそのフラクションと反応させて血清からＩｇＭをトラップして、患 者のＩｇＭｌこ結合されたＡｇの特性決定することによって、患者のＩｇＭの抗 体活性を特性決定して、この疾病の血清学的診断を非常に早期に行うのに用いる ことができる。

またこの発明の目的は、回復期のヒトの血清または予めＮＡＮＢ肝炎のウィルス を感染させたサルの血清から単離した免疫グロブリンからなり、ＮＡＮＢ肝炎の 抗原を含有する糞便のエキスとともに培養すると抗原−抗体免疫複合体を形成す るに適することを特徴とする、流行性、散発性または輸血後のＮＡＮＢ肝炎を検 出するための免疫試薬を提供するにある。

この発明の免疫試薬の有利な実施態様は、この発明によってＮＡＮＢウィルスで 汚染された固体の糞便のエキスととともに培養することによって免疫複合体を形 成するのに適するもので、遠心分離と濾過によりて精製されたものである。

この発明の目的は、ウィルス性ＮＡＮＢ肝炎の患者の糞便のエキスを注射するこ とによって人工的に感染させた動物の血清、またはＮＡＮＢウィルスもしくはそ の精製フラクションで免疫された動物の血清から作製されたＮＡＮＢ抗肝炎抗体 からなることを特徴とする、流行性、散発性または輸血後のウィルス性ＮＡＮＢ 肝炎検出用免疫試薬を提供するにある。

上記の免疫試薬の有利な実施態様では、そのＮＡＮＢ抗肝炎抗体（ＩｇＭまたは ＩｇＧ）は固体の担体に固定される。

上記試薬の有利な実施態様では、ＮＡＮＢ抗肝炎抗体で被覆された固体担体が、 さらにＢＳＡのような蛋白質、特にその好ましくは緩衝溶液で被覆されている。

この発明の免疫試薬は、この発明のＮＡＮＢ抗原の検出方法に用いられる。すな わちこの試薬を、糞便エキス、血液製剤もしくは患者の血清とともに培養し、次 いで流行性ＮＡＮＢ肝炎の回復期の患者の血清もしくはこのウィルスに人工的に 感染させて免疫にした動物の血清由来の精製抗体と培養して用いられるが、前記 の抗体は、例えばβ−ガラクトシダーゼのような適切な酵素によって標識がつけ られている。この反応は、オルトニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドのよ うな適切なデベロッパーまたは基質によってデベロップされる。

それ故に、この発明のＮＡＮＢ肝炎のウィルスの存在を生体外で診断する方法は 、診断を所望する患者の血清もしくは他の生物媒体を、ＮＡＮＢウィルスの蛋白 質もしくは糖蛋白質の少なくともひとつまたはウィルス溶解産物もしくはウィル スエキスと接触させて、免疫蛍光反応もしくは免疫酵素反応を間接もしくは直接 に測定できる、ＥＬＩＳＡ法、他の免疫酵素法または免疫蛍光法によって、免疫 反応を検出することからなる方法である。

これが、この発明が、酵素、蛍光物質もしくは放射性同位元素によって標識化さ れた、標識化ウィルスエキスを用いる理由である。

この発明の免疫検出法は明らかなように次の工程からなるものである。

・この発明の、特異的エキスもしくはウィルス蛋白質の適当量に、滴定用マイク ロプレートのカップのような担体内もしくはその上に付着させる。

・前記カップのような前記担体に、診断すべき血清の希釈物を導入する。

・上記マイクロプレートのような担体を培養する。

・前記マイクロプレートのような担体を適切な緩衝液で注意深く洗浄する。

・特定の標識を付けたヒト抗免疫グロブリン抗体を、前記マイクロプレートのカ ップのごとき担体内もしくはその上に導入する。なお、この標識化は、基質の放 射線の吸収が特定の波長のバンドに少なくとも修正されるように基質を加水分解 できる酵素から選択した酵素で行われる。

・危険な生物学的産物を測定し、該疾病が実際に存在することによって加水分解 された基質の量を、好ましくは対照と比較して検出する、方法である。

またこの発明は、上記定義のこの発明の診断法（抗体またはＮＡＮＢウィルスの 研究）を実施するのに直ちに利用できるキットはアウトフィツトを提供すること を目的とするものである。

このキットは次のもので構成されていることを特徴とするものである。

・この発明のウィルス因子のエキスもしくは精製フラクション。

このエキスもしくはフラクションは例えば放射性同位元素、酵素または免疫蛍光 体で標識化される。

・アガロニスビーズもしくはラテックスのような水不溶性の担体であって磁性を 有するか有しないものに固定可能なヒト抗体免疫グロブリンまたは蛋白質Ａ。

・緩衝剤および必要に応じて標識化を表示する基質。

この発明によって単離されたウィルス因子の組成物に含まれる抗原の特性決定は 、クラマート株の第１フエーズで下記の手順で行われる。

クラマート株は、散発性ＮＡＮＢ肝炎の患者の大便がら単離された。

この大便の上澄を塩化セシウムの勾配中で遠心分離し、前記のようにして精製さ れたウィルス抗原を含有するバンドをあっめ、その密度を測定し、１．３０であ ることが分かった。

上記診断試験で認められたエピトープは、この点で、前記試験で用いることがで きるこれらの抗原によって産生される。

この発明のＮＡＮＢ肝炎の検出に用いられる既製の試薬は下記のようにして製造 して使用される。

サルに、ＮＡＮＢ流行性肝炎患者の糞便を摂取させて人工的に感染させる。

用いたサルの血清は、感染させてから２７日目に前記の人工感染させたサルから 収集される。その血清を、トリス−ＮａＣ１Ｏ，１ａ緩衝液ｐ！（８のデキスト ランゲルカラムのクロマトグラフィに付して、抗ＮＡＮＢ　Ｉａｌｌである所望 の抗体を単離する。

このようにして単離されたＬｇＭを、ＰＢ３１ｍ（当り約１０〜１５μ９の蛋白 質濃度で、好ましくはＰｖｃプレートのような固体担体上において、＋４℃で１ ８〜２４ｈｒ接触させることによって、上記担体に固定する。これらのＰＹＣ板 は、ＮＡＩＩＢ抗肝炎１ｇＭで被覆され、次いで１％のＢＳＡ　（ウシ血清アル ブミン）とｏ、１％の’Ｔｗｅｅｎ　２０”含有のＰＢＳ層で被覆されているの が好ましい。この２重に被覆されたＰｖＣ板は、ＮＡＮＢ肝炎と結合したウィル ス因子の検出に有用な診断試薬として直ちに使用できる。

この発明の診断法は、前記診断用プレートを、診断すべき糞便のエキスとともに ｌｈｒ、３７℃培養することによって始めるのが好ましい。次いでこのプレート を流行性ＮＡＮＢ肝炎の回復期にある患者の血清を、ＤＥＡＥ−）リスアクリル 　カラムのクロマトグラフィで精製し、好ましくはβ−ガラクトシダーゼの酵素 で標識をつけて得たＩｇＧフラクションとともに培養（インキュベート）し、反 応は、好ましくはオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであるデ ベロッパー基質の存在下での加水分解によって行われる。

またこの発明の検出方法には、罹患中もしくは回復期の患者の血清もしくは他の 生物学的媒体中のＮＡＮＢ抗体の存在を診断する方法も含まれる。すなわち、こ の場合は、血清を、例えば遠心分離して単離して対応する密度が１．２８〜１． ３２１１７ｃｍ”のバンドを収集したこの発明のウィルス製剤またはこのウィル ス製剤のフラクションと接触させる。すなわちこのウィルス製剤またはそのフラ クションの一つを、当業者に公知のしかたでマイクロプレートの壁を被覆さ仕た ＩｇＭもしくはＩｇＧ製剤と反応させる。免疫複合体の形成（ウィルスまたは前 記のフラクション−抗ウイルスヒト抗体）は、例えば醇素でラベルされた回復期 のＩｇＧによって、それが含有している抗原のデベロップメントを妨害する。

この検出法による抗体の研究は、罹患患者または回復期の患者の血液、輸血に用 いられる製剤、およびｌ−６１７とｌ−６１６の株、これら２つの基準株と交差 免疫反応を示す菌株、特に輸血後のＮＡＮＢ肝炎の患者から単離した株であって 、その免疫特性が１−６１７株のそれと同じで、ウィルス株“Ｈ−ＳＥＴ”とし て同定され、１９８７年２月５日付で英国ＥＣＡＣＣＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎに第 ８７．ｏｚ、ｏｓＪｏｚ号として寄託された株のいずれかのＮＡＮＢ肝炎の原因 因子にさらされたヒト由来のフラクションについて実施される。

臨床データと疫学的データによって、流行性ＮＡＮＢ肝炎の患者によって示され るＮＡＮＯ肝炎の流行形態が、非経口の注射によって感染した輸血後ＮＡＮＢ肝 炎の起源であるウィルスとは異なるウィルスが原因であるということが示唆でき たが、この発明によって、発明者は、輸血後ＮＡＮＢ肝炎患者から、１９８６年 ｌＯ月３０日イ寸けでインスティティ　パスツールのＣＮＣＭに１−６１６号お よびｌ−６１７号として寄託された株と事実上同一の免疫特性を有するＮＡＮＢ ウィルスの新規のＮＡＮＢウィルス株を単離することができた。ＨＡＶとＨＢＶ のウィルスの存在に著しく敏感な試験法によって、これら２つのウィルスを病原 体として除去することができた。またサイトメガロウィルス、エプスタイン−パ ールウィルスおよび黄熱病のウィルスのようなヘバトトロピック　ウィルス（ｈ ｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ）も同様にして除去することができた。

さらにこの発明の目的は、散発性、流行性および輸血後形のＮＡＮＢ肝炎由来の 新規な精製ウィルス因子を提供することである。このウィルスは、遺伝物質とし てのその蛋白質の抗原相１　同について、ＨＡ　ＶとＨＢ　Ｖのウィルスとは区 別される。

この発明によって製造された組成物（精製ウィルス抗原、原核細胞、真核細胞、 もしくはゲノムの塩基配列から推定される合成ペプチド中へのＮＡＮＢウィルス の表現によって得られた組換え体蛋白質）は、ＮＡＮＢ肝炎の診断、または宿主 に感染防御応答の合成を適確に誘発させる予防接種を行うのに用いることができ る。

この発明は、クラマー）ＮＡＮＢウィルス（ＣＮＣＭ　ｌ−６１７）またはアイ ポリ−コーストウィルス（ＣＮＣＭ　ｌ−６１６）と等しい免疫特性を有する抗 原を含有するこの種のすべてを包含するものである。実際に、２つの蛋白質もし くは抗原は、同じ抗体によって認識できる場合はこの発明の範囲内にあり均等で あるとみなされる。それ故に対応する遺伝子配列をコードする遺伝物質の対応す る配列によって表現される産物は、前記の同様の抗原の範囲に含まれる。

またこの発明には、前記の組成物を用いて前記ＮＡＮＢウィルスを接種すること により動物から産生されうる血清が含まれる。特に、この発明には、ＮＡＮＢウ ィルスの各抗原に対して特異的に生成する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ポリクロナル抗 体が含まれる。

またこの発明は、適切な方法で得ることができて、より特異的にＮＡＮＢウィル スの抗原に対し生成するモノクロナル抗体が含まれる。

この発明によれば、ウィルス、その溶解産物またはこの溶解産物のフラツジぢン の用途は、モノクロナル抗体の製造に期待されている。前記の溶解産物もしくは そのフラクションの中で、ウィルス溶解産物もしくはそのフラクションまたはこ のウィルス由来の精製蛋白質は、ＲＩＰＡ、　ＥＬＩＳ＾または１ｅｓＬｅｒｎ 　ｂｌｏｔ　（免疫プリント法）形の通常の試験法を用いることによって、患者 の血清中の抗体の研究に用いることができる。

これらのポリクロナル抗体とモノクロナル抗体は、多くの用途に用いられ、対応 する抗原または全ウィルスの中和が挙げられる。またそれらは、生物製剤中のウ ィルス抗原を検出したり、または対応する抗原を精製するのに用いることができ る。

またこの発明には、同じ免疫特性を有するＮＡＮＢ肝炎のいずれの均等なウィル スも含まれる。この発明の発明者によってなされた研究によって、流行性、散発 性、および輸血後のＮＡＮＢ肝炎それぞれの患者の糞便のエキスから単離された 抗原物質量には免疫関係があることが分かった。

このようにしてクラマート形の株（ＣＮＣＭに１−６１７号として寄託およびＥ ＣＡＣＣＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎには８７．０２．８５．０２号として寄託）が、 輸血ＮＡＮＢ肝炎として正式に特定された急性ＮＡＮＢ肝炎症を示した患者の糞 便から単離された。この糞便は、流行性肝炎（アイボリイ　コースト）および散 発性肝炎（フランス）において、この発明によって特性決定されたこの発明の抗 原を含有していた。

ＮＡＮＢ肝炎のウィルスと結合した抗原が、この疾病が急性状態にある１５日間 にわたって認められた。他の類似の場合に、大便と、ｌ−６１６と１−６１７と 同じ免疫特性を示すウィルスからの単離物との中に同じ抗原がみとめられた。

前記特徴の外に、この発明は、下記の開示事項から明らかになる他の特性を有し ている。

この発明は、この発明の方法を実施する実施例についての下記構成によって一層 明らかになるであろう。

しかし、これらの実施例は、単にこの発明を例示するだけであってこの発明を限 定するものではない。

第１の工程において、２匹のセルコピチフス・エトブプス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈ ｅｃｕｓ　ａｅｔｈｏｐｓ）モンキイと一匹のエリスロセブス・パタス（Ｅｒｙ ｔｈｒｏｃｅｂｕｓ　ｐａＬｈａｓ）モンキイに、流行性ＮＡＮＢ肝炎に罹患し たと推定されるアイボリイ　コーストの複数の患者の病状が現れた第１日中に収 集した糞便の１０％水性エキスの混合物２ｚＱを経口接種した。この混合物は、 予め遠心分離し、次いで０．２２４ｍのミリボールフィルターで濾過して、細菌 と寄生虫を除去しておいた。上記のサルの血清試料と糞便試料を、−方では前記 糞便エキスの投与前に収集し、他方では接種後２７日目に収集した。これらのサ ルの肝機能は試験しなかった。これらの動物は明確な臨床上の病状発現を示さな かった。また−匹のサイミリモンキイにも、アフリカン・グリーン・モンキイに 用いたのと異なるアイボリイ　コーストの患者由来の糞便エキス０，５峠を同条 件下で接種した。第２のサイミリモンキイは、３力月前にＡ型肝炎ウィルスの糞 便製剤が接種され、２９日目に抗ＢＡＹ　ＩｇＭ抗体によって血清変換（５ｅｒ ｏｃｏｎｖｅｒＬ　）され、濾過糞便の同じ試料０．５１を静脈に接種した。こ の２匹のサイミリモンキイは週２回採血し、生物学的試験と、血清学的試験を行 い、また両者の糞便は毎日試験した。この２匹のサイミリモンキイは、２８日後 に特定の徴候を示すことなく死んだ。これらのモンキイは肝機能障を確信させる 生化学的証拠を何も示さなかったが、死後に実施した組織学的試験では、実質（ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）の障害はなく肝臓の充血を示していた。これら５匹のモ ンキイの血清を、セファクリルＳ　３００　（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ　３００） を用いてＮａＣＱ緩衝液０．１Ｍ　ｐ　Ｈ８で分画してＩｇＭとＩｇＧを含有す るフラクションを収集した。これらのフラクションを免疫酵素試験のレセプター 抗体として用いた。ＩｇＭが、その高い検出容量のためと、リューマチ様因子ま たは、ＮＡＮＢ抗原を刺激すると認められたリューマチ様因子と類似した因子に よる間違った陽性反応を防止するために選択された。

ＩｇＧのバックグランドのノイズはＩｇＭのそれより高く、またある種の製剤に 対して特異性が不充分であるが、実際にＩｇＧを用いることは可能である。

固相上の抗体への糞便抗原の固定を示すために回復期の患者の血清由来のＩｇＧ を、（ＮＨ４）ｔＳＯ４で沈澱させた後、ＤＥＡＥ　）リスアクリルのクロマト グラフィで分画した。ＩｇＧをＢ−ガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼと コンジュゲートさせた。

標識をつけたＩｇＧを抗原の検出に用いた。すなわち流行性ＮＡＮＢ肝炎の回復 期のアイボリイ゛　コーストの患者由来のＩｇＧ製剤、　１９８１年〜１９８２ 年のメディア（Ｍｅｄｅａ　）の流行時の治癒したアルジェリア人の患者から採 取したＩｇＧ製剤；最後に実験的に接種された足長ザルのＩｇＧである。３つの 起源のＩｇＧ製剤は同等の結果を示した。各モンキイに対して、接種前のＩｇＭ を、接種後のＩｇＭの特異性の対照として固相に用いた。非免疫的に標識をつけ たヒトＩｇＧをＡｇに標識をつける対照として用いた。接種されたモンキイの糞 便をＥＬＩＳＡ試験によってＮＡＮＢと推定されるＡｇの存在を確認した。抗原 の活性は２匹のサイミリモンキイの糞便中に検出された（第１表参照）。超音波 処理を利用することによって、検出される抗原の量を増加させることができこの 方法の感度が増大された。

Ａｇは接種してから４日後に現れ、１３日まで持続した。

第１表に、流行性ＮＡＮＢ肝炎患者由来の糞便エキスを実験的に投与したモンキ イの糞便中に検出されたＮＡＮＢ　Ａｇを示す。

検出は、ＥＬＩＳＡ法を用いて次のようにして行った。すなわち、ＮｔｌＮＣ免 疫プレートを５０μｇ／瀧ｇのＩｇＭフラクション１００μｇで被覆した。接種 してから２７日後にサンプリングし、生理的リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に、３ ７℃でｌｈｒ次いで４℃で一夜保持した。数回洗浄した後プレートを１％のウシ 血清−アルブミンと０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳ　２００μｇで被覆 した。３７℃で３時間保持し、洗浄後、０．２２ａｍの多孔度のエレメントで濾 過した糞便エキス（１／１０／Ｖ／Ｖ）　１００μｅをコーティング１ｇＭ上で 、１　ｈｒ：（７℃で次いで４℃で一夜培養した。数回洗浄後、０．１％のＮ　 ａ　Ｎ　ｓ含有のｐＨ７，６のトリスナトリウム緩衝液（ＴＮＳ）中に、Ｉ％Ｐ Ｓ＾十０．１％ツイーン２０を加えた液１ｉｆｆ当り５　ｃｃｇの濃度のペルオ キシダーゼでラベルした免疫モンキイＩｇＧ１００μＱをＡｇの検出に用いた。

３７℃で１時間培養して数回洗浄後、反応生成物を、１μ（１／Ｍ（ｌのＨ２Ｏ ，を含有のｐＨ５，６の０．５Ｍクエン酸ｌｌ衝液に入れたオルソフェニレン　 ジアミンｌＯμｇによってデベロップ（展開）した。得られた結果を、研究対象 の試料と、５つの陰性の試料の平均値との比率（Ｐ／Ｎ）で示した。陰性試料の バックグランドノイズは、　４９２ｎ■において０．０４〜０．０６のオーダー の光学密度（ＯＤ）である。Ｎ　ｇＬＮ　ｓを除けば高い値である。しかしこの 場合、反応時に用いる試薬の量はより少量でなければならない。比率Ｐ／Ｎが２ ．１であった試料は陽性とみなした。試験した糞便（１／ｌｏ重ｆｆｉ／重量） は、超音波処理を受けたものと、この処理を受けなかったものとの２種類であっ た。行った超音波処理は、遠心分離して０．２２ｕｍの多孔度のエレメントで濾 過する前の容積が２〜３ｚＱの試料に対し、ブレンソン装置（Ｂｒｅｎｓｏｎ　 ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、出力強度４で、４℃にて３分間行った。陽性の 結果には、下線をつけである。非伝染性の肝臓病の患者の糞便エキスを投与され たサイミリモンキイの糞便を対照試料として用いたが、常に陰性であった。

（以下余白） 第１表 第２工程は、仮性急性ＮＡＮＢ肝炎に罹患している患者の糞便の研究よりなり、 併せて散発型（フランスの患者）および流行型（象牙海岸の患者）を研究した。

ＮＡＮＢ肝炎は通常の免疫学的判定基準により三種の肝炎ウィルス（Ａ、Ｂ、δ ）感染型として診断された：Ａ型ウィルス感染にはＩｇＭおよび抗−ＨＡＹＩｇ Ｇの存在もしくは非存性、ＨＶＩ３感染にはＨＢｓ　Ａｇ、抗−ＨＢｃ。

抗−１１Ｂｃ　ＩｇＭ、抗−１１ｈ　；適用されるＨ　Ｖ　Ｄにはδおよび抗− δＡｇの存在もしくは非存在。さらに、象牙海岸の患者には黄熱病のしるしがみ られた。全患者について、サイトメガロウィルス感染はＩｇＭ抗体の免疫捕捉法 （ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）により、エプスタイン−パール　ウィルス感 染は免疫蛍光染色法により評価された。ＮＡＮＢと結合したＡｇは流行性および 散発性の両方の場合に検出されＬ（第２表）。他の胃腸障害のあるヨーロッパの 患者の対照エキス９０個にはＡｇは検出されなかった。多くの場合、これらの結 果はＩｇＧまたはＩｇＭの別の固相により、がっＩｇＧで別に標識されたものに より数回確認された。対照の予め免疫したＩｇＭについてテストした時、陽性の 試料には抗体は検出されなかった。従って検出されたＡｇはきっちりとＮＡＮＢ ウィルスに結合していると思われる。

下記の第２表は流行性ＮＡＮＢ肝炎（象牙海岸）と散発性ＮＡＮＢｌｆｆ−炎（ フランス）に罹患した患者の両方の糞便中のＮＡＮＢ　Ａｇ検出量を示す。胃腸 感染があると信じられている患者９０人の糞便を対照として用いた。全仮性ＮＡ ＮＢ試料と対照９０個のうちの１７個を超音波で処理した。ペルオキシダーゼま たはβ−ガラクトンダーゼで標識されたヒト抗体（Ａｃ）をＡｇ）レーサーとし て用いた。

第２表 検出されたＡｇはＮＡＮＢウィルスと実際にしっかり結合していることを確認す るため、肝細胞起源の無限増殖性細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ　５とＨＥＰＧ２、およ び正常なヒトの繊維形成性細胞ＭＲＣ５を１０％子牛の胎児の血清含有のダルベ ツコ培地中で培養した。

細胞系にはＮＡＮＢ肝炎患者の糞便エキスにより抗原を接種した。培養を集密化 し続けて、ＥＤＴＡ−トリプシンを加えた後継代培養した。時には糞便の中にあ る毒性物質が第１週の早熟細胞を死に至らしめた：その他の、細胞系に対して無 毒の糞便は数世代の継代の後に細胞を死に至らしめた。この特異的な致死効果は ＰＬＣ／ＰＲＦ　５の細胞系に単独に観察され、）ＩＥＰＧ２細胞系およびＩＩ ＲＣ５細胞にはいずれもみられない。この細胞を超音波処理に付し、０．２２μ の多孔フィルター（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）で濾過した。ＮＡＮＢ　Ａｇは感染した ＰＬＣ／ＰＲＦ　５の上澄液に検出されるが、同条件下で感染したＨＥＰＧ２細 胞系の上澄液には検出されなかった。

感染したサイミリ（ｓａｉ＊ｉｒＤサルの２０％肝臓エキスを接種されたＰＬＣ ／ＰＲＦ　５細胞は、糞便試料中に見出されるのと同様な陽性の抗原特性を示し た（第３表）：接種後の細胞毒性は観られなかった。

第３表は流行性ＮＡＮＢ肝炎に罹患した象牙海岸患者からの糞便エキスまたはサ イミリ・サル（第１号）からの肝臓エキスを接種された肝細胞系中のＮＡ）１８ 　Ａｇ検出量を示す。

肝臓エキスはｌｏｗ／ｖ％ＰＢＳ中で調製され、ウルトラトウラックス（Ｒ，Ｐ ｏｌｙｌａｂｏ社製−フランス）を用いてホモゲナイズされた。遠心分離に付し た後、残渣を４倍重量のＴＮＢ中に懸濁させ、フェニルメチルスルホニド（ＰＭ ＳＦ）クロリド０．００５ｍｙ／ｚ１の存在下で超音波処理に付した。

非感染肝炎に罹患した患者の糞便エキスを接種したサイミリ・サルの肝臓エキス を対照として用いた。

３世代観代後、接種した細胞の培養物を遠心分離した。残渣をＴＮＢ中に入れ、 ＦＭＳＦを加えて細胞を超音波処理した。

数字はＰ／Ｎ比を示す。

第３表 第４工程の目的として、ウィルスと結合している抗原は別の起源の糞便試料から 精製された。３種の抗原分布曲線は添付の第１図に示すように観察された。新鮮 な試料では抗原活性が１．２８〜１．３２９／ｃｍ’の密度帯に見出される。数 カ月間４℃に保存した数種の糞便試料、または超音波にさらしただけの新鮮な試 料は１．１２〜１．ｊ９９／ｃｍ’の密度帯に抗原活性を示した。その傳の試料 は両方の密度帯に活性を示した。

第１図は次に示すように塩化セシル（ＣｓＣ１２）グラジェントによる等密度遠 心法における抗原の分布を示す。

糞便試料（ＲＰＭＩ中ｌＯ％）３１（！をＣｓＣ１２の１．１−１．６９／ｘｉ ！グラジエントして、０．２２μ多孔質フイルターで濾過した。等密度遠心法（ ４８時間、７ＬＯＯＯ９）に付して１２＊Ｑの管（各密度１．１゜１．２．１． ３．１．４．１．５．１．６のＣ５ＣＱｈ’　１　、　２　、　３　、　２　、 ０．５．０．５ａｌｌ入り）に両分０．５ｚＱを集め、濃度を１／２に希釈した 後、ＮＡＮＢウィルス抗原の存在の確認のテストをした。

第１図において：Ａは新鮮な糞便を示し、ＢとＣは保存または超音波処理した糞 便である。保存または超音波の条件下で発生する低密度の抗原物質は物理的処理 または糞便中に含まれる酵素により分解されると考えられる。抗原に陽性のＣ５ ＣＱ画分をｌＯ〜６０ｖ／ｖ％のショ糖グラジェント中で超遠心に付し、反応性 の両分を電子顕微鏡で検査した。ＮＡＮＢ抗原は、４０〜４１．５％のショ糖グ ラジェントに、顕著には２６〜２８％のショ糖グラジェントに見出された。調製 された９試料のうち、最終的には７試料がＮＡＮＢ抗原に陽性であった：接種さ れたサイミリ・サル（第２号サルは試験しなかった）からの１試料、急性流行性 ＮＡＮＢ肝炎（象牙海岸）に罹患した３人の患者の２つのうち２試料、散発性Ｎ ＡＮＢ肝炎（フランス）に罹患した５人の患者の４試料のうちの４試料である。

さらに、球状ウィルス粒子には２つの型が観察された：二重膜構造をした直径約 ７５ｎｍの大きな粒子と、直径が約２５〜３０ｎｍのより小さな均質な粒子であ る。

直径（または幅）が１５ｎａ、長さｌμ以上の長さの管状構造が、これらの粒子 に多少付着しているのが観察され、添付した第３図に示される。ある図は大きな 球状粒子の外皮を取除いた小さな管を示し、この大きな球状粒子は４０〜４１． ５％のショ糖グラジェントで、密度１．２８〜１Ｊ２９／ｃ＋ｅ’の両分に最初 に観察される。

より小さな粒子は比重１．１２〜１．１９９７ｃｍ’のＣ５ＣＱグラジ工ント画 分及び２６〜２８％のショ糖グラジェントの両分にみられた。

より小さな、より低密度の粒子が最初のウィルスの放出した種類のものか否かは まだ確認されていない。糞便試料６個の中には抗原の存在が陰性のものは見出さ れず、対照として作用するものにも同時にテストして、この粒子によく似た構造 が見出された。

最後の工程は散発性ＮＡＮＢ肝炎に流行性ＮＡＮＢウィルスが含まれるために、 糞便中に）ＩＡＮＢ　Ａｇの検出を可能にした。ウィルスに結合したＮＡＮＢ　 Ａｇが急性散発性ＮＡＮＢ肝炎に罹患の患者の糞便試料１７個のうち７個に検出 された（第２図）。血清テストがこれらの結果を確実にした：研究に使用される ８血清のうち７種が抗−Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂ抗体を含有していた。

第２図はＮＡＮＢに感染したサル及びＮＡＮＢ肝炎患者の糞便について、電子顕 微鏡を用いてウィルス粒子の特性を示す。

上記の方法で等密度超遠心分離に付し、Ａｇ陽性の両分を混合し、ＴＮＢに対し て透析し、ショ糖グラジェント（１０〜６０重量％）のゾーン超遠心分離（７８ ，０００ｙ、５時間）に付した。陽性画分を混合し、透析し、遠心分離に付して 、電子顕微鏡下で観察した。ウィルス製剤の１滴をカーボン被覆した２００メツ シ５格子の上に拡げ、濾紙に吸収させ、２％酢酸ウラニル−蒸留水の１滴を加え た。２分後、格子を濾紙で拭き、ＳＥＭ　１００Ｃｘ１１の電子顕微鏡下で検査 した。

添付した第３図及び第４図はＮＡＮＢ肝炎に罹患している患者の糞便エキスを酢 酸ウラニルで染色して上記の方法によりＡｇの検出後ＰＬＣ／ＰＲＦ　５の電子 顕微鏡断面図を示す。

ウィルス粒子は核及び細胞質の中に「結晶格子」の形で存在する；粒子の直径は 非常に一定であるニア４〜７５ｎａｏ第３図は１６０００倍の拡大図、第４図は ５４０００倍の拡大図である。

発展途上国における流行性ＮＡＮＢ肝炎の流行を考慮して、これらの国において 、流行性ＮＡＮＢ肝炎ウィルスが散発性ＮＡＮＢ肝炎のウィルスと同一であるか 否かをチェックすることは意義深い。従って散発性急性ＮＡＮＢ肝炎に罹ったモ ロッコの患者２８人の血清を試験して、流行性ＮＡＮＢウィルスと結合した抗体 を含有するかどうかを確かめた。患者の６８％は流行性ＮＡＮＢ抗ウィルス抗体 を有していたが、この抗体は同国の血液供給者、即ち対照試料の１０％にしかみ られなかった。

下記の第４表は散発性ＮＡＮＢ肝炎患者の血清中のＮＡＮＢ抗原に関連する特異 的な抗体の検出を示す。上記の第１表に記載した条件下での反応の停止は抗体の 存在を示した。反応は、感染したサルの糞便の基準エキス５０μｇを３７℃で１ 時間培養し、試験される血清５０μｇと共に４℃で１夜放置して行われた。その 他の全反応工程はＡｇの検出と同様の方法で行われた。この基準抗原のＰ／Ｎ比 は約６〜８であった。２４人の正常人と無希釈の血清はＰＢＳに関して、基準Ａ ｇに対して反応の停止をテストした；そのいずれも反応の停止はなかった。最後 に、これら血清の混合物５０μＱはこの反応が１００％陽性であることを示すの に用いられた。テストした試料は反応の停止が５０％を超した時、陽性であると した。

ＮＡＮＢ　Ａｇが５人の急性散発性ＮＡＮＢ肝炎患者の糞便中に検出さりた；抗 体は５人の患者中４人の血清に見出された。追加の２人の患者は各々９力月、３ 力月で急性の病になり、Ａｇは再び糞便中に検出されなかった。残りの５人の患 者は過去にＮＡＮＢ肝炎に罹患し、抗体が検出されたが３年後に消えた。

第４表 血　清　源　血液供給者　研究所職員　血液透析患者　散発性ＮＡＮＢ肝炎国 モロッコ　８／７８　０／１２　１／１２　１９／２ｇフランス　０／２６　７ ／８ 第８表は血液透析患者または研究所で働き血液を取り扱う人の血液には、ＮＡＮ Ｂウィルス感染の危険が増大しているとは思えないことを表している。流行性Ｎ ＡＮＢウィルスに感染したサルから調製されたＡｇが散発性ＮＡＮＢウィルスと 結合したＡｇの検出に用いられるという事実は、Ａｇが同一のウィルスに関係し ていることを示す。

上記の多様な研究によりこの発明者はＮＡＮＢ肝炎に含まれる新規のウィルス因 子の特性を示すことができた。

このウィルス因子はまたＮＡＮＢ肝炎の流行性、散発性及び輸血後肝炎型の原因 となる因子であると思われる。

この新規のウィルス因子はＨＡＶウィルスとは異なる：１、流行性ＮＡＮＢウィ ルスによる感染はサル及び抗ＨＡＶ免疫を示す患者に観察された： ２、急性感染（抗ＨＡＹ　ＩｇＭ）に対する通常のマーカーは検出されなかった 。

３．このつ嘲・ルスは特異的な免疫反応を誘導し、抗体はＨＡＶウィルス製剤と 反応しなかった：Ａ型肝炎回復期の患者の血清は、流行性ＮＡＮＢ抗ウィルス抗 体の検出テストで陰性であった。

ＮＡＮＢウィルスはまたはＨＡＶとも異なり、その結果ＨＤＶとも異なる； １、この病気は抗−１１Ｂｓ　Ａｇ抗体を保持している数人の流行性ＮＡＮＢ患 者について診断され、さらに強力な抗−１（ＢＹ免疫を接種したヨーロッパの患 者にも見られた：２、一般にＨＢｓ　Ａｇ及びＨＢｅ　Ａｇは検出されなかった ；数人の象牙海岸患者は数種の）ＩＢＶマーカーについて陽性であり、恐らく以 前の感染によるものであるが、抗−ＨＢｅ　ＩｇＭもみられなかった； ３、１ｇＭは、流行性ＮＡＮＢウィルスに感染したサルから単離され、ＩＩＢＹ もしくは精製したＨＢｓ　Ａｇ製剤と、または活発にＨＶＢをくり返す患者の血 清とのいずれとも反応しないウィルス抗原の検出に用いられた；抗−ＨＢｓ抗体 は流行性ＮＡＮＢ抗ウィルス抗原検出テストを相殺しない。

上記のような特性を示す新しく精製されたウィルスは、広く分布した感染源から 単離されると思われる。上記の場合に加えて、ウィルスと結合している抗原はセ ネガルの患者にもみられ、抗体は流行性アルジェリアの回復期の患者にみられる 。流行性ＮＡＮＢ因子は水に浮遊するウィルスであると考えられる。それにら拘 わらＣ１散発性肝炎、特に十分な水まわり設備の気性を備えた先進国での流行性 ＮＡＮＢ因子の役割はまだ明らかではない。このことは他の感染方法、特に血液 による方法を除外しない。

さらに、散発性及び輸血後ＮＡＮＢ肝炎の場合に流行性ＮＡＮＢウィルスが包含 されることは、「流行性」の限定的使用を再検討する必要があるかも知れない。

それでもやはり、散発性及び輸血後ＮＡＮＢ肝炎の場合に流行性ＮＡＮＢウィル スが包含されることは、「流行性」の形容詞的使用を再考するべきである。

この発明によって同定されたウィルス、即ち流行性、散発性及び輸血ＮＡＮＢ肝 炎ウィルス（要するに：　ｒＨ−３ＥＴＪ　’）は輸血患者にＮＡＮＢ型肝炎が 出現する原因であるというのがこの発明者の研究の結果である。

感染性肝炎に罹患していない多数回輸血の患者と、Ａ型またはＢ型肝炎に罹患し た患者を含む比較研究は、彼等の大便には、ウィルスに結合した抗原は不在であ り、かつｒｌｌ−３ＥＴＪウイルスが増殖する条件下で培養できるウィルスが不 在であることを示した。輸血ＮＡＮＢ肝炎に罹患している患者の大便から単離さ れ九ｒｌ−ＳＥＴＪ　＋−６１７株は上記の条件下でＰＬＣ／ＰＲＤ　５細胞に 培養できた。特に多数の５ｙｎｃｉＬｉａｌ形成に相当する障害が、感染した細 胞が剥離する前に、Ｃ６−Ｃ７の所にあられれる。培養の同定法が血液試料から ウィルスの単離に用いられる。感染した培養物は感染した患者から生じる抗体分 子の表面に特性を示す未精製の抗原の源として用いることができる（ウィルス− 抗体コンプレックスは標識されたヒトの抗免疫グロブリンにより明らかにされた ）。

クリマート株は、２匹のベンガル・サル［１０％大便エキス０．５ｘＩ２を（口 から摂取させて）接種］に接種後２０〜２４日目に大便中の抗原が現れ、かつ２ ８〜３０日目にトランスアミナーゼの増殖（肝臓罹患に特宵の信号）がおこるこ とにより感染性であるとされた。

菌株寄託報告書の訳文（抄訳） 寄託機関の名称： インスティティ・パスツールの 微生物培養物国立コレクション 寄託機関の所在地： フランス、７５７２４　バリ・セデス　１５、ル・ド・ドクトール・ルー、２８ 寄託日：　１９８６年１０月３０日 寄託番号：　ｌ−６１６ 連絡国：　日本、デンマーク、オーストラリア菌株寄託報告書の訳文（抄訳） 寄託機関の名称： インスティティ・パスツールの 微生物培養物国立コレクション 寄託機関の所在地： フランス、７５７２４　パリ・セデス　１５、ル・ド・ドクトール・ルー、２８ 寄託臼：　１９８６年１０月３０日 寄託番号：　ｌ−６１７ 連絡国：　日本、デンマーク、オーストラリア菌株寄託報告書の訳文（抄訳） 寄託機関の名称： コレクション　ＥＣＡＣＣ 寄託機関の所在地： 英国、サリスバリイ、ボートン　ダウン寄託臼：　１９８７年４月１５日 寄託番号：　Ｖ８７０２０５０２ 連絡国二　日本、デンマーク、オーストラリアＥｌｌ　ＳＡジ阪ムーミる輸上ヒ ＣｓＣｌ中ノ望、刀３　ｇ／ｃｍ’（Ｉ−一→す国際調査報告 一内−−＾−−−砥ＰＣＴ／ＦＲ８７１００４４１国際調査報告　ＦＲ８７００ ４４１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１．２８〜１．３２ｇ／ｃｍ３の密度バンドの少なくとも１つ及び／又は１ ．１２〜１．１９ｇ／ｃｍ３の密度バンドの少なくとも１つを包含する抗原活性 分布曲線を有することを特徴とする、非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎由来の新規精製 ウイルス因子。 ２．流行性、散発性又は輸血後のウイルス性肝炎由来の精製ウイルス因子で構成 されることを特徴とする請求の範囲１の新規精製ウイルス因子。 ３．非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の罹患患者の糞便を、遠心分離し、０．２２ｕｍ オーダーの多孔度のフィルターを通じての濾過して単離されることを特徴とする 請求の範囲１又は２のウイルス因子。 ４．非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎患者の糞便エキス又は感染サルの肝臓エキスを接 種した肝細胞又は無限増殖性肝細胞系から調製されることを特徴とする請求の範 囲１又は２のウイルス因子。 ５．特異性抗原と結合可能で、主として、直径約７５ｎｍの粒子と直径約２５− ３０ｎｍの粒子の２つのタイプの球状ウイルス粒子の形態であり、前者は、密度 変化１．１〜１．６ｇ／ｍｌの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配による密度１ ．２８〜１．３２ｇ／ｃｍ３間のフラクション中並びに１０〜６０％（重量／容 量）間の濃度変化のショ糖濃度勾配による４０〜４１．５％のフラクション中で 優位であり、後者は、上記ＣｓＣｌ密度勾配の密度１．１２〜１．１９ｇ／ｃｍ ３間のフラクション中並びに上記ショ糖濃度勾配２６〜２８％のフラクション中 で優位であることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれかのウイルス因子。 ６．感染肝細胞で培養された患者糞便から単離されたウイルス因子から物理的又 は化学的処理によって得られることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれか に記載のウイルス因子を結合した抗原。 ７．感染無限増殖性肝細胞系から単離されたウイルス因子から超音波処理によっ て得られることを特徴とする請求の範囲６の抗原。 ８．抗原のＣｓＣｌ密度勾配の分布曲線が、密度１．１２〜１．１９ｇ／ｃｍ３ 間の１つのバンド及び／又は密度１．２８〜１．３２間の１つのバンドを有する 形態であり、抗原が、ＣｓＣｌフラクションの遠心分離後のショ糖勾配中に、前 者のバンドとしてショ糖勾配２６〜２８％のフラクション中に、後者のバンドと してショ糖勾配４０〜４１．５％のフラクション中に存在することを特徴とする 請求の範囲５又は７の抗原。 ９．非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の罹患患者の糞便を遠心分離処理に付し、次いで ０．２２うｍのオーダーの多孔度を有するフィルター要素を通じて濾過処理を行 うことにより、糞便よりウイルス因子を抽出することを特徴とする非Ａ非Ｂ型ウ イルス性肝炎由来のウイルス因子の単離方法。 １０．遠心分離処理が、有利には５０００−８０００ｇの遠心分離操作で行われ ることを特徴とする請求の範囲９の方法。 １１．遠心分離及び濾過操作にの前に、糞便エキスが、物理的分離処理、とくに 超音波による処理又は化学的分離処理に付されることを特徴とする請求の範囲９ 及び１０のいずれかに記載の方法。 １２．肝細胞又は無限増殖性肝細胞系に、非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎患者からの 糞便エキス又は予め非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎患者からの糞便エキスを接種した サル（好ましくは、サイミリモンキイ）由来の肝臓エキスを接種し、次いで培養 集密化し、数回遠心分離して所望のウイルス因子を集め、これにより継代培養が 可能となることからなる非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎由来のウイルス因子の製造方 法。 １３．さらに、流行性、散発性及び輸血後の非Ａ非Ｂ型ウイルス肝炎由来のウイ ルス因子を単離する工程を包含する請求の範囲１２の方法。 １４．遠心分離ペレットを、至適バッファー中に再態濁し、次いで超音波処理を 行って非Ａ非Ｂ型抗原を上澄みへ放出させることからなる請求の範囲１２又は１ ３の方法。 １５．非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎に罹患したと推測される哺乳動物からの糞便エ キスを、回復期保菌者又は予め非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスで感染されたサルの血清 から単離した免疫グロブリンから作った抗−非Ａ非Ｂ型抗体とインキュベートす ることにより、抗体−抗原免疫複合体を形成し、この存在を例えばＲＲＩＡ又は ＥＬＩＳＡ試験法のごとき適切な検出方法によって明らかにすることによって非 Ａ非Ｂ型抗原の存在を示すことを特徴とする、非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎患者の 糞便中の非Ａ非Ｂ型抗原の検出方法。 １６．非Ａ非Ｂ型ウイルスで罹患したと推測される患者からの糞便の遠心分離及 び濾過によって得られる糞便エキスを、予め非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスで人工的に感 染させた哺乳動物からの免疫グロブリンとインキュベートすることにより、抗原 −抗体免疫複合体を形成し、この存在を適切な検出試験、とくにＲＩＡ又はＥＬ ＩＳＡ、によって示すことからなる請求の範囲１５の検出方法。 １７．遠心分離及び濾過により得られた非Ａ非Ｂ型ウイルスで感染されたと推測 される哺乳動物の糞便エキスを、（ａ）非Ａ非Ｂ型肝炎病とわかった患者からの 糞便エキスで人工的に感染されたサル血清から単離されかつ予め固体担体に固着 されてなるＩｇＭフラクションで作られた抗−非Ａ非Ｂ型抗体とインキュベート し、次いで（ｂ）同種又は近種の哺乳動物からのＩｇＧの、蛍光、放射能又は酵 素で標識化された免疫フラクションとインキユベートすることからなる請求の範 囲１６の検出方法。 １８．免疫ＩｇＧフラクションが、ｌ−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼ で標識化され、反応が、酸性バッファー中でオルトニトロフェニル−ｌ−Ｄ−ガ ラクトピラノシド又はオルトフェニレンジアミンのような適切なデベロッピング 基質によって補われる請求の範囲１７の検出方法。 １９．患者の血液又は血液製剤中の抗体の検出に適用されることを特徴とする請 求の範囲１５〜１８のいずれか記載の検出方法。 ２０．抗体の検出が、患者又は回復期保菌者の血清と、請求の範囲１〜５のいず れかの精製ウイルス製剤もしくは遠心分離及びバンド単離後の密度１．２９〜１ ．３２に対応するフラクション（好ましくは、予めマイクロプレートの壁面に固 着されたフラクション）を接触させ、得られる抗原／抗体複合体と適当なラベル で標識化されたヒト免疫グロブリン製剤によるデベロップメントによって行われ ることを特徴とする請求の範囲１９の検出方法。 ２１．抗体の検出が、患者血清のＩｇＭを検出し、これを請求の範囲１〜５のい ずれかの精製ウイルス製剤もしくはそのフラクションと反応させ、患者のＩｇＭ に結合したＡｇの特性決定を適当なラベルで標識されたヒト抗免疫グロブリン、 免疫グロブリン類もしくはフラクションのフラグメントによって行うことにより 、患者のＩｇＭの抗体活性の特性を決定し、ごく初期の疾患の診断を可能とする 請求の範囲１９の検出方法。 ２２．散発性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎で罹患された患者の糞便から単離された 請求の範囲１〜５のいずれかの精製ウイルス因子のウイルス株であって、１９８ ６年１０月３０日にＮＯ．Ｉ−６１７として微生物培養物国立コレクションに寄 託された「クラマート株」と呼ばれるウイルス株。 ２３．流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎で罹患された患者の糞便から単離された 請求の範囲１〜５のいずれかの精製ウイルス因子のウイルス株であって、１９８ ６年１０月３０日にＮＯ．Ｉ−６１６として微生物培養物国立コレクションに寄 託された「アイポリイコースト株」と呼ばれるウイルス株。 ２４．流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の罹患患者の糞便を肝細胞上で培養した 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの培養物で構成されてなることを特徴とする「アイポリ イコースト株」と呼ばれる請求の範囲２３の精製ウイルス因子のウイルス株。 ２５．流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の罹患患者の糞便を無限増殖性肝細胞系 上で培養した非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの培養物、ことに「アレキサンダライン（ Ａｌｅｘａｎｄｅｒｌｉｎｅ）」の名称で知られたＰＬＣ／ＰＲＦ５肝細胞の無 限増殖性系上での培養物で構成されてなることを特徴とする請求の範囲２４のウ イルス因子のウイルス株。 ２６．回復期保菌者のヒト血清又は予め非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスで人工感染させ た動物の血清から単離した免疫グロブリンで構成されることを特徴とする、請求 の範囲１５の検出方法による輸血後、散発性又は流行性の非Ａ非Ｂ型ウイルス性 肝炎の検出用免疫試薬。 ２７．流行性非Ａ非Ｂ型肝炎の罹患患者の糞便エキスの摂取で人工感染した動物 の血清から作製した免疫グロブリンで形成された抗体で構成されることを特徴と する請求の範囲２６の免疫試薬。 ２８．非Ａ非Ｂウイルス又はその精製フラクションで免疫された動物の血清から 調製された抗−非Ａ非Ｂ型抗体で構成されることを特徴とする請求の範囲２６の 免疫試薬。 ２９．抗−非Ａ非Ｂ型抗体が固体担体に固着されていることを特徴とする請求の 範囲２６，２７又は２８の免疫試薬。 ３０．抗一非Ａ非Ｂ型抗体でコートされた固体担体が、これに加えて蛋白質でコ ートされてなる請求の範囲２９の免疫試薬。 ３１．流行性非Ａ非Ｂ肝炎の罹患患者の糞便エキスの摂取によって人工感染した 動物の血清を、デキストランをカラムとしｐＨ８のトリスーＮａＣｌ０．１Ｍバ ッファーを用いるクロマトグラフィに付して抗−非Ａ非ＢＩｇＭを単離すること を特徴とする血清からの抗−非Ａ非Ｂ型抗体の単離方法。 ３２．人工感染した動物の血清が糞便エキスによる感染の２７日後に採取したサ ル血清であることを特徴とする請求の範囲３１の方法。 ３３．請求の範囲３１で単離された血清が、固体支持体、ことにＰＶＣプレート に、ＰＢＳ１ｍｌ中蛋白質約１０〜１５ｕｇの濃度のＩｇＭに約＋４℃で１８〜 ２４時間接触することにより固着される請求の範囲３２の方法。 ３４．抗−非Ａ非Ｂ型抗体でコートされた固体支持体が、次いで約０．１％のＢ ＳＡと約０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳの層でコートされる請求の範囲３ ３の方法。 ３５．（ａ）血液又は血液製剤の試料を請求の範囲１〜８のいずれかのウイルス 因子で構成される試薬と接触させ、（ｂ）この血液又は血液製剤試料中の非Ａ非 Ｂ型ウイルス性肝炎の抗体の存在を検証することを特徴とする血液又は血液製剤 中の抗体の検出方法。 ３６．請求の範囲２８又は２９のＩｇＭ抗体でコートされたプレートを、（ａ） 最初に糞便エキスと約１時間約３７℃でインキュベートし、次いで（ｂ）適当な デベロッパー基質の存在下で、流行性非Ａ非Ｂ型肝炎の回復期保菌患者の血清か ら精製され酵素で標識化されたＩｇＭ又はＩｇＧのフラクションとインキュベー トすることを特徴とする、糞便エキス中の散発性、流行性又は輸血後の非Ａ非Ｂ 型ウイルス性肝炎の診断方法。 ３７．ＩｇＧのフラクションがｌ−ガラクトシダーゼで標識され、適当なデベロ ッパー基質が好ましくはオルトニトロフェニルーｌ−Ｄ−ガラクトピラノシドで 構成されることを特徴とする請求の範囲３６の診断方法。 ３８．酵素で標識されたＩｇＧのフラクションが流行性非Ａ非Ｂ型肝炎の回復期 保菌者の血清から得られたものである請求の範囲３６の診断方法。 ３９．ＩｇＧのフラクションを、流行性非Ａ非Ｂ型肝炎の回復期保菌者の血清か ら、ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラムのクロマトグラフィによる精製によって単 離し、次いでこれを適当な酵素、好ましくはｌ−ガラクトシダーゼで標識するこ とを特徴とする請求の範囲３６の方法に用いるＩｇＧの製造法。 ４０．パッファー、溶剤並びに請求の範囲１５〜１９及び３６〜３８のいずれか の診断方法を実施するのに必要な試薬の他に、固体支持体に固着された抗−非Ａ 非Ｂ型ＩｇＭで構成される少なくとも１つの診断帯試薬、酵素で標識された請求 の範囲３７のＩｇＧで構成される少なくとも１つの診断用試薬及び酵素反応デベ ロップメントに適した少なくとも１つの基質を含んでなることを特徴とする、流 行性、散発性又は輸血後の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の診断用キット又は診断用 品。 ４１．請求の範囲１〜８のいずれかのウイルス因子で標識されたエキス、ヒト抗 免疫グロブリン、適切なバッファ及びウイルス因子の標識化の指示薬を含んでな ることを特徴とする、流行性、散発性又は輸血後の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎用 の診断用キット。 ４２．主として、請求の範囲１〜８のいずれかのウイルス因子に対する精製抗体 からなることを特徴とする流行性、散発性又は輸血後の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝 炎治療用の治療剤。 ４３．主として、請求の範囲２６〜３０のいずれかのＩｇＭで構成されることを 特徴とする請求の範囲４２の治療剤。 ４４．請求の範囲１〜８のいずれかの非Ａ非Ｂ型肝炎のウイルス因子を接種され たマウスの骨髄腫細胞と脾臓細胞の融合によって得られるハイプリドーマから産 生されるモノクローナル抗体で主として構成されていることを特徴とする請求の 範囲４２の治療剤。 ４５．輸血後の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の罹患患者の糞便から単離された精製 ウイルス因子のウイルス株であって、１９８７年２月５日にＮＯ．８７．０２． ０５．０２として英国のＥＣＡＣＣコレクションに寄託された「Ｈ−Ｓｅｔ株」 と呼ばれるウイルス株。