JP2010025745A - 抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体を用いたｒｓウイルス検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具、並びに新規な抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、感度の高いＲＳＶ検出用キット、及びイムノクロマトグラフィー用試験具を提供することを目的とする。
【解決手段】受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号（ＲＳＦ２−４１２）のハイブリドーマ（２００８年６月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託）から産生されるＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体を少なくとも含むＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具により、上記の課題を解決する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus：ＲＳＶ）を高感度に検出することができる抗ＲＳＶモノクローナル抗体を用いたＲＳＶ検出用キット、及びイムノクロマトグラフィー用試験具に関する。また、本発明は、上記のＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具に用い得る、抗ＲＳＶモノクローナル抗体にも関する。

ＲＳウイルスは、乳幼児の呼吸器感染症を引き起こす主な原因ウイルスである。通常、ＲＳＶに感染した場合、風邪に似た軽微な症状を引き起こす。しかし、免疫力が低下した小児や高齢者にＲＳウイルスが感染した場合、細気管支炎を生じて呼吸困難となり、死亡する例もある。よって、このウイルスへの感染を迅速かつ簡便に検出することが望まれている。

ＲＳＶは、主に血清学的な違いに基づいて、Ａ型及びＢ型のサブタイプに分類されている。Ａ型のＲＳＶとしてはLong株、A2株などが知られている。Ｂ型のＲＳＶとしては9320株、B1 wild type株などが知られている。

ＲＳＶのエンベロープには、糖タンパク質であるＧタンパク質と、細胞融合に関連するＦタンパク質とが存在する。Ｇタンパク質は、ＲＳＶのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でアミノ酸配列の違いが大きいことが知られている。一方、Ｆタンパク質は、ＲＳＶのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でもアミノ酸配列の違いが小さいことが知られている。

ＲＳＶを認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、いくつか知られている。特表２００１−５１０３２９号（特許文献１）は、ＲＳＶのＦタンパク質と結合し、中和活性を有する改変モノクローナル抗体を開示している。特表２００５−５２２９９６号（特許文献２）は、ヒト型ＲＳＶ抗体を開示している。特表平１１−５０７６４０号（特許文献３）も、ＲＳＶのＦタンパク質と結合するヒト型モノクローナル抗体を開示している。
また、種々のクローンから得られたＲＳＶのＦタンパク質と結合する抗ＲＳＶモノクローナル抗体が、市販で入手可能である。

さらに、BD RSVエグザマン（ベクトン・ディッキンソン）、チェックＲＳＶ（アルフレッサファーマ）、BinaxNOW（栄研化学）、イムノカード（テイエフビー）、ポクテムS RSV（シスメックス）のような、抗ＲＳＶモノクローナル抗体を用いたイムノクロマトグラフィー技術に基づくＲＳＶ検出用キットも販売されている。

しかしながら、これらの従来のＲＳＶ検出用キットでＲＳＶの検出を行なった場合、感度が充分ではなく、全陽性検体の３０〜４０％を陰性として判定する場合があった。
特表２００１−５１０３２９号公報 特表２００５−５２２９９６号公報 特表平１１−５０７６４０号公報

上記の現状に鑑み、本発明は、感度の高いＲＳＶ検出用キット、及びイムノクロマトグラフィー用試験具を提供することを目的とする。
また、本発明は、感度の高いＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具の作成に用いることができる、抗ＲＳＶモノクローナル抗体を提供することも目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、ＲＳＶ抗原、特にＲＳＶのＦタンパク質を認識するモノクローナル抗体を新たに取得した。そして、得られたモノクローナル抗体をＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具に用いることにより、ＲＳＶの検出感度を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号（ＲＳＦ２−４１２）のハイブリドーマ（２００８年６月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託）（以下、このハイブリドーマをハイブリドーマ４１２という）から産生される、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体を少なくとも含むＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具を提供する。
また、本発明は、ハイブリドーマ４１２、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３２１号（ＲＳＦ１−１５６５）のハイブリドーマ（２００７年７月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）（以下、このハイブリドーマをハイブリドーマ１５６５という）、及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０２号（ＲＳＦ６−２５５）のハイブリドーマ（２００８年６月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託）（以下、このハイブリドーマをハイブリドーマ２５５という）から産生されるＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパクを認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体も提供する。

本発明のＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具を用いることにより、従来のＲＳＶ検出法に比較して、ＲＳＶの検出感度を向上することができる。よって、より正確なＲＳＶの検出を迅速にかつ容易に行うことが可能になり、より正確なＲＳＶ感染の診断を行うための指標を提供することができる。

（ハイブリドーマ及び抗ＲＳＶモノクローナル抗体）
本発明のＲＳＶ検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具に用いられる抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ４１２から産生される。この抗体を、以下、「４１２抗体」という。

本発明の抗体は、それ自体公知の方法を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。すなわち、所望により適切なアジュバントと混合したＲＳＶ抗原、好ましくはＲＳＶ Ｆタンパク質で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。通常、抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、同種の動物に由来する。
細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるＰＥＧ法などにより行うことができる。細胞融合後、ＨＡＴ培地などの選択培地でハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマのＲＳＶ Ｆタンパク質を認識する抗体を産生する能力について、常法（例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ））に従ってスクリーニングを行う。次いで、適切な抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。

本発明では、以下の実施例にも示すように、ＲＳＶ Ｆタンパク質でマウスを免疫して得られたマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合して得られたハイブリドーマ４１２を、２００８年6月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号で寄託した。

また、本発明では、上記と同様の方法に従って、さらにハイブリドーマ１５６５及びハイブリドーマ２５５を得た。ハイブリドーマ１５６５は、２００７年７月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３２１で寄託した。ハイブリドーマ２５５は、２００８年6月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号で寄託した。これらのハイブリドーマから産生される抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、以下、それぞれ１５６５抗体及び２５５抗体という。

上記のハイブリドーマ４１２、１５６５及び２５５の具体的な取得方法については、後述の実施例に示す。
上記の各ハイブリドーマから産生される４１２抗体、１５６５抗体及び２５５抗体は、ＲＳＶのＦタンパク質に結合できる。ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株のＦタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、配列番号１に示す。
後述の実施例に示されるように、これらの３種類の抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のそれぞれ異なるエピトープを認識すると考えられる。

本明細書において、「抗体」は、抗体、並びに該抗体と同等のＲＳＶ Ｆタンパク質結合特性を有する抗体フラグメント及び改変抗体も含む。該抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓＦｖフラグメントなどが挙げられる。

（ＲＳＶ検出用キット）
本発明のＲＳＶ検出用キットは、ハイブリドーマ４１２から産生される４１２抗体を少なくとも含む。
本明細書において、「ＲＳＶ検出用キット」とは、複数の構成要素を含み、これらの複数の構成要素を組み合わせて用いることによりＲＳＶの検出を行うことができる構成要素の組のことをいう。本発明のＲＳＶ検出用キットは、上記の４１２抗体を含む第１の構成要素と、他の構成要素とからなる。これらの構成要素は、抗体を含むか又は含まない溶液、抗体を含むか又は含まない固体担体、これらの組み合わせなどであり得る。

本発明のキットは、上記の４１２抗体が認識するＲＳＶのＦタンパク質のエピトープとは異なるエピトープを認識する別の抗体をさらに含むことが好ましい。該別の抗体は、１種又は複数種であり得るが、より好ましくは２種である。本発明のキットは、より好ましくは、４１２抗体と他の２種の抗体との３種類の抗体を含むことにより、ＲＳＶの検出感度を従来のＲＳＶ検出キットに比べてより向上させ得る。
上記の別の抗体が認識するエピトープが４１２抗体と同一であるか否かは、公知の方法を用いて調べることができる。公知の方法としては、競合阻害試験が挙げられる。競合阻害試験とは、目的の抗体の、任意の抗体と抗原との結合に対する競合阻害能力を調べることで、エピトープが同一であるか否かを調べる方法である。より具体的には、後述の実施例３に示す条件で行われる方法が挙げられる。上記の任意の抗体は、目的の抗体以外の抗体であれば、特に限定されない。

例えば、上記の競合阻害試験において、４１２抗体が阻害できる任意の抗体とＲＳＶ抗原との結合を、阻害できない抗体が、４１２抗体が認識するＦタンパク質のエピトープとは異なるエピトープを認識する別の抗体である。また、４１２抗体が阻害できない任意の抗体とＲＳＶ抗原との結合を、阻害できる抗体も、４１２抗体が認識するＦタンパク質のエピトープとは異なるエピトープを認識する別の抗体である。
上記の競合阻害試験において、「阻害できる」とは、上記の任意の抗体とＲＳＶ抗原との結合を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは９０％以上阻害することを意味する。
上記の競合阻害試験において、「阻害できない」とは、上記の任意の抗体とＲＳＶ抗原との結合を３０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは０％阻害することを意味する。

４１２抗体以外の、本発明のキットに含まれ得る上記の別の抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に結合しない抗ＲＳＶモノクローナル抗体が好ましい。配列番号２のアミノ酸配列は、ＲＳＶのＦタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の４２１番目のリジン残基がスレオニン残基に変異したアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質に結合しない抗ＲＳＶモノクローナル抗体としては、例えば１５６５抗体が挙げられる（実施例５参照）。
また、その他の好ましい別の抗体として、２５５抗体が挙げられる。特に、別の抗体として、１５６５抗体及び２５５抗体の両方を含むキットが好ましい。

本発明のキットは、４１２抗体を含み、抗体−抗体反応を用いて抗原を検出するイムノアッセイを行うことを可能にする構成要素を含むものであれば、特に限定されない。このような構成要素は、当業者に公知である。
イムノアッセイとしては、免疫沈降、標識イムノアッセイなどが挙げられる。標識イムノアッセイとしては、イムノクロマトグラフィー、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、化学発光イムノアッセイなどが挙げられる。

（標識抗体）
本発明のキットとしては、標識イムノアッセイを行うためキットが好ましい。このようなキットにおいては、用いられる抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、少なくとも１種が標識物質で標識されている。標識物質で標識される抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に結合しない抗ＲＳＶモノクローナル抗体が好ましく、特に、１５６５抗体が好ましい。

上記の標識物質は、通常のイムノアッセイにおいて用い得る標識物質であれば特に限定されない。例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素、不溶性粒状物質などが挙げられる。
酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。
蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。
放射性同位元素としては、¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³²Ｐなどが挙げられる。

上記の不溶性粒状物質としては、例えば寒天、アガロース、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセルロースエステル類、ゼラチン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの天然又は合成の樹脂及びその誘導体、ガラス(例えば活性化ガラス)、シリカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アルミナ、硫酸バリウムなどの無機材料からなる粒子を色素分子、蛍光分子又は磁気粒子などで標識して得られる標識粒子、金コロイドなどの金属コロイド粒子、赤血球などが挙げられる。不溶性粒状物質としては、上記の合成高分子を色素分子で標識してなる着色合成高分子粒子及び金属コロイド粒子が好ましい。

（固相に固定される抗体）
上記の標識イムノアッセイとしては、抗体の固相への結合を利用する固相化法が好ましい。
本発明のこの態様においては、用いられる抗ＲＳＶモノクローナル抗体の少なくとも１種が、固相に固定される。
固相に固定される抗体は、好ましくは、４１２抗体及び２５５抗体から選択される少なくとも１種である。より好ましくは、これらの２種の抗体が固相に固定されている。

固相化法に用いられる固相としては、マイクロタイタープレート、メンブレン、粒子などが挙げられる。
固相の材料としては、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、シリコーンポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、セルロース類（ニトロセルロース、セルロースアセテートなど）、ナイロン（例えば、カルボキシル基、アルキル基などを置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）などのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。固相は、これらの１種又は複数の材料の組み合わせからなるものであってもよい。

（試料）
本発明のＲＳＶ検出用キットで試験される試料には、ＲＳＶの感染が疑われる患者から採取された生体試料、及び該生体試料を前処理することにより得られる試料が含まれる。生体試料としては、血液、血清、糞便、尿、唾液、鼻腔吸引液、スワブ、汗、涙などが挙げられる。上記の前処理としては、生体試料を適切な前処理用試薬に溶解すること、溶解して得られた溶液をフィルターでろ過することなどが挙げられる。

（キットの構成要素）
上記の固相がマイクロタイタープレートである場合、本発明のキットは、マイクロタイタープレートと、上記の４１２抗体を少なくとも含む溶液とを含むか、又は４１２抗体が固定化されたマイクロタイタープレートを含み得る。
上記の固相がメンブレンである場合、本発明のキットは、メンブレンと、上記の４１２抗体を少なくとも含む溶液とを含むか、又は４１２抗体が担持又は固定化されたメンブレンを含み得る。
上記の固相が粒子である場合、本発明のキットは、粒子と、４１２抗体を少なくとも含む溶液とを含むか、又は４１２抗体が固定化された粒子を含み得る。

本発明のキットとしては、イムノクロマトグラフィーを行うためのキットが好ましい。すなわち、上記のキットは、４１２抗体が固定化又は担持されたイムノクロマトグラフィー用試験具を含む。
本明細書において、抗体を「担持する」とは、抗体が移動可能に保持されていることを意味する。

（イムノクロマトグラフィー用試験具）
よって、本発明は、４１２抗体が固定化又は担持されたイムノクロマトグラフィー用試験具も提供する。
上記のイムノクロマトグラフィー用試験具は、好ましくは、ＲＳＶを含む可能性がある試料を添加する試料添加部材と、抗ＲＳＶモノクローナル抗体を担持する標識保持部材と、標識保持部材に担持されている抗体とは異なる抗ＲＳＶモノクローナル抗体が固定されている判定領域を有するクロマト用膜担体とを有する。

上記のイムノクロマトグラフィー用試験具において、試料添加部材と標識保持部材とは接触していることが好ましい。
また、試料添加部材とクロマト用膜担体とは接触していることが好ましい。試料添加部材は、クロマト用膜担体の試料展開方向上流側でクロマト用膜担体と接触することが好ましい。
標識保持部材は、クロマト用膜担体の試料展開方向上流側に配置されることが好ましい。標識保持部材は、クロマト用膜担体と接触してもよいし、しなくてもよい。

本明細書において、「試料展開方向上流側」及び「試料展開方向下流側」とは、イムノクロマトグラフィー用試験具の長手方向について、試料を添加する側を上流側、試料が展開していく（流れていく）側を下流側として考えた場合の相対的な方向を意味する。

（試験具用の抗体）
上記のイムノクロマトグラフィー用試験具において、標識保持部材に担持されている抗体は、上記の標識物質で標識されているのが好ましい。該標識物質としては、色の変化を肉眼で迅速かつ簡便に観察できるので、不溶性粒状物質が好ましく、特に着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子が好ましい。

上記のイムノクロマトグラフィー用試験具において、標識物質で標識される抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に結合しない抗ＲＳＶモノクローナル抗体であることが好ましく、より好ましくは、１５６５抗体である。

上記の判定領域に固定される抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、４１２抗体及び２５５抗体から選択される少なくとも１種が好ましく、より好ましくはこれらの２種の抗体である。

（試料添加部材）
上記の試料添加部材は、コットン、グラスファイバー、多孔質ポリエチレン、多孔質ポリプロピレンなどの多孔質合成樹脂、セルロースファイバーなどの材質のものを用いることができる。試料添加部材は、これらの材料からなる織布、不織布、濾紙、シート又はフィルムであり得る。

（標識保持部材）
上記の標識保持部材は、グラスファイバー、セルロースファイバー、プラスチック(例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなど)ファイバーなどの材質のものを用いることができる。

上記の標識保持部材は、試料が適切に展開されたか否かを確認するための、対照用標識物質をさらに保持することが好ましい。対照用標識物質は、試料中の成分に対して実質的に反応性を有さないものが好ましい。該対照用標識物質は、以下に記載する対照用標識物質に結合可能な物質と対として用いることができる。すなわち、対照用標識物質、及び対照用標識物質に結合可能な物質は、２つの特異的に結合可能な物質の組み合わせであり、これらのうち、いずれを対照用標識物質として用いてもよい。このような特異的に結合可能な２つの物質の組み合わせとしては、ハプテンとそれに結合可能なタンパク質、例えばストレプトアビジン又はアビジンとビオチン、２，４−ジニトロフェノール又はジゴキシンとタンパク質（例えばアルブミン、カゼイン、フィブリノゲンなど）などが挙げられる。これらの対照用標識物質の組み合わせは、試料中に存在しないものを用いることが好ましい。

上記の対照用標識物質の標識としては、上記の標識物質と同様の標識を用いることができる。対照用標識物質は、抗体と同じ標識成分で標識されていてもよいし、異なる標識成分で標識されてもよい。

（クロマト用膜担体）
上記のクロマト用膜担体は、静電作用、疎水相互作用のような物理的作用によりタンパク質と結合できかつ毛管現象により試料を展開できる材質のものを用いることができる。該材質のものとしては、ニトロセルロース、ナイロン（例えば、カルボキシル基やアルキル基を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテートなどが挙げられる。

上記のクロマト用膜担体は、試料が適切に展開されたか否かを確認するための、対照用標識物質に結合可能な物質が固定化された対照部を有することが好ましい。
上記の対照用標識物質に結合可能な物質は、対照用標識物質について上述したとおりである。

（その他の部材）
上記のイムノクロマトグラフィー用試験具は、吸収部材をさらに備えることができる。吸収部材は、セルロース、グラスファイバー、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの多孔質プラスチックなどの材質の織布、不織布などを用いることができる。該吸収部材は、クロマト用膜担体よりも試料展開方向下流側の位置に、クロマト用膜担体と接触させて配置することが好ましい。このような位置に吸収部材を有することにより、試料の展開速度を速くすることができる。

上記のイムノクロマトグラフィー用試験具は、上記の試料添加部材、標識保持部材及びクロマト用膜担体、並びに任意に吸収部材をまとめて保持するために、基材を有することが好ましい。基材は、通常のイムノクロマトグラフィー用試験具の基材として用いられるものであれば特に限定されず、プラスチック、紙、ガラスなどの材質のものを用いることができる。該基材は、上記の各部材を配置するために、表面に粘着性を有することが好ましい。

（試験具の製造方法）
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具は、従来公知のイムノクロマトグラフィー用試験具と同様にして製造できる。すなわち、抗体、好ましくは標識された抗体を含む適切な緩衝液に標識保持部材を含浸させるか又は該緩衝液を標識保持部材に添加して乾燥させて標識保持部材を作製し、クロマト用膜担体の判定領域に適切な抗体を保持させて乾燥することにより該抗体を判定領域に固定させ、これらの部材と試料添加部材とを適切に組み立てて裁断することにより、上記のイムノクロマトグラフィー用試験具を得ることができる。

（試験具の好ましい実施形態）
図１は、本発明の１つの実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。このイムノクロマトグラフィー用試験具１は、表面に粘着層を有するプラスチック板からなる基材２上に、コットンの不織布からなる試料添加部材３と、ガラス繊維の不織布からなる標識保持部材４と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマト用膜担体５と、セルロースの不織布からなる吸収部材６とを備える。

基材２は、試料添加部材３や標識保持部材４などの上記部材を適切に配置するためのものであり、プラスチック以外にも紙、ガラスなどの材質のものを用いることができる。

試料添加部材３には試料が添加される。試料としては、ＲＳＶが含まれる可能性があるものであればよい。特に、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液又は咽頭拭い液が好ましい。試料は、緩衝液などの適当な溶媒で希釈して添加してもよい。

本実施形態では、標識保持部材４は、試料添加部材３に接触して配置され、標識物質で標識された第一の抗体（１５６５抗体）が担持されている。

本実施形態では、クロマト用膜担体５は、標識保持部材４と間隔を介して配置される。また、クロマト用膜担体５は、測定対象と抗原抗体反応する第二の抗体が固定された判定領域５Ａを有する。第二の抗体は、上記の第一の抗体とは異なる抗体であればよい。本実施形態では、第二の抗体として４１２抗体及び２５５抗体の両方を用いている。なお、４１２抗体が標識保持部材又は判定領域のいずれかに含まれていれば、本発明の抗ＲＳＶモノクローナル抗体以外に、他の抗ＲＳＶモノクローナル抗体を組み合わせて使用することもできる。

吸収部材６は、クロマト用膜担体５と接触するように配置されており、過剰試料を吸収するためのものである。吸収部材６は、液体を速やかに吸収し、保持できる材質のものであればよい。そして、試料添加部材３の一部及び吸収部材６の表面は、図１に示されるように透明シート７で覆われていてよい。

本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具１は、例えば以下のように作製することができる。
（１）クロマト用膜担体５を基材２の中程に貼着させる。
（２）クロマト用膜担体５のクロマト展開の開始点側（すなわち、図１の左側、以下「上流側」という）の末端と接触しないように間隔をあけて、標識保持部材４を基材２の上流側に貼着する。
（３）試料添加部材３の上流側部分を基材２の最上流側部分に貼着させる。
（４）試料添加部材３のクロマト展開の終了点側（すなわち、図１の右側、以下「下流側」という）部分を標識保持部材４及びクロマト用膜担体５の上流側部分の上面に置く。
（５）試料添加部材３を、標識保持部材４とクロマト用膜担体５との間にある基材２に貼着させる。
（６）クロマト用膜担体５の下流側部分の上面に吸収部材６の上流側部分を置く。
（７）吸収部材６の下流側部分を基材２の最下流側部分に貼着する。
（８）試料添加部材３の下流側部分及び吸収部材６の表面を透明シート７で覆う。

かくして、試料を必要に応じて適当な溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液とし、当該混合液に前記イムノクロマトグラフィー用試験具１の上流（試料添加部材３）側を浸すか、又は該混合液を試料添加部材に添加する。これにより、当該混合液は、試料添加部材３を通過して標識保持部材４において、標識された第一の抗体と混合される。その際、前記混合液中にＲＳＶ（抗原）が存在すれば、抗原抗体反応により標識保持部材４と第一の抗体とが結合して複合体が形成される。この複合体は、クロマト用膜担体５中をクロマト展開されて判定領域５Ａに到達し、そこに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。このとき、標識物質として青色ラテックス粒子などの着色合成高分子粒子が使用されていれば、当該粒子の集積により判定領域５Ａが青色に着色する。これにより、直ちにＲＳＶの存在を目視により確認することができる。

なお、クロマト用膜担体５は、判定領域を１つだけでなく２つ以上備えることも可能である。また、クロマト用膜担体５は、対照部を備えていてもよい。対照部を備える場合、標識保持部材４に、標識物質、例えば赤色ラテックス粒子で標識されたアビジンを保持し、クロマト用膜担体５の対照部に、アビジンと特異的に結合するビオチンを固定すればよい。

実施例
本発明を以下の実施例により、より詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されない。

ハイブリドーマの作製
（マウスの免疫）
Ｃａｐｒｉｃｏｎ社より入手した市販のＲＳＶ抗原を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μＬにフロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを混合して乳化させ、ＦＣＡ ＲＳＶ抗原溶液２００μｌを作製した。また、ＦＣＡではなくフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は上記の手順と同様にして、ＦＩＡ ＲＳＶ抗原溶液２００μＬを作製した。

ＦＣＡ ＲＳＶ抗原溶液２００μｌを７〜８週齢の雌 Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与することにより初回免疫した。初回免疫後、２〜３週間毎にＦＩＡ ＲＳＶ抗原溶液２００μＬを用いて追加免疫を行った。脾細胞分離の１０日前及び３日前に、ＲＳＶ抗原（Ｃａｐｒｉｃｏｎ社製）２００μｌを静脈投与した。最後の投与から３日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。

（ハイブリドーマの培養）
ハイブリドーマを２．５×１０⁶細胞/mlとなるようにＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０⁵細胞/ウェルとなるように分注した。培養用プレートを３７℃、８％ＣＯ₂の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。１０日間以上培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行った。

（ハイブリドーマのスクリーニング）
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ₃を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．５）に、ＲＳＶ抗原（Ｃａｐｒｉｃｏｎ社製）の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようＲＳＶ抗原を添加し、固定用ＲＳＶ抗原溶液を調製した。この固定用ＲＳＶ抗原溶液１００μｌをイムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに分注した（以下、抗原固定プレートとする）。４℃で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、緩衝液Ａとする）で３回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、緩衝液Ｂとする）３００μｌを添加して、２〜８℃で４時間以上静置保存した。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。

抗原固定プレート中の緩衝液Ｂを除去した。除去後、緩衝液Ｂを抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、上述のハイブリドーマの培養における培養上清を、培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加した。緩衝液Ｂ及び培養上清添加後、室温で一時間攪拌した。攪拌後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、緩衝液Ｂで１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を抗原固定プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。

得られた３つのハイブリドーマを、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３２１号（ＲＳＦ１−１５６５）、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号（ＲＳＦ２−４１２）、及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０２号（ＲＳＦ６−２５５）として寄託した。

抗ＲＳＶ−Ｆタンパク質モノクローナル抗体の反応性の確認
（１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体の反応性の確認）
ＲＳＶ−Ｆ抗原として、Ｌｏｎｇ株（１０[６．７]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）、Ａ２株（１０[５．５]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）、９３２０株（１０[５．５]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）及びB1 wild-type（ＢＷＶ）株（１０[４．５]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）のＲＳＶを使用した。このＲＳＶ４株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より購入可能である。上述のＲＳＶを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（以下、第１緩衝液と呼称する）で１／１０に希釈した。

希釈した各抗原液と、検体抽出液（１００ｍＭ クエン酸−０．４Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ジチオスレイトール、０．１（ｖ／ｖ）％ ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を等量ずつ混合し、抽出処理を５分間行なうことで、各抗原抽出液を調製した。

市販の抗マウス抗体ＩｇＧと、セファロースビーズ（Amersham Biosciences社製）とが結合した粒子を１５ｖ／ｖ％の濃度で含有するセファロースビーズ溶液を調製した。
セファロースビーズ溶液、上述の各抗原抽出液、及び第１緩衝液を混合し、各抗原試料を調製した。各抗原試料における、セファローズビーズ溶液と各抗原抽出液の混合量の例を表１に示す。

抗原試料を、９６穴Ｖ字プレート（サンプラテック社製）の各ウェルに６０μＬ／ウェルとなるように加えた。次に、１５６５抗体、４１２抗体、２５５抗体のそれぞれを、第１緩衝液で１μｇ/ｍｌになるように希釈し、１５６５抗体液、４１２抗体液及び２５５抗体液を調製した。調製した各抗体液のそれぞれを、別々に各ウェルに３０μＬ／ウェルとなるように加えた。その後、９６穴Ｖ字プレートを室温で６０分間撹拌した。撹拌後、９６穴Ｖ字プレートを１０分間静置した。

０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈した１３３−１Ｈ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製；ＲＳＶに対する抗体）の溶液を、イムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに１００μＬずつ分注した。Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（以下、第２緩衝液と呼称する）を用いて各ウェルを３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに第１緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングした（以下、このイムノモジュールを１３３−１Ｈ抗体感作プレートと呼称する）。

１３３−１Ｈ抗体感作プレート中の第１緩衝液を除去した。除去後、上述の１０分間静置した９６穴Ｖ字プレートの各ウェルの上清 ５０μｌを、１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに添加した。次に、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを、室温で３０分間撹拌した後、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを、第２緩衝液で３回洗浄した。

洗浄後の１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、ビオチン標識したＢ０１６抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製；終濃度２μｇ／ｍｌ）及びストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ；終濃度５０ｍＵ／ｍｌ）を含む第１緩衝液を１００μｌ添加した。次に、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを、室温で６０分間撹拌した。その後、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを、第２緩衝液で３回洗浄した。

１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した（吸光度Ａ）。

対照実験として、抗体液を、第１緩衝液に換えた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した（吸光度Ｂ）。また、対照実験として、抗体液と抗原試料を、第１緩衝液に換えた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した（吸光度Ｃ）。

得られた吸光度Ａ〜Ｃを用いて、下記式（１）により、各ハイブリドーマ由来の抗ＲＳＶ−Ｆタンパクモノクローナル抗体を用いた測定試料の吸収率を求めた。
吸収率（％）＝[１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）]×１００ （１）
各抗ＲＳＶ−Ｆタンパクモノクローナル抗体の反応性の評価結果を表２に示す。表２において、「＋＋＋」は式（１）で求めた吸収率が９０％以上、「＋＋」は５０％以上、「＋」は３０％以上、及び「−」は３０％未満を示す。

表２の結果から明らかなように、１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体は、Ｌｏｎｇ株、Ａ２株、９３２０株及びＢＷＶ株のいずれの抗原に対しても、反応性を示すことが分かった。

抗ＲＳＶ−Ｆタンパクモノクローナル抗体の抗原認識部位の確認
（Ｂ０１６抗体に対する阻害試験）
Ａ２株（１０[５．５]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）を、第１緩衝液で１／１０に希釈した。希釈した抗原液と検体抽出液を等量ずつ混合し、抽出処理を５分間行なうことで、Ａ２株抗原抽出液を調製した。次に、Ａ２株抗原抽出液を、第１緩衝液で１／２０に希釈し、抗原試料を調製した。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した１３３−１Ｈ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）の溶液を、イムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに１００μＬずつ分注した。第２緩衝液を用いて各ウェルを３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに第１緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングした（以下、このイムノモジュールを１３３−１Ｈ抗体感作プレートと呼称する）。

１３３−１Ｈ抗体感作プレート中の第１緩衝液を除去した。除去後、１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、抗原試料１００μＬを加えたのち、３０分間攪拌した。その後、抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。

１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体のそれぞれを、第１緩衝液で１０μｇ／ｍｌになるように希釈し、１５６５抗体液、４１２抗体液及び２５５抗体液を調製した。調製した各抗体液を、１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、それぞれ５０μｌ加えた。次に、１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、ビオチン標識されたＢ０１６抗体（ＵＫ−Ｓｅｒｏｔｅｃ社製；終濃度２μｇ／ｍｌ；ＲＳＶに対する抗体）とストレプトアビジン標識化ＰＯＤ（終濃度４０ｍＵ／ｍｌ）を含む第１緩衝液を５０μＬ加えたのち、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを室温で６０分間攪拌した後、１３３−１Ｈ抗体感作プレートを第２緩衝液で３回洗浄した。

１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに、ＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した（吸光度Ａ）。

対照実験として、抗体液を、第１緩衝液に換えた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した（吸光度Ｂ）。また、対照実験として、抗体液と抗原試料を、第１緩衝液に換えた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した（吸光度Ｃ）。

得られた吸光度Ａ〜Ｃを用いて、下記式（２）により、各ハイブリドーマ由来の抗ＲＳＶ−Ｆタンパク質モノクローナル抗体を用いた測定試料の阻害率を求めた。

阻害率（％）＝[１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）]×１００ （２）

（１３３−１Ｈ抗体に対する阻害試験）
１３３−１Ｈ抗体感作プレートに代えて、Ｂ０１６抗体をイムノモジュールの各ウェルに感作したＢ０１６抗体感作プレート、及びビオチン標識されたＢ０１６抗体に代えて、ビオチン標識された１３３−１Ｈ抗体を用いたこと以外は、上述のＢ０１６抗体に対する阻害試験と同様の実験を行なった。

各抗ＲＳＶ−Ｆタンパクモノクローナル抗体の、１３３−１Ｈ抗体及びＢ０１６抗体に対する阻害結果を表３に示す。表３において、「＋＋＋」は式（１）で求めた阻害率が９０％以上、「＋＋」は５０％以上、「＋」は３０％以上、及び「−」は３０％未満を示す。

表３の結果から、４１２抗体は、１３３−１Ｈ抗体及びＢ０１６抗体とは異なる抗原認識部位を有することが明らかとなった。

ＲＳＶ−Ｆタンパク質モノクローナル抗体の組合せによるＲＳＶ抗体検出試験
Ｌｏｎｇ株（１０[６．７]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）を、第１緩衝液で１／１０に希釈した。希釈した各抗原液と、検体抽出液を等量ずつ混合し、抽出処理を５分間行なうことで、Ｌｏｎｇ株抗原抽出液を調製した。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体のそれぞれを、イムノモジュールの各ウェルに各ウェルに１００μＬずつ分注した。第２緩衝液を用いて各ウェルを３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに第１緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングし、１５６５抗体感作プレート、４１２抗体感作プレート及び２５５抗体感作プレートを作製した。

作製した各抗体感作プレート中の第１緩衝液を除去した。除去後、各抗体感作プレートの各ウェルに、Ｌｏｎｇ株抗原抽出液を５０μｌ／ウェルとなるように加えた。各抗体感作プレートを室温で３０分間撹拌した後、第２緩衝液で３回洗浄した。

１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体のそれぞれを、公知の方法に従ってビオチン標識することで、ビオチン標識ＲＳＦ１−１５６５抗体、ビオチン標識ＲＳＦ２−４１２抗体及びビオチン標識ＲＳＦ６−２５５抗体を調製した。

調製した各ビオチン標識抗体（終濃度２μｇ／ｍｌ）とストレプトアビジン標識化ＰＯＤ（終濃度４０ｍＵ／ｍｌ）を含む第１緩衝液を、各抗体感作プレートに１００μｌ／ウェルとなるように加えた。各抗体感作プレートを室温で、６０分間撹拌した後、第２緩衝液で３回洗浄した。
各抗体感作プレートの各ウェルに、ＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を１３３−１Ｈ抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を表４に示す。

表４の結果から、１５６５抗体、４１２抗体及び２５５抗体は、固相側及び標識側の抗体として同一の抗体を使用しない限り、それぞれの組合せによって、ＲＳＶ抗原をサンドイッチイムノアッセイ法により検出できることが明らかとなった。

１５６５抗体のエピトープ解析
（１５６５抗体エスケープミュータントの作製）
ＲＳＶ感染用細胞Ｈｅｐ２を、１０％子牛胎児血清を添加したＥａｇｌｅ ＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）で２４穴プレート（コーニング社製）中にて培養した。Ｈｅｐ２細胞がコンフルエントになったところで、培養液を、１％子牛胎児血清を添加したＥａｇｌｅ ＭＥＭに替え、Ｌｏｎｇ株（１０[６．７]ＴＣＩＤ（５０）/ｍｌ）をＭＯＩ＝０．０００５で感染させた。感染後、1時間３７℃、５％ＣＯ₂にてインキュベートした。１時間インキュベート後、１５６５抗体を２０μｇ/ウェルで添加した。抗体添加後、３７℃、５％ＣＯ₂にて３〜４日間培養した。

別に１０％子牛胎児血清を添加したＥａｇｌｅ ＭＥＭにて培養していたＨｅｐ２細胞の培養液を除き、３〜４日間培養した上記の細胞培養上清の１/２量を添加した。さらに、細胞培養上清と同量の１％子牛胎児血清含有Ｅａｇｌｅ ＭＥＭを添加した。添加後、1時間３７℃、５％ＣＯ₂にてインキュベートした。１時間インキュベート後、１５６５抗体を２０μｇ/ウェルで添加した。抗体添加後、３７℃、５％ＣＯ₂にて３〜４日間培養した。この操作をさらに５回行った。

計７回の１５６５抗体存在下でのＲＳＶ感染継代培養後、Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅｃｔが観察された。細胞変性効果が観察されたことにより、１５６５抗体エスケープミュータントの出現が確認できたので、この細胞培養液全量を回収し、凍結保存した。

（１５６５抗体エスケープミュータントのＲＳＶ−Ｆタンパク質遺伝子配列解析及びアミノ酸配列解析）
１５６５抗体エスケープミュータントの培養上清液及びＬｏｎｇ株から、ReverTra Ace-α-（ＴＯＹＯＢＯ社製 Product Code FSK-101）及びプライマー[配列：ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣ（配列番号３）]を用いて、ｃＤＮＡを合成した。

合成した各ｃＤＮＡから、PrimeStar（ＴＡＫＡＲＡ社製 Product Code R010A）及びプライマー[配列：ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣ（配列番号４）、ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号５）]を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９５℃２分間反応後、９５℃３０秒、５５℃２０秒、７２℃１００秒の反応サイクルを３５サイクルで行った。反応終了後、ＰＣＲ産物を凍結保存した。

ＰＣＲ産物から、MinElute PCR Purification Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプライマーを除去した。プライマー除去したＰＣＲ産物から、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びプライマー[配列：ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣ（配列番号４）、ＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧ（配列番号６）、ＴＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴ（配列番号７）、ＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＴＧ（配列番号８）]を用いて、サイクルシークエンシング反応を行った。反応後、標識ヌクレオチドを除去し、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び配列解析ソフト（日立ソフト社製）を用いて、遺伝子配列解析及び予測アミノ酸配列解析を行った。

１５６５抗体エスケープミュータントのＲＳＶ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、Ｌｏｎｇ株のＲＳＶ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１及び配列番号２から明らかなように、ＲＳＦ１−１５６５抗体エスケープミュータントのＲＳＶ−Ｆタンパク質は、４２１番目のリジン（Ｋ）が、スレオニン（Ｔ）に変化していることが明らかとなった。

（１５６５抗体エスケープミュータントへの反応性解析）
１５６５抗体エスケープミュータントの培養上清液及びＬｏｎｇ株を、第１緩衝液で１／１０に希釈した。希釈した各抗原液と検体抽出液を等量ずつ混合し、抽出処理を５分間行なうことで、各抗原抽出液を調製した。次に、各抗原抽出液を、第１緩衝液で１／５に希釈し、抗原試料を調製した。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＢ０１６抗体（ＵＫ−Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）の溶液を、イムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに１００μＬずつ分注した。Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（以下、第２緩衝液と呼称する）を用いて各ウェルを３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに第１緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングした（以下、このイムノモジュールをＢ０１６抗体感作プレートと呼称する）。

Ｂ０１６抗体感作プレート中の第１緩衝液を除去した。除去後、Ｂ０１６抗体感作プレートの各ウェルに、抗原試料１００μＬを加えたのち、３０分間攪拌した。その後、Ｂ０１６抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。

１５６５抗体を、公知の方法に従ってビオチン標識することで、ビオチン標識ＲＳＦ１−１５６５抗体を調製した。
調製した１５６５ビオチン標識抗体（終濃度２μｇ／ｍｌ）とストレプトアビジン標識化ＰＯＤ（終濃度４０ｍＵ／ｍｌ）を含む第１緩衝液をＢ０１６抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬ加えたのち、Ｂ０１６抗体感作プレートを室温で６０分間攪拌した。その後、Ｂ０１６抗体感作プレートを第２緩衝液で３回洗浄した。

Ｂ０１６抗体感作プレートの各ウェルに、ＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を含む反応停止液をＢ０１６抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の測定結果を、表５に示す。

表５から、１５６５抗体は、１５６５抗体エスケープミュータントのＲＳＶ−Ｆタンパク質を認識しないことが明らかとなった。

ＲＳＶを検出するためのイムノクロマトグラフィー用試験具の作製
（本発明の試験具の作製）
標識物質で標識される第一の抗体として１５６５抗体を使用し、クロマト用膜担体に固定される第二の抗体として４１２抗体及び２５５抗体を使用して、以下の方法に従って、図１に示すようなイムノクロマトグラフ用試験具１（以下、試験具という）を作製した。

まず、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、４１２抗体及び２５５抗体の終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬになるように希釈した、４１２抗体・２５５抗体混合液を調製した。次に、図１に示される、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体の判定領域５Ａに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて、４１２抗体・２５５抗体混合液を1mm幅で塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。
乾燥後のクロマト用膜担体５をブロッキング液（ＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸漬し、ブロッキングを行った。その後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃で１２０分間乾燥させ、クロマト用膜担体５を得た。

次に、１５６５抗体を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作させ、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁することで、１５６５抗体感作ラテックス粒子を作製した。感作する際の抗体の濃度は、１％ラテックス粒子１ｍＬに対して２００μｇ ＩｇＧとなる濃度であった。この１５６５抗体感作ラテックス粒子を、ガラス繊維製パッドに添加後、真空乾燥機で乾燥させ、標識保持部材４を得た。
上記のクロマト用膜担体５及び標識保持部材４を用いて、本発明の試験具を得た。

（コントロールの試験具の作製）
第一の抗体としてB016抗体を使用し、第二の抗体として133-1H抗体を使用したこと、及び４１２抗体・２５５抗体混合液に代えて、終濃度が２．０ｍｇ／ｍＬになるように希釈したB016抗体液を使用したこと以外は、上記の本発明の試験具の作製と同様の手法で、コントロールの試験具を作製した。

本発明の試験具と、従来の試験具とのＲＳＶへの反応性の確認
（本発明の試験具によるＲＳＶの検出）
実施例６で作製した本発明の試験具を用い、ＲＳＶに対する反応性を以下の手順で確認した。
（１） 表６に示す３種類のＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株、ＢＷＶ株及び９３２０株）をVero細胞にて培養し、得られたウイルスを、表６に示す希釈倍率で生理食塩水により希釈してウイルス液を調製した。
（２） 検体抽出試薬（０．３ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．３）８００μＬに、（１）で調製した所定の希釈倍率のウイルス液１５０μＬを加えて混合し、測定用試料を調製した。
（３） 上記（２）で調製した測定用試料約２００μＬをガラス試験管に滴下し、そこに本発明の試験具の上流（試料添加部材３）側を浸漬して放置し、約１０分後に判定領域５Ａにおける呈色を肉眼で判定した。判定は、呈色が認められたものを（＋）、呈色が認められなかったものを（−）として評価した。これらの結果を表６に示す。

（従来の試験具によるＲＳＶの検出）
従来の試験具として、コントロールの試験具、並びに市販の試験具としてチェックＲＳＶ（アルフレッサファーマ社製）及びBD RSV エグザマン（ベクトン・ディッキンソン社製）を用い、ＲＳＶに対する反応性を確認した。

コントロールの試験具は、上述の本発明の試験具と同様の操作で、ＲＳＶに対する反応性を確認した。また、市販の試験具は、上述のウイルス液を用いて、各市販の試験具の添付資料に記載された操作に従ってＲＳＶに対する反応性を確認した。反応性の確認結果を表６に示す。

表６から明らかなように、本発明の試験具は、従来の試験具よりも、ＲＳＶに対して高い反応性を示した。

本発明のイムノクロマトグラフィー用試験具のある実施形態を示す図である。

符号の説明

１ イムノクロマトグラフィー用試験具
２ 基材
３ 試料添加部材
４ 標識保持部材
５ クロマト用膜担体
５Ａ 判定領域
６ 吸収部材
７ 透明シール

Claims (14)

1. 受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０１号（ＲＳＦ２−４１２）のハイブリドーマ（２００８年６月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託）（以下、「ハイブリドーマ４１２」という）から産生されるＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体を含む、ＲＳＶ検出用キット。
2. 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３２１号（ＲＳＦ１−１５６５）のハイブリドーマ（２００７年７月１９日に独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−６０２号（ＲＳＦ６−２５５）のハイブリドーマ（２００８年６月２６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託）（以下、それぞれ「ハイブリドーマ１５６５」及び「ハイブリドーマ２５５」という）から産生されるＲＳＶ Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体の少なくとも１種をさらに含む請求項１に記載のキット。
3. キットに用いられる前記抗ＲＳＶモノクローナル抗体の少なくとも１種が、標識物質で標識されている請求項１又は２に記載のキット。
4. 標識物質で標識される抗ＲＳＶモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ１５６５から産生される抗ＲＳＶモノクローナル抗体である、請求項３に記載のキット。
5. 抗ＲＳＶモノクローナル抗体の少なくとも１種が、固相に固定されている請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
6. 固相に固定される抗ＲＳＶモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ４１２及びハイブリドーマ２５５から産生される抗ＲＳＶモノクローナル抗体から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載のキット。
7. ハイブリドーマ４１２から産生されるＲＳＶ Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体を少なくとも含む、ＲＳＶ検出用のイムノクロマトグラフィー用試験具。
8. ハイブリドーマ１５６５及びハイブリドーマ２５５から産生されるＲＳＶ Ｆタンパク質を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体の少なくとも１種をさらに含む請求項７に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
9. ＲＳＶを含む可能性がある試料を添加する試料添加部材と、
   抗ＲＳＶモノクローナル抗体を担持する標識保持部材と、
   標識保持部材に担持されている抗体とは異なる抗ＲＳＶモノクローナル抗体が固定されている判定領域を有するクロマト用膜担体と
   を有し、標識保持部材に担持されている抗体が標識物質で標識されている、請求項７又は８に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
10. 標識物質で標識される抗体が、ハイブリドーマ１５６５から産生される抗ＲＳＶモノクローナル抗体である、請求項９に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
11. 標識物質が、不溶性粒状物質である請求項９又は１０に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
12. 不溶性粒状物質が、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である請求項１１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
13. 判定領域に固定される抗ＲＳＶモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ４１２及びハイブリドーマ２５５から産生される抗ＲＳＶモノクローナル抗体から選択される少なくとも１種である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
14. ハイブリドーマ４１２、ハイブリドーマ１５６５、及びハイブリドーマ２５５から産生される、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパクを認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体。

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