JP7274904B2 - ヒトメタニューモウイルス検出用試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトメタニューモウイルスの検出用試薬、ヒトメタニューモウイルスの免疫学的測定方法、並びに、ヒトメタニューモウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置及び免疫クロマト分析キットに関する。

ヒトメタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、以下単にｈＭＰＶと称すこともある）は、パラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科メタニューモウイルス属に属するＲＮＡウイルスである。

ｈＭＰＶは、小児を中心とした急性呼吸器感染症の原因ウイルスの１つであると考えられている。臨床症状はＲＳウイルス感染症に類似しており、上気道炎、気管支炎および肺炎などの下気道炎を引き起こす。

従来、ｈＭＰＶのウイルス分離は比較的困難であると考えられてきており、ｈＭＰＶの検出には遺伝子検査法が広く用いられてきた（例えば、非特許文献１）。

近年、より簡易かつ迅速にｈＭＰＶの検出を可能とすべく、イムノクロマトグラフィー法を用いた診断キットも開発されている。当該診断キットでは、ウイルス粒子表面にあってかつ変異の頻度の少ないｈＭＰＶのＮ蛋白（Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ：核蛋白）またはＦ蛋白（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ：融合蛋白）に対する抗体を使用し、ｈＭＰＶの検出を行うものである（非特許文献２）。

"Ａ ｎｅｗｌｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅ"ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００１ Ｊｕｎ；７（６）：７１９－２４． モダンメディア ６０巻５号２０１４，新しい検査法 迅速ヒトメタニューモウイルス診断キット－保険適用されたイムノクロマト法によるｈＭＰＶ抗原定性－

本発明者の検討によれば、ｈＭＰＶのＮ蛋白やＦ蛋白に対する抗体を用いた上記診断キットでは、ｈＭＰＶ感染者から採取した実検体中に対する感度は十分ではなく、ｈＭＰＶの検査方法としては、いまだ改良の余地があった。

そこで本発明者は、検体試料として実検体を用いた場合であっても、ｈＭＰＶを感度良く検出可能な検出用試薬を提供すべく、ｈＭＰＶのＮ蛋白やＦ蛋白質に代わる新たな標的対象の検討を行った。本発明者は鋭意研究を重ねた結果、新たな標的対象としてｈＭＰＶのマトリックスプロテインに注目した。そして、同タンパク質を認識する抗体を用いることにより、ｈＭＰＶを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は以下の通りである。
１．ヒトメタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）のマトリックスプロテインを認識する抗体を含有することを特徴とする、ヒトメタニューモウイルス検出用試薬。
２．前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する、前記１に記載のヒトメタニューモウイルス検出用試薬。
３．検体中のヒトメタニューモウイルスを、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体により検出する、ヒトメタニューモウイルスの免疫学的測定方法。
４．前記免疫学的測定方法は、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフィー法である前記３に記載の免疫学的測定方法。
５．前記免疫学的測定方法がイムノクロマトグラフィー法であって、前記イムノクロマトグラフィー法は、
ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と検体中のヒトメタニューモウイルスとを接触させることにより、前記標識抗体と前記ヒトメタニューモウイルスとの複合体を形成させる工程と、
前記複合体中のヒトメタニューモウイルスを、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体により検出する工程と、
を含む、前記４に記載の免疫学的測定方法。
６．前記標識抗体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する、前記５に記載の免疫学的測定方法。
７．前記検出用抗体が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインの立体構造を認識する、前記５または６に記載の免疫学的測定方法。
８．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、ヒトメタニューモウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部および前記検出部が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体を含有する、
免疫クロマト分析装置。
９．前記標識物質保持部が含有する抗体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する、前記８に記載の免疫クロマト分析装置。
１０．前記検出部が含有する抗体が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインの立体構造を認識する、前記８または９に記載の免疫クロマト分析装置。
１１．前記８～１０のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。

本発明の一実施態様によれば、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体を用いることによって、ヒトメタニューモウイルスを高感度に検出可能である。また、本発明の一実施態様によれば、ヒトメタニューモウイルスを迅速かつ簡易に検出できる。さらに、本発明の一実施態様によれば、ＲＳＶ等のｈＭＰＶと相同性の高いウイルスに対して交叉反応を起こさず、ｈＭＰＶを特異的に検出できる。

図１は、本発明の一実施形態の免疫クロマト分析装置の構造を説明するための断面図である。 図２は、実施例で作製した抗体が認識するｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列を調べるため実施したＥＬＩＳＡ試験の結果（吸光度）を示すグラフである。 図３は、実施例で作製した抗体が認識するｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列を調べるため実施したＥＬＩＳＡ試験の結果（Ｓ／Ｎ比）を示すグラフである。 図４(ａ)、（ｂ）は、実施例で作製した抗体がｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造を認識するかを調べるため実施したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法の結果を示す写真図である。図中の矢印は全長のｈＭＰＶマトリックスプロテインに相当する約３６ｋＤａのバンドを示す。 図５は、実施例１の免疫クロマト分析キットを用いた検出感度評価の結果を示すグラフである。 図６は、実施例２の免疫クロマト分析キットを用いた検出感度評価の結果を示すグラフである。 図７は、実施例１の免疫クロマト分析キットを用いた交叉反応性評価の結果を示すグラフである。

以下に、本発明を実施するための形態を説明する。

本明細書において、本発明における抗体がｈＭＰＶのマトリックスプロテインを「認識する」とは、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインと実質的に抗原抗体反応することを意味する。また、本発明における抗体がｈＭＰＶのマトリックスプロテインの特定のアミノ酸配列を「認識する」とは、当該アミノ酸配列の全体又はその一部と実質的に抗原抗体反応することを示す。

本発明における抗体が、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインや、その特定のアミノ酸配列の全体又はその一部と実質的に抗原抗体反応するかは、周知の免疫測定方法により確認できる。免疫測定方法としては、免疫測定方式で分類すれば、例えば、サンドイッチ法、競合法、凝集法などが挙げられる。また、用いる標識で分類すれば、例えば、蛍光法、酵素法、放射法などが挙げられる。これらのいずれの免疫測定方法によっても抗原抗体反応の確認を行うことができる。

ここで「実質的に抗原抗体反応する」とは、上記の免疫測定方法で検出可能なレベルで抗原抗体反応するものを意味するが、たとえ検出可能なレベルで反応をしていてもその反応の程度が明らかに弱く、特異的な反応でないものは除くことを意味する。

本発明における抗体は、後述する参考例１に記載のＥＬＩＳＡ試験により吸光度を測定し、ブランク値を減じた吸光度が０．１Ａｂｓ以上であることが好ましく、０．１５Ａｂｓ以上であることがより好ましく、０．２Ａｂｓ以上であることがさらに好ましい。
また、本発明における抗体は、該抗体が認識する対象のタンパク質、またはアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用いたＥＬＩＳＡ試験により吸光度を測定し、該吸光度からブランクの吸光度を除して得られるＳ／Ｎ比が１．４以上であることが好ましく、１．５以上であることがより好ましく、１．６以上であることがさらに好ましい。

本発明に適用できる検体は、ヒトメタニューモウイルスを含む可能性のあるものであれば特に制限されない。検体としては、例えば、ヒトメタニューモウイルス感染者の実検体である、血液、血漿、血清のような血液試料、尿、唾液、髄液、汗、涙、羊水、乳頭分泌液、鼻汁、痰、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、鼻汁鼻かみ液、咽頭拭い液、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び糞便からの抽出物等が挙げられる。なかでも、迅速診断や検出感度向上の観点から鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、鼻汁鼻かみ液、及び咽頭拭い液が好ましい。

［検出用試薬］
本発明の、ヒトメタニューモウイルス検出用試薬は、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を含有することを特徴としている。

ｈＭＰＶのマトリックスプロテインは、下記配列番号１で示される２５４個のアミノ酸からなる。
（配列番号１）
MESYLVDTYQGIPYTAAVQVDLVEKDLLPASLTIWFPLFQANTPPAVLLDQLKTLTITTLYAASQNGPILKVNASAQGAAMSVLPKKFEVNATVALDEYSKLDFDKLTVCEVKTVYLTTMKPYGMVSKFVSSAKSVGKKTHDLIALCDFMDLEKNIPVTIPAFIKSVSIKESESATVEAAISSEADQALTQAKIAPYAGLIMIMTMNNPKGIFKKLGAGTQVIVELGAYVQAESISKICKTWSHQGTRYVLKSR

本発明における抗体が認識するｈＭＰＶのマトリックスプロテインは、ウイルスから分離された天然のタンパク質でもよく、公知となっているマトリックスプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて作製された組換えタンパク質でもよい。また、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインは、ウイルスの構成成分から分離・精製されたものでも未精製のものでもよいが、分離されていない場合はマトリックスプロテインと抗体との接触が容易となるように界面活性剤で処理されたウイルスに由来するマトリックスプロテインであってもよい。

本発明においては、ｈＭＰＶが有する種々のタンパク質の中でも、特にマトリックスプロテインを認識する抗体を用いることによって、実検体であっても高感度にｈＭＰＶを検出することができるものである。

本発明の検出用試薬は、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのうち、アミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体を含有することが、検出感度をより向上させることができるという観点から、好ましい。
上記アミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体は、後述する参考例１に記載のＥＬＩＳＡ試験において、ペプチド５を抗原と用いて測定した吸光度からブランク値を減じた吸光度が０．１Ａｂｓ以上であることが好ましく、０．１５Ａｂｓ以上であることがより好ましく、０．２Ａｂｓ以上であることがさらに好ましい。
また、上記アミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体は、ペプチド５を抗原として用いたＥＬＩＳＡ試験により吸光度を測定し、該吸光度からブランクの吸光度を除して得られるＳ／Ｎ比が１．４以上であることが好ましく、１．５以上であることがより好ましく、１．６以上であることがさらに好ましい。
上記１４９－１７８番目のアミノ酸配列は、以下配列番号２に示される配列である。
（配列番号２）
FMDLEKNIPVTIPAFIKSVSIKESESATVE

本発明における抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。検出感度の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明における抗体の作製方法について、以下例示的に説明をする。

抗体産生動物種としては、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を使用できる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。

本発明における抗体の作製方法の一実施態様において、免疫原としてのｈＭＰＶのマトリックスプロテインのペプチドは、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、ｈＭＰＶから抽出精製したマトリックスプロテインのペプチド、またはクローニングされたマトリックスプロテインの遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したｈＭＰＶマトリックスプロテインのペプチド、さらにはｈＭＰＶマトリックスプロテインのペプチドの一部を構成するポリペプチドを免疫原として用いることができる。

モノクローナル抗体は、常法に従って、上記免疫原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する［例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５－４９７）を参照］。ポリクローナル抗体は、常法により、上記免疫原を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の上記免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。

このハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、単離および／または精製されることが好ましい。

そして、上記の各ハイブリドーマを、通常、細胞培養に用いられる培地において培養し、培養上清から回収することによって、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を作製することができる。また、ハイブリドーマが由来する動物の腹腔内に投与することによって、腹水を貯留させ、該腹水から回収することによっても調製できる。

また、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目（配列番号２）を認識する抗体は以下のように作製できる。すなわち、上記のとおりｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を作製した後、配列番号２のアミノ酸配列に相当するペプチド断片を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等を実施することによって、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して一定の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択する。これにより、上記配列番号２を認識する抗体を入手し、使用できる。

本発明の検出用試薬は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等）、凝集法、またはイムノクロマトグラフィー法等により生体試料中のｈＭＰＶを検出する場合に、好適に用いることができる。
例えば、ＥＬＩＳＡ法の場合では、以下のようにして検出を行うことができる。まず、マイクロプレートの各ウェルに本発明の試薬を添加して、ウェル底面にｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を感作させる。次に、当該マイクロプレートの各ウェルに検体試料を添加して、当該試料中に含まれるｈＭＰＶと上記抗体の複合体を形成させる。そして、各ウェルにｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を標識した標識抗体を添加することにより、上記の複合体に当該標識抗体を結合させる。これにより、上記標識抗体の標識に基づいて、ｈＭＰＶの検出が可能となる。

本発明の検出用試薬は、当該試薬の用途、すなわち、当該試薬を用いて実施する測定法に応じて、上記抗体以外の成分を含有することができる。
その他成分としては、例えば、緩衝液、界面活性剤、塩類、タンパク質、防腐剤等が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法の場合では、他に発色基質等が挙げられる。凝集法では、他に増粘剤等が挙げられる。

緩衝液としては、例えば、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等が挙げられる。
塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
タンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、イソチアゾリン、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Ｐｒｏｘｅｌ）ＧＸＬ等が挙げられる。
発色基質としては、例えば、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ｐ－ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等が挙げられる。
増粘剤としては、例えば、ゼラチン、寒天、グリセロール、澱粉、アルギン酸塩類、デキストリン、カラギナン、キトサン等が挙げられる。

［免疫学的測定方法］
本発明の免疫学的測定方法は、検体中のｈＭＰＶを、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体により検出することを特徴としている。
本発明の方法においては、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体は、本発明の検出用試薬で用いる抗体を用いることができる。

本発明の方法の具体的態様としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、又はイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。なかでも、簡易、迅速かつ高感度で検出可能であるという観点から、イムノクロマトグラフィー法が好ましい。

本発明の免疫学的測定方法としてのイムノクロマトグラフィー法においては、少なくとも、（１）ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と、検体中のｈＭＰＶとを接触させることにより、当該標識抗体とｈＭＰＶとの複合体を形成させる工程、及び、（２）当該複合体中のｈＭＰＶを、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体により検出する工程、を含むことが好ましい。
以下、本発明の免疫学的測定方法としてのイムノクロマトグラフィー法について、当該方法に用いる免疫クロマト分析装置に基づいて、具体的に説明する。

本発明のイムノクロマトグラフィー法の一実施態様は、以下の工程（１）～（４）を含み、免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれるｈＭＰＶを検出する。
なお、免疫クロマト分析装置の一実施形態についての詳細は後述するとおりであるが、図１に示すように、試料添加部１、標識物質保持部２、クロマトグラフ媒体部３、検出部４、吸収部５、バッキングシート６から構成される。当該装置において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「保持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。

工程（１）：検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
工程（２）：標識物質保持部に保持されている、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と、検体中のｈＭＰＶとを接触させることにより、当該標識抗体とｈＭＰＶとの複合体を形成させる工程
工程（３）：上記複合体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（４）：展開された上記複合体中のｈＭＰＶを、検出部に固定されているｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体により検出する工程
以下各工程について説明する。

工程（１）：検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
第１に、検体を、測定精度を低下させることなく、装置内の媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は後述するものを使用できる。
第２に、検体含有液を試料として、試料添加部１上に、所定量（通常、０．１ｍｌ～２ｍｌ）滴下する。試料が試料添加部１に滴下されると、該試料は試料添加部１中で移動を開始する。

工程（２）：標識物質保持部に保持されている、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と、検体中のｈＭＰＶとを接触させることにより、前記標識抗体と前記ｈＭＰＶとの複合体を形成させる工程
工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された試料を、標識物質保持部２へと移動させ、標識物質保持部２に保持されているｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と、検体中の被検出物質であるｈＭＰＶとを接触させることによって、上記標識抗体がｈＭＰＶを認識し、両者が複合体を形成する工程である。標識物質は後述するものを使用できる。

工程（３）：上記複合体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（３）は、工程（２）において被検出物質であるｈＭＰＶが標識物質保持部２において標識抗体に接触、認識されて形成される複合体を、クロマトグラフ媒体部３上を移動相として通過させる工程である。

工程（４）：展開された前記複合体中のｈＭＰＶを、検出部に固定されているｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体により検出する工程
工程（４）は、クロマトグラフ媒体部３上を移動相として通過した検体中のｈＭＰＶが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部４に固定されているｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体と、前記工程（２）において標識物質が結合した標識抗体とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部４が着色する工程である。

被検出物質であるｈＭＰＶが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識物質は、クロマトグラフ媒体部３上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部４が着色しない。

最後に、検体含有液の水分は、吸収部５へと移動する。

上記標識抗体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識することが好ましい。当該抗体を用いることにより、検出感度をより向上させることができる。配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体は、上述したものを使用できる。

また、上記検出用抗体は、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造を認識することが好ましい。当該抗体を用いることにより、検出感度をより向上させることができる。これは、先に上記標識抗体が、検出対象であるマトリックスプロテインの一次構造（ペプチド配列）を認識して結合することで、マトリックスプロテインの立体構造が安定化され、検出部における立体構造を認識する抗体に補足されやすくなるためであると推測できる。また、検出用抗体が上記立体構造を認識する場合は、一次構造（ペプチド配列）を認識する場合と比べ、標識抗体が結合したマトリックスプロテインに対しても検出用抗体がアクセスしやすく、マトリックスプロテイン表面における検出用抗体が認識する部位が限定されないためであると推測できる。

当該抗体が認識するｈＭＰＶのマトリックスプロテインは、天然に存在するｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造の少なくとも特定の抗体との抗原抗体反応を維持するのに十分な立体構造が残されているものであればよく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどによって天然に存在するマトリックスプロテインの立体構造が破壊されて、当該抗体に対するマトリックスプロテインとの実質的な抗原抗体反応を維持することができなくなったものは除かれる。

当該抗体としては、天然に存在するｈＭＰＶのマトリックスプロテインにおける抗原抗体反応を行う部位の立体構造が破壊された当該タンパク質とは実質的に抗原抗体反応しない抗体であればよい。このような抗体としては、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインとはウエスタンブロット法で抗原抗体反応しない抗体が挙げられる。なお、ウエスタンブロット法で抗原抗体反応しないとは、標準的なウエスタンブロット法における抗体濃度、抗原濃度、基質濃度、又は反応時間などの条件下で、検出可能なレベルで抗原抗体反応をしないことをいう。

「ＳＤＳ－ＰＡＧＥ」とは、本発明が属する技術分野で慣用されているタンパク質の分離、分析法であり、代表的にはＬａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０－６８５（１９７０））に従って行うことができるが、この方法に限定されるものではない。

具体的には、例えば、以下の手順により実施することができる。まず、ゲル板に１０～１５％濃度のポリアクリルアミドからなる分離ゲル、その上に３～５％ポリアクリルアミドからなる濃縮ゲルを重層し、作製したゲルをスラブ型電気泳動装置に取り付ける。ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを含有する溶液に等量の２倍濃縮サンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％ グリセロール、２％ ＳＤＳ、２％ ２－メルカプトエタノール、０．００１％ ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を添加し、１００℃で５～１０分間加熱処理し、泳動用試料とする。泳動用試料及び市販の分子量マーカーを濃縮ゲルに作製されたレーンにそれぞれ添加し、泳動用バッファー（１９２ｍＭ グリシン、０．１％ ＳＤＳ、２４ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）を用いて、２０ｍＡの定電流で３０～９０分間泳動を行う。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離される全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインは、分離ゲル中の分子量約３６ｋＤａに相当するバンドとして得ることができる。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥに用いられるｈＭＰＶのマトリックスプロテインを含有する溶液は、最終的に行うウエスタンブロット法において、抗体と抗原抗体反応をするのに十分な量（例えば１～２ｍｇ）のｈＭＰＶのマトリックスプロテインを含有していればいかなるものにも限定されず、マトリックスプロテインに関して精製されていても精製されていなくてもよい。ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを含有する溶液としては、例えば、ｈＭＰＶ懸濁液、市販のｈＭＰＶワクチン及び組換えｈＭＰＶマトリックスプロテイン溶液などが挙げられる。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥに用いられる２倍濃縮サンプルバッファー中のＳＤＳは、ＳＤＳの結合量がタンパク質１に対して１．２～１．５程度であることを考慮して、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインの量に応じて０．５～５重量％の濃度範囲で適宜変更して用いることができる。また、２倍濃縮サンプルバッファー中の２－メルカプトエタノールは、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインに存在するジスルフィド結合を切断する還元剤として作用し、１～１０重量％の濃度範囲で適宜変更して用いてもよく、ジチオスライトール（ＤＴＴ）、Ｔｒｉｓ（２－Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ（ＴＣＥＰ-ＨＣｌ）などの他の物質からなる還元剤を用いることもできる。

「ウエスタンブロット法」とは、上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインを、例えばＴｏｗｂｉｎ Ｈ．らの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６：４３５０－４３５４（１９７９）］に従ってポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写することによって行うことができるが、この方法に限定されるものではない。

具体的には、例えば、ＰＶＤＦ膜を１００％メタノールに１０秒間、さらに転写用電極バッファー（１９２ｍＭ グリシン、５％ メタノール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．３）に３０分間浸潤し、転写に用いる。転写装置の組み立ては、陽極電極板上に下から順にろ紙、ＰＶＤＦ膜、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが終了したゲル、ろ紙を重層し、その上に陰極電極板を固定することにより行う。なお、ろ紙は予め転写用電極バッファーに２～３分間浸しておく。

転写は１．９ｍＡ／ｃｍ^２の定電流で６０～９０分間で行う。転写終了後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング溶液（０．５％ ＢＳＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）中、室温で６０分間インキュベートし、ブロッキング操作を行う。ブロッキング終了後、洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で５分間、２回インキュベートして洗浄し、一次抗体として上記の検出用抗体を用いて、室温で９０分間インキュベートして反応させる。

一次抗体との反応終了後、洗浄バッファーで５分間、２回インキュベートして洗浄し、二次抗体として、例えば酵素、蛍光物質又は放射性同位元素などの標識物質で標識された、一次抗体に特異的に反応する抗体を用いて、室温で６０分間インキュベートして反応させる。二次抗体との反応終了後、洗浄バッファーで５分間、２回インキュベートして洗浄した後、標識物質の性質を利用してＰＶＤＦ膜に転写されたｈＭＰＶのマトリックスプロテインに結合した一次抗体を可視化することにより、ウエスタンブロット法における検出を行う。

検出用抗体が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインとはウエスタンブロット法で抗原抗体反応しないことの確認は、例えば、ウエスタンブロット法でｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応することが確認されている市販の抗体を陽性コントロールの抗体として用い、陽性コントロールの抗体がＰＶＤＦ膜上のｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応し、マトリックスプロテインを検出できる条件下で、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを検出できないことを１つの基準として行うことができる。

検出用抗体として、ウエスタンブロット法において、陽性コントロールの抗体がｈＭＰＶのマトリックスプロテインを検出できる抗体濃度と同じ抗体濃度でｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応しない抗体であることが、検出感度向上の観点から好ましい。より好ましくは２倍の抗体濃度でｈＭＰＶのマトリックスプロテインと反応しない抗体、さらに好ましくは５倍又は１０倍の抗体濃度でｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応しない抗体である。

検出用抗体として、ウエスタンブロット法において、陽性コントロールの抗体が検出できるｈＭＰＶのマトリックスプロテインの抗原濃度と同じ濃度のｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応しない抗体が検出感度向上の観点から好ましい。より好ましくは２倍の抗原濃度で反応しない抗体、さらに好ましくは５倍又は１０倍の濃度のｈＭＰＶのマトリックスプロテインと抗原抗体反応しない抗体である。

上記ｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造を認識する抗体の作製は、上述した抗体の作製方法を採用できるが、免疫原としては、還元剤を含むＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーで処理されていないｈＭＰＶのマトリックスプロテインが好ましく、より好ましくは陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳで処理されていないｈＭＰＶのマトリックスプロテインである。上記免疫原として好ましいものとしては、例えば、陰イオン性界面活性剤を含まないバッファーにｈＭＰＶを懸濁したもの、又は全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインなどである。

本発明の免疫学的測定方法としてのイムノクロマトグラフィー法においては、上記標識抗体として配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体を使用するとともに、上記検出用抗体としてｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造を認識する抗体を使用することが、検出感度の向上という観点から好ましい。これは、標識抗体と検出用抗体の組み合わせを上記のようにすることにより、先に上記標識抗体が、検出対象であるマトリックスプロテインの一次構造（ペプチド配列）を認識して結合することで、マトリックスプロテインの立体構造が安定化され、検出部における立体構造を認識する抗体に補足されやすくなること、さらに検出用抗体が上記立体構造を認識することから、マトリックスプロテイン表面における検出用抗体が認識する部位が限定されないことで、検出用抗体がマトリックスプロテイン－標識抗体の複合体を捉えやすくなるためであると推測される。

［免疫クロマト分析装置］
本発明の免疫クロマト分析装置は、図１に示すように、試料添加部１、標識物質保持部２、クロマトグラフ媒体部３、検出部４、吸収部５、バッキングシート６から構成されている。

試料添加部１は、免疫クロマト分析装置において、検体を含有する試料を添加する部位である。試料添加部１では試料が迅速に吸収されるが、速やかに試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。

標識物質保持部２は、後述する標識物質が結合した標識抗体が保持されている部位である。標識物質保持部２内を試料が移動する際に当該標識抗体と検体中の被検出物質とが結合する。当該標識抗体はｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体である。当該標識抗体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識することが、検出感度向上の観点から好ましい。

標識物質保持部２には、グラスファイバー、セルロース等の膜が通常使用される。

標識物質保持部２の標識抗体の含有量は、通常０．０５μｇ／装置～０．５μｇ／装置であり、好ましくは０．０５μｇ／装置～０．２５μｇ／装置であり、より好ましくは０．０７μｇ／装置～０．１μｇ／装置である。また、標識物質保持部２の単位面積当たりの標識抗体の含有量は、通常０．１５μｇ／ｃｍ^２～１．５μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．１５μｇ／ｃｍ^２～１．０μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．２０μｇ／ｃｍ^２～０．２５μｇ／ｃｍ^２である。標識物質保持部２の標識抗体の含有量を上記範囲内とすることにより、優れた検出感度を達成できる。

免疫クロマト分析において抗体を標識する標識物質としては、一般的に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては、不溶性担体を用いることが好ましい。すなわち本発明において、標識物質保持部２が含有する抗体としては、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を不溶性担体に感作することにより標識化した標識抗体を使用することが好ましい。なお、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。

標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金等の金属粒子、酸化鉄等の金属酸化物粒子、硫黄等の非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他の不溶性担体を用いることができる。上述のように不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。金属粒子及び金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。

標識物質としての不溶性担体は、特に金粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ～２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ～１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ－２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無作為に１００個の粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。標識物質保持部における金粒子の含有量は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．００６μｇ／ｃｍ^２～０．４２μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．０１μｇ／ｃｍ^２～０．３μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．０１μｇ／ｃｍ^２～０．２μｇ／ｃｍ^２である。上記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。

クロマトグラフ媒体部３は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部３は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、検出感度向上の観点から、例えば、ニトロセルロースメンブレンや、酢酸セルロースメンブレンが好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（例えばポリエチレン、ポリプロピレン等）も使用可能である。

ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。

ニトロセルロースメンブレンは、さらに、毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。当該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が、迅速かつ正確な測定を可能にするという観点から好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、標識物質の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。

ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。

上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部３の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。

さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部３の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。

また、クロマトグラフ媒体部３上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部３に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理は、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。

検出部４は、上記クロマトグラフ媒体部３上の任意の位置に形成されており、検出用抗体として、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体を含有する。検出感度向上の観点から、好ましくは、上述したｈＭＰＶのマトリックスプロテインの立体構造を認識する抗体を含有する。
検出部４へのｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体の固定化は、常法に従って行うことができる。

検出部４では、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のｈＭＰＶが、検出部４に固定されている検出用抗体と、標識物質が結合した標識抗体とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に結合する。

検出部４に含有される、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体の含有量は、通常０．０５μｇ／装置～５．０μｇ／装置であり、好ましくは０．０８μｇ／装置～３．０μｇ／装置であり、より好ましくは０．１μｇ／装置～１.０μｇ／装置である。また、検出部４の単位面積当たりの、ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体の含有量は、通常０．１μｇ／ｃｍ^２～５０μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．８μｇ／ｃｍ^２～３０μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは１μｇ／ｃｍ^２～１０μｇ／ｃｍ^２である。検出部４の検出用抗体の含有量を上記範囲内とすることにより、優れた検出感度を達成できる。

吸収部５は、クロマトグラフ媒体部３の末端に、検出部４を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明において、吸収部５は、例えばグラスファイバー、パルプ、セルロースファイバー等、またはそれら不織布にアクリル酸重合体等の高分子、エチレンオキサイド基等を持つ親水性薬剤を含有させたものが用いられる。液体を良好に吸収できるという観点から、グラスファイバーが好ましい。

バッキングシート６は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けたりすることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部１、標識物質保持部２、クロマトグラフ媒体部３、検出部４、および吸収部５の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート６は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。

本発明の免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０℃～５０℃、乾燥時間は０．５時間～１時間である。

［免疫クロマト分析キット］
本発明の免疫クロマト分析キットは、上記の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。

本発明の免疫クロマト分析キットにおいて、検体希釈液は、展開液としても使用することができるものである。検体希釈液は通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩類、および非イオン性界面活性剤を含有する。さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等の１種もしくは２種以上を加えてもよい。

検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体と展開液を予め混合したものを試料として、試料添加部に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体を含有する試料を試料添加部に供給・滴下した後、展開液を試料添加部に供給・滴下して展開させてもよい。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。

本発明におけるｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体は、後述する方法で作製したＮｏ．１～Ｎｏ．８抗体を用いた。また比較例として、以下のｈＭＰＶのＮ蛋白を認識する市販の抗体を用いた。

（ｈＭＰＶのＮ蛋白を認識する抗体）
・ＨＭＰＶ５７（ＢＩＯＲＡＤ社製）：Ｎｏ．９と称する
・ＨＭＰＶ３３（ＢＩＯＲＡＤ社製）：Ｎｏ．１０と称する
・Ｃ０１８５１Ｍ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）：Ｎｏ．１１と称する

（本発明における抗体の作製）
製造例１
ｈＭＰＶのマトリックスプロテインを認識する抗体は以下のように作製した。まず、配列番号１で示されるｈＭＰＶのマトリックスプロテインのアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。Ｈｉｓ－ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ－Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、当該ペプチドと混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。

目的遺伝子を組み込んだ組換えマトリックスプロテインプラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭ ＩＰＴＧ（タカラバイオ）を添加して組換えマトリックスプロテインの発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ－１００（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインをＨｉｓ ｔｒａｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインとした。

得られた組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインを免疫用抗原として、組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインに対するモノクローナル抗体を作製した。モノクローナル抗体の作製は次のように、常法に従っておこなった。１００μｇの組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインと等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ－グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。

クローニングした細胞は、２，６，１０，１４－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。

このようにして得られたモノクローナル抗体に対して、組換えｈＭＰＶマトリックスプロテインを９６穴プレートに固定化した直接ＥＬＩＳＡ法にて抗体をスクリーニングした。その結果、ｈＭＰＶマトリックスプロテインを認識する８種類の抗体が得られた。以下この８種類の抗体を、Ｎｏ．１～Ｎｏ．８の抗体として説明する。

参考例１（ＥＬＩＳＡ試験）
次に、上記作製した抗体が認識するアミノ酸配列をＥＬＩＳＡ試験により調べた。
配列番号１で示されるｈＭＰＶマトリックスプロテインのアミノ酸配列を、下記６つのアミノ酸配列に分け、それぞれのアミノ酸配列からなるペプチドを、ペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法により作製した。なお、ペプチド１は、配列番号１で示されるｈＭＰＶマトリックスプロテインのアミノ酸配列の６－３０番目（配列番号３）、ペプチド２は４０－７０番目（配列番号４）、ペプチド３は７５－１０９番目（配列番号５）、ペプチド４は１２３－１４１番目（配列番号６）、ペプチド５は１４９－１７８番目（配列番号２）、ペプチド６は１８４－２１９番目（配列番号７）にそれぞれ対応する。
ペプチド１：VDTYQGIPYTAAVQVDLVEKDLLPA（配列番号３）
ペプチド２：QANTPPAVLLDQLKTLTITTLYAASQNGPIL（配列番号４）
ペプチド３：SAQGAAMSVLPKKFEVNATVALDEYSKLDFDKLTV（配列番号５）
ペプチド４：YGMVSKFVSSAKSVGKKTH（配列番号６）
ペプチド５：FMDLEKNIPVTIPAFIKSVSIKESESATVE（配列番号２）
ペプチド６：EADQALTQAKIAPYAGLIMIMTMNNPKGIFKKLGAG（配列番号７）

まず、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、抗原として上記各ペプチド（ペプチド１～６）０．５μｇ／ｗｅｌｌ、コントロールとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、４℃で一晩保持した。また、抗原を添加しないブランクウェルも用意した。その後、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、カゼインＮａ（和光純薬社製）溶液を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後カゼインＮａ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。これにより、各ペプチドをウェルに固定化した。

一次抗体としてＮｏ．１～Ｎｏ．８の各抗体を１μｇ／ｍＬ ｉｎ １％ＢＳＡ－ＰＢＳブロッキング溶液（一抗体溶液）１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４－１７６１１）１０μｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３－００－０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
各ウェルの吸光度（実測値）からブランクの吸光度（ブランク値）を減じた値（測定値）を表１及び図２に示す。また、各ウェルの吸光度（実測値）からブランクの吸光度（ブランク値）を除した値（Ｓ／Ｎ比）を表２及び図３に示す。

表１及び図２に示すとおり、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８は、ペプチド５と反応させた場合に吸光度０．１Ａｂｓ以上となった。また、同抗体は、表２及び図３に示すとおり、ペプチド５と反応させた場合に、Ｓ／Ｎ比が１．５以上となった。すなわち、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８はペプチド５に対して実質的に抗原抗体反応を示した。
以上の結果から、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８の抗体は配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体であることが確認できた。

参考例２（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット法）
次に、上記作製したＮｏ．１～Ｎｏ．８の抗体が、ｈＭＰＶマトリックスプロテインの立体構造を認識しているのか、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法により調べた。
０．０１ｍｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈＭＰＶ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ溶液を、２倍濃縮サンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０％グリセロール、４％ＳＤＳ、３％ＴＣＥＰ、０．００１％ ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）と等量で混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ ５－２０％ １８ｗｅｌｌ（ＤＲＣ社製）を用いて、公知の標準的な方法に従った。泳動後のゲルからタンパク質をＳｅｑｕｉ－Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）にブロッテイング装置（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）により転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで室温にて１０分ブロッキングした。ブロッキング液を除き、ＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（以下、Ｔ－ＰＢＳという。）で１０分間３回洗浄後、上記Ｎｏ．１～Ｎｏ．８の抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＶＤＦ膜をＴ－ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、Ｔ－ＰＢＳで５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製）とともに室温で３０分間インキュベートした。Ｔ－ＰＢＳで１０分間３回洗浄後、発色基質である１－Ｓｔｅｐ^ＴＭ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）とともにＰＶＤＦ膜をインキュベートして、ＰＶＤＦ膜に結合した抗体を可視化した。結果を図４に示す。
図４に示すように、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８の抗体において全長のｈＭＰＶマトリックスプロテインに相当する約３６ｋＤａのバンドが検出されたが、Ｎｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７の抗体において同バンドは検出されなかった。
すなわち、Ｎｏ．１、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７の抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された全長のｈＭＰＶのマトリックスプロテインとはウエスタンブロット法で抗原抗体反応しないことから、ｈＭＰＶマトリックスプロテインの立体構造を認識していることが確認された。

〈実施例１〉
検体希釈液、及び、試料添加部１と、標識物質保持部２と、検出部４を有するクロマトグラフ媒体３と、吸収部５とを含む免疫クロマト分析装置からなる免疫クロマト分析キットを作製した。
なお、標識物質保持部が含有する標識抗体、及び、検出部が含有する検出用抗体としては、上記作製したＮｏ．１～Ｎｏ．３の抗体を用い、その組み合わせは、下記表３に示すとおりである。以下詳細に説明する。

（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。

（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した表３に示す抗体（標識抗体）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。

次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。

上記作製した標識物質溶液３００μＬに、３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。標識物質保持部が含有する標識抗体は、０．０７μｇ／装置（０．２μｇ／ｃｍ^２）とした。

（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、表３に示す抗体（検出用抗体）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。

また、金ナノ粒子標識物質の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃にて３０分間乾燥させ、室温にて一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。検出部が含有する検出用抗体は、０．１５μｇ／装置（１．５μｇ／ｃｍ^２）とした。

（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートからなる基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。

（５）検体希釈液の調製
１質量％の非イオン性界面活性剤（ナカライテスク社製ノニデットＰ－４０と日油社製ノニオンＭＮ－８１１の１：１混合物）を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。

〈実施例２〉
実施例１において、標識物質保持部が含有する標識抗体、及び、検出部が含有する検出用抗体として、上記作製したＮｏ．５～Ｎｏ．８の抗体を用い、その組み合わせを表４に示すとおりとした点を除いては、実施例１と同様にして、実施例２の免疫クロマト分析キットを作製した。

〈比較例１〉
実施例１において、標識物質保持部が含有する標識抗体、及び、検出部が含有する検出用抗体として、ｈＭＰＶのＮ蛋白を認識する抗体であるＮｏ．９～Ｎｏ．１１の抗体を用い、その組み合わせを表５に示すとおりとした点を除いては、実施例１と同様にして、比較例１の免疫クロマト分析キットを作製した。

試験例１（検出感度評価）
ｈＭＰＶを含有する検体試料を使用して、上記作製した実施例１、２、及び比較例１の免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を、以下のとおり測定した。
ｈＭＰＶ感染者の鼻腔吸引液を検体希釈液で５０００倍希釈し、検体含有液を調製した。調製した検体含有液１２０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させた。展開開始から５分後に検出部の着色の度合い（発色強度）をデンシトメーターにより測定した。
実施例１の結果を表３及び図５、実施例２の結果を表４及び図６、比較例１の結果を表５に示す。

以上の結果から分かるように、ｈＭＰＶのマトッリクスプロテインを認識する抗体を用いた実施例１、２では、ｈＭＰＶのＮ蛋白を認識する抗体を用いた場合と比較して、ｈＭＰＶの実検体でｈＭＰＶを高感度に検出できた。
特に、イムノクロマトグラフィー法において、標識抗体に配列番号１のアミノ酸配列からなるｈＭＰＶマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識する抗体を用い、検出用抗体にｈＭＰＶマトリックスプロテインの立体構造を認識する抗体を用いることで、特に感度良くｈＭＰＶの検出できた。
一方、ｈＭＰＶのＮ蛋白を認識する抗体（Ｎｏ．９～Ｎｏ．１１）を用いた比較例１では、ｈＭＰＶの実検体を検出することができなかった。

試験例２（交叉反応性評価）
本試験では、上記作製した実施例１の免疫クロマト分析キットを用い、ＲＳＶ（製品名Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製 型番ＥＬ－０７－０２）を検体として測定を行った。ＲＳＶの濃度が３５μｇ／ｍＬとなるように上記検体希釈液で希釈し、検体含有液を調製した検体含有液を試料として、試験例１と同様に測定を行った。また陽性コントロールとして、ＲＳＶ検出キット（製品名：アルソニックＲＳＶ Ｌｏｔ．ＥＮ１３、アルフレッサファーマ社製）を用いて、同様の試験を行った。結果を表６及び図７に示す。

表６及び図７に示すように、本発明の免疫クロマト分析キットは、ｈＭＰＶと相同性の高いＲＳＶに対して交叉反応を起こさず、ｈＭＰＶを特異的に検出できることが分かった。

１ 試料添加部
２ 標識物質保持部
３ クロマトグラフ媒体部
４ 検出部
５ 吸収部
６ バッキングシート

Claims (3)

1. 検体中のヒトメタニューモウイルスを、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体により検出する、ヒトメタニューモウイルスの免疫学的測定方法であって、
   前記免疫学的測定方法がイムノクロマトグラフィー法であり、前記イムノクロマトグラフィー法は、
   ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体に標識物質が結合した標識抗体と、検体中のヒトメタニューモウイルスとを接触させることにより、前記標識抗体と前記ヒトメタニューモウイルスとの複合体を形成させる工程と、
   前記複合体中のヒトメタニューモウイルスを、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する検出用抗体により検出する工程と、
   を含み、
   前記標識抗体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識し、
   前記検出用抗体が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインの立体構造を認識する、免疫学的測定方法。
2. 試料添加部、標識物質保持部及び検出部を有するクロマトグラフ媒体部並びに吸収部を含む、ヒトメタニューモウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置であって、
   前記標識物質保持部および前記検出部が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインを認識する抗体を含有し、
   前記標識物質保持部が含有する抗体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインのアミノ酸配列１４９－１７８番目を認識し、
   前記検出部が含有する抗体が、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスプロテインの立体構造を認識する、免疫クロマト分析装置。
3. 請求項２に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。

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