JPH1048209A - ヒトラクトフェリンの分析方法、感染症のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 尿路感染症や細菌感染性下痢症等の感染症を
確実に検出することができる便又は尿中のヒトラクトフ
ェリンの分析方法、感染症のスクリーニング方法及びス
クリーニング用キットを提供する。 【解決手段】 ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性
が影響されない抗ヒトラクトフェリン抗体を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、便又は尿中のヒトラク
トフェリンを分析する方法に関する。また、ヒトラクト
フェリンを分析することからなる感染症（例えば、尿路
感染症又は細菌感染性下痢症）のスクリーニング方法及
びスクリーニング用キットにも関する。

【０００２】

【従来の技術】尿路感染症や細菌感染性下痢症等におい
ては、その感染（炎症）部位から、便中や尿中に多量の
白血球が浸潤する。従って、尿路感染症や細菌感染性下
痢症の診断には、便又は尿検体の細菌培養検査と並行し
て、白血球の鏡検法が用いられている。しかし、白血球
は便又は尿中では非常に不安定で破砕し易いため、鏡検
法では操作に迅速性と熟練度を要求されるだけでなく、
正確性に欠け、更には保存便又は保存尿検体には適用困
難である。そのため、鏡検法に代わる尿中の白血球検出
法として、白血球の顆粒中に存在するエステラーゼ活性
を、酵素反応を組み入れたアゾ・カップリング反応を用
いて測定し、対象とする尿路感染症を検出する方法［例
えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐ．８５
２〜ｐ．８５４（１９８２）］が開発されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、エステ
ラーゼ活性測定法は、尿保存剤のホルムアルデヒドによ
る偽陽性や、尿中のタンパク質、セファレキシンやゲン
タマイシン等の抗生物質、尿保存剤のホウ酸、アスコル
ビン酸、ビリルビン及び化学療法剤ニトロフラントイン
等の影響による偽陰性が起こるうえに、便検体には適用
不可能である。

【０００４】一方、白血球の顆粒内には、鉄結合性タン
パク質であるラクトフェリンも多量（４．９μｇヒトラ
クトフェリン／１０⁶ 個白血球）に存在しており、便又
は尿中の白血球のマーカーとなり得ることが知られてい
る［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０
（５），ｐ．１２３８〜ｐ．１２４２（１９９２）］。
従って、本発明の目的は、ヒトラクトフェリンを測定対
象とし、便又は尿中の白血球の顆粒内の鉄結合性タンパ
ク質であるヒトラクトフェリンを検出することにより、
鏡検法やエステラーゼ活性測定法に代わる尿路感染症や
細菌感染性下痢症等の感染症の確実な検出方法を提供す
ることにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトラクトフ
ェリンの鉄飽和度に反応性が影響されない抗ヒトラクト
フェリン抗体を用いることを特徴とする、便又は尿中の
ヒトラクトフェリンを免疫学的に分析する方法に関す
る。また、本発明は、前記の分析方法によって便又は尿
中のヒトラクトフェリンを分析することを特徴とする、
感染症のスクリーニング方法にも関する。更に、本発明
は、ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性が影響され
ない抗ヒトラクトフェリン抗体、ヒトラクトフェリンの
鉄飽和度に反応性が影響されない標識化抗ヒトラクトフ
ェリン抗体、及び界面活性剤含有検体希釈液を含む、感
染症のスクリーニング用キットにも関する。本明細書に
おいて「分析」とは、分析対象であるヒトラクトフェリ
ンの存在を検出すること、及びヒトラクトフェリンを定
量的又は半定量的に測定することのいずれをも含む。従
って、本明細書において「分析方法」とは、分析対象で
あるヒトラクトフェリンの存在を検出する方法、及びヒ
トラクトフェリンを定量的又は半定量的に測定する方法
のいずれをも含む。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
ラクトフェリンは鉄結合性タンパク質であるが、鉄結合
量は必ずしも一定でなく、便又は尿中におけるヒトラク
トフェリンの鉄飽和度も現在のところ明らかではない。
従って、ヒトラクトフェリンを免疫学的に分析する場合
に、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体とし
て、その反応性がヒトラクトフェリンの鉄飽和度に影響
されない抗体を選択して用いれば、正確に感染症に起因
するヒトラクトフェリンを検出することができる。この
ように分析したヒトラクトフェリンの値から、例えば尿
路感染症や細菌感染性下痢症等を正確にスクリーニング
することができる。

【０００７】本発明で用いられる抗ヒトラクトフェリン
抗体は、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗
体のいずれであることもできる。ポリクローナル抗体の
調製又はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
の分離並びにモノクローナル抗体の調製は、従来公知の
手段に従って実施することができる。例えば、ラクトフ
ェリン（例えば、哺乳動物、特にヒトの母乳、又は白血
球由来のヒトラクトフェリン）を免疫原として用い、哺
乳動物や鳥類（例えば、ウサギ、マウス、又は鶏等）を
通常の方法により免疫することにより行う。免疫には、
例えば、免疫原溶液を等量のフロイントの完全アジュバ
ント又は不完全アジュバントと乳化混合し、ウサギやマ
ウス等に接種（初回免疫）し、以後、２〜４週間の間隔
で同様の操作を行い、数回免疫する方法等がある。ポリ
クローナル抗体は、このように免疫した動物等の血液を
採取し、抗血清として調製する。

【０００８】またモノクローナル抗体を作製する場合
は、例えば、最終免疫して数日後のマウス等から得た脾
臓細胞等を、細胞融合工程に用いることができる。細胞
融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細胞（骨髄腫
細胞）としては、各種の公知の細胞株、例えば、ｐ３・
ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，５；５１１−５１７（１９７５）］、ＳＰ２／０
−Ａｇ１４［Ｎａｔｕｒｅ，２７６；２６９−２７０
（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３［Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３；１５４８−１５５０（１９
７９）］等を使用することができる。

【０００９】細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融
合促進剤（ポリエチレングリコールなど）を用いて行う
ことができ、細胞の混合比率も、例えば、マウスの脾臓
細胞に対してミエローマ細胞を約１／５〜１／１０程度
の割合で行うことができる。細胞融合剤としては、例え
ば、市販の細胞融合用ポリエチレングリコール［分子量
１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
製）］を用いることができる。細胞融合は、前記の細胞
融合剤中で脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合する
ことによって行い、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培地）
中で培養することによりハイブリドーマのみを増殖した
後、その培養上清中の抗体産生の有無を、例えばＥＬＩ
ＳＡ法によって測定し、目的とするハイブリドーマを分
離することができる。このハイブリドーマを、細胞クロ
ーニング法を用いてクローン化し、モノクローナル抗体
産生細胞を得ることができる。また、ヒトラクトフェリ
ンの鉄飽和度に影響されないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマの選択は、そのハイブリドーマの培
養上清のヒトラクトフェリンとの反応性を、鉄飽和度の
異なる種々のヒトラクトフェリンとの反応性に関して
（例えば、ＥＬＩＳＡ法で）確認することによって、行
うことができる。分離したハイブリドーマは、通常の培
地で培養することができ、液体窒素等の中で容易に長期
間保存することができる。

【００１０】また、本発明で用いるモノクローナル抗体
は、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを培養することにより、容易に調製することができ
る。ハイブリドーマの培養は、例えば、約５％二酸化炭
素、約３７℃及び加湿の条件下で、培養に適した任意の
培地を用いて行うことができるが、好適にはイスコフ改
変ダルベッコ培地に１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと
いう）を含む培地を用いる。またイン・ビボの場合に
は、例えばマウスの腹腔中で培養するのが好ましい。

【００１１】抗体溶液としては、ポリクローナル抗体の
場合には抗血清を、モノクローナル抗体の場合にはイン
・ビトロで培養した培養液又はマウスの腹腔中で培養し
て得た腹水を用いることができるが、これらを出発材料
として用いて、更に分離・精製して得た抗体を用いるこ
ともできる。抗体の分離、精製には、タンパク質の分
離、精製に一般的な方法、例えば硫安塩析、イオン交換
クロマトグラフィー、分子篩カラムクロマトグラフィ
ー、アフィニテイークロマトグラフィー、又は透析等の
方法を用いることができる。

【００１２】こうして得られた抗体（すなわち、反応性
がヒトラクトフェリンの鉄飽和度に影響されない抗体）
１種又は２種以上を用いて、後述するヒトラクトフェリ
ンの免疫学的分析方法、及び感染症のスクリーニング方
法を実施することができ、更には感染症のスクリーニン
グ用キットを構成することができる。なお、ヒトラクト
フェリンは１分子当り最大２分子の鉄を結合するので、
本明細書において「ヒトラクトフェリンの鉄飽和度」と
は、ヒトラクトフェリン１分子当りの結合鉄分子数が２
（飽和型）、１（部分飽和型）又は０（非結合型）のい
ずれかであることを意味する。また、ヒトラクトフェリ
ンは鉄を結合するか否かで（特に鉄結合部位の）立体
（高次）構造がわずかに変化する。従って、「反応性が
ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に影響されない抗体」と
は、鉄結合の有無（度合い）により生ずるヒトラクトフ
ェリン立体（高次）構造の変化に無関係に一定の結合能
を有する抗体をいう。

【００１３】前記の方法に従い、例えば、ヒトラクトフ
ェリンで免疫したウサギの抗血清から、常法により、ウ
サギポリクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体を得るこ
とができる。また、例えば、ヒトラクトフェリンで免疫
したマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞とを融合さ
せてモノクローナル抗体ヒトラクトフェリン抗体産生細
胞を作製し、培養上清からマウスモノクローナル抗ヒト
ラクトフェリン抗体を得ることができる。本発明では、
これらのウサギポリクローナル抗ヒトラクトフェリン抗
体及びマウスモノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体
のうち、ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性が影響
されない抗体を選択して用いる。本発明者は、後記実施
例で示すように、ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応
性が影響されない抗体として、実際に、ウサギポリクロ
ーナル抗体（以下、Ｈ１５抗体と称す）、及びマウスモ
ノクローナル抗体（以下、１５Ｇ１１−０４抗体、１７
Ｂ０４−０８抗体、１７Ｇ０５−１０抗体及び３２Ｄ０
１−１０抗体と称す）を得ることができた。

【００１４】本発明においては、検体として便又は尿を
使用する。この便又は尿をそのまま用いることもできる
が、正常便又は正常尿中に存在するヒトラクトフェリン
量では、ヒトラクトフェリンを検出することができない
ように便又は尿試料を希釈することにより、検出感度を
調整して用いるのが好ましい。検体希釈液としては、反
応系に影響を与えない水性液体であれば特に限定され
ず、例えば、精製水、生理食塩水又は各種緩衝液を用い
ることができる。緩衝液としては、ｐＨ６〜９に緩衝能
を有する従来公知の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液、ホウ
酸塩緩衝液等を用いることができる。希釈液として好ま
しくは緩衝液を使用し、特に好ましくはホウ酸塩緩衝液
を用いる。

【００１５】この際、検体中に含まれるタンパク質及び
／又は脂質等（非イオン性及びイオン性夾雑物）が、抗
体及び金コロイド、メンブレン、ラテックス粒子、磁気
ビーズ粒子、又はポリスチレン製プレート等に対して非
特異的に吸着し、測定に影響を与えることがある。検体
希釈液に界面活性剤を添加することにより、こうした非
特異的な吸着を回避することができる。界面活性剤とし
ては、例えば、非イオン系界面活性剤及び両性イオン系
界面活性剤を使用することが好ましい。特に、Ｎ−テト
ラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパンスルホン酸（以下、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔとい
う）、３−［（３−コラシドプロピル）ジメチルアンモ
ニオ］−プロパンスルホン酸（以下、ＣＨＡＰＳとい
う）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピ
ル）コラミド（以下、ＢＩＧＣＨＡＰという）、及びポ
リエチレングルコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニル
エーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」；以
下、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００という）からなる４種の
界面活性剤を添加した検体希釈液を用いることにより、
非イオン性及びイオン性夾雑物による影響を効果的に排
除することができる。更に、牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を共存させるとより効果的である。

【００１６】これら添加剤の検体希釈液中濃度は、Ｚｗ
ｉｔｔｅｒｇｅｎｔは好ましくは０．０１〜０．１５ｗ
／ｖ％、より好ましくは０．０５〜０．１ｗ／ｖ％、Ｃ
ＨＡＰＳは好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％、より
好ましくは０．０５〜０．１ｗ／ｖ％、、ＢＩＧＣＨＡ
Ｐは好ましくは０．０１〜０．３ｗ／ｖ％、より好まし
くは０．０５〜０．１ｗ／ｖ％、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００は、好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％、より好
ましくは０．１〜０．３ｗ／ｖ％の範囲内で用いる。更
に、必要に応じてＢＳＡを添加する場合には、その検体
希釈液中濃度は、好ましくは０．１〜１．０ｗ／ｖ％、
より好ましくは０．３〜０．７ｗ／ｖ％の範囲内で用い
る。

【００１７】上記で得られた抗ヒトラクトフェリン抗体
を用いて、便又は尿中のヒトラクトフェリンを免疫学的
に分析するには、従来公知の任意の免疫学的分析手段を
適宜選択して適用することが可能である。例えば、酵素
免疫法、又は磁気ビーズ酵素免疫法を利用してラクトフ
ェリンを測定するには、例えば、上記ポリクローナル抗
体（例えば、Ｈ１５抗体）をマイクロプレート又は磁気
ビーズに固相化する。そして、適当なブロッキング剤
（例えば、１．０％ゼラチン溶液）でブロッキングした
後、例えば、便試料（例えば、５０ｍｇ程度）を上記検
体希釈液で約１００〜４０００倍に希釈する。また、尿
試料（例えば、１００μｌ程度）を前記検体希釈液で約
５〜１００倍に希釈する。それぞれの希釈液を試料溶液
として上記固相化抗体と反応させる。続いて、市販の標
識化キット（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ製ビオチン標識
キット；商品名ＲＰＮ２２０２等）を用いて標識した上
記ポリクローナル抗体（例えば、Ｈ１５抗体）と反応さ
せる。更に、標識アビジン（例えば、アルカリホスファ
ターゼ標識アビジン）を反応させた後、適当な基質（例
えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム等）を加
えて発色させ、分光学的にその吸光度を検出する。一
方、コントロール試験として、試料の代わりにヒトラク
トフェリン標準試薬シリーズを用いること以外は前記と
同様の操作を実施して、ヒトラクトフェリン標準曲線を
作成し、前記の試料から得られた吸光度と比較すること
によって、前記試料中のヒトラクトフェリンの存在・不
在を検出し、又はヒトラクトフェリン量を定量的に測定
することができる。前記の酵素免疫法又は磁気ビーズ酵
素免疫法は、２種のモノクローナル抗体の組合せ、又は
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との組合せに
よって実施することもできる。

【００１８】また、ラテックス凝集法、又は磁気ビーズ
凝集法を利用してヒトラクトフェリンを免疫学的に分析
する場合には、例えば、上記ポリクローナル抗体（例え
ば、Ｈ１５抗体）をラテックスビーズ又は磁気ビーズに
固相化する。便試料（例えば、５０ｍｇ程度）を上記検
体希釈液で２０〜１００倍に希釈する。また、尿試料
（例えば、１００μｌ程度）を上記検体希釈液で２０〜
１０倍に希釈する。それぞれの希釈液を試料溶液として
上記固相化抗体と反応させる。室温で数分間（例えば、
３〜１０分間）反応させた後、ラテックス又は磁気ビー
ズの凝集の有無を目視あるいは機械的に検出する。前記
のラテックス凝集法又は磁気ビーズ凝集法は、１種又は
２種以上のモノクローナル抗体の組合せ、又はポリクロ
ーナル抗体と１種以上のモノクローナル抗体との組合せ
を用いることによって実施することもできる。

【００１９】更に、イムノクロマトグラフ法を利用して
ヒトラクトフェリンを免疫学的に分析する場合には、例
えば、上記ポリクローナル抗体（例えば、Ｈ１５抗
体）、あるいは上記モノクローナル抗体（例えば、１５
Ｇ１１−０４抗体、１７Ｂ０４−０８抗体、１７Ｇ０４
−０８抗体、又は３２Ｄ０１−１０抗体）をヒトラクト
フェリン検出用抗体として用い、そしてヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（Ｋａｐｐｅｌ製等）又はウサギ抗マウスＩｇ
抗体（ＤＡＫＯ製等）を陽性コントロール抗体として用
いて、それらの抗体を支持体（例えばナイロンメンブレ
ン）上に固相化する。一方、上記ポリクローナル抗体
（例えば、Ｈ１５抗体）、及び上記モノクローナル抗体
（例えば、１５Ｇ１１−０４抗体、１７Ｂ０４−０８抗
体、１７Ｇ０４−０８抗体、又は３２Ｄ０１−１０抗
体）を金コロイド（例えば、Ａｕｒｏ Ｂｅａｄｓ Ｇ
５，Ｇ１０，Ｇ３０；Ｐｈａｒｍａｃｉａ製等）で標識
し、これらの標識抗体を吸水パット（例えば、Ｌｏｐｒ
ｏｓｏｒｂ；Ｐｏｌｅ製等）に塗布して乾燥させた後、
上記の抗体固相化ナイロンメンブレンの一端に貼付す
る。そして、便試料（例えば、５０ｍｇ程度）を上記検
体希釈液で１００〜４０００倍に、そして尿試料（例え
ば、１００μｌ程度）を上記検体希釈液で２〜１００倍
に希釈して調製した各希釈試料液を、試料液として吸水
パット上に塗布する。室温で５〜１０分間放置した後、
ナイロンメンブレン上に固相化されたヒトラクトフェリ
ン検出用抗体及び陽性コントロール抗体による金コロイ
ドの捕獲に基づく着色（例えば赤紫−紫色）の有無を目
視あるいは機械的に判定する。このような操作法によ
り、試料中のヒトラクトフェリンを正確に分析すること
ができる。

【００２０】なお、本発明において標識化されたポリク
ローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体を用いる場
合には、従来公知の任意の方法によって、従来公知の任
意の標識（例えば、酵素タンパク質や金属コロイド）を
付けることができる。また、標識化されたポリクローナ
ル抗体及び／又はモノクローナル抗体として用いるラテ
ックス感作抗体も、従来公知の任意の方法によって調製
することができる。

【００２１】図１に、酵素免疫法、イムノクロマトグラ
フ法、ラテックス凝集法、磁気ビーズ凝集法、磁気ビー
ズ酵素免疫法によるヒトラクトフェリンの測定可能濃度
範囲を示す。こうして、得られた結果は、感染症、例え
ば尿路感染症や細菌感染性下痢症等の診断指標として適
用することができる。酵素免疫法、又は磁気ビーズ酵素
免疫法により、ヒトラクトフェリンが便中に４０μｇ／
ｇ又はｍｌ便又はそれ以上、尿中に２００ｎｇ／ｍｌ尿
又はそれ以上の量で検出された場合、またラテックス凝
集法、磁気ビーズ凝集法、又はイムノクロマトグラフ法
でヒトラクトフェリンが陽性の場合には、消化管及び尿
路中の細菌が陽性であるものと判断することができ、こ
うして尿路感染症及び細菌感染性下痢症等のスクリーニ
ング法が提供される。

【００２２】本発明によるスクリーニング用キットは、
少なくともヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性が影
響されない抗ヒトラクトフェリン抗体、ヒトラクトフェ
リンの鉄飽和度に反応性が影響されない標識化抗ヒトラ
クトフェリン抗体、及び界面活性剤含有検体希釈液から
構成することができる。それらの具体的な構成は、選択
する免疫学的手段によって適宜変更可能である。以下
に、イムノクロマトグラフ法によるスクリーニング用キ
ットの一例を示す。

【００２３】便中ヒトラクトフェリン測定用のイムノク
ロマトグラフィー用キットの１態様 （１）ヒトラクトフェリン測定用イムノクロマトグラフ
小片（抗ヒトラクトフェリン抗体、標識化抗ヒトラクト
フェリン抗体、及び陽性コントロール抗体を含む） （２）検体希釈用緩衝液 （３）試料採取用具（例えば、滅菌アルミニウム軸綿
棒、又は滅菌定量キャピラリー） （４）試料希釈用容器（例えば、スプーン付キャップ、
及び検体希釈用緩衝液一定量入りの採便容器）

【００２４】試験工程 （１）便検体を滅菌アルミニウム軸綿棒に十分に含ませ
る。 （２）綿棒を採便容器内の検体希釈用緩衝液中に浸し、
十分に洗い込み、便検体の希釈液を調製する。なお、粘
性便、軟様便、又は固形便等のように、綿棒で採取困難
な検体は、添付の定量キャピラリー又は採便容器のキャ
ップに付属しているスプーンで採取した後、採便容器内
の検体希釈用緩衝液中に浸し、均一に懸濁するまでよく
混和する。 （３）上記便検体の希釈液を添付の検体希釈用緩衝液を
用いて更に希釈し、被検液とする。 （４）被検液（例えば、約２００μｌ）をとり、イムノ
クロマトグラフ小片先端の吸水パッドを浸し、所定時間
（例えば、１０分間）静置した後、イムノクロマトグラ
フ小片の「ヒトラクトフェリン検出ゾーン」及び「陽性
コントロールゾーン」の着色の有無により判定する。例
えば、金コロイドを標識物として用いた場合には、以下
の表１の基準に従い判定する。

【００２５】

【表１】 ヒトラクトフェリン検出ゾーン 陽性コントロールゾーン 判 定 赤紫 〜 紫色 赤紫 〜 紫色 陽 性 無 色 赤紫 〜 紫色 陰 性 赤紫 〜 紫色 無 色 再試験 無 色 無 色 再試験 尿検体についても、希釈率を適宜変更して、前記と同様
の工程によって、ラクトフェリンを分析することができ
る。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例において、ヒトラクトフェリンをｈＬ
Ｆと称することがある。実施例１：ウサギポリクローナル抗ヒトラクトフェリン
抗体の作製 免疫原として、ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ製；Ｌ
−０５２０）（４ｍｇ／ｍｌ）の生理食塩水溶液５００
μｌを等量のフロイント完全アジュバント（ヤトロン
製）と十分に混合し、日本白色種ウサギ（１４週齢；
雌）に対して皮下に初回免疫を行った。４週間後、ヒト
ラクトフェリン（１ｍｇ／ｍｌ）の生理食塩水溶液５０
０μｌを等量のフロインド不完全アジュバント（和光純
薬工業製）と十分に混合し、上記ウサギに対して皮下に
追加免疫を行った。更に４週間後、追加免疫と同様の方
法で最終免疫を行った。最終免疫から２週間後に採血を
行い、抗血清を回収した。この抗血清に対して３３％飽
和硫安塩析を行って、ＩｇＧ粗画分を得た後、このＩｇ
Ｇ粗画分を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再
溶解し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムに負荷
した。ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムからの素
通り溶出画分を回収した後、限外濾過式タンパク質濃縮
装置（分子量カットオフ＝３００００）で濃縮し、ウサ
ギポリクローナル抗ｈＬＦ抗体とし、−４０℃下で保存
した。

【００２７】便検体約２０ｍｇを精密に量り取り、検体
希釈用緩衝液〔０．０７％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）、０．０７％ＣＨＡＰＳ（同仁
化学製）、０．０７％ＢＩＧＣＨＡＰ（同仁化学製）、
０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂ．製）、及び０．５％牛血清アルブミン（Ｓｉｇ
ｍａ製）を含むホウ酸塩緩衝液；ｐＨ８．２〕を便の希
釈倍率が１００倍となるように正確に加えた。便検体が
均一に分散するまで超音波処理をした後、綿栓濾過し
た。濾液を１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して得た
上清をＥＬＩＳＡ測定用被検液とした。便中ｈＬＦ量が
多い検体は、検体希釈用緩衝液で更に適宜希釈し、測定
に用いた。

【００２８】実施例２：モノクローナル抗体の作製法 （１）ヒトラクトフェリン（Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ製；Ｎｏ．２７４２２）を２ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で生理食塩水に溶かし、免疫用抗原溶液とし
た。また、ヒトラクトフェリン（Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ製；Ｎｏ．２７４２２；鉄非結合
型）、ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ製；Ｌ−０５２
０；鉄部分飽和型）、及びヒトラクトフェリン（Ｓｉｇ
ｍａ製；Ｌ−３７７０；鉄飽和型）を各々１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ
９．６）に溶かし、分析用抗原溶液とした。免疫用抗原
溶液１００μｌに同量のフロインド完全アジュバントを
加え、充分に混合して均質のゾルを調製した。このゾル
１００μｌを雌マウス（５週齢；ＢａＬＢ／ｃ）の皮下
に投与した。４週間後、免疫用抗原溶液を生理食塩水で
４倍希釈した希釈液１００μｌに同量のフロインド不完
全アジュバントを加え、充分に混合して均質のゾルを調
製した。このゾル１００μｌを上記雌マウスの皮下に投
与した。更に４週間後、免疫用抗原溶液を生理食塩水で
４倍希釈した希釈液１００μｌに同量のフロインド不完
全アジュバントを加え、充分に混合して均質のゾルを調
製した。このゾル１００μｌを上記雌マウスに腹腔内投
与した。

【００２９】血清中の抗ヒトラクトフェリン抗体価の上
昇したマウスの脾臓を摘出し、イスコフ改変ダルベッコ
培地により、シャーレ内で摘出脾臓を３回洗浄した後、
ハサミで切れ目を入れてから、絞り出すように単細胞を
取り出して懸濁液を調製した。単細胞懸濁液をメッシュ
で濾過して大きな固形物を除いた。得られた濾液に、マ
ウスのミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３を細胞数の比で５：１（脾細胞：ミエローマ細胞）に
なるように混ぜ、遠心処理（１０００ｒｐｍ、５分間）
して細胞を集めた。次に、遠心管を指で弾いて沈渣を攪
拌してから３７℃に暖めておいたポリエチレングリコー
ル（分子量１，５００）溶液を、遠心管を回転させなが
ら１分間かけて徐々に加えた。室温下で１分間静置した
後、前記のイスコフ改変ダルベッコ培地５ｍｌを５分間
かけて徐々に加えた後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１ｍｌ
をすばやく加え、細胞融合を停止した。そして前記のイ
スコフ改変ダルベッコ培地４０ｍｌを追加して、室温下
で１０分間静置した後、遠心処理した。得られた細胞を
細胞数が２×１０⁶ 個／ｍｌとなるように１０％ＦＢ
Ｓ、ヒポキサンチン、及びチミジンを含むイスコフ改変
ダルベッコ培地（ＨＴ培地）に懸濁した。この細胞懸濁
液を９６ウェルプラスチックプレートに１００μｌ／ウ
ェルずつ分注して、３７℃にて、５％二酸化炭素及び９
５％加湿空気の条件下で培養を開始した。２４時間後
に、アミノプテリン加ＨＴ培地（ＨＡＴ培地）を１５０
μｌ／ウェルずつ分注し、更に１０〜１４日間同条件下
で継続培養した。培養液中の抗ヒトラクトフェリン抗体
活性を調べ、目的としている抗体を産生しているウェル
の細胞について９６ウェルプラスチックプレートでＨＴ
培地を用い、限界希釈法によりハイブリドーマのクロー
ニングを行った。クローニングの結果、抗ヒトラクトフ
ェリン抗体を産生しているハイブリドーマ９株を得た。

【００３０】ハイブリドーマ９株の各々をペニシリン、
ストレプトマイシン及びファンギソンを各々２．５μｇ
／ｍｌずつ含む組織培養用無血清培地セルグロッサーＨ
（ハイブリドーマ用；住友製薬製）で培養し、培養液を
得た。培養液を３３％硫安分画し、得られたモノクロー
ナル抗体を５０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４）（以下、ＰＢＳという）に溶かして透析し、抗体を
得た。

【００３１】（２）抗体の選定 上記３種類の分析用抗原溶液をマイクロプレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ製；Ｎｏ．３５９０）に５０μｌ／ウェルずつ
分注し、４℃下で一夜静置して抗原を固相化した。各ウ
ェルをホウ酸塩緩衝生理食塩液（ｐＨ８．２）（以下、
ＢＢＳという）で２回洗浄した後、ＢＢＳに溶かしたゼ
ラチン溶液（１％）を２５０μｌ／ウェルの量で各ウェ
ルに分注し、３７℃下で１時間保温してブロッキング
し、ＢＢＳで５回洗浄した。前記実施例１で調製したウ
サギポリクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体及び前記
実施例２（１）で調製したマウスモノクローナル抗ヒト
ラクトフェリン抗体を、０．１％ゼラチン及び０．１％
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名
＝Ｔｗｅｅｎ２０）を含むＰＢＳに濃度１．０ｍｇ〜６
８６ｐｇ／ｍｌの範囲で順次希釈した希釈液を５０μｌ
／ウェルの量で各ウェルに分注し、３７℃下で１時間反
応させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗
浄した。ビオチン標識プロテインＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
製；ＲＰＮ１０１２）又は、ビオチン標識抗マウスＩｇ
Ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製；ＲＰＮ１１７７）を、０．１
％ゼラチン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
１０００倍希釈した希釈液を５０μｌ／ウェルの量で各
ウェルに分注し、３７℃下で１時間反応させた後、０．
１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。

【００３２】アルカリホスファターゼ標識アビジン（Ｄ
ＡＫＯ製；Ｄ３６５）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＢＢＳで１０００倍希釈した希釈液を５０μｌ／ウェ
ルの量で各ウェルに分注し、３７℃下で３０分間反応さ
せた後、ＢＢＳで５回洗浄した。次いで、０．００５％
塩化マグネシウムを含む９．７％ジエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ９．８）に、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナ
トリウム六水和物を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした溶液
を、基質溶液として、５０μｌ／ウェルの量で各ウェル
に分注し、室温下で１０分間静置し、酵素反応させた
後、４Ｍ水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ／ウェルの量
で各ウェルに分注し、反応を止めた。反応液の吸光度を
波長４０５ｎｍにて分光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製；ＥＬ３１２ｅ型）で測定し、シ
グモイド結合曲線を作製した。結果を図２及び図３に示
す。その結果、３種類の分析用抗原に対するシグモイド
結合曲線がほぼ重なる（即ち、鉄飽和度の異なる３種類
のヒトラクトフェリンに対する結合能が同等）抗体とし
て、ウサギポリクローナル抗体（Ｈ１５抗体）、及びマ
ウスモノクローナル抗体（１５Ｇ１１−０４、１７Ｂ０
４−０８、１７Ｇ０５−１０、及び３２Ｄ０１−１０抗
体）、ならびにそれらのモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ４株（１５Ｇ１１−０４、１７Ｂ０４−
０８、１７Ｇ０５−１０、及び３２Ｄ０１−１０）を得
た。

【００３３】図２において、○は鉄非結合型ヒトラクト
フェリン（ａｐｏ−ｈＬＦ；Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ製；Ｎｏ．２７４２２）に対する反応
性、●は鉄部分飽和型ヒトラクトフェリン（ｐｓａｔ−
ｈＬＦ；Ｓｉｇｍａ製；Ｌ−０５２０）に対する反応
性、そして□は鉄飽和型ヒトラクトフェリン（ｈｏｌｏ
−ｈＬＦ；Ｓｉｇｍａ製；Ｌ−３７７０）に対する反応
性を示す。図３において、○は鉄非結合型ヒトラクトフ
ェリン（ａｐｏ−ｈＬＦ；Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ製；Ｎｏ．２７４２２）に対する反応
性、□は鉄部分飽和型ヒトラクトフェリン（ｐｓａｔ−
ｈＬＦ；Ｓｉｇｍａ製；Ｌ−０５２０）に対する反応
性、そして△は鉄飽和型ヒトラクトフェリン（ｈｏｌｏ
−ｈＬＦ；Ｓｉｇｍａ製；Ｌ−３７７０）に対する反応
性を示す。

【００３４】実施例３：ヒトラクトフェリンＥＬＩＳＡ
測定法 マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ製；Ｎｏ．３５９０）
の各ウェルに、Ｈ１５抗体溶液（１０μｇ／ｍｌ；０．
０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液；ｐＨ９．６）を５０μ
ｌずつ分注し、４℃下で一夜保存した後、ＢＢＳで３回
洗浄した。１％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．
製；ＥＩＡ ｐｕｒｉｔｙ）を含むＰＢＳを各ウェルに
２５０μｌずつ分注し、３７℃下で１時間保温してブロ
ッキングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
５回洗浄した。検体希釈用緩衝液（０．０７％Ｚｗｉｔ
ｔｅｒｇｅｎｔ、０．０７％ＣＨＡＰＳ、０．０７％Ｂ
ＩＧＣＨＡＰ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、検
体及び０．５％牛血清アルブミンを含むホウ酸塩緩衝
液；ｐＨ８．２）で希釈したヒトラクトフェリン標準
品、便検体又は尿検体を各ウェルに５０μｌずつ加え、
３７℃下で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで５回洗浄した。

【００３５】予め、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ製；
ＲＰＮ２２０３）を用いてビオチン標識したＨ１５抗体
溶液（２μｇ／ｍｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．
１％ゼラチンを含むＰＢＳ）を各ウェルに５０μｌずつ
分注し、３７℃で１時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。アルカリホスフ
ァターゼ標識アビジン（ＤＡＫＯ製；Ｄ３６５）を、
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ゼラチンを含むＰ
ＢＳで１０００倍に希釈した希釈液を各ウェルに５０μ
ｌずつ分注し、３７℃下で３０分間反応させた後、ＢＢ
Ｓで５回洗浄した。ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリ
ウム六水和物溶液（１０ｍｇ／ｍｌ；０．００５％Ｍｇ
Ｃｌ₂ を含む９．７ｖ／ｖ％ジエタノールアミン緩衝
液；ｐＨ９．８）を各ウェルに５０μｌずつ分注した。
室温下で１０分間酵素反応させ、４ＭＮａＯＨ溶液を各
ウェルに５０μｌずつ分注して酵素反応を停止させた。
最後に、各ウェルの黄色の呈色をマイクロプレート用分
光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
製；ＥＬ３１２ｅ型）を用いて、４０５ｎｍの波長光で
吸光度を測定した。検量線から便又は尿中のヒトラクト
フェリン濃度を算出した。

【００３６】図４は、ＥＬＩＳＡによるヒトラクトフェ
リンの標準曲線を示したものである。図５〜図１０は、
便中ヒトラクトフェリンのＥＬＩＳＡ測定の際に用いた
検体希釈用緩衝液に添加した界面活性剤の効果を検討し
た結果を示したものである。すなわち、界面活性剤の組
成の異なる検体希釈用緩衝液で便検体を２０〜１０００
倍希釈した状態でヒトラクトフェリンの標準添加実験を
行った。使用した界面活性剤の種類と濃度〔ＢＢＳ（ｐ
Ｈ８．２）中〕を以下の表２に示す。

【００３７】

【表２】 図 ５及び６ ７及び８ ９及び１０ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ０．１％ ０．１％ ０．０７％ ＣＨＡＰＳ なし ０．１％ ０．０７％ ＢＩＧＣＨＡＰ ０．１％ なし ０．０７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．２％ ０．２％ ０．２％ＢＳＡ ０．５％ ０．５％ ０．５％

【００３８】なお、図５〜図１０において、●は検体希
釈用緩衝液のみの場合を示す。また、図５、図７及び図
９において、○は２０倍希釈便検体、□は５０倍希釈便
検体、そして△は１００倍希釈便検体の場合を示す。更
に、図６、図８及び図１０において、○は２００倍希釈
便検体、□は５００倍希釈便検体、そして△は１０００
倍希釈便検体の場合を示す。図５〜図１０の結果から明
らかなように、０．０７％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、
０．０７％ＣＨＡＰＳ、０．０７％ＢＩＧＣＨＡＰ、
０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び０．５％牛血清
アルブミンを含むＢＢＳを検体希釈用緩衝液として用い
た場合には、便検体中の夾雑物の影響が最も少なくな
り、ヒトラクトフェリンを定量的に測定することができ
た。

【００３９】前記検体希釈用緩衝液を用いて、ヒトラク
トフェリンの便又は尿への添加回収実験を行った結果を
図１１、図１２及び図１３に示す。すなわち、成人健常
人から採取して前記検体希釈用緩衝液で２００倍に希釈
した便検体１（図１１内の○）、成人健常人から採取し
て前記検体希釈用緩衝液で１００倍に希釈した便検体２
（図１１内の□）、及び成人健常人から採取して前記検
体希釈用緩衝液で１００倍に希釈した便検体３（図１１
内の△）のそれぞれについて種々濃度のａｐｏ−ｈＬＦ
標準品を添加し、前記のＥＬＩＳＡ法により各検体につ
き３回測定した。図１１には、平均値（○、□及び△）
と標準偏差

【外１】 とを示す。なお、検体１、検体２及び検体３の直線回帰
式は以下のとおりであった。 検体１：ｙ＝０．９３６ｘ＋５．１５ 検体２：ｙ＝０．８７２ｘ＋１．２８６ 検体３：ｙ＝０．９７６ｘ＋０．８９０ すなわち、３種類の便検体を１００倍又は２００倍希釈
した状態での添加回収率は、８７．２％〜９７．６％で
あった。

【００４０】また、成人健常人から採取した２種類の尿
について、前記検体希釈用緩衝液で５倍に希釈した尿検
体１（図１２内の●）、１０倍に希釈した尿検体２（図
１２内の○）、同様にもう一方の尿を前記検体希釈用緩
衝液で５倍に希釈した尿検体３（図１３内の●）、１０
倍に希釈した尿検体４（図１３内の○）のそれぞれにつ
いて上記と同様に測定を行った。検体１、検体２、検体
３及び検体４の直線回帰式は以下のとおりであった。 検体１：ｙ＝０．９１６ｘ＋７．６５０ 検体２：ｙ＝０．９６５ｘ＋１．８６１ 検体３：ｙ＝１．１３０ｘ＋３．２２７ 検体４：ｙ＝０．９２５ｘ＋３．５１４ すなわち、添加回収率は、９１．６％〜１１３％であっ
た。

【００４１】実施例４：イムノクロマトグラフ法による
ヒトラクトフェリンの測定 本例では、Ｈ１５抗体及び金コロイド標識Ｈ１５抗体、
又は金コロイド標識１７Ｂ０４−０８抗体を用いてヒト
ラクトフェリンイムノクロマトグラフ法を実施した。ナ
イロン６６製メンブレン（Ｐｏｌｅ製；Ｂｉｏｄｙｎｅ
Ｃ、又はＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ；孔径＝３μ
ｍ又は５μｍ）を６ｍｍ×３５ｍｍのサイズに切断し
た。Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｃは、０．５％ジシクロヘキシル
カルボジイミドの塩化メチレン溶液に浸し、室温下で３
０分間反応させ、塩化メチレンで洗浄し、風乾した後に
用いた。また、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣは、その
ままイムノクロマトグラフ用メンブレンとして用いた。
各々のメンブレンの一端から、１５ｍｍ及び２３ｍｍの
位置にＨ１５抗体溶液（１０ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｌ；
ＢＢＳ）、及び陽性コントロール抗体としてヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体溶液（Ｋａｐｐｅｌ製）又はウサギ抗マウ
スＩｇ抗体溶液（ＤＡＫＯ製）（各３ｍｇ／ｍｌ；ＢＢ
Ｓ）を０．５μｌずつ塗布し、室温下で１時間静置し固
相化した。メンブレンを０．５％モノエタノールアミン
のＢＢＳ溶液に浸し、室温下で３０分間反応させブロッ
キングした。メンブレンを０．５％カゼイン（ハマース
テングレード）溶液（０．１Ｍマレイン酸緩衝液；ｐＨ
７．５；０．４５μｍ濾過）に浸し、室温下で３０分間
静置し更にブロッキングした。メンブレンをＰＢＳで２
回、蒸留水（０．４５μｍで濾過したもの）で３回洗浄
し、風乾した後、シリカゲルデシケーター内に保存し、
ヒトラクトフェリンイムノクロマトグラフ法用メンブレ
ンとした。

【００４２】一方、金コロイド液（Ａｍｅｒｓｈａｍ
製；粒径１０ｎｍ；ＲＰＮ４７６）８０ｍｌ、Ｈ１５抗
体溶液（１ｍｇ／ｍｌ）、及び１７Ｂ０４−０８抗体溶
液（１ｍｇ／ｍｌ）各々１０ｍｌを、２ｍＭＮａ₂ Ｂ₄
Ｏ₇ 緩衝液（ｐＨ９．０）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と
称す）３０００ｍｌで４℃下にて一夜透析した。Ｈ１５
抗体溶液及び１７Ｂ０４−０８抗体溶液は１００，００
０×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を１００，０
００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で、各
々１５０μｇ／ｍｌ、及び２４０μｇ／ｍｌとなるよう
に希釈した。金コロイド溶液各々４０ｍｌに希釈したＨ
１５抗体溶液又は１７Ｂ０４−０８抗体溶液４．０ｍｌ
を加え、室温下にて２分間攪拌した。１０％ＢＳＡ溶液
（ｐＨ９．０；０．４５μｍ濾過）４．９ｍｌを加えて
攪拌した後、２〜８℃下にて４５，０００×ｇで３０分
間遠心分離し、上清を除去した。１％ＢＳＡを含む２０
ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０；
０．４５μｍ濾過）（以下、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓと称す）
４０ｍｌを加えて攪拌した後、２〜８℃下にて４５，０
００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更
に、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓ４０ｍｌを加えて攪拌した後、２
〜８℃下にて４５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、
上清を除去した。

【００４３】沈殿した金コロイドを波長５２０ｎｍの吸
光度が２．５となるようＢＳＡ−Ｔｒｉｓで希釈した
後、４℃下に保存し、ヒトラクトフェリンイムノクロマ
トグラフ法用金コロイド標識抗体懸濁液とした。金コロ
イド標識抗体懸濁液は、その５０μｌを吸水パット（Ｐ
ｏｌｅ製；Ｌｏｐｒｏｓｏｒｂ；６ｍｍ×１０ｍｍ）に
塗布した後、風乾し、イムノクロマトグラフ法用吸水パ
ッドとして用いた。上記イムノクロマトグラフ法用メン
ブレンをアクリル樹脂製支持体（１０×５０ｍｍ）に貼
付した後、その一端に上記イムノクロマトグラフ法用吸
水パッドを貼付して、ヒトラクトフェリン測定用イムノ
クロマトグラフキットとした。前記検体希釈用緩衝液で
希釈したヒトラクトフェリン標準品、便又は尿検体各２
００μｌにイムノクロマトグラフキット上の吸水パッド
を浸し、室温下で５〜１０分間静置した。メンブレンの
Ｈ１５抗体を塗布した部分、及び陽性コントロール抗体
を塗布した部分の金コロイドの捕獲に基づく、赤紫−紫
色の着色により、ヒトラクトフェリンの有無を判定し
た。

【００４４】表３は、イムノクロマトグラフ法によるヒ
トラクトフェリン標準溶液測定結果を示したものであ
る。表３において、＋は陽性、−は陰性、±は偽陽性で
あることを示す（以下の表４及び表５も同様）。Ｈ１５
抗体はポリクローナル抗体であるため、抗体過剰領域で
は金コロイドの抗原濃度依存性凝集が起こり、Ｂｉｏｄ
ｙｎｅ Ｃを用いた場合には、その影響で５００μｇ／
ｍｌ以上の検出が不可能であったが、Ｉｍｍｕｎｏｄｙ
ｎｅ ＡＢＣでは、凝集による影響が軽減し、更に、２
０ｎｇ／ｍｌの検出感度が得られた。１７Ｂ０４−０８
抗体を用いた場合は１０ｎｇ／ｍｌの検出感度が得られ
た。

【００４５】表４は、イムノクロマトグラフ法によるヒ
トラクトフェリン標準品の検出感度の調整結果を示した
ものである。金コロイド標識抗体量は一定であっても、
メンブレン上に固相化する抗体濃度を変化させることに
より、ヒトラクトフェリン検出感度を３０〜３００ｎｇ
／ｍｌの範囲で調整することができた。

【００４６】表５は成人健常人血液より分離した白血球
（多核球）の破砕上清中のヒトラクトフェリンのイムノ
クロマトグラフ法による測定結果を示したものである。
白血球数１０⁶ 個がヒトラクトフェリン量４．９μｇに
相当する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６
５、ｐ１８３〜ｐ１９０、１９８３）ことから、ヒト母
乳由来のラクトフェリンを免疫原として作製した抗ヒト
ラクトフェリン抗体を用いた本イムノクロマトグラフ法
により白血球中のヒトラクトフェリンを効率よく測定す
ることができる。

【００４７】表６は、成人健常便及び成人健常起床時初
尿中のヒトラクトフェリン量をＥＬＩＳＡ法により測定
した結果を示したものである。各々、平均値

【外２】 及び標準偏差（ＳＤ）よりカットオフ値

【外３】 を算出すると３９．３μｇ／ｇ便、１６７ｎｇ／ｍｌ尿
となった。従って、例えば感度１０ｎｇ／ｍｌ（メンブ
レン；Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ、固相化Ｈ１５抗
体濃度３ｍｇ／ｍｌ、金コロイド標識抗体；１７Ｂ０４
−０８）のイムノクロマトグラフキットで測定する場
合、便検体は４０００倍、尿検体は１０〜２０倍に希釈
可能である。

【００４８】表７は、細菌感染性下痢患者由来便及び成
人健常便中のヒトラクトフェリンをＥＬＩＳＡ法及びイ
ムノクロマトグラフ法で測定した結果を示したものであ
る。その結果、前者中にはヒトラクトフェリンが多量に
含まれており、イムノクロマトグラフ法では３０検体中
２７検体を検出することができた。一方、成人健常便中
のヒトラクトフェリン量は少量であり、偽陽性結果を生
じた検体は２８検体中２検体であった。

【００４９】表８は、尿路感染症患者由来の尿及び成人
健常起床時初尿中のヒトラクトフェリンをＥＬＩＳＡ法
及びイムノクロマトグラフ法で測定した結果を示したも
のである。その結果、イムノクロマトグラフ法により、
前者全１８検体中１７検体を検出することができた。ま
た、成人健常起床時初尿中で偽陽性結果を生じた検体は
全２３検体中わずか１検体であった。

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】

【表５】

【００５３】

【表６】

【００５４】

【表７】

【００５５】

【表８】

【００５６】

【発明の効果】本発明によれば、便又は尿中の白血球の
顆粒内の鉄結合性タンパク質であるヒトラクトフェリン
を免疫学的に分析することができるので、尿路感染症や
細菌感染性下痢症等の感染症を確実に検出することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種の免疫学的測定方法によるヒトラクトフェ
リンの測定可能濃度範囲を示した説明図である。

【図２】飽和度の異なる３種類のヒトラクトフェリンに
対するポリクローナル抗体Ｈ１５の反応性を示すグラフ
である。

【図３】飽和度の異なる３種類のヒトラクトフェリンに
対する４種のモノクローナル抗体の反応性を示すグラフ
である。

【図４】ＥＬＩＳＡによるヒトラクトフェリンの標準曲
線を示すグラフである。

【図５】２０〜１００倍希釈便検体中のヒトラクトフェ
リンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体希釈用
緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＢＩＧＣＨ
ＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＢＳＡの効果を示
すグラフである。

【図６】２００〜１０００倍希釈便検体中のヒトラクト
フェリンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体希
釈用緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＢＩＧ
ＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＢＳＡの効果
を示すグラフである。

【図７】２０〜１００倍希釈便検体中のヒトラクトフェ
リンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体希釈用
緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＢＳＡの効果を示す
グラフである。

【図８】２００〜１０００倍希釈便検体中のヒトラクト
フェリンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体希
釈用緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＣＨＡ
ＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＢＳＡの効果を示
すグラフである。

【図９】２０〜１００倍希釈便検体中のヒトラクトフェ
リンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体希釈用
緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＣＨＡＰ
Ｓ、ＢＩＧＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＢ
ＳＡの効果を示すグラフである。

【図１０】２００〜１０００倍希釈便検体中のヒトラク
トフェリンに対して、ＥＬＩＳＡ測定の際に用いた検体
希釈用緩衝液に添加したＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＣＨ
ＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及
びＢＳＡの効果を示すグラフである。

【図１１】成人健常便検体に対してヒトラクトフェリン
の添加回収実験を行った結果を示すグラフである。

【図１２】成人健常尿検体に対してヒトラクトフェリン
の添加回収実験を行った結果を示すグラフである。

【図１３】成人健常尿検体に対してヒトラクトフェリン
の添加回収実験を行った結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大田 美佐子 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性
   が影響されない抗ヒトラクトフェリン抗体を用いること
   を特徴とする、便又は尿中のヒトラクトフェリンを免疫
   学的に分析する方法。
2. 【請求項２】 免疫学的方法が、酵素免疫法、イムノク
   ロマトグラフ法、ラテックス凝集法、磁気ビーズ凝集
   法、又は磁気ビーズ酵素免疫法である請求項１に記載の
   分析方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の分析方法によって便又
   は尿中のヒトラクトフェリンを分析することを特徴とす
   る、感染症のスクリーニング方法。
4. 【請求項４】 感染症が尿路感染症又は細菌感染性下痢
   症である請求項３に記載のスクリーニング方法。
5. 【請求項５】 ヒトラクトフェリンの鉄飽和度に反応性
   が影響されない抗ヒトラクトフェリン抗体、ヒトラクト
   フェリンの鉄飽和度に反応性が影響されない標識化抗ヒ
   トラクトフェリン抗体、及び界面活性剤含有検体希釈液
   を含む、感染症のスクリーニング用キット。
6. 【請求項６】 検体希釈液が、界面活性剤として、Ｎ−
   テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１
   −プロパンスルホン酸、３−［（３−コラシドプロピ
   ル）ジメチルアンモニオ］−プロパンスルホン酸、Ｎ，
   Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミ
   ド、及びポリエチレングルコール モノ−ｐ−イソオク
   チルフェニルエーテルを含む請求項５に記載のスクリー
   ニング用キット。
7. 【請求項７】 感染症が尿路感染症又は細菌感染性下痢
   症である請求項５に記載のスクリーニング用キット。