WO2019163922A1 - モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 - Google Patents

モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 Download PDF

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WO2019163922A1
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reaction inhibitor
immunoassay
monoclonal antibody
present
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PCT/JP2019/006663
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Inventor
鈴木　啓太
久彦 岩本
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田中貴金属工業株式会社
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    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody, a nonspecific reaction inhibitor for immunoassay containing the same, an immunochromatographic test strip and an immunochromatographic test kit, and an immunoreaction in the presence of a nonspecific reaction inhibitor. It relates to an immunoassay.
  • An immunoassay method using an antigen-antibody reaction is widely used in clinical tests because it can measure trace components specifically and with high sensitivity.
  • immunoassay methods for example, enzyme immunoassay methods (for example, ELISA method), aggregation methods, immunochromatographic methods, radioimmunoassay methods, turbidimetric methods, and the like are known.
  • the antigen-antibody reaction is a highly specific binding reaction that occurs when an antigen-binding site of an antibody induced to an antigenic determinant has high complementarity with the antigenic determinant.
  • antigen-antibody reactions it is often recognized that non-specific reactions other than the original target specific antigen-antibody reactions occur and the reliability of measured values is impaired.
  • non-specific factor a component that binds to the antibody used for immunoassay
  • a measurement result indicating the presence of the substance to be detected is obtained even though the substance to be detected is not present.
  • non-specific factor is a substance that binds not only to an antibody that specifically reacts with a substance to be detected but also to an antibody that does not react with the substance to be detected.
  • non-specific factors heterophilic antibodies and rheumatoid factors are known.
  • the heterophilic antibody is an antibody against an antibody derived from a non-human animal species present in human blood or the like, including a human antibody (HAMA) against a mouse antibody, a human antibody (HAGA) against a goat antibody, and a human antibody against a sheep antibody. (HASA), and a human antibody (HARA) against a rabbit antibody.
  • HAMA human antibody
  • HASA human antibody
  • HAA human antibody
  • Rheumatoid factor is an antibody against a human antibody present in human blood or the like, and is an autoantibody often found in rheumatoid arthritis patients.
  • non-specificity is obtained by adding an anti-human IgM antibody or anti-human IgG antibody that reacts with an IgM-type or IgG-type natural antibody, which is a non-specific factor present in a sample, to an immunoassay system.
  • An immunological assay that can suppress non-specific reactions caused by factors and accurately measure antigens is disclosed.
  • the conventional method shows a certain effect on suppression of non-specific reaction in the immunoassay method, the effect is not necessarily sufficient, and there is still room for improvement.
  • the effects of the conventionally used non-specific reaction inhibitor are hardly obtained, and there are not a few that cannot suppress the non-specific reaction due to non-specific factors, which is not always satisfactory in practice. .
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that can sufficiently suppress a nonspecific reaction caused by a nonspecific factor, a nonspecific reaction inhibitor for immunoassay containing the same, and the like.
  • the present inventors conducted immunoassay using monoclonal antibodies produced by specific hybridomas among monoclonal antibodies that react with canine IgM, and as a result, sufficiently suppressed nonspecific reactions.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows. 1. A monoclonal antibody against canine IgM produced by the hybridoma with accession number NITE BP-02556. 2. Hybridoma with accession number NITE BP-02556. 3. A non-specific reaction inhibitor for immunoassay containing the monoclonal antibody according to 1 above. 4). 4. The nonspecific reaction inhibitor according to 3 above, wherein the content of the monoclonal antibody is 0.5 ⁇ g or more and 20 ⁇ g or less. 5. 5. The non-specific reaction inhibitor according to 3 or 4 above, wherein the immunoassay is an immunochromatography method. 6). An immunochromatographic test strip comprising the nonspecific reaction inhibitor according to any one of 3 to 5 above. 7).
  • An immunochromatographic test kit comprising the non-specific reaction inhibitor described in any one of 3 to 5 above. 8). 6. An immunoassay method for specifically detecting a substance to be detected in a specimen, wherein an immune reaction is carried out in the presence of the nonspecific reaction inhibitor described in any one of 3 to 5 above. 9. 9. The immunoassay method according to 8, wherein the immunoassay method is an enzyme immunoassay method, an agglutination method, or an immunochromatography method. 10. 9. The immunoassay method according to 8 above, wherein the immunoassay method is an immunochromatographic method.
  • FIG. 1 is a view showing an embodiment of an immunochromatographic test strip containing the nonspecific reaction inhibitor of the present invention.
  • the monoclonal antibody according to one embodiment of the present invention is a monoclonal antibody against canine IgM produced by a hybridoma (Anti-Dog IgM No. 12) having a deposit number of NITE BP-02556.
  • Dog IgM means an IgM type immunoglobulin derived from a dog.
  • the applicant has deposited the above-mentioned hybridoma (Anti-Dog IgM No. 12) obtained by the method shown in the Examples described later in the Patent Microorganism Depositary Center, National Institute of Technology and Evaluation. The contents specifying the deposit are described below.
  • the applicant deposited the hybridoma (Anti-Dog IgM No. 12) under the following conditions.
  • Depositary institution name National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center
  • Contact information Room 2-5-8 Kazusa Kamashiri, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818 Phone number 0438-20 -5580
  • Accession number NITE BP-02556
  • Display for identification: Anti-Dog IgM No. 12 Original deposit date: October 10, 2017
  • the above monoclonal antibody can sufficiently suppress a nonspecific reaction in an immunoassay by using it in a nonspecific reaction inhibitor.
  • the nonspecific reaction inhibitor containing the monoclonal antibody may be composed only of the monoclonal antibody, and contains other components other than the monoclonal antibody as long as the effects of the present invention are not impaired. May be.
  • the other components include phosphates, buffers such as trishydroxymethylaminomethane, preservatives such as sodium azide, and inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride.
  • the form of the nonspecific reaction inhibitor which is one embodiment of the present invention is not particularly limited, and may be a solid or a liquid. In the case of a liquid, it can be prepared by dissolving or suspending the components contained in the nonspecific reaction inhibitor in a solvent.
  • the solvent include water, organic solvents such as glycerol, and mixed solvents thereof.
  • the content of the above-mentioned monoclonal antibody in the non-specific reaction inhibitor which is one embodiment of the present invention is not particularly limited, and is based on the type of specimen, the quantity of specimen, the measurement conditions of the immunoassay, and the like. It can be adjusted appropriately.
  • the content of the above-mentioned monoclonal antibody in the nonspecific reaction inhibitor used per specimen is preferably 0.5 ⁇ g or more and 20 ⁇ g or less, more preferably 1 ⁇ g or more and 15 ⁇ g or less, from the viewpoint of the effect of suppressing the nonspecific reaction. 2 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less is more preferable.
  • the immunoassay method to which the non-specific reaction inhibitor according to one embodiment of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a method for measuring a substance to be detected in a specimen using an immune reaction, and the effect thereof is not limited. It can be demonstrated.
  • an enzyme immunoassay for example, ELISA method
  • an agglutination method for example, an immunochromatography method, a radioimmunoassay method, a turbidimetric method and the like can be mentioned
  • an enzyme immunoassay method, an agglutination method or an immunochromatography method is preferable.
  • the non-specific reaction inhibitor which is one embodiment of the present invention is particularly useful in an immunochromatographic method that is easy to handle because of the ease of sampling.
  • the immunochromatographic test strip which is one embodiment of the present invention contains the above-mentioned non-specific reaction inhibitor.
  • the immunochromatographic test strip according to one embodiment of the present invention is used for, for example, determining the presence or absence of a detected substance or measuring the concentration of a detected substance using an immunochromatographic method. Can do.
  • the immunochromatographic test strip that is one embodiment of the present invention is not particularly limited except that it contains the above-mentioned nonspecific reaction inhibitor, and has the same configuration as a known immunochromatographic test strip. Can do.
  • the nonspecific reaction inhibitor is included in a member that constitutes an immunochromatographic test strip in a member in which a liquid phase containing a specimen develops by capillary action in a manner that can participate in an immune reaction. Just do it. By doing in this way, an immune reaction can be performed in the presence of a non-specific reaction inhibitor, and the non-specific reaction can be sufficiently suppressed.
  • an immunochromatographic test strip of the present invention will be described with reference to the drawings.
  • the immunochromatographic test strip of the present invention is not limited to the following embodiment.
  • FIG. 1 is provided with a sample pad 1, a conjugate pad 2, a membrane pad 3, an absorbent pad 5, and a backing sheet 6.
  • the immunochromatographic test strip shown in FIG. 1 is provided with a sample pad 1, a conjugate pad 2, a membrane pad 3, an absorbent pad 5, and a backing sheet 6.
  • the sample pad 1 is a member provided for adding a sample including a specimen and moving the sample downstream by capillary action.
  • known materials can be used. For example, ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria, and alumina, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, Examples include nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, and cotton.
  • the size and shape of the sample pad 1 are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the sample pad 1 can also have the function of a conjugate pad described later.
  • the conjugate pad 2 is a member containing a labeling reagent in which an antibody or antigen that specifically reacts with a substance to be detected in a specimen is labeled with a labeling substance.
  • a complex of the substance to be detected and the labeling reagent is formed.
  • a known material can be used. For example, ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria, and alumina, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon , Nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, cotton and the like.
  • the size and shape of the conjugate pad 2 are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the labeling substance is not particularly limited, and for example, known substances such as metal nanoparticles such as gold, silver and platinum, and latex particles can be used.
  • the average particle diameter of the metal nanoparticles is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 150 nm, more preferably 20 nm to 100 nm.
  • the average particle size of the latex particles is not particularly limited, but is preferably 100 nm to 500 nm, more preferably 100 nm to 250 nm. Since the presence or absence of the substance to be detected in the specimen can be visually determined, the labeling substance is preferably gold nanoparticles.
  • the antibody or antigen in the labeling reagent a commercially available antibody or antigen can be used as long as it can specifically bind to the substance to be detected in the sample. Can be used.
  • an antibody that can specifically bind to it is preferable.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Such an antibody can be produced by a known method, for example, by sensitizing an animal with an antigen as a substance to be detected. Specific examples of animal species include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, dogs, goats, sheep, pigs, horses, cows and humans.
  • the content of the antibody or antigen in the labeling reagent is not particularly limited, but is preferably 0.01 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less, more preferably 0.02 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less, and still more preferably 0.8 per test strip. It is 02 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less.
  • the membrane pad 3 is a member having a detection unit 4 for determining the presence or absence of a substance to be detected or measuring the concentration of the substance to be detected by detecting the substance to be detected.
  • a capture reagent including an antibody or an antigen for capturing the substance to be detected is fixed to the detection unit 4.
  • the detection unit 4 when a detected substance is contained in the sample, a complex composed of a labeling reagent, a detected substance and a capture reagent is formed and colored, and when the detected substance is not contained in the sample, the labeled reagent Since no complex consisting of the substance to be detected and the capture reagent is formed, no color develops.
  • a known material can be used as a material of the membrane pad 3.
  • ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria, and alumina, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, Examples include nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, and cotton.
  • the size and shape of the membrane pad 3 are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the antibody or antigen used for the capture reagent may be the same antibody or antigen as the antibody or antigen contained in the labeling reagent, or may be a different antibody or antigen.
  • the antibody or antigen used for the capture reagent a commercially available antibody or antigen can be used as long as it can specifically bind to the substance to be detected in the specimen, and is prepared as necessary. Can be used.
  • an antibody that can specifically bind to it is preferable.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Such an antibody can be produced by a known method by sensitizing an animal with an antigen as a substance to be detected. Specific examples of animal species include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, dogs, goats, sheep, pigs, horses, cows and humans.
  • the content of the antibody or antigen used for the capture reagent is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less, more preferably 0.2 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less, more preferably 0 per test strip. .2 ⁇ g or more and 4 ⁇ g or less.
  • the shape of the detection unit is not particularly limited, and examples thereof include a linear shape and a circular shape. From the viewpoint of visibility and detection efficiency, a linear shape is preferable.
  • the membrane pad 3 can be subjected to a blocking treatment by a known method as necessary in order to prevent the accuracy of analysis from being lowered due to non-specific adsorption.
  • proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein, and gelatin are preferably used for the blocking treatment.
  • a surfactant such as Tween (registered trademark) 20, Triton X-100 (registered trademark), and SDS may be washed in combination with one or more if necessary.
  • the absorption pad 5 is a member that absorbs surplus samples and the like that have passed through the membrane pad 3.
  • a material of the absorbent pad a known material can be used, for example, ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria, and alumina, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, nitro Examples thereof include cellulose, cellulose acetate, glass fiber, and cotton.
  • the size and shape of the absorbent pad 5 are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the backing sheet 6 is a member used as a support for fixing each member such as the sample pad 1, the conjugate pad 2, the membrane pad 3, and the absorbent pad 5.
  • the material of the backing sheet is not particularly limited. For example, various conventionally known materials that can be made impermeable and impermeable to the sample by the adhesive can be used. Further, the size and shape of the backing sheet 6 are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the non-specific reaction inhibitor is contained in at least one of the sample pad 1, the conjugate pad 2, and the membrane pad 3.
  • the content of the above-described monoclonal antibody in the non-specific reaction inhibitor contained in the immunochromatographic test strip which is one embodiment of the present invention is not particularly limited. From the viewpoint of the effect of suppressing nonspecific reaction, it is preferably 0.5 ⁇ g or more and 20 ⁇ g or less, more preferably 1 ⁇ g or more and 15 ⁇ g or less, and further preferably 2 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less per test strip. By being in the above range, nonspecific reaction can be strongly suppressed.
  • the test kit refers to a kit including two or more items such as reagents necessary for immunoassay.
  • the immunochromatographic test kit according to one embodiment of the present invention is not particularly limited except that it contains the above-mentioned non-specific reaction inhibitor, and may have the same configuration as a known immunochromatographic test kit. it can.
  • the non-specific reaction inhibitor may be contained in the immunochromatographic test kit in such a manner that it can participate in an immune reaction.
  • the nonspecific reaction inhibitor may be contained independently as a reagent, or may be contained in advance in a reagent such as a specimen diluent used for immunoassay, a test strip, or the like.
  • an immunochromatographic test kit includes reagents necessary for immunoassay in addition to a test strip.
  • the test strip is not particularly limited, and for example, a test strip composed of the above-described sample pad, conjugate pad, membrane pad, absorption pad, backing sheet or the like can be used.
  • the reagent necessary for the immunoassay is not particularly limited, and examples thereof include a sample diluent and a developing solution.
  • a non-specific reaction inhibitor is contained in at least one of the test strip and the reagent. More specifically, a nonspecific reaction inhibitor is contained in at least one of the sample pad, the conjugate pad, the membrane pad, and the reagent.
  • the content of the above-described monoclonal antibody in the non-specific reaction inhibitor contained in the immunochromatographic test kit which is one embodiment of the present invention is not particularly limited. From the viewpoint of the effect of suppressing non-specific reaction, it is preferably 0.5 ⁇ g or more and 20 ⁇ g or less, more preferably 1 ⁇ g or more and 15 ⁇ g or less, and further preferably 2 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less per test kit. By being the said range, a nonspecific reaction can be suppressed efficiently, without increasing the viscosity of a solution.
  • the immunoassay method according to one embodiment of the present invention is one in which an immune reaction is performed in the presence of the above-mentioned non-specific reaction inhibitor.
  • the immunoassay method which is one embodiment of the present invention can suppress non-specific reactions other than the originally intended immune reaction by performing an immune reaction in the presence of a non-specific reaction inhibitor.
  • the immunoassay method according to one embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it is a method for quantitatively or qualitatively measuring a substance to be detected in a specimen using an immune reaction.
  • An enzyme immunoassay for example, ELISA method
  • an agglutination method for example, an immunochromatography method, a radioimmunoassay method, a turbidimetric method and the like can be mentioned, and an enzyme immunoassay method, an agglutination method or an immunochromatography method is preferable.
  • the immunoassay method according to one embodiment of the present invention is particularly useful in an immunochromatographic method that is easy to handle because of the ease of collecting a specimen.
  • Specimens used in the immunoassay method according to one embodiment of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include serum, plasma, whole blood, urine, saliva, nasal discharge and the like.
  • Examples of the substance to be detected that can be measured in the immunoassay method according to one embodiment of the present invention include viruses, bacteria, parasites, metabolites, and the like contained in a specimen. And proteins, peptides, polysaccharides, and complex carbohydrates.
  • an antigen contained in a trace amount in a specimen is preferable. This is because the smaller the concentration of the antigen contained in the specimen, the greater the influence of the non-specific reaction, so the non-specific reaction inhibitor which is one embodiment of the present invention is useful. .
  • the immune reaction in the present invention is not particularly limited as long as it is performed in the presence of a non-specific reaction inhibitor, and can be performed according to a conventional method.
  • the immune reaction can be carried out by bringing the sample and a nonspecific reaction inhibitor into contact with each other in advance before the immune reaction, and then contacting with an antibody or antigen that can bind to the substance to be detected in the sample. Further, before the immune reaction, an antibody or antigen that can bind to the substance to be detected in the specimen is brought into contact with the nonspecific reaction inhibitor, and then the immune reaction can be carried out by contacting with the specimen.
  • the content of the above-mentioned monoclonal antibody in the non-specific reaction inhibitor used in the present invention is not particularly limited, and is appropriately adjusted based on the type of specimen, the quantity of specimen, the measurement conditions of the immunoassay, and the like. be able to.
  • the content of the above-mentioned monoclonal antibody in the nonspecific reaction inhibitor used per specimen is preferably 0.5 ⁇ g or more and 20 ⁇ g or less, more preferably 1 ⁇ g or more and 15 ⁇ g or less, from the viewpoint of the effect of suppressing the nonspecific reaction. 2 ⁇ g or more and 10 ⁇ g or less is more preferable.
  • the immunoassay method is an immunochromatography method
  • a sample obtained by adding a nonspecific reaction inhibitor in advance to a specimen containing an antigen is added to a solid phase
  • Antigens can be detected by forming immune complexes in the phase.
  • the antigen can be detected by developing a specimen containing the antigen on a solid phase such as a sample pad or conjugate pad to which a nonspecific reaction inhibitor has been added in advance, and forming an immune complex in the solid phase.
  • the immunoassay method according to one embodiment of the present invention is an enzyme immunoassay method (for example, ELISA method), for example, a nonspecific inhibitor is added in advance to a specimen containing an antigen, and then, according to a conventional method By performing an antigen-antibody reaction, the concentration of the antigen can be measured.
  • an enzyme immunoassay method for example, ELISA method
  • a nonspecific inhibitor is added in advance to a specimen containing an antigen, and then, according to a conventional method
  • the concentration of the antigen can be measured.
  • the immunoassay method according to one embodiment of the present invention is an agglutination method
  • a non-specific inhibitor may be added in advance to a specimen containing an antigen.
  • it may be added to the latex turbid liquid.
  • the latex agglutination turbidimetry can be performed by a conventional method.
  • a monoclonal antibody of an anti-canine IgM antibody was prepared according to a conventional method using canine IgM (manufactured by Rockland, product name DOG IgM Whole molecule) as an immunogen as follows. 100 ⁇ g of the above dog IgM and an equal amount of Advertant Complete Freund (Difco) were mixed, and mice (BALB / c, 5 weeks old, Japan SLC) were immunized three times, and the spleen cells were used for cell fusion. For cell fusion, Sp2 / 0-Ag14 cells (Shulman et al., Nature, 276, 269-270, 1978), which are mouse myeloma cells, were used.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • JRH fetal bovine serum
  • the fused cells are cultured in HAT-DMEM [serum-containing DMEM containing 0.1 mM sodium hypoxanthine, 0.4 ⁇ M aminopterine and 0.016 mM thymidine (Gibco)], and the antibody in the culture supernatant is measured by enzyme immunoassay (ELISA method). Production was confirmed.
  • Antibody-positive cells were cultured in HT-DMEM [serum-added DMEM containing 0.1 mM sodium hypoxanthine and 0.16 mM thymidine], and further cultured in serum-added DMEM.
  • mice BALB / c, Retire, Japan SLC
  • 2,6,10,14-tetramethylpentadecane Sigma
  • This ascites was applied to a protein G column to purify the monoclonal antibody.
  • 4 types of monoclonal antibodies No. 12, 32, 70, 80
  • IgG type Of these, No. 12 is a monoclonal antibody against canine IgM, which is produced by the hybridoma having the aforementioned accession number NITE BP-02556.
  • Non-specific reaction inhibition test Using human serum exhibiting a non-specific reaction as a specimen, the non-specific reaction inhibitory effect of the immunoassay using the prepared monoclonal antibody and the conventionally known heterophilic blocking reagent HBR was evaluated. Specifically, as shown in FIG. 1, a test strip in which a membrane pad 3 having a detection unit 4, a sample pad 1, a conjugate pad 2, and an absorption pad 5 are formed on a backing sheet 6, and A developed sample was prepared as follows and measured by an immunochromatographic method to evaluate a nonspecific reaction inhibitory effect.
  • sample pad As a sample pad, the nonwoven fabric (Millipore company make: 300 mm x 30 mm) which consists of glass fiber was used.
  • conjugate pad Gold colloid suspension manufactured by Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd .: LC 40 nm
  • LC 40 nm conjugate pad Gold colloid suspension
  • 0.1 ml of anti-dika virus NS1 antibody product name: Anti-Zika virus NS1 Antibody, manufactured by Aaltobioreagent was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • a phosphate buffer pH 7.4 containing 1% by mass of bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was further allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, after sufficiently stirring, centrifugation was performed at 8000 ⁇ g for 15 minutes to remove the supernatant, and 0.1 ml of a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 1% by mass of BSA was added.
  • the labeling reagent was produced by the above procedure.
  • an immunochromatographic dispenser “XYZ3050” manufactured by BIODOT
  • a goat-derived antiserum having a wide affinity for the gold nanoparticle labeling substance and phosphate buffer solution (pH 7.4) downstream of the detection unit in order to confirm the presence / absence and development speed of the gold nanoparticle labeling reagent was applied to the control site (control line). Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes and dried overnight at room temperature.
  • test strip A sample pad, a conjugate pad, and an absorption pad made of a nonwoven fabric made of glass fiber were sequentially bonded to a membrane pad having a detection part. And it cut
  • the length of the conjugate pad in the sample development direction was 12 mm.
  • the human serum used as a specimen is a specimen in which a non-specific reaction occurs.
  • the nonspecific reaction could be suppressed notably.

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Abstract

本発明は、非特異因子による非特異反応を十分に抑制することができるモノクローナル抗体、およびそれを含有する非特異反応抑制剤等を提供することを課題とする。本発明は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマにより産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体に関する。

Description

モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤
　本発明は、モノクローナル抗体、それを含有する免疫測定法用の非特異反応抑制剤、イムノクロマトグラフ用テストストリップ及びイムノクロマトグラフ用テストキット、並びに、非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる免疫測定法に関するものである。
　抗原抗体反応を利用した免疫測定法は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できることから、臨床検査に広く利用されている。そのような免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が知られている。
　抗原抗体反応は、ある抗原決定基に対して誘導された抗体の抗原結合部位が、その抗原決定基と高い相補性をもつことにより生ずる、特異性の高い結合反応である。ところが、抗原抗体反応を利用した免疫測定においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応が生じ、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。
　このような現象が起こる原因の１つとして、被検出物質（抗原）以外の成分であるにもかかわらず、免疫測定に用いる抗体に結合する成分（以下、非特異因子という）が検体中に存在することが挙げられる。検体中に非特異因子が存在すると、被検出物質が存在しないにもかかわらず、被検出物質が存在することを示す測定結果が得られることとなる。
　このような非特異因子は、被検出物質と特異的に反応する抗体のみならず、被検出物質と反応しない抗体とも結合する物質である。非特異因子としては、異好性抗体やリウマトイド因子が知られている。
　異好性抗体は、ヒト血液等に存在するヒト以外の動物種由来の抗体に対する抗体であり、マウス抗体に対するヒト抗体（ＨＡＭＡ）をはじめ、ヤギ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＧＡ）、ヒツジ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＳＡ）、及びウサギ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＲＡ）等がある。
　リウマトイド因子は、ヒト血液等に存在するヒトの抗体に対する抗体であり、関節リウマチ患者に多く見られる自己抗体である。
　さらに、上記異好性抗体やリウマトイド因子以外にも、いまだ成分が明らかになっていない非特異因子が多く存在するといわれている。
　検体中の非特異因子の存在は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できるという免疫測定法の利点を損ない、臨床検査分野においては、患者などの疾病の診断を誤らせることにもつながる重大な問題である。そのため、従来、非特異因子による非特異反応を抑制し正しい測定値を得るための様々な試みが行われてきた。
　特許文献１には、試料中に存在する非特異因子であるＩｇＭ型またはＩｇＧ型の自然抗体に対して反応する抗ヒトＩｇＭ抗体や抗ヒトＩｇＧ抗体を免疫測定系に添加することにより、非特異因子による非特異反応を抑制し、抗原を正確に測定することができる、免疫学的測定法が開示されている。
日本国特開平１１－２８７８０１号公報
　しかしながら、従来の方法では、免疫測定法における非特異反応の抑制にある程度の効果を示すものの、必ずしもその効果は十分とは言えず、いまだ改良の余地があった。また、検体によっては、従来用いられてきた非特異反応抑制剤による効果がほとんど得られず、非特異因子による非特異反応を抑制できないものも少なからず存在し、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
　したがって、本発明では、非特異因子による非特異反応を十分に抑制することができるモノクローナル抗体、およびそれを含有する免疫測定法用の非特異反応抑制剤等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イヌＩｇＭに反応するモノクローナル抗体のうち、特定のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いて免疫測定法を実施した結果、非特異反応を十分に抑制することができることを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は以下の通りである。
１．受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマにより産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体。
２．受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマ。
３．前記１に記載のモノクローナル抗体を含有する、免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
４．前記モノクローナル抗体の含有量が０．５μｇ以上２０μｇ以下である、前記３に記載の非特異反応抑制剤。
５．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記３または４に記載の非特異反応抑制剤。
６．前記３～５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
７．前記３～５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
８．検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、前記３～５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
９．前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
１０．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
　本発明のモノクローナル抗体、およびそれを含有する非特異反応抑制剤を用いることにより、免疫測定法における非特異反応を抑制することができる。
図１は、本発明の非特異反応抑制剤を含有するイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態を示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
　本発明の一実施態様であるモノクローナル抗体は、受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６であるハイブリドーマ（Ａｎｔｉ－Ｄｏｇ　ＩｇＭ　Ｎｏ．１２）により産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体である。イヌＩｇＭとはイヌに由来するＩｇＭ型の免疫グロブリンを意味する。
　本出願人は、後述する実施例に示す方法により得られた上記ハイブリドーマ（Ａｎｔｉ－Ｄｏｇ　ＩｇＭ　Ｎｏ．１２）を独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託した。以下に寄託を特定する内容を記載する。
　本出願人は、上記ハイブリドーマ（Ａｎｔｉ－Ｄｏｇ　ＩｇＭ　Ｎｏ．１２）を下記の条件で寄託した。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室　電話番号０４３８－２０－５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６
（４）識別のための表示：Ａｎｔｉ－Ｄｏｇ　ＩｇＭ　Ｎｏ．１２
（５）原寄託日：２０１７年１０月１０日
　上記モノクローナル抗体は、非特異反応抑制剤に含有させて用いることにより、免疫測定法における非特異反応を十分に抑制することができる。
　上記モノクローナル抗体を含有する非特異反応抑制剤は、上記モノクローナル抗体のみからなるものであってもよく、本発明の効果を妨げない範囲で上述のモノクローナル抗体以外の他の成分を含有するものであってもよい。他の成分としては、例えば、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等の緩衝剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム、および塩化カリウム等の無機塩等が挙げられる。
　本発明の一実施態様である非特異反応抑制剤の形態は、特に限定されるものではなく、固体であってもよく、液体であってもよい。液体の場合は、溶媒中に非特異反応抑制剤が含有する成分を溶解又は懸濁させることで調製することができる。溶媒としては、例えば、水、グリセロール等の有機溶媒、これらの混合溶媒等が挙げられる。
　本発明の一実施態様である非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、特に限定されるものではなく、検体の種類、検体の量、免疫測定法の測定条件等に基づいて適宜調整することができる。例えば、１検体あたりに使用する非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、非特異反応の抑制効果の観点から、０．５μｇ以上２０μｇ以下が好ましく、１μｇ以上１５μｇ以下がより好ましく、２μｇ以上１０μｇ以下がさらに好ましい。
　本発明の一実施態様である非特異反応抑制剤を適用できる免疫測定法としては、免疫反応を利用して、検体中の被検出物質を測定する方法であれば特に限定されず、その効果を発揮することができる。例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である。本発明の一実施態様である非特異反応抑制剤は、検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。
　次に、本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストストリップについて説明する。本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストストリップは、上述の非特異反応抑制剤を含有する。
　本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストストリップは、イムノクロマトグラフ法を利用して、例えば、被検出物質の有無を判定したり、被検出物質の濃度を測定したりするために使用することができる。
　本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストストリップは、上述の非特異反応抑制剤を含有すること以外は特に限定されるものではなく、公知のイムノクロマトグラフ用テストストリップと同様の構成とすることができる。本発明においては、非特異反応抑制剤は、イムノクロマトグラフ用テストストリップを構成する部材のうち、検体を含む液相が毛細管現象によって展開する部材の中に免疫反応に関与し得る態様で含まれていればよい。このようにすることで、非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うことができ、非特異反応を十分に抑制できる。
　以下、本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態を図面に基づいて説明するが、本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップは以下の実施形態に限定されるものではない。
　図１に示す本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態は、サンプルパッド１と、コンジュゲートパッド２と、メンブレンパッド３と、吸収パッド５と、バッキングシート６とを備える。
　サンプルパッド１は、検体を含む試料を添加し、毛細管現象によって試料を下流へ移動させるために設けられている部材である。サンプルパッド１の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、サンプルパッド１の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。サンプルパッド１には、後述のコンジュゲートパッドの機能を持たせることもできる。
　コンジュゲートパッド２は、検体中の被検出物質と特異的に反応する抗体又は抗原を標識物質で標識した標識試薬を含有する部材である。検体を含む試料がコンジュゲートパッド２を通過すると、被検出物質と標識試薬との複合体が形成される。コンジュゲートパッド２の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、コンジュゲートパッド２の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　標識物質としては、特に限定されるものではなく、例えば、金、銀、白金等の金属ナノ粒子、ラテックス粒子等の公知のものを使用することができる。金属ナノ粒子の平均粒径は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。また、ラテックス粒子の平均粒径は、特に限定されるものではないが、好ましくは１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以上２５０ｎｍ以下である。検体中の被検出物質の有無を目視で判定できることから、標識物質は、金ナノ粒子であることが好ましい。
　標識試薬中の抗体又は抗原は、検体中の被検出物質と特異的に結合することができるものであれば市販されている抗体又は抗原を使用することができ、必要に応じて作製したものを使用することができる。被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体は、例えば被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。動物種の具体例としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　標識試薬中の抗体又は抗原の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストストリップあたり、好ましくは０．０１μｇ以上１０μｇ以下、より好ましくは０．０２μｇ以上５μｇ以下、さらに好ましくは０．０２μｇ以上１μｇ以下である。
　メンブレンパッド３は、被検出物質を検出することにより、被検出物質の有無等を判定したり、被検出物質の濃度を測定したりするための検出部４を有する部材である。検出部４には、被検出物質を捕捉するための抗体又は抗原を含む捕捉試薬が固定されている。検出部４では、検体中に被検出物質が含まれると、標識試薬、被検出物質及び捕捉試薬からなる複合体が形成されて発色し、検体中に被検出物質が含まれないと、標識試薬、被検出物質及び捕捉試薬からなる複合体が形成されないため発色しない。
　メンブレンパッド３の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、メンブレンパッド３の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原は、上記標識試薬に含有される抗体又は抗原と同一の抗体又は抗原であってもよく、異なる抗体又は抗原であってもよい。
　捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原は、検体中の被検出物質と特異的に結合することができるものであれば市販されている抗体又は抗原を使用することができ、必要に応じて作製したものを使用することができる。被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体は、被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。動物種の具体例としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストストリップあたり、好ましくは０．１μｇ以上１０μｇ以下、より好ましくは０．２μｇ以上５μｇ以下、さらに好ましくは０．２μｇ以上４μｇ以下である。
　検出部の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば、線状、円状等が挙げられる。視認性、検出効率の観点から、線状が好ましい。
　メンブレンパッド３は、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、及びゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標）、及びＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
　吸収パッド５は、メンブレンパッド３を通過した余剰の試料等を吸収する部材である。吸収パッドの材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、吸収パッド５の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　バッキングシート６は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレンパッド３、吸収パッド５等の各部材を固定する支持体として用いられる部材である。バッキングシートの材料としては、特に限定されるものではなく、例えば、粘着剤によって試料に対して不透過性、非透湿性となるような、従来公知の種々の材料を用いることができる。また、バッキングシート６の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態においては、非特異反応抑制剤は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２及びメンブレンパッド３のうち少なくとも１つに含有されている。
　本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストストリップに含まれる非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、特に限定されるものではない。非特異反応の抑制効果の観点から、１テストストリップあたり、好ましくは０．５μｇ以上２０μｇ以下、より好ましくは１μｇ以上１５μｇ以下、さらに好ましくは２μｇ以上１０μｇ以下である。上記範囲であることによって、非特異反応を強く抑制できる。
　次に、本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストキットについて説明する。
　本発明においてテストキットとは、免疫測定に必要な試薬等の２以上の物品を備えるキットをいう。本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストキットは、上述の非特異反応抑制剤を含むこと以外は特に限定されるものではなく、公知のイムノクロマトグラフ用テストキットと同様の構成とすることができる。
　本発明においては、非特異反応抑制剤は、免疫反応に関与し得る態様でイムノクロマトグラフ用テストキットに含まれていればよい。例えば、非特異反応抑制剤は、試薬として独立して含有されていてもよく、免疫測定に用いる検体希釈液等の試薬、テストストリップ等に予め含有されていてもよい。
　本発明の一実施形態においては、イムノクロマトグラフ用テストキットは、テストストリップに加えて、免疫測定に必要な試薬を備える。テストストリップとしては、特に限定されるものではなく、例えば、上述のサンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレンパッド、吸収パッド、バッキングシート等から構成されるものを使用することができる。免疫測定に必要な試薬としては、特に限定されるものではないが、例えば、検体希釈液、展開液等が挙げられる。
　本発明の一実施形態においては、テストストリップ、試薬の少なくとも１つに非特異反応抑制剤が含有される。より具体的には、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレンパッド、試薬の少なくとも１つに非特異反応抑制剤が含有される。このようにすることで、非特異反応抑制剤の存在下で抗原抗体反応を行うことができ、非特異反応を抑制することができる。
　本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用テストキットに含まれる非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、特に限定されるものではない。非特異反応の抑制効果の観点から、１テストキットあたり、好ましくは０．５μｇ以上２０μｇ以下、より好ましくは１μｇ以上１５μｇ以下、さらに好ましくは２μｇ以上１０μｇ以下である。上記範囲であることによって、溶液の粘度を増加させることなく非特異反応を効率的に抑制することができる。
　次に、本発明の一実施態様である免疫測定法について説明する。
　本発明の一実施態様である免疫測定法は、上述の非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うものである。本発明の一実施態様である免疫測定法は、非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うことにより、本来の目的とする免疫反応以外の非特異反応を抑制することができる。
　本発明の一実施態様である免疫測定法としては、免疫反応を利用して、検体中の被検出物質を定量的若しくは定性的に測定する方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である。本発明の一実施態様である免疫測定法は、検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。
　本発明の一実施態様である免疫測定法に用いられる検体としては、特に限定されるものではなく、例えば、血清、血漿、全血、尿、唾液、鼻汁等が挙げられる。
　本発明の一実施態様である免疫測定法において測定することができる被検出物質としては、例えば、検体中に含まれるウイルス、細菌、寄生虫、代謝物等が挙げられ、より具体的にはそれらが有するタンパク質、ペプチド、多糖類、及び複合糖質等を挙げることができる。特に、検体中に微量に含まれる抗原が好適である。なぜなら、検体中に含まれる抗原の濃度が微量である程、相対的に非特異的反応の影響が大きくなるので、本発明の一実施態様である非特異反応抑制剤が有用となるからである。
　本発明における免疫反応は、非特異反応抑制剤の存在下で行うものであれば特に限定されるものではなく、常法にしたがって行うことができる。例えば、免疫反応を行う前に予め検体と非特異反応抑制剤とを接触させ、続いて検体中の被検出物質に結合し得る抗体又は抗原と接触させて免疫反応を行うことができる。また、免疫反応を行う前に予め検体中の被検出物質に結合し得る抗体又は抗原と非特異反応抑制剤とを接触させ、続いて検体と接触させて免疫反応を行うことができる。
　本発明に用いられる非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、特に限定されるものではなく、検体の種類、検体の量、免疫測定法の測定条件等に基づいて適宜調整することができる。例えば、１検体あたりに使用する非特異反応抑制剤中の上述のモノクローナル抗体の含有量は、非特異反応の抑制効果の観点から、０．５μｇ以上２０μｇ以下が好ましく、１μｇ以上１５μｇ以下がより好ましく、２μｇ以上１０μｇ以下がさらに好ましい。
　本発明の一実施態様である免疫測定法がイムノクロマトグラフ法である場合には、例えば、抗原を含む検体に予め非特異反応抑制剤を添加して得られた試料を固相に添加し、固相中で免疫複合体を形成することで抗原を検出することができる。また、予め非特異反応抑制剤を添加したサンプルパッド、コンジュゲートパッド等の固相に抗原を含む検体を展開し、固相中で免疫複合体を形成することで抗原を検出することができる。
　本発明の一実施態様である免疫測定法が酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）である場合には、例えば、抗原を含む検体に予め非特異抑制剤を添加し、その後、常法にしたがって抗原抗体反応を行うことで抗原の濃度を測定することができる。
　本発明の一実施態様である免疫測定法が凝集法である場合には、例えば、ラテックス凝集比濁法の場合、抗原を含む検体中に予め非特異抑制剤を添加しておいてもよいし、ラテックス混濁液中に添加しておいてもよい。ラテックス凝集比濁法は常法により行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［抗体の作製］
　イヌＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＤＯＧ　ＩｇＭ　Ｗｈｏｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を免疫原として抗イヌＩｇＭ抗体のモノクローナル抗体を、次のように常法に従って作製した。１００μｇの上記イヌＩｇＭと等量のＡｄｕｖａｎｔ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９－２７０，１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ－グルタミン　０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム　１００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン　１００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ　４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ　Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ－ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。
　クローニングした細胞は、２，６，１０，１４－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。得られた抗体のうち、４種のモノクローナル抗体（Ｎｏ．１２、３２、７０、８０）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。このうちＮｏ．１２は、上述した受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマにより産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体である。
［非特異反応抑制試験］
　検体として、非特異反応を示すヒト血清を用い、上記作製したモノクローナル抗体、及び、従来公知の異好性阻止試薬ＨＢＲによる免疫測定法の非特異反応抑制効果を評価した。
　具体的には、図１に示すように、バッキングシート６上に、検出部４を有するメンブレンパッド３と、サンプルパッド１と、コンジュゲートパッド２と、吸収パッド５とを形成したテストストリップ、及び展開試料を以下のとおり作製し、イムノクロマトグラフ法により測定を行い、非特異反応抑制効果を評価した。
（１）サンプルパッドの作製
　サンプルパッドとして、グラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）コンジュゲートパッドの作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ－Ｚｉｋａ　ｖｉｒｕｓＮＳ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
　次いで、１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識試薬を作製した。
　上記作製した標識試薬３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。
（３）検出部の作製
　メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
　次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ－Ｚｉｋａ　ｖｉｒｕｓＮＳ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
　また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させた。
（４）テストストリップの作製
　検出部を有するメンブレンパッドに、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、及びグラスファイバー製の不織布からなる吸収パッドを順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、バッキングシート（倉本産業社製、製品名イムノクロマト用バッキングシート）上に貼り付け、テストストリップとした。なお、コンジュゲートパッドの試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
（５）展開試料の調製
　非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ　Ｆｅｍａｌｅ　Ｓｅｒｕｍ）を検体とし、検体３０μＬ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ溶液６０μＬ、及び上記作製した実施例または比較例のモノクローナル抗体各４μｇ、あるいはＨＢＲ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｙ社製）４μｇを混合し、展開試料を調製した。また、上記抗体の代わりにＰＢＳ１０μＬを使用したものをコントロールとした。
（６）測定
　上記作製したテストストリップ及び展開試料を用いて、以下の方法で非特異反応抑制効果を試験した。
　展開試料１５０μＬをテストストリップのサンプルパッドに添加し展開させ、１５分後にイムノクロマトリーダーを用いて、検出部の発色強度（４５０ｎｍの吸光度）を測定した。その結果を表１に示す。
　また、判定方法を以下に示す。
○：検出部の発色が目視で認識されない
×：検出部の発色が目視で認識される
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　コントロールの結果からもわかるように、検体として使用したヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ　Ｆｅｍａｌｅ　Ｓｅｒｕｍ）は、非特異反応が生じる検体であることがわかる。そして、本発明における抗体を用いた実施例では、比較例の抗体や異好性阻止試薬ＨＢＲと比較しても顕著に非特異反応を抑制できた。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１８年２月２１日付で出願された日本特許出願（特願２０１８－０２９０７１）に基づいており、その全体が引用により援用される。
１　サンプルパッド
２　コンジュゲートパッド
３　メンブレンパッド
４　検出部
５　吸収パッド
６　バッキングシート

Claims (10)

  1. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマにより産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体。
  2. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２５５６のハイブリドーマ。
  3. 　請求項１に記載のモノクローナル抗体を含有する、免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
  4. 　前記モノクローナル抗体の含有量が０．５μｇ以上２０μｇ以下である、請求項３に記載の非特異反応抑制剤。
  5. 　前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項３または４に記載の非特異反応抑制剤。
  6. 　請求項３～５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
  7. 　請求項３～５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
  8. 　検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、請求項３～５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
  9. 　前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である請求項８に記載の免疫測定法。
  10. 　前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項８に記載の免疫測定法。
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