KR20170053190A - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 감별 진단용 래피드 키트 및 이를 이용한 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감별을 위한 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 키트를 이용하면 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여 특별한 검사 장비 없이 현장에서 간편하고 신속하게 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염여부를 감별하여 진단할 수 있다. 본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 이와 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 이용하므로 민감도 및 특이도 면에서 우수한 성능을 보인다.
Description
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 및 이의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 진단 용도에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기 증후군(PRRS, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 은 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고된 후 현재 국내뿐만 아니라 전세계 양돈 산업 국가에서 발생하고 있는 질병이다.
돼지생식기호흡기 증후군의 원인체는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRSV, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)로써 Nidovirales, Arterviridae, Arterivirus 에 속하는 RNA바이러스이다. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 크게 항원적, 유전학적 특성들에 따라 유럽형 타입 1(European genotype, EU)과 북미형 타입 2(North American genotype, NA)로 구분될 수 있다. 돼지생식기호흡기증후군의 증상으로는 불임, 임신말기 미이라 태아, 유산, 조산 등이 나타나며, 바이러스에 감염되어 태어난 허약 자돈은 생후 호흡기에 2차 감염으로 인해 폐사하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생물학적 시료에서 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 빠르고 정확하게 감별 진단할 수 있는 진단 키트를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단클론항체 및 각각 특이적으로 결합하는 단클론항체를 이용할 경우, 신속 면역크로마토그래피법을 통해 돼지 유래 생물학적 시료에서 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원의 존재 여부를 신속하고 정확하게 감별 검출할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 감별 진단용 래피드 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 키트를 이용하여 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감별 항원 진단용 래피드 키트를 제공한다:
(a) (i) 생물학적 시료; 및 (ⅱ) 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸(europium) 비드 또는 골드 나노입자의 결합제(conjugate)를 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;
(b) (i) 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 및 (ⅱ) 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위한 대조군 항체가 고정된 멤브레인; 및
(c) 액체 시료를 흡수할 수 있는 흡수 패드.
본 발명자들은 생물학적 시료에서 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 빠르고 정확하게 감별 진단할 수 있는 진단 키트를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단클론항체를 이용할 경우, 신속 면역크로마토그래피법을 통해 돼지 유래 생물학적 시료에서 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원의 존재 여부를 신속하고 정확하게 감별 검출할 수 있음을 규명하였다.
본 발명에서 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 진단에 사용하고 있는 각각의 면역크로마토그래피법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 임신진단 또는 간염발병 등과 같은 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 모세관 현상이 작용하는 다공성 박막을 고상(solid phase)으로 하고 금 콜로이드 또는 착색 폴리스티렌 나노 입자 등의 유색입자를 측정 라벨로 사용하는 신속 현장진단용 면역검사법의 일종이다.
본 키트에서 사용하는 유로퓸 형광 물질은 여기(excitation) 파장 333 nm, 방사(emission) 파장 613 nm를 가지고 있어서 일반적으로 많이 사용하는 다른 형광물질(FITC)에 비해 두 파장대 간격이 넓어 검출할 때 간섭이 적다는 장점이 있으며 간단히 UV 조명장치를 이용하여 육안으로 확인할 수 있다. 본 발명의 키트는 검체 중에 PRRSV 항원이 존재할 경우 PRRSV 항원-형광나노입자 콘쥬게이트와 결합하여 모세관력에 의해 멤브레인을 이동하면서 멤브레인 상에 분주되어 있는 PRRSV 특이 항체와 샌드위치 반응을 하여 형광발색이 나타나는 진단키트이다.
또한, 본 발명의 일 구현예 따르면, 반응 결과 측정을 위한 발색 물질로 골드 나노입자를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질”은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스로부터 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 ORF7 유전자를 증폭시킨 후 대장균 발현 시스템을 통하여 발현시킨 단백질이다.
본 명세서에서 용어 “단일클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 유로퓸 비드 또는 골드 나노입자와 결합시키는 단일클론항체는 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 모두 결합한다.
본 발명의 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 모두 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제1서열에 의해 코딩된 단백질 및 서열목록 제2서열에 의해 코딩된 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 모두 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단일클론항체는 한국생명공학연구원 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2015년 07월 23일자 기탁번호 KCTC 18397P로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체이다.
본 발명의 키트에서 멤브레인에 고정되는 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 각각 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 고친화도를 가지면서 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제1서열에 의해 코딩된 단백질에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 한국생명공학연구원 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2015년 09월 22일자 기탁번호 KCTC 18409P로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제2서열에 의해 코딩된 단백질에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 한국생명공학연구원 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2015년 09월 22일자 기탁번호 KCTC 18410P로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체이다.
본 발명의 키트는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드, 항체가 고정된 멤브레인 및 액체 시료를 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트에서 멤브레인은 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질과 결합하는 단일클론 항체가 고정된 시험선(test line) 및 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위한 대조선(control line)을 포함한다.
대조선에는 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위해 액체 시료에 포함되는 대조군 항체에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 대조군 항체로 토끼 IgG, 마우스 IgG 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 액체 시료에 포함되는 대조군 항체는 마우스 IgG이고, 대조선에 고정되는 항체는 항-마우스 IgG이다.
본 발명의 키트에 적용되는 생물학적 시료로서 돼지 유래 장기 조직, 정액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 기타 체액(소변 등) 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트에 적용되는 생물학적 시료는 돼지의 장기조직, 정액, 전혈, 혈장 또는 혈청이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 생물학적 시료는 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸 비드 또는 골드 나노입자의 결합제가 건조된 튜브에 검체희석 버퍼를 넣어 혼합한 다음 본 발명의 키트에 적용한다.
보다 상세하게는, 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원측정용 래피드 키트의 경우 생물학적 시료를 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸 비드 또는 골드 나노입자의 결합제가 건조되어 있는 튜브에 희석 버퍼와 섞은 후 샘플 패드의 투입구에 넣어 전개시킨다. 시료 중에 유럽형 PRRSV에 대한 항원이 존재할 경우, 유럽형 PRRSV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체-유로퓸 비드 결합제 또는 단일클론항체-골드 나노입자 결합제와 결합하여 모세관력에 의해 멤브레인을 이동하면서 멤브레인 상에 분주되어 있는 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 특이적인 항체와 반응함으로써 발색된다. 따라서, 생물학적 시료 내에 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항원이 있는 경우에는 멤브레인의 대조선 및 검사선에서 발색되고, 생물학적 시료 내에 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항원이 없는 경우에는 대조선에서만 발색된다(도 1 및 도 3 참조).
한편, 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원측정용 래피드 키트의 경우 생물학적 시료를 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸 비드 또는 골드 나노입자의 결합제가 건조되어 있는 튜브에 희석 버퍼와 섞은 후 샘플 패드의 투입구에 넣어 전개시킨다. 시료 중에 북미형 PRRSV에 대한 항원이 존재할 경우, 북미형 PRRSV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체-유로퓸 비드 결합제 또는 단일클론항체-골드 나노입자와 결합하여 모세관력에 의해 멤브레인을 이동하면서 멤브레인 상에 분주되어 있는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 특이적인 항체와 반응함으로써 발색된다. 따라서, 생물학적 시료 내에 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항원이 있는 경우에는 멤브레인의 대조선 및 검사선에서 발색되고, 생물학적 시료 내에 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항원이 없는 경우에는 대조선에서만 발색된다(도 1 및 도 3 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 단일클론항체와 교차반응을 일으킬 수 있는 질병의 바이러스 및 세균에 대하여 교차반응을 보이지 않는다(표 9 및 10 참조).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 진단 방법을 제공한다:
(a) 생물학적 시료를 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 공통으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸(europium) 비드 또는 골드 나노입자의 결합제(conjugate)와 혼합하여 상기 키트에 적용시키는 단계; 및
(b) 상기 키트에서 발생하는 신호를 분석하여 상기 생물학적 시료의 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염 여부를 측정하는 단계.
본 발명은 상기 키트를 이용하여 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 진단하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 및 이를 이용한 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 진단 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 키트를 이용하면 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여 특별한 검사 장비 없이 현장에서 간편하고 신속하게 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염여부를 진단할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 이와 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 이용하므로 민감도 및 특이도 면에서 우수한 성능을 보인다.
도 1은 본 발명의 형광 래피드 키트 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 FITC와 유로퓸의 파장대를 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 형광 래피드 키트에 대한 결과 해석을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 형광 콘쥬케이트 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제조한 스트립을 나타난 모식도이다.
도 6은 최저검출(NA 검출) 한계 결과에 대한 그래프이다.
도 7은 최저검출(EU 검출) 한계 결과에 대한 그래프이다.
도 8은 RT-PCR을 통해 NA 양성을 확인한 결과이다(1-27: 103, 28-61: 102, 62-100: 101).
도 9는 양성 검체 분포 결과 그래프(NA 검출)이다.
도 10은 바이러스 역가별 양성 검체 분포 결과를 나타낸 그래프이다(NA 검출)
도 11은 RT-PCR을 통해 EU 양성을 확인한 결과(1-45: 102, 46-100: 101).
도 12는 바이러스 역가별 양성 검체 분포 결과를 나타낸 그래프이다(EU 검출).
도 13은 교차반응 결과에 대한 그래프이다. (a) NA 검출, (b) EU 검출
도 14는 음성 검체 분포 결과 그래프이다. (a) NA 검출, (b) EU 검출
도 15는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 야외주를 구분시험 결과이다.
도 2는 FITC와 유로퓸의 파장대를 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 형광 래피드 키트에 대한 결과 해석을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 형광 콘쥬케이트 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제조한 스트립을 나타난 모식도이다.
도 6은 최저검출(NA 검출) 한계 결과에 대한 그래프이다.
도 7은 최저검출(EU 검출) 한계 결과에 대한 그래프이다.
도 8은 RT-PCR을 통해 NA 양성을 확인한 결과이다(1-27: 103, 28-61: 102, 62-100: 101).
도 9는 양성 검체 분포 결과 그래프(NA 검출)이다.
도 10은 바이러스 역가별 양성 검체 분포 결과를 나타낸 그래프이다(NA 검출)
도 11은 RT-PCR을 통해 EU 양성을 확인한 결과(1-45: 102, 46-100: 101).
도 12는 바이러스 역가별 양성 검체 분포 결과를 나타낸 그래프이다(EU 검출).
도 13은 교차반응 결과에 대한 그래프이다. (a) NA 검출, (b) EU 검출
도 14는 음성 검체 분포 결과 그래프이다. (a) NA 검출, (b) EU 검출
도 15는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 야외주를 구분시험 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
개발 내용 및 방법
본 발명은 PRRSV 고민감도/특이 항체들을 이용하여 PRRSV 감염유무를 타입을 구분하여(북미형/유럽형) 검출하는 형광 타입의 항원 검출용 래피드 키트이다.
PRRSV 진단 방법에는 세포배양 방법과 PCR 방법, GOLD 타입의 RAPID 방법이 많이 사용되고 있으나, 세포배양 방법과 PCR 방법은 여러 과정이 필요하고 많은 시간이 소요되며 PCR의 경우 고가의 장비가 필요하여 간편하고 신속한 진단에는 어려움이 있고 래피드 키트 보다 비용이 비싼 단점이 있다.
| 검사방법 | 장점 | 단점 |
| 세포배양 | - 저렴한 비용 |
- 검사기간만 2-3일 소요 숙련된 기술자 필요 |
| PCR | - 고감도 검출 가능 - real-time PCR:정량 분석 가능 |
- 검사시간 3시간 이상 - 고가의 장비 필요 - 숙련된 기술자 필요 - 고비용 |
| GOLD RAPID |
- 빠르고 간편한 검사 가능 (10-20분 이내) - 저렴한 비용 - 정량 분석 가능 저장성 편리 (상온보관) |
낮은 민감도 |
| 형광 RAPID | - 빠르고 간편한 검사 가능 (10-20분 이내) - 저렴한 비용 - 정량 분석 가능 높은 민감도 |
빛에 민감 저장성 불편(4℃보관) |
본 진단키트는 검체를 투입하고 10분 후 PRRSV 항원을 검출할 수 있고 비용이 저렴한 장점이 있다. PRRSV와 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 이용함으로써 특이성을 높이고 형광방법을 사용하여 민감도 면에서 우수한 성능을 보인다.
본 키트에서 사용한 유로퓸(Europium) 형광 물질은 아래 그림과 같이 여기(excitation) 파장 333 nm, 방사(emission) 파장 613 nm를 가지고 있어서 일반적으로 많이 사용하는 다른 형광물질(FITC)에 비해 두 파장대 간격이 넓어 검출할 때 간섭이 적다는 장점이 있다. 간단히는 UV 조명장치를 이용하여 육안으로 확인이 가능하다. 형광 비드는 Fluoro-Max Fluorescent Carboxylate-Modified Particles 0.3 μm(Thermo)를 사용하였다. 이 비드는 유로퓸 킬레이트 염료를 포함하는 Carboxylate-modified polystylene particles로 EDC/NHS를 이용하여 단백질과 반응할 수 있도록 카복실기를 활성화시켜 사용하였다.
본 키트의 사용 방법은 혈청 또는 조직 검체를 형광 콘쥬게이트가 건조되어 있는 북미형 PRRSV, 유럽형 PRRSV 검출 튜브에 각각 희석 버퍼와 섞은 후 5분간 반응하고, 투입구에 넣으면 검체 중에 PRRSV 항원이 존재할 경우 PRRSV 항원-형광 콘쥬게이트와 결합하여 모세관력에 의해 멤브레인을 이동하면서 멤브레인 상에 분주되어 있는 PRRSV 특이 항체와 샌드위치 반응을 하여 형광발색이 나타나는 진단키트이다.
실시예
1: 재조합 항원 제작
유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 각각 1종 씩 생산하였다. 유럽형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 유럽형 PRRSV인 렐리스타드 스트레인(Lelystad strain)의 ORF7 전체 유전자를, 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 북미형 PRRSV인 VR2332 스트레인의 ORF7 전체 유전자를 pET21a 벡터에 각각 PCR 클로닝하여 생산한 대장균 재조합단백질들이다.
| Gene Origin | 재조합 단백질 | 유전자 부위 | 프라이머 | 크기 (kDa) |
융합 단백질 |
| PRRSV (Lelystad) |
pET21a (BL21 DE3) |
387bp (ORF7) |
Forward: 5’-AATGGATCCATGGCCGGTAAAAACCAGAG-3` Reverse: 5’-TATCTCGAGTTAACTTGCACCCTGACTGG-3` |
17 | C-말단 6X 히스티딘 |
| PRRSV (VR-2332) |
pET21a (BL21 DE3) |
372bp (ORF7) |
Forward: 5’ -ATAGGATCCATGCCAAATAACAACGGCAA-3` Reverse: 5’-CGGCTCGAGTGCTGAGGGTGATGCTGTGA-3` |
16 | C-말단 6X 히스티딘 |
유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 제조하기 위해 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고 PCR 산물(유럽형 PRRSV의 경우 387 bp, 북미형 PRRSV의 경우 372 bp)을 pET21a 벡터에 각각 삽입하였다. PCR 조건은 다음과 같다(유럽형 및 북미형 PRRSV 공통): 초기 변성, 94℃ 3분; 3-스텝 사이클링(35 사이클), 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분; 최종 연장, 72℃ 10분. 클로닝한 벡터에 대하여 콜로니를 선별한 다음 인덕션하고 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다.
염기서열을 확인한 클론을 대장균에 배양하여 인덕션을 유도한 다음, SDS-PAGE를 실시하여 발현 단백질의 크기 및 단백질 발현 성상을 확인하였다. 6XHis Tag을 이용하여 발현 단백질을 정제하고, SDS-PAGE를 실시하여 정제도 및 양을 측정하였다. 유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질은 가용성 단백질로 발현되며 정제하였을 때 각각 17 KDa 및 16 KDa의 단백질을 획득하였다.
실시예
2: 항체 제작 및 선별
유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 반응하는 항체 개발을 위해 유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 각각 마우스 면역을 진행하였다.
2-1: 재조합단백질에 대한 단일클론항체
단계 1: 면역
위에서 제조한 재조합단백질에 대한 단클론항체를 제작하기 위해 실험동물에 면역(immunization)을 실시하였다. 항원으로서 재조합 단백질(유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질)을 0.5 mg/ml 농도로 준비하고 재조합 단백질 200 μl와 Freund's Adjuvant(FA) 200 μl를 혼합하여 BALB/c 마우스 복강에 2주 간격으로 1-3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA, IFA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 재조합 단백질 100 μl를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하였다.
단계 2: 세포융합 및
하이브리도마
제조
면역화된 마우스 몸통 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하여 DMEM 배지에 부유시킨다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고 배양배지 DMEM과 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 현탁액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 비장세포와 골수세포주(SP2/0 Ag14 (ATCC, USA)) 1:5의 비율로 혼합한 후 원심분리하여 세포를 침천시켜 상층액은 제거한다. 원심분리된 세포를 천천히 분산시킨후 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG1500, Roche) 1 ml을 처리하고, 37℃에서 1분 동안 유지시킨 후, DMEM 1 ml을 첨가한다. 이 후 DMEM 10 ml을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 반응시킨 후 50 ml로 맞추어 다시 원심분리한다. 세포침전물을 분리배지(HAT배지)에 1~2×105 세포/ml 농도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 0.1 ml씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
단계 3:
하이브리도마
세포의 선별
상기 단계 2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 각각 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 IFA와 ELISA 분석 방법을 사용하였다.
IFA 검사 방법은 96웰 마이크로플레이트에 MA-104 세포를 배양한 후 PRRSV LV(Lelystad) 및 VR2332 를 감염시킨 뒤 메탄올을 이용하여 세포를 고정시켜 PRRSV가 감염된 세포 플레이트를 제작하였고, 감염시키지 않은 플레이트를 제조하여 실험에 사용하였다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 100 μl씩을 가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈20(PBS-T) 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-플루오레세인이소티오시안산염(Goat anti-mouse IgG-FITC)를 가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 플레이트를 형광현미경으로 PRRSV가 감염된 플레이트에 반응성이 있고, 정상세포에는 반응성이 없는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.
ELISA 검사 방법은 96웰 마이크로플레이트에 목적으로 하는 항원 유럽형 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 대조항원인 정상세포 용해물을 한 웰당 각각 100 μl(0.5 μg/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 100 μl 씩을 가하여 1시간동안 실온에서 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈20(PBS-T) 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제(Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M을 플레이트 각 웰에 50 μl씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 목적으로 하는 항원에 반응성이 높고, 대조항원에 반응성이 없는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주를 제한 희석하여 클로닝을 진행하여 단일클론화 하였고, 이후 위와 같은 방법으로 목적으로 하는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.
위와 같은 방법으로 유럽형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 반응하는 단클론 항체(6E36) 및 북미형 PRRSV 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 반응하는 단클론 항체(B90-10), 북미형 및 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질에 모두 반응하는 단클론항체(11D56)를 선별하였다.
| Clone | IFA | ELISA (코팅 Ag) | 면역원 | ||
| LV | VR | LV rNC | VR2332 rNC | ||
| 6E36 | + | - | 3.78 | 0.33 | LV rNC |
| 11D56 | + | + | 3.68 | 3.82 | LV rNC |
| B90-10 | - | + | 0.15 | 3.63 | VR2332 rNC |
실시예
3:
래피드
진단 키트
제조
1) 형광 콘쥬게이트 제조
형광 콘쥬게이트는 항체와 형광 입자(300 nm) 간의 결합체를 뜻하며 콘쥬게이트 제조를 위해 공유결합 방법을 이용하여 아래와 같이 제조를 하였다.
제조방법
① MES 버퍼 800 μl + 2 mM EDC + 2 mM NHS + 1% 유로퓸 비드 200 μl (최종 0.2%)를 상온에서 30분간 반응시킨다.
② 원심분리하여 상층액을 제거하고 MES 버퍼 1 ml를 넣고 세척해준다.
③ 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고 보랙스 버퍼 1 ml를 넣고(최종 0.2% 비드) 접합(conjugation) 시킬 항체(북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 및 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드와 공통으로 반응하는 mAb 11D56)를 250 μg 첨가하여 상온에서 3시간 동안 반응시킨다.
④ 카제인을 0.3%가 되도록 첨가하여 상온에서 1시간 동안 블로킹을 하고 글라이신을 50 mM이 되도록 첨가하여 상온에서 30분 동안 비드에 남아있는 카복실기를 불활성화 시킨다.
⑤ 원심분리하여 상층액을 제거하고 보랙스 버퍼에 희석한 0.1% 카제인 1 ml로 재분산 시켜서 OD 450으로 비드 %를 확인한 후 검체 희석 튜브에 건조한다.
2) 골드 콘쥬게이트 제조
골드 콘쥬게이트는 항체와 골드나노입자(40 nm) 간의 결합체를 뜻하며 콘쥬게이트 제조를 위해 흡착 방법을 이용하여 아래와 같이 제조를 하였다.
제조방법
① 항체 준비: 북미형 PRRSV 재조합 뉴클레오캡시드와 유럽형 PRRSV 재조합 뉴클레오캡시드에 공통으로 반응하는 단클론항체 11D56 1 mg/ml을 준비한다(골드용액 1 ml 커플링 시 각각 10 μg이 필요).
② 골드 용액 준비: 40 nm 콜로이드 골드를 분광광도계를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값 1이 되도록 만들고, pH 10으로 맞춰 준비한다.
③ 콘쥬게이트 제조: 위에서 준비한 항원과 골드를 10 μg/ml로 섞고 상온에서 1시간 반응시킨다.
④ 블로킹 및 세척: 골드 용액의 항원과 반응하지 못한 부분을 블로킹 하기 위해 0.3% 카제인을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨다. 제조된 콘쥬게이트 외 반응하지 못한 항원과 블로킹 용액을 제거하기 위해 원심분리를 이용하여 상층액을 버리고 1% BSA 용액을 첨가하여 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고 1% BSA 용액을 첨가하여 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고 1% BSA 용액으로 처음 시작한 볼륨에서 약 1/10이 되도록 첨가한 후, 분광광도계를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값을 측정한다.
3) 스트립의 제조
스트립은 샘플패드(Ahlstrom), 멤브레인(Millipore), 흡수패드(Ahlstrom)를 중첩되게 하여 일정한 방향으로 흘러가면서 캡처와 반응하도록 하는 형태를 갖는다.
제조방법
① 항체 준비 : 항-마우스 IgG(Arista) 1 mg/ml과 PRRSV mAb 6E36 2 mg/ml, PRRSV mAb B90-10 1.5 mg/ml 에 각각 0.5% 수크로오스(Sigma)와 0.1% NaN3 (Sigma)를 첨가하여 준비한다.
② 항체 분주 및 고정 : 백킹 카드(PJ상사)에 멤브레인을 붙이고 대조선에는 항-마우스 IgG를, NA용 시험선에는 B90-10 항체를, EU용 시험선에는 6E36 항체를 스피드 10 cm/sec, 분주 볼륨 0.9 μl/cm로 각각 분주한다. 그 후 제습 캐비닛에서 24시간 이상 건조하여 항체를 멤브레인에 고정시킨다.
③ 패드 부착 및 절단 : 항체가 고정이 되면 샘플패드와 흡수패드를 각각 정해진 위치에 붙이고 로터리 슬리터를 이용하여 4 mm간격으로 절단한다.
④ 조립 및 포장 : 완성된 스트립을 하우징에 조립하고 알루미늄 파우치에 실리카겔과 밀봉하여 포장한다.
3) 검체 희석 버퍼 제조
50 mM 보랙스 버퍼에 0.5% Triton X-100 (Sigma), 0.01% NaN3를 넣는다.
4) 사용 방법 및 결과 판정
① 검체 희석 버퍼를 형광 콘쥬게이트가 건조되어 있는 튜브에 드로퍼를 이용하여 90 μl 넣고, 테스트 하고자 하는 혈청 샘플도 10 μl 넣어 5분간 반응 시켜 준다.
② 디바이스를 꺼내 평평한 곳에 놓고 샘플 주입구에 1번에서 혼합한 용액을 3방울 넣는다.
③ 상온에서 10분 동안 로딩시키고 형광 리더기를 이용하여 수치 값을 측정한다.
결과 분석
검출 한계 비교
음성검체 최대 OD + 5SD는 NA 검출용은 353.3, EU 검출용은 1,476이다. 컷-오프 수치를 NA검출용은 400으로 EU 검출용은 1500으로 설정하면 개발한 래피드 키트의 최저검출 한계는 NA 검출용은 3.12 TCID50/ml, EU 검출용은 12.5 TCID50/ml이다.
바이러스 역가 확인용 계산식은 NA 바이러스는 X(TCID50/ml)=(형광 수치-217.59)/91.793 이고 EU 바이러스는 X(TCID50/ml)=(형광 수치-1057.4)/62.811이다.
| 검체Titer (TCID50/ml) |
1회 TEST | 2회 TEST | 3회 TEST | AVER | STDEV | CV% |
| 100 | 9127 | 8295 | 10597 | 9340 | 1165.64 | 12.48 |
| 50 | 4390 | 4376 | 5620 | 4795 | 714.22 | 14.89 |
| 25 | 2550 | 2648 | 3320 | 2839 | 419.14 | 14.76 |
| 12.5 | 1307 | 1154 | 1294 | 1252 | 84.83 | 6.78 |
| 6.25 | 759 | 622 | 828 | 736 | 104.85 | 14.24 |
| 3.125 | 401 | 537 | 529 | 489 | 76.32 | 15.61 |
| 1.5625 | 327 | 406 | 412 | 382 | 47.44 | 12.43 |
| negative | 201 | 165 | 218 | 195 | 27.06 | 13.90 |
| 검체Titer (TCID50/ml) |
1회 TEST | 2회 TEST | 3회 TEST | AVER | STDEV | CV% |
| 100 | 6443 | 8419 | 6697 | 7186 | 1075.05 | 14.96 |
| 50 | 3750 | 4825 | 4423 | 4333 | 543.16 | 12.54 |
| 25 | 2528 | 3324 | 3165 | 3006 | 421.24 | 14.01 |
| 12.5 | 1609 | 2121 | 1676 | 1802 | 278.29 | 15.44 |
| 6.25 | 1504 | 1642 | 1228 | 1458 | 210.80 | 14.46 |
| 3.125 | 1286 | 1128 | 1024 | 1146 | 131.92 | 11.51 |
| 1.5625 | 1281 | 1026 | 1184 | 1164 | 128.71 | 11.06 |
| negative | 922 | 759 | 954 | 878 | 104.58 | 11.91 |
민감도 특이도 측정
PRRSV 항원 측정 상위 방법인 RT-PCR 방법과 비교하여 진단키트의 용법에 따라 시험하여 얻어진 결과를 바탕으로 민감도 특이도를 측정하였다.
| PRRSV 항원진단 (NA 타입) |
형광 rapid | 측정민감도 (양성/(양성+위음성) |
93% | |||
| 양성 | 음성 | 합 | ||||
| RT-PCR | 양성 | 93 | 7 | 100 | 측정 특이도 음성/(음성+위양성) |
93% |
| 음성 | 7 | 93 | 100 | |||
| 합 | 100 | 100 | 200 | |||
| PRRSV 항원진단 (EU 타입) |
형광 rapid | 측정민감도 (양성/(양성+위음성) |
92% | |||
| 양성 | 음성 | 합 | ||||
| RT-PCR | 양성 | 92 | 8 | 100 | 측정 특이도 음성/(음성+위양성) |
90% |
| 음성 | 10 | 90 | 100 | |||
| 합 | 102 | 98 | 200 | |||
바이러스
역가별
민감도
북미형 PRRSV 항원측정용 래피드 키트의 민감도 검증을 위해 표준 검체를 RT-PCR 결과 음성으로 확인된 혈청 100종에 대하여 역가별로 VR2332 바이러스를 스파이킹(spiking)하여 테스트 하였다. 100종 중 93종을 컷-오프 수치 이상로 판정하여 93%(93/100)의 민감도를 나타내었다. 바이러스 역가별 민감도를 계산해 보면 아래 표와 같다.
| Titer(TCID50/ml) | Average | 민감도(검체 수) |
| 101 | 632.5 | 82% (32/39) |
| 102 | 2177.9 | 100% (34/34) |
| 103 | 35921.3 | 100% (27/27) |
102, 103 TCID50/ml의 검체 61종 모두 양성으로 판정하여 100%의 민감도를 확인하였고, 101 TCID50/ml의 검체 39종 중 32종을 양성으로 판정하여 82%의 민감도를 확인하였다.
유럽형 PRRSV 항원 측정용 래피드 키트의 민감도 검증을 위해 표준 검체를 RT-PCR 결과 음성으로 확인된 혈청 100종에 역가별로 EU 바이러스를 스파이킹하여 테스트 하였다. 100종 중 92종을 컷-오프 수치 이상로 판정하여 92%(92/100)의 민감도를 나타내었다. 바이러스 역가별 민감도를 계산해 보면 아래 표와 같다.
| Titer(TCID50/ml) | Average | 민감도(검체 수) |
| 101 | 2359.9 | 85.5% (47/55) |
| 102 | 7773.2 | 100% (45/45) |
102 TCID50/ml의 검체 45종 모두 양성으로 판정하여 100%의 민감도를 확인하였고, 101 TCID50/ml의 검체 55종 중 47종을 양성으로 판정하여 85.5%의 민감도를 확인하였다.
교차반응성 평가
PRRSV 단클론 항체와 교차반응을 일으킬 수 있는 질병의 바이러스와 세균을 선별하여 교차반응을 확인하였다.
| 교차반응 질병(바이러스) | Titer( TCID 50 /ml) | 결과 |
| PRRSV VR2332 | 103 | 14925 |
| PRRSV LV | 102 | 157 |
| EMCV | 104.1 | 14 |
| JEV | 105 | 145 |
| CSFV | 105 | 184 |
| SIV H1N2 | 105 | 115 |
| ADV | 106.5 | 42 |
| PPV | 105.1 | 192 |
| PCV2 | 104 | 177 |
| PEDV | 103 | 134 |
| ROTA OSU | 104 | 70 |
| TGEV | 103 | 154 |
| 교차반응 질병(세균) | Titer( CFU ) | 결과(형광 Signal) |
| MH | 105 | 123 |
| HP4 | 105 | 115 |
| HP5 | 105 | 142 |
| PM D type | 105 | 152 |
| ATCC 17981 | 105 | 23 |
| ATCC 19168 | 105 | 0 |
| ATCC 27399 | 105 | 27 |
| ATCC 51909 | 105 | 81 |
| 교차반응 질병(바이러스) | Titer( TCID 50 /ml) | 결과 |
| PRRSV NA | 103 | 1223 |
| PRRSV EU | 102 | 10739 |
| EMCV | 104.1 | 941 |
| JEV | 105 | 1080 |
| CSFV | 105 | 692 |
| SIV H1N2 | 105 | 1259 |
| ADV | 106.5 | 1085 |
| PPV | 105.1 | 1076 |
| PCV2 | 104 | 933 |
| PEDV | 103 | 1015 |
| ROTA OSU | 104 | 1267 |
| TGEV | 103 | 1233 |
| 교차반응 질병(세균) | Titer( CFU ) | 결과 |
| MH | 105 | 295 |
| HP4 | 105 | 15 |
| HP5 | 105 | 12 |
| PM D type | 105 | 152 |
| ATCC 17981 | 105 | 157 |
| ATCC 19168 | 105 | 695 |
| ATCC 27399 | 105 | 327 |
| ATCC 51909 | 105 | 881 |
개발한 래피드 키트 2종 모두 바이러스 질병 11종과, 균 질병 8종에 대한 교차반응이 없는 것으로 확인되었다.
특이도 평가
특이도 평가를 위해 PRRSV 유전자 검출용 RT-PCR 결과 음성으로 확인된 혈청 100종을 테스트 하였다.
| NA KIT 음성 검체 분포 결과 | EU KIT 음성 검체 분포 결과 | ||
| 형광 범위 | 검체 수 | 형광 범위 | 검체 수 |
| >100 | 25 | >100 | 0 |
| 100~200 | 16 | 100~200 | 0 |
| 200~300 | 23 | 200~300 | 1 |
| 300~400 | 29 | 300~400 | 13 |
| 400~500 | 4 | 400~500 | 5 |
| 500~1000 | 1 | 500~1000 | 33 |
| 1000~2000 | 2 | 1000~1500 | 38 |
| 2000~4000 | 0 | 1500~4000 | 8 |
| 4000~5000 | 0 | 4000~5000 | 0 |
| 5000~10000 | 0 | 5000~10000 | 2 |
| 10000< | 0 | 10000< | 0 |
| TOTAL | 100 | TOTAL | 100 |
북미형 PRRSV 항원 측정용 래피드 키트는 93%(93/100), 유럽형 PRRSV 항원 측정용 래피드 키트는 90%(90/100)의 특이도를 나타내었다.
재현성 시험
개발한 시제품의 재현성을 확인하기 위해 표준검체 5종을 5회 반복 테스트 하여 성능 평가를 실시하였다.
| NA | TEST 1 | TEST 2 | TEST 3 | TEST 4 | TEST 5 | Average | STDEV | CV% |
| NA 고 | 17791 | 21879 | 19734 | 19812 | 18463 | 19535.80 | 1565.36 | 8.01 |
| NA 중 | 2299 | 2606 | 2499 | 2765 | 2349 | 2503.60 | 190.13 | 7.59 |
| NA 저 | 599 | 864 | 652 | 754 | 791 | 732.00 | 106.63 | 14.57 |
| N1 | 22 | 28 | 22 | 29 | 26 | 25.40 | 3.29 | 12.94 |
| N2 | 19 | 22 | 24 | 16 | 22 | 20.60 | 3.13 | 15.20 |
| EU | TEST 1 | TEST 2 | TEST 3 | TEST 4 | TEST 5 | Average | STDEV | CV% |
| EU 고 | 41666 | 42284 | 43072 | 42522 | 42677 | 42444.20 | 520.97 | 1.23 |
| EU 중 | 7730 | 8198 | 8463 | 8342 | 8325 | 8211.60 | 285.13 | 3.47 |
| EU 저 | 2391 | 2546 | 2427 | 2663 | 2367 | 2478.80 | 123.83 | 5.00 |
| N1 | 1408 | 1160 | 1339 | 1265 | 1265 | 1287.40 | 92.79 | 7.21 |
| N2 | 1318 | 1055 | 1422 | 1347 | 1259 | 1280.20 | 138.89 | 10.85 |
두 가지 검출 KIT 모두 CV% 15% 내 외로 양호한 재현성을 보였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc.
<120> Rapid Kit for Diagnosing Porcine Respiratory Reproductive
Syndrome Virus Antigen
<130> PN150344
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> EU PRRSV Lelystad ORF7
<400> 1
atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaagta cagctccgat ggggaatggc 60
cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga taaagtccca gcgccagcaa 120
cctaggggag gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cctggctgct 180
gaagatgaca tccggcacca cctcacccag actgaacgct ccctctgctt gcaatcgatc 240
cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300
tttcaggttg agtttatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttct 360
acatccgcca gtcagggtgc aagttaa 387
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> NA PRRSV VR2332 ORF7
<400> 2
atgccaaata acaacggcaa gcagcagaat agaaagaagg gggatggcca gccagtcaat 60
cagctgtgcc agatgctggg taagatcatc gctcagcaaa accagtccag aggcaaggga 120
ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgactgaa 180
gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcaatccag 240
accgccttta atcaaggcgc tgggacttgc accctgtcag attcagggag gataagttac 300
actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgcgcc tgattcgcgt cacagcatca 360
ccctcagcat ga 372
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> EU PRRSV Lelystad nucleocapside protein
<400> 3
Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro
1 5 10 15
Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala
20 25 30
Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys
35 40 45
Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile
50 55 60
Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr
100 105 110
Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> NA PRRSV VR2332 nucleocapside protein
<400> 4
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> PRRSV Lelystad Forward primer
<400> 5
aatggatcca tggccggtaa aaaccagag 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> PRRSV Lelystad Reverse primer
<400> 6
tatctcgagt taacttgcac cctgactgg 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> PRRSV VR-2332 Forward primer
<400> 7
ataggatcca tgccaaataa caacggcaa 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> PRRSV VR-2332 Reverse primer
<400> 8
cggctcgagt gctgagggtg atgctgtga 29
Claims (7)
- 다음을 포함하는 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome Virus) 감별 항원 진단용 래피드 키트:
(a) (i) 생물학적 시료; 및 (ⅱ) 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸(europium) 비드 또는 골드 나노입자의 결합제(conjugate)를 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;
(b) (i) 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 및 (ⅱ) 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위한 대조군 항체가 고정된 멤브레인; 및
(c) 액체 시료를 흡수할 수 있는 흡수 패드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 뉴클레오캡시드에 공통으로 결합하는 단일클론항체는 수탁번호 KCTC18397P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 수탁번호 KCTC18409P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항에 있어서, 상기 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 수탁번호 KCTC18410P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지의 전혈, 혈장, 혈청, 조직 또는 정액인 것을 특징으로 하는 키트.
- 다음 단계를 포함하는 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 진단 방법:
(a) 생물학적 시료를 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 유전자 재조합 뉴클레오캡시드 단백질에 공통으로 결합하는 단일클론항체 및 유로퓸(europium) 비드 또는 골드 나노입자의 결합제(conjugate)와 혼합하여 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 키트에 적용시키는 단계; 및
(b) 상기 키트에서 발생하는 신호를 분석하여 상기 생물학적 시료의 유럽형 또는 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염 여부를 측정하는 단계.
- 제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지의 전혈, 혈장, 혈청, 조직 또는 정액인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150155064A KR101776232B1 (ko) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150155064A KR101776232B1 (ko) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170053190A true KR20170053190A (ko) | 2017-05-16 |
| KR101776232B1 KR101776232B1 (ko) | 2017-09-12 |
Family
ID=59035000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020150155064A KR101776232B1 (ko) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 진단용 래피드 키트 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200016580A (ko) * | 2018-08-07 | 2020-02-17 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| KR20200016583A (ko) * | 2018-08-07 | 2020-02-17 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 유전형별 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| CN114316038A (zh) * | 2022-01-15 | 2022-04-12 | 杭州恒奥科技有限公司 | 猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 |
-
2015
- 2015-11-05 KR KR1020150155064A patent/KR101776232B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
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| CN114316038A (zh) * | 2022-01-15 | 2022-04-12 | 杭州恒奥科技有限公司 | 猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 |
| CN114316038B (zh) * | 2022-01-15 | 2023-06-27 | 杭州恒奥科技有限公司 | 猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 |
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| KR101776232B1 (ko) | 2017-09-12 |
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