KR20200016583A - 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 유전형별 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스에 대한 면역 형성과 면역 수준을 평가함과 동시에 북미형 또는 유럽형의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 유도 항체의 특이적 검출을 통해 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 감염 여부 및 이들의 유전형을 명확하게 진단할 수 있는 새로운 재조합 항원 단백질 및 이의 진단 용도에 관한 것이다. 본 발명의 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 각각 북미형 PRRSV 및 유럽형 PRRSV 를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있으므로, 양돈 농가에 감염된 PRRSV 및 이의 유전형을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스에 대한 면역 형성과 면역 수준을 평가함과 동시에 북미형 또는 유럽형의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 유래 특이 항체의 검출을 통해 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 감염 여부 및 이들의 유전형을 명확하게 진단할 수 있는 새로운 재조합 항원 단백질 및 이의 진단 용도에 관한 것이다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus; 이하, PRRSV)는 말 동맥염 바이러스(EAV), 젖산 탈수소화효소-증가 바이러스(LDV) 및 원숭이 출혈열 바이러스(SHFV)를 포함하는 아테리바이러스의 신규 바이러스과에 속하는 단일한 아테리바이러스 속으로 분류되었다. 이러한 군의 단일(+)쇄 RNA 바이러스는 많은 특징, 예를 들어 게놈 조직, 복제 전략, 형태 및 마크로파지 향성을 공유한다. 또한, 무증상 감염 및 항체 생산을 수반하는 지속형(persistent) 바이러스혈증은 아테리바이러스의 특징적인 조직병리학적 특성이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군은 전 세계적으로 돼지 축산업에서 경제적으로 가장 중요한 질병중의 하나이다. 이 질병은 암퇘지에서 유산 또는 사산을 일으키며, 새끼 돼지에서는 심각한 호흡기 질환을 일으키는 특징을 가지고 있다. 이 질병은 1987년 북미에서 처음 발견되었으며, 이어 1990년 유럽에서도 발견되었다. 그 이후 미국과 네덜란드에서 이 질병의 원인체로 PRRSV를 각각 독립적으로 분리하였다.
PRRSV의 경우 유전자형에 따라 북미형과 유럽형의 두 가지 유전형으로 구분되어 있으며, 국내에는 양돈장 내에 두 가지 형태가 모두 유입되어 있다. PRRSV의 북미분리주 (VR-2332)와 유럽분리주 (Lelystad) 는 형태학적으로나 게놈의 구조적인 측면에서 유사하나, 유전학적으로나 항원적인 측면에서는 단지 약 60~70% 의 염기상동성 (sequence homology)을 가지고 있다.
우리나라의 연도별 PRRSV 감염 비중 조사에 따르면, 2013년에는 유럽형 바이러스 단독 감염이 우세했지만, 2014년에는 북미형 바이러스 단독 감염이 우위를 나타냈고, 2015년에는 북미형과 유럽형의 감염이 비슷한 비중을 나타내는 것으로 보고되었다. 또한 혼합형 감염은 2013년부터 2015년까지 꾸준한 증가세를 나타내어 28.6% 라는 높은 감염 비중을 차지하는 것으로 보고되었다. 따라서 적절한 치료제 및 백신 투여, 질병억제/관리를 위해 다양한 유전형의 PRRSV 감염여부를 정확하고 신속하게 진단하는 방법에 대한 필요성이 있어 이에 대한 연구가 진행되었다. 특히 PRRSV의 경우 북미형과 유럽형 사이에 낮은 염기 상동성에 의하여 서로 교차 면역이 잘 되지 않고 각 유전형의 바이러스들이 유전자 변이도 심해 예방 및 진단이 매우 어려워 소모성질환의 대표적인 원인체로 꼽히고 있다. 따라서, 모든 유전형 및 변이형 PRRSV에 대한 감염여부를 정확하게 진단하는 것이 매우 중요하고, 특히 종돈장과 같이 PRRS음성 유지가 매우 중요한 농장에서의 위양성 진단을 피할수 있는 진보적인 진단방법에 대한 필요성이 절실하다. 게다가 복합 감염된 농장에서도 시기별로 한가지 유형만 검출될 수 있고, 모돈과 자돈 사이에서도 유형이 다를 수 있어 단순히 PRRSV에 대한 감염 여부를 진단하는 것 외에도 이들의 유전형을 명확하게 결정할 수 있는 특이적인 진단 방법이 있을 경우, 그에 따른 맞춤형 예방전략 수립에 큰 도움이 된다.
본 발명자들은 양돈농장에서의 PRRSV 감염에 의한 항체 면역 형성과 면역 수준을 평가함과 동시에 감염된 바이러스의 유전형을 결정할 수 있는 방법을 연구하던 중, 북미형 및 유럽형 유래의 단백질을 이용하는 경우 유전자형 특이적인 항체의 검출을 통해 PRRSV 감염을 진단하고 나아가 이들의 유전형을 판별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 새로운 북미형 또는 유럽형 PRRSV 진단용 항원 단백질 및 이를 이용한 PRRSV 진단 및 유전형 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 및 2) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 또는 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 2) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 시료에서 항체를 검출하는 단계; 를 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 또는 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 2) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 시료에서 항체를 검출하는 단계; 를 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 각각 북미형 PRRSV 및 유럽형 PRRSV 를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있으므로, 양돈 농가에 감염된 PRRSV 및 이의 유전형을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 제조된 북미형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 나타낸 도이다.
도 2은 북미형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 제조된 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 제조된 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 북미형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질; 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질; 및 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질;을 이용한 PRRSV 진단 및 PRRSV 유형 판별 방법의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 진단 방법에 따른 PRRSV 유형 구별 결과를 나타낸 도이다 (Type 2 (NA) : 북미형 PRRSV, Type 1 (EU): 유럽형 PRRSV), SDB: = sample diluting buffer , MBP: maltose binding protein.
도 2은 북미형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 제조된 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 제조된 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질의 pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 북미형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질; 유럽형 PRRSV 특이적 재조합 항원 단백질; 및 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원 단백질;을 이용한 PRRSV 진단 및 PRRSV 유형 판별 방법의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 진단 방법에 따른 PRRSV 유형 구별 결과를 나타낸 도이다 (Type 2 (NA) : 북미형 PRRSV, Type 1 (EU): 유럽형 PRRSV), SDB: = sample diluting buffer , MBP: maltose binding protein.
본 발명은 개별 유전형 진단이 가능한 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질, 이들을 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 북미형 PRRSV 유래의 단백질을 포함하고, 북미형 PRRSV에 대한 가변성 아미노산 서열까지 포함하여 북미형 특이적인 항체 반응을 신속하게 탐지할 수 있다.
본 발명의 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 1로 표시되는 히스티딘 태그를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열은 서열번호 5로 표시될 수 있고, 본 발명에 있어 “북미형 PRRSV”는 북미 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 PRRSV, 예로서, NVSL 97-7895 종 또는 IAF-Klop, MLV, ATCC VR-2332, ATCC VR-2385, IAF-BAJ, IAF-DESR, IAF-CM, IAF 93-653, IAF 93-2616, IAF 94-3182, IAF 94-287 종 및 VR233 주 중 임의의 한 종일 수 있으며, 바람직하게는 VR2332 주일 수 있다. 따라서 본 발명의 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열은 VR2332 주 유래의 뉴클레오캡시드 단백질에서 변형된 형태일 수 있다.
상기 본 발명의 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 pI 조절 서열을 더 포함하여 항원의 수용성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열은 목적하는 항원성을 달성할 수 있도록 단백질이 발현되는 한, 자유로운 순서로 배열될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 기재된 순서대로 재조합된 재조합 항원 단백질을 제공한다.
따라서 본 발명의 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 가장 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 항원 단백질일 수 있다.
또한 본 발명은 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 이에 제한되는 것은 아니나 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 유럽형 PRRSV 유래의 단백질을 포함하고, 유럽형 PRRSV에 대한 가변성 아미노산 서열까지 포함하여 유럽형 특이적인 항체 반응을 신속하게 탐지할 수 있다.
또한 본 발명의 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열은 서열번호 9로 표시될 수 있으며, 본 발명에 있어 “유럽형 PRRSV”는 유럽 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 PRRSV, 예로서, 렐리스타드 종을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열은 렐리스타드(Lelystad) 주 유래의 뉴클레오캡시드 단백질에서 변형된 형태일 수 있다.
상기 본 발명의 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 pI 조절 서열을 더 포함하여 항원의 수용성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열은 목적하는 항원성을 달성할 수 있도록 단백질이 발현되는 한, 자유로운 순서로 배열될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 기재된 순서대로 재조합된 재조합 항원 단백질을 제공한다.
따라서 본 발명의 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 가장 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 항원 단백질일 수 있다.
또한 본 발명은 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 이에 제한되는 것은 아니나 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질 또는 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 각각 포함하는, 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물, 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 및
2) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 북미형 및 유럽형 특이적인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 포함하므로, 시료 내 유럽형 및 북미형을 특이적으로 진단 및 판별할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 바람직하게는 서열번호 7로 표시될 수 있으며, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 10으로 표시될 수 있다.
또한 본 발명의 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 유전자 타입 진단용 조성물은 3) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질 을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 북미형 PRRSV 및 유럽형 PRRSV 유래의 단백질을 모두 포함하고, 각각의 유전형에 대한 가변성 아미노산 서열까지 포함하여 북미형 및 유럽형 모두에 대한 항체 반응을 신속하게 탐지할 수 있다.
상기와 같은 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나 바람직한 일 예로서 서열번호 20으로 표시되는 단백질 일 수 있다.
본 발명은 또한 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이는 서열번호 20으로 표시되는 단백질을 암호화할 수 있는 다양한 폴리뉴클레오티드를 제한없이 포함할 수 있고 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 뉴클레오티드일 수 있다.
또한 본 발명의 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 발현단백질 중 PRRSV 유래 단백질만을 원할 때 GST 서열과 PRRSV유래 단백질을 순수하게 분리해낼 수 있도록 하기 위한 목적으로 효소 절단 서열을 더 포함할 수 있다. 효소 절단 서열은 GST 서열과 PRRSV 유래 단백질 서열의 사이에 포함될 수 있으며, 효소 절단 서열의 절단을 통해 GST 서열이 PRRSV 유래 단백질 서열과 분리되므로, 순수한 PRRSV 유래 단백질만을 수득할 수 있다. 본 발명은 일 예로 트롬빈 절단 서열을 효소 절단 서열로 사용하였으며, 따라서 본 발명의 항원 단백질은 서열번호 13으로 표시되는 트롬빈 절단 서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 트롬빈 절단 (Thrombin cleavage site) 서열은 발현단백질 중 PRRSV 유래 단백질만을 트로빈 처리를 통해 순수하게 분리할 수 있도록 할 수 있다.
또한 본 발명의 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 19로 표시되는 pI 조절 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. pI 조절 서열을 포함하는 경우, 항원의 수용성이 더 증가될 수 있으며, pI 10 초반에서 pI 10 중후반까지 pI 를 조절할 수 있다.
본 발명의 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15 로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17으로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열은 목적하는 항원성을 달성할 수 있도록 단백질이 발현되는 한, 자유로운 순서로 배열될 수 있다. 또한 본 발명의 항원 단백질은 서열번호 12로 표시되는 GST (Glutathione-S-transferase) 서열, 서열번호 13으로 표시되는 트롬빈 절단 서열, 서열번호 19로 표시되는 pI 조절 서열을 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 서열번호 12 내지 18 로 기재된 순서대로 재조합된 재조합 항원 단백질을 제공하며, 서열번호 19의 pI 조절 서열은 서열번호 17 및 18 서열 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 서열번호로 표시되는 단백질은 상기 단백질의 기능적 동등물을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 상기 “기능적 동등물” 이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 표시된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 구체적으로 상기 기능적 동등물은 본 발명 항원 단백질의 항원성을 실질적으로 변형시키지 않는 범위에서 적절하게 변형된 것 일 수 있다. 아미노산의 변형은 아미노산 잔기 치환체의 유사성, 예를 들면 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어지며, 이를 위해 아미노산의 소수성 인덱스(hodrophobic index)가 고려될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 일부 아미노산의 치환, 결실, 부가 등일 수 있으며, 치환은 특히 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은 결과적인 분자의 생물학적 활성이 유의하게 변경시키지 않는 치환으로서, 치환되는 아미노산이 단백질의 3차 구조 또는 국부 전하 상태에 유의한 영향을 야기하지 않는 경우를 지칭한다. 분자 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미할 수 있다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함할 수 있다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent condition) 하에서, 예를 들어, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 80% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성 또는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. .
본 발명에 있어 “진단”이란, 북미형 및/또는 유럽형에 대한 항체 반응을 탐지하는 것을 의미하며, 시료가 PRRSV 에 감염되었는지 여부 및 북미형 및 유럽형에 감염되었는지 여부를 모두 포함하여 정보를 제공하는 것을 의미한다. 특히 본 발명의 진단은 PRRSV 감염된 시료가 북미형 또는 유럽형 중 어느 유형에 감염되었는지 여부를 신속하고 특이적으로 판별하는 것을 모두 포함한다.
또한 본 발명은 북미형 및 유럽형 특이적인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 목적에 따라 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 진단 및 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
바람직하게는 본 발명의 키트는 효소면역측정법(ELISA)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 ELISA 키트는 항원 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)"란 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법을 말한다. ELISA에는 항원을 검출하는 직접 ELISA와 항체를 검출하는 간접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트보다 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있으며, 다량의 샘플로부터 간단한 공정을 통해 유럽형 및 북미형을 진단할 수 있고, 특히 유럽형 및 북미형에 대한 중화 항체를 확인할 수 있어 백신 연구 및 역학 조사 등에 다양하게 응용할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (VR2332-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 또는
서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계;
2) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 및
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 시료에서 항체를 검출하는 단계; 를 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 시료에서 항체를 검출하는 단계는 본 발명의 단백질 항원과 직접 결합하는 항체를 검출하는 방법 또는 상기 항체와 결합하는 2차 항체를 검출하는 방법 등을 포함하며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 본 발명의 단백질 항원과 반응하는 특이 항체를 돼지 특이 이차항체와 반응시킨 후 색깔 변화를 측정하여 항체 형성 유무 및 면역 수준을 평가하는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있으며, 가장 바람직하게는 혈청일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 북미형 특이적 진단 항원 단백질의 제조
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 따른 돼지에서의 바이러스 유전형을 결정하고 검출하기 위하여 북미형 항원만을 사용하여 유전자를 합성하여 북미형 특이적 항체 검출 진단용 단백질 항원을 제조하였다.
먼저 북미형 대표 표준주인 VR233 주의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N 단백질) 의 전체 서열을 기본으로 하여 디자인하였다. 북미주에 특이적인 비 중화항체 (NNA) 에피토프 크러스터 부위를 선별하였으며, 기초가 되는 서열을 변형하여 북미 주에 특이적인 변형된 NNA 구조체를 수득하였다. 제조된 북미형 특이적 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 도 1에 나타내었으며, 항원 단백질의 서열을 서열번호 7 로 표시하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 제조된 재조합 항원 단백질은 6xHis, maltose binding protein (MBP) fusion protein 서열, TEV cleavage site, Streptavidin binding peptide (SBP), 북미형 돼지생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (VR2332) 뉴클레오캡시드 단백질, 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 단백질 서열을 포함하였다.
pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, pI 조절서열이 포함되지 않은 단백질의 pI 는 9.72로 나타났으며, 이를 포함하는 경우 단백질의 pI 는 10.79 인 것을 확인하였다.
실시예
2. 유럽형 특이적 진단 항원 단백질의 제조
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 따른 돼지에서의 바이러스 유전형을 결정하고 검출하기 위하여 유럽형 항원만을 사용하여 유전자를 합성하여 유럽형 특이적 항체 검출 진단용 단백질 항원을 제조하였다.
먼저 유럽형 대표 표준주인 렐리스타드(Lelystad) 주의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N 단백질) 의 전체 서열을 기본으로 하여 디자인하였다. 유럽형에 특이적인 비 중화항체 (NNA) 에피토프 크러스터 부위의 선별, 제조된 유럽형 특이적 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 도 3에 나타내었으며, 항원 단백질의 서열을 서열번호 10 으로 표시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 제조된 재조합 항원 단백질은 6xHis 서열, maltose binding protein (MBP) fusion protein 서열, TEV cleavage site, Streptavidin binding peptide (SBP), 유럽형 돼지생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (LV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 AviTag 단백질을 유래 서열을 포함하였다.
pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, pI 조절서열이 포함되지 않은 단백질의 pI 는 9.59로 나타났으며, 이를 포함하는 경우 단백질의 pI 는 10.51 인 것을 확인하였다.
실시예
3. 북미형 및 유럽형 동시 진단 항원 단백질의 제조
돼지에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의해 형성된 특이항체를 검출하기 위하여 북미형 및 유럽형 바이러스 특이 항체 동시 반응 단백질 항원을 제조하였다. 북미형 및 유럽형 각각의 대표 표준주인 VR2332 주 및 Lelystad 주의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N 단백질) 의 전체 서열을 기본으로 하였고, 유럽형 분리주 중 Lelystad 주와의 유사성이 가장 낮은 주 및 북미형 분리주 중 VR2332주와의 유사성이 가장 낮은 주의 가변성 부위의 아미노산 서열을 추가하였다. 구체적으로 유럽형 분리주들간 존재하는 항원형의 다양성으로 인한 진단 민감도의 저하(low diagnostic sensitivity)를 극복하기 위해 유럽형 대표 표준주인 Lelystad와 아미노산 서열에서 상동성이 가장 떨어지는 유럽형 변형주(Accession number ABW73274) 를 발굴하여 아미노산 서열의 차이가 가장 심한 구간의 아미노산 서열을 진단항원 제조에 포함시켰다. 북미형 분리주에 대해서도 동일한 방법으로 변형주(Accession number AEV40704)를 발굴하고, 아미노산 서열의 차이가 가장 심한 변형 유발구간 서열을 찾아 진단항원 제조에 포함시켰다. 추가적으로 지금까지 발표된 PRRSV 에피토프들 중에 감염 초기에 나타나는 것들을 다양한 분리주에 대한 진단효율을 높이기 위하여 추가하고, 항원의 수용성을 증가시켜주기 위해 pI 조절 아미노산 서열을 포함시켰다. 항원 구조체는 다양한 PRRSV 의 N 단백질 아형 및 북미 주에 대한 비 중화항체 (non-neutralizing antibody) (NNA) 를 이용하여 디자인하였다. 제조된 항원 단백질의 모식도 및 대응 부위 서열을 도 5 에 나타내었으며, 항원 단백질의 서열을 서열번호 20으로 표시하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이 제조된 재조합 항원 단백질은 GST, 트롬빈 절단 서열, VR2332 주 유래의 N (nucleocapsid) 단백질, Lelystad 주 유래의 N 단백질, 비 중화 항체(non-neutralizing antibody) 에피토프 클러스터(NNA construct), 북미 주 가변성 N 단백질 (NA supplement), 유럽주 가변성 N 단백질(EU supplement) 및 PI 조절 아미노산 서열을 포함하였다.
pI 조절 서열 유무에 따른 pI 를 확인한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, pI 조절서열이 포함되지 않은 76.7kDa, 약 77kDa 단백질의 pI 는 10.01로 나타났으며, pI 조절 서열을 포함하는 80.05kDa 단백질의 pI 는 10.50 인 것을 확인하였다.
실시예
4. 재조합 항원 단백질을 이용한
PRRSV
진단 검증
상기 실시예 1 내지 3 를 통해 도출한 재조합 항원 단백질의 유전자를 합성하고 북미형 및 유럽형 특이적인 재조합 항원 단백질의 유전자 서열을 각각 서열번호 8, 11으로, 북미형 및 유럽형 동시 반응 재조합 항원 단백질의 유전자 서열을 서열번호 21로 나타내었다. 합성된 유전자를 각각 발현벡터인 pGEX-2로 클로닝하고 대장균주 (BL21(DE3) pLysE)에서 1mM IPTG를 이용하여 재조합 단백질을 발현시켰으며, 발현된 단백질을 부분 정제하여 ELISA 진단항원으로 사용하였다. True positive 및 true negative 혈청으로 만든 민감도패널을 이용하여 비교평가시험을 시행하였다. Absorption 방법을 이용한 PRRSV 유형 감별 진단법 모식도를 도 7에 간략하게 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 먼저 실시예 1의 북미형 바이러스에 특이적인 재조합 항원 단백질 및 실시예 2의 유럽형 바이러스에 특이적인 재조합 항원 단백질을 검사용 돼지 혈청을 반응시키고, 이후 실시예 3에서 제조된 동시 반응 재조합 항원 단백질과 야외 혈청과 반응시킨 후, 이에 반응하는 야외 혈청의 바이러스 특이 항체를 돼지 특이 이차항체와 반응시킨 다음 색깔 변화를 측정하여 항체 형성 유무 및 면역 수준을 평가할 수 있게 된다.
이에 따라 북미형 PRRSV 에 감염된 돼지 혈청을 실시예 1에서 제조된 북미형 특이적 재조합 항원 단백질 (rNA-N) 또는 실시예 2에서 제조한 유럽형 특이적 재조합 항원 단백질 (rEU-N) 로 처리한 후에 반응을 확인하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
표 1에 나타낸 바와 같이, 북미형 특이적 재조합 항원 단백질을 처리한 경우, 유럽형 특이적 재조합 항원 단백질을 처리한 경우 및 대장균 항원만을 처리한 경우와 비교하여 뚜렷한 반응 차이가 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 북미형 특이적 재조합 항원 단백질을 이용하는 경우 북미형 특이적인 항체 검출이 가능함을 보여주는 결과이다.
또한 유럽형 PRRSV 에 감염된 돼지 혈청을 이용하여 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
표 2에 나타낸 바와 같이, 유럽형 특이적 재조합 항원 단백질을 처리한 군에서 북미형 특이적 재조합 항원 단백질 또는 대장균 항원만을 처리한 경우와 비교하여 뚜렷하게 낮은 S/N 비가 나타남을 확인하였다. 이러한 결과 역시 유럽형 특이적 재조합 항원 단백질을 이용하는 경우 유럽형 특이적인 항체 검출이 가능함을 보여주는 결과이다.
이후 야외 혈청을 북미형 및 유럽형 특이적 재조합 항원과 먼저 반응시킨 후 유니버셜 재조합 항원 단백질을 이용한 ELISA를 실시하여, 북미형 또는 유럽형 특이적 재조합 항원에 반응하지 않고 남아 있는 혈청내 바이러스 특이 항체의 양을 돼지 특이 이차항체와 반응시킨 다음 색깔 변화를 측정하여 항체의 프로파일을 분석하였다.
마지막으로 개발된 유전형 구분용 진단법을 이용하여 타이핑 비율에 따라 구분한 결과, 실시예 1 내지 3의 북미형 및/또는 유럽형 재조합 항원 단백질을 이용하는 경우, 실험군으로 사용된 유형 특이적 항체 패널들이 모두 명확하게 구별되는 것을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 북미형 및 유럽형 특이적 재조합 항원 및 유니버셜 재조합 항원 단백질을 이용하는 경우 항체 양성인 혈청을 희석하여도 개별 항원을 진단하는 타이핑 효율이 그대로 유지되는 것을 확인하였다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6x His
<400> 1
His His His His His His
1 5
<210> 2
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP(Maltose Binding Protein) fusion protein
<400> 2
Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly
1 5 10 15
Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly
20 25 30
Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His
50 55 60
Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr
65 70 75 80
Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala
85 90 95
Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala
100 105 110
Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr
115 120 125
Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys
130 135 140
Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu
145 150 155 160
Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr
165 170 175
Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu
180 185 190
Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr
195 200 205
Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met
210 215 220
Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val
225 230 235 240
Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys
245 250 255
Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn
260 265 270
Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu
290 295 300
Lys Ser Tyr Glu Glu Val Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr
305 310 315 320
Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met
325 330 335
Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser
340 345 350
Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gly Ser
355 360 365
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEV Cleavage Site
<400> 3
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide (SBP)
<400> 4
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NORTH AMERICAN TYPE Nucleocapsid sequence
<400> 5
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Avi Tag
<400> 6
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein for NORTH AMERICA TYPE
<400> 7
Met His His His His His His Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile
1 5 10 15
Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys
20 25 30
Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp
35 40 45
Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro
50 55 60
Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu
85 90 95
Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala
100 105 110
Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu
115 120 125
Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys
130 135 140
Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe
165 170 175
Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn
180 185 190
Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn
195 200 205
Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe
210 215 220
Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr
245 250 255
Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly
260 265 270
Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu
275 280 285
Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Val Leu Ala Lys
305 310 315 320
Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile
325 330 335
Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr
340 345 350
Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Lys Asp Ala Gln Thr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
370 375 380
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
385 390 395 400
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
405 410 415
Gln Gly Gln Arg Glu Pro Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn
420 425 430
Arg Lys Lys Gly Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu
435 440 445
Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly
450 455 460
Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala
465 470 475 480
Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu
485 490 495
Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys
500 505 510
Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu
515 520 525
Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser
530 535 540
Ala Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
545 550 555 560
<210> 8
<211> 1683
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein for NORTH AMERICA TYPE
<400> 8
atgcatcatc accaccatca caaaatcgaa gaaggtaaac tggtaatctg gattaacggc 60
gataaaggct ataacggtct cgctgaagtc ggtaagaaat tcgagaaaga taccggaatt 120
aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact 180
ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct 240
ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc 300
tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta 360
tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg aacccgccaa aaacctggga agagatcccg 420
gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa 480
ccgtacttca cctggccgct gattgctgct gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac 540
ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc 600
ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca 660
gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc 720
aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa 780
ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa 840
gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt 900
aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg ctgaagtctt acgaggaagt gttggcgaaa 960
gatccacgta ttgccgccac catggaaaac gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc 1020
ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt 1080
cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac gcgcagactg gatccgagaa tctgtacttc 1140
cagggtggat ccatggacga aaaaaccacc ggttggcgtg gtggtcacgt tgttgaaggt 1200
ctggctggtg aactggaaca gctgcgtgct cgtctggaac accacccgca gggtcagcgt 1260
gaaccgatgc ccaataataa cggcaaacag caaaatcgca aaaagggtga tggtcagccg 1320
gtcaatcaac tgtgccagat gctgggaaag attatagcac agcagaatca aagccgcgga 1380
aaaggaccgg gaaaaaaaaa taaaaaaaaa aatccagaga agccccattt cccattggca 1440
actgaagacg atgttcgtca tcatttcact ccgtctgaac gccaactgtg tttgagcagt 1500
atccagacag cgtttaacca aggcgccggt acatgcactt tgtcagactc cggaagaatc 1560
agttatacag ttgaattttc tcttccgacg caccacactg tgcgtctcat tcgcgtaact 1620
gcatctccct cagctggtct gaacgacatc ttcgaggctc agaaaatcga atggcacgaa 1680
taa 1683
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EUROPEAN TYPE Nucleocapsid sequence
<400> 9
Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro
1 5 10 15
Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala
20 25 30
Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys
35 40 45
Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile
50 55 60
Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr
100 105 110
Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 565
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein for European Type
<400> 10
Met His His His His His His Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile
1 5 10 15
Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys
20 25 30
Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp
35 40 45
Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro
50 55 60
Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu
85 90 95
Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala
100 105 110
Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu
115 120 125
Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys
130 135 140
Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe
165 170 175
Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn
180 185 190
Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn
195 200 205
Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe
210 215 220
Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr
245 250 255
Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly
260 265 270
Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu
275 280 285
Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Val Leu Ala Lys
305 310 315 320
Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile
325 330 335
Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr
340 345 350
Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Lys Asp Ala Gln Thr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
370 375 380
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
385 390 395 400
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
405 410 415
Gln Gly Gln Arg Glu Pro Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys
420 425 430
Lys Lys Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu
435 440 445
Cys Gln Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg
450 455 460
Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu
465 470 475 480
Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser
485 490 495
Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr
500 505 510
Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met
515 520 525
Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser
530 535 540
Ala Ser Gln Gly Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
545 550 555 560
Ile Glu Trp His Glu
565
<210> 11
<211> 1698
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein for European Type
<400> 11
atgcatcatc accaccatca caaaatcgaa gaaggtaaac tggtaatctg gattaacggc 60
gataaaggct ataacggtct cgctgaagtc ggtaagaaat tcgagaaaga taccggaatt 120
aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact 180
ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct 240
ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc 300
tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta 360
tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg aacccgccaa aaacctggga agagatcccg 420
gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa 480
ccgtacttca cctggccgct gattgctgct gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac 540
ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc 600
ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca 660
gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc 720
aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa 780
ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa 840
gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt 900
aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg ctgaagtctt acgaggaagt gttggcgaaa 960
gatccacgta ttgccgccac catggaaaac gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc 1020
ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt 1080
cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac gcgcagactg gatccgagaa tctgtacttc 1140
cagggtggat ccatggacga aaaaaccacc ggttggcgtg gtggtcacgt tgttgaaggt 1200
ctggctggtg aactggaaca gctgcgtgct cgtctggaac accacccgca gggtcagcgt 1260
gaaccgatgg ctggtaagaa ccaaagccag aaaaagaaaa agagcactgc cccgatgggt 1320
aacggtcaac cggtgaatca actttgccag ttgctgggtg cgatgattaa gagccagcgc 1380
cagcaaccgc gtggcggcca agctaaaaag aagaagccgg agaaaccaca ttttccgctg 1440
gcagcagaag atgatatccg ccaccacctg acgcagaccg agcgtagcct gtgtctgcag 1500
tccatccaaa ccgcattcaa tcagggcgct ggtacggcta gcctgtccag cagcggtaaa 1560
gtttcgtttc aagttgagtt catgctgccg gtcgcccaca ccgttcgcct gattcgcgtc 1620
acctcaacgt ccgcgagcca aggtgcaagc ggtctgaacg acatcttcga ggctcagaaa 1680
atcgaatggc acgaataa 1698
<210> 12
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST sequence
<400> 12
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val
210 215 220
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> thrombin cleavage sequence
<400> 13
Pro Arg Gly Ser
1
<210> 14
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VR2332-N nucleocapside sequence
<400> 14
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 15
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lelystad nucleocapside sequence
<400> 15
Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro
1 5 10 15
Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala
20 25 30
Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys
35 40 45
Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile
50 55 60
Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr
100 105 110
Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> non neutralizing antibody epitope cluster
<400> 16
Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ile Thr Ala Asn Val
1 5 10 15
Thr Asp Glu Ser Tyr Leu Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr
20 25 30
Asn Leu Thr Gln Pro Leu Thr Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala
35 40 45
Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Leu Val
50 55 60
Asn Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg
65 70 75 80
Val Gln Trp Gly Arg Pro
85
<210> 17
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EU PRRSV variant nucleocapsid sequence
<400> 17
Met Ala Gly Arg Asn Gln Arg Gln Lys Arg Asn Asn Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Met Gly Asn Asp Gln Ser Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Lys
20 25 30
Met Met Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Val Asn Lys
35 40 45
Arg Lys Arg Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala
50 55 60
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NA PRRSV variant nucleocapsid sequence
<400> 18
Met Pro Asn Asn Asn Gly Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Arg Gln Arg
35 40 45
Ser Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala
50 55
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI adjuster seqence
<400> 19
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 706
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein
<400> 20
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile
245 250 255
Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys
260 265 270
Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp
275 280 285
Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser
290 295 300
Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp
305 310 315 320
Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His
325 330 335
Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala Met Ala Gly
340 345 350
Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn
355 360 365
Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys
370 375 380
Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro
385 390 395 400
Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His
405 410 415
Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala
420 425 430
Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val
435 440 445
Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu
450 455 460
Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser Gly Tyr Asp
465 470 475 480
Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu
485 490 495
Ser Tyr Leu Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr
500 505 510
Gln Pro Leu Thr Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala Ile Gln Thr
515 520 525
Ala Phe Asn Gln Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Leu Val Asn Arg Leu
530 535 540
Tyr Arg Trp Arg Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Gln Trp
545 550 555 560
Gly Arg Pro Met Ala Gly Arg Asn Gln Arg Gln Lys Arg Asn Asn Asn
565 570 575
Thr Ala Ser Met Gly Asn Asp Gln Ser Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu
580 585 590
Leu Gly Lys Met Met Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln
595 600 605
Val Asn Lys Arg Lys Arg Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala
610 615 620
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Met Pro Asn Asn
625 630 635 640
Asn Gly Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn
645 650 655
Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser
660 665 670
Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Arg Gln Arg Ser Pro Glu Lys
675 680 685
Pro His Phe Pro Leu Ala Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg
690 695 700
Lys Arg
705
<210> 21
<211> 2118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant antigenic protein
<400> 21
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gtggatctat gccaaacaac aacggtaaac aacagaatcg caagaaaggt 720
gacggccagc cggttaatca gttatgtcag atgctgggca agattatcgc gcagcagaat 780
cagagccgtg gtaaaggtcc gggcaagaaa aacaagaaga aaaatccgga gaagcctcac 840
ttccctctgg cgacggaaga tgacgtgcgt caccatttca ccccgagcga acgccaactg 900
tgcctgagct cgattcagac cgcgtttaat cagggtgcgg gtacgtgtac gctgtctgac 960
agcggccgta tcagctatac ggttgagttt agcctgccga cccatcatac cgtgcgcctg 1020
atccgtgtta ccgccagccc gtccgcaatg gctggtaaga accaaagcca gaaaaagaaa 1080
aagagcactg ccccgatggg taacggtcaa ccggtgaatc aactttgcca gttgctgggt 1140
gcgatgatta agagccagcg ccagcaaccg cgtggcggcc aagctaaaaa gaagaagccg 1200
gagaaaccac attttccgct ggcagcagaa gatgatatcc gccaccacct gacgcagacc 1260
gagcgtagcc tgtgtctgca gtccatccaa accgcattca atcagggcgc tggtacggct 1320
agcctgtcca gcagcggtaa agtttcgttt caagttgagt tcatgctgcc ggtcgcccac 1380
accgttcgcc tgattcgcgt cacctcaacg tccgcgagcc aaggtgcaag cggttatgac 1440
aatctcaaat tggaaggcta ctacatcacc gcgaacgtga ccgatgagag ctacctgtat 1500
gacagcagca cgtaccagta catttacaac ctgacccagc cgctgacccg cactagcgcg 1560
gagcaatggg aagccattca aaccgcgttc aaccagggcg cagtcctggt gaatgccctg 1620
gtcaatcgtc tgtatcgttg gcgtgagggt catctgatcg acctgaagcg tgttcagtgg 1680
ggccgtccga tggcaggccg taaccaacgt caaaaacgca ataacaacac cgcgagcatg 1740
ggtaatgatc agagcgtcaa ccagctgtgc cagctgctgg gcaaaatgat gaaaagccaa 1800
cgtcaacagc cgcgtggtgg tcaagtcaac aagcgcaaac gtccagagaa gccgcacttt 1860
ccgttggcgg cgaagcgtaa acgtaaacgc aaacgtaagc gtaagcgcat gccgaacaat 1920
aacggtcgtc aacagaagaa aaaaaagggt aacggccaac cggtcaatca actgtgccag 1980
atgttgggta aaatcattgc gcagcaaaat cagtctcgtg gcaagggtcc gggtaaaaag 2040
aaccgtcagc gttcccctga aaaaccgcac ttcccgctgg ccaaacgcaa gagaaagcgc 2100
aagcgtaaaa gaaaacgt 2118
Claims (14)
- 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 항원 단백질은 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 제2항에 있어서, 상기 항원 단백질은 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 항원 단백질은 서열번호 10으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 항원 단백질은 서열번호 11로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질.
- 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 및
2) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 7 로 표시되고, 상기 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 10으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
3) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 더 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질은 서열번호 21로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 키트는 효소면역측정법 키트인 것을 특징으로 하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 키트.
- 1) 서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 5로 표시되는 북미형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질; 또는
서열번호 2 로 표시되는 MBP (maltose binding protein) 서열, 서열번호 3으로 표시되는 TEV 서열, 서열번호 4로 표시되는 SBP(Streptavidin binding peptide) 서열, 서열번호 9로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 (LV-N) 단백질 유래 서열 및 서열번호 6으로 표시되는 AviTag 서열을 포함하는, 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계;
2) 서열번호 14로 표시되는 북미형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 15로 표시되는 유럽형 PRRSV 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열, 서열번호 16으로 표시되는 비중화 항체 에피토프 클러스터, 서열번호 17로 표시되는 유럽형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열 및 서열번호 18로 표시되는 북미형 PRRSV 가변 뉴클레오캡시드 단백질 유래 서열을 포함하는, 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 항원 단백질을 시료와 접촉시키는 단계; 및
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 시료에서 항체를 검출하는 단계; 를 포함하는 북미형 및 유럽형 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단 방법.
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| WO2022086064A1 (ko) * | 2020-10-21 | 2022-04-28 | 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 | 스트렙트아비딘 결합 펩타이드가 태그된 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 특이적 항원 및 이의 용도 |
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| KR20180015210A (ko) * | 2018-02-02 | 2018-02-12 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 |
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| KR20220052645A (ko) * | 2020-10-21 | 2022-04-28 | 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 | 스트렙트아비딘 결합 펩타이드가 태그된 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 특이적 항원 및 이의 용도 |
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