KR20210106181A

KR20210106181A - 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210106181A
Application number: KR1020200021013A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 윤선우; 송대섭
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-08-30
Also published as: KR102648716B1

Abstract

본 발명은 항원 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 항원 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법 및 키트는 특정의 아프리카 돼지 열병 바이러스 항원 단백질을 이용하여 높은 특이성 및 민감성으로 신속하면서 편리하게 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 진단하고 유사한 임상적 병리를 가지는 다른 질환과도 구분할 수 있는 우수한 진단 효과를 나타낸다.

Description

아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물 및 이의 용도 {Antigen protein composition for diagnosing infection of African Swan Fever and use thereof}

본 발명은 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물, 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.

아프리카 돼지 열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)는 아프리카 돼지 열병의 원인 인자로서 감염 세포의 세포질을 복제하는 거대 이중 나선 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 아스파바이러스 과(Asfarviridae), 아스피바이러스 속(Asfivirus)에 속하는 약 200nm 정도의 DNA 바이러스이고 유전자 염기서열 분석을 통해 총 23개의 유전형(genotype)으로 구분되고 있으며, 돼지에게 치명적인 출혈열을 야기한다. 어떤 분리 바이러스는 감염 후 한 주만에 빠르게 동물의 죽음을 야기할 수 있다. 이 바이러스는 다른 모든 종에게는 명백한 질병을 야기하지 않는다. 이 바이러스는 사하라 이남 아프리카에 풍토적이고, 진드기, 멧돼지, 강멧돼지, 혹멧돼지 사이의 감염 주기를 거쳐 야생 상태로 현존한다.

아프리카 돼지 열병 바이러스는 병원성에 따라 보통 고병원성, 중병원성 및 저병원성으로 분류된다. 고병원성은 보통 심급성(감염 1-4일 후 돼지가 죽음) 및 급성형(감염 3-8일 후 돼지가 죽음) 질병을, 중병원성 균주는 급성(감염 11-15일 후 돼지가 죽음) 및 아급성(감염 20일 후 돼지가 죽음)형 질병을 일으킨다. 저병원성은 풍토병화된 지역에서만 보고되었으며 준임상형 또는 만성형 질병을 일으킨다. 이병률(감염된 동물의 비율)은 감염된 바이러스와 노출 경로에 따라 달라지며 자연 감염 시 잠복기는 4일에서 19일까지 다양하다. 폐사율은 고병원성 바이러스에 감염된 경우 거의 100% 폐사되는 것이 특징이며 만성형에서는 20% 이하이다. 일부 풍토병화된 지역에서는 바이러스에 대한 돼지의 적응으로 인해 고병원성에 감염된 돼지에서의 생존률이 좀 더 높아질 수 있다.

이러한 아프리카 돼지 열병은 21세기에 접어들면서 2007년 조지아를 시작으로 동부 유럽지역과 러시아 연방에서 발생을 지속하고 있다. 아시아에서는 이란에서 발생한 이후 2018년 들어 중국에서 8월 첫 발생하였고 점차 발생지역이 확대되고 있어 시간이 갈수록 문제의 심각성이 높아지고 있다. 이에 따라 대한민국 농림축산식품부도 아프리카 돼지 열병 예방관리대책에 이어 긴급행동지침(SOP)을 제작하여 배포할 정도로 이의 심각성에 대해 크게 인지하고 있다.

현재 아프리카 돼지 열병을 방어할 수 있는 백신은 상용화되어 있지 않다. 유럽지역에서 아프리카 돼지 열병이 다시 확산되고 아시아 대륙까지 전파되면서 과거 제대로 진행되지 못했던 백신에 대한 개발 연구에 이목이 집중되고 있으나 아직 개발된 치료제가 없는 상태이다. 이에 따라 바이러스가 국내에 유입되지 않도록 하는 것이 최선이나, 이의 유입시 이를 빠른 시간 내에 진단하고 확인하여 이를 격리시켜 이의 확산을 막을 필요가 있다. 또한, 임상적으로 유사한 소견 때문에 아프리카 돼지 열병의 병변은 다른 전신 출혈성 및 패혈증성 전염병과 감별이 필요하다. 임상 증상이나 병변이 가장 유사한 형태는 돼지 열병(classical swine fever), 돈단독, 전신성 살모넬라증(Salmonella Cholerasuis 감염증) 등이 있으며, 최근 중국 및 동남아 지역에서 발생하는 고병원성 돼지생식기호흡기증후군(HP-PRRS)과 피부 병변의 특성상 돼지피부염신증증후군(PDNS)도 감별대상이다. 유사산 또는 자돈의 청색증 등의 소견을 고려하면 오제스키병이나 액티노바실러스 감염증도 감별대상이 된다. 비감염성 원인 중에서는 출혈성 병변을 동반하는 와파린 등의 살서제, 아플라톡신과 같은 일부 곰팡이독소, 살충제 등이 포함될 수 있다.

위와 같은 문제점으로 인하여, 아프리카 돼지 열병의 확진을 위한 공인된 실험실의 진단 검사가 필수적으로 수행될 필요가 있다. 실험실 진단 검사는 혈액 및 내부 장기에서 ASFV를 검출하거나 감염된 돼지의 혈청에서 항체를 검출하는 방법 등이 있을 수 있겠으나, 이와 관련된 기술은 현재 매우 미비한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 아프리카 돼지 열병 바이러스 CD2v, p54, p22 및/또는 CAP80 항원 단백질들을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 조성물 및 진단 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 시료와 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 시료 중 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, p54, p22 및 CAP80의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 (a) 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 시료와 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 시료 중 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, p54, p22 및 CAP80 의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서는, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 다양한 항원 단백질들을 검토하여 그 중 항원성이 높은 CD2v, p54, p22 및/또는 CAP80을 이용함으로써 높은 특이성 및 민감성을 가지면서도 신속하면서 편리하게 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 진단하는 우수한 효과를 확인하고, 이를 통해 아프리카 돼지 열병 바이러스의 검출의 유용성을 확인함과 동시에 국내 축산업을 보호하고 국내 가축방역에 기여할 수 있다.

본 발명에서 상기 "진단"은 대상, 예컨대 돼지과 (Suidae)의 특정 바이러스, 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 바이러스 보유, 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 보균/보유의 유무를 확인하는 것이다. 특히 돼지과 동물에서의 아프리카 돼지 열병 바이러스의 보균/보유의 유무를 확인하는 것이다.

위 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단의 대상이 되는 돼지과 동물은 바람직하게 사육돼지와 유럽과 아메리카대륙의 야생멧돼지로 바이러스에 대한 내성이 없는 돼지과 동물이다. 이들 동물은 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염시 임상적으로 예컨대 아래와 같은 병변을 나타낼 수 있다 :

(1) 심급성형(Peracute)

심급성형은 고병원성 바이러스에 감염되어 나타나며, 41-42°C의 고열, 식욕결핍, 무기력, 호흡항진 및 피부의 충혈이 나타나는 것이 특징이다. 보통 임상증상이 시작된 지 1-4일 만에 돼지가 갑자기 죽고 장기에 뚜렷한 병변이 나타나지 않는다.

(2) 급성형(Acute)

가장 일반적으로 나타나는 유형이며 고병원성이나 중병원성 바이러스에 의해 유발된다. 거의 대부분의 감염된 돼지는 발열이 시작된 지 1주일 후에 쇼크로 죽으며 일반적으로 입과 코 주변에 기포가 관찰된다.

또한, 비장의 크기가 정상보다 6배까지 커질 수 있는 특징적인 충혈성 비장비대증을 나타내는데, 이때 비장 변연부가 둥그렇게 되고 만져보면 무르고 검보라색이며 복강 전체를 차지할 만큼 커질 수 있다. 그리고, 주로 위와 간 및 신장의 림프절 수질에 출혈을 나타내며 따라서 이환된 림프절 단면부위가 가끔 대리석 양상을 보이며, 신장의 수질부위와 신우, 그리고 방광 점막, 심외막, 심내막 및 흉막 부위에 점상출혈이 있다.

(3) 아급성형(Subacute)

아급성형은 중병원성 바이러스로 인해 발생하며 이환된 동물은 급성형에 감염된 돼지와 유사하나 덜 뚜렷한 임상증상을 나타낸다. 그러나, 아급성형에서 보이는 출혈이나 부종 같은 혈관성 변화들은 급성형에서 보고된 것보다 훨씬 더 심하다. 비록 일시적이긴 하지만 심한 혈소판 감소증의 발현과 관련이 있는 출혈은 이 질병의 초기와 중기 단계에서 관찰된다. 일반적으로 유산이 아급성형의 첫번째 임상증상이다. 이환된 돼지들은 보통 7-20일 이내에 죽고 폐사율은 30~70% 범위에 달한다.

(4) 만성형(Chronic)

저병원성 바이러스에 의해 발생하며 다른 유형과 달리 만성형은 혈관 병변이 없고 섬유소성 흉막염 또는 심낭염, 흉부유착, 괴사성 폐염, 섬유소성 관절염/관절주위염 및 괴사성 피부병변 뿐만 아니라 편도선과 혀에 괴사 부위과 같은 세균이 연루된 병변이 존재하는 것이 특징이다.

본 발명의 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법은 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함한다. 구체적으로, (a) 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 시료와 반응시키는 단계;를 포함한다.

본 발명에 따른 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수, 또는 복수액 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원 발명에 따른 일실시양태에서는 혈액, 특히 혈청일 수 있다.

본 발명에 따른 항원 단백질 조성물은 아프리카 돼지 열병 바이러스에서 발현되는 항원 단백질로 알려져 있는 CD2v, p54, p22 및/또는 CAP80의 서열을 이용한 것으로, 높은 항원성을 이용하여 우수한 진단 효과를 나타낼 수 있게 한다.

본 발명에 따른 항원 단백질 조성물은 각각 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 염기서열로부터 합성된 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 또는 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질일 수 있다. 이러한 염기서열로부터 단백질서열의 합성은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 단백질 또는 염기서열은 기능적 동등물을 포함한다. 상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열들과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상 갖는 것이다. 예컨대, 서열번호 5 내지 8으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 (a) 단계에서 바람직하게 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질을 모두 포함하는 항원 단백질 조성물을 시료와 반응시킬 수 있다. 이들을 모두 포함함으로써 보다 더 우수한 민감성과 정확성으로 아프리카 돼지 열병 바이러스를 진단할 수 있다.

이러한 항원 단백질 조성물과 시료의 반응은 항원-항체 복합체 반응이다.

본 발명의 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법은 (b) 상기 (a) 단계의 시료 중 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, p54, p22 및 CAP80의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다.

본원 발명에 따른 항체를 검출하는 단계는 위 항원 단백질 조성물과 시료의 반응에 따른 항원-항체 복합체 형성 반응으로부터 생성된 항체를 검출하는 것을 의미한다. 이의 가장 큰 장점은 항원성이 높은 항원 단백질을 이용하므로 항체의 검출에 대한 특이도 및 민감도가 높다.

항원-항체 복합체 반응에 의한 검출은 기존에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 포함하는 방법이 가장 바람직하다.

본 발명에서 "ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)"란 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법을 말한다. ELISA에는 항원을 검출하는 직접 ELISA와 항체를 검출하는 간접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서는 간접 ELISA를 이용하였다

이러한 항체를 검출하는 단계에서의 대조군은 아프리카 돼지 열병 바이러스를 가지지 않은 정상 대조군 즉 건강한 돼지과 동물 또는 타 돼지 관련 바이러스를 가지는 돼지과 동물 등으로부터 유래한 시료일 수 있다. 상기 항체를 검출하여 대조군 대비 일정 수준 이상 검출 수준이 증가하는 경우 아프리카 돼지 열병 바이러스를 보유하는 것으로 판단한다.

본 발명은 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트는 높은 특이성 및 민감성을 가지면서도 신속하면서 편리하게 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 진단하는 우수한 효과를 확인하고, 이를 통해 아프리카 돼지 열병 바이러스의 검출에 유용하여, 국내 축산업을 보호하고 국내 가축방역에 기여할 수 있다.

본원 발명은 바람직하게 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질을 모두 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)와 관련된 키트 장치를 더 포함할 수 있다. ELISA 키트는 항원 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 진단용 키트는 간접(Indirect) ELISA 키트일 수 있다. 즉, microtiter 폴레이트에 항원 단백질을 coating 한 후 항원-항체반응을 이용 항체를 결합시키고 결합된 항체의 양을 효소가 결합된 2차 항체와 반응시켜 최종적으로 효소활성을 측정함으로서 검정하는 방식을 통해 진단을 수행할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.

또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 항원 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법 및 키트는 특정의 아프리카 돼지 열병 바이러스 항원 단백질을 이용하여 높은 특이성 및 민감성으로 신속하면서 편리하게 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 진단하고 유사한 임상적 병리를 가지는 다른 질환과도 구분할 수 있는 우수한 진단 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 CD2v 항원 단백질을 정제하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 p54 항원 단백질을 정제하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 p22 항원 단백질을 정제하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 CAP80 항원 단백질을 정제하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 상용화 키트인 ID Screen® African Swine Fever Indirect (IDvet)를 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 CD2v, p54, p22 및 CAP80의 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 CD2v 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 p54 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 p22 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 CAP80 항원 단백질을 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아프리카 돼지 열병 바이러스 항원 단백질의 제조

실험에 사용된 아프리카 돼지 열병 구조 단백질의 염기서열은 각각 서열번호 1 (CD2v), 서열번호 2 (p54), 서열번호 3 (p22) 또는 서열 번호 4(CAP80)에 나타내었다. 상기 서열은 각각의 전체 유전자 서열인 서열번호 9(CD2v 전체 유전자 서열), 10 (p54 전체 유전자 서열), 11 (p22 전체 유전자 서열), 또는 12(CAP80 전체 유전자 서열)의 일부 또는 전체 서열을 사용한 것으로 아미노산 잔기의 위치 및 사용된 염기 서열은 서열정보를 통해 구체적으로 확인할 수 있다.

CD2v-N 말단 항원을 제작하기 위하여 전체 CD2v 단백질 중 아미노산 잔기 20-197 위치의 유전자 서열(서열번호 1)을 EcoRI과 NotI을 사용하여 pAcGP-67a-6HT 벡터에 단백질의 C-말단에 6개의 히스티딘이 붙도록 서브클론한 후, 곤충 세포 발현 시스템을 이용하여 발현하였다.

His-태그된 pAcGP-67a-CD2v-N(20-197)-6HT를 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하였고, Q 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하였다. Q 이온 교환 크로마토그래피 과정 중 flow through를 CD2v-N1, 정제된 분획을 모은 것을 CD2v-N2라 하고 CD2v-N2는 SP 이온 교환 크로마토그래피를 과정을 진행하였다. CD2v-N1와 CD2v-N2는 Superdex 200 겔 여과 크로마토그래피를 통해 최종 용액이 2X PBS가 되도록 정제하였다. 위 정제 결과는 도 1에 나타내었다.

또한, p54 항원을 제작하기 위하여 전체 p54 단백질 중 아미노산 잔기 59-184 위치의 유전자 서열(서열번호 2)을 BamHI과 XhoI을 사용하여 pET-28a-MBP 벡터에 단백질의 N- 말단에 MBP와 6개의 히스티딘이 붙도록 서브클론한 후, 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) RIL 균주 (strain)를 사용하여 과발현 시켰다. 단백질을 대장균에 접종하고 OD 600nm에서 0.5~0.6사이에 0.2mM IPTG를 넣고 18시간 동안 290 K에서 배양하였다. His-태그된 pET-28a-MBP-p54(59-184)를 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하였고, TEV protease를 처리하여 MBP와 6-His-tag를 잘라내었다. 니켈-친화성 크로마토그래피를 한 번 더 진행하여 잘라낸 MBP와 6-His-tag를를 제거하였고 SP 이온 교환 크로마토그래피와 Superdex 75 겔 여과 크로마토그래피를 통해 최종 용액이 2X PBS가 되도록 정제하였다. 정제 결과는 도 2에 나타내었다.

p22 항원을 제작하기 위하여 전체 p22 단백질 중 아미노산 잔기 32-177 위치의 유전자 서열(서열번호 3)을 BamHI과 NotI을 사용하여 pAcGP-67a-6HT 벡터에 단백질의 C- 말단에 6개의 히스티딘이 붙도록 서브클론한 후, 곤충 세포 발현 시스템을 이용하여 발현하였다. His-태그된 pAcGP-67a-p22(32-177)-6HT를 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하였고, 최종 용액이 2X PBS가 되도록 Superdex 200 겔 여과 크로마토그래피로 최종 정제하였다. 정제 결과는 도 3에 나타내었다.

CAP80 항원을 제작하기 위하여 전체 CAP80 단백질의 유전자 서열(서열번호 4)을 EcoRI과 NotI을 이용하여 pET-28a 벡터에 단백질의 N- 말단에 6개의 히스티딘이 붙도록 서브클론한 후, 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) RIL 균주 (strain)를 사용하여 과발현시켰다. 단백질을 대장균에 접종하고 OD 600nm에서 0.5~0.6사이에 0.2mM IPTG를 넣고 18시간 동안 290K에서 배양하였다. His-태그된 pET-28a-CAP80을 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제한 후, Q 이온 교환 크로마토그래피와 Sepacrly 200 겔 여과 크로마토그래피를 통해 최종 용액이 2X PBS가 되도록 정제하였다. 정제 결과는 도 4에 나타내었다.

위 결과로부터 제조된 항원 단백질 서열을 각각 서열번호 5 내지 8로 나타내었다.

실시예2. 제작된 재조합 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스의 진단 실험

2.1. 시료의 확인

아프리카돼지열병에 감염되었을 것으로 예상되는 시료(80개)를 베트남 돼지 농장들로부터 얻었다. 얻은 감염 시료를 qPCR 키트인 VDx® ASFV qPCR(메디안디노스틱)를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 qPCR을 수행하여, Ct Value를 얻었다.

그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 확인할 수 있는 바와 같이, 총 80 종의 시료 중 총 70 종의 시료에서 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 확인하고 나머지 10 종의 시료의 경우 감염되지 않음을 확인하였다.

2.2. 대조군 상용화 키트를 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 확인

상기 실시예 2.1.에서 감염이 확인된 총 70종의 시료 및 비감염된 시료 10종에 대하여 상용화 키트인 ID Screen® African Swine Fever Indirect (IDvet)을 이용하여 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 항-혈청을 희석한 후 ELISA를 제조사의 지침에 따라 수행하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상용화 키트인 ID Screen® African Swine Fever Indirect (IDvet) 경우 일부 시료에서 감염을 확인할 수 있었다. 그러나, 항-혈청의 희석 정도가 높아지는 경우 검출이 거의 이루어지지 않음이 확인되어, 특이성 및 민감도가 낮은 것으로 확인되었다.

2.3. 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, p54, p22 및 CAP80의 항원 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 확인

제작된 재조합 단백질을 각각 혹은 섞어서 96 well plate에 코팅하여 아프리카 돼지 열병 바이러스에 걸린 돼지의 혈청과 걸리지 않은 돼지 혈청에 대해 Indirect ELISA 실험을 수행하였다.

먼저, 각각의 항원 재조합 단백질을 1 μg/ml의 농도로 0.2 M Carbonate-Bicarbonate buffer를 이용하여 4 ℃에서 16~24 시간 동안 반응시켰다. 이후 비-특이적인 반응을 Block 시키기 위해 2% BSA/PBS를 이용하여 1시간 동안 37 ℃에서 반응 시키고, 세척 후 아프리카 돼지 열병 바이러스에 걸린 돼지의 혈청과 걸리지 않은 돼지 혈청을 3 시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 세척 후 접합체액(HRP)이 붙은 2차 항체를 1 시간 동안 37 ℃에서 반응 시키고, 세척 후 Substrate solution을 7 분 동안 상온에서 반응시켰다. 그 다음 0.5 M 황산(H₂SO₄)를 이용하여 반응을 중지시켜서 450nm에서 OD값을 측정하여 양성 혹은 음성을 파악하였다. 앞서 실시예 2.2.와 마찬가지로 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 항-혈청을 희석한 시료를 사용하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 CD2v, p54, p22 및 CAP80 항원 단백질 조합 키트는 매우 우수한 특이성 및 민감도로 항-혈청의 희석 정도가 높은 시료에서도 우수하게 바이러스를 검출하였다.

특히, 본 발명에 따른 CD2v, p54, p22 및 CAP80 항원 단백질 조합 키트는 상용화 키트에서 검출되지 않았던 농도 등에서도 우수한 효과로 감염 여부를 진단할 수 있었다.

2.4 각각의 재조합 항원 단백질들의 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 반응 실험

상기 실시예 2.3과 동일한 방식으로 각각의 항원 단백질 CD2v, p54, p22 또는 CAP80를 이용하여 아프리카 돼지 열병 바이러스에 걸린 돼지의 혈청과 걸리지 않은 돼지 혈청에 대해 Indirect ELISA 실험을 수행하였다. 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 항-혈청을 희석한 시료를 사용하여 실험을 수행하였고, 각각의 실험 결과를 도 7 내지 10에 구체적으로 기재하였다.

도 7은 CD2v 항원 단백질을 사용한 결과를 나타내며, 도 8은 p54 항원 단백질을 사용한 결과를 나타내며, 도 9는 p22 항원 단백질을 사용한 결과를 나타내며, 도 10은 CAP80 항원 단백질을 사용한 결과를 나타낸다.

각각의 도 7 내지 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, CD2v, p54, p22 또는 CAP80 항원 단백질 각각은 우수한 특이성 및 민감도로 항-혈청의 희석 정도가 높은 시료에서도 우수하게 바이러스를 검출하였다.

상기 결과들로부터 본 발명의 항원 단백질을 이용한 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법 및 키트가 특정의 아프리카 돼지 열병 바이러스 항원 단백질을 이용하여 높은 특이성 및 민감성으로 신속하면서 편리하게 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염을 진단하고 유사한 임상적 병리를 가지는 다른 질환과도 구분할 수 있는 우수한 진단 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, CD2v, p54, p22 및 CAP80 항원 단백질 조합의 경우 상용화되고 있는 키트와 대비하여 매우 우수한 효과로 바이러스 감염 진단에 효과를 나타낸다는 점에서 그 기술 우수성이 뛰어난 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Antigen protein composition for diagnosing infection of African Swan Fever and use thereof <130> 1.52P <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD2v insert <400> 1 atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacataag caagatggta 60 agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120 cccgggaatt cggttagttt taataaaaca ataattttag atagtaatat tactaatgat 180 aataatgata taaatggagt atcatggaat ttttttaata attcttttaa tacactagct 240 acatgtggaa aagcaggtaa cttttgtgaa tgttctaatt atagtacatc aatatataat 300 ataacaaata attgtagctt aactattttt cctcataatg atgtatttga tacaacatat 360 caagtagtat ggaatcaaat aattaattat acaataaaat tattaacacc tgctactccc 420 ccaaatatca catataattg tactaatttt ttaataacat gtaaaaaaaa taatggaaca 480 aacactaata tatatttaaa tataaatgat acttttgtta aatatactaa tgaaagtata 540 cttgaatata actggaataa tagtaacatt aacaatttta cagctacatg tataattaat 600 aatacaatta gtacatctaa tgaaacaaca cttataaatt gtacttattt aacattgtca 660 tctaacgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccac 699 <210> 2 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p54 insert <400> 2 ggccatatgg ctagcatgac tggtggacag caaatgggtc gcggatccgc tgctgctatt 60 gaggaggaag atatacagtt tataaatcct tatcaagatc agcagtgggt agaagtcact 120 ccacaaccag gtacctctaa accagctgga gcgactacag caagtgtagg caagccagtc 180 acgggcagac cggcaacaaa cagaccagca acaaacaaac cagttacgga caacccagtt 240 acggacagac tagtcatggc aactggcggg ccggcggccg cacctgcggc cgcgagtgct 300 cctgctcatc cggctgagcc ttacacgaca gtcactactc agaacactgc ttcacaaaca 360 atgtcggcta ttgaaaattt acgacaaaga aacacctata cgcataaaga cctagaaaac 420 tccttg 426 <210> 3 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p22 insert <400> 3 atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacataag caagatggta 60 agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120 ccccaacaac caccgaaaaa ggtctgtaaa gtagataaag attgtggtag tggagagcat 180 tgtgttcgtg gatcatgtag ctcattgagc tgcttagatg ccgtaaaaat ggacaaacga 240 aatattaaga tagattctaa gatttcctca tgcgaattca ctcccaattt ttaccgtttt 300 acggatactg ctgctgatga gcagcaagaa tttggaaaaa cacggcatcc tataaaaata 360 actccatctc caagtgaatc ccatagcccc caagaggtgt gtgaaaaata ttgttcatgg 420 ggaaccgatg actgtacagg ttgggaatat gttggtgatg aaaaggaggg aacatgttat 480 gtatataata atccacatca cccggttctt aaatatggta aggatcacat catagcctta 540 cctagaaatc ataaacatgc agcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccac 594 <210> 4 <211> 1698 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP80 insert <400> 4 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat ggcagaattt 120 aatattgatg agcttctcaa aaacgtattg gaggatccct ctactgaaat atccgaagaa 180 acgcttaaac agctttacca aaggacgaac ccttacaaac agttcaaaaa tgatagcagg 240 gtggcctttt gctcttttac aaatttgcgg gagcagtata ttcgacgtct tataatgact 300 agctttattg gatatgtctt caaagctctg caggaatgga tgccttccta ttcaaaacct 360 acccacacga ccaaaactct tctcagtgag ctaataacgt tagttgatac tttgaaacag 420 gaaactaatg atgttccctc tgaatcggta gtaaatacaa ttttatctat agcagatagc 480 tgcaaaaccc agacgcagaa aagcaaggaa gctaaaacaa cgatcgatag ctttttacga 540 gaacattttg tgtttgatcc taatcttcat gctcaaagtg cgtatacttg tgcagatacc 600 aatgtagaca cttgtgcaag catgtgtgca gataccaatg tagacacctg tgcaagcatg 660 tgtgcagata ccaatgtaga tacctgtgca agcacttgta caagcacaga atacaccgat 720 ttagcagatc ctgagcgcat ccctttacac atcatgcaaa aaacattaaa tgtgcctaat 780 gagcttcagg ccgatattga tgcaatcacc caaaccccac agggctatag ggcagcagcc 840 cacatattac aaaatataga acttcaccaa agcattaaac atatgcttga aaatccgagg 900 gcgtttaaac ccattctctt taacacaaaa attactagat atctttcgca gcatattcca 960 cctcaggata ctttttataa gtggaattat tacattgagg ataattacga agagttgcgg 1020 gccgctacgg aaagcatcta cccagaaaaa cccgacctag agtttgcctt cattatttat 1080 gatgtggtgg atagcagcaa ccaacaaaag gttgatgaat tttattataa atataaagac 1140 cagattttct cagaggtttc atccattcaa ttaggcaact ggacactcct gggaagcttt 1200 aaggccaaca gagagcgcta caattatttt aatcaaaata atgaaataat aaaacggatt 1260 ttggaccgtc atgaggaaga cctaaagata ggaaaagaga ttttacgaaa tactatttac 1320 cacaaaaaag caaaaaatat acaagaaact ggcccggatg ctccggggct ctccatctat 1380 aattcaacct ttcacacgga tagcgggatt aagggactgc tttcctttaa ggagctaaaa 1440 aacctagaaa aagcatctgg aaatatcaaa aaagctcgag agtatgattt tatagacgac 1500 tgcgaagaaa aaattaagca actgcttagt aaagaaaatt taacccccga tgaagaaagc 1560 gagctgataa aaacaaaaaa acagttagat aatgcgcttg aaatgctcaa tgtgcctgat 1620 gatacgatac gggtagatat gtgggtcaac aataataata aactcgaaaa agaaatttta 1680 tatacaaaag cagaattg 1698 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD2v Antigen <400> 5 Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro Gly Asn Ser Val Ser Phe Asn 35 40 45 Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile 50 55 60 Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala 65 70 75 80 Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr 85 90 95 Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His 100 105 110 Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile 115 120 125 Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr 130 135 140 Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr 145 150 155 160 Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr 165 170 175 Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn 180 185 190 Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu 195 200 205 Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu Thr Leu Ser Ser Asn Ala Ala 210 215 220 Ala Leu Glu His His His His His His 225 230 <210> 6 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p54 Antigen <400> 6 Gly His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln 20 25 30 Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro 35 40 45 Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro 50 55 60 Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val 65 70 75 80 Thr Asp Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala 85 90 95 Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr 100 105 110 Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg 115 120 125 Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu 130 135 140 <210> 7 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p22 Antigen <400> 7 Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Ile 1 5 10 15 Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gln Pro Pro Lys Lys Val 35 40 45 Cys Lys Val Asp Lys Asp Cys Gly Ser Gly Glu His Cys Val Arg Gly 50 55 60 Ser Cys Ser Ser Leu Ser Cys Leu Asp Ala Val Lys Met Asp Lys Arg 65 70 75 80 Asn Ile Lys Ile Asp Ser Lys Ile Ser Ser Cys Glu Phe Thr Pro Asn 85 90 95 Phe Tyr Arg Phe Thr Asp Thr Ala Ala Asp Glu Gln Gln Glu Phe Gly 100 105 110 Lys Thr Arg His Pro Ile Lys Ile Thr Pro Ser Pro Ser Glu Ser His 115 120 125 Ser Pro Gln Glu Val Cys Glu Lys Tyr Cys Ser Trp Gly Thr Asp Asp 130 135 140 Cys Thr Gly Trp Glu Tyr Val Gly Asp Glu Lys Glu Gly Thr Cys Tyr 145 150 155 160 Val Tyr Asn Asn Pro His His Pro Val Leu Lys Tyr Gly Lys Asp His 165 170 175 Ile Ile Ala Leu Pro Arg Asn His Lys His Ala Ala Ala Ala Leu Glu 180 185 190 His His His His His His 195 <210> 8 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP80 Antigen <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 20 25 30 Gly Ser Glu Phe Met Ala Glu Phe Asn Ile Asp Glu Leu Leu Lys Asn 35 40 45 Val Leu Glu Asp Pro Ser Thr Glu Ile Ser Glu Glu Thr Leu Lys Gln 50 55 60 Leu Tyr Gln Arg Thr Asn Pro Tyr Lys Gln Phe Lys Asn Asp Ser Arg 65 70 75 80 Val Ala Phe Cys Ser Phe Thr Asn Leu Arg Glu Gln Tyr Ile Arg Arg 85 90 95 Leu Ile Met Thr Ser Phe Ile Gly Tyr Val Phe Lys Ala Leu Gln Glu 100 105 110 Trp Met Pro Ser Tyr Ser Lys Pro Thr His Thr Thr Lys Thr Leu Leu 115 120 125 Ser Glu Leu Ile Thr Leu Val Asp Thr Leu Lys Gln Glu Thr Asn Asp 130 135 140 Val Pro Ser Glu Ser Val Val Asn Thr Ile Leu Ser Ile Ala Asp Ser 145 150 155 160 Cys Lys Thr Gln Thr Gln Lys Ser Lys Glu Ala Lys Thr Thr Ile Asp 165 170 175 Ser Phe Leu Arg Glu His Phe Val Phe Asp Pro Asn Leu His Ala Gln 180 185 190 Ser Ala Tyr Thr Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met 195 200 205 Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr 210 215 220 Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Thr Cys Thr Ser Thr Glu Tyr Thr Asp 225 230 235 240 Leu Ala Asp Pro Glu Arg Ile Pro Leu His Ile Met Gln Lys Thr Leu 245 250 255 Asn Val Pro Asn Glu Leu Gln Ala Asp Ile Asp Ala Ile Thr Gln Thr 260 265 270 Pro Gln Gly Tyr Arg Ala Ala Ala His Ile Leu Gln Asn Ile Glu Leu 275 280 285 His Gln Ser Ile Lys His Met Leu Glu Asn Pro Arg Ala Phe Lys Pro 290 295 300 Ile Leu Phe Asn Thr Lys Ile Thr Arg Tyr Leu Ser Gln His Ile Pro 305 310 315 320 Pro Gln Asp Thr Phe Tyr Lys Trp Asn Tyr Tyr Ile Glu Asp Asn Tyr 325 330 335 Glu Glu Leu Arg Ala Ala Thr Glu Ser Ile Tyr Pro Glu Lys Pro Asp 340 345 350 Leu Glu Phe Ala Phe Ile Ile Tyr Asp Val Val Asp Ser Ser Asn Gln 355 360 365 Gln Lys Val Asp Glu Phe Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asp Gln Ile Phe Ser 370 375 380 Glu Val Ser Ser Ile Gln Leu Gly Asn Trp Thr Leu Leu Gly Ser Phe 385 390 395 400 Lys Ala Asn Arg Glu Arg Tyr Asn Tyr Phe Asn Gln Asn Asn Glu Ile 405 410 415 Ile Lys Arg Ile Leu Asp Arg His Glu Glu Asp Leu Lys Ile Gly Lys 420 425 430 Glu Ile Leu Arg Asn Thr Ile Tyr His Lys Lys Ala Lys Asn Ile Gln 435 440 445 Glu Thr Gly Pro Asp Ala Pro Gly Leu Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Phe 450 455 460 His Thr Asp Ser Gly Ile Lys Gly Leu Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys 465 470 475 480 Asn Leu Glu Lys Ala Ser Gly Asn Ile Lys Lys Ala Arg Glu Tyr Asp 485 490 495 Phe Ile Asp Asp Cys Glu Glu Lys Ile Lys Gln Leu Leu Ser Lys Glu 500 505 510 Asn Leu Thr Pro Asp Glu Glu Ser Glu Leu Ile Lys Thr Lys Lys Gln 515 520 525 Leu Asp Asn Ala Leu Glu Met Leu Asn Val Pro Asp Asp Thr Ile Arg 530 535 540 Val Asp Met Trp Val Asn Asn Asn Asn Lys Leu Glu Lys Glu Ile Leu 545 550 555 560 Tyr Thr Lys Ala Glu Leu 565 <210> 9 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD2v <400> 9 atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60 agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120 ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180 ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240 agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300 caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360 aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420 ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480 aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540 tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600 acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660 cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720 atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780 tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840 tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900 cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960 ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020 cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080 taa 1083 <210> 10 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p54 <400> 10 atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60 gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120 ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180 gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240 gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300 ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa acaaaccagt tacggacaac 360 ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420 agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480 caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540 gaaaactcct tgtaa 555 <210> 11 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p22 <400> 11 atgtttaata ttaaaatgac aatttctaca ttgcttattg ctcttattat actacttatt 60 attattttag tagtgttttt atactataag aaacaacaac caccgaaaaa ggtctgtaaa 120 gtagataaag attgtggtag tggagagcat tgtgttcgtg gatcatgtag ctcattgagc 180 tgcttagatg ccgtaaaaat ggacaaacga aatattaaga tagattctaa gatttcctca 240 tgcgaattca ctcccaattt ttaccgtttt acggatactg ctgctgatga gcagcaagaa 300 tttggaaaaa cacggcatcc tataaaaata actccatctc caagtgaatc ccatagcccc 360 caagaggtgt gtgaaaaata ttgttcatgg ggaaccgatg actgtacagg ttgggaatat 420 gttggtgatg aaaaggaggg aacatgttat gtatataata atccacatca cccggttctt 480 aaatatggta aggatcacat catagcctta cctagaaatc ataaacatgc ataa 534 <210> 12 <211> 1593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP80 <400> 12 atggcagaat ttaatattga tgagcttctc aaaaacgtat tggaggatcc ctctactgaa 60 atatccgaag aaacgcttaa acagctttac caaaggacga acccttacaa acagttcaaa 120 aatgatagca gggtggcctt ttgctctttt acaaatttgc gggagcagta tattcgacgt 180 cttataatga ctagctttat tggatatgtc ttcaaagctc tgcaggaatg gatgccttcc 240 tattcaaaac ctacccacac gaccaaaact cttctcagtg agctaataac gttagttgat 300 actttgaaac aggaaactaa tgatgttccc tctgaatcgg tagtaaatac aattttatct 360 atagcagata gctgcaaaac ccagacgcag aaaagcaagg aagctaaaac aacgatcgat 420 agctttttac gagaacattt tgtgtttgat cctaatcttc atgctcaaag tgcgtatact 480 tgtgcagata ccaatgtaga cacttgtgca agcatgtgtg cagataccaa tgtagacacc 540 tgtgcaagca tgtgtgcaga taccaatgta gatacctgtg caagcacttg tacaagcaca 600 gaatacaccg atttagcaga tcctgagcgc atccctttac acatcatgca aaaaacatta 660 aatgtgccta atgagcttca ggccgatatt gatgcaatca cccaaacccc acagggctat 720 agggcagcag cccacatatt acaaaatata gaacttcacc aaagcattaa acatatgctt 780 gaaaatccga gggcgtttaa acccattctc tttaacacaa aaattactag atatctttcg 840 cagcatattc cacctcagga tactttttat aagtggaatt attacattga ggataattac 900 gaagagttgc gggccgctac ggaaagcatc tacccagaaa aacccgacct agagtttgcc 960 ttcattattt atgatgtggt ggatagcagc aaccaacaaa aggttgatga attttattat 1020 aaatataaag accagatttt ctcagaggtt tcatccattc aattaggcaa ctggacactc 1080 ctgggaagct ttaaggccaa cagagagcgc tacaattatt ttaatcaaaa taatgaaata 1140 ataaaacgga ttttggaccg tcatgaggaa gacctaaaga taggaaaaga gattttacga 1200 aatactattt accacaaaaa agcaaaaaat atacaagaaa ctggcccgga tgctccgggg 1260 ctctccatct ataattcaac ctttcacacg gatagcggga ttaagggact gctttccttt 1320 aaggagctaa aaaacctaga aaaagcatct ggaaatatca aaaaagctcg agagtatgat 1380 tttatagacg actgcgaaga aaaaattaag caactgctta gtaaagaaaa tttaaccccc 1440 gatgaagaaa gcgagctgat aaaaacaaaa aaacagttag ataatgcgct tgaaatgctc 1500 aatgtgcctg atgatacgat acgggtagat atgtgggtca acaataataa taaactcgaa 1560 aaagaaattt tatatacaaa agcagaattg taa 1593

Claims

(a) 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 단백질을 시료와 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 시료 중 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, P54, p22 및 CAP80의 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 소변, 흉수 및 복수액으로 이루어진 군으부터 선택되는 어느 하나 이상인 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 항원과 결합된 항체를 검출하는 단계는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에 의한 것인 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법.
제3항에 있어서, 상기 (b) 단계의 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법.
제1항에 있어서,
(a) 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질을 시료와 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 시료 중 아프리카 돼지 열병 바이러스 단백질 CD2v, p54, p22 및 CAP80의 항원 단백질과 결합된 항체를 검출하는 단계;를 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단 방법.
서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트인 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트는 직접 ELISA 키트, 간접 ELISA 키트, 직접적 샌드위치 ELISA 키트 및 간접적 샌드위치 ELISA 키트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트.
제6항에 있어서, 서열번호 5의 CD2v의 항원 단백질, 서열번호 6의 p54의 항원 단백질, 서열번호 7의 p22의 항원 단백질 및 서열번호 8의 CAP80 항원 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단용 키트.