JPH11510893A

JPH11510893A - 単純ヘルペスウイルスの診断

Info

Publication number: JPH11510893A
Application number: JP9507586A
Authority: JP
Inventors: リンバーク，ラエ; アレキサンダー，ディアナ
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-06-20
Publication date: 1999-09-21
Also published as: US5965354A; ATE204083T1; DE69614393D1; WO1997005488A1; DE69614393T2; EP0842430A1; PT842430E; ES2159032T3; CA2227844A1; EP0842430B1; AU6284996A; GR3037090T3

Abstract

(57)【要約】単純ヘルペスウイルス(HSV)感染を診断するための新規な方法および免疫診断試験キットが開示される。この方法およびキットは、型特異的抗原および型共通抗原の両方を１段階アッセイフォーマットで用いることによって、非常に精度の高い結果を提供する。この方法では、HSV-1感染とHSV-2感染とを区別するので、正確な診断を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】単純ヘルペスウイルスの診断技術分野本発明は、一般に、ウイルス診断技術に関する。より詳細には、本発明は、単純ヘルペスウイルス感染を正確に検出するための方法に関する。発明の背景単純ヘルペスウイルス（「HSV」）感染は非常に流行しており、免疫無防備状態の個人および新生児において、見かけ上無症候性の獲得から、重篤な疾患および生命を脅かす感染に至るまでの範囲の発現を有する。これらの感染は、２つのウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（「HSV-1」）および２型単純ヘルペスウイルス（「HSV-2」）によって引き起こされる。HSV-1は、口腔感染の主な原因であり、そして通常小児期に獲得されるが、一方で、HSV-2感染は、通常性的に伝播する生殖器の感染である。しかし、これらの区別ははっきりとしておらず、生殖器のヘルペスの25％までがHSV-1によって引き起こされる。最初の感染後、ウイルスは一生の潜伏性の状態を確立し、そして定期的に再活性化して、臨床的に明らかな病変の発現または無症候性のウイルスの出芽を引き起こす。一般に、HSVは、膜内にエンベロープ化された正二十面体のヌクレオカプシド内にパッケージされた約150〜160kbpのゲノムを有する２本鎖DNAウイルスである。この膜（またはエンベロープ）は、10以上のウイルス特異的糖タンパク質を含み、この中で最も多いのは、gB、gC、gDおよびgEである。ウイルスのゲノムはまた、被膜タンパク質VP16を含む、50以上の他のタンパク質をコードする。HSV-1 およびHSV-2のウイルスのゲノムは、共直線性であり、ゲノム全体にわたって50 ％の相同性を共有する。gBおよびgDのようないくつかの遺伝子については、２つのウイルス型の間のアミノ酸同一性は80〜90％までにもなる。この類似性の結果、多くのHSV特異的抗体は、両方のウイルス型に対して交差反応性である。１つのウイルス型の中では、糖タンパク質遺伝子の株間の配列の可変性には制限がある（１〜２％）。HSVの株には、333およびPattonが含まれるが、これに限定されない。 HSV用の抗ウイルス剤である、アシクロビルが入手可能であるにもかかわらず、HSV-2の人口に対する発生率は、８〜50％の範囲であり、そして増加している。この増加の明らかな理由は、ほとんどの個人が自己の感染に気付いていないということである。さらに、伝染の大半は、無症候状態で出芽したウイルスから生じる。 HSV感染の診断のために、いくつかのアッセイが開発されている。残念ながら、これらのアッセイにはいくつかの欠点がある。最も一般的に用いられるアッセイは、ウイルスの培養を包含する。ウイルスの有意な試料は、感染の病変期初期にしか入手し得ない。しかし、多くの個人は、以前にヘルペスに感染しているが、無症候性である。このような個人は、進行中の病変を有することなく、無症候性にウイルスを出芽し得、そして感染をウイルスの培養を用いて検出することはできない。従って、ウイルスの培養によるHSVの検出は、再発性のヘルペスの症状の発現については、偽陰性が高率であり、約50％もの高さになる。さらに、ウイルスの培養は遅く、この診断方法は、乳児の分娩直前または新生児の病気のように、迅速な結果が必要とされる潜在的に深刻な状況では使用し得ない。さらに、培養は高価であり、ウイルスの試料は、研究室への輸送中に分解し得る。HSV 感染がHSV-1かHSV-2かを決定するために、付加的試験を行わなければならない。抗原検出試験は、ウイルスの培養の代替策を提供する。しかし、ウイルスの培養同様、これらの試験は進行中の病変からの試料を必要とし、従って、例えば無症候性の感染の場合は、偽陰性が高率である。ウイルスの培養より迅速、かつ高感度であるが、感染がHSV-1によるものかまたはHSV-2によるものかを決定するためには、付加的試験が必要である。 HSVに対する抗体を検出する血液検査である血清学的アッセイもまた試みられている。これらの試験は、症候性および無症候性の感染の双方を検出し得る。しかし、この試験によっては、抗体が形成される通常感染約２週間後まで、急性の一次感染は正確に診断されない。従って、これらの方法は、最初の発生を診断するために有用でない。さらに、試験はしばしばHSV-1とHSV-2を混同する。 Ashleyら、J．Clin．Microbiol.（1988）26: 662-667は、最初の症候の発症２１日後に、培養でHSV-2感染であると証明された患者の９９％で、HSV-2の抗体を検出すると言われるウエスタンブロットテストを記載している。この試験は、HS V-1とHSV-2とを100％正確に識別することが示された。しかし、この試験は、50 もの個々のHSVタンパク質に対する抗体（これらの中には、１型に特異的なものもあれば、２型に特異的なものもある）を検出するために２工程のプロセスを用い、実施が困難である。さらに、型特異的抗体を決定するために、２回のウエスタンブロットを（１回はHSV-1抗原で、もう１回はHSV-2抗原で）行わなければならない。この技術は時間がかかり、そして結果の解釈は主観的なものである。研究室技術者は、試験を適切に行うために、広範な訓練を受けなければならない。タンパク質特異的イムノアッセイ法もまた開発されている。例えば、Ashleyら、J．Clin．Microbiol.（1988）26: 662-667; Sanchez-Martinezら、J．Infect ．Dis.（1991）164: 1196-1199; Leeら、J．Clin．Microbiol.（1985）22: 641- 644; Leeら、J．Virol．Meth.（1986）14: 111-118を参照のこと。これらのアッセイは、gGのような、１つのウイルス性タンパク質に対する抗体を検出する。このタンパク質は、HSV-1（gG1）およびHSV-2（gG2）に固有である。この試験は、イムノドットフォーマットで行われ得、一般に、HSV-2に対する抗体の同定では正確な結果を出すが、HSV-1抗体の同定では、多くの偽陽性を生じる。さらに、g G2に対する抗体は、感染後６〜８週間は発達しないかもしれず、そしてまた被験者の５〜10％では、gG抗体は、前述のアッセイフォーマットを用いては検出不可のままである。型特異的血清学的アッセイの広範囲にわたる入手可能性は、疾患の流行の蔓延を防止するために、ヘルペス感染の診断のための重要なツールになる。発明の要旨本発明は、HSV感染を診断するための、ならびにHSV-1とHSV-2感染との存在を識別するための、単純で、極めて正確かつ効率的な方法を提供する。本アッセイ方法は、型特異的HSV抗原および型共通HSV抗原の両方を利用し、一つの実施態様では１工程のアッセイフォーマットで使用し得る。従って、ある実施態様において、本発明は、HSV感染を検出する方法に関し： (a)生物学的サンプルを提供する行程； (b)上記生物学的サンプルと、１つ以上の精製HSV型特異的抗原および１つ以上の精製HSV型共通抗原とを、上記生物学的サンプル中に存在する場合にHSV抗体が上記型特異的抗原および／または上記型共通抗原に結合し得る条件下で、反応させる行程； (c)免疫グロブリン分子と結合し得る１つ以上の部分(moieties)を提供する行程；および (d)上記１つ以上の部分の有無を検出する行程、を包含する。なお別の実施態様において、本発明は、生物学的サンプル中においてHSV-1感染とHSV-2感染とを区別するための方法に関し： (a)型特異的HSV-1糖タンパク質（例えば、型特異的gG1ポリペプチドおよび／またはgB1の型特異的エピトープ）、型特異的HSV-2糖タンパク質（例えば、gG2 ポリペプチド）、および型共通HSVポリペプチドをニトロセルロースストリップ上に固定化する行程； (b)行程(a)の上記ニトロセルロースストリップと、上記生物学的サンプルとを、上記生物学的サンプル中に存在する場合に抗HSV-1および抗HSV-2抗体が上記型特異的HSV-1もしくはHSV-2糖タンパク質および／または上記型共通HSVポリペプチドに結合し得る条件下で、接触させる行程； (c)検出可能に標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を提供する行程；および (d)上記生物学的サンプル中の結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体の有無を検出する行程、を包含し、これにより、上記生物学的サンプル中のHSV-1および／またはHSV-2感染の有無を検出する。特に好適な実施態様において、上記生物学的サンプルはヒト血清サンプルであり、上記HSVポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している。なおさらなる実施態様において、本発明は、HSV感染を検出するための免疫診断試験キットに関する。このキットは、型特異的HSV抗原および型共通HSV抗原、ならびに免疫診断試験を行うための説明書を含む。なおさらなる別の実施態様において、本発明は、生物学的サンプル中における HSV-1感染とHSV-2感染とを区別するための免疫診断試験キットに関する。この試験キットは、ニトロセルロースストリップ上に固定化された、型特異的HSV-1糖タンパク質（例えばgG1ポリペプチドおよび／または型特異的gB1エピトープ）、型特異的HSV-2糖タンパク質（例えば、gG2ポリペプチド）、および型共通HSVポリペプチド、ならびに免疫診断試験を行うための説明書を含む。本明細書中の開示内容を考慮すれば、当業者は、本発明の上記およびその他の実施態様を容易になし得る。図面の簡単な説明図１は、本発明によるストリップイムノブロットアッセイ（SIA）の代表的な結果を示す。図２Ａ〜２Ｄは、種々のgG1抗原を示す。図２Ａは、gG1抗原が由来したgG1前駆体分子を示す。図２Ｂは、HSV1gG1の構造を示す。図２Ｃは、SOD/HSV1gG1M-D の構造を示す。図２Ｄは、SOD/HSV1gG1P-Dの構造を示す。図３Ａ〜３Ｈは、種々のgG2抗原を示す。図３Ａは、gG2抗原が由来したgG2前駆体分子を示す。図３Ｂは、HSV2gG2M-Dの構造を示す。図３Ｃは、SOD/HSV2gG2M -Dの構造を示す。図３Ｄは、SOD/HSV2gG2R-Dの構造を示す。図３Ｅは、SOD/HSV2 gG2-N末端の構造を示す。図３Ｆは、SOD/HSV2gG2-C末端の構造を示す。図３Ｇは、SOD/gG2M393-D649の構造を示す。図３Ｈは、SOD/gG2A489-D649の構造を示す。図４は、本アッセイ方法での使用のためのgB1型特異的ペプチドのアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内で、ウィルス学、微生物学、分子生物学および組換えDNA技術の従来の方法を用いる。そのような技術は文献に十分な記載がある。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A L aboratory Manual（第２版、1989）；DNA Cloning: A Practical Approach，第I およびII巻（D．Glover編）；Oligonucleotide Synthesis（N．Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization（B．HamesおよびS．Higgins編、1985）；Transc ription and Translation（B．HamesおよびS．Higgins編、1984）；Animal Cell Culture（R．Freshney編、1986）；Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）；Fundamental Virology、第２版、第IおよびII巻(B.N．Fields およびD.M.Knipe編)を参照せよ。本明細書において引用する前出または後出の全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体を本明細書において援用するものとする。本明細書および付属の請求項において使用する、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに指示しない限り、複数の言及を包含するものとする。さらに、本明細書に記載する様々なHSVポリペプチドのアミノ酸配列は、特に明記しない限り、全長前駆体分子（シグナル配列を含む）について番号付けしている。Ｉ．定義本発明の説明において、以下の用語を用い、そしてそれらは以下のように定義されることが意図される。「型特異的HSV抗原」は、HSV-1および有SV-2の両方ではなくHSV-1またはHSV-2 のいずれかに対する抗体と優勢に反応する１つ以上のエピトープを含む、HSV-1 またはHSV-2のいずれか由来のポリペプチドを意味する。代表的な型特異的HSV抗原は以下を包含する。すなわち、HSV-1およびHSV-2糖タンパク質Ｃポリペプチド（「gC1」および「gC2」）ならびにその型特異的ペプチドエピトープ；HSV-1およびHSV-2糖タンパク質Ｇポリペプチド（「gG1および「gG2」）ならびにその型特異的ペプチドエピトープ、例えば、gG1のアミノ酸111位〜116位およびgG2のアミノ酸357位〜364位、553位〜572位、573位〜580位および601位〜608位；HSV-1 およびHSV-2糖タンパク質Ｂ（「gB1」および「gB2」）の型特異的ペプチドエピトープ、例えばgB2のアミノ酸18位〜228位（Goadeら、Abstracts of the 34th I nterscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy、1994年1 0月4〜7日、アブストラスクトH6）およびgB1のアミノ酸１位〜50位（成熟分子を参照して番号付けした）（アミノ酸31位〜80位（前駆体を参照して番号付けした））内に見られる型特異的エピトープ、例えばgB1のアミノ酸１位〜46位および１位〜47位（成熟分子を参照して番号付けした（アミノ酸31位〜76位および31位〜77位（それぞれ前駆体分子を参照して番号付けした））（Pereiraら、Virolog y(1989)172:11〜24；および以下の実施例を参照）；ならびにHSV-1およびHSV-2 糖タンパク質Ｄ（「gD1」および「gD2」）の型特異的ペプチドエピトープである。「型共通HSV抗原」とは、HSV-1およびHSV-2の両方に対して生じる抗体と反応する１つ以上のエピトープを含む、HSV-1またはHSV-2のいずれか由来のポリペプチドを意味する。代表的な型共通HSV抗原は以下を包含する。すなわち、gB1，gB 2、gD1、gD2、ウィルス性タンパク質16（「VP16」）ポリペプチドおよびその型共通エピトープ、例えばgB2のアミノ酸228位〜903内に見られるものである（Goa deら、Abstracts of the 34th Interscience Conference on Antimicrobial Age nts and Chemotherapy、1994年10月4〜7日、アブストラスクトH6を参照）。用語「ポリペプチド」は、gB、gD、gG、VP16などに対して用いる際には、任意の様々なHSV-1またはHSV-2株由来のgB、gD、gG、VP16などのポリペプチド（天然 (native)、組換え、または合成）を指す。従って、この用語は、糖タンパク質、テグメントタンパク質などを含む、任意の様々なHSVタンパク質に由来するポリペプチドを含む。「糖タンパク質」とは、HSV膜中に見られるものに由来するポリペプチド（天然、組換え、または合成）、例えば、gB、gD、gGなどを意味する。以下のポリペプチドに関する説明は、糖タンパク質にも等しく当てはまる。ポリペプチドは、当該分子（reference molecule）の全長アミノ酸配列を含む必要はなく、ポリペプチドがその所期の目的を果たすために必要なだけの分子を含んでいればよい。従って、ポリペプチドが「型特異的」抗原として用いられる際、分子の型特異的エピトープが１つのみまたはそれ以上存在している必要がある。ポリペプチドが「型共通」抗原として用いられる際は、HSV-1および有SV-2 の両方に対する抗体と反応する当該分子のエピトープが、１つ以上存在する。従って、ポリペプチドは、当該分子の全長配列、フラグメント、短縮および部分配列、ならびにアナログおよび前駆体形態を包含し得る。従ってこの用語は、ポリペプチドが意図通り機能する限り、配列の欠失、付加および置換を意図している。この点に関して、特に好ましい置換は、一般に性質が保存的な置換、すなわち、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内において起こる置換である。具体的には、アミノ酸は一般に以下の４つのファミリーに分けられる：(1)酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；(2)塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時に芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで孤立した置換 (isolated replacement)をすること、または同様にアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で保存的置換することは、生物学的活性に大きな影響を与えないことが十分予測される。従って、当該分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の抗体結合能に実質的に影響しないようなわずかなアミノ酸置換を有するタンパク質は、当該ポリペプチドの定義内とする。当該ポリペプチドの特に好適な欠失は、当該分子内に存在する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全部または一部の欠失を含む。そのような欠失は、分泌を高め、そして従ってHSV-1および／またはHSV-2に対する抗体との反応性をなお保ったままで、組換え的に産生した際の分子の回収を増加させる。所与のタンパク質中の膜貫通ドメインの位置は、２０個のアミノ酸の各々の疎水性および親水性特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列からハイドロパシースケールを導出するコンピュータプログラムを用いて、決定することができる（例えばKyteら、J．Mol．Biol.(1982)157:105-132ならびに、HoppおよびにWoods，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA(1981)78:3824-3828に記載がある）。「gBポリペプチド」とは、上記定義を有するgB1またはgB2由来のポリペプチドを意味する。gB1およびgB2のDNAおよび対応アミノ酸配列は公知であり、例えば米国特許第5,244,792号およびStuveら、J．Virol.(1987)61:326-335に報告されている。全長前駆体gB1タンパク質は約904個のアミノ酸を含み、そのうち約１位〜30位がシグナル配列を含む第１の疎水性領域を有し、31位〜約726位が可変極性領域を有し、727位〜約795位のアミノ酸が膜貫通アンカーを含む第２の疎水性領域を有し、そして796位〜約904位のアミノ酸が細胞質ドメインを含む第２の可変極性領域を構成する。同様に、全長gB2タンパク質は約904アミノ酸長である。最初の22個のアミノ酸はシグナル配列を構成し、そして成熟非グリコシル化タンパク質は、この配列の開裂後において約98kDの予測分子量を有する。23位〜約72 3位のアミノ酸は、第１の可変極性領域を構成し、724位〜約798位のアミノ酸は膜貫通ドメインを含み、そして799位〜約904位のアミノ酸は細胞質ドメインを含む第２の可変極性領域を構成する。細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの全部または一部を欠くgBの代表的な短縮誘導体は、以下の実施例に記載するが、米国特許第5,244,792号（例えば、遺伝子の3'-末端から580塩基対を欠失し、そして194個のカルボキシル末端アミノ酸を欠くタンパク質をコードするgB1遺伝子を含むプラスミドpHS114(ATCC受託番号39651)および、3'-末端から637塩基対を欠失したgB2遺伝子を含むプラスミドp H210の記載を参照）にも記載されている。米国特許第5,171,568号は、1187塩基対gB1遺伝子フラグメントを有するプラスミドpHS127A（ATCC受託番号39652）を記載している。HSV抗体と反応性を有するこれらの誘導体およびその他のいずれもが、本発明の方法において有用である。「gDポリペプチド」とは、上記定義を有するgD1またはgD2由来のポリペプチドを意味する。gD1およびgD2のDNAおよび対応アミノ酸配列は公知である。例えば米国特許第4,818,694号；LaskyおよびDowbenko、DNA(1984)3:23-29を参照。gD1 およびgD2タンパク質は、全体として約86%の相同性を共有する。全長gD1およびg D2は両方とも約393個のアミノ酸を有し、膜貫通ドメインは333位〜362位の残基に位置し、そしてカルボキシ末端まで延びる細胞質ドメインは残基393位に位置する。gD1およびgD2タンパク質は、１位から25位に位置するシグナル配列を有する。細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの全部または一部を欠くgDの代表的な短縮誘導体は、米国特許第5,171,568号（例えば、gD2の最初の305個のアミノ酸および最初の352個のアミノ酸をそれぞれコードするgD2遺伝子を含むプラスミドpH S211およびpHS213の記載、ならびにgD1の315個のアミノ酸をコードするgD1遺伝子を含むプラスミドpHS132の記載を参照）；Laskyら、Bio/Technology(1984年6 月):527-532（最初の300個のアミノ酸残基を有するgD1ポリペプチドをコードする短縮gD1遺伝子を記載）に記載されている。また、米国特許第4,618,578号に記載されているように（例えば、gD1のシグナル配列コード領域の欠失を含む600塩基対の5'欠失を有するプラスミドpYHS116およびpYHS117の記載；上記600塩基対ならびにgD1のアンカー配列の大部分を含むコード領域の3'末端における1300塩基対の欠失を有するプラスミドpYHS118の記載；5'-末端までの600塩基対の欠失と3'-末端における2400塩基対の欠失（膜アンカー領域全体の欠失およびgD1のアンカー配列の約700塩基対上流の欠失を含む）とを有するプラスミドpYHS119の記載を参照）、シグナル配列の全部または一部を欠く様々なgDポリペプチドが構築されている。HSV抗体と反応性を有するこれらの誘導体およびその他のいずれもが、本発明の方法において有用である。「gGポリペプチド」とは、上記定義を有するgG1またはgG2由来のポリペプチドを意味する。gG1およびgG2のDNAおよび対応アミノ酸配列は公知である。例えば、McGeochら、J．Mol．Biol.(1985)181:1-13、McGeochら、J．Gen．Virol.(1987 )68:19-38を参照。gG1遺伝子の構造を図２Ａに示す。gG1遺伝子は、238個のアミノ酸を有する糖タンパク質をコードし、21個のアミノ酸の予測シグナル配列、３個の潜在的なN結合グリコシル化部位を有しかつシステイン残基を有さない167個のアミノ酸の第１の可変極性領域（細胞外ドメインとも呼ばれる）、24個のアミノ酸の疎水性膜貫通ドメインおよび24個のアミノ酸のＣ末端細胞質ドメインを有する。 gG2遺伝子の構造を図３Ａに示す。gG2糖タンパク質は699個のアミノ酸を含み、21個のアミノ酸のシグナル配列、４個の潜在的なN結合グリコシル化部位を有しかつ６個のシステイン残基を有する626個のアミノ酸の第１の可変極性領域、2 5個のアミノ酸の膜貫通結合ドメイン、および24個のアミノ酸のＣ末端細胞質ドメインを有する。有用な型共通エピトープとして機能し得る、gG1およびgG2間の限られた相同性を有する３つの小領域の位置は、以下の通りである：膜貫通結合ドメインを含むＣ末端の部分を欠くgG1およびgG2遺伝子の両方の多数の短縮誘導体ならびに、Ｎ末端短縮タンパク質を本明細書に記載する（図２、３および４を参照）。これらの誘導体は、本発明の方法において有用である。「VP16ポリペプチド」とは、上記定義を有するHSV-1またはHSV-2 VP16由来のポリペプチドを意味する。VP16は、ウィルスのキャプシドとエンベロープとの間に位置するウィルス性テグメントタンパク質であり、そしてICP25、VmW65および a-トランス誘導因子(aTIF)としても知られている。HSV-1 VPI6のDNAおよびアミノ酸配列は報告されている。例えば、Campbellら、J．Mol．Biol.(1984)180:1、およびTriezenbergら、Genes and Develop.(1988)2:718を参照せよ。同様に、HS V-2 VP16のDNAおよび対応アミノ酸配列は公知である。例えば、1992年２月20日に公開された国際公開第WO 92/02251号を参照せよ。HSV-1およびHSV-2 VP16は、 489個のアミノ酸を有する。２つのタンパク質は、約85%の相同性を共有する。アミノ酸１位〜416位を含むVP16の短縮誘導体を、本明細書に記載する。HSV抗体と反応性を有するこのVP16ポリペプチドならびにその他のVP16ポリペプチドは、本発明の方法において有用である。「エピトープ」とは、特定のＢ細胞およびＴ細胞が反応する、抗原上の部位を意味する。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と同じ意味で用いられる。１つのエピトープは、そのエピトープにユニークな立体配置にある３つ以上のアミノ酸を有し得る。一般に、エピトープは少なくとも５個のそのようなアミノ酸から構成され、さらに通常は、少なくとも８〜10個のそのようなアミノ酸から構成される。アミノ酸の立体配置を決定するための方法は当該分野において公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴などが挙げられる。さらに、所与のタンパク質中のエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を用いて容易に達成される。例えば、Geysenら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA(1984)81:3998-4002（ペプチドを迅速に合成することによって所与の抗原中の免疫原性エピトープの位置を決定するための一般的方法）、米国特許第4, 708,871号（抗原のエピトープを同定しそして化学的に合成するための手順）、およびGeysenら、Molecular Immunology(1986)23:709-715（所与の抗体に高い親和性を有するペプチドを同定する技術）を参照せよ。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純なイムノアッセイにおいて、同定することが可能である。「精製」タンパク質またはポリペプチドは、組換えまたは合成によって生成されたタンパク質であって、組成物中に存在するタンパク質の量が粗ウィルス調製物中に存在するタンパク質の量よりも実質的に大きいものである。一般に、精製タンパク質は、≧50％均質であり、より好ましくは≧均質である。本明細書において用いる、「生物学的サンプル」は、個体から単離された組織または体液(fluid)のサンプルを指し、これらに限定されないが例として、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚の外分泌物、気道、腸管、および尿生殖器管、涙、唾液、乳、血球、器官、生検、ならびにまたインビトロ細胞培養物成分のサンプル（これらに限定されないが例として、培養培地中の細胞および組織（例えば組換え細胞）を増殖させることにより得られる馴化培地、および細胞成分）を含む。本明細書において用いる、「標識」および「検出可能な標識」とは、検出可能な分子を指し、これらに限定されないが例として、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチンまたはハプテン）などを含む。「蛍光体」の用語は、検出可能な範囲の蛍光を示す能力を有する物質またはその一部を指す。本発明において使用し得る標識の特定例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、NADP Hおよび、a-b-ガラクトシダーゼがある。 II．発明の実施の形態本発明は、HSV感染を正確に検出し、そしてHSV-1感染とHSV-2感染とを区別するための新規な診断方法の発見に基づいている。この方法は、型特異的および型共通HSV抗原を用いることにより、偽判定(false results)の発生を減少させる。本方法は、単純な１工程アッセイ形式で実施され得、これは感染の検出ならびに、存在する感染の型の同定の両方を、単一のアッセイで可能とする。より特定すると、型共通抗原の存在により、HSV感染一般の診断が可能になる。型特異的抗原の存在により、ウィルス型の決定、すなわち感染がHSV-1および／またはHSV-2によって引き起こされたかどうかの決定が可能になる。型共通抗原の存在により、型分類不可能な(untypable)サンプルにおいてさえも陽性判定が得られる。従って、偽陰性の発生が減少する。本発明の診断技術で用いる抗原は、様々な技術を用いて生成し得る。例えば、当該分野において周知の組換え方法によって抗原を生成することができる。この点に関して、HSVゲノムの公知の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを案出し、そしてこれを用いてゲノムまたはcDNAライブラリーを本発明に有用な抗原をコードするHSV遺伝子についてプローブしてもよい。次いで、標準的な技術を用いて遺伝子をさらに単離することができ、また所望であれば、制限酵素を用いて遺伝子を全長配列内の所望の位置において短縮することができる。同様に、HSV遺伝子は、これを含有する細胞および組織から、フェノール抽出などの公知の技術を用いて直接単離することができ、そして配列をさらに操作することにより所望の短縮物を生成してもよい。例えば、DNAを得て単離するために用いる技術の記載について前出Sambrookらを参照せよ。最後に、HSV抗原をコードする遺伝子は、公知の配列に基づいて合成的に生成することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定アミノ配列に対する適切なコドンを用いて設計することができる。一般には、配列を発現させる意図される宿主に好適なコドンが選択されるであろう。完全な配列は、一般に、標準的な方法によって調製され、そして完全なコード配列に組み立てられた重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756、Nambairら、(1984)Science 223 :1299、Jayら(1984)J．Biol．Chem.259:6311を参照せよ。一旦所望のタンパク質のコード配列が単離または合成されると、それらは昆虫、哺乳動物、細菌、ウィルスおよび酵母発現系を含む様々な系（全て当該分野において周知である）における発現のために、任意の適切なベクターまたはリプリコンにクローンされ得る。例えば、バキュロウィルス系などの昆虫細胞発現系は、当業者に公知であり、そして例えば、SummersおよびSmith、Texas Agricultur al Experiment Station Bulletin No.1555(1987)に記載されている。バキュロウィルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、なかでもIn vitrogen，SanDiego CAから市販されている（「MaxBac」キット）。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野において周知であり、そして例えば、前出Sambrookらに記載されている。酵母発現系もまた当該分野において公知であり、そして例えばYeast Genetic Engineering(Barrら編、1989)、Butterworths ，Londonに記載されている。ウイルスシステム、例えば、Tomeiら、J．Virol.（1993）67:4017-4026および Selbyら、J．Gen．Virol.（1993）74:1103-1113に記載のワクシニアベースの感染／トランスフェクションシステムもまた、本発明による使用を見出す。このシステムにおいて、細胞はまず、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体によりインビトロでトランスフェクトされる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを有するテンプレートを転写するのみという点で高度な特異性を示す。感染後、細胞は、T7プロモーターにより駆動される、目的のDNAによりトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質内に発現したポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いでRNAは宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。この方法は、大量のRNAおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質生成を提供する。選択された発現系および宿主に依存して、本発明の抗原は、目的の抗原が発現される条件下において、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより産生される。次いで抗原は、宿主細胞から単離されて精製される。発現系が抗原の分泌を提供する場合、抗原は培地から直接精製され得る。抗原が分泌されない場合、抗原は細胞溶解物から単離される。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の知識の範囲内である。 HSV抗原はまた、固相または溶液のペプチド合成などの化学合成により、当業者に公知の方法を用いて産生され得る。ペプチドの化学合成は、問題の抗原が比較的小さい場合に好適であり得る。固相ペプチド合成技術に関しては、例えば、 J．M．StewartおよびJ．D．Young、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、P ierce Chemical Co.、Rockford、IL(1984)、ならびにG．BaranyおよびR．B．Mer rifield、The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology、E．GrossおよびJ．Me ienhofer編、第２巻、Academic Press、New York、(1980)、3-254頁を参照されたい。古典的溶液合成に関しては、例えば、M．Bodansky、Principles of Pepti de Synthesis、Springer-Verlag、Berlin(1984)、ならびにE．GrossおよびJ．Me ienhofer編、The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology（上記）、第１巻を参照されたい。型特異的および型共通HSV抗原は、本明細書中において、生物学的サンプル中のウイルスの反応性抗体の存在を検出するための診断薬として用いられる。例えば、HSV抗原と反応性する抗体の存在は、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術を用いて検出され得る。このようなアッセイは、ウエスタンブロット、凝集テスト、ELISAなどの酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動法、免疫沈降などを含むが、これらに限定されない。反応は概して、蛍光、ケミルミネッセンス、放射性、酵素標識または色素分子などの指示標識、または抗原と、抗原に反応する抗体との複合体の形成を検出する他の方法を含む。上記のアッセイは概して、液相中の未結合抗体の、抗原−抗体複合体が結合する固相支持体からの分離を含む。本発明の実施に用いられ得る固相支持体は、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態で）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリジン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどの支持体を含む。代表的には、固相支持体はまず、適切な結合条件下において固相成分（例えば、１以上の型特異的および１以上の型共通抗原）と反応し、その結果、成分は支持体に十分固定化される。時々、抗原の支持体に対する固定化は、より良好な結合特性を有するタンパク質にまず抗原を結合させることにより増強し得る。適切な結合タンパク質は、ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミンおよび当業者に周知の他のタンパク質を含む血清アルブミンなどのマクロ分子を含むが、これらに限定されない。支持体に抗原を結合するために用いられ得る他の分子は、多糖体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーなどを含む。このような分子およびこれらの分子を抗原に結合させる方法は、当業者に周知である。例えば、Brinkley、M．A．Bioconjugate Chem.（1992）3:2-13、 Hashidaら、J．Appl．Biochem.（1984）6:56-63、ならびにAnjaneyuluおよびSta ros、International J．of Peptide and Protein Res.（1987）30:117-124を参照されたい。固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の固定化されなかった固相成分が洗浄により支持体から除去され、支持体結合成分は、その後、適切な結合条件下において、リガンド部分（例えば、固定化抗原に対する抗体）を含むと考えられる生物学的サンプルと接触する。洗浄により任意の非結合リガンドを除去した後、二次的なバインダー部分が適切な結合条件下で添加される。そこにおいて、二次的なバインダーは、結合リガンドと選択的に会合し得る。二次的なバインダーの存在は、その後当該分野で周知の技術を用いて検出され得る。より詳細には、ELISA法が用いられ得る。そこにおいて、マイクロタイタープレートのウェルが型特異的抗原または型共通的抗原によりコートされる。次いで、抗HSV免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと考えられる生物学的サンプルが、コートされたウェルに添加される。１つのマイクロタイタープレートを用いることが望ましいアッセイにおいて、選択された数のウェルが第１の型特異的抗原部分によりコートされ、異なるセットのウェルが第２の型特異的抗原部分によりコートされ、そして第３のセットのウェルが型共通的抗原部分によりコートされる。別の例において、一連のELISAが一緒に行われ得、そこにおいて、個々のプレートは各型特異的および型共通抗原部分に対して用いられる。固定化抗原に対する抗体の結合を可能にするに十分なインキュベーション期間の後、プレートは、未結合部分、および添加された、検出可能に標識された二次的な結合分子を除去するために洗浄され得る。二次的結合分子は、任意の捕獲されたサンプル抗体と反応することが可能となり、プレートは洗浄されて当該分野で周知の方法を用いて二次的な結合分子の存在が検出される。このように、１つの特定の実施態様において、生物学的サンプル由来の、結合された抗型特異的または型共通抗原リガンドの存在は、抗体リガンドに対する抗体を含む二次的バインダーを用いて容易に検出され得る。多くの抗ヒト免疫グロブリン(Ig)分子は、当該分野において公知である（例えば、市販のヤギ抗ヒトIg またはウサギ抗ヒトIg）。これらの分子は、当業者に公知の方法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼなどの、検出可能な酵素標識に容易に結合され得る。その後、適切な酵素基質が、検出可能シグナルを生成するために用いられる。他の関連する実施態様において、競合型 ELISA技術が、当業者に公知の方法を用いて実施され得る。アッセイはまた、溶液中において、ウイルス性タンパク質およびこれらのウイルス性タンパク質に特異的な抗体が沈降条件下で複合体を形成するように行われ得る。１つの特定の実施態様において、型特異的および／または型共通抗原は、直接的化学結合または間接的結合などにより、当該分野において公知の結合技術を用いて固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に結合され得る。抗原でコートされた粒子は、その後、適切な結合条件下において、型特異的および／または型共通HSV抗原に対する抗体を含むと考えられる生物学的サンプルと接触する。結合した抗体間の架橋は、沈降され得かつ洗浄および／または遠心分離を用いてサンプルから単離され得る粒子−抗原一抗体複合体凝集体の形成を引き起こす。反応混合物は、上記の免疫診断法などの多数の標準的な方法のいずれかを用いて抗体−抗原複合体の存在または不在を決定するために分析され得る。なおさらなる実施態様において、免疫親和性マトリックスが提供され得る。そこにおいて、抗型特異的および／または抗型共通分子を含むと考えられる生物学的サンプルからの抗体のポリクローナル集団が基体に固定化される。この点に関して、サンプルの最初のアフィニティー精製が、固定化された抗原を用いて行われ得る。従って、得られたサンプル調製物は、抗HSV部分のみを含んでおり、親和性支持体における潜在的な非特異性結合特性を回避する。免疫グロブリンを（インタクトまたは特定の断片のいずれかで）高い収率および良好な抗原結合活性保持率で固定化する多くの方法が当該分野において公知である。固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧは、どの特定の方法にも限定されることなく、免疫グロブリンを固定化するために用いられ得る。従って、免疫グロブリン分子が一旦固定化されて免疫親和性マトリックスを供給すると、各々が別々で異なる標識を有する型特異的および型共通抗原が、適切な結合条件下において結合された抗体と接触する。任意の非特異的に結合した抗原が免疫親和性支持体から洗浄された後、結合抗原の存在が、当該分野で公知の方法を用いて、各々の特異的な標識についてアッセイすることにより決定され得る。本発明を用いてHSV感染を診断するのに特に好適な方法は、ストリップ免疫ブロットアッセイ(SIA)技術（例えば、伝統的なウエスタンブロット技術とドット (Chiron Corp，Emeryville，CA)テストの使用を含む。これらのアッセイにおいて、１以上の型特異的および１以上の型共通抗原が、膜性支持体テストストリップ上に個々の互いに離れたバンドとして固定化される。生物学的サンプル中の抗 HSV反応性の視覚化は、比色酵素基質と共に抗ヒトIgG酵素結合体を用いて達成される。抗ヒトIgMおよびヒトIgGなどの内部コントロールもまた、ストリップ上に存在し得る。アッセイは、手動でまたは自動化されたフォーマットを用いて行われ得る。型特異的および型共通抗原を含む上記のアッセイ試薬は、上記のようなイムノアッセイを行うために、適切な指示および他の必要な試薬と共にキットとして提供され得る。キットはまた、用いられる特定のイムノアッセイに依存して、適切な標識および他のパッケージされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。上記のような標準的なイムノアッセイはこれらのキットを用いて行われ得る。 III．実験以下に、本発明を実施する特定の実施態様の実施例を示す。実施例は、説明の目的のためのみに提供され、如何なる点でも本発明の範囲を限定することは意図されない。用いられた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするために努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差は、言うまでもなく許容されるべきである。実施例１ HSV 診断アッセイにおいて使用される組換えgG1ポリペプチドの産生ａ．SOD/HSV1gG1M-D ２つのオリゴヌクレオチド、5 AGG AAC CAT GGC AAT GTC GCC GGG CGC CAT GC T GGC CGT TGT T3 および5 TCC CGT CGA CTA CTA GTC CAG GGC GGG GGA GGC AGT GAG GAA CGA3を、HSV-1(株Patton)のgG1の190アミノ酸(Met₁-Asp₁₉₀)のアミノ末端領域をコードするDNAフラグメントのPCR合成を開始するために使用した(Kud lerら、Virology(1983)124：86-99)。(図2Bを参照)。このポリペプチドは、先に HSV-1、株17についてMcGeochらによって報告されたgG1糖タンパク質のMet₁-Asp₁ ₈₉ と対応する(McGeochら、J.Mol.Biol.(1985)181：1-13)。１つのアミノ酸のずれは、PCR実験においてテンプレートとして使用するDNA(プラスミドpSVgG1)が、 HSV-1、株17の対応するgG1 Glu₇₉-Glu₈₅アミノ酸ストレッチ中の１つの追加グルタミン酸をコードするHSV-1単離体由来であったという事実のためである。 PCRで合成されたDNAフラグメントは、5末端においてNcoI制限部位およびATGコドンを含み、そして3末端において２つの停止コドンおよび制限部位SalIを含んだ。これらの改変は、ウィルスタンパク質のクローニングを容易にするために導入した。DNAを、NcoI/SalIで消化し、583bpフラグメントを、pSOD/HIV2PR113由来の細菌ベクターにクローニングし(Pichuantesら、J.Biol.Chem.(1990)265： 13890-13898)、プラスミドpSODgG1を生成した。この細菌発現プラスミドは、SOD /HSV1gG1M-D(35.7kDの分子量を有しヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)および上記したHSV-1gG1アミノ酸配列(図2C)からなるハイブリッドタンパク質)をコードする。ｂ．SOD/HSV1gG1P-D この33.2kDの組換え抗原は、シグナル配列が含まれていない(図2D)ことを除いては、上記SOD/HSV1gG1M-D抗原に類似している。ｃ．酵母中のgG1抗原の発現酵母中での上記した組換えタンパク質の発現のために、以下の操作を行った； HIV-1プロテアーゼ(Pichuantesら、Proteins Struct．Funct．Genet.(1989)6：3 24-337)をコードするプラスミドpSI1/PR179の833bp StuI/SalI挿入物を、pSODgG 1から単離した918bp StuI/SalIフラグメントと置換し、プラスミドシャトルベクターpSI/gG1を生成した。ADH2/GAPDHプロモータ-SOD/HSV1gG1配列を含む2408bp BamHI/SalIカセットを、pSI/gG1から取り除き、酵母ベクターpBS24.1にクローニングした(Pichuantesら、Protein Engineering: A Guide to Design and Produc tion第６章、J.L．ClelandおよびC.Craik編、John Wiley & Sons、New York、NY 、印刷中)。生じるプラスミドpSODHSV1gG1M-Dは、酵母中に自己複製のための2m 配列、ハイブリッドプロモータADH2/GAPDH、転写終結を確実にするためのａ-因子ターミネータ、ならびに選択のための酵母遺伝子leu2-dおよびURA3を含む。細菌におけるプラスミド複製および選択に必要な複製のCo/E1オリジンおよびβ-ラクタマーゼ遺伝子もまた、この組換えプラスミド中に存在する。SOD/HSV1gG1P-D をコードするプラスミドのために、同様の手順を続けた。 S．cerevisiae JSC310[MAT a，leu2，ura3-52，prbl-1122，pep4-3，prcl-407 ,::DM15(pGAP/ADR1::G418^r),(cir⁰)]の細胞は、pSODHSV1gG1M-Dプラスミドで形質転換され、酵母培地中のグルコースの消耗後(Pichuantesら、J.Biol.Chem.(19 90)265:13890-13898およびFranzusoffら、J.Biol.Chem.(1995)270:3154-3159)、 SOD(153アミノ酸)、２アミノ酸(Met-Ala)のリンカー、および190アミノ酸のHSV- 1gG1ポリペプチドからなる35.7kDの融合タンパク質を発現した(図2C)。ヌクレオチド配列を、pSOD-HSV1gG1 M/DのSOD/HSV1gG1コード領域のDNA塩基配列決定により、照合した。 SODおよびHSV-1陽性血清に対するモノクローナル抗体を用いたクーマシーブルー染色および免疫ブロット分析によって検出したところ、組換えタンパク質は酵母中で高レベルで発現した。タンパク質を以下のように精製した。形質転換した酵母細胞を溶解し、溶解物を10,000rpmで１時間遠心分離した。上清を、50 mM M ES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)(pH5.2)で１：10に希釈し、S-セファロースカラム上にかけた。０から１M NaCl勾配を用いて、タンパク質を溶出し、タンパク質ピークをプールし、濃縮し、Sephacryl S-200 HRゲル濾過を用いてさらに精製した。タンパク質ピークをプールし、濃縮し、そしてさらに使用するために保存した。ｄ．gG1t gG1のシグナル配列および全細胞外ドメインを含むアミノ酸１から189を含む、 gG1tと称される追加の切形されたgG1の誘導体を以下のように作成した。以下のプライマーを用いたPCRによって、gG1tをコードする遺伝子を、HSV-1EcoRIフラグメントＨ(株Patton)からクローニングした。 5末端 Pstl Met 5 AGT ACC GGA TCC CTG CAG ATG TCG CAG GGC GCC ATG CGT G 3末端 BamHI 停止 Gluエピトープ 5 TTA TCA GGA TCC CTA TTC CAT TGG CAT GTA TTC GTC CAG GGC GGG GGA GGC AGT 昆虫細胞系を用いて、以下のようにタンパク質gG1tを発現した。 PCRフラグメントを、PstIおよびBamHIで消化し、pAcC13バキュロウィルス発現プラスミドに挿入し(Munemitsuら、Mol.Cell.Biol.(1990)10:5977-5982)、ジデオキシ鎖終結法を用いてその全体を配列決定した。このフラグメントは、シグナル配列および全細胞外ドメインを含む、5末端から翻訳開始点までの567ヌクレオチド塩基対およびアミノ酸１から189をコードする領域を含んだ。フラグメントの３末端においては、プライマーはまた、6-アミノ酸gluエピトープタグ(5 TTC CAT TGG CAT GTA TTC 3)をコードした。このタグは、gluエピトープを特異的に認識する対応する抗体の使用によりこのタグを担持するあらゆるタンパク質の同定、定量、および精製を容易にする。記載されるように(Kittsら、Nuc.Acids Res.(1990)18:5667-5672)、２mgの導入ベクターpAc-gG1tまたはpAc-gG2tDNAを、0.5mgの直線化された、野生型ウィルスDNAで、SF9細胞に同時トランスフェクトすることによって、gG1tをコードする DNA配列を、pAcC13導入ベクター(Munemitsuら、Mol.Cell.Biol.(1990)10:5977-5 982)を介して、Autographa californicaバキュロウィルス(AcNPV)に組み換えた。組換えバキュロウィルスを、プラーク精製により単離した(Smithら、Mol.Cell .Biol.(1983)3:2156-2165)。１ml当たり1.5×10⁶組換えAcNPV-感染したSF9細胞の懸濁培養物からの上清を、1Lガラスエルレンマイヤーフラスコ中で、無血清培地中で関連するバキュロウィルスと2-10のmoiで120rpmにて振とうする48時間の感染に続いて、収穫した(Maiorellaら、Biotech.(1988)6:1406-1410)。培地を４ ℃にて400-600×ｇ10分間遠心分離し、0.8mm濾過し、濃縮し、精製の前に-80℃ にて保存した。 gG1ポリペプチドを、非イオン性界面活性剤NP-40を、最終濃度が0.2％となるように解凍濃縮された上清に加えて免疫精製した。上清を室温にて15分間インキュベートし、9000rpmにて10分間遠心分離し、抗gluモノクローナル抗体をタンパク質G-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)に結合することによって調製したアフィニティーカラムに付与した。結合タンパク質を、gly-ペプチド含有リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で溶出し、濃縮した。精製したタンパク質を、SDS-PAGEを用いて評価した。gG1tバンドの移動度は、分子量35kDのタンパク質のそれと対応していた。精製したタンパク質を、全ての N-連結された炭水化物鎖を取り除くためにN-グリカナーゼで消化した。タンパク質を、アミノ酸分析に供した。gG1tの予想されたアミノ酸組成は、測定されたものと良好に一致した。N末端アミノ酸配列決定を、Edman分解を用いてタンパク質に対して行った。gG1tタンパク質は、配列分析により予想されたようにVal₂₂から開始し、タンパク質が21アミノ酸シグナル配列を有することを確認した。タンパク質の同一性もまた、ウェスタンブロット分析により確認した。クーマシーブルー染色されたタンパク質の移動度と対応する移動度を有する単一バンドは、抗gluモノクローナル抗体およびアルカリホスファターゼ接合されたヤギ抗マウスIgGと反応した。実施例２ HSV 診断アッセイにおいて使用される組換えgG2ポリペプチドの産生ａ．gG2t gG2(gG2t)をコードする遺伝子の切形された誘導体を、以下のプライマーを用いたPCRによってHSV-2 HindIIIフラグメントＬ(株333)からクローニングした： 5末端 Pstl Met 5 AGT ACC GGA TCC CTG CAG ATG CAC GCC ATC GCT CCC AGG 3末端 BamHI 停止 Gluエピトープ 5 TTA TCA GGA TCC CTA TTC CAT TGG CAT GTA TTC ATC TAG AGC AGG GGA GGC CG PCRフラグメントを、PstIおよびBamHIで消化し、pAcC13バキュロウィルス発現プラスミドに挿入し、ジデオキシ鎖終結法を用いてその全体を配列決定した。このフラグメントは、シグナル配列および全細胞外ドメインを含む、5末端から翻訳開始点までの1953のヌクレオチド塩基対およびアミノ酸１から651をコードする領域を含んだ。フラグメントの3末端においては、プライマーはまた、上記したように6-アミノ酸glyエピトープタグ(5 TTC CAT TGG CAT GTA TTC 3)をコードした。 gG1tについて上記したように、gG2tをコードするDNA配列を、pAcC13導入ベクター(Munemitsuら、Mol.Cell.Biol.(1990)10:5977-5982)を介して、Autographa caiifornicaバキュロウィルス(AcNPV)に組み換えた。精製したタンパク質を、SDS-PAGEを使用して評価した。gG2tバンドの移動度は、分子量90kDのタンパク質のそれと対応していた。精製したタンパク質を、全てのN-連結された炭水化物鎖を取り除くためにN-グリカナーゼで消化した。タンパク質を、アミノ酸分析に供した。gG2t組成は、配列から計算したそれとは一致しなかった。不一致の源を決定するために、Edman分解を用いてN末端アミノ酸配列決定を行った。gG2tタンパク質は、細胞外ドメインの中心にあるアミノ酸Ala₃₄₅ に対応する配列Ala-Leu-Thrで開始していた。従って、バキュロウィルスに感染した昆虫細胞中で発現したgG2タンパク質を、哺乳動物細胞中の他のウィルスタンパク質の非存在下で発現したウィルスgG2タンパク質およびgG2タンパク質について先に記載したように切断した。タンパク質は、Met₃₄₄とAla₃₄₅との間で切断すると思われる。 gG2tタンパク質の同一性もまた、ウェスタンブロット分析により確認した。クーマシーブルー染色されたタンパク質の移動度と対応する移動度を有する単一バンドは、抗gG2モノクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ接合された抗マウス抗体と反応した。ｂ．SOD/HSV2gG2Arg21-Arg342(N 末端領域)およびSOD/HSV2gG2Leu343-Asp649(C 末端領域 ) 上記説明したように、組換え的に産生されたgG2タンパク質は、アミノ酸344と 345との間でプロテアーゼによって細胞内的に切断されることが発見されたため、gG2タンパク質は、高レベルの発現を達成するために、Gly22-Arg342およびLeu 343-Asp649のそれぞれに対するSOD融合からなる２つのフラグメントとして産生された。分子のアミノ末端部分(図3E)およびカルボキシル末端部分(図3F)を発現するように２つの構築物を作成した。N末端およびC末端gG2構築物を、以下のように昆虫細胞内で発現させた。HSV-2からのgG2のC末端をコードする配列をサブクローニングするストラテジーは、プラスミド、完全長gG2のためのバキュロウィルス転移ベクターであるpAcgG2Lを独特なPstIおよびNcoI部位との間でクローニングするための174bp PCR産物の生成を含んだ。5-プライムアンプリマー5 d-AACTGCA GAAATGCTGGGGCCCTGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCTCCCTGGGCATC GCCTTGACCGAGGACGCGTCCTCCGAT-3を、ベクターpAcgG2L中のクローニング部位に相補的なPstI制限部位、それに続く共通真核開始部位およびペプチドの正確な切断のためにアミノ酸位置１にIleを有するヒト胎盤アルカリホスファターゼシグナル配列の21コドン、それに続くgG2(Ala₃₄₅-Asp₃₅₄)のC末端の９コドンを含むように設計した。下流アンプリマー5 d-AGGGCGCCATGGCGGTGGCCGACA-3を、４つのコドンgG2配列に直接上流に隣接するNcoI認識部位を含むように合成した。NcoI部位は、PstIおよびNcoIでのベクターpAcgG2Lの消化および精製の間に取り除かれるN末端gG2をコードする1.1kb配列の代わりにPCR産生物を挿入するのを容易にする。標準PCR反応を、製造者の推奨に従ってベント(vent)ポリメラーゼで行った( New England Biolabs，Beverly，MA)。増幅された産物を、Geneclean(RPI，Moun t Prospect，IL)を用いてゲル精製し、PstIおよびNcoIで激しく消化し、PstI/Nc oI-切断されたpACgG2Lに連結した。ベクターにクローニングされたPCR産物のオリジンおよび適合度を、バキュロウィルス導入ベクター中の独特なPstIおよびNc oIクローニング部位にそれぞれ隣接する正配列決定プライマー5 D-GATAACCATCTC GCAAATAAATAAG-3および逆配列決定プライマー5 d-CATCTCGTCGGGGGGAGTAGT-3により確認した。アルカリホスファターゼリーダ配列、およびN末端的に切形されたg G2を含む改変した導入ベクターはpAcapgG2Lと称した。記載のように(Kittsら、Nuc.Acids Res.(1990)18:5667-5672)、0.5mgの直線化された、野生型ウィルスDNAを有する２mgのプラスミドDNAでSf9昆虫細胞を同時トランスフェクトすることによって、gG2のC末端をコードする配列、導入ベクターpAcapgG2Lを介して(親ベクターpAcC13、Munemitsuら、Mol.Cell.Biol.(1990)1 0 :5977-5982)、Autographa californicaバキュロウィルス(AcMNPV)に組み換えた。組換えバキュロウィルスを、プラーク精製により単離した(Smithら、Mol.Cell .Biol.(1983)3:2156-2165)。Log相で、１ml当たり1.5×10e6 Sf9細胞の懸濁培養物を、2-10のmoiでバキュロウィルスに感染させ、ISFM7培地中で組換えタンパク質を産生した(Maiorellaら、Biotech.(1988)6:1406-1410)。無血清上清を、感染後約48時間後のタンパク質精製のために収穫した。 N末端およびC末端gG2タンパク質はまた、酵母株AB122、JSC310、およびAD1において発現した。高い発現レベルのSOD/HSV2gG2Arg₂₁-Arg₃₄₂タンパク質を、酵母不溶性画分中でクーマシーブルー染料によって検出した。タンパク質は、約55 kDの見かけ分子量を有する(翻訳された分子量は50.9)。酵母株AB122およびJSC31 0中での発現は、株AD1中でのそれよりも高かった。タンパク質は、抗HSV-2抗体と免疫反応した。 SOD/HSV2gG2Leu₃₄₃-Asp₆₄₉を、AB122、JSC310、またはAD1の不溶性画分中で検出しなかった。さらなる実験(クーマシーブルー染色および免疫ブロット分析)は、タンパク質が、AB122およびJSC310細胞の可溶性画分中で見いだされたことを示した。タンパク質は、約80kDの見かけ分子量を有していた(翻訳された分子量は46.3kD)。５つの別々のコロニー(C1〜C5)から得た細胞の全溶解物で検出されたように、 SOD/HSV2gG2-NtermおよびSOD/HSV2gG2-Ctermの酵母発現は、以下の通りであった。クーマシーブルー染色されたタンパク質は、N末端抗原(予想分子量＝50.9)が、全ての培養物中(C1〜C5)で高レベルで発現したことを示した。このタンパク質は、MAbからhSODと反応し、HSV-2陽性血清中に存在する抗体との弱い反応性を示した。C末端抗原(予想分子量＝46.3)は、クーマシーブルー染色により検出されなかった。約80kDの見かけ分子量を有するタンパク質バンドを、ウェスタンブロットにおいて検出した。このタンパク質は、HSV-2陽性血清と強く反応した。細胞において発現する組換えタンパク質をより良好に特徴づけるために、各C3 クローンの全画分、可溶性画分および不溶性画分を調製した。結果は、ほとんどのN末端抗原が、(hSOD/envタンパク質の場合に予想されたように)不溶性画分において見いだされたことを示した。C末端抗原は、クーマシーブルー染色によって検出されなかったが、MAbからhSOD、およびHSV-2陽性血清に対するその反応性によって明らかに同定された。驚くことに、hSOD/envタンパク質については、抗原が、可溶性および不溶性画分の両方で検出された(可溶性画分における反応性がより強かった)。約30kDのタンパク質バンドもまた、免疫ブロットにおいて検出した。ｃ．SOD/Gg2M393-D649 gG2のMet₃₉₃-Asp₆₄₉に対するSOD融合からなる、より小さいHSV2gG2 C末端ポリペプチドをコードするPCR DNA産物を構築した。(図3Gを参照) ｄ．SOD/gG2A489-D649 gG2のAla₄₈₉-Asp₆₄₉に対するSOD融合からなる、より小さいHSV2gG2 C末端ポリペプチドをコードするPCR DNA産物を構築した。(図3Hを参照) 実施例３ HSV 診断アッセイにおける使用のための短縮型HSV VP16の産生短縮型HSV VP16ポリペプチドを、以下のようにバキュロウイルス系で発現させた。Ｃ末端に６アミノ酸のglu-エピトープタグを有するアミノ酸１〜416をコードする、HSV-2株G VP16の短縮型誘導体であるVP16-2tを、以下のプライマーを用いて、プラスミドpSVVP-2（以下に記載する）からのPCR増幅によってクローン化した。 5'末端 BgIII Met VP16 5’ACA GAT CTT ATG GAC CTG TTG GTC GAC 3'末端 ECoRI Stop Glu エピトープ 5’AG AAT TCA CTA TTC CAT TGG CAT V16GTA TTC GGT GGA CAG TCT GCG 1.38kbのPCRフラグメントをBgIIIおよびEcoRIで消化し、pAcC13バキュロウイルス発現プラスミド（Munemitsuら、Mol.Cell.Biol.（1990）10:5977〜5982）に挿入し、そしてその全体をジデオキシ鎖終止法を用いて配列決定した。この新しいプラスミドを、pAcVP16Tと命名した。 VP16-2tをコードするDNA配列を、上でgG1tに関して記載したようにAutographa califormicaバキュロウイルス（AcNPV）に組み換えた。 pHS226（国際公開番号WO/92/02251；ATCC寄託番号第68372号）由来のVP16-2をコードする約2.0kbのEcoRI-BamHIフラグメントを単離し、そして予めEcoRIおよびBamHIで消化したpSV7dに挿入することにより、プラスミドpSVVP-2を得た。 pH2G512由来のVP16-2をコードするXhoI-SphI平滑末端フラグメントをpUC18のS maI部位にクローン化して、pUC18からpHS226を作製した。短縮型VP16ポリペプチドを、以下のように免疫精製した。20mMのTris-HCl、pH 8.2、１mMのEGTA、１mMのMgCl₂、４mMのβ-メルカプトエタノール、1mg/mlのアプロチニン、0.2％のNP-40、および、抗プロテイナーゼ反応混合液からなる緩衝液を用いて、バキュロウイルス細胞培養物のペレットからVP16-2tを抽出した。この抗プロテイナーゼ反応混合液は、ペプスタチン、ロイペプチン、E-64、pefa bloc SC、EDTA、およびEGTAからなる。抽出物を遠心分離により清澄化し、そしてPBS中でのglu-ペプチドで溶出した抗glu Protein G-Sepharose Fast Flow（Ph armacia）カラム上で、VP16を精製した。精製したタンパク質を、SDS-PAGEによって特徴づけた。VP16バンドの移動度は、完全長のVP16については分子量65kDのタンパク質の移動度と一致し、VP16の短縮型については45kDのタンパク質の移動度と一致した。タンパク質の同一性を、抗gluモノクローナル抗体およびVP16のＮ末端に対するモノクローナル抗体であるLP1を用いて、ウエスタンブロットにより確認した。実施例４ HSV 診断アッセイにおける使用のための組換えgDポリペプチドの産生細胞外ドメインのアミノ酸１〜302をコードするgD2遺伝子フラグメントを哺乳動物発現ベクターpSV7dにクローン化し、上述のようにpHS213を作製した（米国特許第5,171,568号）。プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトし、そして短縮型gD2誘導体タンパク質を発現する安定な細胞株を選択し、次いでこれを、メトトレキセートの濃度を増加させながら連続的に曝露することにより増幅させた。標準的な技術を用いて、短縮型タンパク質を培地から精製した。特に、馴化培地を濃縮し、濃縮した培地を酸で沈殿させ、そしてヘパリンセファロース、ブチル 650M、およびＱ−セファロースファストフローカラムを含む一連のカラムを用いた。生成物を濃縮し、ダイアフィルトレーションを行い、さらなる使用のために保存した。実施例５ HSV 診断アッセイにおける使用のための組換えgBポリペプチドの産生ａ．HSV gB 米国特許第5,171,568号および同第5,422,792号；Pachlら、J.Virol.（1987）6 1 :315-325で開示された方法を用いて、本発明の診断アッセイにおける使用のための、完全長のgBポリペプチド、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失を有するgBのフラグメントとを組換え的に産生した。ｂ．HSV gB の短縮型誘導体膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのすべてまたは一部分を欠くHSV gBの種々の短縮型誘導体を、米国特許第5,171,568号および同第5,244,792号に記載されるように構築した。特に、gB1遺伝子の3'末端から580bpを欠失し、そして194個のカルボキシル末端アミノ酸を欠くタンパク質をコードするgB1遺伝子を含むプラスミドpHS114（ATCC寄託番号第39651号）を構築した。3'末端から637bpを欠失するgB2遺伝子を含むプラスミドpHS210もまた作製した。1187塩基対のgB1遺伝子フラグメントを有するプラスミドpHS127A（ATCC寄託番号第39652号）もまた構築した。ｃ．HSVgB2dTM gB2抗原の発現ベクターであるプラスミドpPRgBdTMは、SV40初期プロモータの制御下でgB遺伝子の欠失誘導体を含む。gB遺伝子誘導体は、膜貫通（TM）領域を含む、アミノ酸Ala₇₀₃からLeu₇₇₆によって規定される領域を欠く長さのポリペプチド808アミノ酸をコードする。この構築物は、アミノ酸Gln₇₇₇からＣ末端を含む。この誘導体は、以前に用いた短縮型gB2（膜貫通ドメインおよびＣ終端領域の両方を欠失していた）と比べてgB2タンパク質の分泌効率を改善するように構築した。タンパク質誘導体はともに、gBタンパク質の実質的にすべての細胞外ドメインを含む。この構築物によってコードされるgB2ポリペプチド（gB2dTM）は、細胞外ドメインと細胞質ドメインとの間の融合部でのKpnI部位のクローンニングおよび導入の結果として挿入された２つの新しいアミノ酸Gly₇₀₂およびThr₇₀₃を有する。プラスミドpPRgBdTMはまた、アデノウイルス主要後期プロモータ（Ad-dhfr）の制御下で、SV40複製起点、SV40ポリＡ付加部位、およびジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAを含む。すべてのプラスミドの構築を以下に詳細に説明する。ｄ．プラスミドpPRgBdTMの構築 pPRgBdTMの構築のために用いた機構は、以下の通りである。プラスミドpHS214 -A由来の2.57kpのEcoRI-BamHIフラグメントとして、gB2dTM誘導体遺伝子配列を得た。このフラグメントを、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてインキュベートし、EcoRI部位およびBamHI部位を修復して末端を平滑化し、その後、予めSaIIで切断し、そして末端を修復してクレノウDNAポリメラーゼＩフラグメントで平滑化し、その後アルカリホスファターゼで処理した哺乳動物細胞発現ベクターpPR25に連結した。プラスミドpHS214-Aの構築は、以下の通りである。完全なHSV-2 gB配列は、プラスミドpHS208（米国特許第5,171,568号に記載される）の3467bpのNruIからBam HIのフラグメント内に含まれる。膜貫通ドメインのアミノ酸Asp₇₀₁からGln₇₇₈を欠失するgB2誘導体遺伝子gB2dTMを、以下の３つのフラグメントから組み立てた：(1)22アミノ酸のシグナル配列および細胞外ドメインの604アミノ酸Ala₁〜Ala₆ ₀₄ とを含むgB2遺伝子の5'末端、ならびにSV40プロモータ、SV40ポリアデニル化部位、および細菌内での複製に必要な配列を含むpSV7d（米国特許第5,171,568号に記載される）ベクター配列のすべてを、プラスミドpHS214から、4360bpのXhoI からBamHIのフラグメントとして得た；（2）プラスミドpHS208から、ヌクレオチド1 870〜1980（gB遺伝子の最初のATGをヌクレオチド１と考える）に相補的な天然の XhoI部位を含むプライマーＡと、ヌクレオチド2158〜2169に相補的で、そして導入されたKpnI部位を含むプライマーＢとを用いて、294bpのPCRフラグメントとして、Leu₆₀₅からAsp₇₀₁までのgB2の細胞外ドメインの残りを得た。このフラグメントを制限酵素XhoIおよびKpnIで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動によって単離した；および(3)操作されたKpnI部位を含むヌクレオチド2395〜2407に相補的なPCRプライマーＣと、終止コドンおよびBamHI部位を含むヌクレオチド2698 〜2715に相補的なPCRプライマーＤとを用いることによって、アミノ酸Gln₇₇₈からアミノ酸883位の終止コドンを含む細胞質ドメインを含むgB2遺伝子の3'末端を、プラスミドpHS208から、321bpのKpnIからBamHIのフラグメントとして調製した。このフラグメントを制限酵素KpnIおよびBamHIで消化し、ゲル電気泳動によって単離した。これらの３つのフラグメント１、２、および３を互いに連結して、発現ベクターpSV7dに誘導体gB2dTMを含むプラスミドpHS214-Aを作製した。プラスミドpPR25は、スモールＴ抗原イントロンおよびポリアデニル化配列をコードするSV40 DNAであるアデノウイルス-2主要後期プロモータ（Ad-2 MLP）の制御下でジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）cDNAを含む、哺乳動物細胞発現ベクターである。pPR25の構築には、StuIでのプラスミドpPR21の消化、および発現ベクターpAD-dhfr由来の3388bpのNruI-EcoRIフラグメントの挿入が必要であった。 blaプロモータ、ならびにStuIおよびXhoIの制限部位を含む合成85-merをポリリンカーのSspI部位に挿入することによって、pSV7dからプラスミドpPR21を誘導した。 pHS214の構築のために用いた機構は、以下の通りである。発現ベクター中に互いに連結した２つのフラグメントとして、gB2遺伝子の短縮型誘導体を得た。pHS 208をTthIIIで消化し、そして1660bpフラグメントを単離して、pHS208からコード配列の3'末端を得た。フラグメントの末端を、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでフィルインし、DNAをSphIで消化し、そしてgB2アミノ酸560〜718 をコードする配列を含む477bpのSphI-(TthII)フラグメントを単離した。 gB2タンパク質の591個のアミノ酸をコードする1.90kbpのHindIII-PvuIIフラグメントを含むプラスミドであるpHS210（米国特許第5,244,792号に記載される）から、短縮型gB2遺伝子の5'末端を得た。pHS210のgB2コード領域を、膜アンカー配列と提案されているＮ末端の110アミノ酸をPvuII部位で切断した。pHS210 をHindIIIで消化し、フラグメントの末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでフィルインし、そしてDNAをSphIで消化した。1735bpの(HindIII)-SphI フラグメントを単離した。先で単離した２つのgB2遺伝子フラグメントを互いに連結し、フラグメントの末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでフィルインし、予めXgaIで消化し、そしてDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで修復して平滑末端化したpSV7dに挿入し、pHS214を作製した。ｅ．哺乳動物細胞におけるgB2dTMの発現プラスミドpPRgBdTMを、COS7細胞およびdhfrCHO細胞の両方にトランスフェクトした。Stuveら、J．Virol.（1987）61:326-335に記載されるように、ELISAによって培養培地へのgB2タンパク質の発現を確認した。分泌されたgB2dTMを発現するCHO細胞株を、大規模な商業的生産用に選択した。この目的のために、dhfr およびHSV gB2誘導体の両方の遺伝子を含むDNAプラスミドベクターpB2dTMで、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr酵素をコードする遺伝子）を欠失するCHO 細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、dhfrを発現する細胞だけが増殖し得るような選択培養培地で増殖させた。これらの細胞によるgB産生のレベルは、dhfrの非競合阻害剤である薬剤メトトレキセート（MTX）の増大する濃度を含む選択培地での段階的な培養プロセスによって増加した。dhfr遺伝子のコピー数を増幅させることによって、細胞は、MTXの存在下で増殖する能力を獲得した（Altら、J．Biol．Chem.（1978）235:1357-1370、およびKaufmanら、Mol．Cellular Biol.（1981）1:1069-1076）。dhfr DNAに直接連結する第２の遺伝子gB2もまた同時に増幅した（Kaufman，R.J.ら、J．Mol．Biol.159:601〜62 1（1982））。このプロセスは、バルク集団中の細胞の、MTX含有選択培地への曝露、50〜400個の異なる単一コロニークローンの選択、96ウェルプレート、次いで24ウェルおよび６ウェルプレートに連続的に通過させることによるコロニー細胞数の拡大を必要とし、ELISAアッセイを用いて培養培地に分泌されるgBの量を測定して同時にgB2の生産性を評価した。生産性にさらなる増大が観察されなくなった場合は、このプロセスを停止した。実施例６ gB2 型特異的エピトープおよび型共通エピトープの同定 gB2の３つの異なるセグメントを表す組換えタンパク質を、ヒトIgG抗体反応性について試験した。これらの構築物は、gB2のアミノ酸18〜228を含むアミノ近位タンパク質（gB2 SS2）、gB2のアミノ酸154〜503を含む中央部（gB2 AP2）、およびgB2のアミノ酸228〜903を含むカルボキシ近位部（gB2 SS1）を含んだ。これらの組換えタンパク質を、ウエスタンイムノブロットアッセイにおける抗体標的として用いた。 HSV型特異的gG試験により既知のHSV血清型を有する45個体由来の血清サンプルを評価した。gB2 SS2は、HSV 2+/1-個体由来の15の血清サンプルのうちの15と強く反応性であった。これに対し、15のHSV 1+/2-血清サンプルの０、および15のH SV 1-/2-血清サンプルの０は反応性であった。15のHSV 2+/1-血清サンプルの５、15のHSV 1+/2-血清サンプルの０、および15のHSV 1-/2-血清サンプルの０において、gB2 AP2反応性が見られた。最後に、15のHSV 2+/1-血清サンプルの15、15 のHSV 1+/2-血清サンプルの15、および０から15のHSV 1-2-血清サンプルにおいてgB2 SS1反応性が見られた。このように、HSV gB2は、HSV-2抗体と反応するアミノ近位領域のエピトープ、ならびにHSV-1抗体およびHSV-2抗体の両方と反応するカルボキシ近位領域のエピトープとを含む。このアッセイにおいて、これらのエピトープをそれぞれ型特異的抗原および型共通抗原として用いることができる。実施例７ HSV 診断アッセイにおける使用のための型特異的gB1ペプチドの合成図４に示す成熟分子（前駆体分子を参照して番号を付けたアミノ酸31〜77）を参照して番号を付けたgB1のアミノ酸１〜47を含む型特異的gB1ペプチドを、Carp inoおよびHan、J．Amer．Chem．Soc.（1970）92:5748-5749、CarpinoおよびHan 、 J．Org．Chem.（1972）37:3404-3409、ならびにChangおよびMeienhofer、J．Pep tide Protein Res.（1978）11:246-249に記載されるように、標準的な0.25mMスケールおよび標準的なABI FastMocプロトコル、化学薬品および試薬を用いて、A BI433Aペプチドシンセサイザー（Foster City，CA）で合成した。BSAへの結合を促進するためにシステイン残基をＮ末端に付加し（以下を参照のこと）、BSAに結合したペプチドの量を測定する補助のためにノルロイシン残基をＣ末端に付加した。合成の後、Kingら、Int．J．Peptide Prot．Res；およびLundtら、Int．J．Pe ptide Prot．Res.（1978）に記載されるように、樹脂支持体からペプチドを切断した。Burkeら、J．Liq．Chromatogr.（1988）11:1229；およびHodgesら、Pepti des: Chemistry and Biology Proceedings of the Tenth American Peptide Sym posium、Marshal編、Escom Science Publishers、Leiden、オランダ（1988）、2 26頁の「逆相HPLCによるペプチドの精製の新規なアプローチ：サンプル置換クロマトグラフィー」に記載されるように、ペプチドを精製した。簡潔には、C18樹脂および５倍のカラム容量の５〜50％のアセトニトリルを用いる45°勾配を使用して逆相HPLCを行った。0.1％のTFAをイオン対形成剤として用いた。カラム溶出を分画した。これらの画分の分析HPLCを行い、上記のKingらおよびLundtらに記載のように純度について試験した。分析用スケールC18逆相カラムを、５〜50％のアセトニトリル勾配およびイオン対形成剤として0.1％のTEAPとともに用いた。90％を上回る純度の画分をプールした。最終的に精製したペプチドプールは、95％の純度であった。合成の後、ペプチドを、BSA（単量体、Sigma Chemicals Co.，St．Louis，MO 、カタログ番号A-1900）に結合させた。標準的な技術を用いて、Sulfo-SMCC（Pi erce，Rockford，IL）を用いて化学的結合を行った。Brinkley、Bioconjugate C hem.（1992）3:2-13；Hashidaら、J．Appl．Biochem.（1984）6:56-63；ならびにAnjaneyuluおよびStaros、International Journal of Peptide and Protein R esearch（1987）30:117-124を参照のこと。ノルロイシンの存在についてアッセイすることによる標準的なアミノ酸分析技術により確認されるように、１つのBSAに対する4.52 gB1ペプチドのモル比を得た。カップリングの後、30,000の分子量のカットオフを有する膜を用いるAmiconフローセルでのダイアフィルトレーションにより、混合物から結合していないgB1 ペプチドを取り除いた。遊離のペプチドの除去を、分析用スケールカラムを用いる逆相HPLCにより測定した。0.1％のTEAPをイオン対形成剤として用いて、５〜5 0％のアセトニトリルからの勾配を走査した。ペプチド結合体のエリアに対する遊離のペプチドのエリアを比較した。実施例８型特異的および型共通HSV糖タンパク質を用いた HSV 診断アッセイａ．ストリップイムノブロットアッセイ（SIA）上記の、バキュロウイルスで発現させたgG1およびgG2タンパク質を、型特異的抗原として、別々の細いバンドで、gGIについては４mg/mlの濃度およびgG2については0.25mg/mlの濃度で、ニトロセルロースストリップに塗布した。実施例４に記載したgD2タンパク質（HSV-1ホモログとHSV-2ホモログとの間で86%の同一性を有する型共通タンパク質）を、さらに別のバンドとして1mg/mlの濃度で、同じニトロセルロースストリップにコートした。内部コントロールとして、さらなるバンドは、精製したヒトIgGを低濃度（185ng/ml）および高濃度（925ng/ml）で、そして抗ヒトIgM（1mg/ml）を含んだ。イムノブロットアッセイのために、ストリップを、各バッチにつき30ストリップを有するバッチ様式で処理した。全ての工程を室温で行った。各ストリップに番号をつけ、次に、別々のチューブに入れ、そのチューブに１mlの希釈液（ウシタンパク質の安定剤および界面活性剤を含むPBS、0.1％のアジ化ナトリウム、および防腐剤として0.05％のゲンタマイシン硫酸塩）および20mlの血清サンプルを加えた。チューブを４時間穏やかに振動させ、溶液を吸引によって取り除き、1m lの新鮮な希釈液を各チューブに加えた。チューブを30分間振動させ、溶液を吸引によって取り除き、そして洗浄緩衝濃縮物（50×）から作製された1mlの洗浄緩衝液（防腐剤として0.01%のチメロサールを含むリン酸緩衝化界面活性剤溶液）を、各チューブに加えた。各チューブの内容物を、１つの洗浄容器に空け、ストリップを20秒間回旋させることによって洗浄した。洗浄緩衝液を、デカントし、30mlの新鮮な緩衝液を加え、そしてこのプロセスを繰り返した。残留溶液を吸引によって取り除き、20mlの結合溶液（conjugate solution）（ウシタンパク質安定剤を有し、防腐剤として0.01%のチメロサールを含有する、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（重鎖および軽鎖））を加えた。容器を、10分間110rpmで回転させ、結合溶液をデカントし、そして洗浄工程を３回繰り返した。残留溶液を、吸引によって再び取り除き、20mlの基質／現像液（メタノール／リン酸緩衝過酸化水素中の４−クロロ−１−ナフトール）を加え、次に15〜20分間、110rpm で回転させた。溶液をデカントし、そしてストリップを蒸留水中で２回洗浄した。現像したストリップをペーパータオル上に表を上にして置き、暗所で30分間乾燥させた。次に、ストリップを３時間以内の乾燥で読みとった。HSV抗原バンドの色の強度に、以下のアルゴリズムを用いて、-(0)〜4+の範囲の値を割り当てた。低IgGバンドに1+の値を割り当て、高IgGバンドに3+の値を割り当てる。次に、 gG1、gG2、およびgDバンドを、これらのバンドの強度がIgGのコントロールバンドの強度とどのように比較されるかに応じて、０〜4+でスコアする。ｂ．ランダムな血清サンプルのSIA、およびウエスタンブロットアッセイによって得られた結果に対する結果との比較 HSVワクチン研究のために志願した個人由来のスクリーニングサンプルとして得られた、738のランダムに選ばれた血清サンプルのセットを、上記のSIAアッセイを用いて、HSVの血清状態（serostatus）について分析した。≧1+でスコアされる３つのHSV抗原バンドのいずれかを有するサンプルを、陽性とみなした。様々な血清状態のクラスを示す代表的なサンプルを図１に示す。各サンプルのHSV 血清状態をまた、刊行された手順（Ashleyら、J．Clin．Micro.（1988）26:662 〜667）によるウエスタンブロットアッセイによって別々に決定した。イムノブロットアッセイの結果と、ウエスタンブロットアッセイから得られた診断との比較を表１に示す。ウエスタンブロットアッセイによって、HSV-1のみの血清陽性（seropositive）であるとみなされた327の血清のうち、286、すなわち87.5%をイムノブロットによって診断した。２つのアッセイで一致しない結果を出した51のサンプルを、様々な診断カテゴリに分配した；13をHSV1+2+に指定し、３つをHSV2+のみとして指定した。ウエスタンブロットアッセイによってHSV 1+2+であった120の血清のうち、100（83.3%）をまた、イムノブロットアッセイによっても検出し、そして20を、HSV2+のみであると決定した。55の全サンプル（ウエスタンブロットアッセイによってHSV1+またはHSV1+2+である447の全サンプルの12.3%）が、検出可能なgG1抗体を有さなかった。これらのうち、26がgD2 抗体のみを有し、陽性の型分類不可能（positive untypable）と指定し、９を、二重血清陰性（double seronegative）として指定し、そして20を、HSV2+のみとして診断した。ウエスタンブロットアッセイによってHSV2+のみとして指定した血清についての２つのアッセイ間に優れた一致があり、116のうち115（99.1%）を、イムノブロットアッセイによって同様に診断した。同様に、174の血清をイムノブロットアッセイによって二重血清陰性として指定し、これは、ウエスタンブロットアッセイによって二重血清陰性として指定した176の血清の98.9%に対応する。ｃ．ランダムな血清サンプルのSIA、および型特異的gB1ペプチドを用いるウエスタンブロットアッセイにより得られた結果に対する結果との比較酵母中で産生され、実施例1aおよび2b（Ｃ末端領域）にそれぞれ記載される型特異的gG1およびgG2と、実施例４に記載される型共通gD2タンパク質とを、実施例8aに記載されるようなニトロセルロースストリップに塗布した。さらに、実施例７に記載される合成の型特異的gB1-BSAペプチドを、別々の細いバンドで、1mg /mlの濃度でニトロセルロースストリップに塗布した。内部コントロールとして、さらなるバンドは、精製ヒトIgGを低濃度（185ng/ml）および高濃度（925ng/m l）で、そして抗ヒトIgM（1mg/ml）を含んだ。 18〜50歳までの健康な成人からランダム選択された737の血清を、このSIAを用いてスクリーニングしてHSV血清状態を決定した（表２）。これらのうち176（23 .9%）がHSVに対する抗体を持たず、419（56.8%）がHSV-1血清陽性であり、243（ 33.0%）がHSV-2血清陽性であり、そして122のサブセットが、二重HSV-1および-2 血清陽性であった。さらなる21がgD2抗体のみを有し、従って、HSV血清陽性として型分類不可能と指定した。これらの診断を、ウエスタンブロット（WB）アッセイによって決定したものと比較すると、SIAは、HSV-1陽性サンプルの92.4%、HSV -2陽性サンプルの99.6%、およびHSV陰性サンプルの97.1%を正しく識別した。 gB1ペプチドは、260/297（87.5%）を診断したgG1タンパク質と比較して（表３）、SIAによってHSV-1のみの血清陽性として指定した合計297の血清のうちの264 （88.9%）を診断した。従って、gB1ペプチドは、gG1タンパク質と同等に、この目的のために良好な抗原であった。SIAによってHSV-1⁺HSV-2⁺として指定した122 の血清のうち、gG1タンパク質によって検出した108/122（88.5%）と比較して、g B1ペプチドは、101/122、すなわち82.8%を検出した。SIAによってHSV-1⁺/2⁺として診断した419の血清のうち、414が、ウエスタンブロット診断と一致した。gB1 ペプチドは、ウエスタンブロット分析によってHSV-2⁺のみであった３つの血清を、HSV-1⁺/2⁺として診断した（３つのHSV-1偽陽性に対応）。gG1タンパク質は、ウエスタンブロットによってHSV-2⁺のみであった１つの血清を、HSV-1⁺/2⁺として診断し、両方の抗原からの結果を組み合わせて合計4/419（0.95%）のHSV-1偽陽性を示した。従って、ウエスタンブロットにより415/449（92.4%）のHSV-1⁺サンプルが、SIAによって正確に診断された。gB1およびgG1抗原の両方は、最終HSV-1⁺ 診断に等しく寄与した。従って、SIAを読みとるための最終的なアルゴリズムは、gB1およびgG1抗原のバンドのどちらか一方または両方が陽性（血清がHSV-1⁺）であるかどうかである。SIAによればHSV-1^-であり、ウエスタンブロットによればHSV-1⁺である34のHSV-1⁺血清のうち、12をHSV-2⁺のみとして指定し、６つを、 HSV陰性として指定し、そして16を、HSV陽性として型分類不可能と指定した。SI AアッセイにgB1ペプチドを加えることにより、gG1のみをHSV-1特異的抗原として 82.0%（-gB1）〜93.3%（+gB1）含むアッセイと比較して、HSV-1偽陰性の数が約5 0％減少した。 HSVウエスタンブロットアッセイと比較した、HSV SIA の実施の容易さ、およびより広範な有用性により、HSVの広範な血清学的スクリーニングを容易にし得る。 ^*これらのうち３つは、WBによればHSV-2⁺のみであり；^**これらのうち１つが、W BによればHSV-2⁺のみである。 †これらは、gD2が陰性であるので、HSV陰性として診断された。ｄ．ELISA gGのELISA方法を、以下の工程を用いて実行した。Immulon２マイクロタイタープレート（Dynatech Laboratories、Chantilly、VAより入手可能）を、gG1またはgG2抗原を用いて、ホウ酸塩緩衝液中のそれぞれの抗原を、2mg/ml（50l/ウェル）で、４℃で一晩プレートに塗布することによりコートした。プレートを、0. 14MのNaClおよび0.05%のTriton X-100を含む洗浄緩衝液で４回洗浄し、そしてプレートを、10%ウシ胎児血清（FCS）、リン酸緩衝食塩水（PBS）中の0.3%のTween 20で、37℃で約２時間ブロックした。プレートを、適切な洗浄液、および0.25M の二塩基リン酸ナトリウム、0.001MのEDTA、0.5MのNaCl、0.2Mのチメロサール、 0.01%のTriton X-100、0.001%のHCl、6N、および1%のカゼインを含む希釈溶液中で1:20に希釈したヒト血清で４回洗浄した。サンプルを、50l/ウェルで加え、そしてプレートを37℃で約２時間インキュベートした。ヒト血清との反応の後、プレートを４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合されたCappel Fab'2のヤギ抗ヒトIgG（希釈溶液中で1:4000に希釈（50l/ウェル））をウェルに加え、そして37℃で約１時間インキュベートした。適切な洗浄溶液で４回洗浄した後、プレートを、50l/ウェルで加えられたOPD（o -フェニレンジアミンジヒドロクロライド）溶液を用いて約15分間現像した。反応を4NのH₂SO₄(50l/ウェルで加えられた)で停止させ、ELISAリーダーにおいてOD 490-650でプレートを読みとった。アッセイの結果を、以下の表４および５に示す。従って、HSV感染を検出する新規な方法が開示される。本発明の好適な実施態様を、ある程度詳細に記載したが、明白な変更が、添付の請求の範囲によって定義される、本発明の精神および範囲から逸脱することなく成され得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．単純ヘルペスウイルス(HSV)感染を検出する方法であって： (a)生物学的サンプルを提供する行程； (b)該生物学的サンプルと、１つ以上のHSV型特異的抗原および１つ以上のHSV 型共通抗原とを、該生物学的サンプル中に存在する場合にHSV抗体が該型特異的抗原および／または該型共通抗原に結合し得る条件下で、反応させる行程； (c)免疫グロブリン分子と結合し得る１つ以上の部分を提供する行程；および (d)該１つ以上の部分の有無を検出する行程、を包含する、方法。２．前記HSV感染がHSV-1である、請求項１に記載の方法。３．前記HSV感染がHSV-2である、請求項１に記載の方法。４．前記１つ以上の部分が、検出可能に標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を含む、請求項１に記載の方法。５．前記検出可能な標識が、蛍光剤または酵素である、請求項４に記載の方法。６．前記１つ以上の型特異的抗原および前記１つ以上の型共通抗原が、固体支持体上に固定化されている、請求項１に記載の方法。７．前記固体支持体がニトロセルロースストリップである、請求項６に記載の方法。８．前記１つ以上の型特異的抗原が、HSV糖タンパク質Ｇ(gG)ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。９．前記gGポリペプチドがgG1ポリペプチドである、請求項８に記載の方法。 10．前記gGポリペプチドがgG2ポリペプチドである、請求項８に記載の方法。 11．前記１つ以上の型特異的抗原が、HSV gG1およびHSV gG2ポリペプチドを含む、請求項８に記載の方法。 12．前記gGポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項８に記載の方法。 13．前記１つ以上の型特異的抗原が、成熟gB1分子を参照して番号付けしたHSV g B1のアミノ酸１〜47に対応するアミノ酸配列を含有するHSV-1糖タンパク質Ｂ(gB 1)の型特異的エピトープを含む、請求項１に記載の方法。 14．前記１つ以上の型共通抗原が、HSV糖タンパク質Ｄ(gD)ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。 15．前記gDポリペプチドがgD1ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。 16．前記gDポリペプチドがgD2ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。 17．前記gDポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項14に記載の方法。 18．前記１つ以上の型共通抗原が、HSV糖タンパク質Ｂ(gB)ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。 19．前記gBポリペプチドがgB1ポリペプチドである、請求項18に記載の方法。 20．前記gBポリペプチドがgB2ポリペプチドである、請求項18に記載の方法。 21．前記gBポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項18に記載の方法。 22．前記１つ以上の型共通抗原が、HSV VP16ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。 23．前記VP16ポリペプチドがHSV-1 VP16ポリペプチドである、請求項22に記載の方法。 24．前記VP16ポリペプチドがHSV-2 VP16ポリペプチドである、請求項22に記載の方法。 25．前記生物学的サンプルがヒト血清サンプルである、請求項１に記載の方法。 26．生物学的サンプル中において１型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)感染と２型単純ヘルペスウイルス(HSV-2)感染とを区別するための方法であって、 (a)１つ以上の型特異的HSV-1ポリペプチド、１つ以上の型特異的HSV-2ポリペプチド、および１つ以上の型共通HSVポリペプチドをニトロセルロースストリップ上に固定化する行程であって、ここで該１つ以上の型特異的HSV-1ポリペプチドが、HSV-1糖タンパク質Ｇ(gG1)ポリペプチドおよび、成熟gB1分子を参照して番号付けしたHSV gB1のアミノ酸１〜47に対応するアミノ酸配列を含有するHSV-1 糖タンパク質Ｂ(gB1)の型特異的エピトープからなる群から選択され、さらに、該１つ以上の型特異的HSV-2ポリペプチドが、型特異的HSV-2糖タンパク質Ｇ(gG2 )ポリペプチドを含む、行程； (b)行程(a)の該ニトロセルロースストリップと、生物学的サンプルとを、該生物学的サンプル中に存在する場合に抗HSV-1および抗HSV-2抗体が該型特異的および／または該型共通HSVポリペプチドに結合し得る条件下で、接触させる行程； (c)検出可能に標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を提供する行程；および (d)該生物学的サンプル中の結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体の有無を検出する行程、を包含し、これにより、該生物学的サンプル中のHSV-1および／またはHSV-2感染の有無を検出する、方法。 27．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-1糖タンパク質Ｄ(gD1 )ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 28．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-2糖タンパク質Ｄ(gD2 )ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 29．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-1糖タンパク質Ｂ(gB1 )ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 30．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-2糖タンパク質Ｂ(gB2 )ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 31．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-1 VP16ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 32．前記１つ以上の型共通HSVポリペプチドが、型共通HSV-2 VP16ポリペプチドを含む、請求項26に記載の方法。 33．前記生物学的サンプルがヒト血清サンプルである、請求項26に記載の方法。 34．前記gG1、gG2および型共通HSVポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項26に記載の方法。 35．HSV感染を検出する免疫診断試験キットであって、１つ以上の型特異的および型共通HSV抗原、ならびに該免疫診断試験を行うための説明書を含む試験キット。 36．前記型特異的抗原がHSV糖タンパク質ｇ(gG)ポリペプチドである、請求項35 に記載の免疫診断試験キット。 37．前記gGポリペプチドがgG1ポリペプチドである、請求項36に記載の免疫診断試験キット。 38．前記gGポリペプチドがgG2ポリペプチドである、請求項36に記載の免疫診断試験キット。 39．前記１つ以上の型特異的抗原が、HSV gG1およびHSV gG2ポリペプチドを含む、請求項36に記載の免疫診断試験キット。 40．前記gGポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項36に記載の免疫診断試験キット。 41．前記１つ以上の型特異的抗原が、成熟gB1分子を参照して番号付けしたHSV g B1のアミノ酸１〜47に対応するアミノ酸配列を含有するHSV-1糖タンパク質Ｂ(gB 1)の型特異的エピトープを含む、請求項35に記載の免疫診断試験キット。 42．前記１つ以上の型共通抗原が、HSV糖タンパク質Ｄ(gD)ポリペプチドを含む、請求項35に記載の免疫診断試験キット。 43．前記gDポリペプチドがgD1ポリペプチドである、請求項42に記載の免疫診断試験キット。 44．前記gDポリペプチドがgD2ポリペプチドである、請求項42に記載の免疫診断試験キット。 45．前記gDポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項42に記載の免疫診断試験キット。 46．前記１つ以上の型共通抗原がHSV糖タンパク質Ｂ(gB)ポリペプチドを含む、請求項35に記載の免疫診断試験キット。 47．前記gBポリペプチドがgB1ポリペプチドである、請求項46に記載の免疫診断試験キット。 48．前記gBポリペプチドがgB2ポリペプチドである、請求項46に記載の免疫診断試験キット。 49．前記gBポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項46に記載の免疫診断試験キット。 50．前記１つ以上の型共通抗原がHSV VP16ポリペプチドを含む、請求項35に記載の免疫診断試験キット。 51．前記VP16ポリペプチドがHSV-1 VP16ポリペプチドである、請求項50に記載の免疫診断試験キット。 52．前記VP16ポリペプチドがHSV-2 VP16ポリペプチドである、請求項50に記載の免疫診断試験キット。 53．生物学的サンプル中の１型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)感染と２型単純ヘルペスウイルス(HSV-2)感染とを区別するための免疫診断試験キットであって： (a)ニトロセルロースストリップ上に固定化された、１つ以上の型特異的HSV-1 糖タンパク質ポリペプチド、１つ以上の型特異的HSV-2ポリペプチド、および１つ以上の型共通HSVポリペプチドであって、ここで該１つ以上の型特異的HSV-1ポリペプチドが、HSV-1糖タンパク質Ｇ(gG1)ポリペプチド、および成熟gB1分子を参照して番号付けしたHSV gB1のアミノ酸１〜47に対応するアミノ酸配列を含有するHSV-1糖タンパク質Ｂ(gB1)の型特異的エピトープからなる群から選択され、さらに、該１つ以上の型特異的HSV-2ポリペプチドが、型特異的HSV-2糖タンパク質Ｇ(gG2)ポリペプチドを含む、１つ以上の型特異的HSV-1糖タンパク質ポリペプチド、１つ以上の型特異的HSV-2ポリペプチド、および１つ以上の型共通HSVポリペプチド；および (b)免疫診断試験を行うための説明書、を含む、免疫診断試験キット。 54．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-1糖タンパク質Ｄ(gD1)ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 55．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-2糖タンパク質Ｄ(gD2)ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 56．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-1 VP16ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 57．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-2 VP16ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 58．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-1糖タンパク質Ｂ(gB1)ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 59．前記型共通HSVポリペプチドが型共通HSV-2糖タンパク質Ｂ(gB2)ポリペプチドである、請求項53に記載の免疫診断試験キット。 60．前記gG1、gG2および型共通HSVポリペプチドの膜貫通ドメインの全部または一部が欠失している、請求項53に記載の免疫診断試験キット。