PT842430E - Diagnostico do virus do herpes simples - Google Patents

Description

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

DESCRIÇÃO

Diagnósticos do vírus do herpes simples

Campo técnico A presente invenção refere-se de um modo geral a técnicas de diagnóstico virai. Em particular, a invenção refere-se a métodos para a detecção precisa de infecção pelo vírus do herpes simples.

Antecedentes da invenção

As infecções pelo vírus do herpes simples ("HSV") são extremamente prevalecentes e têm uma gama de manifestações desde a contracção aparentemente assintomática até à doença grave e infecções com risco de vida no indivíduo imunocomprometido e no neonato. Estas infecções são provocadas por dois vírus, o vírus do herpes simples do tipo 1 ("HSV-1") e o vírus do herpes simples do tipo 2 ("HSV-2"). O HSV-1 é a causa predominante de infecções orais e é normalmente adquirido na infância, enquanto que as infecções pelo HSV-2 são normalmente infecções genitais sexualmente transmitidas. Estas distinções são esbatidas, contudo, e até cerca de 25% do herpes genital é causado por HSV-1. Após a infecção inicial, o vírus estabelece um estado latente prolongado e reactiva-se periodicamente, causando episódios lesionais clinicamente aparentes ou disseminação assintomática do vírus.

De um modo geral, o HSV é um vírus de ADN de cadeia dupla possuindo um genoma de cerca de 150-160 kpb, alojado no interior de uma nucleocápside icosaédrica envolvida numa membrana. A membrana (ou envelope) inclui 10 ou mais glicoproteínas específicas do vírus, sendo as mais abundantes gB, gC, gD e gE. 0 genoma virai codifica também mais de 50 outras proteínas incluindo a proteína do tegumento VP16. Os genomas virais de HSV-1 e HSV-2 são colineares e partilham 50% de homologia ao longo de todo o genoma. Para alguns genes, tais como os de gB e de gD, a identidade de aminoácidos entre os dois tipos do vírus aumenta até mesmo 80 a 90%. Como resultado desta semelhança, muitos anticorpos específicos para o HSV sofrem reacção cruzada com ambos os tipos do vírus. Dentro de um tipo do vírus existe uma variabilidade de sequências cadeia-a-cadeia limitada (1 a 2%) dos genes das glicoproteínas. As estirpes de HSV incluem, mas não se lhes limitam, a 333 e a Patton.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Apesar da disponibilidade do agente antíviral, aciclovir, para o HSV, a incidência do HSV-2 na população varia de 8-50% e está aumentar. A razão aparente para este aumento é a de que a maioria dos indivíduos não sabem da sua infecção. Adicionalmente, a maioria dos casos de transmissão ocorre de vírus disseminados assintomaticamente.

Foram desenvolvidos muitos ensaios para o diagnóstico da infecção por HSV. Estes ensaios sofrem, infelizmente, de várias desvantagens. 0 ensaio mais vulgarmente utilizado envolve uma cultura virai. Uma amostra significativa do vírus apenas pode ser obtida precocemente na fase de lesão da infecção. Contudo, muitos indivíduos tiveram infecções por herpes anteriores mas são assintomáticos. Estes indivíduos podem disseminar o vírus assintomaticamente, sem ter lesões activas, e a infecção não será detectável utilizando a cultura virai. Assim, a detecção de HSV por cultura virai tem uma elevada taxa de falsos negativos, tão elevada como cerca de 50% para os episódios de herpes recorrentes. Adicionalmente, a cultura do vírus é lenta, tornando este método de diagnóstico impraticável em situações potencialmente graves em que são necessários resultados rápidos, tais como imediatamente antes do parto ou doença de um recém-nascido. Adicionalmente, a cultura é dispendiosa e as amostras virais podem-se degradar durante o transporte para o laboratório. É necessário conduzir um teste adicional para determinar se a infecção por HSV é por HSV-1 ou HSV-2.

Os testes de detecção de antigénios proporcionam uma alternativa à cultura virai. Contudo, tal como a cultura virai, estes testes requerem amostras de lesões activas e portanto têm uma elevada taxa de falsos negativos, e.g. no caso de infecção assintomática. Se bem que mais rápidos e mais sensíveis do que a cultura virai, é necessário um teste adicional para determinar se a infecção é devida a HSV-1 ou HSV-2.

Tentaram-se também ensaios serológicos, testes ao sangue que detectam anticorpos para o HSV. Estes testes podem detectar a infecção quer sintomática quer assintomática. Contudo, os testes não dão diagnósticos precisos de uma infecção primária aguda até que se formem anticorpos, normalmente cerca de duas semanas após a infecção. Assim, estes métodos não são úteis para o diagnóstico de um primeiro surto. Adicionalmente, os testes confundem frequentemente o HSV-1 e o HSV-2.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 3 A Patente dos EUA No. 4 764 459 descreve um método para o diagnóstico de HSV-1 ou HSV-2 utilizando antigénios de HSV-1 ou HSV-2. Os soros de teste têm que ser pré-absorvidos com extractos de células infectadas com o vírus para remover anticorpos intertípicos que reagem de forma cruzada, têm que ser realizados dois testes separados para detectar anticorpos dó HSV-1 e do HSV-2 e amostras não tipificáveis dão resultados falsos negativos.

Ashley et a/., J. C/in. Microbioi. (1988) 26:662-667, descrevem um teste Western Blot que afirmam detectar anticorpos para HSV-2 em 99% dos pacientes com infecção por HSV-2 provada em cultura, 21 dias após o início dos primeiros sintomas. Mostrou-se que o teste tinha uma precisão de 100% quanto à distinção entre HSV-1 e HSV-2. Contudo, o teste é difícil de realizar, utilizando um processo de dois passos para detectar anticorpos para até 50 proteínas de HSV individuais, algumas das quais específicas para o tipo 1 e outras para o tipo 2. Em adição, têm que ser realizados dois Western Blots (um com antigénios de HSV-1 e o outro com antigénios de HSV-2) para determinar anticorpos específicos do tipo. A técnica é demorada e a interpretação dos resultados é subjectiva. Os técnicos de laboratório têm que ter um intenso treino para conduzir o teste da maneira correcta.

Foram também desenvolvidos imunoensaios específicos de proteínas. Veja-se, e.g., Ashley et a!., J. Clin, MicrobioL (1988) 26:662-667;

Sanchez-Martinez et ai., J. infect. Dis. (1991) 1 64:1196-11 99; Lee et ai., J. Clin. MicrobioL (1985) 22:641-644, Lee et ai., Virol. Meth. (1986) 14:111-118. Estes ensaios detectam anticorpos para uma única proteína virai, tal como gG, que é única para o HSV-1 (gG1) e para o HSV-2 (gG2). Os testes podem ser realizados no formato de imunopontos ("immunodot"), dão geraimente resultados precisos na identificação de anticorpos para o HSV-2, mas produzem grandes números de falsos positivos na identificação de anticorpos para o HSV-1. Adicionalmente, os anticorpos para a gG2 podem não se desenvolver durante 6-8 semanas após a infecção e, em 5-10% dos indivíduos, o anticorpo para a gG permanece indetectável utilizando os formatos de ensaio descritos.

Os antigénios específicos de HSV-1 e de HSV-2 podem ser definidos utilizando padrões de reactividade com vírus recombinantes intertípicos HSV-1 x HSV-2 (Koelle et ai., J. Virol. (1994) 68:2803-2810).

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 4 A ampla disponibilidade de um ensaio serológico específico do tipo seria uma ferramenta importante para o diagnóstico da infecção por herpes de modo a parar a disseminação epidémica da doença. A presente invenção proporciona um método simples, extremamente preciso e eficiente para o diagnóstico da infecção por HSV, bem como para distinguir entre a presença de infecção por HSV-1 e por HSV-2. 0 método de ensaio utiliza antigénios de HSV tanto comuns aos tipos como específicos dos tipos e pode, numa concretização, ser utilizado num formato de ensaio num único passo.

Assim, numa concretização, a presente invenção refere-se a um método para detectar infecção por HSV compreendendo: (a) proporcionar uma amostra biológica de um ser humano; (b) fazer reagir a amostra biológica com um ou mais antigénios purificados de HSV, específicos do tipo, e um ou mais antigénios purificados de HSV, comuns aos tipos, sob condições que permitam que os anticorpos para o HSV, quando presentes na amostra biológica, se liguem ao antigénio específico do tipo e/ou ao referido antigénio comum; e (c) detectar a presença ou a ausência de anticorpos ligados no passo (b) como uma indicação da presença ou da ausência de anticorpos para HSV, em que a referida detecção é realizada utilizando um ou mais anticorpos imunoglobulina anti-humanos marcados de forma detectável.

Em ainda outra concretização, a invenção refere-se a um método para distinguir entre infecção por HSV-1 e por HSV-2 numa amostra biológica, compreendendo o método: (a) imobilizar um ou mais polipéptidos de HSV-1 purificados, específicos do tipo, um ou mais polipéptidos de HSV-2 purificados, específicos do tipo, e um ou mais polipéptidos de HSV purificados, comuns aos tipos, em posições discretas sobre uma tira de nitrocelulose, em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionados de entre o grupo que consiste em um polipéptido de glicoproteína G de HSV-1 (gG 1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 da gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, e ainda em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 5 compreendem um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2) específico do tipo; (b) colocar em contacto a tira de nitrocelulose do passo (a) com a amostra biológica, sob condições que permitam que anticorpos anti-HSV-1 e anti-HSV-2, quando presentes na amostra biológica, se liguem aos polipéptidos de HSV específicos dos tipos e/ou comuns aos tipos; e (c) detectar a presença ou a ausência de anticorpos ligados no passo (b) como uma indicação da presença ou da ausência de HSV-1 e/ou HSV-2 na amostra biológica, em que a referida detecção é realizada utilizando um ou mais anticorpos imunoglobulina anti-humanos marcados de forma detectável, distinguindo deste modo entre o HSV-1 e o HSV-2 na referida amostra biológica.

Em concretizações particularmente preferidas, a amostra biológica é uma amostra de soro humano e os polipéptidos de HSV têm todo ou parte de um domínio transmembranar deles eliminado.

Em ainda outras concretizações, a invenção refere-se a estojos de testes de imunodiagnóstico para a detecção de infecção por HSV. Os estojos compreendem: (a) um ou mais polipéptidos purificados de HSV-1, específicos do tipo, ligados a um suporte sólido em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionados de entre o grupo que consiste em um polipéptido da glicoproteína G do HSV-1 (gG 1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína de HSV-1 (gB1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 de gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, um polipéptido purificado de HSV-2, específico do tipo, ligado a um suporte sólido em que o referido polipéptido de HSV-2 específico do tipo é um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2), e um ou mais polipéptidos purificados de HSV comuns aos tipos, ligados a um suporte sólido; e (b) instruções para a condução do teste de imunodiagnóstico.

Ainda em outras concretizações, a invenção refere-se a um estojo de testes de imunodiagnóstico para distinguir entre infecção por HSV-1 e por HSV-2 numa amostra biológica. O estojo de teste compreende:

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 6 (a) um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo, um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo e um ou mais polipéptidos de HSV comuns aos tipos, imobilizados em posições discretas sobre uma tira de nitrocelulose, em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionados de entre o grupo que consiste em um polipéptido de glicoproteína G de HSV-1 (gG1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB1), compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 da gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, e ainda em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo compreendem um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2); e (b) instruções para a condução do teste de imunodiagnóstico.

Estas e outras concretizações da presente invenção ocorrerão prontamente aos peritos na arte em face desta descrição.

Breve descricão das Figuras A Figura 1 representa resultados representativos de um ensaio de immunoblot em tiras (SIA) de acordo com a presente invenção.

As Figuras 2A-2D representam vários antigénios gG1. A Figura 2A mostra a molécula precursora de gG1 a partir da qual derivam os antigénios gG1. A Figura 2B mostra a estrutura de HSV1gG1. A Figura 2C mostra a estrutura de S0D/HSV1 gG1 M-D. A Figura 2D mostra a estrutura de SOD/HSV1gG1 P-D.

As Figuras 3A-3H representam vários antigénios gG2. A Figura 3A mostra a molécula precursora de gG2 a partir da qual derivam os antigénios gG2. A Figura 3B mostra a estrutura de HSV2gG2M-D. A Figura 3C mostra a estrutura de SOD/HSV2gG2M-D. A Figura 3D mostra a estrutura de S0D/HSV2gG2R-D. A Figura 3E mostra a estrutura de SOD/HSV2gG2-Nterm. A Figura 3F mostra a estrutura de SOD/HSV2gG2-Cterm. A Figura 3G mostra a estrutura de SOD/gG2M393-D649. A Figura 3H mostra a estrutura de S0D/gG2A489-D649. A Figura 4 representa a sequência de aminoácidos de um péptido de gB1 específico do tipo para utilização nos presentes métodos de ensaio.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 7

Descrição detalhada da invenção A prática da presente invenção irá empregar, a menos que indicado de outro modo, métodos convencionais de virologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de ADN recombinante dentro da perícia na arte. Estas técnicas estão completamente explicadas na literatura. Veja-se e.g., Sambrook, et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1 989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&ll (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins eds., 1984); Animal Ce/I Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Fundamental Viro/ogy, 2a Edição, vol. I&ll (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.).

Quando utilizadas nesta descrição e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique ciaramente o contrário.

Adicionalmente, as sequências de aminoácidos dos vários polipéptidos de HSV aqui descritos estão numerados com referência à molécula precursora de comprimento completo, incluindo a sequência de sinal, a menos que especificado de outra forma. L Definições

Na descrição da presente invenção serão empregues os termos seguintes, que se pretendem definidos como indicado abaixo.

Um "antigénio de HSV específico do tipo" significa um polipéptido derivado quer de HSV-1, quer de HSV-2, que contém um ou mais epítopos que reagem predominantemente com anticorpos contra um de HSV-1 e HSV-2, mas não com ambos de HSV-1 e HSV-2. Os antigénios de HSV específicos do tipo representativos incluem polipéptidos de glicoproteína C de HSV-1 e de HSV-2 ("gC1" e "gC2") e seus epítopos peptídicos específicos do tipo; polipéptidos de glicoproteína G de HSV-1 e HSV-2 ("gG1" e "gG2"), e seus epítopos peptídicos específicos do tipo, tais como os aminoácidos 111-116 de gG1 e os aminoácidos 357-364, 553-572, 573-580 e 601-608 de gG2, epítopos peptídicos específicos do tipo de glicoproteína B de HSV-1 e de HSV-2 ("gB1" e "gB2"), tais como os aminoácidos 18-228 de gB2 (veja-se Goade et ai,

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 8

Abstracts of the 34,h Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 4-7 Outubro de 1994, Resumo H6) e epítopos específicos do tipo encontrados dentro dos aminoácidos 1-50 de gB1, numerados com referência à molécula madura (aminoácidos 31-80, numerados com referência ao precursor), tais como os aminoácidos 1-46 e 1-47 de gb1, numerados com referência à molécula madura (aminoácidos 31-76 e 31-77, respectivamente, numerados com referência à molécula precursora) (veja-se, Pereira et ai, Virology (1989) 172:1 1-24; e os exemplos adiante); e epítopos peptídicos específicos do tipo, de glicoproteína D de HSV-1 e de HSV-2 ("gD1" e "gD2").

Um "antigénio de HSV comum aos tipos" significa um polipéptido derivado quer de HSV-1, quer de HSV-2, que contém um ou mais epítopos que reagem com anticorpos gerados contra ambos de HSV-1 ou HSV-2. Os antigénios de HSV comuns aos tipos representativos incluem polipéptidos de gB1, gB2, gD1, gD2, proteína virai 16 ("VP16") e seus epítopos comuns aos tipos, tais como os que se encontram dentro dos aminoácidos 228-903 de gB2 (veja-se Goade et al., Abstracts of the 34,h interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 4-7 de Outubro de 1994, Resumo H6). 0 termo "polipéptido", quando utilizado com referência a gB, gD, gG, VP16, etc., refere-se a um polipéptido de gB, gD, gG, VP16, etc., seja nativo, recombinante ou sintético, derivado de qualquer uma das várias estirpes de HSV-1 ou HSV-2. Assim, o termo inclui polipéptidos de qualquer uma das várias proteínas de HSV, incluindo glicoproteínas, proteínas do tegumento, etc. "Glicoproteína" significa um polipéptido, seja nativo, recombinante ou sintético, derivado de um dos que se encontram na membrana de HSV, tais como gB, gD, gG, etc. A descrição que se segue em função de polipéptidos aplica-se também, de igual modo, a glicoproteínas. O polipéptido não precisa incluir a sequência de aminoácidos de comprimento completo da molécula de referência, mas pode incluir apenas a parte da molécula necessária para que o polipéptido funcione para a utilização a que se destina. Assim, se o polipéptido é utilizado como um antigénio "específico do tipo", apenas é necessário que estejam presentes um ou mais epítopos específicos do tipo, da molécula. Se o polipéptido é utilizado como um antigénio "comum aos tipos", estarão presentes um ou mais epítopos da 9 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ molécula de referência, que reagem com anticorpos contra ambos de HSV-1 e HSV-2.

Assim, o polipéptido pode compreender a sequência de comprimento completo, fragmentos, sequências truncadas e parciais, bem como formas análogas e precursoras da molécula de referência. O termo inclui portanto deleções, adições e substituições na sequência, desde que o polipéptido funcione conforme se pretende. Neste sentido, substituições particularmente preferidas serão, de um modo geral, de natureza conservativa, i.e., as substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados quanto às suas cadeias laterais. Especificamente, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares, não carregados - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. A fenilalanina, o triptofano e a tirosina são por vezes classificadas como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina, de um aspartato por um glutamato, de uma treonina por uma serina, ou uma substituição conservativa semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito importante sobre a actividade biológica. As proteínas com substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo poucas substituições de aminoácidos que não afectem substancialmente as capacidades de ligação a anticorpos da proteína, estão portanto na definição do polipéptido de referência.

Deleções particularmente preferidas dos polipéptidos de referência incluem a deleção de todo ou parte do domínio transmembranar e do domínio citopiasmático presentes na molécula de referência. Estas deleções permitem a secreção aumentada e portanto recuperação aumentada das moléculas, quando produzidas de forma recombinante, enquanto mantendo ainda reactividade com anticorpos para HSV-1 e/ou para HSV-2. A localização de um domínio transmembranar numa dada proteína pode ser determinada utilizando um programa de computador que formule uma escala hidropática a partir da sequência de aminoácidos da proteína, utilizando as propriedades hidrófilas e hidrófobas de cada um dos 20 aminoácidos, conforme descrito em, e.g., Kyte

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 10 et ai., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132; e Hopp e Woods, Proc. NatL Acad. Sei. USA (1981) 28:3824-3828. "Polipéptido de gB" significa um polipéptido como definido acima, que é derivado de gB1 ou gB2. O ADN e as sequências de aminoácidos correspondentes para gB1 e gB2 são conhecidos e estão relatados em e.g., Patente dos EUA No. 5 244 792; e Stuve et ai, J. Viro/. (1 987) 6J_:326-335. A proteína precursora de gB1, de comprimento completo, inclui cerca de 904 aminoácidos, dos quais de cerca do 1 ao 30 compreendem a primeira região hidrófoba que inclui a sequência de sinal; do 31 a cerca do 726 compreendem uma região de polaridade variável; os aminoácidos 727 a cerca de 795 compreendem a segunda região hidrófoba que inclui a âncora transmembranar; e os aminoácidos 796 a cerca de 904 constituem a segunda região de polaridade variável que inclui o domínio citoplasmático. De modo semelhante, a proteína gB2 de comprimento completo tem cerca de 904 aminoácidos de comprimento. Os primeiros 22 aminoácidos constituem uma sequência de sinal e a proteína madura, não glicosilada, após clivagem desta sequência, tem um peso molecular previsto de cerca de 98 kD. Os aminoácidos 23 a cerca de 723 constituem a primeira região de polaridade variável; os aminoácidos 724 a cerca de 798 compreendem o domínio transmembranar; e os aminoácidos 799 a cerca de 904 constituem a segunda região de polaridade variável que inclui o domínio citoplasmático.

Os derivados truncados de gB, representativos, a que faltam todos ou uma porção do domínio transmembranar e do domínio citoplasmático, estão descritos nos exemplos que se seguem, bem como na Patente dos EUA No. 5 244 792 (veja-se, e.g., a descrição do plasmídeo pHS114 (No. de acesso no ATCC 39651), que contém um gene de gB1 a que faltam 580 pb na extremidade 3' do gene e que codifica uma proteína a que faltam os 194 aminoácidos do terminal carboxilo; e do plasmídeo pHS210, que inclui um gene de gB2 a que faltam 637 pb na extremidade 3'). A Patente dos EUA No. 5 171 568 descreve o plasmídeo pHS127A (No de acesso no ATCC 39652), com um fragmento de 1187 pares de bases do gene de gB1. Qualquer destes derivados, bem como outros, que sejam reactivos com anticorpos de HSV, serão úteis nos presentes métodos.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 1 1 "Polipéptido de gD" significa um polipéptido tal como definido acima, que é derivado de gD1 ou gD2. O ADN e as sequências de aminoácidos correspondentes para gD1 e gD2 são conhecidas. Veja-se e.g., Patente dos EUA No. 4 818 694; Lasky e Dowbenko, DNA (1984) 3:23-29. As proteínas gD1 e gD2 partilham cerca de 86% de homologia total. As gD1 e gD2 de comprimento total incluem cerca de 393 aminoácidos com domínios transmembranares nos resíduos 333-362 e domínios citoplasmáticos que se prolongam até aos terminais carboxi no resíduo 393. As proteínas gD1 e gD2 têm sequências de sinal nas posições 1 a 25.

Os derivados truncados de gD representativos, a que faltam todos ou uma porção dos domínios transmembranar e citoplasmático, foram descritos na Patente dos EUA No. 5 171 568 (veja-se, e.g., a descrição dos plasmídeos pHS211 e pHS213, incluindo os genes de gD2 que codificam os primeiros 305 aminoácidos e os primeiros 352 aminoácidos, respectivamente, de gD2; e a descrição do plasmídeo pHS132, incluindo um gene de gD1 que codifica 315 aminoácidos de gD 1); Lasky et a/., Bio/Technology (Junho de 1984) (que descrevem o gene de gD1 truncado que codifica para um polipéptido de gD1 possuindo os primeiros 300 resíduos de aminoácido). Foram também construídos vários polipéptidos de gD a faltavam toda ou parte das sequências de sinal, como descrito na Patente dos EUA No. 4 618 578 (veja-se, e.g., a descrição dos plasmídeos pYHS116 e pYHS117, que incluem uma deleção em 5' de 600 pb, que inclui a deleção da região que codifica a sequência de sinal de gD1; o plasmídeo pYHS118, que inclui a deleção de 600 pb anterior, bem como uma deleção de 1300 pb na extremidade 3' da região de codificação que inclui a maior parte da sequência âncora de gD1; o plasmídeo pYHS119 que inclui a deleção de 600 pb na extremidade 5' e uma deleção de 2400 pb na extremidade 3' que inclui a deleção de toda a região âncora à membrana e cerca de 700 pb a montante da sequência âncora de gD1). Quaisquer destes derivados, bem como outros, que são reactivos com anticorpos para HSV, serão úteis nos presentes métodos. "Polipéptido de gD" significa um polipéptido tal como acima definido, que é derivado de gG1 ou gG2. O ADN e as sequências de aminoácidos correspondentes para gG1 e gG2 são conhecidas. Veja-se, e.g., McGeoch et al., J. Mol. BioL (1985) 181:1-13; McGeoch et al., J. Gen. Viroi. (1987) 68:19-38. A estrutura do gene de gG1 está representada na Figura 2A. O gene de

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 12 gG1 codifica uma glicoproteína possuindo 238 aminoácidos, com uma sequência de sinal prevista de 21 aminoácidos, uma primeira região de polaridade variável (também designada um domínio extracelular) de 167 aminoácidos com 3 potenciais locais de glicosilação ligada a N e sem resíduos cisteína, um domínio transmembranar hidrófobo de 24 aminoácidos e um domínio citoplasmático no terminal C de 24 aminoácidos. Esta proteína partilha uma homologia muito limitada com a proteína gG2. A estrutura do gene de gG2 está representada na Figura 3A. A glicoproteína gG2 inclui 699 aminoácidos, tem uma sequência de sinal de 21 aminoácidos, uma primeira região de polaridade variável de 626 aminoácidos com 4 potenciais locais de glicosilação ligada a N e 6 resíduos cisteína, um domínio de ligação transmembranar de 25 aminoácidos e um domínio citoplasmático no terminal C de 24 aminoácidos. A localização de três pequenas regiões de homologia limitada entre gG1 e gG2, que podem servir como epítopos comuns aos tipos, úteis, é a seguinte: 82 91 80% de homologia

HSV-1 EEEEGAGDGE

HSV-2 EEFEGAGDGL 562 571 136 156 62% de homologia

HSV-1 PARPETSRPKTPPTSIIGPLA

HSV-2 PARPGAIRPTLPPG ILGPLA 594 613 171 189 89% de homologia

HSV-1 PTPQHTPLFSFLTASPALD HSV-2 PTPQHIPLFWFLTASPALD 632 650 São aqui descritos vários derivados truncados de ambos os genes de gG1 e de gG2, a que faltam porções nos terminais C, incluindo o domínio de ligação transmembranar, bem como proteínas truncadas no terminal N (vejam-se as Figuras 2, 3 e 4). Estes derivados serão úteis nos presentes métodos.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 13 "Polipéptido de VP16" significa um polipéptido tal como definido acima, que é derivado de VP16 de HSV-1 ou HSV-2. A VP16 é uma proteína do tegumento virai, localizada entre a cápside e o envelope do vírus, e é também conhecida por ICP25, VmW65 e o factor de indução a-trans (aTIF). O ADN e as sequências de aminoácidos de VP16 de HSV-1 foram relatadas. Veja-se e.g., Campbell et al., J. Mol. Biol. (1984) 180:1; e Triezenberg et a/., Genes and Develop. (1988) 2:718. De modo semelhante, O ADN e as sequências de aminoácidos correspondentes de VP16 de HSV-2, são conhecidas. Veja-se, e.g., a publicação do Pedido Internacional No. WO 92/02251, publicado em 20 de Fevereiro de 1992. As VP16 de HSV-1 e de HSV-2 incluem 489 aminoácidos. As duas proteínas partilham aproximadamente 85% de homologia. É aqui descrito um derivado truncado de VP16, incluindo os aminoácidos 1-416. Este, bem como outros polipéptidos de VP16, que são reactivos com anticorpos para HSV, serão úteis nos presentes métodos. "Epítopo" significa um local num antigénio ao qual respondem células B e células T específicas. O termo é também utilizado indiferentemente em relação a "determinante antigénico" ou a "local determinante antigénico". Um epítopo pode compreender 3 ou mais aminoácidos numa conformação espacial única para o epítopo. De um modo geral, um epítopo consiste em pelo menos 5 destes aminoácidos e, mais vulgarmente, consiste em pelo menos 8-10 destes aminoácidos. Os métodos para a determinação da conformação espacial de aminoácidos são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Adicionalmente, a identificação de epítopos numa dada proteína é prontamente conseguida utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Veja-se, e.g., Geysen et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81:3998-4002 (método geral para a síntese rápida de péptidos para determinar a localização de epítopos imunogénicos num dado antigénio); Patente dos EUA No. 4 708 871 (procedimentos para identificação e síntese química de epítopos de antigénios); e Geysen et ai., Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (técnica para identificação de péptidos com alta afinidade para um dado anticorpo). Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados num imunoensaio simples que mostre a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigénio alvo. 14 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Um polipéptido ou uma proteína "purificada" é uma proteína que é produzida de forma sintética ou recombinante, tal que a quantidade de proteína presente numa composição seja substancialmente maior do que a presente numa preparação virai em bruto. Em geral, uma proteína purificada será >50% homogénea e mais preferivelmente > homogénea.

Tal como aqui se utiliza, uma "amostra biológica", refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolada de um indivíduo, incluindo mas não se lhes limitando, por exemplo, sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, bílis, fluido espinal, fluido linfático, amostras da pele, excreções externas da pele, dos tractos respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, glóbulos vermelhos, órgãos, biópsias e também amostras de constituintes de culturas de células in vitro incluindo, mas não se lhes limitando, meios condicionados resultantes do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, e.g. células recombinantes e componentes celulares.

Tal como aqui se utilizam, os termos "marcador" e "marcador detectável", referem-se a uma molécula capaz de ser detectada, incluindo, mas não se lhes limitando, isótopos radioactivos, fluorescentes, quimioluminescentes, enzimas, substratos de enzimas, cofactores de enzimas, inibidores de enzimas, cromóforos, corantes, iões metálicos, sóis metálicos, ligandos (e.g., biotina ou haptenos) e semelhantes. O termo "fluorescente" refere-se a uma substância ou uma sua porção, que seja capaz se exibir fluorescência na gama detectável. Os exemplos particulares de marcadores que podem ser utilizados na invenção incluem fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, Vermelho do Texas, luminol, NADPH e a-b-galactosidase. II. Modos de realização da invenção A presente invenção baseia-se na determinação de novos métodos de diagnóstico para a detecção precisa de infecção por HSV e para a discriminação entre a infecção por HSV-1 e por HSV-2. Os métodos utilizam antigénios específicos dos tipos e comuns aos tipos, reduzindo desse modo a incidência de falsos resultados. Os métodos podem ser postos em prática num formato de ensaio simples, de um só passo, que permite tanto a detecção de infecção como a identificação do tipo de infecção presente, num único ensaio. 15 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Mais particularmente, a presença de um antigénio comum aos tipos permite o diagnóstico de infecção por HSV em geral. A presença do antigénio específico do tipo permite a determinação do tipo do vírus, i.e., se a infecção é provocada por HSV-1 e/ou por HSV-2. Devido à presença do antigénio comum aos tipos, ocorrerão resultados positivos mesmo em amostras não tipificáveis. Portanto, a incidência de falsos negativos é reduzida.

Os antigénios para utilização nas presentes técnicas de diagnóstico podem ser produzidos utilizando várias técnicas. Por exemplo, os antigénios podem ser gerados utilizando métodos recombinantes, bem conhecidos na arte. Assim, podem ser concebidas sondas oligonucleotídicas com base nas sequências conhecidas do genoma de HSV e utilizadas para sondar bibliotecas de ADNc ou ADN genómico quanto a genes de HSV que codificam para os antigénios úteis na presente invenção. Os genes podem então ser adicionalmente isolados utilizando técnicas Standard e, se necessário, podem-se empregar enzimas de restrição para truncar o gene nas porções desejadas da sequência de comprimento completo.

De modo semelhante, os genes de HSV podem ser isolados directamente a partir de células e tecidos contendo os mesmos, utilizando técnicas como a extracção com fenol, e a sequência pode ser ainda manipulada para produzir as porções truncadas desejadas. Veja-se, e.g., Sambrook et al., supra, para a descrição de técnicas utilizadas para obter e isolar ADN. Finalmente, os genes que codificam os antigénios de HSV podem ser produzidos sinteticamente, com base nas sequências conhecidas. A sequência de nucleótidos pode ser desenhada com os códãos apropriados para a sequência de aminoácidos particular desejada. Em geral, seleccionar-se-ão os códãos preferidos para o hospedeiro pretendido em que a sequência será expressa. A sequência completa é geralmente montada a partir de oligonucleótidos sobreponíveis preparados por métodos Standard e montados formando uma sequência de codificação completa. Veja-se e.g., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et ai, (1984) Science 223:1299: Jay et ai, (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Uma vez isoladas ou sintetizadas as sequências de codificação para as proteínas desejadas, estas podem ser clonadas em qualquer vector ou replicão adequados para expressão numa variedade de sistemas, incluindo sistemas de expressão de insecto, de mamífero, bacterianos, virais e de leveduras, todos 16 Τ'**'*·' 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ bem conhecidos na arte. Por exemplo, os sistemas de expressão em células de insecto, tais como sistemas de baculovírus, são bem conhecidos dos peritos na arte e estão descritos em, e.g., Summers e Smith, Texas Agricultura! Experiment Station Bu/fetin No. 1555 (1987). Os materiais e os métodos para sistemas de expressão em baculovírus/ células de insecto estão comercialmente disponíveis na forma de estojos de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (estojo "MaxBac"). De modo semelhante, os sistemas de expressão em células bacterianas e de mamífero são bem conhecidos na arte e estão descritos em, e.g., Sambrook et ai. Supra. Os sistemas de expressão em leveduras também são conhecidos na arte e encontram-se descritos em, e.g., Yeast Genetic Engineering (Barr et ai., eds., 1989) Butterworths, London.

Sistemas virais, tais como um sistema de infecção/transfecção baseado em vacinia, como descrito em Tomei et ai., J. Viro/. (1993) 67:4017-4026 e Selby et a!., J. Gen. Viro/. (1993) 74:1 103-1 1 13, encontrarão também uso na presente invenção. Neste sistema, as células são primeiro transfectadas in vitro com um vírus da vacinia recombinante que codifica a ARN-polimerase do bacteriófago T7. Esta polimerase apresenta especificidade sensível na medida em que apenas transcreve moldes portadores de promotores de T7. Após a infecção, as células são transfectadas com o ADN de interesse, levado por um promotor de T7. A polimerase expressa no citoplasma a partir do vírus da vacinia recombinante transcreve o ADN transfectado para ARN que é depois traduzido em proteína pela maquinaria de tradução do hospedeiro. O método proporciona uma produção citoplasmática de alto nível, transiente, de grandes quantidades de ARN e seu(s) produto(s) de tradução.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionados, os antigénios da presente invenção são produzidos através do crescimento das células hospedeiras transformadas com um vector de expressão sob condições nas quais o antigénio de interesse é expresso. O antigénio é então isolado das células hospedeiras e purificado. Se o sistema de expressão proporciona a secreção do antigénio, o antigénio pode ser purificado directamente a partir dos meios. Se o antigénio não for excretado, é isolado a partir de lísados celulares. A selecção das condições de crescimento apropriadas e dos métodos de recuperação estão ao alcance dos peritos na arte. 17 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Os antigénios de HSV podem também ser produzidos por síntese química tal como por síntese de péptidos em solução ou em fase sólida, utilizando métodos conhecidos pelos peritos na arte. A síntese química de péptidos pode ser preferível se o antigénio em questão for relativamente pequeno. Veja-se, e.g., J.M. Stewart e J.D. Young, So/id Phase Peptide Synthesis, 2a edição, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) e G. Barany e R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross e J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York (1980), páginas 3-254, para técnicas de síntese de péptidos em fase sólida; e M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) e E. Gross e J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol.1, para a síntese clássica em solução.

Os antigénios de HSV específicos dos tipos e comuns aos tipos são aqui utilizados como diagnóstico para detectar a presença de anticorpos reactivos do vírus numa amostra biológica. Por exemplo, a presença de anticorpos reactivos com os antigénios de HSV pode ser detectada utilizando técnicas Standard electroforéticas e de imunodiagnóstico, incluindo imunoensaios tais como ensaios de competição, de reacção directa ou tipo sanduíche. Estes ensaios incluem, mas não se lhes limitam, Western Blot; testes de aglutinação; imunoensaios mediados por, e marcados com enzimas, tais como ELISA; ensaios do tipo biotina/avidina; radioimunoensaios; imunoelectroforese; imunoprecipitação, etc. As reacções geraimente incluem revelação de marcadores tais como marcadores fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivos, enzimáticos ou moléculas corantes, ou outros métodos para a detecção da formação de um complexo entre o antigénio e o anticorpo ou os anticorpos que com eles reagem.

Os ensaios acima mencionados envolvem geralmente a separação de anticorpo não ligado numa fase líquida a partir de um suporte em fase sólida ao qual estão ligados os complexos antigénio-anticorpo. Os suportes sólidos que podem ser utilizados na prática da invenção incluem substratos tais como nitrocelulose {e.g., na forma de membrana ou poço de microtítulo); poli(cloreto de vinilo) (e.g., folhas ou poços de microtítulo); látex de poliestireno (e.g., contas ou placas de microtítulo); poli(fluoreto de vinilidino); papel diazotizado; membranas de nylon; contas activadas, contas magneticamente responsivas, e semelhantes. 18 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Tipicamente, faz-se primeiro reagir um suporte sólido com um componente da fase sólida (e.g., um ou mais antigénios específicos dos tipos e um ou mais antigénios comuns aos tipos) sob condições de ligação adequadas de modo a que o componente seja suficientemente imobilizado no suporte. Por vezes, a imobilização do antigénio no suporte pode ser aumentada acoplando primeiro o antigénio a uma proteína com melhores propriedades de ligação. As proteínas de acoplamento adequadas incluem, mas não lhes estão limitadas, macromoléculas tais como albuminas séricas incluindo albumina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa do género Fissurella, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina e outras proteínas bem conhecidas dos peritos na arte. Outras moléculas que se podem utilizar para ligar os antigénios ao suporte incluem polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, e semelhantes. Estas moléculas e os métodos de acoplamento destas moléculas aos antigénios são bem conhecidos dos peritos na arte. Veja-se, e.g., Brinkley, M.A., Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et a/., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; e Anjaneyulu e Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1 987) 30:11 7-124.

Após reacção do suporte sólido com o componente da fase sólida, removem-se quaisquer componentes da fase sólida não imobilizados do suporte por lavagem, e colocou-se então o componente ligado ao suporte em contacto com uma amostra biológica que se suspeite conter porções de ligando (e.g., anticorpos para os antigénios imobilizados) sob condições de ligação adequadas. Após lavagem para remover qualquer ligando não ligado, adiciona-se uma porção ligante secundária sob condições de ligação adequadas, em que o ligante secundário é capaz de se associar selectivamente com o ligando ligado. A presença do ligante secundário pode então ser detectada utilizando técnicas bem conhecidas na arte.

Mais particuiarmente, pode-se utilizar um método ELISA, em que os poços de um placa de microtítulo estão revestidos com antigénio específico dos tipos ou antigénio comum aos tipos. Uma amostra biológica contendo ou que se suspeite conter moléculas de imunoglobulina anti-HSV é então adicionada aos poços revestidos. Em ensaios em que se deseje utilizar uma placa de microtítulo, podem-se revestir um número seleccionado de poços com uma primeira porção de antigénio específico para os tipos, revestir um conjunto diferente de poços com uma segunda porção de antigénio específico para os

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 19 tipos e um terceiro conjunto de poços com uma porção de antigénio comum aos tipos. Em alternativa, podem-se realizar uma série de ELISA seguidos, em que são utilizadas placas individuais para cada porção de antigénio específico dos tipos e comum aos tipos. Após um período de incubação suficiente para permitir a ligação do anticorpo aos antigénios imobilizados, a(s) placa(s) podem ser lavadas para remover porções não ligadas e pode ser adicionada uma molécula de ligação secundária marcada de forma detectável. Deixa-se a molécula de ligação secundária reagir com quaisquer anticorpos da amostra capturados, lava-se a placa e detecta-se a presença da molécula de ligação secundária utilizando métodos bem conhecidos na arte.

Assim, numa concretização particular, a presença de ligandos antigénicos específicos dos tipos ou comuns aos tipos, numa amostra biológica, pode ser prontamente detectada utilizando um ligante secundário compreendendo um anticorpo dirigido contra os ligandos do anticorpo. Conhecem-se na arte várias moléculas de imunoglobulina (Ig) anti-humanas (e.g., Ig anti-humana de cabra ou Ig anti-humana de coelho, comercialmente disponíveis) que podem ser facilmente conjugadas com um marcador enzimático detectável, tal como peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou urease, utilizando métodos conhecidos dos peritos na arte. É então utilizado um substrato da enzima apropriado para gerar um sinal detectável. Em outras concretizações relacionadas, podem-se utilizar técnicas de ELISA do tipo competitivo, utilizando métodos conhecidos dos peritos na arte.

Podem também ser conduzidos ensaios em solução, tais que as proteínas virais e anticorpos específicos para essas proteínas virais formem complexos sob condições de precipitação. Numa concretização particular, podem-se fixar os antigénios específicos dos tipos e/ou comuns aos tipos, a uma partícula de fase sólida {e.g., uma conta de agarose ou semelhante) utilizando técnicas de acoplamento conhecidas na arte, tais como acoplamento químico directo ou indirecto. A partícula revestida com antigénio é então colocada em contacto, sob condições de ligação apropriadas, com uma amostra biológica que se suspeite conter anticorpos para o antigénio de HSV específico dos tipos e/ou comum aos tipos. A ligação cruzada entre anticorpos ligados causa a formação de agregados de complexos partícula-antigénio-anticorpo que podem ser precipitados e separados da amostra utilizando lavagem e/ou centrifugação. A mistura reaccional pode ser analisada para determinar a presença ou ausência

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 20 de complexos anticorpo-antigénio utilizando qualquer número de métodos Standard, tais como os métodos de imunodiagnóstico acima descritos.

Em ainda outra concretização, pode-se proporcionar uma matriz de imunoafinidade, em que uma população policlonal de anticorpos de uma amostra biológica que se suspeite conter moléculas anti-específicas dos tipos e/ou comuns aos tipos é imobilizada num substrato. Assim, uma purificação inicial por afinidade da amostra pode ser realizada utilizando os antigénios imobilizados. A preparação da amostra resultante conterá portanto apenas porções anti-HSV, evitando potenciais propriedades de ligação não específica no suporte de afinidade. São conhecidos na arte vários métodos para a imobilização de imunoglobulinas (quer intactas quer fragmentos específicos) com alto rendimento e boa retenção de actividade de ligação ao antigénio. Não ficando limitados a qualquer método em particular, podem-se utilizar proteína A ou proteína G imobilizadas para imobilizar imunoglobulinas.

Assim, uma vez imobilizadas as moléculas de imunoglobulina para proporcionar uma matriz de afinidade, os antigénios específicos dos tipos e comuns aos tipos, cada um com marcadores separados e distintos, são colocados em contacto com os anticorpos ligados, sob condições de ligação adequadas. Após remoção de quaisquer antigénios ligados de forma não específica por lavagem do suporte de imunoafinidade, a presença de antigénio ligado pode ser determinada por ensaios para cada marcador específico utilizando métodos conhecidos na arte.

Um método particularmente preferido para o diagnóstico de infecção por HSV utilizando a presente invenção envolve a utilização de técnicas de ensaio de immunoblot em tiras (SIA), tais como as conhecidas na arte, que combinam técnicas tradicionais de Western Blot e Dot Βίοι, e.g., o teste RIBA® (Chiron Corp., Emeryville, CA). Nestes ensaios, imobilizam-se um ou mais antigénios específicos dos tipos e um ou mais antigénios comuns aos tipos, na forma de bandas individuais e discretas sobre uma tira de teste de suporte membranoso. A visualização de reactividade anti-HSV na amostra biológica é conseguida utilizando conjugados de enzima e IgG anti-humana em conjunção com um substrato colorimétrico da enzima. Podem também estar presentes na tira controlos internos, tais como IgM anti-humana e IgG humana. O ensaio pode ser realizado manualmente ou num formato automático.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 21

Os reagentes do ensaio acima descrito, incluindo os antigénios específicos dos tipos e comuns aos tipos, podem ser proporcionados em estojos, com instruções adequadas e outros reagentes necessários, de modo a conduzir os imunoensaios como descrito acima. O estojo pode também conter, dependendo do imunoensaio particular utilizado, marcadores adequados e outros reagentes e materiais embalados [i.e. tampões de lavagem e semelhantes). Os imunoensaios Standard tais como os descritos acima, podem ser conduzidos utilizando estes estojos. iii. Experimental

Seguem-se exemplos de concretizações específicas para a realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos para fins de ilustração apenas, e não se pretende com eles limitar de nenhum modo o âmbito da presente invenção.

Foram feitos esforços para assegurar a precisão relativamente aos números utilizados [e.g., quantidades, temperaturas, etc.), mas deve ser evidentemente considerado algum erro e desvio experimentais.

Exemplo 1

Produção de polipéptidos de qG1 recombinantes para utilização em ensaios de

diagnóstico de HSV a. S0D/HSV1 qG1 M-D.

Utilizaram-se dois oligonucleótidos, 5'AGG AAC CAT GGC AAT GTC GCC GGG CGC CAT GCT GGC CGT TGT T3' E 5'TCC CGT CGA CTA CTA GTC CAG GGC GGG GGA GGC AGT GAG GAA CGA3', para iniciar a síntese por PCR de um fragmento de ADN que codifica para uma região do terminal amino de 190 aminoácidos (MetrAsp190) de gG1 de HSV-1, estirpe Patton (Kudler et a/., Virology (1983) 124:86-99). (Veja-se a Figura 2B). Este polipéptido corresponde a MevAsp,^ da glicoproteína gG1 previamente reportada por McGeoch et ai, para Flsv-1, estirpe 17 (McGeoch et ai, J. Moi Biol. (1985) 181:1-13). A discrepância de um aminoácido deve-se ao facto de que o ADN utilizado como molde nas experiências de PCR (plasmídeo pSVgGI) foi derivado de um isolado de HSV-1 que codifica para um ácido glutâmico adicional no trecho de aminoácidos Glu79-Glu85 correspondentes de gG1 de HSV-1, estirpe 1 7.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 22 Ο fragmento de ADN sintetizado por PCR continha um local de restrição para Nco\ e um códão ATG na extremidade 5', e dois códãos de terminação e o local de restrição para SalI na extremidade 3'. Estas modificações foram introduzidas para facilitar a clonagem da proteína virai. O ADN foi digerido com Nco\ISal\ e o fragmento de 583 pb foi clonado num vector bacteriano derivado de pSOD/HIV2PR113 (Pichuantes et ai, J. Biol. Chem. (1990) 265:13890-13898) para gerar o plasmídeo pSODgGI. Este plasmídeo de expressão bacteriano codifica para S0D/HSV1 gG1 M-D, uma proteína híbrida possuindo uma massa molecular de 35,7 kD e consistindo em superóxido-dismutase (SOD) humana e a sequência de aminoácidos de gG1 de HSV-1 acima mencionada (Figura 2C).

b. SOD/HSV1 gG1 P-D

Este antigénio recombinante de 33,2 kD é semelhante ao antigénio SOD/HSV1 gG1 M-D descrito acima, excepto quanto à sequência de sinal que não foi incluída (Figura 2D). c. Expressão de antiqénios de qGI em leveduras

Para a expressão das proteínas recombinantes acima descritas em leveduras, realizaram-se as seguintes manipulações: a inserção StuUSaft de 833 pb do plasmídeo pSI1/PR179 que codifica para a protease de HSV-1 (Pichuantes et al., Proteins Struct. Funct. Genet. (1989) 6:324-337) foi substituída pelo fragmento Stu\/SaJ\ de 918 pb isolado de pSODgGI para gerar o vector plasmídeo "vaivém" pSI/gG 1. A cassete Bam\-\\/Sal\ de 2408 pb contendo a sequência promotor ADH2/GAPDH-SOD/HSV1 gG1 foi removida de pSI/gG 1 e clonada no vector de leveduras pBS24.1 (Pichuantes et ai, em "Protein Engineering: A Guide to Design and Production", Capítulo 6, J.L. Cleland e C. Craik, eds., John Wiley & Sons, New York, NY, no prelo). O plasmídeo pSODHSVI gG1 M-D resultante contém 2m sequências para replicação autónoma em leveduras, o promotor híbrido ADH2/GAPDH, o terminador de factor a para assegurar a terminação da transcrição e os genes de levedura Ieu2-d e URA3 para selecção. A origem de replicação Co/E1 e o gene da b-lactamase necessários para a replicação do plasmídeo e para a selecção em bactérias estão também presentes neste plasmídeo recombinante. Seguiu-se um procedimento semelhante para o plasmídeo que codifica SOD/HSV1 gG1 P-D.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 23 Células de S. cerevisiae JSC310 [ΜΑΤ a, Ieu2, ura3-52, prb1-T122, pep4-3, prcl-407, ::DM15 (pGAP/ADR1 ::G418r), (cir°)] foram transformadas com o plasmídeo pSODHSVI gG1 M-D e, após o esgotamento da glucose no meio para leveduras (Pichuantes et ai., J. Biol. Chem. (1990) 265:13890-13898 e Franzusoff et a/., J. Biol. Chem. (1995) 270:3154-3159), expressaram uma proteína de fusão de 35,7 kD que consiste em SOD (153 aminoácidos), um ligante de 2 aminoácidos (Met-Ala) e um polipéptido de gG1 de HSV-1 de 190 aminoácidos (Figura 2C). Verificou-se a sequência de nucleótidos por sequenciação de ADN da região codificante de SOD/HSV1gG1 de pSOD-HSV1gG1 M/D.

As proteínas recombinantes eram expressas em níveis elevados na levedura, tal como detectado por coloração com azul de Coomassie e análise de immunoblot utilizando anticorpos monoclonais para SOD e soros positivos para HSV-1. A proteína foi purificada como se segue. Lisaram-se as células de levedura transformadas e centrifugou-se o lisado a 10 000 rpm durante 1 hora. Diluiu-se o sobrenadante 1:10 em MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico) 50 mM, pH 5,2 e correu-se numa coluna de S-Sepharose. Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de NaCI de 0 a 1 M, reuniu-se o pico da proteína e concentrou-se e purificou-se adicionalmente utilizando filtração em gel Sephacryl S-200 HR. Reuniu-se o pico da proteína, concentrou-se e armazenou-se para utilização posterior. d. gGlt

Fez-se um derivado truncado adicional de gG1, denominado gG1t, que incluía os aminoácidos 1 a 189, incluindo a sequência de sinal e todo o domínio extracelular de gG1, como se segue. Clonou-se o gene que codifica gG1t a partir do fragmento H fcoRI de HSV-1 (estirpe Patton) por PCR, utilizando os seguintes iniciadores:

Extremidade 5' Pst\ Met

5' AGT ACC GGA TCC CTG CAG ATG TCG CAG GGC GCC ATG

CGT G

Extremidade 3' BamHl terminação epítopo GIu

5' TTA TCA GGA TCC CTA TTC CAT TGG CAT GTA TTC GTC CAG GGC GGG GGA GGC AGT. 24 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ A proteína gG1t foi expressa utilizando um sistema de células de insecto como se segue.

Digeriu-se o fragmento de PCR com Pst\ e BamH\, inseriu-se no plasmídeo de expressão de baculovírus pAcC13 (Munemitsu et a!., Mol. Cell. BioL (1990) 10:5977-5982) e sequenciou-se na sua totalidade utilizando o método de terminação da cadeia com didesoxi. Este fragmento continha 567 pares de bases nucleotídicas a 5' do início da tradução e a região que codifica os aminoácidos 1 a 189, incluindo a sequência de sinal e todo o domínio extracelular. Na extremidade 3' do fragmento, o iniciador também codificava uma marca de epítopo glu de 6 aminoácidos (5' TTC CAT TGG CAT GTA TTC 3'). Esta marca facilita a identificação, a quantificação e a purificação de quaisquer proteínas suas portadoras através da utilização de um anticorpo correspondente que reconheça especificamente o epítopo glu. A sequência de ADN que codifica gG1t foi recombinada no baculovírus Autographa ca/ifornica (AcNPV) através do vector de transferência pAcC13 (Munemitsu et ai, Mol. Cell. BioL (1990) 1_0:5977-5982) por co-transfecção de 2 mg do ADN do vector de transferência pAc-gG1t ou pAc-gG2t com 0,5 mg de ADN virai do tipo selvagem linearizado, para células SF9 como descrito (Kitts et ai, Nuc. Acids Res. (1990) 18:5667-5672). Isolaram-se os baculovírus recombinantes por purificação de placas (Smith et a/., Mol. Cell. BioL (1983) 3:2156-2165). Recolheram-se os sobrenadantes das culturas em suspensão de 1,5 x 106 células SF9 recombinantes infectadas com AcNPV por ml, 48 horas após a infecção, em balões de Erlenmeyer de vidro de 11, agitando a 120 rpm com o baculovírus relevante a uma moi de 2-10, em meio isento de soro (Maiorella et al., Biotech. (1988) 6:1406-1410). Centrifugou-se o meio durante 10 minutos, 400-600 xg a 4°C, filtrou-se por 0,8 mm, concentrou-se e armazenou-se a -80°C antes da purificação. 0 polipéptido de gG1 foi imunopurificado por adição do detergente não iónico NP-40 ao sobrenadante concentrado descongelado até uma concentração final de 0,2%. Incubou-se o sobrenadante à temperatura ambiente durante 15 minutos, centrifugou-se a 9000 rpm durante 10 minutos e aplicou-se sobre uma coluna de afinidade preparada por acoplamento de anticorpo monoclonal anti-glu a proteína G-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Eluiu-se a proteína

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 25 ligada com péptido-gly em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e concentrou-se.

Avaliou-se a proteína purificada utilizando SDS-PAGE. A mobilidade da banda de gG1t correspondia à de uma proteína de massa molecular de 35 kD. Digeriu-se a proteína purificada com N-glicanase para remover todas as cadeias de hidrato de carbono ligadas a N. Submeteu-se a proteína a análise de aminoácidos. A composição em aminoácidos prevista de gGlt concordou muito bem com a que foi medida. A sequenciação dos aminoácidos do terminal N foi realizada na proteína utilizando degradação de Edman. A proteína gG1t começava em Val22, tal como previsto pela análise da sequência, afirmando que a proteína tinha uma sequência de sinal de 21 aminoácidos. A identidade da proteína foi também confirmada por análise Western Blot. Uma única banda com mobilidade correspondente á da proteína corada com azul de Coomassie era reactiva com um anticorpo monoclonal anti-glu e uma IgG anti-ratinho de cabra conjugada com fosfatase alcalina.

Exemplo 2

Produção de polipéptidos de qG2 recombinantes para utilização nos ensaios de

diagnóstico de HSV a. qG2t

Clonou-se um derivado truncado do gene que codifica gG2 (gG2t) a partir do fragmento L Hind\\\ de HSV-2 (estirpe 333) por PCR utilizando os seguintes iniciadores:

Extremidade 5' Pst\ Met

5' AGT ACC GGA TCC CTG CAG ATG CAC GCC ATC GCT CCC AGG

Extremidade 3' BamH\ term. epítopo Glu

5' TTA TC A GGA TCC CTA TTC CAT TGG CAT GTA TTC ATC TAG AGC AGG GGA GGC CG

Digeriu-se o fragmento de PCR com PstI e BamH\, inseriu-se no plasmídeo de expressão de baculovírus pAcC13 e sequenciou-se na sua totalidade utilizando o método de terminação da cadeia com didesoxi. Este 26 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ fragmento continha 1953 pares de bases nucleotídicas a 5' do início da tradução e a região de codificação dos aminoácidos 1 a 651 incluindo a sequência de sinal e todo o domínio extracelular. Na extremidade 3' do fragmento, o iniciador também codificava a marca do epítopo gly de 6 aminoácidos (5' TTC CAT TGG CAT GTA TTC 3'), acima descrita. A sequência de ADN que codifica gG2t foi recombinada no baculovírus Autographa ca/ifornica (AcNPV) através do vector de transferência pAcC13 (Munemitsu et al., Mol. Cell. Biol. (1990) 1_0:5977-5982), como descrito em relação ao gG1t acima.

Avaliou-se a proteína purificada utilizando SDS-PAGE. A mobilidade da banda de gG2t correspondia à de uma proteína de massa molecular de 90 kD. Digeriu-se a proteína purificada com N-glicanase para remover todas as cadeias de hidrato de carbono ligadas a N. Submeteu-se a proteína a análise de aminoácidos. A composição de gG2t não concordava com a calculada a partir da sequência.

Para determinar a fonte da discordância, realizou-se a sequenciação dos aminoácidos do terminal N utilizando degradação de Edman. A proteína gG2t começava com a sequência Ala-Leu-Thr, correspondendo ao aminoácido Ala·^ no meio do domínio extracelular. Assim, a proteína gG2 expressa em células de insecto infectadas com baculovírus é clivada como tinha sido previamente descrito para a proteína gG2 virai e para a proteína gG2 expressa na ausência de outras proteínas virais em células de mamífero. A proteína parece ser clivada entre Met344 e Ala345. A identidade da proteína gG2t foi confirmada por análise Western Blot. Uma única banda com mobilidade correspondente à da proteína corada com azul de Coomassíe era reactiva com um anticorpo monoclonal anti-gG2 e com um anticorpo anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano. b. SOD/HSV2qG2Arq21 -Arq342 (região do terminal N) e SOD/HSV2qG2Leu343-Asp649 (região do terminal C).

Uma vez que, como acima explicado, se verificou que a proteína gG2 produzida de forma recombinante é clivada intracelularmente por uma protease entre os aminoácidos 344 e 345, as proteínas gG2 foram produzidas na forma

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 27 de dois fragmentos, consistindo em fusões de SOD com Gly22-Arg342 e Leu343-Asp649, respectivamente, de modo a conseguir níveis elevados de expressão.

Fizeram-se duas construções para expressar a porção do terminal amino (Figura 3E) e a porção do terminal carboxi (Figura 3F) da molécula. As construções dos terminais N e C de gG2 foram expressas em células de insecto como se segue. A estratégia para a subclonagem das sequências que codificam o terminal C de gG2 de HSV-2 envolvia a produção de um produto de PCR de 174 pb para clonagem entre locais Psfl e Nco\ únicos do plasmídeo, pAcgG2L, um vector de transferência de baculovírus para gG2 de comprimento completo. O 5-amplímero principal, 5'd-AACTGCAGAAATGCTGGGGCCCTGCATGCTGC TGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCTCCCTGGGCATCGCCTTG ACCGAGGACGCGTCCTCCGAT-3', foi desenhado para conter um local de restrição para Pst\ complementar ao local de clonagem no vector pAcgG2L, seguido por um local de início eucariota de consenso e dos 21 códãos da sequência de sinal da fosfatase alcalina de placenta humana com uma lie na posição de aminoácido 1 para a correcta clivagem do péptido, seguida por 9 códãos do terminal C de gG2 (Ala345-Asp35J. O amplímero a jusante, 5'd-AGGGCGCCATGGCGGTGGCCGACA-3', foi sintetizado para conter um local de reconhecimento de Nco\ adjacente à sequência de quatro códãos de gG2 directamente a montante. O local para Nco\ facilita a inserção do produto de PCR no lugar da sequência de 1,1 kb que codifica o terminal N de gG2 removido durante a digestão e a purificação do vector, pAcgG2L com Pst\ e Nco\. As reacções PCR Standard foram realizadas com polimerase vent (New England Biolabs, Beverly, MA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os produtos amplificados foram purificados em gel utilizando Geneclean (RPI, Mount Prospect, IL) e digeridos exaustivamente com Pst\ e Nco\ e ligados a um corte de pACgG2L com Pst\INco\. A origem e a fidelidade do produto da PCR clonado no vector foram verificadas pela sequenciação directa do iniciador 5'D-GATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3' e pela sequenciação inversa do iniciador 5'd-CATCTCGTCGGGGGGAGTAGT-3' que flanqueiam os únicos locais de clonagem Pst\ e Nco\, respectivamente, no vector de transferência de baculovírus. O vector de transferência modificado contendo a sequência de comando de fosfatase alcalina e a gG2 truncada no terminal N, foi designado por pAcapgG2L.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 28 A sequência que codifica ο terminal C de gG2 foi recombinada no baculovírus Autographa californica (AcMNPV) através do vector de transferência pAcapgG2L, (vector progenitor pAcC13, Munemitsu et a!., Mol. Cell. Biol. (1990) 1_0:5977-5982) por co-transfecção de células de insecto Sf9 com 2 mg de ADN plasmídico com 0,5 mg de ADN virai do tipo selvagem, linearizado, como descrito (Kitts et a!., Nuc. Acids Res. (1990) 1 8:5667-5672). 0 baculovírus recombinante foi isolado por purificação de placas (Smith et a!., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165). Infectaram-se culturas em suspensão, em fase log, de 1,5x10e6 células Sf9 por ml, com baculovírus, a uma moi de 2-10, para produção de proteína recombinante em meios ISFM7 (Maiorella et a!., Biotech. (1986) 6:1406-1410). Recolheram-se os sobrenadantes isentos de soro para purificação da proteína, aproximadamente 48 horas após a infecção.

As proteínas gG2 N- e C-terminais foram também expressas nas estirpes de leveduras AB122, JSC310 e AD1. Detectou-se um elevado nível de expressão da proteína SOD/HSV2gG2Arg21-Arg342 por coloração com azul de Coomassie nas fracções insolúveis das leveduras. A proteína tinha aparentemente um peso molecular de «55 kD (o peso molecular traduzido é de 50,9). A expressão nas estirpes de levedura ABI 22 e JSC310 era mais elevada do que na estirpe AD1. A proteína imunorreagiu com anticorpos anti-HSV-2. A SOD/HSV2gG2Leu343-Asp649 não foi detectada nas fracções insolúveis de AB122, JSC310 ou AD1. Experiências adicionais (coloração com azul de Coomassie e análise de immunob/ot) indicaram que a proteína foi encontrada na fracção solúvel de células de Ab122 e JSC310. A proteína tinha um peso molecular aparente de «80 kD (o peso molecular traduzido é de 46,3 kD). A expressão em leveduras de SOD/HSV2gG2-Nterminal e SOD/HSV2gG2-Cterminal, tal como detectada em lisados totais de células provenientes de 5 colónias independentes (C1 a C5), foi como se segue. As proteínas coradas com azul de Coomassie mostraram que o antigénio N-terminal (peso molecular previsto = 50,9) foi expresso em níveis elevados em todas as culturas (C1 a C5). Esta proteína reagia com Mab para hSOD e exibia uma reactividade fraca com anticorpos presentes num soro positivo para HSV-2. O antigénio C-terminal (peso molecular previsto = 46,3) não foi detectado por coloração com azul de Coomassie. Detectou-se uma banda de uma proteína

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 29 com um peso molecular aparente «80 kD por Western Blot. Esta proteína reagia fortemente com os soros positivos para HSV-2.

De modo a mais bem caracterizar as proteínas recombinantes expressas nas células, prepararam-se fracções totais, solúveis e insolúveis de cada clone C3. Os resultados indicaram que o antigénio N-terminal se encontrava principalmente na fracção insolúvel (tal como esperado para uma proteína hSOD/env). O antigénio C-terminal não foi detectado por coloração com azul de Coomassie mas foi claramente identificado através da sua reactividade com MAB para hSOD e com os soros positivos para HSV-2. Surpreendentemente, para uma proteína hSOD/env, o antigénio foi detectado em ambas as fracções, solúvel e insolúvel (maior reactividade na fracção solúvel). A banda da proteína de «30 kD também foi detectada nos immunoblot. c. SOD/qG2M393-D649

Construiu-se um produto de ADN por PCR que codifica para um polipéptido do terminal C de HSV2gG2 mais pequeno que consistia em fusões de SOD com Met3g3-Asp649 de gG2. (Veja-se Figura 3G). d. SOD/aG2A489-D649

Construiu-se um produto de ADN por PCR que codifica para um polipéptido do terminal C de HSV2gG2 mais pequeno que consistia em fusões de SOD com Ala489-Asp649 de gG2. (Veja-se Figura 3H).

Exemplo 3

Produção de VP16 de HSV truncada para utilização em ensaios de diagnóstico

de HSV

Expressou-se um polipéptido de VP16 de HSV truncado num sistema de baculovírus, como se segue. Clonou-se um derivado truncado de VP16 da estirpe G de HSV-2, VP1 6-2t, que codifica os aminoácidos 1-416 com a marca de epítopo-glu de seis aminoácidos no terminal C, através de amplificação por PCR do plasmídeo pSVVP-2 (adiante descrito) utilizando os seguintes iniciadores:

Extremidade 5' Bg/\ Met VP16

5' ACA GAT CTT ATG GAC CTG TTG GTC GAC

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 30

Extremidade 3' EcoRI term. epítopo Glu 5' AG AAT TCA CTA TTC CAT TGG CAT VP16

GTA TTC GGT GGA CAG TCT GCG 0 fragmento de PCR de 1,38 kb foi digerido com BglI e EcoRI, inserido no plasmídeo de expressão de baculovírus pAcC13 (Munemitsu et a!., Mol. Cell. Biol. (1990) 10:5977-5982) e sequenciado na sua totalidade utilizando o método de terminação de cadeias com didesoxi. 0 novo plasmídeo foi designado por pAcVP16T. A sequência de ADN que codifica VP16-2t foi recombinada no baculovírus Autographa californica (AcNPV) como descrito em relação ao gG1t acima. 0 plasmídeo pSVVP-2 foi obtido por isolamento do fragmento EcoR\-BamY\\ de «2,0 kb que codifica VP16-2 a partir de pHS226 (Publicação do Pedido Internacional No. WO 92/02251; No. de acesso no ATCC 68372) e inserção em pSV7d que tinha sido previamente digerido com EcoRI e BamH\. O pHS226 foi gerado a partir de pUC18 no qual foi clonado um fragmento de extremidades lisas Xho\-Sph\ que codifica VP1 6-2 obtido a partir de pH2G512, clonado no local Sma\ de pUC18. O polipéptido de VP16 truncado foi imunopurificado como se segue. Extractou-se VP16-2t a partir da pelete da cultura de células de baculovírus com um tampão que consiste em Tris-HCI 20 mM, pH 8,2, EGTA 1 mM, MgCI2 1 mM, beta-mercaptoetanol 4 mM, aprotinina a 1 mg/ml, NP-40 a 0,2% e um cocktail anti-proteínase consistindo em pepstatina, leupeptina, E-64, pefabloc SC, EDTA e EGTA. Clarificou-se o extracto por centrifugação e purificou-se a VP16 sobre uma coluna de Proteína G-Sepharose Fast Flow anti-glu (Pharmacia) eluída com péptido-glu em PBS. A proteína purificada foi caracterizada por SDS-PAGE. A mobilidade da banda de VP1 6 correspondia à de uma proteína de massa molecular de 65 kD para a VP16 de comprimento completo e de 45 kD para a forma truncada de VP16. A identidade da proteína foi confirmada por Western Blot utilizando 31 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ anticorpo monoclonal anti-glu e LP1, um anticorpo monoclonal para o terminal N de VP1 6.

Exemplo 4

Produção de polipéptido qD recombinante para utilização em ensaios de

diagnóstico de HSV

Clonou-se um fragmento do gene de gD2, codificando os aminoácidos 1-302 do domínio extracelular, no vector de expressão de mamífero pSV7d, para gerar pHS2l3 conforme previamente descrito (Patente dos EUA No. 5 171 568). Transfectou-se o plasmídeo para células CHO e as linhas de células estáveis que expressavam a proteína derivada de gD2 truncada foram seleccionadas e depois amplificadas por exposições em série a concentrações crescentes de metotrexato. A proteína truncada foi purificada a partir dos meios utilizando técnicas Standard. Em particular, concentraram-se meios condicionados, os meios concentrados foram precipitados com ácido e utilizaram-se uma série de colunas, incluindo uma coluna de Sepharose-heparina, Butilo 650M e Q-Sepharose Fast Flow. Concentrou-se o produto, diafiltrou-se e armazenou-se até posterior utilização.

Exemplo 5

Produção de qB recombinante para utilização em ensaios de diagnóstico de HSV

a. qB de HSV

Os polipéptidos de gB de comprimento completo, bem como fragmentos de gB que contêm deleções dos domínios citoplasmático e transmembranar, para utilização nos presentes ensaios de diagnóstico, são produzidos de forma recombinante utilizando os métodos descritos na Patente dos EUA Nos. 5 171 568 e 5 244 792; Pachl et ai, J. Viro/. (1987) 61:315-325.

b. Derivados truncados de gB de HSV

Foram construídos vários derivados truncados de gB de HSV, a que faltam todos ou uma porção dos domínios transmembranar e citoplasmático, como descrito nas Patentes dos EUA Nos. 5 171 568 e 5 244 792. Em particular, o plasmídeo pHS114 (No. de acesso no ATCC 39651), que contêm um gene de gB a faltam 580 pb na extremidade 3' do gene e codificam uma proteína a que faltam os 194 aminoácidos do terminal carboxilo. O plasmídeo pHS210 foi também feito, o qual inclui um gene de gB2 a que faltam 637 pb na

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ extremidade 3'). Foi também construído o plasmídeo pHS127A (No. de acesso no ATCC 39652), possuindo um fragmento do gene de gB1 de 1187 pares de bases.

c. HSVaB2dTM O plasmídeo pPRgBdTM, um vector de expressão para um antigénio de gB2, contém um derivado de deleção do gene de gB sob o controlo do promotor precoce de SV40. 0 derivado do gene de gB codifica um polipéptido de 808 aminoácidos de comprimento a que falta uma região definida pelos aminoácidos Ala703 a Leu776, que inclui a região transmembranar (TM). A construção inclui os aminoácidos Gln777 até ao terminal C.

Este derivado foi construído para melhorar a eficiência da secreção da proteína gB2 em relação à gB2 truncada utilizada anteriormente, em que tanto o domínio transmembranar como a região do terminal C foram eliminados. Ambos os derivados da proteína contêm substancialmente todo o domínio extracelular da proteína gB. 0 polipéptido de gB2 codificado pela construção, gB2dTM, tem dois novos aminoácidos, Gly702 e Thr703, que foram inseridos em resultado da clonagem e a introdução de um local Kpn\ na fusão entre os domínios extracelular e citoplasmático. O plasmídeo pPRgBdTM contém também a origem de replicação de SV40, o local de adição poliA de SV40 e o ADNc da di-hidrofolato-redutase sob o controlo do promotor tardio principal de adenovírus (Ad-dhfr). A construção de todos os plasmídeos é descrita em detalhe adiante.

d. Construção do plasmídeo pPRgBdTM O esquema utilizado para construir o pPRgBdTM é o seguinte. A sequência do gene derivado de gB2dTM foi obtida na forma de um fragmento EcoR\-BamH\ de 2,57 kpb a partir do plasmídeo pHS214-A. O fragmento foi incubado com o fragmento de Klenow de ADN-polimerase I para reparar os locais fcoRI e BamVW formando extremidades lisas e depois ligou-se ao vector de expressão em células de mamífero pPR25 que tinha sido previamente cortado com SalI e repararam-se as extremidades tornando-as lisas com fragmento de Klenow de ADN-polimerase I seguida de tratamento com fosfatase alcalina.

85 856

EP 0 842 430/PT 33 A construção do plasmídeo pHS214-A foi como se segue. A sequência de gB2 de HSV-2 completa está contida num fragmento de Nru\ a BamH\ de 3467 pb no plasmídeo pHS208 (descrito na Patente dos EUA No. 5 171 568). O gene derivado de gB2, gB2dTM a que faltam os aminoácidos Asp701 a Gln776 do domínio transmembranar, foi montado a partir de três fragmentos: (1)A extremidade 5' do gene de gB2 que contém a sequência de sinal de 22 aminoácidos · e 604 aminoácidos do domínio extracelular, Ala., a Ala604, bem como todas as sequências do vector pSV7d (descrito na Patente dos EUA No. 5 171 568) incluindo o promotor de SV40, o local de poliadenilação de SV40 e as sequências necessárias para a replicação em bactérias, foram obtidas na forma de um fragmento Xho\ a BamH\ de 4360 pb do plasmídeo pHS214; (2) O restante do domínio extracelular de gB2 de Leu605 a Asp701 foi obtido a partir do plasmídeo pHS208 na forma de um fragmento de PCR de 294 pb com o iniciador A contendo o local Xho\ natural complementar aos nucleótidosl 870 a 1980 (considerando o ATG inicial do gene de gB como nucleótido 1) e o iniciador B complementar aos nucleótidos 2158 a 2169 e contendo um local Kpn\ introduzido. Este fragmento foi digerido com as enzimas de restrição Xho\ e Kpn\ e isolado por electroforese em gel de agarose; e (3) A extremidade 3' do gene de gB2, compreendendo o domínio citoplasmático contendo os aminoácidos Gln776 até ao códão de terminação na posição de aminoácido 883, foi preparado a partir do plasmídeo pHS208 na forma de um fragmento Kpn\ a BamHI de 321 pb utilizando na PCR os iniciadores C, complementares aos nucleótidos 2395 a 2407 contendo o local Kpn\ manipulado e o iniciador D complementar aos nucleótidos 2698 a 2715 contendo o códão de terminação e o local BamH\. Este fragmento foi digerido com as enzimas de restrição Kpn\ e BamH\ e isolado por electroforese em gel. Estes três fragmentos, 1, 2 e 3, foram ligados uns aos outros para gerar o plasmídeo pHS214-A contendo o gene de gB2dTM derivado no vector de expressão pSV7d. O plasmídeo pPR25 é um vector de expressão em células de mamífero contendo o ADNc da di-hidrofolato-redutase (dhfr) sob o controlo do promotor tardio principal do adenovírus-2 (Ad-2 MLP), ADN de Sv40 que codifica o intrão do antigénio T pequeno e sequências de poliadenilação. Para a construção do pPR25 foi necessária a digestão do plasmídeo pPR21 com S?t/I e a inserção de um fragmento Nru\-EcoH\ de 3388 pb do vector de expressão pAD-dhfr. O plasmídeo pPR21 era derivado de pSV7d por inserção de um 85-mero sintético,

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 34 contendo ο promotor bla e os locais de restrição para Stu\ e Xho\, no local de Ssp\ no poliligante. O esquema utilizado para construir o PHS214 foi o seguinte. O derivado truncado do gene de gB2 foi obtido na forma de dois fragmentos que foram ligados um ao outro no vector de expressão. A extremidade 3' da sequência de codificação foi obtida a partir de PHS208 que foi digerido com Tth\\\ e isolou-se um fragmento de 1660 pb. As extremidades do fragmento foram preenchidas com fragmento de Klenow de ADN-polimerase I, o ADN foi digerido com Sph\ e isolou-se um fragmento Spftl(Tthlll) de 477 contendo sequências de codificação para os aminoácidos 560-718 de gB2. A extremidade 5' do gene de gB2 truncado foi obtida a partir de pHS210 (descrito na Patente dos EUA No. 5 244 792), um plasmídeo que contém um fragmento Hind\\\-Pvu\\ de 1,90 kpb que codifica 591 aminoácidos da proteína gB2. A região de codificação de gB2 no pHS210 está truncada num local PvuW, 110 aminoácidos no terminal N relativamente à sequência de âncora à membrana proposta. O pHS210 foi digerido com Hind\\\, as extremidades do fragmento foram preenchidas com o fragmento de Klenow de ADN-polimerase I e o ADN foi digerido com Sph\. Isolou-se um fragmento (Hind\\\)-Sph\ de 1735 pb.

Os dois fragmentos do gene de gB2 isolados acima foram ligados um ao outro, as extremidades do fragmento foram preenchidas com o fragmento de Klenow de ADN-polimerase I e foram inseridos no pSV7d, previamente digerido com Xga\ e reparado formando extremidades lisas com o fragmento de Klenow de ADN-polimerase I, para gerar o pHS214. e. Expressão de qB2dTM em células de mamífero

Transfectou-se o plasmídeo pPRgGBdTM tanto para células COS como para células dhfrCHO. A expressão da proteína gB2 no meio de cultura foi confirmada por um ELISA, conforme descrito por Stuve et al., J. Viro/. (1987) 61:326-335. Seleccionou-se uma linha de células CHO que expressa a gB2dTM excretada para produção industrial em grande escala. Para isto, transfectaram-se células CHO a que faltava a di-hidrofolato-redutase endógena (gene que codifica a enzima dhfr), com um vector plasmídico de ADN contendo genes tanto para dhfr como para um derivado de gB2 de HSV, gB2dTM.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 35

Cresceram-se as células transfectadas em meio de cultura selectivo de modo a que apenas as células que expressavam dhfr pudessem crescer. O nível de produção de gB por estas células foi aumentado através de um processo de cultura por passos em meio selectivo contendo uma concentração crescente da droga metotrexato (MTX), um inibidor não competitivo de dhfr. As células adquiriram a capacidade de crescer na presença de MTX amplificando o número de cópias do gene de dhfr, Alt et a!., J. Biol. Chem. (1978) 235:1 357-1370; Kaufman et al., Mol. Cellular Biol. (1981) V.1069-1076. Um segundo gene, gB2, que foi directamente ligado ao ADN de dhfr foi também co-amplificado, Kaufman, R.J., et al., J. Mol. Biol. 159:601-621. Este processo implicava a exposição de células numa população em bruto a meio selectivo com MTX, a selecção de 50-400 clones únicos de colónias discretas, a expansão do número de células da colónia através de passagens em série em placas de 96 poços, depois de 24 poços e 6 poços, com avaliação simultânea da produtividade em gB utilizando um ensaio ELISA para medir a quantidade de gB excretada para o meio de cultura. Este processo foi interrompido quando deixaram de se observar ganhos de produtividade.

Exemplo 6

Identificação de epítopos de qB2 específicos dos tipos e comuns aos tipos Testaram-se proteínas recombinantes que representavam três segmentos diferentes de gB2, quanto a reactividades com anticorpos IgG humanos. As construções abrangiam a proteína próxima de amino (gB2 SS2) incluindo os aminoácidos 18 a 228 de gB2, a porção intermédia (gB2 AP2) incluindo os aminoácidos 154 a 503 de gB2, e a porção próxima de carboxi (gB2 SS1) incluindo os aminoácidos 228 a 903 de gB2. Estas proteínas recombinantes foram utilizadas como antigénios alvos em ensaios de immunob/ot de Western.

Avaliaram-se amostras de soro de 45 indivíduos com serótipos conhecidos de HSV por testes de gG específica dos tipos de HSV. A gB2 SS2 foi fortemente reactiva com 15 de 15 amostras de soro de indivíduos HSV 2 + /1-. Em contraste, 0 de 1 5 amostras de soro HSV 1 +12-, e 0 de 15 amostras de soro HSV 1-/2- foram reactivas. Foi observada reactividade de GB2 AP2 em 5 de 15 amostras de soro HSV 2 + /1-, 0 de 15 amostras de soro HSV λ+12- e 0 de 15 HSV 1-/2-. Finalmente, observou-se reactividade de gB2 SS1 em 1 5 de 1 5 amostras de soro HSV 2 + /1-, 15 de 15 amostras de soro HSV 1 + /2- e 0 de 1 5 HSV 1 -/2-.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Assim, a gB2 de HSV inclui um epítopo na região próxima de amino que reage com anticorpos para HSV-2, e um epítopo na região próxima de carboxi que reage com ambos os anticorpos, para HSV-1 e HSV-2. Estes epítopos podem ser utilizados como antigénios específico do tipo e comum aos tipos, respectivamente, nos presentes ensaios.

Exemplo 7 Síntese de um péptido de qB1 específico do tipo para utilização em ensaios de

diagnóstico de HSV

Um péptido de gB1 específico do tipo, incluindo os amínoácidos 1-47 de gB1, numerado com referência à molécula madura (amínoácidos 31-77, numerados com referência à molécula precursora), representada na Figura 4, foi sintetizado num sintetizador de péptidos ABI 433A (Foster City, CA) utilizando uma escala Standard de 0,25 mM e protocolos, produtos químicos e reagentes Standard para ABI FastMoc, como descrito em Carpino e Han, J. Amer. Chem. Soc. (1970) 92:5748-5749; Carpino e Han, J. Org. Chem. (1972) 37:3404-3409; e Chang e Meienhofer, J. Peptide Protein Res. (1978) 11:246-249. Adicionou-se um resíduo cisteína ao terminal N para facilitar a conjugação a BSA (veja-se adiante) e adicionou-se um resíduo norleucina ao terminal C para auxiliar na determinação da quantidade de péptido conjugado a BSA.

Após a síntese, o péptido foi clivado da resina de suporte como descrito em King et a/., Int. J. Peptide Prot. Res.) e Lundt et al., Int. J. Peptide Prot. Res., (1978). O péptido foi purificado como descrito em Burke et a!., J. Liq. Chromatogr. (1988) 1J_:1229; e Hodges et al., "A Novel Approach to the Purification of Peptides by Reverse-Phase HPLC: Sample Displacement Chromatography", em Peptides: Chemistry and Biology - Proceedings of the Tenth American Peptide Symposium, Marshal, Ed., Escom Science Pubiishers, Leiden, The Netherlands (1988), p.226. Em resumo, a HPLC de fase inversa foi realizada utilizando uma resina C18 e um gradiente a 45° com 5-50% de acetonitrilo sobre 5 volumes de coluna. Utilizou-se TFA a 0,1 % como agente de emparelhamento de iões. 0 eluente da coluna foi fraccionado.

Realizou-se HPLC analítica às fracções a testar quanto a pureza como descrito em King et al., e Lundt et ai., supra. Utilizou-se uma coluna de fase inversa C18 de escala analítica, com um gradiente de acetonitrilo de 5-50% e TEAP a 0,1% como agente de emparelhamento de iões. Reuniram-se as

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 37 fracções com pureza superior a 90%. O conjunto reunido final de péptido purificado era 95% puro.

Após a síntese, o péptido foi conjugado a BSA (monomérica, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, número de catálogo A-1900). A conjugação química foi realizada com Sulfo-SMCC (Pierce, Rockford, IL), utilizando técnicas Standard. Veja-se Brinkley, Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et a!., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; e Anjaneyulu e Staros, International Journal of Peptide and Protein Research (1987) 30:117-1 24.

Obteve-se uma razão molar de 4,52 de péptidos de gB1 para uma BSA, tal como confirmado por técnicas Standard de análise de aminoácidos testando a presença de norleucina.

Após o acoplamento, removeu-se o péptido de gB1 não ligado da mistura por diafiltração com uma célula de fluxos Amicon utilizando uma membrana com um peso molecular de exclusão nominal de 30 000. A remoção do péptido livre foi medida por HPLC de fase inversa com uma coluna de escala analítica. Correu-se um gradiente de 5-50% de acetonitrilo com TEAP a 0,1% como agente de emparelhamento de iões. Comparou-se a área de péptido livre com a área de péptido conjugado.

Exemplo 8

Ensaios de diagnóstico de HSV utilizando qlicoproteínas de HSV específicas dos tipos e comuns aos tipos a. Ensaio de immunoblot em tiras (SIA)

Aplicaram-se proteínas gG1 e gG2 expressas por baculovírus, acima descritas, em bandas estreitas discretas de tiras de nitrocelulose em concentrações de 4 mg/ml para a gG1 e 0,25 mg/ml para a gG2, como antigénios específicos dos tipos. A proteína gD2 descrita no Exemplo 4, uma proteína comum aos tipos com 86% de identidade entre os homólogos HSV-1 e HSV-2, foi aplicada, na forma de uma outra banda discreta, numa concentração de 1 mg/ml, sobre as mesmas tiras de nitrocelulose. Como controlos internos, bandas adicionais continham IgG humana purificada numa concentração baixa (185 ng/ml) e elevada (925 ng/ml) e IgM anti-humana (1 mg/ml). 38 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

Para ο ensaio de immunoblot, processaram-se as tiras de forma descontínua com 30 tiras por lote. Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente. Cada tira foi numerada e colocada num tubo separado ao qual se adicionou 1 ml de diluente (PBS com estabilizantes de proteína bovina e detergentes, azida de sódio a 0,1 % e sulfato de gentamicina a 0,05% como conservantes) e 20 ml de uma amostra de soro. Rodaram-se os tubos suavemente durante 4 h, removeu-se a solução por aspiração, e adicionou-se 1 ml de diluente fresco a cada tubo. Rodaram-se os tubos durante 30 min. removeu-se a solução por aspiração e adicionou-se a cada tubo 1 ml de tampão de lavagem feito a partir de concentrado de tampão de lavagem (50x) (solução detergente tamponada com fosfato com 0,01% de timerosal como conservante). Esvaziaram-se os tubos para um único vaso de lavagem e lavaram-se as tiras rodando-as durante 20 segundos. Decantou-se o tampão de lavagem e adicionaram-se 30 ml de tampão fresco e repetiu-se o processo. Removeu-se a solução residual por aspiração e adicionaram-se 20 ml de solução de conjugado (IgG de cabra anti-humana marcada com peroxidase (cadeias leve e pesada)), com estabilizantes de proteína bovina, contendo timerosal a 0,01% como conservante). Rodou-se o vaso a 110 rpm durante 10 min., decantou-se a solução de conjugado e repetiu-se o passo de lavagem três vezes. Removeu-se novamente a solução residual por aspiração e adicionaram-se 20 ml de substrato/revelador (4-cloro-1-naftol em metanol/peróxido de hidrogénio tamponado com fosfato), seguindo-se rotação durante 15-20 min. a 110 rpm. Decantou-se a solução e lavaram-se as tiras duas vezes em água destilada. Colocaram-se as tiras reveladas voltadas para cima sobre tolhas de papel e deixaram-se secar durante 30 min. no escuro. Leram-se então as tiras ao fim de 3 horas de secagem. Atribuíram-se valores à intensidade da cor das bandas de antigénio de HSV que variavam de - (0) a 4 +, utilizando o seguinte algoritmo. À banda de IgG de baixa concentração é atribuído um valor de 1 + , à banda de IgG de concentração elevada é atribuído um valor de 3 + . As bandas de gG1, gG2 e gD são então classificadas de 0 a 4+ de acordo com a sua intensidade em comparação com a das bandas de controlo de IgG. b. SIA de amostras de soro aleatórias e comparação de resultados com os obtidos por ensaio Western Blot

Um conjunto de 738 amostras de soro escolhidas aleatoriamente, obtidas como amostras de rastreio de indivíduos voluntários para estudos de vacinas de HSV, foi analisado quanto ao estado do soro relativamente ao HSV utilizando o 39 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ ensaio Si A acima descrito. As amostras com qualquer das três bandas de antigénio de HSV classificadas com >1 + foram consideradas positivas. As amostras representativas que apresentam as várias classes de estados de soro estão mostradas na Figura 1. O estado do soro relativamente a HSV de cada uma das amostras foi também determinado separadamente por ensaio Western Blot de acordo com os procedimentos publicados. Ashley et a/., J. Clin. Micro. (1988) 26:662-667.

Mostra-se na Tabela 1 uma comparação dos resultados do ensaio de ímmunoblot com o diagnóstico obtido a partir do ensaio Western Blot. Dos 327 soros considerados como sendo seropositivos somente para HSV-1 no ensaio Western Blot, 286, ou 87%, foram diagnosticados no Ímmunoblot. As 51 amostras que deram resultados discordantes nos dois ensaios foram distribuídas em várias categorias de diagnóstico; 13 foram designadas HSV1+2 + , e 3 foram designadas como somente HSV2 + . Dos 120 soros que eram HSV1 +2 + no ensaio Western Blot, 100 (83,3%) foram também detectados pelo ensaio de ímmunoblot e 20 determinaram-se ser apenas HSV2 + . Um total de 55 amostras (12,3% do total de 447 amostras que são HSV1 + ou HSV1 +2+ no ensaio Western Blot) não tinham anticorpo igG 1 detectável. Destas, 26 tinham anticorpo gD2 apenas e foram designadas como positivas não tipificáveis, 9 foram designadas como duplamente seronegativas e 20 foram diagnosticadas como somente HSV2+. Houve uma concordância excelente entre os dois ensaios para soros designados como somente HSV2+ no ensaio Western Blot, 115 das 116 (99,1%) foram diagnosticadas de modo semelhante pelo ensaio de Ímmunoblot. Do mesmo modo, 174 soros foram designados como duplamente seronegativos no ensaio de Ímmunoblot, correspondendo a 98,9% dos 176 soros assim designados no ensaio Western Blot. (Segue Tabela 1)

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 40 TABELA 1 Resultados de SIA de HSV-1 e HSV-2 comparados com 738 amostras de soro caracterizadas por Western Blot SIA: Positivo Positivo para Positivo Positivo não Negativo para Western: para HSV-1 HSV-1 &2 para HSV-2 tipificável HSV-1 &2 Positivo para 286 _2 _3 26 _9 HSV-1 327 327 327 327 327 (87,5%) (0,6%) (0,9%) (8,0%) (2,7%) Positivo para 0 100 2~Õ _0 0 HSV-1 &2 120 120 (83,3%) 120 (16,7%) 120 120 Positivo para 0 _0 115 j. _0 HSV-2 116 116 116 (99,1%) 116 (0,8%) 116 Negativo para 0 _0 _0 2. 174 HSV-1 &2 176 176 176 176 (1,1%) 176 (98,9%) c. SIA de amostras de soro aleatórias e comparação de resultados com os obtidos por ensaio Western B/ot utilizando um péptido de qB1 específico para o tipo

Aplicaram-se em tiras de nitrocelulose, como descrito no Exemplo 8a, gG1 e gG2 específicas dos tipos produzidas em levedura e descritas nos Exemplos 1 a e 2b (região do terminal C), respectivamente, e a proteína gD2 comum aos tipos descrita no Exemplo 4. Adicionalmente, o péptido sintético de gB1 específico do tipo-BSA, descrito no Exemplo 7, foi aplicado na forma de uma banda estreita discreta em tiras de nitrocelulose numa concentração de 1 mg/ml. Como controlos internos, bandas adicionais continham IgG humana purificada em concentração baixa (185ng/ml) e elevada (925 ng/ml) e IgM anti-humana (1 mg/ml).

Pesquisaram-se 737 soros de adultos saudáveis de 18-50 anos, seleccionados aleatoriamente, utilizando este SIA para determinar o estado do soro quanto ao HSV (Tabela 2). Destes, 176 (23,9%) não tinham anticorpo para HSV, 419 (56,8%) eram seropositivos para HSV-1, 243 (33,0%) eram seropositivos para HSV-2 e um subconjunto de 122 eram duplamente seropositivos, para HSV-1 e para HSV-2. Um adicional de 21 apenas tinham anticorpo para gD2 e portanto foram designados como seropositivos para HSV, não tipificáveis. Quando estes diagnósticos se compararam com os que foram

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 41 determinados pelo ensaio Western B/ot (WB), o SIA identificou correctamente 92,4% de amostras positivas para HSV-1, 99,6% de positivas para HSV-2 e 97,1 % de negativas para HSV. O péptido de gB1 diagnosticou 264 (88,9%) de um total de 297 soros designados por SIA como seropositivos somente para HSV-1 em comparação com a proteína gG1 que diagnosticou 260/297 (87,5%) (Tabela 3). Assim, o péptido de gB1 foi um bom antigénio para este fim tal como a proteína gG1. Dos 122 soros designados como HSV-1 "/HSV-2* por SIA, o péptido de gB1 detectou 101/122 ou 82,8% em comparação com 108/122 (88,5%) detectados pela proteína gG1. Dos 419 soros diagnosticados como HSV-1+/2 + por SIA, 414 estavam de acordo com o diagnóstico por Western Blot. 0 péptido de gB1 diagnóstico 3 soros como HSV-1 "/2" que eram apenas HSV-2" por análise Western Blot (correspondente a 3 falsos positivos para HSV-1). A proteína gG1 diagnosticou 1 soro como HSV-1 */2“ que por Western Blot era apenas HSV-2", dando um total de 4/419 (0,95%) de falsos positivos para HSV-1 combinando os resultados de ambos os antigénios. Assim, 415/449 (92,4%) de amostras HSV-1" por Western Blot foram correctamente diagnosticadas por SIA. Ambos os antigénios, gB1 e gG1, contribuíram igualmente para o diagnóstico final de HSV-1Assim, o algoritmo final para a leitura do SIA é de que, se qualquer uma ou ambas as bandas dos antigénios gB 1 e gG1 são positivas, os soros são HSV-1". Dos 34 soros HSV-1 + por Western Blot que eram HSV-1' por SIA, 12 foram designados como apenas HSV-2", 6 foram designados como negativos para HSV e 16 como positivos para HSV, não tipificáveis. A adição do péptido de gB1 ao ensaio SIA reduziu o número de falsos negativos para HSV-1 em cerca de 50% em comparação com um ensaio que inclui apenas gG1 como antigénio específico de HSV-1, 82,0% (-gB1) a 93,3% ( + gB1). A facilidade de realização e a vasta disponibilidade do SIA para o HSV em comparação com o ensaio Western Blot para o HSV, podem facilitar a pesquisa serológica alargada de HSV.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 42

Tabela 2 Diagnóstico por WB N Diagnóstico por SIA N % correcta pelo SIA em comparação com o WB Negativo para HSV 175 Negativo para HSV 170 97,7 Pos./Não tipif. 5 HSV-1 + 330 HSV-1 * 296 89,7 HSV-2 ~ 1 HSV-1 Ί2" 11 Neg. para HSV 6 Pos./Não tipif. 16 HSV-2 + 113 HSV-2* 109 96,5 HSV-1 */2" 4 HSV-1 + 12" 119 HSV-1 "I2 + 107 89,9 j í HSV-1 * 1 HSV-2" 11

Tabela 3 Diagnóstico por SIA Positivo para gB1 Positivo para gG1 Positivo para ambos Positivo para nenhum Total de positivos para HVS-1 HSV-1 + 37 33 227 - 297 HSV-1+ e HSV-2* 14* 21 * * 87 122 Negativo para HSV 1t | 2T i i ! 0 Positivo não tipificável 0 0 0 20 0 HSV-2 + 0 I o 1 0 0 0 * 3 destes são apenas HSV-2" por WB; ** 1 destes é apenas HSV-2" por WB. t Estes foram diagnosticados como negativos para HSV uma vez que foram negativos para gD2.

85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ

d. ELISA

Realizou-se um método de ELISA com gG utilizando os passos seguintes. Revestiu-se uma placa de microtítulo Immlon 2 (disponível de Dynatech Laboratories, Chantilly, VA), com antigénio gG1 e gG2 por aplicação do antigénio respectivo em tampão borato nas placas a 2 mg/ml (50 l/poço) durante a noite a 4°C. Lavaram-se as placas quatro vezes com um tampão de lavagem compreendendo NaCI 0,14 M e Triton X-100 a 0,05%, e bloquearam-se as placas com soro de vitelo fetal (FCS) a 10%, Tween 20 a 0,3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante aproximadamente duas horas a 37°C. Lavaram-se as placas quatro vezes com uma lavagem adequada, e soro humano, diluído de 1:20 em solução de diluição incluindo fosfato de sódio dibásico 0,25 M, EDTA 0,001 M, NaCI 0,5 M, Timerosal 0,2 M, Triton X-100 a 0,01%, HCI a 0,001%, 6 N, e caseína a 1%. Adicionaram-se as amostras a 50 l/poço e incubaram-se as placas a 37°C durante aproximadamente 2 horas.

Após a reacção com os soros humanos, lavaram-se as placas quatro vezes, e adicionou-se aos poços Fab'2 Cappel de IgG anti-humana de cabra conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (diluído de 1:4000 em solução de diluição (a 50 l/poço)) e incubou-se a 37°C durante aproximadamente 1 hora. Após lavagem quatro vezes com uma solução de lavagem adequada, revelaram-se as placas durante aproximadamente 1 5 minutos com solução de 0PD (dicloridrato de o-fenilenodiamina) adicionada a 50 l/poço. Interrompeu-se a reacção com H2S04 4N (adicionado a 50 l/poço) e leram-se as placas num leitor de ELISA a OD 490-650. Os resultados dos ensaios são apresentados abaixo nas Tabelas 4 e 5. TABELA 4 Resultados do ensaio com gG1 Falso + Falso - % de erro Antes de gD 16/559 16/559 5,7% (2,9%) (2,9%) Depois de gD 6/559 16/559 3,9% (1,1%) (2,9%) 44 44 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ TABELA 5 Resultados do ensaio com gG2 Falso + Falso - % de erro Antes de gD 11/559 11 /559 3,9% (2,0%) (2,0%) Depois de gD 10/559 11/559 3,8% (1,8%) (2,0%)

Assim, são revelados novos métodos para a detecção de infecção por HSV. Apesar de as concretizações preferidas da presente invenção terem sido descritas com algum detalhe, entenda-se que podem ser feitas variações óbvias sem afastamento ao espírito e ao âmbito da invenção como definidos pelas reivindicações em anexo. •V' i1 ‘‘Π C* t-ι l··

Lisboa,

Por CHIRON CORPORATION - O AGENTE OFICIAL -

Eng" ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERBEIRA Ag. Of. Pr. índ

Roa daa Flonef 74-4/ j yglggA |

Claims (32)

1. 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detecção da presença de anticorpos para o vírus do herpes simples (HSV) compreendendo: (a) proporcionar uma amostra biológica de um ser humano; (b) fazer reagir a referida amostra biológica com um ou mais antigénios purificados de HSV específicos dos tipos e um ou mais antigénios purificados de HSV comuns aos tipos, sob condições que permitam que os anticorpos para o HSV, quando presentes na amostra biológica, se liguem ao referido antigénio específico do tipo e/ou ao referido antigénio comum aos tipos; e (c) detectar a presença ou a ausência de anticorpos ligados no passo (b) como uma indicação da presença ou ausência de anticorpos para HSV, em que a referida detecção é realizada utilizando um ou mais anticorpos imunoglobulina anti-humanos marcados de forma detectável.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios específicos dos tipos compreendem um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo e um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infecção por HSV é por HSV-1.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infecção por HSV é por HSV-2.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o marcador detectável é um agente fluorescente ou uma enzima.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios específicos dos tipos e os referidos um ou mais antigénios comuns aos tipos são imobilizados num suporte sólido.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6 em que o suporte sólido é uma tira de nitrocelulose.

   85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 2/5
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios específicos dos tipos compreendem um poiipéptido de glicoproteína G de HSV (gG).
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido poiipéptido de gG é um poiipéptido de gG1.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido poiipéptido de gG é um poiipéptido de gG2.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 8, em que os referidos um ou mais antigénios específicos dos tipos compreendem polipéptidos de gG1 de HSV e gG2 de HSV.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido poiipéptido de gG tem todo ou parte de um domínio transmembranar dele eliminado.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios específicos dos tipos compreendem um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB 1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 de gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios comuns aos tipos compreendem um poiipéptido de glicoproteína D de HSV (gD).
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido poiipéptido de gD é um poiipéptido de gD1.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido poiipéptido de gD é um poiipéptido de gD2.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido poiipéptido de gD tem todo ou parte de um domínio transmembranar dele eliminado.

    85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 3/5
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios comuns aos tipos compreendem um polipéptido de glicoproteína B de HSV (gB).
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido polipéptido de gB é um polipéptido de gB1.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido polipéptido de gB é um polipéptido de gB2.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido polipéptido de gB tem todo ou parte de um domínio transmembranar dele eliminado.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos um ou mais antigénios comuns aos tipos compreendem um polipéptido de VP16 de HSV.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido polipéptido de VP1 6 é um polipéptido de Vp1 6 de HSV-1.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido polipéptido de VP16 é um polipéptido de Vp16 de HSV-2.
25. 25. Método para distinguir entre o vírus do herpes simples do tipo 1 (HSV-1) e o vírus do herpes simples do tipo 2 (HSV-2) numa amostra biológica, compreendendo o referido método: (a) imobilizar um ou mais polipéptidos purificados de HSV-1, específicos do tipo, um ou mais polipéptidos purificados de HSV-2, específicos do tipo, e um ou mais polipéptidos purificados de HSV, comuns aos tipos, em posições discretas, sobre uma tira de nitrocelulose, em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionado de entre o grupo que consiste em um polipéptido de glicoproteína G de HSV-1 (gG 1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB 1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 da gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, e ainda em que

    85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 4/5 os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo compreendem um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2) específico do tipo; (b) colocar em contacto a referida tira de nitrocelulose do passo (a) com a referida amostra biológica sob condições que permitam que anticorpos anti-HSV-1 e anti-HSV-2, quando presentes na amostra biológica, se liguem aos referidos polipéptidos de HSV específicos dos tipos e/ou comuns aos tipos; e (c) detectar a presença ou ausência de anticorpos ligados no passo (b) como uma indicação da presença ou da ausência de HSV-1 e/ou HSV-2 na referida amostra biológica em que a referida detecção é realizada utilizando um ou mais anticorpos imunoglobulina anti-humanos marcados de forma detectável, distinguindo deste modo entre o HSV-1 e o HSV-2 na referida amostra biológica.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV comuns aos tipos são definidos como em qualquer uma das reivindicações 14a 16, 1 8 a 20 e 22 a 24.
27. 27. Método de acordo com as reivindicações 25 ou 26, em que os referidos polipéptidos de gG1, gG2 e de HSV comum aos tipos têm todo ou parte de um domínio transmembranar deles eliminado.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida amostra biológica é uma amostra de soro humano.
29. 29. Estojo de teste de imunodiagnóstico para a detecção de anticorpos para o vírus do herpes simples (HSV) numa amostra de soro humano, compreendendo o referido estojo; (a) um ou mais polipéptidos purificados de HSV-1 específicos do tipo ligados a um suporte sólido em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionados de entre o grupo que consiste em um polipéptido de glicoproteína G de HSV-1 (gG1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 de gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, um polipéptido purificado de HSV-2 específico do tipo ligado a um suporte sólido em que o referido 85 856 ΕΡ Ο 842 430/ΡΤ 5/5 polipéptido de HSV-2 específico do tipo é um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2), e um ou mais polipéptidos purificados de HSV comuns aos tipos ligados a um suporte sólido; e (b) instruções para a condução do teste de imunodiagnóstico.
30. 30. Estojo de teste de imunodiagnóstico para distinguir entre infecção pelo vírus do herpes simples do tipo 1 (HSV-1) e pelo vírus do herpes simples do tipo 2 (HSV-2) numa amostra biológica, compreendendo o referido estojo de teste: (a) um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo, um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo, e um ou mais polipéptidos de HSV comuns aos tipos, imobilizados em posições discretas de uma tira de nitrocelulose, em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-1 específicos do tipo são seleccionados de entre o grupo que consiste em um polipéptido de glicoproteína G de HSV-1 (gG1) e um epítopo específico do tipo de glicoproteína B de HSV-1 (gB1) compreendendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos 1-47 de gB1 de HSV, numerados com referência à molécula de gB1 madura, e ainda em que os referidos um ou mais polipéptidos de HSV-2 específicos do tipo compreendem um polipéptido de glicoproteína G de HSV-2 (gG2) específico do tipo, e (b) instruções para a condução do teste de imunodiagnóstico.
31. 31. Estojo de teste de imunodiagnóstico de acordo com a reivindicação 29 ou 30, em que o polipéptido de HSV comum aos tipos é definido como em qualquer uma das reivindicações 14a 16, 1 8 a 20 e 22 a 24.
32. 32. Estojo de teste de imunodiagnóstico de acordo com a reivindicação 29 ou 30, em que os referidos polipéptidos de gG1, gG2 e de HSV comum aos tipos têm todo ou parte de um domínio transmembranar deles eliminado. Lisboa, cí. í -4 cuu» Por CHIRON CORPORATION - O AGENTE OFICIAL -

    DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores. 74-4.® 1200-195 LISBOA 1200