JPS60155974A - 分子クロ−ンされた診断用産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は組換えＤＮＡ技術によって得られた免疫学的診
断用産物、並びにその使用方法に関するものである。

従来技術 種々の感染源に対する免疫応答の解析は、重要な細胞表
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があった。

ＨＳ　Ｖ　−１の　ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の検出は、
酵素−結合性免疫吸着剤分析法（ＥＬＩＳＡ）（Ａ、Ｂ
）によって行なわれた＝この両者の方法で、Ｈ８Ｖ−感
染細胞の抽出物を抗原として用いることが亦された。し
かし、実験室内で生の抗原を使用すること＋（は、培養
の必要性や感染性物質による汚染等の不都合を伴なうこ
とがよく知られている。

分子クローニング法の出現によって、病原体からの遺伝
子生成物を非病原型で事実上量的に無限に発現できる手
段が提供され、これらの限界が克服されるようになった
。現在ではインフルエンザ＋１＞、口締病（２）、肝炎
（３）、小水庖性口内炎ウィルス（４）、狂犬病（５）
、および単純ヘルペス（＠疹）ウィルス（６）のような
ウィルスからの表面抗原がＥ、　ｃｏｌ　ｉおよびＳ、
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　において発現され、将来、改
良されたサブユニットワクチンの提供を約束している。

下等微生物における表面抗原の発現は、不完全なプロセ
シングのために（例えば、タンパク質分解、糖付加）、
またはクローンした遺伝子産物を精製する間の変性によ
り、恐らく重要な意味のある抗原決定基を失うかも知れ
ないという理由で満足すべきものであるとは言い難い。

このことは、膜タンパク質の場合は、Ｅ、ｃｏｌｉ中で
発現された時に、それが疎水性の膜透過領域のために、
凝集し、不溶性となり勝ちであるので特にそうである。

゛膜タンパク質を暗号化したクローン遺伝子が、哺乳動
物細胞中で知られておりこの場合、この宿主細胞が適宜
プロセスし、ポリペプチドを組み合わせ、細胞膜内に取
り込むのに必要な因子を提供する（７．８）。

他方これらの研究において、膜タンパク質が組換え宿主
細胞の表面で発現されることがわかり、さらに例えば（
８）では、疎水性のカルボキシ−末端領域を欠く先端を
切断された膜タンパク質が、宿主細胞と結合するよりも
、むしろ徐々に分泌され得ることが示されており、さら
に膜結合タンパク質のクローン遺伝子が一時的に発現さ
れたこと、およびそれに相補的な標識抗体により染色し
てそのタンパク質を検出したこと、が記載されている。

しかし、これらの文献中には膜−結合タンパク質が免疫
学的診断産物として有用であることを示唆するものはな
い。その様な示唆があっても、該細胞系の不安定さの故
に、記載された膜−結合タンパク質は科学的な興味の対
象となり得ても、実際の診断用物質として有用とは言い
難い。

単純ヘルペスウィルス（）（Ｓ■）は、関連性はあるが
区別できる二つの型でヒト感染症に見出される巨大ＤＮ
Ａウィルスである。ウィルスが暗号化している多数のタ
ンパク質のうちの少なくとも４個が、グリコジル化した
形で発見され、それらがウィルス粒子（ピリオン）およ
び感染細胞の両表面に存在していることが明らかにされ
た（９）。

ＳＩＡ／Ｂ　、９Ｃ、ｇＤ　、およびｇＥと呼ばれるこ
れらの糖タンパク質はＨ８Ｖｌ型（ｉ−ｉｓＶ−ｉ）お
よびＨ５Ｖ２型（Ｈ８Ｖ−２）の双方に見出されるが、
Ｈ５Ｖ−２の場合は、更にもう１個の糖タンパク質（９
Ｆ　）が発見されたと報告されている０ω。それらの機
能についてはなお完全に理解されてはいないが、それら
の糖タンパク質が、ウィルスの細胞への付着、細胞融合
、およびウィルス感染に対する宿主の免疫学的応答に関
与しているように思われる（１１）。Ｈ８Ｖ−１とＨ８
Ｖ　−２は５０％までのＤＮＡ配列相同性しか示さない
が（１２）、それらの糖タンパク質の大部分は両型に共
通しているようである。このように、ｆＡ／Ｂ、ｇＤ、
およびｐＥは型に共通した多くの抗原決定基を示すが（
１３〜１６）、以前には完全に型特異性があると思われ
ていたｇＣ（１７，１８）も幾つかのシ通性の決定基を
有することが明らかになって来た。然しなから、幾つか
の糖タンパク質に対する単クローン性抗体を使用して、
型特異性のある抗原決定基を証明でき（１０，１９）、
Ｈ５Ｖ−１とＨ３Ｖ−２に分れて以来、ある種のアミノ
酸変化が起こったことを物語っている。

ウィルス中和に関して最も重要な糖タンパク質０）一つ
はｆＤである（１１）。Ｈ５Ｖ−１（！：Ｈ５Ｖ−２の
それぞれのｆＤタンパク質が近縁であることを強く示唆
する注目すべき証拠が提示されている。例えば、遺伝子
組み換え地図を作ると、対応′する遺伝子が二つのウィ
ルスのゲノムの共直線領域につきとめられる。アミノ酸
分析の結果は二つのタンパク質問に総体的な相同性が有
ることを示した。ｐＤタンパク質は１型および２型の両
ウィルスに対し型共通性の型式で中和抗体を誘導する（
１９−．２１　）。更に、これらの糖タンパク質に対し
て生じるモノクローナル抗体の大部分は型共通性であり
、同様に二つの糖タンパク質の型の間の高度な構造的相
関性を示している（２０）。然し、幾つかの単クローン
性（モノクローナル）抗体は型特異的に反応することが
知られており、両タンパク質の間に有惹の差のあること
を示した（１９）。

同様に、タンパク質のペプチド地図も不明瞭ではあるが
そのような違いを示した（２２）。これらの結果は、こ
れらのポリペプチドが相関していることを示唆している
が、その関係がとの程度近縁であるかを正確に示すには
不充分である。

Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２のｐＤタンパク質の型共通性の
特徴を検討するため、Ｈ８Ｖ−１とＨ５ｖ−２のｇＤ遺
伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導されたアミノ酸配列
は近似性を示した。また、その結果生じたタンパク質配
列についても、タンパク質の疎水性領域と親水性領域を
測定すべく設計されたプログラムを使用することにより
、構造的な相違を解析した。この解析の結果から、総体
的構造水準は高度に維持されていることが明らかにされ
た。二つの糖タンパク質の間に数ケ所のアミノ酸置換が
見られたが、これらの置換のほとんど大部分はコンサー
バテイブであり、この糖タンパク質がウィルスの構造上
重要な必要条件であることを示していた。

上記のｇＤタンパク質の構造に関する情報に照らし、本
明細書中に詳しく述べるが、このｇＤタンパクＤ　、Ｎ
　Ａの哺乳類動物の細胞内での発現に関し、以下の事柄
を調べた。即ち、その様な発現が可能か否か、可能であ
るならば発現したタンパク質が宿主細胞の膜に結合して
いるか否か、また、いずれかの場合においては、発現し
たタンパク産物がＨ８Ｖ−１および／またはＨ５Ｖ−２
に対して有効な抗体と結合し得るか否か、に関する決定
を行なった。その全工程は未決定の特許出願（第５２７
．９１７号、１９８３年８月３０日出願）の中に記載し
た。この出願において示した様に、上記の如き発現産物
であるタンパク質はＨ５Ｖ−１および／またはＨ５Ｖ−
２に対して有効な抗体を高めることができ、従ってワク
チンとしそ有用である。本明細書に記載した結果が示す
様に、Ｈ５ｖ−１および／またはＨ８Ｖ−２に対する抗
体によって認識され得る、前記の組換えＤＮＡ技術で得
られた発現タンパク質は、これらのウィルスに特有の抗
体の存在を検出し、そして／または測定するのに有用な
診断用産物でもある。マツピングスタディ−の結果は、
ｆＦに相当するＨ８Ｖ−２ゲノムから導かれたタンパク
質配列が、Ｈ８Ｖ−Ｂｃ　に対するＨ８Ｖ−２の相同部
分であることを示唆していた（２２ａ） Ｈ８Ｖ−１ｐＣは、この糖タンパク質（グリコプロティ
ン）に対する抗体が殆んど独占的にＨ５Ｖ−１１Ｃと反
応することが見出されたため（１７）、ＨＳ　Ｖ　−２
と相同性を有さない、型特異性のものであると考えられ
ていた。しかも、Ｈｓｖ＝１ｇｃとＨＳ　Ｖ　−２ウイ
ルスに対して調製された抗血清との間には検出可能な免
疫学的反応が存在することを証明するものは何もなかっ
た（１８）。Ｈ５Ｖ−１ｙＣと同様な電気泳動上の挙動
を示すタンパク質がＨ８Ｖ−２にも認められたが、それ
はＨ３Ｖ−Ｂｃとマツプ上で共通線性を有するものでは
なかった（３５）。

ＨＳ　Ｖ　−１と対照的に、Ｈ３Ｖ−２はｇＦと呼ばれ
るもう１個の糖タンパク質を暗号化しているようである
（２２ｂ、１０．２２Ｃ，２２ｄ）。

ｒｒｓＶ−２１Ｆは電気泳動によってＨ３Ｖ−１ｙＣよ
りはるかに速く移動するが、組み換え体ウィルスのマツ
ピング研究により、このタンパク質はＨ５Ｖ−１’／ム
のＨ５Ｖ−１ｆＣ（７）ため（７）遺伝子とほぼ共直線
的な領域で暗号化されているこ　１とが明らかになった
（２２Ｃ１２２ｄ）。更に最近、Ｈ５Ｖ−２ｆＦの単ク
ローン性抗体が弱いながらもｕｓｖ−ｉｇｃと交叉反応
するらしいということ（２２ｆ）、　およびＨ５Ｖ−１
ウイルス粒子のエンベロープタンパク質に対して作られ
た多クローン性抗血清がｇＦを沈降させること（２２ｄ
）が証明されコニつの糖タンパク質の間に構造上の相同
硅ア可能性があることが示唆された。このように、Ｈ５
Ｖ−１ｙｃとの相同性はＨ５Ｖ−２９Ｆタンパク質であ
る可能性を示すものである。この。

関係は本発明において検討された。

以下、図面について説明する。

第１図は、Ｈ５Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２ｇＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列と、推定されたア
ミノ酸配列を示す。

第２図はＨ５Ｖ−１とＨ８Ｖ−２タンパク質からのｐＤ
タンパク質のヒドロパシ〜（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）解
析を示す。

第３図は、膜結合型のＨ５Ｖ−１糖タンパク質りの発現
のために組み立てられた、ｐｇＤ−ｄｈｆｒプラスミド
の模式図である。

第４図はＨ５Ｖに対するヒト抗体でｆＤ１２細胞を標識
した結果を示し、（Ａ）は位相差顕微鏡像、ＣＢ）は同
じ細胞の螢光顕微鏡像である。

第５図は、ｐＤ１２細胞系からのクローンされたダＤお
よびＨ５Ｖ−１に感染させたヒトの細胞から得られた天
然のｇＤの放射免疫沈降を示すグラフである。

第６図は、９Ｄ１２細胞および親のＣＨＯ細胞細胞対す
るヒト抗Ｈ８Ｖ抗体の結合度を示す。横軸に血清希釈度
の逆数、縦軸に４９２ｎｍにおける吸光度を示す。

第７図はＨ８Ｖ−１ｐＤタンパク質を模式的に表わした
もので、シグナル配列および膜結合領域の位置を示す。

第８図は分泌型のＨｓｖ−１ｇ０タンパク質のための発
現プラスミドｐ　（Ｉ　Ｄ　ｔｒｕｎｃ　−ｄｈｆｒの
組立て模式図である。

第９図はｐＤｌｏ、２細胞系からの放射免疫沈降線を示
す。

第１０図は増幅前および増幅を行なったｇｌＤ　Ｉｏ、
２細胞系からの放射免疫沈降線を示す。

第１１図はＭｔｘで増幅したｇＤｌｏ、２細胞系で達成
された増幅度を示す。

第１２図はＤＮＡ配列解析を行なった２ｇＣ２Ｓａ１２
．９の断片を示す。

第１ゝ３図はｐ　ｙ　Ｃ２Ｓ　ａ−’　２．９から誘導
されたＤＮＡ配列とＨ５Ｖ−１ｐＣ領域のＤＮＡ配列の
比較を示す。

第１４図はＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡとｐ　ｙＣ２Ｓａ１
２、９　Ｄ　Ｎ　Ａのサザーンブロッテイング解析を示
す。

第１５図はＨＳ　Ｖ　−２のラージオープンリーディン
グフレームの翻訳とＨ８Ｖ−１ｇｃのアミノ酸配列の比
較を示す。

第１６図はＨ５ｖ−１ｇＣタンパク質とＨ５Ｖ−２のメ
ジャー・オープンリーディングフレームタンパク質のヒ
トロバシー解析結果を示す。

発明の要約 本発明においては、遺伝子産物を、診断用物質として用
いる目的で、それらを大量に、しかも非病原性の状態で
提供するために組換えＤＮＡ技術を利用した。また、そ
の様な遺伝子産物の利点をＨ５Ｖの如きある種の感染症
の診断に関連させて示した。今日用いられているＨ５Ｖ
診断法には、（ａ）臨床的に単離したものを培養する、
（ｂ）生ウィルスから得た試薬を用いる、または＜ｃ＞
螢光標識または酵素標識と結合したモノクローナル抗体
を使用する、の３方法がある。第１の方法は骨の折れる
方法であり、結果を得るまでに通常数日間を要する。第
２の方法は大多数の臨床実験室での取扱い範囲を超えた
生化学的な操作を要するので、実用的でないことが多い
。また、第３の方法は開放病巣の検出に係り、例えば螢
光顕微鏡または螢光標識の如き検出手段を利用すること
ができるということに依存する。この様な理由から、臨
床診断には、実験室的な確認方法は一般に採用されてい
ない。

本発明のシステムでは、相補的な抗体と特異的に結合し
得る抗原決定基をもったポリペプチドを含有する診断用
産物（以下に定義する）を用いる。

１つの態様では、該ポリペプチドは、それを生産するこ
とのできる組換え宿主細胞の表層膜に機能的に連合（ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅ　）　している。通常、その様な機能
的な連合において、ポリペプチドは表層膜に結合し、膜
を通って突出している。この組換え細胞系は、商業的規
模で診断用産物を供給するたやに安定で連続的な系から
導かれている。

もう１つの態様における診断用産物は、同じ抗原決定基
を有するが表層膜と機能的に連合していないポリペプチ
ドを含んでいる。以下に詳しく示すが、その様なポリペ
プチドの１つは膜−結合ポリペプチドから得られた、膜
を含まない、先端を切断されたものである。この誘導物
質はポリペプチドの膜−結合領域を除去し、それが生産
された宿主細胞系から分泌させることにより産生される
。

また別の態様では、ポリペプチドをまず表層膜と機能的
に連合した形で生成させ、次いでこのポリペプチドを膜
から離すために、好ましくは非イオン性界面活性剤を用
いて細胞を溶解させて得る。

その全容を以下に詳しく示すが、本発明に係る診断用産
物は、アナローガスイムノアッセイにおいて、生の病原
体に由来する１方の物質（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ　）
の代りに用いることができる。

この様な点から、市販の診断試験用キットに、上記の診
断用産物をその他の種々の免疫学的産物（それらの内生
くとも１つは、それに相補的な抗体または他の抗原を検
出するために標識化されている）を含むことになろう。

この様な系に関して、相補的な抗体、即ちＨ５Ｖ−１お
よびＨ８Ｖ−２に対する抗体、と特異的に結合するのに
充分な抗原決定基を有する、Ｈ５Ｖ−１およびＨ５Ｖ−
２由来のｇＤタンパク質の分子クローニングについて記
載した。Ｈ５Ｖ−１ｇＤタンパク質のクローニング、配
列決定、並びに発現に関する特殊な技術は以下の実施例
１に記述した。そこで述べる様に、第２図のバイトロバ
シープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙｐｌｏｔ　）から
、親水性のカルボキシ末端が、疎水性の領域に先行され
ていることがわかった。この構造は膜−結合性糖タンパ
ク質に特有である。その機能はタンパク質を細胞内およ
びウィルス膜内に固定することにある。

Ｈ３Ｖ−１とＨ５Ｖ−２との関係ヲＦｌｌ　ヘｆニー結
果、−）ＩＳＶ−２ゲ／ムの２．２９Ｋｂ領域とＨ５Ｖ
−１ｇＣ遺伝子とは共通線関係にあることが確認された
。この領域の、ラージオープンリーディングフレームの
翻訳によって、この領域にはＨ５Ｖ−１ｇ（と有意な相
同性を有するタンパク質が暗号化されていることが証明
された。即ちこの領域にはＨ５Ｖ−２ｐＦ遺伝子が暗号
化されており、従ってｐＦタンパク質はＨ５Ｖ−２の、
Ｈ５Ｖ・−１糖タンパク質Ｃ１’Ｃ）との相同部分であ
ることを示唆するものといえる。

ここで述べた様に、前にｇＦと称したＨ８Ｖ−２中の糖
タンパク質はｆＣと命名するのが適当である。（この生
産物に関しては、［ＨＳ　Ｖ　−２ｆＦＪ、ｒＨ５Ｖ−
２ｆＣＪ　およびｒｇｃ−２Ｊ　という語句を相互変換
的に用いることとする。）ｇｃ−２の１つのセグメント
（部分）は、他のセグメントが型特異性であるのに対し
て、ｔ−ｔｓｖ−１ｇｃ（またはｆＣ−１）と型共通性
であることがわかった。

型特異性セグメントを含むが、型共通性セグメントを含
まないｇｃ−２の７ラグメントて形成された診断用産物
によれば、Ｈ５Ｖ−１と区別してｌｌＳ■−２を検出す
ることができる。診断試験が陽性であれば、対象はＨ５
Ｖ−２を有する。この試験を、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２
に共通な他の試験法と併用すれば、Ｈ５Ｖ−１を診断す
ることができるであろう。例えば、ｇＤを用いた診断試
験での陽性判定はＨ８Ｖ−１および／またはＨ５Ｖ−２
ウイルスの存在を意味する。もしも、型持異性ｇＣ−２
試験も陽性であれば、対象はＨ８Ｖ−１およびＨ５Ｖ−
２をもっといえる；陰性であれば、対象はＨ５Ｖ−２の
みを有するといえる。かくして、Ｈ５Ｖ−２からＨ５Ｖ
−１を区別することのできる診断試験法が初めて考案さ
れたことになる。

その他の既知のＨ５Ｖ−１またはＨ８Ｖ−２の糖タンパ
ク質類、例えばｇＡ％　ｐＢまたはｇＥ１アロイＬヨ＊
ｆｆ：Ｅ’ｉ１ｇｔ１．ｒイｆＬイｔｌｔｉｌ　ｙｚｆ
７ｊＩｉＧ、　ＩＨ５Ｖ−１またはＨ５Ｖ−２に対する
診断用産物として利用することもできる。もしも、その
様な糖タンパク質がＨ５Ｖ−１またはＨ５Ｖ−２に対す
る型特異性の決定基を含有している場合には、本明細書
中でｆＣおよびｐＤに関して記載した相似（アナローガ
ス）組換え技術を利用して、上記梼タンパク質類を用い
てＨ５Ｖ−２からＨ５Ｖ−１を区別し得る様な診断用産
物を生成させること１またはＨＳ　Ｖ　−２について特
異的な診断薬を得るために、本明細書中でｙｃ−２の生
産に関して述べたと同じ組換え技術を利用して型共通性
画分から分離された型特異性画分を分離することができ
る。もしも、その糖タンパク質が型共通性画分のみを含
んでいる場合にはｇＣに関すると類似の組換え技術によ
り上記診断薬を生産することができる。

ある一定の分子クローニング法によってのみ、それに対
して相補的な抗体によって検出されるに適した特異的抗
原決定基をもったポリペプチドを生産することができる
と思われる。こうして、生産の過程中で、ポリペプチド
は適切に折りただまれ、糖付加され、そして正しい工程
に従った方法で形成されねばならない。実施例１に示す
如く、この様な望ましい性質を有する細胞の生産を一成
するための１つの方法は、組換え宿主細胞の表層膜に機
能的に連合するｉな方法で分子クローンされたポリペプ
チドを得る方法に関する。こめ目的のためには真核性宿
主細胞系を用いる必要があり、哺乳類の細胞系が好まし
いと確信される。かくして、例えぼチャイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＣＨＯ）内で発現したＨ８Ｖ−１糖タン
パク質りは、適ｉな抗原特性を有する膜−結合ｇＤタン
パク質を生産する。その他の適当な組換え宿主細胞系に
はマウスＬ細胞等が含まれる。

本明細書で使用する“組み換え体”なる用語は、組み換
えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターでトラン
スフェクトされ、ポリペプチドを生産する能力を形質導
入された細胞を意味する。

機能的連合”とは、膜に結合することであり、典型的に
は、天然の病原体によって誘発された抗体によって認識
され得る天然の立体配座に含まれている抗原決定基を露
出する様に、膜の両側へ突出して膜と結合することを意
味する。゛膜結合”ポリペプチドとは、通常真核細胞で
生産され、それが３種々の細胞膜を通って分泌されるの
を助けると考えられているシグナル配列、および細胞膜
からの完全な分泌を妨げると考えられる膜結合領域（通
常、疎水性であり、Ｃ−末端に存在する°）を有してい
ることにより特徴づけられるポリペプチドの一群を言う
。従って、それは機能的に膜に連合または結合した状態
のままでいる。本発明では、特に病原微生物、例えばヘ
ルペスウィルスに関する膜結合ポリペプチドを開発しよ
うとするものである。

本明細書で使用しているＨＳ　Ｖ　−２ｆｌ　Ｆ”、“
Ｈ８Ｖ−２ｇＣ″および“ＩＣ−２”なる用語は、ｕｓ
ｖ−１ｙｃと高度の相同性を有し、ワクチンとして有用
な充分な量の抗体を生成せしめることができるＨ５Ｖ−
２の糖タンパク質部分を指す用語として、交換可能に使
用される。

表面膜と機能的に連合した形で本発明のポリペプチドの
抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリペプチドから
、抗原性を破壊することなく除去することができる。例
えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶液、望ましく
は非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶解することに
より、ポリペプチドを膜から除去することができる。こ
れを行なうことの利点は、無関係な細胞性物質からポリ
ペプチドを分離し、ワクチンに使用する際の、その潜在
的活性を充分に高めることである。ポリペプチドから膜
を除去する技術は後述する。

もう一つの実施態様としては、分泌系を創製することに
よって、膜を含有しない標品を得ることである。後段で
更に詳細に記述するように、そのように分泌されたポリ
ペプチドは少なくとも抗体産生を刺激するのに必要な幾
つかの抗原部位を持っている。

他の態様では、ポリペプチドをその膜−結合状況から分
泌させる方法で膜を除去する。その様にして分泌された
ポリペプチドは抗原性の検出法に必要な抗原性部位を少
くとも数個有している。この方法を実施するための技術
を以下の実施例３に示す。

血清、尿、または皮膚標本等に由来する生物学的な液体
中の抗原または抗体に関する未知量をある方法には数多
の既知技術がある。本発明方法は、上記の既知技術にお
ける診断用物質の代りにある種の分子クローン診断試薬
を用いることの外は、原則的にその様な既知技術を利用
するものである。従って、工程に関しては、その詳細な
部分を従来の免疫学の書物を参照することとし、一般的
な記述に止めた。本発明の新規な診断用産物を従来から
の免疫学的手法に適用する方法は、当該技術分野の人々
にとって容易に理解し得ることである。

記述を簡略化するために、一般的な語句である「診断用
産物」という言葉は、本発明の抗原様機能を有する産物
を述べるのに用いるものとする。

本明細書において「診断用産物」という言葉は、病原菌
から誘導された、対応する抗体と特異的に結合し得る抗
原決定基をもったポリペプチドであって、安定かつ連続
的な組換え細胞系から導かれ、該ポリペプチドを生産し
得る様な組換え宿主細胞内で生産されたものである、と
定義する。このポリペプチドは組換え宿主細胞の表層膜
と機能的に連合しているか、あるいはそうでないかのい
ずれかである。

後者の場合には、該ポリペプチドは、一般に先端を切断
された形であって、その形で宿主細胞系から分泌される
か、あるいは、膜を溶かす様な溶液、または非イオン性
界面活性剤溶液の中で膜から遊離せしめることにより、
生産される。

一般に、診断用産物は生物学的に得られた液体中の抗体
または抗原を検出するのに用いることができる。抗体を
検出するには、診断用産物を上記試料溶液中の相補的な
抗体と結合させるために、該試料溶液を診断用産物に接
触させ、この結合を検出し、好ましくは測定をも行なう
。また、抗原を検出するには、試料溶液を、試料中の抗
原と同様な抗原決定基をもった診断用産物と接触させる
。

次いで試料中の抗原を、競合的分析法により検出もしく
は測定する。

上記の如く、周知方法の１つは、抗原としてＨＳＶ−感
染細胞の抽出液を用いるＥＬＩＳＡ−サンドインチ法で
ある。その様な技術の一般的手法を、本発明中で使用し
た。

抗体検出用の系においては、一般に診断用産物は固相表
面、通常、くぼみ、または゛試験管の°表面に結合（例
えば、吸着または共有結合により）した状態に調製され
る。

その他、適当な固相表面にはビーズの如く、診断用試薬
を不動化することのできる表面が含まれる。

診断用産物の層を支持する固体表面は、非結合試薬を洗
い流すことができるに充分な、液体に対する不浸透性を
有することが必要である。またそのものは、診断用試薬
を結合させねばならない。

共有結合を望む場合には、適当な表面にポリスチレン等
のプラスチックが含まれる。固相表面に診断用試薬を結
合させる好適な方法は、Ｂｅｎｎ　ｉ　ｃｈらのアメリ
カ特許第３．７２０．７６０号に記載されている。

サンドイツチ法によって試料中の未知抗体を検出するに
は、結合した診断用産物を、未知抗体、並びに試料中に
含まれている相補的な抗体と特異的に結合し得る、可溶
性で標識された抗−抗体と反応させる。こうすることに
より、試料抗体は、診断用産物と標識抗−抗体の両者間
にはさまれサンドイッチの形で固相表面に結合すること
になる。

次いで固相表面を洗って未反応の標識抗−抗体を除く。

その後、固相表面、または洗浄液中の標識抗−抗体を検
出し、試料中の抗体量の指標とする。

同相表面上の反応で得られる反応生成物は、固相表面＊
診断用産物＊試料抗体＊標識抗−抗体の１１＠序で結合
している。ここで＊は結合を意味する。

その内、表面と診断用産物との結合は共有結合または吸
着であってよい。また、診断用産物と試料抗体、並びに
試料抗体と標識抗−抗体との間の結、６よえゆつ、ア。

８１あ、。　Ｉ 周知の如く、ＥＬＩＳＡにおける標識は酵素であ”す、
着色形を与える相補的な基質と反応させた後、比色分析
法で検出する。この様な比色分析法による検出は機器化
を必要としない、という点で有利である。その他、周知
の標識には、機器的な検出に係る放射活性または螢光測
定、等を利用する゛ものが含まれる。

抗−抗体の酵素による標識化は、１または１以上の共有
結合で結合させる従来法で行なうのが好ましい。その様
な共有結合は外因性の、カップリング（結合）あるいは
架橋用の分子を加えるか、もしくは、存在する側鎖と直
接的に縮合せしめることによって達成される。この様な
目的を達成する≠ための、機能的な架橋剤は当該技術分
野で周知である。

本発明の系は、生物学的液体中の抗体を検出するための
イムノアッセイ（免疫検定法）における、いわゆる競合
的結合法番ども適用できる。この場合も、診断用産物は
前記の如く固相表面に層状に結合されている。この固相
を、検出すべき抗体を含んだ生物学的液体、並びに該検
出すべき抗体と免疫学的に同様の型である遊離状態で可
溶性の標識抗体と接触させる。結合した診断用産物と（
ａ）検出すべき試料中の抗体、および（ｂ）酵素標識抗
体の両者との間で競合的な免疫反応が起こる。従って、
生物学的液体中の抗体濃度は、固相表面に結合した酵素
標識抗体の量に反比例する。

上記の競合反応の後、液相から固相を分ける。

試験管またはくぼみを用いる場合には、この操作は試験
管またはくぼみを洗浄することで行なわれる。この洗浄
により、固相表面から非結合−標識抗体が除去される。

次いで、固相または液相に存在する標識抗体を試料抗体
の目安として検出する。この検出は、分離した固相を、
上記酵素によって着色した形に変換される様な可溶性の
基質を含有する溶液と接触させることにより、行なわれ
る。

上記のサンドインチ法、または競合法は、試料中の病原
菌に対する抗体の存在が、その患者の該病原菌に対する
感染を意味するものである、と診断する場合における、
生物学的試料中の抗体測定にとって特に有効な方法であ
る。例えば、Ｈ５Ｖに対する抗体の測定は、患者が感染
していることを示唆するものである。

その他、ウィルス感染後の病原性抗体に対して本発明を
適用し得るウィルスには、アデノウィルス、コクサラキ
ー、サイトメガロウィルス、エプスタイン−バーウィル
ス、ネコ白血病ウィルス、肝炎、豚コレラ、インフルエ
ンザ、麻疹、三ニーカッスル病ウィルス、パラインフル
エンザ、狂犬病、ＲＳウィルス、ロータウィルス、風疹
、センダイ、水痘、等のウィルスが含まれる。また、寄
生虫感染症には、アメーバ症、バベシア症、嚢虫症、包
虫症、リーシュマニア症、糸状虫症、マラリア、幼虫臓
器移行症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、旋毛
虫症、および住血吸虫症が含まれる。その他、本発明は
生産物が宿主由来の膜結合タンパク質を含むものであっ
て、それを、該タンパク質、例えばアセチルコリン受容
体タンパク質に対する抗体を測定するのに用いる、こと
を介して自己免疫疾患の領域にまで拡張して利用するこ
とができる。

本発明の診断用産物は、該診断用分子クローニング産物
と同様の抗原決定基をもった、生物学的試料中のポリペ
プチドまたはタンパク質の全てを、その病原性の有無に
拘らず調べるのに適用することができる。例えば、本発
明の系は、ヒト成長ホルモンおよびインシュリン様成長
因子類の如きヒトホルモン類、ヒト組織のプラスミン賦
活物質（ｔＰＡ）の如き血液タンパク質、インターフェ
ロン、等の血清試料を分析するのに有用である。

その様なタンパク質類（抗原類と称する）の検出法は上
記の競合法と直接的な類似関係にある。

この場合は本発明の診断用産物ではなく抗体類を固相表
面に結合させる。競合法の場合には、上記の如く例えば
酵素によって標識された診断用産物を、固相−結合抗体
および測定を望む抗原決定基をもったタンパク質を含有
する血清試料と混合する。すると不動化抗体と、検出す
べき抗原および酵素標識診断用産物の両者との間に競合
的な免疫反応が起こる。検出すべき抗原の濃度は固相表
面に結合した酵素標識診断用産物の濃度に反比例する。

競合反応の後、固相を液相から分け、標識した診断用産
物を測定する。

標識を診断用産物に結合させるには、前記の従来技術に
従う。例えばゲルタールアルデヒド交差結合剤（ｃｒｏ
ｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　）を用いて酵素標
識を７９Ｄタンパク質に結合させる。

試料中の抗原を測定するためのもう一つの方法は、第１
段階に競合的結合法を行ない、次いて第２段階にサンド
インチ型結合法を行なうことからなる。第１段階では、
診断用産物は前述の如く固相表面に結合している。これ
を、測定すべき未知の抗原と既知量の相補的な抗体とを
含む液体試料と混合する。すると遊離の試料抗原と固相
表面上の診断用産物との間で競合反応が起こる。次いで
固相表面を洗い、固相上の抗体と免疫学的に反応し得る
、標識抗−抗体をこの系に加える。この段階はサンドイ
ンチ法に相当しており、反応生成物は、固相表面＊診断
用産物＊抗体＊標識抗二抗体の順に結合して形成されて
いる。抗体と結合した標識抗−抗体の量が、液体試料中
の未知抗原の量の目安となる。

上記の方法で抗原または抗体の診断を行なうには、前述
の診断用産物を利用した試験用キットが有用である。そ
のようなキットの内の１つは、診断用産物と、該診断用
産物のポリペプチドの抗原決定基に相補的な抗体と特異
的に結合することのできる標識抗−抗体とを含有するも
のである。この試験用キットは試料中の抗体を対象とす
るサンドイッチ型のＥＬＩＳＡ法に適する。

もう一つの試験用キットは診断用産物、標識抗−抗体、
およびそのポリペプチドの抗原決定基と相補的な非標識
抗体とを含有する。この試験用キットは試料中の抗原を
測定するためのいわゆる競合的サンドインチ法に有用で
ある。

その他、診断用産物と、該診断用産物のポリペプチドの
抗原決定基に相補的な標識抗体とを含む試験用キットが
ある。この試験用キットは競合法によって試料中の抗体
を決定するのに適する。

試験用キット中の診断用産物は、それらが使用される態
様の溶液、または固相表面に結合した状態で含まれる。

例えば、診断用産物は、最終的なイムノアッセイに直接
使用するため、試験管またはへ数のくぼみを設けたシー
トの各くぼみの内部表面に層状に支持させるとよい。こ
の形態は生ウィルスを使用する場合と比較した場合、分
子クローンによる診断用産物の安定性における利煮を際
立たせるものである。勿論、この形態は、分子クローン
産物が、従来のイムノアッセイに用いられていた生の病
原菌の様に感染性でないため、実験室や医療施設での試
験を極めて容易ならしめるものでもある。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１ コノ実施例は、Ｈ５Ｖ−１およびＨ８ｖ−２タンパク質
からのｇＤタンパク質の生成法および確認法を示すもの
である。

Ｈｅｐ２細胞でＨ８Ｖ−１（Ｈｚｔ株）およびＨ８Ｖ−
２（０株）をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させた
。ウィルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分解
酵素Ｋによる消化とＣＳ　Ｃ／勾配により分離した（２
３）。

ｔ−ｉ　ｓ　ｖ−１およびＨ５Ｖ−２のｇＤ遺伝子のク
ローニング 先のマツピングおよびクローニング研究でＨ５Ｖ−１ｇ
ｏ遺伝子は〜６．６ｋｂのＢａｍＨＩ　断片につきとめ
られた（　６．２４　）。　Ｈｓ■−１をＢａｍＨＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動により６〜７ｋｂ領域
を分離した。この断片をＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ３
２２に連結（リゲーション）し、得られた混合物をＥ、
ｃｏｌｉ　２９４撫ＡＴＣ（４３１４４６）に導入した
。制限酵素消化により、好適なＨ５Ｖ＝１断片をめてア
ンピシリン耐性、テトラサイタリン感受性のプラスミド
をスクリーニングした。

正確なｇＤを含有するＳｓｔ　ｌ　断片を、５ｓｔ−１
゜で消化したプラスミドｐＦＭ３にサブクローンした（
ヨーロッパ特許公報、第００６８６９３号；１”９８３
年１月５日）。

Ｈ３Ｖ−２のダＤ遺伝子は先にＨ８Ｖ−１による組本換
えによりマツピングが行なわれているが、この遺伝子の
正確な位置はまだ判っていない。そこでＨ５Ｖ−２ゲノ
ムの短かい単一領域（４）からの二’１０　ｋ　ｂ　、
Ｈｉｎｄ　ｌ［断片を、２４クヶリオ、アージλクロー
ニングベクター５９０　（２５）　（７）　）ｒｉｎｄ
　Ｍ部位ぺ連結した。インビトロ（試験管内）でノ°ク
ツケージングしたファージを低密度でプレートに撤き１
−ｉｓｖ−１から得たｇＤ遺伝子の３２ｐ−標識サブク
ローンとＢｅｎｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ法によりスクリーニ
ングした（２６）。陽性のハイブリダイゼーションを示
したプラークを発育させ、ＤＮＡを分離し、サザーン・
プロツテイグおよび３２ｐ−標識Ｈ８Ｖ−１ｐＤ遺伝子
とのハイブリダイゼーション法によりｐＤ遺伝子の位置
をつきとめた（２７）。

ハイプリダイゼション陽性のＨ８Ｖ−２７；ＩＤ含有断
片をプラスミドｐｕｃ９へサブクローンした（２８）。

Ｈ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２ｇＤ遺伝子から得た種々の
断片をｍ１３フア一ジベクターｍ　ｐ　９ヘサブクロー
ンしく２９）、Ｓａｎｇｅｒ　のジデオキシヌクレオチ
ド法により配列決定した（３０）。

ヌクレオチド配列は８０Ｍプログラムを使用して解析し
た（３１）。推定したタンパク質配列のヒトロバシーは
１２幅（ｗｉｄｔｈ　）および１ジヤンプ（ｊｕｍｐ）
を使用して解析した（３１ａ）。

Ｈ’５Ｖ−１およびＨ５■−２から得たｇＤ領領域クロ
ーニング　□ 他の研究でＨ８Ｖ−１ｙＤ遺伝子はＲｏ　ｉ　ｚｍａ　
ｎの命名法に従い、５．５　ｋｂ　Ｂａｍ　’ＨＩ　Ｊ
　断片につきとめられた（６．１２．２４）。この断片
部分を分離して配列決定を行ない、この断片がＨ５Ｖ−
１ｆＤ遺伝子を含有することがわかった。Ｈ５Ｖ−１ｐ
Ｄ遺伝子のＤＮＡ配列はＨ５Ｖ−２ｙＤ遺伝子と比較的
相同的であると予想されるので、この断片をＨＳ　Ｖ　
−２ゲノムからのｇＤ遺伝子の分離のためのプローブと
して使用した。

Ｈ５Ｖ−１およびＨＳ　Ｖ−２ゲノ“ムからの遺伝子の
大部分は共直線的に配列していると思われるので（３５
）、Ｈ８Ｖ−ｉｇＤ領域に対応するＨ５ｖ−２のゲノム
の短かい単一の領域からの領域（Ｈｉｎｄｌ［Ｌ断片（
１２）　）ヲλファーシヘクターへＮクローンした。得
られたプラークを３２Ｐ−標識ＨＳ　Ｖ　７１９　Ｉ）
遺伝子サブクローンでスクリーニングすると陽性のハイ
ブリダイゼーションを示したプラークの存在することが
わかった。どのことは、二つのウィルスゲノムのこの領
域に、事実上核酸配列の相同性が存在することを示唆し
ている。

ファージＤＮＡを分離し、次いでサザーンブロツテイン
グ解析を行なうことにより、ｇＤ遺伝子に対応するこの
断片の領域が明らかにされた。この領域をＤＮＡ配列解
析のためサブク・ローンした。

暗号化領域 第１図は二つのｇＤＩ）ＮＡ配列をＩ−１０Ｍプログラ
ム（３１）と比較したものを示している。ヌクレオチド
番号の１番は、イニシェークーメチオニンのＡ　Ｔ　Ｇ
のＡから始めた。ギャップは、配列相同性を最大にする
ためにＨＯＭコンピュータープログラムにより導入した
（３１）。ヌクレオチドの相違は＊印で示し、アミノ酸
の相違は枠で囲んで示しである。ここに報告する）Ｉｓ
Ｖ−１のＨｚｔ　株で測定したＨ５Ｖ−１ｐＤ配列と、
Ｗａｔｓｏｎら（６）によりＰａ　ｔ　ｔ　ｏｎ株につ
いて報告された配列との間のアミノ酸の相違は十印で示
した。矢印で示したＨ８Ｖ−１ｇｏ遺伝子の転写開始は
Ｗａｔｓｏｎらによる（３２）。Ｎ−結合糖付加（グリ
コジル化）部位は陰影をつけて示しである。二つの可能
性のある“’ｒＡ　Ｔ　Ａ”配列はｇＤ転写開始への５
′で示されるが、第３の“ＴＡＴＡ”配列はＨ８Ｖ−２
配列の３′終末における２番目のオープンリーディング
フレームへの５′で示される。非暗号化配列の２つの相
同領域はｇＤ遺伝子への５′−位と、５Ｖ−２配列から
の２番目のオープンリーディングフレーム５′−位に記
録されるべきである。

ｆＩＤタンパク質のヒトロバシー 各糖タンパク質のヒトロバシーをＨｏｐｐら（３１ａ）
によって開発されたプログラムを使用して解析した。第
２図に示したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の
３′−末端に存在する。１２個の長さのアミノ酸鎖を解
析し、平均ヒトロバシーを計算した。二つの糖タンパク
質問の残基の相違のうち、コンサーバテイブな変化を＊
印、ノンコンサーバテイブの変化を→−印で示す。Ａ）
はＨ５Ｖ−１’ｊｙｏタンパク質のヒトロバシーを、Ｂ
）はＨ８Ｖ−２ｇＤタンパク質のヒトロバシーヲ示す。

ＤＮＡ配列分析の結果、ｎ５ｖ−１およびｎ５ｖ−２の
ｆ！Ｄタンパク質は８０％の相同性があることが明らか
にされた。これらの２個のタンパク質問で見出された相
違点の大部分はアミノ末端およびカルボキシル末端領域
にあった。これらのタンパク質のアミノ末端領域は、ア
ミン末端メチオニンの近くにアルギニン残基を含有する
高度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水性領域は、
分泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特徴的なシグ
ナル配列であり、また多分、少なくとも一部のタンパク
質を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグナル配列で
ある（３３）。最初の２０個のアミン末端アミノ酸の比
較から、１型と２型との遺伝子間には、総計で１２ケ所
の差違があることが示された。然し実質的には、すべて
の差異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗号化してい
るので、コンサーバテイプである。例外は、３番目の残
基のｇｌ　ｙ　−ａｒｇ置換と、７番目の残基ノａｒｇ
−ｇｌＹ置換である。これらの置換はコンサーバテイブ
ではないが、これらはシグナル領域の本質的な構造を変
化させるものではない。両遺伝子とも最初の１０個のア
ミノ酸の中にプラスの電荷を有する残基を保有している
。

ヒトロバシーの結果を図示した第２図では、疎水性の領
域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領域が見られ
る。この構造は膜結合型糖タンパク質の特徴であって、
以前にも他のウィルス表面抗原で発見された（５．３４
）。その働きは細胞膜およびウィルス膜にタンパク質を
固定することにあり、そのことからウィルス感染に重要
な役割りを果たす。ｊ９Ｄタンパク質のこの領域におけ
る１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２番目め
残基に見られ、それらの大部分はコンサーパティグであ
る。このことは、この領域のアミノ酸としての唯一条件
が、脂質二重層に架橋するために著しく無極性であると
いうことであることを示唆↓でいる。更に、恐らくタン
パク質を膜に固定させる働きをしていると考えられる膜
領域に続く領域（３６３〜３７５残基）　（３３）は、
最初の１３個の残基に５ケ所の変化を示し、その後に長
い相同鎖を有する。この結果から、カルボキシル末端親
水性領域の最初の１０〜１５残基は固定機能を果すだけ
であって、従って荷電されることだけが必要であるが、
一方、それに続く２３残基はｇＤタンパク質に特異的に
重要な何か他の機能を果しているのかも知れないことが
示唆される。

この二つのタンパク質の全体にわたり、他の多くのアミ
ノ酸変化が見られるが、その変化の大部分はコンサーバ
ティブである。この事実は、第２図に示したヒトロバジ
−プログラムによって現わされた構造によって強調され
る。この比較で見られるように、二つの糖タンパク質は
非常に近似した図形を示す。コンサーバティグでないア
ミノ酸変化はタンパク質のヒトロバシーを変化させない
ようである。

恒久的に膜結合したｐＤを生産する細胞系を確立するた
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈ
ｆｒ　）　、を含有しているヒト発現ベクター（３６）
へｐＤを含有する断片を連結した（第３図）。第３図は
、Ｈ８Ｖ−１糖タンパク質りの発現のために組み立てら
れたプラスミドｐｙＤ−ｄｈｆｒの図式を示す。この発
現プラスミドは、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉプラスミドｐＢＲ３２２から誘導された複製
超厚とβ−ラクタマーゼ遺伝子（ａｍｐ　ｒ）　（３７
）、５Ｖ−４０の初期（第一）プロモーターのコントロ
ール下にマウスのｄｈｆｒを暗号化したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
挿入体（３６，３８）、および同じ＜５Ｖ−４０初期プ
ロモーターのコントロール下にダＤ遺伝子を＊＊ｔ、ｒ
イｘ　Ｈｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ　５４．６　ｋｂ　
ＩＦｉ＃　’から成っていた。この断片のＨｉｎｄｌｌ
［終末は、イニシエーターメチオニンのコドン（’）　
５’−側へ７４ｂｐで位置しており、ｍＲＮＡのキャッ
プ部位を含有している。Ｂｉｎｄｌ［部位は、５Ｖ−４
０プロモーターノＧｏｌｄｌ）ｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ
ボックスの３′−側へ２５０　ｂｐで位置している。ｐ
Ｄを含有する断片の暗号化領域は１１７９　ｂｐの長さ
を有し、少なくとも翻訳停止コドン、ポリアデニル化部
位および糖タンパク質遺伝子（２４，３２）の一部を含
んでいる巨大（１、ｇｋｂ）な３′−領域に隣接してい
る。

プラスミドｐｇＤ、ｄｈ［ｒは次のように組み立てＨｉ
ｎｄ　■−ＢａｍＨＩ　断片を分離した（上記参照）。

ＳＶ４０に由来する初期プロモータおよびＰＢＲ３２２
アンピシリン耐性遺伝子から成る２、８ｋｂのＨｉｎｄ
　ｌ［−Ｓａｌ　ｌ断片およびＤＮＡ複製起原をプラス
ミドｐＥＨＢａＩ！１４から分離した。

第２の５ｖ４０由来の初期プロモーターのコントロール
下にあるマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡク
ローンを含有している２、ｌｋｂ　のＳａ／　ｌ　−Ｂ
ａｍＨＩ　断片をプラスミドｐＥ　３４８ＨＢｖＥ４０
０Ｄ２２（３６）から分離した。これら３個の断片はＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼを使用する三重連結法（トリプルリ
ゲーション）によって互いに連結し、得られた混合物を
Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　２　ｇ　４菌株への導入に使用した。

生成したコロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡを５ａ
ｃ２で消化することによりスクリーニングした。正しい
ＤＮＡコンストラクションｐｙＤ−ｄｈｆｒ　（第３図
）を次のトランスフエクショ′ン研究に使用した。

リン酸カルシウム沈澱法（４０）を使用して、このプラ
スミドをｄｈｆｒ生産欠乏のチャイニーズハムスター卵
巣細胞（ＣＨＯ）　（３９）へ導入した。

ヒボキサンチン、グリシン、およびチミジンを含まない
培地で発育し得るコロニーを採り、９個のｄｂｆｒ＋ク
ローンを分析した。これらのうち、５個のコロニーに、
抗Ｈ８Ｖ−１抗体を使用する放射免疫沈降法および免疫
螢光検定で、ｇＤが検出できた。この５個の系列のうち
の１個１’ＤＩ２）を更に次の研究用にあてた。クロー
ンしたｇＤ遺伝子生産物を特徴づけるために、１Ｄ１２
細胞を３５Ｓ　−メチオニンまたは３Ｈ−グルコサミン
で代謝的に標識し、放射免疫沈殿法により分析した。

使用した方法は次の通りである：市販の７％のウシ胎児
透析血清（Ｇｉｂｃｏ　）、ペニシリン（１００ｕ　／
ｒｎｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｕ／−）
を添加したＨａｍのＦ１２培地で細胞を発育させた。培
養が約８０％まで密集した状態°（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ
　）　になったら、培地を除き、細胞をリン酸緩衝食塩
液（ＰＢＳ）で２回洗滌した後、標識培地（１／１０規
定濃度のメチオニンまたはグルコースを含有するＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅの培地）を最終濃度ｏ、ｏ
６４ｉ／ｃ７ＩＩとなるまで添加した。３５５−メチオ
ニン（ＳＪ、２０４、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｃ　、　
）　（５０〜７５　μｃｉ／ｒｎｌ）または３Ｈ−グル
コサミン（１００μＣ４／ｄ）を加え、更に細胞を１８
〜２０時間発育させた。標識終了後、培地を回収し、細
胞をＰＢＳで２回洗滌し、０．０２％のＥＤＴＡを含有
するＰＢＳで処理することによって培養皿から除いた。

次いで細胞を、ＰＢＳ、３％　ＮＰ−４０，０，１％ウ
シ血清アルフルオリド、０．０１７ＴＩＵ／ｒｎｌのア
ポプロチニンから成る溶菌緩衝液に溶解し、得られた溶
解物を１２，０００Ｘｆで遠心分離により透明にした。

免疫沈降反応のために、細胞溶解液をＰＢＳで３倍に希
釈し、検液（典型的には１８０μｌ）を２〜５μｌの抗
血清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。免
疫複合体をＫｅｓｓｌｅｒ法（４０ａ）により、固定し
たＳ　、ａｕｒｅｕｓ細胞に吸着させ、１２．０００Ｘ
４で３０分間遠心分離して沈澱させた。次に、ｓ　、　
ａｕｒｅｕｓ細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ。

１％ＮＰ−４０，０，３％ドデシル硫酸ナトリウム）で
３回洗滌後、免疫複合体を２０μｌのポリアクリルアミ
ドゲル検体緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メル
カプトエタノール、ｏ、ｏｉ％ブロモフェノールブルー
を含有する６　２．５　ｍＭ　）、　リス−ＨＣ／バッ
ファー、ｐＨ６，８）で９０℃で３分間溶出した。３０
秒間遠心分離後、上清をＬａｅｍｍｌ　ｉの方法（４５
）に従い１０％ポリアクリルアミドスラブゲルにかけた
。

第５Ａ図はｆＤ１２細胞系とＨＳ　Ｖ　−１感染細胞で
得られたオートラジオグラフを比較したものである：ｐ
Ｄ１２細胞溶菌液と正常家兎血清から得た対照免疫沈降
（１列目）：ＨＥＬ細胞で発育・さ・せた野性（天然）
のｙＤと単クローン性（モノクローナル）抗ダ１）抗体
、５５−８（４１）との免疫沈降（２列目）、およびＡ
３４９細胞と５゛５−５の免疫沈降（３列目）；ダＤ１
２細胞の溶解液からのクローンしたｇＤと、多クローン
性ｔｉ　ｓ　ｖ−１家兎抗体（１）ａｋｏ　Ｃｏｒｐ、
　）の免疫沈降（４列目）、および単クローン性抗体５
５−５との免疫沈降（５列月）；３Ｈ−グルコサミンで
代謝的に標識したｇＤ１２細胞からのクローンしたｊ７
Ｄと多クローン性家兎抗Ｈ８Ｖ−１抗体の免疫沈降（６
列目）。

ｇＤ１２細胞系から、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１タンパクに
特異的な（４１）、単りローン性抗−９Ｄ抗体、５５−
５または家兎抗１−ｉｓｖ−１抗体を使用じて、５９．
１３Ｑｋｄの拡散バンドが特異的に沈澱したことが見ら
れる（４および５列目）。この分子量は、ｉｉ　ｓ　ｖ
　−ｉに感染させたＫＢ細胞（４２）から分離されたｇ
Ｄに関して報告された値とよく一致する。

同じ単クローン性抗体が、Ｈ５Ｖ−１に感染させたヒト
細胞系からの類似の、しかし分子量の異なるタンパク質
を沈降させるのが見られる。Ａ３４９生 ヒト肺癌細胞系から沈降させた生成物は５３　ｋｄ△ であり（２列目）、ヒト胎児肺細胞系（ＨＦ、Ｌ）から
沈降させた生成物は５５　ｋｄであった（３列目）。以
前の研究（４３）で、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ糖タンパク質の分
子量は宿主によって変化し、この相違は糖付加反応の相
違に起因することが示されている。ＣＩ′ｌＯ細胞で生
産された９Ｄタンパク質が実際に糖付加されているかど
うかを調べるために、細胞を３Ｈ−グルコサミンで代謝
的に標識した。３５５−メチオニンまたは３Ｈ−グルコ
サミンで代謝的に標識した後に、同一分子量のバンドが
沈降したことから（５および６列目）、ＣＨＯ細胞で生
産されたｐｉ）タンパク質は糖付加されていると結論し
た。

ヒト細胞系Ａ３４９（ＡＴＣＣＣＣＬ　１８５）および
ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３７）を、３．５ａ
ｎの組織培養皿で密に発育させ、Ｈ５Ｖ−１を細胞膜た
り１Ｑｐｆｕの多重度で感染させた。

ライ卆ス感染細胞はＣｏｈｅｎら（４４）の記載した方
法と同様の方法で標識した。感染させてから４時間後に
、培地を除去し、細胞を新しい培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏの改良Ｅａｇｌｅ培地）で１回、更に°リン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）で１回洗滌した。１／ｌＯ規定濃度のメ
チオニン含有する新しい培地を、３５Ｓ−メチオ＝　７
　Ｇ　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔ　１ｏｎ
ａｌ　）と共に、最終放射活性が培地−当たり７５μＣ
ｉとなるまで細胞に加えた。細胞を更に２０時間発育さ
せ、次にＥＤＴＡを含有する（０．０２％）ＰＢＳで洗
滌処理した細胞を回収した。ウィルス性タンパク質を、
ＰＢＳ、３％ＮＰ−４Ｑ、１％ウシ血清アルブミン、５
×１０−５Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、詔
よび０．０１７ＴＩＵ／−のアポプロチニンから成る溶
菌緩衝液に溶解した。得られた細胞溶解物を小型遠心機
で１２，０００×ダの回転数で遠沈することにより透明
にした。

免疫沈降反応を行なうため、細胞またはウィルスの溶解
液をリン酸緩衝液で３倍に希釈し、２〜５μｌの好適な
抗血清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。

抗原−抗体複合物を、固定した１０％Ｓ　、　ａｕｒｅ
ｕｓ　溶液（Ｋｅｓｓｌｅｒ（４０ａ）　）、の２５μ
ｊを加えることによって反応培地から除き、１２，００
０Ｘｆで３０秒間遠心分離して沈澱させた。次に、Ｓ　
、ａｕｒｅｕｓ細胞を洗滌用緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ
−４０，０，３％ドデシル硫酸ナトリウム）で３回洗滌
し、細胞を２０μｌのポリアクリルアミドゲルサンプル
緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタ
ノール、０．０６２５Ｍトリスバッファー（ｐＨ６，８
）、０゜０１％ブロモフェノールブルー）に懸濁させ、
９０℃で３分間インキュベートした。３０秒間遠心分離
（１，２００（ｌＸｇ）した後、上清を１０％ポリ↑ アクリルアミドスラブゲル（４５）にかけた。

クローンしたｐＤの翻訳後修飾（プロセシング）を更に
調べるために、パルスチェイス実験を行な°ちた。第５
Ｂ図は３５５−メチオニンでパルス標識した種々の時間
後の、ＦＤ−１２細胞からのクローン化したｐＤと家兎
抗ｔｉｓｖ、−１抗体（Ｄａｋ。

ｃｏｒｐ、）との免疫沈降線を示している。第５Ｂ図は
、Ｆ　Ｄ　１２細胞のパルス標識を示す。これらの研究
では、細胞は１０ｃｒｎの組織培養皿で密集して発育さ
せ、前記と同様にして３５３−メチオニンで標識される
が、標識化反応は氷上で１５分藺行ない、細胞は新しい
培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し、３７℃で種々
の時間インキュベートした。冷リン酸緩衝食塩液中で細
胞を洗滌することによって反応を停止させ、前記と同様
にして細胞を溶解した。タンパク質はパルス標識後、次
の時間で免疫沈降させた：１列目、５分後；２列目、１
５分後；３列目、３０分後；４列目、６０分後：５列目
、１２０分後。５１　ｋｄの分子量を有するｐＤの前駆
体型は、ｆＤ１２細胞系から、３５Ｓ−メチオニンでパ
ルス標識後、５分後から特異的に沈降し、この前駆体は
約６０分後により高い分子量型（５９ｋｄ）の所に追跡
された。これらの検討から、本発明者らは、この翻訳後
エベントのハーフタイムは約４５分と推定した。５１　
ｋｄバンドと５９　ｋｄバンドとの間の前駆体−生成物
の　−関係は、ウィルスが生産したｇＤに関する報告（
１４，４２，４６，４７）と非常によく似ており、また
このプロセスの反応速度は（：ｏｈｅｎ　らの記載（４
２）とよく類似している。ウィルス感染細胞における前
駆体と生成物の分子量の相違は、Ｎ−結合および〇−結
合オリゴサツカライドの双方に起因している（４８）。

ｇｌ〕が細胞表面へ輸送されるかどうか調べるために、
間接免疫螢光実験を行なった。これらの検討では、細胞
膜を透過せしめないような条件下（４９）で、固定して
いない細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗Ｈ３Ｖ−１抗
体と反応させた。ダＤ細胞と成体（親）ＣＨＯ細胞（１
：１の比）をカバーグラス（２，２ｘ　２．２ｃｍ　）
に載せ、細胞が約６０％密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　）
　するまで発育させた。Ｈｓｖ−１の抗体を含有するこ
とが判っているヒト血清（５０）をリン酸緩衝食塩液（
ＰＢＳ）で４０倍に希釈して、洗滌した細胞にその１０
０μｊをピペットで滴下し、増湿箱の中で室温で３０分
間インキュベートした。細胞をＰＢＳに３回浸漬して、
結合していない抗体を洗い去り、次に２０倍希釈′のテ
トラメチルロダミンインチオシアネートー標識ヤギ抗ヒ
トＩｇＧ抗体（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔ□ｒｉｅｓ
　）　ｌ　Ｑ　Ｑ　μｌｊと更に３０分間インキュベー
トした。結合しなかった標識抗体をＰＢＳで洗い去り、
細胞を氷冷した、５０％エタノールおよび１００％エタ
ノール中で脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセ
ロールで再水和した（４９）。次に細胞を螢光顕微鏡（
Ｚｅｉｓｓ　）で位相差および螢光光学下に検鏡した。

第４図のＡは、ｇＤ１２およびＣＨＯ細胞の位相差光学
的顕微鏡像であり、Ｂは、Ａと同じ細胞を螢光像で把え
たものである。位相差顕微鏡像き螢光顕微鏡像を比較す
ると（第４図）、ｇＩ）１２細胞は強く標識されている
のに対し、成体（親）ＣＨＯ細胞は標識抗体とほとんど
または全く結合しなかったことがわかる。Ｈ５Ｖ抗体に
対してネガティブであることが知られている正常マウス
血清、正常家兎血清、またはヒト血清で行なった対照実
験では、何ら特異的な細胞の標識は検出できなかった。

これらの検ｄ」から、７Ｄは細胞表面へ輸送されること
が示唆された。細胞膜を透過させ得ることが知られてい
る薬剤（メタノールまたはアセトン）で標識する的に固
定したＣＨＯおよびｌｉｌ’Ｄ細胞での実験では、異な
った標識パターンが得られた。これらの検討で、抗ＥＩ
　Ｓ　Ｖ　−１抗体によるｆＤ１２細胞の強い核周囲標
識が観察されたが、ＣＨＯ細胞では何ら特異的な標識化
が見られなかった。

ｇＩ）　１２細胞がヒトのＨ３Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２
感染に対し適切な抗原決定基を発現するかどうか決定す
るために、抗Ｈ５Ｖ−１抗体または抗ＨＳ　Ｖ−２抗体
を有することが判っている個体（５０）から得た抗体の
結合性を検討した。代謝的に標識したｇＤ１２細胞から
得られた細胞溶解物の放射免疫沈降反応ては、け−歯頚
の抗Ｈ５Ｖ血　ｉ清で得られた結果に匹敵し得る結果を
得た（第５図）。同様に、ヒト抗Ｈ５Ｖ−、１血清は、
間接的免゛疫螢光測定法により、特異的なｆｉＤＬ２細
胞の８Ｒ化を示す（第４図）が、成体ＣＨＯ細胞系を標
識化しなかった。これらから、種々のけつ歯頚の抗Ｈ８
Ｖ−１および抗Ｈ５Ｖ−２抗血清、単りロ鳶ン性抗ｇＤ
抗体およびヒト抗Ｈ８Ｖ抗血清によって得られた結果は
、！ｆＤ１２細胞表面に発現されたｉＤは、野性の該ウ
ィルスと共通した多くの抗原決定基を有しており、しか
もこれらの決定基の構造は他のＨ５Ｖ−１タンパク質と
の相互反ビトロ（４１）およびインビボ（５１）でＨ５
Ｖ−１を中和することが知られている事実は、ＣＨＯ細
胞で生産される９Ｄが野性のウィルスと共通した中和抗
原決定基を少なくとも１個は有していることを示してい
る。

実施例２ この実施例は、実施例１で得られたｙＤ１２細胞を、酵
素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ　−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｐｔｏｎ　ａｓｓａｙ　：　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ
　）　（５２）で、ｇＤ１２細胞と結合した抗−Ｈ３Ｖ
抗体の結合を定量するための、サンドインチ型イムノア
ッセイに用いる方法に関するものである。

ｆＤ１２細胞に対する抗Ｈ５Ｖ抗体の結合を定量的に測
定するために酵素標識イムノソープションアッセイ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐｔｉ
ｏｎａｓｓａｙ　）　（ＥＬＩ　ＳＡ）が開発された（
５２）　Ｏ今回の研究では、９６穴のマイクロタイター
組織培養平板を使用し、！Ｄ１２細胞とＣＨＯ細胞を交
互の穴に加え、化学的に固定した。次にＨ８Ｖに対する
抗体を有することが判っている種々の抗血清を連続的に
逐次希釈して加え、固定した細胞と反応させた。測定の
終末点て、各穴の吸光度を測定し、正常な結合曲線を作
成した。ｇＤ１２細胞に対する抗体の特異的な結合は、
ｇＤ１２細胞で得られた値から成体ＣＨＯ細胞で得られ
た値を減じることによって決定した。高い力価の血清に
よる特異な結合はｉ　：　ｔｏ、ｏｏｏ　に希釈して検
出することができた。

ｇ　ｌ）　１２細胞ＥＬＩ　ＳＡ測定法を使用して測定
した血清力価を、通常の方法により決定した抗即ち、血
液凝集阻止反応（ＩＨＦ　）または補体結合反応（ｃｐ
）でＨ５Ｖに対する力価測定を行なったヒト血清（５０
）を逐次希釈し、ｇＤ１２細胞、系または成体ＣＨＯ細
胞系を含有するマイクロタイター板の孔に加え、抗１ｉ
１Ｄ抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。ｆＤ１２
細胞と、ＣＨ・０細胞は９６大のマイクロタイター組織
培養平板（Ｆａｌｃｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ　）　の穴に
交互に植え、１０％ウシ胎児血清を加えたＦ１２培地（
ｃｌＢｃｏ）中で、密集して発育させた細胞をリン酸緩
衝食塩液（ＰＢＳ）で３回洗滌し、次に０．０６２５％
グルタールアルデ七ドを加えたＰＢＳで化学的に固定し
た。細胞は再度ＰＢＳで３回洗滌し、所望の時期まで、
１％ウシ血清アルブミン、１００ｍＭグリシン、１　ｒ
ｎ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｎ　３　を含有するＰＢＳ中で４℃で
貯蔵した。抗ｐＤ抗体力価を測定するには、細胞をＰＢ
Ｓで洗滌し、逐次希釈した抗血清を固定した細胞と室温
で１時間反応させた（最終容量５０μ／）。結合しない
抗体を洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシダーゼ（
Ｔａｇｏ　Ｉｎｃ、）とカップリングさせたヤギの抗ヒ
トＩｇＧ（１：２０００希釈）５０μｌとインキュベー
トした。酵素を結合した抗体を室温で１時間反応させ、
次に細胞をＰＢＳで３回洗滌した。インキュベーション
の後、ペルオキシダーゼの基質１、Ｏ−フェニレンジア
ミンを加え（２００μｌ）、更に１０分間反応を進行さ
せた。２．５ＭＨ２５０４（５０μｌ）を加えて反応を
停止し、各穴の反応液の吸光度を自動プレートリーディ
ングスペクトロフォトメーター（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　）
で測定した。第６図において、白丸および黒丸で表わし
た血清は、１２８のＨ５Ｖ−１ｃｉ”力価、および４０
９６のＨ８Ｖ−１およびＨＳ　Ｖ　−２のＩＨＦ力価を
示している。白の四角および黒の四角で表わした血清は
、８以下のＨＳカ フ−”０′劇８’Ｊ２ｔＴＯＨＳ　Ｖ−””、Ｉｇｕｓ
　。

Ｖ−２ＩＨＦ力価を示している。Ａ図の黒丸および黒の
四角はｆＤ１２細胞との結合を示し、白丸および白の四
角はＣＨＯ細胞との結合を示す。８図の黒丸および黒の
四角は、Ａにおける値を差引いて算出したｆＤ１２細胞
への特異的な結合を示す。第６図から、通常の方法によ
る測定で高い抗Ｈ８Ｖ力価を示した血清は、ＥＬＩＳＡ
法でも高い九個が得られるが、一方、低い抗Ｈ５Ｖ力価
の別の血清ではｇＤ１２ＥＬＩＳＡで検出し得る結合が
得られないことが判る。

記載した検討から、安定した細胞系列は、゛ヘルペスウ
ィルス感染によって生じる抗体と結合するトランスフェ
クト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現することが
証明された。

種々の選択マーカーを用いたトランスフェクション（Ｄ
ＮＡ感染）を行なうことができる。例えば、マウスＬ細
胞は、通常、変異体ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとし
てトランスフェクトされ得る。

ｐＤ遺伝子を、その様なマーカーを有する（ｈａｒｂｏ
ｒｉｎｇ　）　ベクターを介して上記の細胞にトランス
フェクトした。

ｐＤ１２の様な細胞系を用いることができ、特に、ｔ−
１ｓｖ−１およびＨ３Ｖ−２感染症の臨床的な診断に用
いるとよい。診断薬開発の可能性は、クローン細胞系が
出現することに基づいている。

何故ならば、それによって安定で、充分に定義づけられ
た、抗原の再生産源が供給されることになるので、培養
の必要性並びに感染性物質による汚染のおそれがなくな
るからである。細胞基盤の診断系をＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ
型で行なうときには、抗体の決定は２時間またはそれ以
内で完了することができ、血清の必要量は５０μｌ以下
である。

実施例３ この実施例は発現された膜−結合タン／ｓ、６り質から
の膜の除去に関するものである。

上記の記載は膜−結合ｇＤタンパク質の生産に関するも
のである。しかしながらＦｉｇ、２’１％ｔ、て△ 既に論じた様に、Ｈ８Ｖ−１およびＨ３Ｖ−２のｐＤタ
ンパク質のアミノ酸配列の分析により、これらの各々は
疎水性／親水性カルボキシ−末端の膜結合領域において
同一であることがわかった。

ＨＳ　Ｖ　−１糖タンパク質（ｙＤ）の模式図遺伝子配
列から導かれたｙＤ遺伝子配列のヒトロバシー解析（３
１ａ）から、タンパク質の疎水性領域（陰影部分）およ
び親水性領域（十印）が決定された。膜に局在し、結合
するのに重要であ名と思われる領域だけを示した。機能
的領域は、ａ）シグナル配列（３３）、ｂ）疎水性の膜
透過領域；Ｃ）荷電している膜固定領域である。推定さ
れる３ケ所のＮ一連結糖付加部位はＧの文字で示す。発
現プラスミドは、ＰＢＲ３２２の細菌性複製起源とアン
ピシリン耐性遺伝子、５Ｖ４Ｑ初期（第一）プロモータ
ーの転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子を暗号化しているｃＤＮＡ挿入体（６３
）、および第２の５Ｖ４Ｑ初期プロモーターの転写コン
トロール下にあるｙＤの最初の３００アミノ酸を暗号化
しているＨｉｎｄｌｌｌ−Ｈｉｎｆｌ　断片から成る。

この断片のＨｉｎｄｎ１部位ｉ；！、ｐＤ遺伝子のイニ
シエーターメチオニンノ５′−位側へ７４　ｂｐ　に位
置している。５Ｖ−４９の初期領域ベクターのＨｉｎｄ
ｎ１部１位’（３６１は５Ｖ４ＱプロモーターのＧｏｌ
ｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックスの３′−位置へ２
５０　ｂｐ　に位置して′いる。Ｈｉｎｆｌ　部位（Ｋ
ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼと４デオキシヌク
レオチド−３リン酸で平滑化した）を、Ｂ型肝炎ウィル
スの表面抗原遺伝子の３′非翻訳領域のＨｐａ１部位（
３６１へ連結（リゲーション）する。この方法は先端切
断Ｈ５Ｖ−２遺伝子を生産するのにも有用である。得ら
れた配列は、ｙＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ後に停
止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端切断ｙＤ遺伝子転
写のための転写停止およびポリアデニル化部位は、Ｂ型
肝炎表面坑原遺伝子の３′非翻訳領域（淵により暗号化
されている。

プラスミドｐ　ｇ　Ｄ　ｔｒｕｎｃ　、　ｄ　ｈｆｒ　
は次のようにして組み立てられた。ｙＩ）を含有してい
る２、９キロベースのＳａｃ　１断片を、Ｓａ（１で切
断したプラスミドｐＦＭ３（前述）中でＨ８Ｖ−１ゲノ
ム（前述）からクローンしたＢａｍＨ１断片から分離し
た。完全なｙＤ遺伝子を含有する１、６　ｋｂ　Ｈｉｎ
ｄＩｌｌ　−−ＢｓｔＮｌ　断片を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
　−Ｂｓ　ｔＮ　１　で消化したＰＦＭ４２　（Ｅ　Ｐ
　Ｏ特許出願第６８６９３号）へサブクローンした。次
に、このプラスミドをＨｉｎｆｌで切断し、Ｋｌ　ｅｎ
ｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼと４姻のデオキシヌクレ
オチド−３リン酸で平滑化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで
切断した。先端を切断したｙＤ遺伝子を含有する９６０
塩基対（ｂｐ）のＨｉｎｄ　ｍ−プラント（平滑化）Ｈ
ｉｎｆｌ断片を分離し、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｈｐａｌで
消化したｐＥＨＢａ１１４へ連結した。得られた組み立
て体（ｐｙＤｃｏｓ−ｔｒｕｎｃ　）は、その３プライ
ム末端にＢ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子を持った先
端切断ｙＤ遺伝子を含有していた。先端を切断されたｙ
Ｄ遺伝子を含有する２、　３　ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ｌｌ
ｌ　−ＢａｍＨ１断片をｐｙ、Ｄｃｏｓ−ｔｒｕｎｃ　
から分離した。５Ｖ−４９由来の初期プロモーターおよ
びｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子および細菌性複
製起源を含有する２、８ｋｂ断片をプラスミドｐＥＨＢ
ａｌ　１４から分離した。第２の５Ｖ−４Ｑ初期プロモ
ーターの転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸
レダクターゼＣＤＮＡクローンを含有する２、　１　ｋ
　ｂ断片をプラスミドｐＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２
（３６１から分離した。これら３個の断片をＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼで連結し、得られた混合物をＥ、ｃｏｌｉ　
細菌株２９４への導入に使用した。得られたコロニーか
ら得たプラスミドＤＮＡを５ａｃ２てスクリーニングし
、正確に組み立てられたｐｙＤｔｒｕｎｃ、ｄｈｆｒ（
第８図）を更にトランスフェクション研究に使用した。

プラスミドｐＥＨＢａｌ１４は、５Ｖ−４０−肝炎ウィ
ルスのキメラ遺伝子であるｐＥ３４２△Ｒ１（後述）を
×ｂａＩで開裂することにより、一度ＨＢＶ表面抗原の
暗号化領域において開裂し、引続きこのＸ　ｂａＩ　部
位の周囲の配列をヌクレアーゼＢａ１３１を使用して除
去することにより組み立てた。このプラスミドを合成オ
リゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＴＧＡＡ−１”ＴＣの存
在下でライゲートした。これにヨリ、ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ
　ＡにＨｉｎｄＩＩｌ制限部位が加わる。

得られたプラスミドを、〜１５０ｂｐのＥｃｏＲｌ−ｔ
ｌｉｎｄ　ＩＩＩ断片についてスクリーニングした。

ｐＥＨＢａ１１４の配列決定をし、Ｂｉｎｄｎ１部位は
ＨＢｓＡｙ開始コドンが標準的に見出される場所のすぐ
上流の位置に存在することが確かめられた。この、よう
に、この組み立てにより、クローンするのに好適な独特
のＨｉｎｄ　ｍ部位が、高度に発現されるタンパク質（
ＨＢｓ　Ａｙ　）の翻訳開始位置に置かれる。タンパク
質を高度に発現するのに必要ななんらかの推定されるシ
グナルが、この５′−リーダ配列上に存在するはずであ
る。

ＨＢＶ表面抗原を発現するプラスミドｐＥ３４２（ｐＨ
Ｂｓ　３４８−Ｅとも呼ばれる）は、ＥＰＯ公報第００
７３６５６号（１９８３年３月９日）にＬｅｒｉｎｓｏ
ｎらにより記載されている（簡単に説明すると、Ｓ　ｉ
ｍｉ　ａｎウィルス５ｖ４０の起源は、５ｖ４ＱＤＮＡ
をＨｉｍｄ　［１で消化し、：ｌＩ　ンハータ−（ＡＧ
ＣＴＧＡＡＴＴＣ）を加えることによりＨｉｎｄｌｎ末
端をＥｃｏＢＩ　末端へ変換することによって分離した
。このＤＮＡをＰｖｕＩＩで切断し、Ｒ■リンカ−を加
えた。次いでＥＣＱＪで消化した後、起源にまで及ぶ３
４８　塩基対（ｂｐ）の断片をポリアクリルアミドゲル
電気泳動法および電気溶出法により分離し、ｐＢＲ３２
２にクローンした。ＨＢＶをＥｃｏＢＩおよびＢｙｆｆ
ｌで消化して得られた１９８６ｂｐ断片（Ａｎｉｍａｌ
　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　（Ｃｈ、５）Ａｃ
ａｄ、Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９８０））　（これは
ＨＢｓＡｙを暗号化している遺伝子にまで及ぶ）をプラ
スミドｐ　Ｍ　Ｌ　（Ｌｕ５ｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ、　
２９３　：　７９（１９８１））のＥｃｏＲｉとＢａｍ
ＨＩ部位にクローンすることによって、発現プラスミド
ＰＨＢＳ　３４２−Ｅを組み立てた。（ｐＭＬ　は、サ
ル細胞におけるプラスミド複製を抑制する配列を欠失し
たｐＢＲ３２２の誘導体である）。次に、得られたプラ
スミド（ｐＲＩ−Ｂｙｌ　）をＥｃｏＢＩとつなぎ、５
ｖ４０の起源領域を表わす３４８ｂＰの断片をｐＲＩ−
Ｂｐｌ　のＥｃｏＲ１部位へ導入した。起源断片はどち
らの方向からでも挿入できる。この断片は複製起源だけ
ではなく、初期および後期５Ｖ４Ｑプロモータの両方を
暗号化しているので、ＨＢＶ遺伝子はこの方向によって
どちらかのプロモータのコントロール乍に発現されるこ
とができる（ＨＢｓを表わすｐＨＢ５−３４８　Ｅは初
期プロモーターのコントロール下に発現される）。ｐＥ
３４２は、ＥｃｏＲＩで部分消化し、ｋｌｅｎｏｗ　Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩを使用して切断部位を充填し、プラ
スミドの背後同志を連結（リゲーション）し、ｐＥ３４
２のＳＶ４０起源に先行するＥｃｇＲＩ部位を除くこと
により修飾された。得られたプラスミドはｐＥ３４２°
△Ｒｉと命名した。

得られた配列はｙＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ後に
停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端を切り取ったｙ
Ｄ遺伝子の転写停止部位とポリアデニル化部位は、Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原の非翻訳３′領域（ト）によって
暗号化されている。

生成したベクターをｄｈｆｒ　ＣＨＯ細胞系（ト）へト
ランスフェクション（ＤＮＡ感染）させ、先端を切り取
ったｙＤタンパク質を生産し、それを周囲の媒質へ分泌
する好適なりローンｙＧ１０．２を選択した。タンパク
質を媒質から抽出し、細胞の免疫原性活性を試験した。

第９図に、細胞内および細胞外の３５５−メチオニン標
識抽出物の免疫沈降試験の成績を示す。

市販の透析した７ｃｌ）のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）
。

ペニシリン（１００ｕ　／ｍｌ　）、およびストレプト
マイシン（１００ｕ／ｍｌりを添加したＨ　ａ　ｍのＦ
１２培地（Ｇｉｂｃｏ）　に細胞を発育させた。培養が
約８０％に密・集した時に、培地を除去し、細胞をリン
酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗滌し、標識培地（１／
１０規定濃度のメチオニンを含有するＤｕ　Ｉｂｅｃｃ
ｍにより改良されたＥａｇｌｅ　培地）を最終濃度０．
０５１ｎｌ／ｄとなるまで加えた。３５ｓ−メチオニン
（ＳＪ。

２０４　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔ、）を最終濃度
５０〜７５ｕ　Ｃｉ　／　ｍｅ　となるまで加え、細胞
を１８〜２０時間発育させた。標識後、培地を回収し、
細胞をＰＢＳで２回洗滌り、、０．０２＜ＥＤＴＡを加
エタＰＢＳで処理することにより培養皿から除いた。次
に細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４Ｑ、０．１％ウシ血清
アルフミン、５Ｘ１０−５Ｍ　フェニルメチルスルホニ
ルフルオリド、および０．０１７　ＴＩ　ｕ／ｍｅのア
ポプロチニンから成る細胞溶解緩衝液に溶解し、得られ
た溶解液を１２．０００Ｘｐで遠心分離することにより
透明にした。免疫沈降反応に使用するため、細胞溶解液
をＰＢＳで３倍に希釈し、検液（、標準的には１８０μ
Ｉ　）を２〜５μｌの抗血清と混合し、４℃で３０分間
インキュベートした。

分泌型のｙＤを免疫沈降するため、５００μｌの条件培
地を２μｌの抗血清と３０分間、４°Ｃ゛でインキュベ
ートした。免疫複合体はｋｅｓｓｌｅｒの方法（４０ａ
）により固定したＳ、ａｕｒｅｕｓ細胞に吸着させ、１
２．０００Ｘｐで３０分間遠心分離して沈降させた。次
に、Ｓ、ａｕｒｅｕ９細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ、１％
ＮＰ−４Ｑ、０．３％ドデシル硫酸ナトリウム）で３回
洗滌し、免疫複合体を２０μｌのポリアクリルアミドゲ
ルサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メル
カフトエタ／　−／ｌ／、０．０１％ブロモフェノール
ブルーを含有スる６２．５ｍＭ　）リス＝Ｉ（ｃｚ　緩
衝液（ｐＨ６，８’　）　’）　で、９０℃で３分間溶
出した。３０秒間゛遠心後、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（４
５）に従い、上清を１０％ポリアクリルアミド平板（ス
ラブ）ゲルに掛けた。

Ａ　：　ｙ　Ｄ　１２細胞系から得た全膜結合型ｙＤの
免疫沈降線。Ｂ：２個の別個に誘導した細胞系（１およ
び２）の溶解液から得た先端切断ｙＤの細胞連合型の免
疫沈降線。Ｃ：Ｂに示した２個の細胞系の培養上清から
得られた先端切断ｙＤの免疫沈降線。（−）は、対照家
兎抗血清を示し、（＋）は、家兎抗Ｈ８Ｖ−１抗血清を
示す（Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐ）。

図に見られるように、３５，０００　ダルトンの細胞内
型、および分泌され、明らかに糖付加されている細胞外
２Ｄタンパク質が明瞭である。

免疫感作に使用する先端切断ｙＤの製造ｙ　Ｄ　１０．
２　細胞を、ポリスチレン製回転組繊培養゛瓶（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ　２５１４０）で、市販の透析した７％ウシ胎
児血清、５０μｙ／ｒｎｅのストレプトマイシン、およ
び０．３μｙのグルタミンを添加したＦ１２培地中で密
に発育させた。密生後、培地を除き、ウシ胎児血清を含
まない同じ培養液で３回洗滌し、２　ｍｇ／　ｍｅのｆ
（ｅｐｅｓ　緩衝液（血清を含まない培地）を添加した
。細胞を血清を含まぬ培地中で３〜４日発育させ、次に
条件付き培地を回収して、−２０℃で貯蔵した。培地を
３７′Ｃで融解し、５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳ　−３ｏ−タ
ーで２０分間５００　ｒｐｍで遠心した。遠心後、ペレ
ットは破棄し、上清はＹ、Ｍ−５限外濾過膜を備えた限
外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。得られた標品
を出発物質と比較して約１５０倍に濃縮したところ、■
ｌ当たり約８■のタンパク質を含有していた。次にこの
標品をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ　）でよく透析し、そ
れ以上精製することなく免疫感作に使用した。

先端を切断されたタンパク質を診断に適用することには
、それが細胞外の培地中に分泌されたものであるために
、全細胞標品中に存在するものよりもはるかに少ないタ
ンパク質で汚染されているにすぎない、という利点があ
る。

本発明においては、タンパク質の生産に永久細胞系（ｐ
ｅｒｍａｎｅｎｔ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）　を用いる
点が注目されるであろう。トランスフェクションに際し
、ベクターは細胞系のゲノムに取り込まれ、該細胞系は
細胞溶解を起こすことなくそのタンパク質を生産するこ
とができる。この細胞系は上記の如くタンパク質の連続
的な生産、特に細胞から分泌される様な先端を切断され
た形のタンパク質の連続的な生産に用いることができる
。例えば、先端の切断されたタンパク質を発現する細胞
を、潅流系内に入れ、抗原に富む培地を細胞の周囲から
除き、新らしい培地と置き換えることを連続的に行なう
ことにより、継続的に使用することができる。

ここで用いる特殊な細胞系はｄｈｆｒの生産を欠くＣ１
１Ｏ系細胞にｄｈｆｒマーカーを含有するベクターをト
ランスフェクトした細胞系である。適当な条件（５４）
の下で細胞系をメトトレキセート（Ｍｔｘ　）にさらす
ことにより、ｄｈｆｒの生産、従って結合したｙＩ）タ
ンパク質の生産が増幅される。

先端を切断されたｙＤ遺伝子のｄｈｆｒｃＨｏ　細胞へ
のトランスフェクトにより導かれた３つの細胞系を平板
上に並行におき、３５Ｓ−メチオニンで標識し、免疫沈
殿に付した結果を第２図に示す。図中、第１列および第
２列はメトトレキセートによる選択に先立って独立に単
離した２個の細胞系から調整した５００μｌの培地から
免疫学的に沈殿させた、分泌ｙＤの量を示すものである
。第３列は１，２５０　ｎＭのメトトレキセート中での
増殖に基ついて選択した１つの細胞系（９Ｄ　１０．２
．２　）から調整した等量の培地で免疫学的に沈殿させ
た先端切断ｙＤの量を示すものである。第１〜３列の場
合には、免疫沈殿にウサギ抗−ｔ−ｔｓｖ−１抗体（Ｄ
ａ　ｋｏ　Ｃｏｒｐ　）を用いた。第４列はｌｌｉ’Ｄ
１０．２．２細胞系の５００μｌの培地から健常なウサ
ギの血清で免疫沈殿させて調整した対照で挑る。

メトトレキセート中での選択の前、並びに後における細
胞系により、培地中に分泌される先端を切断されたｇｔ
Ｄの相対量を定量するために競合的ＥＬＩ　ＳＡ分析を
行なった。膜結合形ｙＤを発現するｙ−Ｄに細胞を平板
から取り、９６個のくぼみを有する微量力価検定用プレ
ートの表面に、前記の如くゲルタールアルデヒドと共に
固定した。先端の切断されたｙＤを生産することがわか
っている種々の細胞系から調整した培地を微量検定用プ
レートの横方向に連続的に希釈して配し、一定量（２ｔ
ｔｌ）のウサギ抗−Ｈ８Ｖ−１抗体（Ｄａｋ。

Ｃｏ　ｒ　ｐ　）と共に、２０℃で１時間インキュベー
トした。各くぼみをＰＢＳで３回洗浄することにより非
結合状態の抗体と可溶性の、先端切断ｙＤ−抗体コンプ
レックスとを除いた。次いで固定細胞を、ヤギの抗−ウ
サギＩｇＧ　と結合した西洋ワサビのペルオキシダーゼ
と２０℃で１時間反応させ、ｐＢＳ　で３回洗浄して結
合しなかった抗体を除いた。次いで比色用の基質である
０ＰＤ（ｏ−ｐｂｅｎｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　）
を各くぼみに加え、結合した西洋ワサビペルオキシダー
ゼ−抗体コンプレックスと１５分間反応させた。硫酸を
最終濃度が０、２５　Ｎになる様に加えて反応を終結さ
せた。各くぼみのＯＰＤの吸光度を、自動微量力価検定
プレートスキャナー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ｍｕｌｔｉｓ
ｋａｎ　）を用いて測定し、希釈曲線をプ・ツトした。

抗−Ｈｌｓｖ−１抗体のＣＨＯ親細胞系への結合を、各
希釈物における非特異的な結合を知る目安とした。

各′培養上澄み中の先端切断ｙＤの齢は、各くぼみにお
ける吸光度に反比例する。白丸（○）は、メトトレキセ
ートで増幅する前の先端切断ｙＤ分泌細胞によって調整
された培地の存在下における抗Ｈ８ψ−１抗体のｐＤｌ
　２細胞への結合を表わす。

黒丸（＠１）は、２５０　ｎＭのメトトレキセート中で
の増殖に基づいて選択されたｙＤｌｏ、２．２細胞によ
って調整された培地の存在下での抗Ｈ８Ｖ−１抗体のｙ
Ｄ　１ｏ、　２．２への結合を示すものである。

白四角（ロ）は、増幅されていない先端切断ｙＤ分泌細
胞から調整した１００倍濃縮培地の存在下における抗−
Ｈ８Ｖ−１抗体のｐＤｌ　２細胞への結合を示している
。この工程は、２５０　ｎＭのＭｔｘ　中で増殖可能で
あり、親細胞のｐＤｌｏ、２゜細胞系よりも約２０倍多
量の先端切断２Ｄを培地に分泌することのできる増殖細
胞系ｐＤ１０．２．２を生産するｙＤｌｏ、２細胞系に
関して行なった（第１０．１１図参照）。

ｄｈｆｒ標識／増幅系は外来性ＤＮＡを得、安定的に取
り込むことのできる他の細胞についても用いることがで
きる。

本発明において、膜との結合に関与する疎水性−親水性
カルボキシ末端領域部分を欠（／Ａた、先端。

を切断された形の膜結合タンｔ、ａり質を実際に示すこ
とに成功した、ということは他の免疫性膜結合　・型タ
ンパク質についても同様の結果が期待でき、かくしてウ
ィルス、寄生虫そ−の他の病原性微生物に対するワクチ
ンのより優れた供給源を与え得る、ということを免疫学
的に示唆するものである。

先の実施例において、ｙＤタンパク質のＤＮＡは、制限
部位（制限酵素切断部位）が存在するので、残基（ｒｅ
ｓｉｄｕｅ）　３００の位置で好都合に先端を切断され
た。その結果、第２図の７１イドロノくシー図かられか
る様に、カルボキシ末端の疎水性／親水性領域が完全に
除かれた。実際は、それに先行する残基３０１〜３３２
領域も除去されているが、このことは該タンパク質の免
疫学的な特性を破壊しないように思われる。従って、こ
のタンパク質、およびおそらく他の免疫学的な膜結合性
タンパク質についても、そのタンパク質が周囲の培地′
に分泌され得る様、膜結合性を除くのに有効である限り
において、その切断程度を所望によりかなり少なくする
ことができる。

実施例４ 実施例４はＨ５Ｖ−２ｙＣタンパク質（以前はｙＦタン
パク質と命名されていた１、）に関する。

細胞、ウィルス、およびＤＮＡ分離 Ｈ８Ｖ−２（Ｇ株）を０．１のインプット多重度ＨＥＰ
２細胞に感染させた後この細胞培養を、１０％のウシ胎
児血清および抗生物質を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改
良Ｅａｙｌ培地で３日間、３３℃で増殖させた。Ｈ５Ｖ
−２ＤＮＡは、前述のようにプロテイナーゼにで消化し
、Ｃ８Ｃ１超遠心により分離した（２３）。

ＤＮ醪詐 制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリヌクレチオドキナーゼ
はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓから
購入し、提供者の指示に従って使用した。

Ｅ（ＱＲｌで消化したＨ８Ｖ−２ＤＮＡを５呪ポリアク
リルアミドゲルで処理することにより、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ
　−２ゲノムの地図でほぼ０．６５０の位置に相当する
ＥｃｏＲｌ“Ｐ”断片を分離した。分離した断片を、Ｅ
ｃｏＲｌで消化したｐｕｃ９（２８）ヘクローンした。

このプラスミドはｐｕＣ−ＲＩＰ　と呼ばれた。

次に、ｐＨｃ−ＲＩＰサブクローンを、Ｅ（ＱＲｌ”Ｐ
”断片を含有するＨ５Ｖ−２ゲノムの５ａ（ｌ断片の位
置を突き止めるのに使用した。サザーンブロツテイング
実験（２７）によって、Ｈ３Ｖ−２の４．９ｋｂｓａｃ
ｌフラグメントがＥｃｏＲｌ”Ｐ”断片を含有している
ことがわかった。この断片を０．７％アガロースゲルで
分離し、独特の５ａｃ１部位（５５）を含有しているｐ
ＢＲ３２２誘導プラスミドヘクローンした。このプラス
ミドはｐＢＲ５ａ　ｃ　１−Ｅ”と呼ばれた。更に、ｐ
ＢＲ８ａｃ１−“Ｅ”の制限酵素分析によりＥｃｏＲｌ
”Ｐ”断片と配列相同性を有する２、９ｋｂの５ａｌｌ
断片が証明され、前述と同様にして５ａｌｌで消化され
たｐｕＣ９へサブクローンした。このプラスミドはｐ　
ｙ　Ｃ２Ｓ　ａ　ｌ　２−９と呼ばれた。

クローンしたＨ５Ｖ−２ＤＮＡのＤＮＡ配列解析ＤＮＡ
配列の大部分はジデオキシヌクレオチドチェｉンターミ
ネーション法を使用して決定した。

種々の断片を複製型のｍ１３　ファージベクター、ｍｐ
７、ｍｐ８、およびｍｐ９　にサブクローンし、′前述
したようにＤＮＡ配列を決定した（２９）。幾つかの場
合には、断片を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレ
アーゼを用いてその５′−位を３２ｐで標識し、断片の
ＤＮＡ配列を化学的分解法を使用して決定した（５６）
。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコンピュータを使用す
る解析は８０Ｍプログラムを用いて実施した（５７）。

推定したアミノ酸配列のヒトロバシーは１２アミノ酸幅
、１ジヤンプ法を使用して解析した（３１ａ）。

制限エンドヌクレアーゼでＩ（ＳＶ−２ＤＮＡを消化し
、プラスミドＤＮＡを１．５％アガロースゲル上で分画
し、標準的な方法でニトロセルロース上にプロット（移
し換え）した。第１２図で星印を付した５ａｃ２断片の
一本鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ１のｋｌｅｎｏｗ断片で
充填し、１尋られた平滑末端断片を、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを使用して、Ｓｍａｌで消化されたｍ１３ｍ７複製型
（２９）に連結（、ライゲーション）した。このライゲ
ーションおよびトランスフェクションにより調製された
ー、ｉｌ［ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ■のｋｌｅｎ
ｏｗ断片を使用し、高い特異的活性（ＩＸＩＯｃｐｍ／
μｇ）を有する３２ｐ−標識一本鎖プローブＤＮＡの合
成の鋳型として使用した。ハイブリダイゼーションは標
準的な方法を使用した（２７．５８）。

結果 ニング １−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−２のｙＦ遺伝子を分離するのに採ら
れた方針は、この遺伝子がＨＳ　Ｖ　−１ｙ　Ｃ遺伝子
と共直線的（コリニア−）であるという仮定に基づいて
いた。この仮定は、Ｈ８Ｖ−１の糖タンｔＸ６り質Ｃと
抗原的に相関性のある７　５，０００ダルトンの糖多ン
パク質ｙＦがＨ８Ｖ−２中に発見されたこと、およびこ
のタンパク質のための遺伝子がＨｓｖ−１ｙｃ遺伝子と
ほぼ共直線的であると言う最近の知見によって支持され
ていた（２２ｄ、５９）。

また、Ｈ５Ｖ−１ｙｃおよびＨ５Ｖ−２９Ｆの双方に結
合する単クローン性抗体が分離されたことは、この二つ
のタンパク質が相互に相同的であるかも知れないことを
更に示唆している（２２ｆ）。

従って、ＨＳ　Ｖ　−ｙ　Ｃ遺伝子と共直線的であるＨ
ｓｖ−２ゲノム領域のＤＮＡ配列を解析すれば、ＨＳ　
Ｖ　−２ｙＦ　遺伝子の配置を突き止めるタンパク質配
列情報の手簡りが得られるであろうと考えられた。

Ｈ８Ｖ−２ゲノムの６００塩基対のＥ（ＱＲｌ”Ｐ”断
片は〜０．６５０の位置に存在することがわかった（１
２）。この領域は、Ｈ８Ｖ−１ゲノムの約０．６３０〜
０．６４０に位置するＨ８Ｖ−１ｙｃ遺伝子の既知の暗
号化領域（５９）とほぼ共直線的である。

コノ断片はＨ８Ｖ−２ＤＮＡｃ７）ＥＣＯＲＩ消化物か
ら分離され、プラスミドｐｕｃ９（２８）にクローンさ
れ、そのＤＮＡ配列が決定された（２９．５６）。

得られた配列をＨｓｖ−１ｙｃ配列と比較すると（５９
）、ＥｃｏＲｌ“Ｐ”断片とｔ−１ｓｖ−１ｙｃ暗号化
領域の３′−末端の間に高度の配列相同相性が見られた
。それ故、Ｈｓｖ−１ｙｃ遺伝子と相同性であるＨｓｖ
−２遺伝子の残りの部分も十分に含んでいるＥｃｏＲｌ
“Ｐ”断片と重複しているＨ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡから
、５ａｃｌ制限工ンドヌクレアーゼ断片を分離するプロ
ーブとして、このＥｃｏＲｌ”Ｐ″を使用した。第１２
図には、ＥｃｏＲｌ”Ｐ”断片を含んでおり、ＤＮＡ配
列解析に使用した２、９ｋｂの５ａｉｌ断片をＨ５Ｖ−
２ゲノムから分離するのに要した手順を図示した。

列解析 ＥｃｏＲｌ”Ｐ”断片との配列相同性に基づき、Ｈｓｖ
−２ゲノムから分離した４、３ｋｂの５ａ（１＠Ｅ”断
片を更に消化して、２．９ｋｂの５ａｌｌ断片を得　１
て、これをｐ　９　Ｃ２Ｓ　ａ　１２．９　と命名した
。第１２図は、ジデオキシヌクレオチド配列決定法（２
９）または化学的分解法（５６）のいずれかによりＤＮ
Ａ配列解析が行なわれたＰｆ　Ｃ２Ｓａ　Ｉ　２．９か
らの断片を示している。更にこの図は、Ｐｆ　Ｃ２５ａ
　ｌ　２．９ノ中のＥ（ＱＲＩ”Ｐ″断片位置と同時に
、Ｈ８Ｖ−ンゲノムの〜０．６２８の位置のＢｙｌＩＩ
“Ｎ”　断片の右側末端に相当するＢｙ１１１部位の位
置を示している（１２）。

更に詳細に述べると、第１２図は、ＨＳ　Ｖ−１ｙｃと
共直線的に配置しているＨ８Ｖ−２領域、ＰｙＣ２Ｓ　
ａ　１２．９のクローニングを示している。〜ｏ、６１
〜０．６６に配置しているＨ８Ｖ−ゲノムの領域は、６
００塩基対のＥ（ｏＲｌ”Ｐ”断片をプローブとして使
用し、５ａｃｌ断片（ｐＢＲ−５ａｃ″Ｅ”）とシテク
ローンした。ｐＢＲ８ａ　ｃ”　Ｅ　”のサブクローン
、ｐ　ｙＣ２Ｓ　ａ　Ｉ　２．９　はＤＮＡ配列解析に
使用した。

矢印は配列化された領域を表わし、その配列から誘導さ
れた主な４７．９アミノ酸のオープンリーディングフレ
ームの位置が図示されている。ＥｃｏＲｌ”Ｐ”　断片
を略示するＥ（□Ｒ１部位、およびＢｐ１２゛Ｎ″断片
の右端にあるＢｙ１２　部位（地図の〜０．６２８の位
置）（２６）を含む種々の制限部位が示されている。星
（★）印で示しであるＳａｃ　２断片は、この領域に出
現する欠失を調べるために行なったサザーンブロツテイ
シー験に使用した（結果参照）。

Ｓｍ　；　Ｓｍａｌ　、Ｓａ　；　５ａｃ２　、Ｒｓ：
Ｒｓａｌ、Ｂｙ；Ｂｙ１２．Ｐｖ；Ｐｖｕ２　、ｔｔｌ
　；　ＥｃｏＲｌ　などの他の部位はＤＮＡ配列決定実
験に使用した。

第１３図はＰｙＣ２Ｓａｌ　２．９から得られたＤＮＡ
配列をｔ−ｔｓｖ−１ｙｃ領域のＤＮＡ配列（５９）と
比較して示している。Ｈ５Ｖ−＝ｌｙＣ領域（Ｈ８Ｖ−
１）とｐｙＣ２Ｓ　ａ　１２．９から得た配列（Ｈ５Ｖ
−２）はｌ−Ｉ　ＯＭプログラム（５７）を用いて比較
した。種々の欠失は配列の重複を最大化するのに使用さ
れたから、わかり易くするためにスペースを含むすべて
の位置に番号を付けた。星印は一致しないヌクレオチド
の上に付けた。Ｈ８Ｖ−１配列の４３位にある下線を引
いた”Ａ”残基は、７ＣｍＲＮＡのほぼ転写開始部位で
ある（５９）。”ＴＡＴＡ”１、オヨび−ＴＡＴＡ”２
ｉｔ、それぞれＨｓｖ−１ｙｃｍＲＮＡ　と７３０塩基
ｍＲＮＡの転写コントロール領域と推定される（５９．
６０）。Ｈ５Ｖ−１配列の１７２８の位置に挿入された
Ｔ残基は、この領域の配列再決定により発見され（Ｍ、
Ｊａｃｋｓｏｎ　、未発表）、それはＨ’５Ｖ−２の主
オープンリープイン、グフレームの停止コドンと相同で
ある１７３５〜１７３７の位置にインフェース停止コド
ンを導入するものであることが明らかにされた。第２Ｈ
５Ｖ−２開始コドンの位置が１９７５〜１９７７で゛あ
るように、Ｈ８Ｖ−１の７３０塩基ｍＲＮＡ開始コドン
の位置は、２０３２〜２０３４に示されている。

再び第１３図において、Ｈ８Ｖ−２の図示された誘導配
列をＨ５Ｖ−１のｙＣ遺伝子領域のＤＮＡ配列（５９）
と比較すると、これら二つの断片間の全体的な配列相同
性は約６８％であった。然しなから配列のある一定の領
域を見ると、配列相同性の程度は他に比較してはるかに
高いか、または低かった。例えば、Ｈ８Ｖ−１とＨ８Ｖ
−２の０〜５７０位の配列は僅かに５１ｅｆＤの相同性
しか示さないが、５７０−’１７４０位の領域は、遥か
に高い配列相同性を示した（８０呪）。もう一つの相同
性の高い領域（７０％）は二つの配列の終りの１９７５
位〜２４１９位に見出された。ヌクレオチド配列の変化
に加えて、二つのゲノムを相互に比較すると、種々の欠
失または挿入が見られた。最も顕著なのはＨＳ　Ｖ　−
ｌ　ｙＣ配列の３４６〜４２６の位置に見られる８１塩
基対の領域が、Ｈ８Ｖ−２ゲノムでは失われていること
であった。この全体的な配列比較から、ここに配列決定
を行なったＨ８Ｖ−１ｐｃ領域とＨＳ　Ｖ、　−２領域
との間には高度の配列相同性があることが示された。

Ｆｒ１ｎｋら（５９）は、Ｈ５Ｖ−１ｙｃを暗号化して
いる２、５２０塩基ｍＲＮＡの５′−末端が、第１３図
の４３位の下線を引いたＡ残基にマツプ（配置）するこ
とを発見した。更に、彼らは、この残基の約２２塩基対
（５′）にＡＴに富んだ“ＴＡＴＡ”ボックス（６０）
を指摘している。第１３図に示した二つの配列を比較す
ると、Ｈ３Ｖ−１とＨ８Ｖ−２の配列は共にこの領域に
同一の配列、ＣＧＧＧＴＡＴＡＡＡを含んでいることを
示している。この配列は、これまで決定された多くのＨ
８Ｖ−１およびＨＳ　Ｖ二２配列中の“ＴＡＴＡ”ボッ
クス領域に存在することが見い出されている先のＷｈｉ
ｔｔｏｎ　らの報告（６１）の配列と一致する。この保
存配列に続いて、両ウィルスゲノムともＧに富んだ領域
がある。この推定上の転写コントロール領域のほかに、
第２のＴＡＴＡ”ボックスが第１３図の二つの配列の１
８４５〜１８４９の位置に見出された。この第２の”　
ＴＡＴＡ”ボックスはＨ５Ｖ−１ゲノ゛ムにおいて７３
０塩基ｍＲＮＡ　の転写をコントロールするものと推定
されている（５９）。Ｈ８Ｖ−１とＨ５ｖ−２は共にこ
の配列を含んでおり、それは第一のＴ　Ａ　Ｔ　Ａ”ボ
ックスの前にあるＣＧＧＧ配列と類似したＣＧＧＧＣＧ
配列を含むＧＣに富んだフランキンク配列に囲まれてい
る。史に両ゲノムとも、この第２の”　ＴＡＴＡ”ボッ
クスの３′にオープンリーディングフレームを暗号化し
ており、これについては後に論じる。

前述した８１塩基対の欠失がＨ５Ｖ−２ゲノムに実際に
見出されるのか、或いはクローニングまたは配列決定の
実験中に起こる人為的なものなのかどうかを決定するた
めに、ＨＳ　Ｖ　−２ゲノムＤＮＡおよびクローンした
Ｈ３Ｖ−２ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析を実施
した。失われた８１塩基対の領域にまたがる５ａｃ２断
片（第１２図の断片参照）から３２ｐ−標識プローブを
調製した。もしＨ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の
領域を欠失しているならば、この領域にまたがるＳｍａ
ｌ−Ｂｙｌ　断片は５７６塩基対となり、Ｓｍａ１断片
は６６２塩基となり、５ａｃ２断片は１９５塩基対とな
るであろう。

第１４図は、Ｈ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡとＰｉｉｉ”２Ｓ
ａ１２．９ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析を示す
。第１３図に示したＨ５Ｖ−２配列中、脱落している８
１塩基対領域にまたがる領域（Ｈ８Ｖ−２の３４６〜４
２６の位置）を、欠失領域に重なり合う第１２図の星印
で示した５ａｃ２　断片を使用して解析した。１〜３列
はＨ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡの制限消化物であり、４〜６
列はｐｙｃ２Ｓａ１２．９の制限酵素消化物である。消
化されたＤＮＡは１．５％アガロースゲルで電気泳動し
、変性”し、ニトロセルロースにプロットし、３２ｐ　
ｇ識５ａｃ２断片でプローブした。（矢印は、ファージ
λＤＮＡの５６４塩基対のＢｉｎｄｌＩ［断片の位置を
示す）。１列および６列目；　Ｓｍａｌ　＋Ｂｙｌ　２
：２列および５列目；　Ｓｍａｌ　：　３列および４列
目；’５ａｃ２　。

第１４図に示された結果から、予測した制限部位がＨ３
Ｖ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨ　Ｓ　Ｖ　−
２Ｄ　Ｎ　Ａの双方において、８１塩基対を欠失してい
る領域を囲んでいることが明らかになった。更に、Ｈ３
Ｖ−２ゲノム断片およびクローンした断片は正確に伴移
動（コマイブレート）シており、欠失がクローニングま
たは配列決定における手技によって人為的に起こったも
のでないことがわかった。

Ｈ５Ｖ−２の２．９ｋｂＳａｌｌ　断片に含まれティる
潜在的暗号化配列を解析し、第１３図に示したＨ５Ｖ−
２配列の１９９〜２０１の位置に暗号化されているメチ
オニンから始まり、この図のＨ８Ｖ−２配列の１７３５
〜１７３７　の位置のＴＡＡ停止コリこ終る４７９個の
アミノ酸から成るオープンリーディングフレームを明ら
かにした。第１３図から判るように、ｔ−１ｓｖ−１ｐ
ｃタンパク質とＨｓｖ−２オープンリーデイングフレー
ムは、共に二つの配列の、”　ＴＡＴＡ″ボックス相同
に対してほぼ同じ位置から開始する。更に、最初この領
域に存在するＨ８Ｖ−２オープンリーデイングフレーム
はｔｉｓｖ−１ｙｃ遺伝子の前の１２コドンで終ると考
えられていたがＨ８Ｖ−ＩＦ株のｙＣ遺伝子配列のカル
ボキシル末端領域の配列を再決定することにより（Ｍ　
、　Ｊａｃｋｓｏｎ、未発表）、Ｆｒ１ｎｋら（５９）
＋こよって報告された配列は１７２７の位置の後のチミ
ジンヌクレオチドを見落としていたこと、およびこの残
基を挿入すると、翻訳したｔ−１ｓｖ−１ｙｃタンパク
質はＨ５Ｖ−２オープア、−アイアゲ７Ｌ／−４□、所
、第□３゜。　１１７３５〜１７３７）で終了する翻訳
されたＨ５Ｖ−１ｙＣ蛋白質となることが明らかになっ
た。このよう°にして、種々の欠失および挿入を考慮す
ると、第１３図に示したように、Ｈ５Ｖ−１ｙｃ遺伝子
とＨ８Ｖ−２のオープンリーディングフレームは非常に
高度の重なりを示す。

、第１５図は、Ｈ８Ｖ−２大−オープンリーディングフ
レームの翻訳と、Ｈｓｖ−１ｙｃアミノ酸配列との比較
を示す。アミノ酸は１文字略号法を使用して表わした。

１−ｉｓｖ−１ｙｃは１−ｉｓ゛ｖ−１ｐｃ配列を意味
し、Ｈ８Ｖ−２ｙＦはＨ８Ｖ−２オ一プンリーデイング
フレーム配列を意味する。

タンパク質は８０Ｍプログラムを使用して比較し、間隙
の場所は、所望により相同体を最大化して挿入した。相
同でないアミノ酸の上に星印を付した。

Ｎ−結合糖タンパク質と推定される部位（ＮＸＳ、４ま
たはＮＸＴ）（６２）には陰影を付け、システィン残基
（ｃ）　は枠で囲んだ。空間部分（スペース）を除き、
アミノ酸だけに番号を付けた。図１５Ｂは、２番目のＨ
５Ｖ−２オープンリーデイングフレームの翻訳およびＨ
８Ｖ−１７３０塩基ｍＲＮＡタンパク質との比較を示す
。７３００ＲＦＨ８Ｖ−２は、第１３図に示したＨ８Ｖ
−２配列の１９７５〜２４０６　の位置から誘導された
第２のＨ８Ｖ−２オープンリーデイングフレームの不完
全アミノ酸配列である。７３Ｑ　ＯＲＦ　Ｈ５Ｖ−１は
、Ｈ３Ｖ−１の７３０塩基ｍＲＮＡ（５９）によって暗
号化されたタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。

第４Ａ図および第４Ｂ図のいずれにおいても、電荷に関
して保守（コンサーブ）されているアミノ酸変化には（
ｃ）印を、電荷に関して保守（コンサーブ）されていな
い変化には（Ｎ）印を付けた。

第１５図には、Ｈ８Ｖ−１＠Ｃ遺伝子と４７９アミノ酸
Ｈ８Ｖ−２オ一プンリーデイングフレーム間の高度の配
列相同性を図示している。最初の１９個のアミ、ノ酸は
、電荷に関してすべて保守的（コンサーバテイブ）であ
る最初の２５個のアミノ酸の変化を伴ない、約８０％の
配列相同性を含んでいる。Ｈｓｖ−１ｐｃの１２４番目
の残基（ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−２配列の９００番目残基）
から両タンパク質の末端まででは、電荷に関して保守的
（コンサーバテイブ）である７５％のアミノ酸変化を伴
°なう約７４％の配列相同性がある。Ｎ一連結糖付加が
推定される５ケ所の部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ（６２）
　）は、両タンパク質問で保守（コンサーブ）され、７
個のシスティン残基はすべてＣ末端に対し枇同的な位置
に局在している。タンパク質の力・ルボキシル末端基の
３／４における全般的な配列の［Ｆ４　（コンサーベー
ション）に加えて、２゜残基の長さにわたる大きい領域
のアミノ酸配列の＋Ｘ発的な相同性もある（即ち、ＨＳ
　Ｖ　−１の３８５〜４０５の位置の配列（！ｌ：Ｈ８
Ｖ−２の３５２〜３７２の位置の配列）。この配列の比
較からＨ５Ｖ−２ゲノムのこの領域のオープンリーディ
ングフレームは、ｔ−１ｓｖ−１ｙｃ　と相同なタンパ
ク質を暗号化されていると結論して良い。

この領域に暗号化されているＨ３Ｖ−２タンパク質はＨ
５Ｖ−１ｙｃ配列と著しい配列相同性を示しているが、
一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべき差異がある
。最も際立った差異は、Ｈ８Ｖ−１ｙｃ配列における５
０〜７６残基から見出される２７個のアミノ酸がＨ５Ｖ
−２配列に欠失している（第１５図）ことであり、これ
は先に記述した８１塩基対の欠失に対応する。この大き
い欠失のほかに、面配列には１個または２個のアミノ酸
から成る短かい欠失が見られる。これらの欠失のすべて
はタンパク質のアミン末端領域に見出される。これらの
欠失のほかに、Ｈ８Ｖ−１ｙｃ配列の２９〜１２３残基
の間（Ｈ５Ｖ−２配列の３１〜９０残基）に頻発するタ
ンパク質のアミノ末端領域には多くのアミノ酸の変異が
ある。

この領域ではアミノ酸の３０％だけが相同性であり、こ
の相同の多くは保守（コンサーブ）されたプロリン残基
に起因している。この領域に見出されるアミノ酸置換の
４３％は電荷に関して非保守的（ノンコンサーバテイブ
）である。そのような多数の変異を示す唯一の他の領域
はカルボキシル末端−疎水性領域（Ｈ５Ｖ−１配列の４
７６〜４９６残基およびＨ８Ｖ−２配列の４４３〜４６
３残基）であり、そこではタンパク質の５５％が相同性
であるが、すべての変化が保守（コンサーブ）され、荷
電されず、疎水性のアミノ酸であり、ますこ該タンパク
質のカルボキシル末端では配列の僅ｈ）２５％だけが相
同であるが、全般的なアミノ酸の構成は相似している（
Ｈ５Ｖ−１の５００〜５１２残基オヨびＨ８Ｖ−２（７
）４６７〜４７ｃ＋残基）。

二Ｑのタンパク質問には５ケ所のＮ−結合糖付加推定部
位が保守（コンサーブ）されているが、一方Ｈ５Ｖ−ｙ
Ｃ配列ハ１（ＳＶ−２配列より２ケ所含んでいる部位が
多い（総計９ニア）。Ｈ′５ｖ−１ｙｃ配列には、Ｈ５
Ｖ−２部位からは欠失している２７個のアミノ酸中に２
ケ所のＮ−結合糖付加部位と、第１５図の１０９〜１１
２残基間に１対の重複している部位が含まれている。Ｈ
８Ｖ−２配列はＨ５Ｖ−１配列には見られない２ケ所の
Ｎ−結合糖付加部位を含んでおり、その１個はアミノ末
端領域の近くにある。

Ｈ５Ｖ−１配列とＨＳ　Ｖ　−２配列間に起こり得る構
造上の相同性を一層充分に吟味するために、ヒトロバシ
ー解析を実施した（３１ａ）。第６図に、Ｈ５ｖ−１ｙ
Ｃタンパク質とＨ８■−２主−オープンリーディングタ
ンパク質のヒトロバシー解析を図示する。各タンパク質
のヒドロノドシーはＩ（ｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ　（３
１ａ　）のプログラムを使用して測定した。中央線より
上方は疎水性領域、中央線より下方は親水性領域である
。１２個ずつのアミノ酸を解析し、その平均ヒトロバシ
ー値を計算した。

アスパラギン一連結線付加推定部位（６２）を（○）印
で示した。ｙＣ−１：Ｈ５Ｖ−１ｙｃ　タンパク質ヒド
ロノドシー。ｙＣ−２（ｙ−Ｆ）　：　Ｉ（ＳＶ−２主
−、ｔ−フンリーディングフレームヒトロバシー。

両タンパク質が、アミノ酸配列の親水性と疎水性の性質
に基づいた極度の構造上の相同性を示すことを第１６図
に示す。各図において、Ｎ−末端疎水性領域の後には親
水性のアミノ酸鎖が続いており、それぞれ総計９個のう
ち６個（Ｈ８Ｖ　−１）または総計７個のうち３個（Ｈ
８Ｖ−２）のＮ一連結線付加推定部位を含んでいること
を示している。この親水性領域に続くピークと谷は、最
後のＮ−結合糖付加部位を含む親水性領域を含めて両タ
ンパク質とも非常に相似している。両タンパク質のカル
ボキシル末端領域は非常に疎水性の２０残基領域を示し
、その後にカルボキシル末端領域が続いている。Ｈ５Ｖ
−１ｙｅにだけ見出される２７個の近接するアミノ酸は
５０〜７６残基間に比較的親水性の領域を暗号化されて
いるようであるぐ第１６図）。以上結論すると、この解
析によってＨ５ｖ−１ｙｃとＨ５ｖ−２タンパク質の両
者のヒドロノぎシー像は非常に相似１ており、これらタ
ンパク質の最低に保守（コンサーブ）されたアミノ末端
面域は高度に糖付加を受ける電位を有する親水性領域に
見出されることが明らかにされた。

解析 第２図に示したＨ　Ｓ　Ｖ　−２配列の最終４３１塩基
対（１９７５〜２４０６　残基）の翻訳によって１０５
アミノ酸から成る第２オープンリーデイングフレームが
明らかに成った。ここに報告する配列情報は、Ｈ８Ｖ−
２第２オープンリーデングフレームの全部を十分に把握
しているわけではないが、この配列をＦｒ１ｎｋら（１
ｏ）が報告したＨ５Ｖ−１の７３０塩基ｍＲＮＡ　によ
り暗号化されたオープンリーディングフレームと比較す
ると、この場合もまた高度の相同性を示している。第４
Ｂ図で明らかなように、二つの配列は重なり合う領域で
は７５％の配列相同性を示し、またそのアミノ酸変異の
約９０％は電荷に関して保守的（コンサーバテイブ）で
ある。二つの配列の主な差異は、Ｈ８Ｖ−２に見られる
１９アミノ酸Ｎ−末端領域がＨ８Ｖ−１配列には見出さ
れない点である。従ってこの領域に暗号化されている機
能は不明であるが、Ｈ５Ｖ−１とＨ８Ｖ−１から得られ
るタンパク質はかなりの配列相同性を示している。

考察 上記の結果は、Ｈ５Ｖ−２ゲノムが共直線的に配置して
いるＨ５Ｖ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化されて
いることを証明している。ここに見出された配列の共直
線性は、Ｈ’５Ｖ−１の７３０　１塩基対ｍＲＮＡの同
族体（１ｏ）を明らかに暗号化されているＨ８Ｖ−２の
主−オープンリーデングフレームの３′　配列の発見に
よって強化される。

）ＩＳＶ−２７Ｆ遺伝子ノｌｌ前の地図作成（３３）は
、ここに記載した数ケ所の潜在性のＮ−結合糖負荷部位
と、明らかなアミノ末端シグナル配列（５）、および推
定カルボキシル末端膜透過領域（２８）を包含するＨ８
Ｖ−２ゲノムの主・オープンリーディングフレームの性
質の双方によって、ここに記載したＨ８Ｖ−２タンパク
質は糖タンパク質ｙＦであると結論される。更に、翻訳
されたＨ′Ｓ　Ｖ　−２タンパク質の大きさく〜５２．
０００ダルトン）は、エンドグリコシダーゼＨで処理し
たＨ８Ｖ−２１Ｆの天然の大きさとして報告されている
値（５４，０００ダルトン）と近似している。最後に、
広範囲にわたるアミノ酸配列の相同性と、数ケ所の潜在
性Ｎ−結合糖付加部位および７個のシスティン残基すベ
テノコ〜−ベーション（保存性）はＨ５Ｖ−１ｙｃとＨ
８Ｖ−２ｙＦ間の構造的和動性を示している。

これらの結果は、Ｈ８Ｖ−２９Ｆ　、！：Ｈ８Ｖ−１ｙ
Ｃは主として型特異性であるが、それらは型共通性の決
定基を有していることを証明した以前の成績（１７，２
２ｄ、２２ｆ、４３）を説明することを助ける。２，３
の以前の研究（１７，１８゜４３）で、これらのタンパ
ク質が型特異性抗体を優勢に誘導することを証明してい
るので、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグ
ナル配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見出
されるのは理屈にあっている。分岐領域の潜在性のＮ−
結合糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質（
６２）から、これらの領域がタンパク質表面に位置する
ことが示唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外
側へ暴露していることは、これらの分岐抗原決定基（エ
ピトープ）に対する型特異性抗体の生成に対する役割り
を果しているのかも知れない。然し、ｆ？Ｃと１Ｆの間
で保守（コンサーブ）されている親水性領域がタンパク
質の外側へ暴露することができ、１例において糖付加さ
れている（ｔ−ｔｓｖ−１ｙｃの３６３〜３６６残基お
よびＨ８Ｖ−２ｙＦの３３０〜３３２残基）ことがあり
得るので、型共通性抗体もタンパク質の３／４　のより
高度に保守（コンサーブ）されているカルボキシル末端
によって生成される可能性がある。このように、１−ｔ
ｓｖ−１ｙｃ　とＨＳ　Ｖ−２ｐＦは型特異性および型
共通性決定基の双方を共有しているが、型特異性決定基
の方がより抗原性でへるようである。

ｙｃとｙｖの型特異性および型共通決定基の説明は知ら
れていないが、タンパク質には少なくとも二つの機能、
即ち、その一つは両ウィルスの生存率に重要である型共
通性領域、またはその一つは各ウィルスの型に特異的で
ある型特異性領域である。ｙＣおよびｙＦの機能は現在
のところ不明であり、生存し得るｙＣマイナスのＨ８Ｖ
−１突然変異株がインビトロで分離されているが（６５
）、ヒト宿主のインビボ感染期間および潜伏確立期間に
おいて、ｙＣまたは２Ｆのいずれが必要不可欠であるの
かは明らかでない。Ｈｓｖ−１およびＨ８Ｖ−２の間で
、感染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物学的な差異
の少なくとも幾つかはｇｉＣとｐＦのアミノ末端領域間
の著しい構造的差異に由来するであろうことは考えられ
る。例えこれらタンパク質の機能的な知識が全くなくて
も、異なつた選択圧がｙＣおよびｙ−Ｆの分岐領域と保
守（コンサーブ）領域に作用するに違いないと結論して
も良かろう。

）１ｓＶ−１およびＨ８Ｖ−２のｇｌＤ遺伝子の配列に
関する以前の比較（５８）で、アミノ末端シグナル配列
（６３）とカルボキシル末端膜透過領域（６４）は置換
アミノ酸が疎水性である限り多数の突然変異に耐容し得
ることを証明した。ｙＣおよびｙＦの配列比較により、
ｙｃの４７９〜４９６残基とｙＦの４４３〜４６３残基
からカルボキシル末端、推定膜透過領域（６４）で同様
の知見が示された。この領域における多くの非対応性疎
水性置換体は、ｙＤの場合のように、脂溶性であるアミ
ノ酸ならばこの領域に耐容できることが示唆される。然
しなから、ｇＩＤとは対照的にｙＣとｙＦのアミノ末端
シグナル配列は最初の１９残基で高度に相同である。こ
のようにこの領域は、糖タン守（コンサーブ）された機
能を持つか（５）、或いは保守されねばならないゲノム
のこの領域に、重複する遺伝子または他の機能的な配列
がある（６６）かである。

完全な比較をするにはＨ８Ｖ−２配列が不充分であるが
、ＨＳ　Ｖ　−１ｙｃ　ｍＲＮＡ転写開始への５′領域
は、Ｈ５Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２ゲノムの双方とも同じ
ＣＧＧＧＴＡＴＡＡ配列を示す。更に、面配列とも、そ
れに続いて転写開始の直前のＧに富んだ領域がある。こ
のように、ｔｉｓｖ−１およびＨ５Ｖ−２のｙＤ遺伝子
で以前に発見されたように、二つのウィルス型間の上流
配列に相同性が存在しており、このことはこれらの領域
がこれら遺伝子の転写調節に関与している可能性を示唆
している。両ウィルスゲノムに見出され、多分７３０塩
基ｍＲＮＡの転写をコントロールしていると思われる（
５９，６０）”ＴＡ’ｒＡ”ボックス相同性も、Ｈ５Ｖ
−１とＨ８Ｖ−２における比較的高度な配列相同性を示
しているのは興味深い。第１３図に示したように、この
ＴＡＴＡ”ボックスの前にあるＣＧに富んだ配列が来る
が、これは第一のＴ　Ａ　Ｔ　Ａ“領域の前にある配列
と相似しているが、全く同一ではなく、それらの後にい
ずれも〜８０％の配列相同性を示す１４塩基対の領域が
続く。全般的な配列相同性は〜７５幅であるのに対し、
この領域を囲む全領域の相同性は僅かに３３塩基対であ
る。もしこの領域が７３０塩基ｍ　ＲＮＡの転写調節に
関与するのならば、転写調節因子による認識には比較的
短かい配列で充分であるようである。

結論として、これらの結果はＨｓｖ−１７ｃおよびｉ■
Ｓ　Ｖ　−２ｙＦ糖タンパク質が高度にホモローガスな
関係にあり、それらが型−共通性並びに型−特異性領域
を暗号化していることを証明するものである、といえる
。また、これらの２種のタンパク質はまさに有意な配列
の相同性を示し、しかもマツプ上で共直線性を有するよ
うに思えるので、ｌ−ｌ５Ｖ−２ｐＦ　を［（ＳＶ−２
９ＣまたはｙＣ−２と改名することについてのＺｅｚｕ
ｌａｋと５ｐｅａｒ（２２ｄ）　の提案を支持するもの
である。さらに、ここで報告した配列に関するデーター
は、２Ｃ−１およびｙｃ−２タンパク質を、これら２種
のりンパク質問の種々の型特異性領域をインビトロで相
互に変換し、得られたキメラ配列を哺乳類細胞内で発現
させる（６７）、あるいはこれらの領域をウィルスに再
渡取り込ませる（６８）ことにより、７ｃｍ１およびｙ
ｃ−２タンパク質を機能的に分析する方法を開示するも
のである。

クローンされたｙｃ−２糖タンパク質顛はミ実施例１で
述べたｙＤの発現と同様にして発現せしめることができ
る。ｙｃ−１に対して型特異性である配列を有するが、
ｙｃ−１およびｙｃ−２に対して型共通性の配列は除外
されているようなｙｃ−２のフラグメントが、Ｈ８Ｖ−
２からＨ８Ｖ−１を区別するための診断薬として極めて
有用である。

以下の参考図書、および本明細書中に、その都度文字お
よび数字でそれぞれ付加的に引用した参考文献を参照と
して示した。

８、　Ｒｏｓｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３０．
７５３　（１９８２）。

１１、　Ｎｏｒｒｉ　Ｉｄ、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９０，６７　（
１９８０）、　’１２、　Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｃｅ１１
１６．４８１　（１９７９）。

１５、　Ｅｂｅｒｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ、　３６．６６５　（１９８０）。

２２ｆ、Ｚｗｅｉｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、　４７．１８５　（１９８３）。

２７、　Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、　９８．５０３　（１９７５）。

２Ｂ、　Ｖｉｅｉｒａ、　ｅｔ　ａｔ、、Ｇｅｎｅ　１
９．２５９　（１９８２）。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ｐ、　３１１゜ ３２、Ｗａｔｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、Ａ
ｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１１．１５０７．（１９８３）。

４０、　Ｇｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ
、　５２．４５６．　（１９７３）。

および５５−５は、ＤｒｌＭａｒｔｉｎ　Ｚｗｅｉｇ　
ｏｆ　ｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、　ＮａｔｉｏｎａｌＣａ
ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ
、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２１７０１１こより提供された
。

４２；’　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、　３６．４２９　（１９８０）。

４３、　Ｐｅｒｅｉｒａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）７８
、５２０２　（１９８１）。

４４、　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｖｉｒｏ
ｌ、　２７．１７２　（１９７８）。

４５、　Ｌａｅｍｍｌｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．
６８０　（１９７０）。

４６、　Ｈｏｎｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、　１６．１３０８　（１９７５）。

４７、５ｐｅａｒ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１７．９９
１　（１９７６）。

−２に対して力価測定を行なったヒトヘルペス血清は、
Ｄｒ、　Ｊｏｈｎ　Ａ、Ｓｔｅｗａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒ
ｏｌ　、　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒｇｉａから提供
された。

５１、　Ｒｅｃｔｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃ
ｔ、　ａｎｄ　Ｉ＋ｎｍｕｎ、　３８．１６８（１９８
２）　。

Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８０）、　ＰＰ、　３
７６−３７７゜５３、１’１ｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ　２７３．１１３　（１９７８）；　Ｇ
ｌｕｚｍａｎ。

Ｃｅ１ｌ　２３．２７５　（１９８１）。

ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　５．　Ｓｕ
ｐｐｌｅｍｅｎｔ　２．　ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎ、　ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
、　ｐ、　３１１　（１９７６）。

５８、　Ｌａ５ｋｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ、印刷
中　（１９８４）　。

５９、　Ｆｒ１ｎｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、　４５．６３４　（１９８３）。

６０、　Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２１７．３１６　（１９８２）。

６１、　Ｗｂｉｔｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ
　、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．６２７１（１９８
３）。

６２、　Ｈｇｂｂａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、
　ＲｅＶ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　５０゜５５５　（１９
８１）。

６３、Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓ（ｉ、ＵＳＡ　７７゜１４９１　（１９８０）
。

６５、　Ｃａ５ｓａｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｅｒ
ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６．２１２　（１９７５）。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＳ　Ｖ　−１ｙｏ遺伝子およびＨ５Ｖ−２２
Ｄ遺伝、およびその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列、並
びに推宇的に決定したアミノ酸配列を比較して示した模
式図である。第２図はＨ５Ｖ−１ｙＤタンパク質および
ＨＳ　Ｖ　−２ｙＤタンパク質のヒトロバシー解析の結
果を示すグラフである。 第３図は膜結合型のＨ５Ｖ−１糖タンパク質りを発現す
るためのプラスミドｐｙＤ　−ｄｈｆｒの組立て工程を
示す模式図である。第４図は、ヒトのＨ５Ｖに対する抗
体で標識した”Ｄ１２細胞の位相差顕微鏡図（Ａ）、お
よび同一細胞の螢光顕微鏡図（Ｂ）である。第５図Ａは
ｙＤ１２細胞系からクローン化したｙＤ、およびＨ５Ｖ
−１に感染したヒトの細胞に由来する天然のｙＤに関す
る放射性免疫沈降を示すグラフであり、第５図Ｂは２Ｄ
０２細胞からクローン化されたｙＤの免疫沈降線を、パ
ルス標識法でその結果を示したグラフである。第６図は
ヒト抗Ｈ８Ｖ抗体の、”Ｄ１２細胞、並びにその親細胞
であるＣＨＯ細胞系との結合状態を示すグラフであって
横軸に血清希釈度の逆数、縦軸に４９２ｎｍにおける吸
光度を示す。第７図はＨ５Ｖ−１２Ｄタンハク質の模式
図であって、そのシグナル配列および膜結合領域をも示
す模式図である。第８図はＨ５Ｖ−１４Ｄタンパク質を
分泌形として発現せしめる、プラスミドｐ７Ｄ　ｔｒｕ
ｎｃ−ｄｈｆｒの組立て工程を示す模式図である。第９
図はｙＤ１ｏ２細胞系の、細胞内および細胞外からの抽
出物の放射免疫沈降線を示すグラフである。第１０図は
ｙＤｌｏ、２細胞系の増幅前および増幅後の免疫沈殿の
結果を示すグラフである。第１１図はＭｔｘ　によって
達成された２Ｄ□。、２細胞系の増幅度を示すグラフで
ある。第１２図はｐ　ｙ　Ｃ２Ｓ　ａ　ｌ　２−９フラ
グメントのＩ）　Ｎ　Ａ配列分析の結果を示す模式図で
ある。 第１３図はＰＰＣ２５ａ　１２．９　（Ｈ８Ｖ−２）か
う導カレたＤＮＡ配列を、Ｈ５Ｖ−１ｐｃ領域のＤＮＡ
配列との比較において示した模式図である。第１４図は
、Ｈ８Ｖ−２ゲ／ムＤＮＡおよびＰｙＣ２Ｓａ１２．９
−ＤＮＡ　のサザーンブ・四ツティング法による解析結
果を示すグラフである。第１５図は、Ｈ８Ｖ−２のラー
ジオープンリーディングフレームを翻訳した配列を、Ｈ
５Ｖ−１ｙｃアミノ酸配列どの比較において示した模式
図である。第１６図はＨ８ｖ　−１ｙｃタンパク質とＨ
５Ｖ−２メジヤーオープンリーデイングフレームタンパ
ク質のヒトロバシー解析の結果を示すグラフである。 特許出願人　ジエネンテク　、　インコーポレイテッド
代理人　弁理士　青　山　葆ほか１名 ＤＩ２　１　２　１　２ 図面の浄書（内容に変更なし） １２３４ ★　☆ ☆★★☆★☆★★☆☆☆☆★★★★☆ ＮＣＮＣＣＮ　Ｎ　ＣＮＣＮ　ＣＣＮＣＲＬＹＳＶＶＧ
ＰＬＧＲＱＲＬＩＩＥＥＬＴＬＥＴＱＧＭＹＹＷＶＷＧ
Ｒ★★★★☆★責＊嚢★★★★★− ★　★　★　☆　★ ★　★★　責★ ）ＩＳＶ−１７３０ｂｐ　ＯＲＦ　１３１　ＹＹＰＲ５
ＰＧＧＦＶＱＦＶＴＳ１３ ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ ☆★★★★　☆　☆　★　☆　★　★☆☆★☆ＲＰＰＰ
ＡＲＡＲＶＰＡＶＡＷＩＧＶＧＡＩＶＧＡＦＡＬＶＡＡ
ＬＶＬＶＰ−−一−ＭＲＡＲＬＰＡＡＡＷＶＧＶＧＴＩ
ＩＧＧＶＶＩＩＡＡＬＶＬＶＰｃｃｃ ★　★★　☆ ＲＮＡＬＧＬＰ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　０１９８４＊３月９１０米国（Ｕ　Ｓ）［相］田７
７６３手続補正書（ヵ、） 昭和６０年　２月２６日 １事件の表示 昭和５９年特許願第　１８３６２２　万３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリ７オルニア９４０８０、サウ
ス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーフ・
ブールバード４６０番 名称　ジェネンテク、インコーボレイテッド４、代理人 ７、ｍ？正の内容 イ）図面の簡単な説明の欄の補正 １）１１７頁下４行、「鏡図（Ａ）、・・・（Ｂ）」を
１−鏡写真の模写図（Ａ）、および同一細胞の蛍光顕微
鏡写真の模写図（Ｂ）」と訂正。 ２）１１８頁１行、「示ずグラフＪを１−撮影した写真
の模写図」と訂正。 ３）１１８頁３行、「議決て　・・・・グラフ１を［議
決で示した状態を撮影した写真の模写図−１と訂正。 ４）１１８頁１４行、「示ずグラフ」を１−撮影した写
真の模写図」と訂正。 ５）１１８頁ＩＧ行、１−示すグラフＪを１撮影した写
真の模写図１と言］正。 〔１）製画を用いて適正な用紙に鮮明に描いた第４．５
．９．１０．１４図を提出する。１ 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、相補的な抗体と特異的に結合し得る抗原決定基をも
   ったポリペプチドであって、該ポリペプチドを生産する
   ことができる、安定で連続的な組換え細胞系の膜に機能
   的に連合している膜−結合ポリペプチドを含有する診断
   用産物。 ２、該ポリペプチドが単純庖疹ウィルスの特異抗体と結
   合し得るものである第１項に記載の診断用産物。 ３、該ポリペプチドが単純庖疹ウィルス１型または２型
   の糖タンパク質りであって、単純庖疹ウィルス１型およ
   び／または２型の抗体と結合することができるものであ
   る第２項に記載の診断用産物。 ４、該ポリペプチドが単純庖疹ウィルス１型または２型
   の糖タンパク質Ｃである第２項に記載の診断用産物。 ５、該ポリペプチドが単純庖疹ウィルス２型の糖タンパ
   ク質Ｃの７ラグメントを含有し、単純庖疹ウィルス１型
   または２型と結合することができるものである第４項に
   記載の診断用産物。 ６、該ポリペプチドが単純庖疹ウィルス２型と結合でき
   るが単純庖疹ウィルス１型とは結合し得ない糖タンパク
   質Ｃフラグメントを含有するものである第４項に記載の
   診断用産物。 ７、固相表面に結合したものである第１項に記載の診断
   用産物。 ８、標識に結合したものである第１項に記載の診断用産
   物。 ９、該標識が酵素である第１項に記載の診断用産物。 １０、該組換え細胞が哺乳類の細胞である第１項に記載
   の診断用産物。 １１、該相補的抗体と特異的に結合することができる標
   識した抗−抗体と共に、診断試験用のキット中に含まれ
   ているものである第１項〜第１０項のいずれかに記載の
   診断用産物。 １２、該診断試験用キット中に、標識化されていない相
   補的な抗体と共に含まれているものである第１０項に記
   載の診断用産物。 １３、診断試験用キット中に、標識された相補的な抗体
   と共に含まれているものである第１項〜第９項のいずれ
   かに記載の診断用産物。 １４、（ａ）安定かつ連続的な組換え細胞系で生産され
   、相補的な抗体と特異的に結合すること゛のできる抗原
   決定基を有する膜−結合ポリペプチドを含有する診断用
   産物；および （ｂ）第２の成分として該相補的な抗体、または該相補
   的な抗体と特異的に結合することのできる抗−抗体のい
   ずれか、 を含有する診断試験用キット。 １５、該診断用産物が固相表面に結合したものである第
   １４項に記載の診断試験用キット。 １６、該診断用産物が標識と結合したものである第１４
   項に記載の診断試験用キット。 １７、第２の成分が該相補的抗体と特異的に結合するこ
   とができる、標識された抗−抗体からなるものである第
   １４項に記載の診断試験用キット。 １８、標識されていない相補的抗体をも含むものである
   第１７項に記載の診断試験用キット。 １９、第２の成分が相補的な抗体からなるものである第
   １４項に記載の診断試験用キット。 邪２診断用産物が、膜結合領域を失うことによって膜か
   ら遊離した、先端の切断された、膜を含まないポリペプ
   チド誘導体である第１４項に記載の診断試験用キット。 ２１、先端を切断されたポリペプチドが、該ポリペプチ
   ドを生産し得る組換え真菌性宿主細胞系から分泌されて
   生成されたものである第２０項に記載の診断試験用キッ
   ト。 η１診断用産物が１、安定かつ連続的な組換え細胞内で
   該細胞の膜と機能的に連合した状態で生成させた後、該
   層から遊離させて得た該ポリペプチドの膜遊離型誘導体
   である第１４項に記載の診断試験用キット。 ｎ１診断用産物が単純庖疹ウィルス１型または２型の糖
   タンパク質からなるものである第１４項”に記載の診断
   試験用キット。 ２４、該糖タンパク質が単純庖疹ウィルス１型または２
   型のいずれか一方と結合することができるが、それらの
   両方とは結合し得ないものである第２５３項に記載の診
   断試験用キット。 ５、該糖タンパク質がｇＤである第２３項に記載の診断
   試験用キット。 部、該診断用産物が単純庖疹ウィルス１゛型または２型
   の糖タンパク質Ｃからなるものである第２３項に記載の
   診断試験用キット。 ｎ、該糖タンパク質Ｃが単純庖疹ウィルス２型の糖タン
   パク質Ｃである第２６項に記載の診断試験用キット。 あ、該ポリペプチドが単純性庖疹ウィルス２型と結合す
   ることができるが、単純性庖疹ウィルス１型とは結合で
   きない、単純性庖疹ウィルス２型のフラグメントからな
   るものである第２７項に記載の診断試験用キット。 ２９、（ａ）第１項〜第２８項のいずれかに記載の診断
   用産物を生理学的に得られた液体試料と接触させて診断
   用産物と該試料中の相補的な抗体と結合させ；そして （ｂ）　段階（ａ）における結合を検出する、２段階か
   らなる、生物学的に得られた液体試料に含まれる抗体の
   検出方法。 ３０、段階（ａ）における結合の測定をも行なうことを
   特徴とする第２９項に記載の方法。 ３１、段階（ａ）において、該診断用試薬を固相表面に
   結合せしめると共に、該試料を該相補的な抗体と特異的
   に結合することのできる可溶性の標識抗−抗体とも接触
   させ、該試料抗体を固相表面に、該診断用産物および該
   標識抗−抗体の両方と結合させて連結し、さらに、段階
   （ｂ）に移る前に、上記固相表面を未反応の、可溶性標
   識抗体を含む溶液から分離し、次いで段階（ｂ）では、
   固相あるいは分離した溶液中に含まれる標識抗−抗体を
   検出することからなる第２９項に記載の方法。 ３２、段階（ａ）において該診断用産物を固相表面に結
   合せしめると共に、該試料を、同じく該診断用産物と特
   異的に結合することのできる可溶性の標識抗体とも接触
   させて該試料抗体と標識抗体とを該固相表面の該診断用
   産物に競合的に結合させ、さらに、段階（ｂ）に移る前
   に、上記固相表面を未反応の、可溶性標識抗体を含む溶
   液から分離し、次−Ｊ、）で段階（ｂ）では、固相ある
   いは分離した溶液中に金車れる標識抗−抗体を検出する
   ことからなる第３０項に記載の方法。 ３３、（ａ）生物学的に得られた液体試料を°該試料中
   の抗原と同様な抗原決定基を有する第１項〜第２９項の
   いずれかに記載の診断用産物と接触させ、次いで、 （ｂ）　競合法によって試料抗原を検出することからな
   る、生物学的に得られた液体試料中の抗原の検出法。 ３４、段階（ａ）において該診断用産物を固相表面に結
   合せしめると共に、該試料を可溶性の標識されていない
   相補的な抗体とも接触させて該相補的な抗体に、該診断
   用産物と試料抗原とを競合的に結合させ、さらに、段階
   （ｂ）に移る前に、（Ｃ）固相を溶液から分離し、そし
   て （ｄ）分離した同相表面または溶液を、該相補的な抗体
   と特異的に結合することのできる標識抗−抗体と結合さ
   せ、次いで、段階（ｂ）において標識抗−抗体を検出す
   ることからなる第３３項に記載の方法。 ３５、段階（ａ）において該診断用産物を標識化すると
   共に、該試料を不動化された相補的な抗体とも接触させ
   て標識診断用産物および試料抗原と競合的に結合させる
   ことからなる、第３３項に記載の方法。