JPH0658372B2 - 分子クローンされた診断用産物 - Google Patents

分子クローンされた診断用産物

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JPH0658372B2
JPH0658372B2 JP59183622A JP18362284A JPH0658372B2 JP H0658372 B2 JPH0658372 B2 JP H0658372B2 JP 59183622 A JP59183622 A JP 59183622A JP 18362284 A JP18362284 A JP 18362284A JP H0658372 B2 JPH0658372 B2 JP H0658372B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は組換えＤＮＡ技術によつて得られた免疫学的診
断用産物、並びにその使用方法に関するものである。
従来技術 種々の感染源に対する免疫応答の解析は、重要な細胞表
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があつた。
ＨＳＶ−１のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の検出は、酵素−
結合性免疫吸着剤分析法（ＥＬＩＳＡ）（Ａ，Ｂ）によ
つて行なわれた。この両者の方法で、ＨＳＶ−感染細胞
の抽出物を抗原として用いることが示された。しかし、
実験室内で生の抗原を使用することには、培養の必要性
や感染性物質による汚染等の不都合を伴なうことがよく
知られている。
分子クローニング法の出現によつて、病原体からの遺伝
子生成物を非病原型で事実上量的に無限に発現できる手
段が提供され、これらの限界が克服されるようになつ
た。現在ではインフルエンザ(1)、口蹄病(2)、肝炎
(3)、小水疱性口内炎ウイルス(4)、狂犬病(5)、および
単純ヘルペス（疱疹）ウイルス(6)のようなウイルスか
らの表面抗原がE.coliおよびS.cerevisiaeにおいて発現
され、将来、改良されたサブユニツトワクチンの提供を
約束している。下等微生物における表面抗原の発現は、
不完全なプロセシングのために（例えば、タンパク質分
解、糖付加）、またはクローンした遺伝子産物を精製す
る間の変性により、恐らく重要な意味のある抗原決定基
を失うかも知れないという理由で満足すべきものである
とは言い難い。
このことは、膜タンパク質の場合は、E.coli中で発現さ
れた時に、それが疎水性の膜透過領域のために、凝集
し、不溶性となり勝ちであるので特にそうである。膜タ
ンパク質を暗号化したクローン遺伝子が、哺乳動物細胞
中で知られておりこの場合、この宿主細胞が適宜プロセ
スし、ポリペプチドを組み合わせ、細胞膜内に取り込む
のに必要な因子を提供する（７、８）。
他方これらの研究において、膜タンパク質が組換え宿主
細胞の表面で発現されることがわかり、さらに例えば
(8)では、疎水性のカルボキシ−末端領域を欠く先端を
切断された膜タンパク質が、宿主細胞と結合するより
も、むしろ徐々に分泌され得ることが示されており、さ
らに膜結合タンパク質のクローン遺伝子が一時的に発現
されたこと、およびそれに相補的な標識抗体により染色
してそのタンパク質を検出したこと、が記載されてい
る。しかし、これらの文献中には膜−結合タンパク質が
免疫学的診断産物として有用であることを示唆するもの
はない。その様な示唆があつても、該細胞系の不安定さ
の故に、記載された膜−結合タンパク質は科学的な興味
の対象となり得ても、実際の診断用物質として有用とは
言い難い。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、関連性はあるが区
別できる二つの型でヒト感染症に見出される巨大ＤＮＡ
ウイルスである。ウイルスが暗号化している多数のタン
パク質のうちの少なくとも４個が、グリコシル化した形
で発見され、それらがウイルス粒子（ビリオン）および
感染細胞の両表面に存在していることが明らかにされた
(9)。
ｇＡ／Ｂ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＥと呼ばれるこれらの
糖タンパク質はＨＳＶ１型（ＨＳＶ−１）およびＨＳＶ
２型（ＨＳＶ−２）の双方に見出されるが、ＨＳＶ−２
の場合は、更にもう１個の糖タンパク質（ｇＦ）が発見
されたと報告されている(10)。それらの機能については
なお完全に理解されてはいないが、それらの糖タンパク
質が、ウイルスの細胞への付着、細胞融合、およびウイ
ルス感染に対する宿主の免疫学的応答に関与しているよ
うに思われる(11)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２は５０％ま
でのＤＮＡ配列相同性しか示さないが(12)、それらの糖
タンパク質の大部分は両型に共通しているようである。
このように、ｇＡ／Ｂ、ｇＤ、およびｇＥは型に共通し
た多くの抗原決定基を示すが（１３〜１６）、以前には
完全に型特異性があると思われていたｇＣ（１７、１
８）も幾つかの型共通性の決定基を有することが明らか
になつて来た。然しながら、幾つかの糖タンパク質に対
する単クローン性抗体を使用して、型特異性のある抗原
決定基を証明でき（10、19）、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
に分れて以来、ある種のアミノ酸変化が起こつたことを
物語つている。
ウイルス中和に関して最も重要な糖タンパク質の一つは
ｇＤである(11)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２のそれぞれの
ｇＤタンパク質が近縁であることを強く示唆する注目す
べき証拠が提示されている。例えば、遺伝子組み換え地
図を作ると、対応する遺伝子が二つのウイルスのゲノム
を共直線領域につきとめられる。アミノ酸分析の結果は
二つのタンパク質間に総体的な相同性が有ることを示し
た。ｇＤタンパク質は１型および２型の両ウイルスに対
し型共通性の型式で中和抗体を誘導する（19−21）。更
に、これらの糖タンパク質に対して生じるモノクローナ
ル抗体の大部分は型共通性であり、同様に二つの糖タン
パク質の型の間の高度な構造的相関性を示している(2
0)。然し、幾つかの単クローン性（モノクローナル）抗
体は型特異的に反応することが知られており、両タンパ
ク質の間に有意の差のあることを示した(19)。同様に、
タンパク質のペプチド地図も不明瞭ではあるがそのよう
な違いを示した(22)。これらの結果は、これらのポリペ
プチドが相関していることを示唆しているが、その関係
がどの程度近縁であるかを正確に示すには不充分であ
る。
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２のｇＤタンパク質の型共通性の
特徴を検討するため、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２のｇＤ遺
伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導されたアミノ酸配列
は近似性を示した。また、その結果生じたタンパク質配
列についても、タンパク質を疎水性領域と親水性領域を
測定すべく設計されたプログラムを使用することによ
り、構造的な相違を解析した。この解析の結果から、総
体的構造水準は高度に維持されていることが明らかにさ
れた。二つの糖タンパク質の間に数ケ所のアミノ酸置換
が見られたが、これらの置換のほとんど大部分はコンサ
ーバテイブであり、この糖タンパク質がウイルスの構造
上重要な必要条件であることを示していた。
上記のｇＤタンパク質の構造に関する情報に照らし、本
明細書中に詳しく述べるが、このｇＤタンパクＤＮＡの
哺乳類動物の細胞内での発現に関し、以下の事柄を調べ
た。即ち、その様な発現が可能か否か、可能であるなら
ば発現したタンパク質が宿主細胞の膜に結合しているか
否か、また、膜結合領域を欠く先端を切断された形のタ
ンパク質が宿主細胞から分泌されるか否か、そして後二
者のいずれかの場合においては、発現したタンパク産物
がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に対して有効な
抗体と結合し得るか否か、に関する決定を行なつた。そ
の全工程は未決定の特許出願（第５２７，９１７号、１
９８３年８月３０日出願）の中に記載した。この出願に
おいて示した様に、上記の如き発現産物であるタンパク
質はＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２に対して有効
な抗体を高めることができ、従つてワクチンとして有用
である。本明細書に記載した結果が示す様に、ＨＳＶ−
１および／またはＨＳＶ−２に対する抗体によつて認識
され得る、前記の組換えＤＮＡ技術で得られた発現タン
パク質は、これらのウイルスに特有の抗体の存在を検出
し、そして／または測定するのに有用な診断用産物でも
ある。マツピングスタデイーの結果は、ｇＦに相当する
ＨＳＶ−２ゲノムから導かれたタンパク質配列が、ＨＳ
Ｖ−１ｇＣに対するＨＳＶ−２の相同部分であることを
示唆していた（２２ａ） ＨＳＶ−１ｇＣは、この糖タンパク質（グリコプロテイ
ン）に対する抗体が殆んど独占的にＨＳＶ−１ｇＣと反
応することが見出されたため(17)、ＨＳＶ−２と相同性
と有さない、型特異性のものであると考えられていた。
しかも、ＨＳＶ−１ｇＣとＨＳＶ−２ウイルスに対して
調製された抗血清との間には検出可能な免疫学的反応が
存在することを証明するものは何もなかつた(18)。ＨＳ
Ｖ−１ｇＣと同様な電気泳動上の挙動を示すタンパク質
がＨＳＶ−２にも認められたが、それはＨＳＶ−１ｇＣ
とマツプ上で共通線性を有するものではなかつた(35)。
ＨＳＶ−１と対照的に、ＨＳＶ−２はｇＦと呼ばれるも
う１個の糖タンパク質を暗号化しているようである（２
２ｂ、１０、２２ｃ、２２ｄ）。ＨＳＶ−２ｇＦは電気
泳動によつてＨＳＶ−１ｇＣよりはるかに速く移動する
が、組み換え体ウイルスのマツピング研究により、この
タンパク質はＨＳＶ−２ゲノムのＨＳＶ−１ｇＣのため
の遺伝子とほぼ共直線的な領域で暗号化されていること
が明らかになつた（２２ｃ、２２ｄ）。更に最近、ＨＳ
Ｖ−２ｇＦの単クローン性抗体が弱いながらもＨＳＶ−
１ｇＣと交叉反応するらしいということ(22f)、および
ＨＳＶ−１ウイルス粒子のエンベロープタンパク質に対
して作られた多クローン性抗血清がｇＦを沈降させるこ
と(22d)が証明され、二つの糖タンパク質の間に構造上
の相同性の可能性があることが示唆された。このよう
に、ＨＳＶ−１ｇＣとの相同性はＨＳＶ−２ｇＦタンパ
ク質である可能性を示すものである。この関係は本発明
において検討された。
以下、図面について説明する。
第１図は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ｇＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列と、推定されたア
ミノ酸配列を示す。
第２図はＨＳＶ−１とＨＳＶ−２タンパク質からのｇＤ
タンパク質のヒドロパシー(hydropathy)解析を示す。
第３図は、膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現
のために組み立てられた、ｐｇＤ−dhfrプラスミドの模
式図である。
第４図はＨＳＶに対するヒト抗体でｇＤ１２細胞を標識
した結果を示し、(A)は位相差顕微鏡像、(B)は同じ細胞
の蛍光顕微鏡像である。
第５図は、ｇＤ１２細胞系からのクローンされたｇＤお
よびＨＳＶ−１に感染させたヒトの細胞から得られた天
然のｇＤの放射免疫沈降を示すグラフである。
第６図は、ｇＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞系に対す
るヒト抗ＨＳＶ抗体の結合度を示す。横軸に血清希釈度
の逆数、縦軸に４９２nmにおける吸光度を示す。
第７図はＨＳＶ−１ｇＤタンパク質を模式的に表わした
もので、シグナル配列および膜結合領域の位置を示す。
第８図は分泌型のＨＳＶ−１ｇＤタンパク質のための発
現プラスミドｐｇＤtrunc−dhfrの組立て模式図であ
る。
第９図はｇＤ10.2細胞系からの放射免疫沈降線を示す。
第１０図は増幅前および増幅を行なつたｇＤ10.2細胞系
からの放射免疫沈降線を示す。
第１１図はMtxで増幅したｇＤ10.2細胞系で達成された
増幅度を示す。
第１２図はＤＮＡ配列解析を行なつたpgC2Sa12.9の断片
を示す。
第１３図はpgC2Sal2.9から誘導されたＤＮＡ配列とＨＳ
Ｖ−１ｇＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す。
第１４図はＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpgC2Sal2.9ＤＮＡ
のサザーンブロツテイング解析を示す。
第１５図はＨＳＶ−２のラージオープンリーデイングフ
レームの翻訳とＨＳＶ−１ｇＣのアミノ酸配列の比較を
示す。
第１６図はＨＳＶ−１ｇＣタンパク質とＨＳＶ−２のメ
ジヤー・オープンリーデイングフレームタンパク質のヒ
ドロパシー解析結果を示す。
発明の要約 本発明においては、遺伝子産物を、診断用物質として用
いる目的で、それらを大量に、しかも非病原性の状態で
提供するために組換えＤＮＡ技術を利用した。また、そ
の様な遺伝子産物の利点をＨＳＶの如きある種の感染症
の診断に関連させて示した。今日用いられているＨＳＶ
診断法には、(a)臨床的に単離したものを培養する、(b)
生ウイルスから得た試薬を用いる、または(c)蛍光標識
または酵素標識と結合したモノクローナル抗体を使用す
る、の３方法がある。第１の方法は骨の折れる方法であ
り、結果を得るまでに通常数日間を要する。第２の方法
は大多数の臨床実験室での取扱い範囲を超えた生化学的
な操作を要するので、実用的でないことが多い。また、
第３の方法は開放病巣の検出に係り、例えば蛍光顕微鏡
または蛍光標識の如き検出手段を利用することができる
ということに依存する。この様な理由から、臨床診断に
は、実験室的な確認方法は一般に採用されていない。
本発明のシステムでは、相補的な抗体と特異的に結合し
得る抗原決定基をもつたポリペプチドを含有する診断用
産物（以下に定義する）を用いる。１つの態様では、該
ポリペプチドは、それを生産することのできる組換え宿
主細胞の表層膜に機能的に連合（結合；associate）し
ている。通常、その様な機能的な連合において、ポリペ
プチドは表層膜に結合し、膜を通つて突出している。こ
の組換え細胞系は、商業的規模で診断用産物を供給する
ために安定で連続的な系（即ち、安定な連続的継代細胞
系）から導かれている。
もう１つの態様における診断用産物は、同じ抗原決定基
を有するが表層膜と機能的に連合していないポリペプチ
ドを含んでいる。以下に詳しく示すが、その様なポリペ
プチドの１つは膜−結合ポリペプチドから得られた、膜
を含まない、先端を切断されたものである。この誘導物
質はポリペプチドの膜−結合領域を除去し、それが生産
された宿主細胞系から分泌させることにより産生され
る。
また別の態様では、ポリペプチドをまず表層膜と機能的
に連合した形で生成させ、次いでこのポリペプチドを膜
から離すために、好ましくは非イオン性界面活性剤を用
いて細胞を溶解させて得る。
その全容を以下に詳しく示すが、本発明に係る診断用産
物は、アナローガスイムノアツセイにおいて、生の病原
体に由来する１方の物質（counterpart）の代りに用い
ることができる。この様な点から、市販の診断試験用キ
ツトに、上記の診断用産物をその他の種々の免疫学的産
物（それらの内少くとも１つは、それに相補的な抗体ま
たは他の抗原を検出するために標識化されている）を含
むことになろう。この様な系に関して、相補的な抗体、
即ちＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する抗体、と特異
的に結合するのに充分な抗原決定基を有する、ＨＳＶ−
１およびＨＳＶ−２由来のｇＤタンパク質の分子クロー
ニングについて記載した。ＨＳＶ−１ｇＤタンパク質の
クローニング、配列決定、ならびに発現に関する特殊な
技術は以下の実施例１に記述した。そこで述べる様に、
第２図のハイドロパシープロツト（hydropathyplot）か
ら、親水性のカルボキシ末端が、疎水性の領域に先行さ
れていることがわかつた。この構造は膜−結合性糖タン
パク質に特有である。その機能はタンパク質を細胞内お
よびウイルス膜内に固定することにある。
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２との関係を調べた結果、ＨＳＶ
−２ゲノムの2.29Ｋｂ領域とＨＳＶ−１ｇＣ遺伝子とは
共道線関係にあることが確認された。この領域の、ラー
ジオープンリーデイングフレームの翻訳によつて、この
領域にはＨＳＶ−１ｇＣと有意な相同性を有するタンパ
ク質が暗号化されていることが証明された。即ちこの領
域にはＨＳＶ−２ｇＦ遺伝子が暗号化されており、従つ
てｇＦタンパク質はＨＳＶ−２の、ＨＳＶ−１糖タンパ
ク質Ｃ（ｇＣ）との相同部分であることを示唆するもの
といえる。
ここで述べた様に、前にｇＦと称したＨＳＶ−２中の糖
タンパク質はｇＣと命名するのが適当である。（この生
産物に関しては、「ＨＳＶ−２ｇＦ」、「ＨＳＶ−２ｇ
Ｃ」よび「ｇＣ−２」という語句を相互変換的に用いる
こととする。）ｇＣ−２の１つのセグメント（部分）
は、他のセグメントが型特異性であるのに対して、ＨＳ
Ｖ−１ｇＣ（またはｇＣ−１）と型共通性であることが
わかつた。
型特異性セグメントを含むが、型共通性セグメントを含
まないｇＣ−２のフラグメントで形成された診断用産物
によれば、ＨＳＶ−１と区別してＨＳＶ−２を検出する
ことができる。診断試験が陽性であれば、対象はＨＳＶ
−２を有する。この試験を、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２に
共通な他の試験法と併用すれば、ＨＳＶ−１を診断する
ことができるであろう。例えば、ｇＤを用いた診断試験
での陽性判定はＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２ウ
イルスの存在を意味する。もしも、型特異性ｇＣ−２試
験も陽性であれば、対象はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
をもつといえる；陰性であれば、対象はＨＳＶ−２のみ
を有するといえる。かくして、ＨＳＶ−２からＨＳＶ−
１を区別することのできる診断試験法が初めて考案され
たことになる。
その他の既知のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の糖タンパ
ク質類、例えばｇＡ、ｇＢまたはｇＥ、あるいは未だ同
定されていない糖タンパク質類を、ＨＳＶ−１またはＨ
ＳＶ−２に対する診断用産物として利用することもでき
る。もしも、その様な糖タンパク質がＨＳＶ−１または
ＨＳＶ−２に対する型特異性の決定基を含有している場
合には、本明細書中でｇＣおよびｇＤに関して記載した
相似（アナローガス）組換え技術を利用して、上記糖タ
ンパク質類を用いてＨＳＶ−２からＨＳＶ−１を区別し
得る様な診断用産物を生成させることができる。もし
も、これらの糖タンパク質が型共通性の決定基をも含有
している場合には、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２につい
て特異的な診断薬を得るために、本明細書中でｇＣ−２
の生産に関して述べたと同じ組換え技術を利用して型共
通性画分から分離された型特異性画分を分離することが
できる。もしも、その糖タンパク質が型共通性画分のみ
を含んでいる場合にはｇＣに関すると類似の組換え技術
により上記診断薬を生産することができる。
ある一定の分子クローニング法によつてのみ、それに対
して相補的な抗体によつて検出されるに適した特異的抗
原決定基をもつたポリペプチドを生産することができる
と思われる。こうして、生産の過程中で、ポリペプチド
は適切に折りたたまれ、糖付加され、そして正しい工程
に従つた方法で形成されねばならない。実施例１に示す
如く、この様な望ましい性質を有する細胞の生産を達成
するための１つの方法は、組換え宿主細胞の表層膜に機
能的に連合する様な方法で分子クローンされたポリペプ
チドを得る方法に関する。この目的のためには真核性宿
主細胞系を用いる必要があり、哺乳類の細胞系が好まし
いと確信される。かくして、例えばチヤイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＣＨＯ）内で発現したＨＳＶ−１糖タン
パク質Ｄは、適当な抗原特性を有する膜−結合ｇＤタン
パク質を生産する。その他の適当な組換え宿主細胞系に
はマウスＬ細胞等が含まれる。
本明細書で使用する“組み換え体”なる用語は、組み換
えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターでトラン
スフエクトされ、ポリペプチドを生産する能力を形質導
入された細胞を意味する。“機能的連合”または“機能
的結合”とは、膜に結合することであり、典型的には、
天然の病原体によつて誘発された抗体によつて認識され
得る天然の立体配座に含まれている抗原決定基を露出す
る様に、膜の両側へ突出して膜と結合することを意味す
る。“膜結合”ポリペプチドとは、通常真核細胞で生産
され、それが種々の細胞膜を通つて分泌されるのを助け
ると考えられているシグナル配列、および細胞膜からの
完全な分泌を妨げると考えられる膜結合領域（通常、疎
水性であり、Ｃ−末端に存在する）を有していることに
より特徴づけられるポリペプチドの一群を言う。従つ
て、それは機能的に膜に連合または結合した状態のまま
でいる。本発明では、特に病原微生物、例えばヘルペス
ウイルスに関する膜結合ポリペプチドを開発しようとす
るものである。
本明細書で使用している“ＨＳＶ−２ｇＦ”、“ＨＳＶ
−２ｇＣ”および“ｇＣ−２”なる用語は、ＨＳＶ−１
ｇＣと高度の相同性を有し、ワクチンとして有用な充分
な量の抗体を生成せしめることができるＨＳＶ−２の糖
タンパク質部分を指す用語として、交換可能に使用され
る。
表面膜と機能的に連合した形で本発明のポリペプチドの
抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリペプチドか
ら、抗原性を破壊することなく除去することができる。
例えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶液、望まし
くは非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶解すること
により、ポリペプチドを膜から除去することができる。
これを行なうことの利点は、無関係な細胞性物質からポ
リペプチドを分離し、ワクチンに使用する際の、その潜
在的活性を充分に高めることである。ポリペプチドから
膜を除去する技術は後述する。
もう一つの実施態様としては、分泌系を創製することに
よつて、膜を含有しない標品を得ることである。後段で
更に詳細に記述するように、そのように分泌されたポリ
ペプチドは少なくとも抗体産生を刺激するのに必要な幾
つかの抗原部位を持つている。
他の態様では、ポリペプチドをその膜−結合状況から分
泌させる方法で膜を除去する。その様にして分泌された
ポリペプチドは抗原性の検出法に必要な抗原性部位を少
くとも数個有している。この方法を実施するための技術
を以下の実施例３に示す。
血清、尿、または皮膚標本等に由来する生物学的な液体
中の抗原または抗体に関する未知量を求める方法には数
多の既知技術がある。本発明方法は、上記の既知技術に
おける診断用物質の代りにある種の分子クローン診断試
薬を用いることの外は、原則的にその様な既知技術を利
用するものである。従つて、工程に関しては、その詳細
な部分を従来の免疫学の書物を参照することとし、一般
的な記述に止めた。本発明の新規な診断用産物を従来か
らの免疫学的手法に適用する方法は、当該技術分野の人
々にとつて容易に理解し得ることである。
記述を簡略化するために、一般的な語句である「診断用
産物」という言葉は、本発明の抗原様機能を有する産物
を述べるのに用いるものとする。本明細書において「診
断用産物」という言葉は、病原菌から誘導された、対応
する抗体と特異的に結合し得る抗原決定基をもつたポリ
ペプチドであつて、安定かつ連続的な組換え細胞系から
導かれ、該ポリペプチドを生産し得る様な組換え宿主細
胞内で生産されたものである、と定義する。このポリペ
プチドは組換え宿主細胞の表層膜と機能的に連合してい
るか、あるいはそうでないかのいずれかである。
後者の場合には、該ポリペプチドは、一般に先端を切断
された形であつて、その形で宿主細胞系から分泌される
か、あるいは、膜を溶かす様な溶液、または非イオン性
界面活性剤溶液の中で膜から遊離せしめることにより、
生産される。
一般に、診断用産物は生物学的に得られた液体中の抗体
または抗原を検出するのに用いることができる。抗体を
検出するには、診断用産物を上記試料溶液中の相補的な
抗体と結合させるために、該試料溶液を診断用産物に接
触させ、この結合を検出し、好ましくは測定をも行な
う。また、抗原を検出するには、試料溶液を、試料中の
抗原と同様な抗原決定基をもつた診断用産物と接触させ
る。次いで試料中の抗原を、競合的分析法により検出も
しくは測定する。
上記の如く、周知方法の１つは、抗原としてＨＳＶ−感
染細胞の抽出液を用いるELISA−サンドイツチ法であ
る。その様な技術の一般的手法を、本発明中で使用し
た。
抗体検出用の系においては、一般に診断用産物は固相表
面、通常、くぼみ、または試験管の表面に結合（例え
ば、吸着または共有結合により）した状態に調製され
る。
その他、適当な固相表面にはビーズの如く、診断用試薬
を不動化することのできる表面が含まれる。
診断用産物の層を支持する固体表面は、非結合試薬を洗
い流すことができるに充分な、液体に対する不浸透性を
有することが必要である。またそのものは、診断用試薬
を結合させねばならない。共有結合を望む場合には、適
当な表面にポリスチレン等のプラスチツクが含まれる。
固相表面に診断用試薬を結合させる好適な方法は、Benn
ichらのアメリカ特許第３，７２０，７６０号に記載さ
れている。
サンドイツチ法によつて試料中の未知抗体を検出するに
は、結合した診断用産物を、未知抗体、並びに試料中に
含まれている相補的な抗体と特異的に結合し得る、可溶
性で標識された抗−抗体と反応させる。こうすることに
より、試料抗体は、診断用産物と標識抗−抗体の両者間
にはさまれサンドイツチの形で固相表面に結合すること
になる。次いで固相表面を洗つて未反応の標識抗−抗体
を除く。その後、固相表面、または洗浄液中の標識抗−
抗体を検出し、試料中の抗体量の指標とする。固相表面
上の反応で得られる反応生成物は、固相表面＊診断用産
物＊試料抗体＊標識抗−抗体の順序で結合している。こ
こで＊は結合を意味する。その内、表面と診断用産物と
の結合は共有結合または吸着であつてよい。また、診断
用産物と試料抗体、並びに試料抗体と標識抗−抗体との
間の結合は免疫学的な結合である。
周知の如く、ＥＬＩＳＡにおける標識は酵素であり、着
色形を与える相補的な基質と反応させた後、比色分析法
で検出する。この様な比色分析法による検出は機器化を
必要としない、という点で有利である。その他、周知の
標識には、機器的な検出に係る放射活性または蛍光測
定、等を利用するものが含まれる。
抗−抗体の酵素による標識化は、１または１以上の共有
結合で結合させる従来法で行なうのが好ましい。その様
な共有結合は外因性の、カツプリング（結合）あるいは
架橋用の分子を加えるか、もしくは、存在する側鎖と直
接的に縮合せしめることによつて達成される。この様な
目的を達成するための、機能的な架橋剤は当該技術分野
で周知である。
本発明の系は、生物学的液体中の抗体を検出するための
イムノアツセイ（免疫検定法）における、いわゆる競合
的結合法にも適用できる。この場合も、診断用産物は前
記の如く固相表面に層状に結合されている。この固相
を、検出すべき抗体を含んだ生物学的液体、並びに該検
出すべき抗体と免疫学的に同様の型である遊離状態で可
溶性の標識抗体と接触させる。結合した診断用産物と
(a)検出すべき試料中の抗体、および(b)酵素標識抗体の
両者との間で競合的な免疫反応が起こる。従つて、生物
学的液体中の抗体濃度は、固相表面に結合した酵素標識
抗体の量に反比例する。
上記の競合反応の後、液相から固相を分ける。試験管ま
たはくぼみを用いる場合には、この操作は試験管または
くぼみを洗浄することで行なわれる。この洗浄により、
固相表面から非結合−標識抗体が除去される。
次いで、固相または液相に存在する標識抗体を試料抗体
の目安として検出する。この検出は、分離した固相を、
上記酵素によつて着色した形に変換される様な可溶性の
基質を含有する溶液と接触させることにより、行なわれ
る。
上記のサンドイツチ法、または競合法は、試料中の病原
菌に対する抗体の存在が、その患者の該病原菌に対する
感染を意味するものである、と診断する場合における、
生物学的試料中の抗体測定にとつて特に有効な方法であ
る。例えば、ＨＳＶに対する抗体の測定は、患者が感染
していることを示唆するものである。
その他、ウイルス感染後の病原性抗体に対して本発明を
適用し得るウイルスには、アデノウイルス、コクサツキ
ー、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイル
ス、ネコ白血病ウイルス、肝炎、豚コレラ、インフルエ
ンザ、麻疹、ニユーカツスル病ウイルス、パラインフル
エンザ、狂犬病、ＲＳウイルス、ロータウイルス、風
疹、センダイ、水痘、等のウイルスが含まれる。また、
寄生虫感染症には、アメーバ症、バベシア症、嚢虫症、
包虫症、リーシユマニア症、糸状虫症、マラリア、幼虫
臓器移行症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、旋
毛虫症、および住血吸虫症が含まれる。その他、本発明
は生産物が宿主由来の膜結合タンパク質を含むものであ
つて、それを、該タンパク質、例えばアセチルコリン受
容体タンパク質に対する抗体を測定するのに用いる、こ
とを介して自己免疫疾患の領域にまで拡張して利用する
ことができる。
本発明の診断用産物は、該診断用分子クローニング産物
と同様の抗原決定基をもつた、生物学的試料中のポリペ
プチドまたはタンパク質の全てを、その病原性の有無に
拘らず調べるのに適用することができる。例えば、本発
明の系は、ヒト成長ホルモンおよびインシユリン様成長
因子類の如きヒトホルモン類、ヒト組織のプラスミン賦
活物質（tPA）の如き血液タンパク質、インターフエロ
ン、等の血清試料を分析するのに有用である。
その様なタンパク質類（抗原類と称する）の検出法は上
記の競合法と直接的な類似関係にある。この場合は本発
明の診断用産物ではなく抗体類を固相表面に結合させ
る。競合法の場合には、上記の如く例えば酵素によつて
標識された診断用産物を、固相−結合抗体および測定を
望む抗原決定基をもつたタンパク質を含有する血清試料
と混合する。すると不動化抗体と、検出すべき抗原およ
び酵素標識診断用産物の両者との間に競合的な免疫反応
が起こる。検出すべき抗原の濃度は固相表面に結合した
酵素標識診断用産物の濃度に反比例する。
競合反応の後、固相を液相から分け、標識した診断用産
物を測定する。
標識を診断用産物に結合させるには、前記の従来技術に
従う。例えばグルタールアルデヒド交差結合剤（cross-
linking agent）を用いて酵素標識をｇＤタンパク質に
結合させる。
試料中の抗原を測定するためのもう一つの方法は、第１
段階に競合的結合法を行ない、次いで第２段階にサンド
イツチ型結合法を行なうことからなる。第１段階では、
診断用産物は前述の如く固相表面に結合している。これ
を、測定すべき未知の抗原と既知量の相補的な抗体とを
含む液体試料と混合する。すると遊離の試料抗原と固相
表面上の診断用産物との間で競合反応が起こる。次いで
固相表面を洗い、固相上の抗体と免疫学的に反応し得
る、標識抗−抗体をこの系に加える。この段階はサンド
イツチ法に相当しており、反応生成物は、固相表面＊診
断用産物＊抗体＊標識抗−抗体の順に結合して形成され
ている。抗体と結合した標識抗−抗体の量が、液体試料
中の未知抗原の量の目安となる。
上記の方法で抗原または抗体の診断を行なうには、前述
の診断用産物を利用した試験用キツトが有用である。そ
のようなキツトの内の１つは、診断用産物と、該診断用
産物のポリペプチドの抗原決定基に相補的な抗体と特異
的に結合することのできる標識抗−抗体とを含有するも
のである。この試験用キツトは試料中の抗体を対象とす
るサンドイツチ型のＥＬＩＳＡ法に適する。
もう一つの試験用キツトは診断用産物、標識抗−抗体、
およびそのポリペプチドの抗原決定基と相補的な非標識
抗体とを含有する。この試験用キツトは試料中の抗原を
測定するためのいわゆる競合的サンドイツチ法に有用で
ある。
その他、診断用産物と、該診断用産物のポリペプチドの
抗原決定基に相補的な標識抗体とを含む試験用キツトが
ある。この試験用キツトは競合法によつて試料中の抗体
を決定するのに適する。
試験用キツト中の診断用産物は、それらが使用される態
様の溶液、または固相表面に結合した状態で含まれる。
例えば、診断用産物は、最終的なイムノアツセイに直接
使用するため、試験管または多数のくぼみを設けたシー
トの各くぼみの内部表面に層状に支持させるとよい。こ
の形態は生ウイルスを使用する場合と比較した場合、分
子クローンによる診断用産物の安定性における利点を際
立たせるものである。勿論、この形態は、分子クローン
産物が、従来のイムノアツセイに用いられていた生の病
原菌の様に感染性でないため、実験室や医療施設での試
験を極めて容易ならしめるものでもある。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例１ この実施例は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２タンパク質
からのｇＤタンパク質の生成法および確認法を示すもの
である。
詳細な記述（実施例） ウイルスの増殖とウイルス性ＤＮＡの分離 Hep２細胞でＨＳＶ−１（Hzt株）およびＨＳＶ−２（Ｇ
株）をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させた。ウイ
ルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分解酵素Ｋ
による消化とＣＳＣｌ勾配により分離した(23)。
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子のクローニン
グ 先のマツピングおよびクローニング研究でＨＳＶ−１ｇ
Ｄ遺伝子は〜6.6ｋｂのBamHI断片につきとめられた（6.
24）。ＨＳＶ−１をBamHIで切断し、アガロースゲル電
気泳動により６〜７ｋｂ領域を分離した。この断片をBa
mHIで消化したｐＢＲ３２２に連結（リゲーシヨン）
し、得られた混合物をE.coli２９４株（ＡＴＣＣNo.314
46）に導入した。制限酵素消化により、好適なＨＳＶ−
１断片を求めてアンピシリン耐性、テトラサイクリン感
受性のプラスミドをスクリーニングした。正確なｇＤを
含有するSst１断片を、Sst-1で消化したプラスミドpFM3
にサブクローンした（ヨーロツパ特許公報、第００６８
６９３号；１９８３年１月５日）。
ＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子は先にＨＳＶ−１による組み換
えによりマツピングが行なわれているが、この遺伝子の
正確な位置はまだ判つていない。そこでＨＳＶ−２ゲノ
ムの短かい単一領域(4)からの〜１０ｋｂHindIII断片
を、バクテリオフアージλクローニングベクター５９０
(25)のHindIII部位へ連結した。イソビトロ（試験管
内）でパツケージングしたフアージを低密度でプレート
に撤きＨＳＶ−１から得たｇＤ遺伝子の３２ｐ−標識サ
ブクローンとBenton-Davis法によりスクリーニングした
(26)。陽性のハイブリダイゼーシヨンを示したプラーク
を発育させ、ＤＮＡを分離し、サザーン・ブロツテイン
グおよび３２Ｐ−標識ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子とのハイブ
リダイゼーシヨン法によりｇＤ遺伝子の位置をつきとめ
た(27)。ハイブリダイゼシヨン陽性のＨＳＶ−２ｇＤ含
有断片をプラスミドpuc9へサブクローンした(28)。
ＤＮＡ配列決定とコンピユーター解析 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ｇＤ遺伝子から得た種々の
断片をｍ１３フアージベクターｍｐ９へサブクローンし
(29)、Sangerのジデオキシヌクレオチド法により配列決
定した(30)。
ヌクレオチド配列はＨＯＭプログラムを使用して解析し
た(31)。推定したタンパク質配列のヒドロパシーは１２
幅（width）および１ジヤンプ（jump）を使用して解析
した(31a)。
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２から得たｇＤ領域のクロー
ニング 他の研究でＨＳＶ−１ｇＤの遺伝子はRoizmanの命名法
に従い、6.6kb Bam HIJ断片につきとめられた（６、１
２、２４）。この断片部分を分離して配列決定を行な
い、この断片がＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子を含有することが
わかつた。ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子のＤＮＡ配列はＨＳＶ
−２ｇＤ遺伝子と比較的相同的であると予想されるの
で、この断片をＨＳＶ−２ゲノムからのｇＤ遺伝子の分
離のためのプローブとして使用した。
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ゲノムからの遺伝子の大部
分は共直線的に配列していると思われるので(35)、ＨＳ
Ｖ−１ｇＤ領域に対応するＨＳＶ−２のゲノムの短かい
単一の領域からの領域（HindIII L断片(12）をλフアー
ジベクターへクローンした。得られたプラークを32p−
標識ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子サブクローンでスクリーニン
グすると陽性のハイブリダイゼーシヨンを示したプラー
クの存在することがわかつた。このことは、二つのウイ
ルスゲノムのこの領域に、事実上核酸配列の相同性が存
在することを示唆している。フアージＤＮＡを分離し、
次いでサザーンブロツテイング解析を行なうことによ
り、ｇＤ遺伝子に対応するこの断片の領域が明らかにさ
れた。この領域をＤＮＡ配列解析のためサブクローンし
た。
暗号化領域 第１図は二つのｇＤ ＤＡＮ配列をＨＯＭプログラム(3
1)と比較したものを示している。ヌクレオチド番号の１
番は、イニシエーターメチオニンのＡＴＧのＡから始め
た。ジヤツプは、配列相同性を最大にするためにＨＯＭ
コンピユータープログラムにより導入した(31)。ヌクレ
オチド相違は＊印で示し、アミノ酸の相違は枠で囲んで
示してある。ここに報告するＨＳＶ−１のＨｚｔ株で測
定したＨＳＶ−１ｇＤ配列と、Watsonら(6)によりPatto
n株について報告された配列との間のアミノ酸の相違は
＋印で示した。矢印で示したＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子の転
写開始はWatsonらによる(32)。Ｎ−結合糖付加（グリコ
シル化）部位は陰影をつけて示してある。二つの可能性
のある“ＴＡＴＡ”配列はｇＤ転写開始への５′で示さ
れるが、第３の“ＴＡＴＡ”配列はＨＳＶ−２配列の
３′終末における２番目のオープンリーデイングフレー
ムへの５′で示される。非暗号化配列の２つの相同領域
はｇＤ遺伝子への５′−位と、ＳＶ−２配列からの２番
目のオープンリーデイングフレーム５′−位に記録され
るべきである。
ｇＤタンパク質のヒドロパシー 各糖タンパク質のヒドロパシーをHoppら(31a)によつて
開発されたプログラムを使用して解析した。第２図に示
したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の３′−末
端に存在する。１２個の長さのアミノ酸鎖を解析し、平
均ヒドロパシーを計算した。二つの糖タンパク質間の残
基の相違のうち、コンサーバテイブな変化を＊印、ノン
コンサーバテイブの変化を＋印で示す。A)はＨＳＶ−１
ｇＤタンパク質のヒドロパシーを、B)はＨＳＶ−２ｇＤ
タンパク質のヒドロパシーを示す。
ＤＮＡ配列分析の結果、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の
ｇＤタンパク質は８０％の相同性があることが明らかに
された。これらの２個のタンパク質間で見出された相違
点の大部分はアミノ末端およびカルボキシル末端領域に
あつた。これらのタンパク質のアミノ末端領域は、アミ
ノ末端メチオニンの近くにアルギニン残基を含有する高
度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水性領域は、分
泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特徴的なシグナ
ル配列であり、また多分、少なくとも一部のタンパク質
を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグナル配列であ
る(33)。最初の２０個のアミノ末端アミノ酸の比較か
ら、１型と２型との遺伝子間には、総計で１２ケ所の差
違があることが示された。然し実質的には、すべての差
異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗号化しているの
で、コンサーバテイブである。例外は、３番目の残基の
gly-arg置換と、７番目の残基のarg-gly置換である。こ
れらの置換はコンサーバテイブではないが、これらはシ
グナル領域の本質的な構造を変化させるものではない。
両遺伝子とも最初の１０個のアミノ酸の中にプラスの電
荷を有する残基を保有している。
ヒドロパシーの結果を図示した第２図では、疎水性の領
域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領域が見られ
る。この構造は膜結合型糖タンパク質の特徴であつて、
以前にも他のウイルス表面抗原で発見された（５、３
４）。その働きは細胞膜およびウイルス膜にタンパク質
を固定することにあり、そのことからウイルス感染に重
要な役割りを果たす。ｇＤタンパク質のこの領域におけ
る１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２番目の
残基に見られ、それらの大部分はコンサーバテイブであ
る。このことは、この領域のアミノ酸としての唯一条件
が、脂質二重層に架橋するために著しく無極性であると
いうことであることを示唆している。更に、恐らくタン
パク質を膜に固定させる働きをしていると考えられる膜
領域に続く領域（３６３〜３７５残基）(33)は、最初の
１３個の残基に５ケ所の変化を示し、その後に長い相同
鎖を有する。この結果から、カルボキシル末端親水性領
域の最初の１０〜１５残基は固定機能を果すだけであつ
て、従つて荷電されることだけが必要であるが、一方、
それに続く２３残基はｇＤタンパク質に特異的に重要な
何か他の機能を果しているのかも知れないことが示唆さ
れる。
この二つのタンパク質の全体にわたり、他の多くのアミ
ノ酸変化が見られるが、その変化の大部分はコンサーバ
テイブである。この事実は、第２図に示したヒドロパシ
ープログラムによつて現わされた構造によつて強調され
る。この比較で見られるように、二つの糖タンパク質は
非常に近似した図形を示す。コンサーバテイブでないア
ミノ酸変化はタンパク質のヒドロパシーを変化させない
ようである。
ＨＳＶ−１ｇＤの発現 恒久的に膜結合したｇＤを生産する細胞系を確立するた
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）、を含有しているヒト発現ベクター(36)へｇＤを含
有する断片を連結した（第３図）。第３図は、ＨＳＶ−
１糖タンパク質Ｄの発現のために組み立てられたプラス
ミドpgD-dhfrの図式を示す。この発現プラスミドは、E.
coliプラスミドpBR322から誘導された複製起原とβ−ラ
クタマーゼ遺伝子（ampr）(37)、ＳＶ−４０の初期（第
一）プロモーターのコントロール下にマウスのdhfrを暗
号化したcDNA挿入体（36、38）、および同じくＳＶ−４
０初期プロモーターのコントロール下にｇＤ遺伝子を含
有しているHindIII-BamHIの4.6kb断片から成つていた。
この断片のHindIII終末は、イニシエーターメチオニン
のコドンの５′−側へ７４bpで位置しており、mRNAのキ
ヤツプ部位を含有している。HindIII部位は、ＳＶ−４
０プロモーターのGoldberg-Hognessボツクスの３′−側
へ２５０bpで位置している。ｇＤを含有する断片の暗号
化領域は１１７９ｂｐの長さを有し、少なくとも翻訳停
止コドン、ポリアデニル化部位および糖タンパク質遺伝
子（２４，３２）の一部を含んでいる巨大（1.9kb)な
３′−領域に隣接している。
プラスミドｐｇＤ．dhfrは次のように組み立てられた：
ＨＳＶ−１ゲノムからクローンしたBamＨ１断片から、
全ｇＤ暗号配列を含有する4.6ｋｂのHindIII-BamHI断片
を分離した（上記参照）。ＳＶ４０に由来する初期プロ
モータおよびｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子から
成る2.8ｋｂのHindIII−Ｓａｌ１断片およびＤＮＡ複製
起原をプラスミドpEHBal１４から分離した。第２のＳＶ
４０の由来の初期プロモーターのコントロール下にある
マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAクローンを含有
している2.1kbのSal1-BamHI断片をプラスミドｐＥ３４
８ＨＢＶ E400D22(36)から分離した。これら３個の断
片はＴ４ＤＮＡリガーゼを使用する三重連結法（トリプ
ルリゲーシヨン）によつて互いに連結し、得られた混合
物をE.coli２９４菌株への導入に使用した。生成したコ
ロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡをSac２で消化す
ることによりスクリーニングした。正しいＤＮＡコンス
トラクシヨンpgD-dhfr（第３図）を次のトランスフエク
シヨン研究に使用した。
リン酸カルシウム沈澱法(40)を使用して、このプラスミ
ドをdhfr生産欠乏のチヤイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ）(39)へ導入した。ヒポキサンチン、グリシ
ン、およびチミジンを含まない培地で発育し得るコロニ
ーを採り、９個のdhfr+クローンを分析した。これらの
うち、５個のコロニーに、抗ＨＳＶ−１抗体を使用する
放射免疫沈降法および免疫蛍光検定で、ｇＤが検出でき
た。この５個の系列のうちの１個(gD12)を更に次の研究
用にあてた。クローンしたｇＤ遺伝子生産物を特徴づけ
るために、ｇＤ１２細胞を35S−メチオニンまたは3H−
グルコサミンで代謝的に標識し、放射免疫沈殿法により
分析した。使用した方法は次の通りである：市販の７％
のウシ胎児透析血清（Gibco）、ペニシリン（１００ｕ
／ｍ）、およびストレプトマイシン（１００ｕ／ｍ
）を添加したHamのF12培地で細胞を発育させた。培養
が約８０％まで密集した状態（confluent）になつた
ら、培地を除き、細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で
２回洗滌した後、標識培地（１／１０規定濃度のメチオ
ニンまたはグルコースを含有するDulbeccoの改良Eagle
の培地）を最終濃度0.064ｍ／cm2となるまで添加し
た。35S−メチオニン（ＳＪ．２０４、Amersham Int.）
（50〜75μCi/ｍ）または3H−グルコサミン（１００
μCi/ｍ）を加え、更に細胞を１８〜２０時間発育さ
せた。標識終了後、培地で回収し、細胞をＰＢＳで２回
洗滌し、0.02％のＥＤＴＡを含有するＰＢＳで処理する
ことによつて培養皿から除いた。次いで細胞を、ＰＢ
Ｓ、３％ＮＰ−４０、0.1％ウシ血清アルブミン、５×1
0-5M フエニルメチルスルホニルフルオリド、0.017Ｔ
ＩＵ／ｍのアポプロチニンから成る溶菌緩衝液に溶解
し、得られた溶解物を１２，０００×ｇで遠心分離によ
り透明にした。免疫沈降反応のために、細胞溶解液をＰ
ＢＳで３倍に希釈し、検液（典型的には１８０μ）を
２〜５μの抗血清と混合し、４℃で３０分間インキユ
ベートした。免疫複合体をKessler法（40ａ）により、
固定したS.aureus細胞に吸着させ、１２，０００×ｇで
３０分間遠心分離して沈澱させた。次に、s.aureus細胞
を洗滌緩衝液（ＰＢＳ．１％ＮＰ−４０、0.3％ドデシ
ル硫酸ナトリウム）で３回洗滌後、免疫複合体を２０μ
のポリアクリルアミドゲル検体緩衝液（１０％グリセ
ロール、５％２−メルカプトエタノール、0.01％ブロモ
フエノールブルーを含有する62.5mMトリス−ＨＣｌバツ
フアー、ｐＨ6.8）で９０℃で３分間溶出した。３０秒
間遠心分離後、上清をLaemmliの方法(45)に従い１０％
ポリアクリルアミドスラブゲルにかけた。
第５Ａ図はｇＤ１２細胞系とＨＳＶ−１感染細胞で得ら
れたオートラジオグラフを比較したものである：ｇＤ１
２細胞溶菌液と正常家免血清から得た対照免疫沈降（１
列目）；ＨＥＬ細胞で発育させた野性（天然）のｇｄと
単クローン性（モノクローナル）抗ｇＤ抗体、５５−Ｓ
(41)との免疫沈降（２列目）、およびＡ５４９細胞と５
５−Ｓの免疫沈降（３列目）；ｇＤ１２細胞の溶解液か
らのクローンしたｇＤと、多クローン性ＨＳＶ−１家兎
抗体（Dako Corp.）の免疫沈降（４列目）、および単ク
ローン性抗体５５−Ｓとの免疫沈降（５列目）；3H−グ
ルコサミンで代謝的に標識したｇＤ１２細胞からのクロ
ーンしたｇＤと多クローン性家兎抗ＨＳＶ−１抗体の免
疫沈降（６列目）。
ｇＤ１２細胞系から、ＨＳＶ−１タンパクに特異的な(4
1)、単クローン性抗−ｇＤ抗体、５５−Ｓまたは家兎抗
ＨＳＶ−１抗体を使用して、５９〜６０ｋｄの拡散バン
ドが特異的に沈澱したことが見られる（４および５列
目）。この分子量は、ＨＳＶ−１に感染させたＫＢ細胞
(42)から分離されたｇＤに関して報告された値とよく一
致する。同じ単クローン性抗体が、ＨＳＶ−１に感染さ
せたヒト細胞系からの類似の、しかし分子量の異なるタ
ンパク質を沈降させるのが見られる。Ａ５４９ヒト肺癌
細胞系から沈降させた主生成物は５３ｋｄであり（２列
目）、ヒト胎児肺細胞系（ＨＥＬ）から沈降させた生成
物は５６ｋｄであつた（３列目）。以前の研究(43)で、
ＨＳＶ糖タンパク質の分子量は宿主によつて変化し、こ
の相違は糖付加反応の相違に起因することが示されてい
る。ＣＨＯ細胞で生産されたｇＤタンパク質が実際に糖
付加されているかどうかを調べるために、細胞を３Ｈ−
グルコサミンで代謝的に標識した。35S−メチオニンま
たは3H−グルコサミンで代謝的に標識した後に、同一分
子量のバンドが沈降したことから（５および６列目）、
ＣＨＯ細胞で生産されたｇＤタンパク質は糖付加されて
いると結論した。
ヒト細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）およ
びＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３７）を、3.5c
mの組織培養皿で蜜に発育させ、ＨＳＶ−１を細胞当た
り１０ｐｆｕの多重度で感染させた。ウイルス感染細胞
はCohenら(44)の記載した方法と同様の方法で標識し
た。感染させてから４時間後に、培地を除去し、細胞を
新しい培養液（Dulbeccoの改良Eagle培地）で１回、更
にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１回洗滌した。1/10規
定濃度のメチオニン含有する新しい培地を、35S−メチ
オニン（Amersham、International）と共に、最終放射活
性が培地ｍ当たり７５μＣｉとなるまで細胞に加え
た。細胞を更に２０時間発育させ、次にＥＤＴＡを含有
する（0.02％）ＰＢＳで洗滌処理した細胞を回収した。
ウイルス性タンパク質を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４０、１
％ウイルス血清アルブミン、５×１０-5Ｍフエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、および0.017ＴＩＵ／ｍの
アポプロチニンから成る溶菌緩衝液に溶解した。得られ
た細胞溶解物を小型遠心機で12,000×ｇの回転数で遠沈
することにより透明にした。免疫沈降反応を行なうた
め、細胞またはウイルスの溶解液をリン酸緩衝液で３倍
に希釈し、２〜５μの好適な抗血清と混合し、４℃で
３０分間インキユベートした。抗原−抗体複合物を、固
定した１０％S.aureus溶液（Kessler(40a)）、の２５μ
を加えることによつて反応培地から除き、12,000×ｇ
で３０秒間遠心分離して沈澱させた。次に、S.aureus細
胞を洗滌用緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ−４０、0.3％ド
デシル硫酸ナトリウム）で３回洗滌し、細胞を２０μ
のポリアクリルアミドゲルサンプル緩衝液（１０％グリ
セロール、５％２−メルカプトエタノール、0.0625Ｍト
リスバツフアー（pH6.8）、0.01％ブロモフエノールブ
ルー）に懸濁させ、９０℃で３分間インキユベートし
た。３０秒間遠心分離（1,2000×ｇ）した後、上清を１
０％ポリアクリルアミドスラブゲル(45)にかけた。
クローンしたｇＤの翻訳後修飾（プロセシング）を更に
調べるために、パルスチエイス実験を行なつた。第５Ｂ
図は35S−メチオニンでパルス標識した種々の時間後
の、ｇＤ−１２細胞からのクローン化したｇＤと家兎抗
ＨＳＶ−１抗体（Dakocorp.）との免疫沈降線を示して
いる。第５Ｂ図はｇＤ１２細胞のパルス標識を示す。こ
れらの研究では、細胞は１０cmの組織培養皿で密集して
発育させ、前記と同様にして35S−メチオニンで標識さ
れるが、標識化反応は氷上で１５分間行ない、細胞は新
しい培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し、３７℃で
種々の時間インキユベートした。冷リン酸緩衝食塩液中
で細胞を洗滌することによつて反応を停止させ、前記と
同様にして細胞を溶解した。タンパク質はパルス標識
後、次の時間で免疫沈降させた：１列目、５分後；２列
目、１５分後；３列目、３０分後；４列目、６０分後；
５列目、１２０分後。５１ｋｄの分子量を有するｇＤの
前駆体型は、ｇＤ１２細胞系から、35S−メチオニンで
パルス標識後、５分後から特異的に沈降し、この前駆体
は約６０分後により高い分子量型（５９ｋｄ）の所に追
跡された。これらの検討から、本発明者らは、この翻訳
後エベントのハーフタイムは約４５分と推定した。５１
ｋｄバンドと５９ｋｄバンドとの間の前駆体−生成物の
関係は、ウイルスが生産したｇＤに関する報告（１４、
４２、４６、４７）と非常によく似ており、またこのプ
ロセスの反応速度はCohenらの記載(42)とよく類似して
いる。ウイルス感染細胞における前駆体と生成物の分子
量の相違は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴサツカライ
ドの双方に起因している(48)。
ｇＤが細胞表面へ輸送されるかどうかを調べるために、
間接免疫蛍光実験を行なつた。これらの検討では、細胞
膜を透過せしめないような条件下(49)で、固定していな
い細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗ＨＳＶ−１抗体と
反応させた。ｇＤ細胞と成体（親）ＣＨＯ細胞（１：１
の比）をカバーグラス（2.2×2.2cm）に載せ、細胞が約
６０％密集（confluent）するまで発育させた。ＨＳＶ
−１の抗体を含有することが判つているヒト血清(50)を
リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で４０倍に希釈して、洗滌
した細胞にその１００μをピペツトで滴下し、増湿箱
の中で室温で３０分間インキユベートした。細胞をＰＢ
Ｓに３回浸漬して、結合していない抗体を洗い去り、次
に２０倍希釈のテトラメチルロダミンイソチオシアネー
ト−標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Cappel Laboratorie
s）１００μと更に３０分間インキユベートした。結
合しなかつた標識抗体をＰＢＳで洗い去り、細胞を氷冷
した、５０％エタノールおよび１００％エタノール中で
脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセロールで再
水和した(49)。次に細胞を蛍光顕微鏡（Zeiss）で位相
差および蛍光光学下に検鏡した。第４図のＡは、ｇＤ１
２およびＣＨＯ細胞の位相差光学的顕微鏡像であり、Ｂ
は、Ａと同じ細胞を蛍光像で把えたものである。位相差
顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を比較すると（第４図）、ｇＤ
１２細胞は強く標識されているのに対し、成体（親）Ｃ
ＨＯ細胞は標識抗体とほとんどまたは全く結合しなかつ
たことがわかる。ＨＳＶ抗体に対してネガテイブである
ことが知られている正常マウス血清、正常家兎血清、ま
たはヒト血清で行なつた対照実験では、何ら特異的な細
胞の標識は検出できなかつた。これらの検討からｇＤは
細胞表面へ輸送されることが示唆された。細胞膜を透過
させ得ることが知られている薬剤（メタノールまたはア
セトン）で標識する前に固定したＣＨＯおよびｇＤ細胞
での実験では、異なつた標識パターンが得られた。これ
らの検討で、抗ＨＳＶ−１抗体によるｇＤ１２細胞の強
い核周囲標識が観察されたが、ＣＨＯ細胞では何ら特異
的な標識化が見られなかつた。
ｇＤ１２細胞がヒトのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染
に対し適切な抗原決定基を発現するかどうか決定するた
めに、抗ＨＳＶ−１抗体または抗ＨＳＶ−２抗体を有す
ることが判つている個体(50)から得た抗体の結合性を検
討した。代謝的に標識したｇＤ１２細胞から得られた細
胞溶解物の放射免疫沈降反応では、けつ歯類の抗ＨＳＶ
血清で得られた結果に匹敵し得る結果を得た（第５
図）。同様に、ヒト抗ＨＳＶ−１血清は、間接的免疫蛍
光測定法により、特異的なｇＤ１２細胞の標識化を示す
（第４図）が、成体ＣＨＯ細胞系を標識化しなかつた。
これらから、種々のけつ歯類の抗ＨＳＶ−１および抗Ｈ
ＳＶ−２抗血清、単クローン性抗ｇＤ抗体およびヒト抗
ＨＳＶ抗血清によつて得られた結果は、ｇＤ１２細胞表
面に発現されたｇＤは、野性の該ウイルスと共通した多
くの抗原決定基を有しており、しかもこれらの決定基の
構造は他のＨＳＶ−１タンパク質との相互反応に依存し
ていないという証拠を提供している。試験した単クロー
ン性抗体の一つ（１−Ｓ）がインビトロ(41)およびイン
ビボ(51)でＨＳＶ−１を中和することが知られている事
実は、ＣＨＯ細胞で生産されるｇＤが野性のウイルスと
共通した中和抗原決定基を少なくとも１個は有している
ことを示している。
実施例２ この実施例は、実施例１で得られたｇＤ１２細胞を、酵
素免疫測定法（enzyme-linked immunosorpton assay；
ＥＬＩＳＡ）(52)で、ｇＤ１２細胞と結合した抗−ＨＳ
Ｖ抗体の結合を定量するための、サンドイツチ型イムノ
アツセイに用いる方法に関するものである。
ｇＤ１２細胞に対する抗ＨＳＶ抗体の結合を定量的に測
定するために酵素標識イムノソープシヨンアツセイ（en
zyme-linked immunosorption assay）（ＥＬＩＳＡ）が
開発された(52)。今回の研究では、９６穴のマイクロタ
イター組織培養平板を使用し、ｇＤ１２細胞とＣＨＯ細
胞を交互の穴に加え、化学的に固定した。次にＨＳＶに
対する抗体を有することが判つている種々の抗血清を連
続的に逐次希釈して加え、固定した細胞と反応させた。
測定の終末点で、各穴の吸光度を測定し、正常な結合曲
線を作成した。ｇＤ１２細胞に対する抗体の特異的な結
合は、ｇＤ１２細胞で得られた値から成体ＣＨＯ細胞で
得られた値を減じることによつて決定した。高い力価の
血清による特異な結合は１：１０，０００に希釈して検
出することができた。
ｇＤ１２細胞ＥＬＩＳＡ測定法を使用して測定した血清
力価を、通常の方法により決定した抗ＨＳＶ−１をＨＳ
Ｖ−２力価と比較した。予じめ通常の方法、即ち、血液
凝集阻止反応（ＩＨＦ）または補体結合反応（ＣＦ）で
ＨＳＶに対する力価測定を行なつたヒト血清(50)を逐次
希釈し、ｇＤ１２細胞系または成体ＣＨＯ細胞系を含有
するマイクロタイター板の孔に加え、抗ｇＤ抗体の結合
をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。ｇＤ１２細胞と、ＣＨＯ
細胞は９６穴のマイクロタイター組織培養平板（Falcon
Labware）の穴に交互に植え、１０％ウシ胎児血清を加
えたＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ）中で、密集して発育させ
た細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で３回洗滌し、次
に0.0625％グルタールアルデヒドを加えたＰＢＳで化学
的に固定した。細胞は再度ＰＢＳで３回洗滌し、所望の
時期まで、１％ウシ血清アルブミン、１００mMグリシ
ン、１mMＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で４℃で貯蔵し
た。抗ｇＤ抗体力価を測定するには、細胞をＰＢＳで洗
滌し、逐次希釈した抗血清を固定した細胞と室温で１時
間反応させた（最終容量５０μ）。結合しない抗体を
洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Tago I
nc.）とカツプリングさせたヤギの抗ヒトＩｇＧ（１：2
000希釈）５０μとインキユベートした。酵素を結合
した抗体を室温で１時間反応させ、次に細胞をＰＢＳで
３回洗滌した。インキユベーシヨンの後、ペルオキシダ
ーゼの基質、Ｏ−フエニレンジアミンを加え（２００μ
）、更に１０分間反応を進行させた。2.5MH2SO4（50
μ）を加えて反応を停止し、各穴の反応液の吸光度を
自動プレートリーデイングスペクトロフオトメーター
（Titertek）で測定した。第６図において、白丸および
黒丸で表わした血清は、１２８のＨＳＶ−１ＣＦ力価、
および４０９６のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＩＨＦ
力価を示している。白の四角および黒の四角で表わした
血清は、８以下のＨＳＶ−１ＣＦ力価、８以下のＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２ＩＨＦ力価を示している。Ａ図の
黒丸および黒の四角はｇＤ１２細胞との結合を示し、白
丸および白の四角はＣＨＯ細胞との結合を示す。Ｂ図の
黒丸および黒の四角は、Ａにおける値を差引いて算出し
たｇＤ１２細胞への特異的な結合を示す。第６図から、
通常の方法による測定で高い抗ＨＳＶ力価を示した血清
は、ＥＬＩＳＡ法でも高い力価が得られるが、一方、低
い抗ＨＳＶ力価の別の血清ではｇＤ１２ＥＬＩＳＡで検
出し得る結合が得られないことが判る。
記載した検討から、安定した細胞系列は、ヘルペスウイ
ルス感染によつて生じる抗体と結合するトランスフエク
ト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現することが証
明された。
種々の選択マーカーを用いたトランスフエクシヨン（Ｄ
ＮＡ感染）を行なうことができる。例えば、マウスＬ細
胞は、通常、変異体dhfr遺伝子を選択マーカーとしてト
ランスフエクトされ得る。ｇＤ遺伝子を、その様なマー
カーを有する（harboring）ベクターを介して上記の細
胞にトランスフエクトした。
ｇＤ１２の様な細胞系を用いることができ、特に、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２感染症の臨床的な診断に用いる
とよい。診断薬開発の可能性は、クローン細胞系が出現
することに基づいている。何故ならば、それによつて安
定で、充分に定義づけられた、抗原の再生産源が供給さ
れることになるので、培養の必要性並びに感染性物質に
よる汚染のおそれがなくなるからである。細胞基盤の診
断系をＥＬＩＳＡ型で行なうときには、抗体の決定は２
時間またはそれ以内で完了することができ、血清の必要
量は５０μ以下である。
実施例３ この実施例は発現された膜−結合タンパク質からの膜の
除去に関するものである。
上記の記載は膜−結合ｇＤタンパク質の生産に関するも
のである。しかしながらFig．２に関して既に論じた様
に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＤタンパク質のア
ミノ酸配列の分析により、これらの各々は疎水性／親水
性カルボキシ−末端の膜結合領域において同一であるこ
とがわかつた。
ＨＳＶ−１糖タンパク質（ｇＤ）の模式図 遺伝子配列から導かれたｇＤ遺伝子配列のヒドロパシー
解析(31a)から、タンパク質の疎水性領域（陰影部分）
および親水性領域（＋印）が決定された。膜に局在し、
結合するのに重要であると思われる領域だけを示した。
機能的領域は、a)シグナル配列(33)、b)疎水性の膜透過
領域、c)荷電している膜固定領域である。推定される３
ケ所のＮ−連結糖付加部位はＧの文字で示す。発現プラ
スミドは、PBR322の細菌性複製起源とアンピシリン耐性
遺伝子、ＳＶ４０初期（第一）プロモーターの転写コン
トロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子を暗号化しているcDNA挿入体(53)、および第２のＳＶ
４０初期プロモーターの転写コントロール下にあるｇＤ
の最初の３００アミノ酸を暗号化しているHindIII-Hinf
1断片から成る。この断片のHindIII部位は、ｇＤ遺伝子
のイニシエーターメチオニンの５′−位側へ７４ｂｐに
位置している。ＳＶ−４０の初期領域ベクターのHindII
I部位(36)はＳＶ４０プロモーターのGoldberg-Hogness
ボツクスの３′−位側へ２５０ｂｐに位置している。Hi
nf1部位（Klenow ＤＮＡポリメラーゼと４デオキシヌ
クレオチド−３リン酸で平滑化した）を、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原遺伝子の３′非翻訳領域のHpal部位(36)
へ連結（リゲーシヨン）する。この方法は先端切断ＨＳ
Ｖ−２遺伝子を生産するのにも有用である。得られた配
列は、ｇＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ後に停止コド
ン（ＴＡＡ）を作り出す。先端切断ｇＤ遺伝子転写のた
めの転写停止およびポリアデニル化部位は、Ｂ型肝炎表
面抗原遺伝子の３′非翻訳領域(36)により暗号化されて
いる。
プラスミドｐｇＤtrunc.d hfrは次のようにして組み立
てられた。ｇＤを含有している2.9キロベースのSac1断
片を、Sac1で切断したプラスミドｐＦＭ３（前述）中で
ＨＳＶ−１ゲノム（前述）からクローンしたBamH1断片
から分離した。完全なｇＤ遺伝子を含有する1.6kbHindI
II-BstN1断片を、HindIII-BstN1で消化したpFM42（ＥＰ
Ｏ特許出願第６８６９３号）ヘサブクローンした。次
に、このプラスミドをHinf1で切断し、KlenowＤＮＡポ
リメラーゼと４個のデオキシヌクレオチド−３リン酸で
平滑化し、次いでHindIIIで切断した。先端を切断した
ｇＤ遺伝子を含有する９６０塩基対（ｂｐ）のHindIII
−ブラント（平滑化）Hinf1断片を分離し、Hind III-Hp
a1で消化したｐＥＨＢａｌ１４へ連結した。得られた組
み立て体（pgDCos-trunc）は、その３プライム末端にＢ
型肝炎ウイルスの表面抗原遺伝子を持つた先端切断ｇＤ
遺伝子を含有していた。先端を切断されたｇＤ遺伝子を
含有する2.3ｋｂHind III−BamH1断片をpgDCos-truncか
ら分離した。ＳＶ−４０由来の初期プロモーターおよび
pBR322アンピシリン耐性遺伝子および細菌性複製起源を
含有する2.8ｋｂ断片をプラスミドpEHBal 14から分離し
た。第２のＳＶ−４０初期プロモーターの転写コントロ
ール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ
クローンを含有する2.1ｋｂ断片をプラスミドｐＥ348Ｈ
ＢＶＥ４００Ｄ２２(36)から分離した。これら３個の断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた混合物をE.
coli細菌株２９４への導入に使用した。得られたコロニ
ーから得たプラスミドＤＮＡをSac2でスクリーニング
し、正確に組み立てられたpgDtrunc.dhfr（第８図）を
更にトランスフエクシヨン研究に使用した。
プラスミドpEHBal14は、SV-40−肝炎ウイルスのキメラ
遺伝子であるpE342ΔR1（後述）を×ｂａＩで開裂する
ことにより、一度ＨＢＶ表面抗原の暗号化領域において
開裂し、引続きこの×ｂａＩ部位の周囲の配列をヌクレ
アーゼBal31を使用して除去することにより組み立て
た。このプラスミドを合成オリゴヌクレオチド５′−AG
CTGAATTCの存在下でライゲートした。これにより、ＨＢ
Ｖ ＤＮＡにHind III制限部位が加わる。
得られたプラスミドを、〜１５０ｂｐのEcoR1-Hind III
断片についてスクリーニングした。pEHBal14の配列決定
をし、Hind III部位はHBsAg開始コドンが標準的に見出
される場所のすぐ上流の位置に存在することが確かめら
れた。このように、この組み立てにより、クローンする
のに好適な独特のHind III部位が、高度に発現されるタ
ンパク質（HBsAg）の翻訳開始位置に置かれる。タンパ
ク質を高度に発現するのに必要ななんらかの推定される
シグナルが、この５′−リーダ配列上に存在するはずで
ある。
ＨＢＶ表面抗原を発現するプラスミドpE342（pHBs348-E
とも呼ばれる）は、ＥＰＯ公報第００７３６５６号（１
９８３年３月９日）にLerinsonらにより記載されている
（簡単に説明すると、SimianウイルスＳＶ４０の起源
は、ＳＶ４０ＤＮＡをHimd IIIで消化し、コンバーター
（ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を加えることによりHind III
末端をEcoRI末端へ変換することによつて分離した。こ
のＤＮＡをPvuIIで切断し、ＲＩリンカーを加えた。次
いでEcoRIで消化した後、起源にまで及ぶ３４８塩基対
（ｂｐ）の断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動およ
び電気溶出法により分離し、pBR322にクローンした。Ｈ
ＢＶをEcoRIおよびBgIIIで消化して得られた１９８６ｂ
ｐ断片（Animal Virus Genetics、(Ch.5)Acad.Press,N.
Y.(1980)）（これはHBsAgを暗号化している遺伝子にま
で及ぶ）をプラスミドｐＭＬ（Luskyら、Nature,293：7
9（1981））のEcoRIとBamHI部位にクローンすることに
よつて、発現プラスミドpHBS342-Eを組み立てた。（ｐ
ＭＬは、サル細胞におけるプラスミド複製を抑制する配
列を欠失したpBR322の誘導体である）。次に、得られた
プラスミド（pRI-Bg1）をEcoRIとつなぎ、ＳＶ４０の起
源領域を表わす３４８ｂｐの断片をpRI-Bg1のEcoRI部位
へ導入した。起源断片はどちらの方向からでも挿入でき
る。この断片は複製起源だけではなく、初期および後期
ＳＶ４０プロモータの両方を暗号化しているので、ＨＢ
Ｖ遺伝子はこの方向によつてどちらかのプロモータのコ
ントロール下に発現されることができる（HBsを表わすp
HBS-348-Eは初期プロモーターのコントロール下に発現
される）。pE342は、EcoRIで部分消化し、klenowDNAポ
リメラーゼＩを使用して切断部位を充填し、プラスミド
の背後同志を連結（リゲーシヨン）し、pE342のＳＶ４
０起源に先行するEcoRI部位を除くことにより修飾され
た。得られたプラスミドはpE342ΔRIと命名した。
得られた配列はｇＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ後に
停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端を切り取つたｇ
Ｄ遺伝子の転写停止部位とポリアデニル化部位は、Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原の非翻訳３′領域(36)によつて暗
号化されている。
生成したベクターをdhfr-CHO細胞系(39)ヘトランスフエ
クシヨン（ＤＮＡ感染）させ、先端を切り取つたｇＤタ
ンパク質を生産し、それを周囲の媒質へ分泌する好適な
クローンｇＧ10.2を選択した。タンパク質を媒質から抽
出し、細胞の免疫原性活性を試験した。第９図に、細胞
内および細胞外の35S−メチオニン標識抽出物の免疫沈
降試験の成績を示す。
細胞連合型および分泌型ｇＤの放射免疫沈降試験 市販の透析した７％のウシ胎児血清（Gibco）、ペニシ
リン（１００ｕ／ｍ）、およびストレプトマイシン
（１００ｕ／ｍ）を添加したHamのF12培地（Gibco）
に細胞を発育させた。培養が約８０％に密集した時に、
培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２
回洗滌し、標識培地（1/10規定濃度のメチオニンを含有
するDulbeccoにより改良されたEagle培地）を最終濃度
0.05ｍ／cm2となるまで加えた。35S−メチオニン（S
J.204、Amersham Int.）を最終濃度５０〜７５uCi/ｍ
となるまで加え、細胞を１８〜２０時間発育させた。標
識後、培地を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗滌し、0.02
％ＥＤＴＡを加えたＰＢＳで処理することにより培養皿
から除いた。次に細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４０、0.
1％ウシ血清アルブミン、５×１０-5Ｍフエニルメチル
スルホニルフルオリド、および0.017TIu/ｍのアポプ
ロチニンから成る細胞溶解緩衝液に溶解し、得られた溶
解液を12,000×ｇで遠心分離することにより透明にし
た。免疫沈降反応に使用するため、細胞溶解液をＰＢＳ
で３倍に希釈し、検液（標準的には１８０μ）を２〜
５μの抗血清と混合し、４℃で３０分間インキユベー
トした。分泌型のｇＤを免疫沈降するため、５００μ
の条件培地を２μの抗血清と３０分間、４℃でインキ
ユベートした。免疫複合体はkesslerの方法(40a)により
固定したS.aureus細胞に吸着させ、12,000×ｇで３０分
間遠心分離して沈降させた。次に、S.aureus細胞を洗滌
緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ−４０、0.3％ドデシル硫酸
ナトリウム）で３回洗滌し、免疫複合体を２０μのポ
リアクリルアミドゲルサンプル緩衝液（１０％グリセロ
ール、５％２−メルカプトエタノール、0.01％ブロモフ
エノールブルーを含有する62.5mMトリス−HCl緩衝液（p
H6.8））で、９０℃で３分間溶出した。３０秒間遠心
後、Laemmliの方法(45)に従い、上清を１０％ポリアク
リルアミド平板（スラブ）ゲルに掛けた。Ａ：ｇＤ１２
細胞系から得た全膜結合型ｇＤの免疫沈降線。Ｂ：２個
の別個に誘導した細胞系（１および２）の溶解液から得
た先端切断ｇＤの細胞連合型の免疫沈降線。Ｃ：Ｂに示
した２個の細胞系の培養上清から得られた先端切断ｇＤ
の免疫沈降線。（−）は、対照家兎抗血清を示し、
（＋）は、家兎抗ＨＳＶ−１抗血清を示す（Dako Cor
p）。
図に見られるように、35,000ダルトンの細胞内型、およ
び分泌され、明らかに糖付加されている細胞外ｇＤタン
パク質が明瞭である。
免疫感作に使用する先端切断ｇＤの製造 ｇＤ10.2細胞を、ポリスチレン製回転組織培養瓶（Corn
ing25140）で、市販の透析した７％ウシ胎児血清、５０
μｇ／ｍのストレプトマイシン、および0.3μｇのグ
ルタミンを添加したＦ１２培地中で密に発育させた。密
生後、培地を除き、ウシ胎児血清を含まない同じ培養液
で３回洗滌し、２mg/ｍのHepes緩衝液（血清を含まな
い培地）を添加した。細胞を血清を含まぬ培地中で３〜
４日発育させ、次に条件付き培地を回収して、−２０℃
で貯蔵した。培地を３７℃で融解し、Sorvall GS-3ロー
ターで２０分間５００rpmで遠心した。遠心後、ペレツ
トは破棄し、上清はＹＭ−５限外過膜を備えた限外
過装置（Amicon）で濃縮した。得られた標品を出発物質
と比較して約１５０倍に濃縮したところ、１当たり約
８mgのタンパク質を含有していた。次にこの標品をリン
酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）でよく透析し、それ以上精製す
ることなく免疫感作に使用した。
先端を切断されたタンパク質を診断に適用することに
は、それが細胞外の培地中に分泌されたものであるため
に、全細胞標品中に存在するものよりもはるかに少ない
タンパク質で汚染されているにすぎない、という利点が
ある。
本発明においては、タンパク質の生産に永久細胞系（pe
rmanent cell line）を用いる点が注目されるであろ
う。トランスフエクシヨンに際し、ベクターは細胞系の
ゲノムに取り込まれ、該細胞系は細胞溶解を起こすこと
なくそのタンパク質を生産することができる。この細胞
系は上記の如くタンパク質の連続的な生産、特に細胞か
ら分泌される様な先端を切断された形のタンパク質の連
続的な生産に用いることができる。例えば、先端の切断
されたタンパク質を発現する細胞を、灌流系内に入れ、
抗原に富む培地を細胞の周囲から除き、新らしい培地と
置き換えることを連続的に行なうことにより、継続的に
使用することができる。
ここで用いる特殊な細胞系はdhfrの生産を欠くＣＨＯ系
細胞にdhfrマーカーを含有するベクターをトランスフエ
クトした細胞系である。適当な条件(54)の下で細胞系を
メトトレキセート（Mtx）にさらすことにより、dhfrの
生産、従つて結合したｇＤタンパク質の生産が増幅され
る。先端を切断されたｇＤ遺伝子のdhfCHO細胞へのト
ランスフエクトにより導かれた３つの細胞系を平板上に
並行におき、35S−メチオニンで標識し、免疫沈殿に付
した結果を第２図に示す。図中、第１列および第２列は
メトトレキセートによる選択に先立つて独立に単離した
２個の細胞系から調整した５００μの培地から免疫学
的に沈殿させた、分泌ｇＤの量を示すものである。第３
列は、２５０nMのメトトレキセート中での増殖に基づい
て選択した１つの細胞系（ｇＤ10.2.2）から調整した等
量の培地で免疫学的に沈殿させた先端切断ｇＤの量を示
すものである。第１〜３列の場合には、免疫沈殿にウサ
ギ抗−ＨＳＶ−１抗体（DakoCorp）を用いた。第４列は
ｇＤ10.2.2細胞系の５００μの培地から健常なウサギ
の血清で免疫沈殿させて調整した対照である。
メトトレキセート中での選択の前、並びに後における細
胞系により、培地中に分泌される先端を切断されたｇＤ
の相対量を定量するために競合的ＥＬＩＳＡ分析を行な
つた。膜結合形ｇＤを発現するｇＤに細胞を平板から取
り、９６個のくぼみを有する微量力価検定用プレートの
表面に、前記の如くグルタールアルデヒドと共に固定し
た。先端の切断されたｇＤを生産することがわかつてい
る種々の細胞系から調整した培地を微量検定用プレート
の横方向に連続的に希釈して配し、一定量（２μ）の
ウサギ抗−ＨＳＶ−１抗体（Dako Corp）と共に、２０
℃で１時間インキユベートした。各くぼみをＰＢＳで３
回洗浄することにより非結合状態の抗体と可溶性の、先
端切断ｇＤ−抗体コンプレツクスとを除いた。次いで固
定細胞を、ヤギの抗−ウサギIgGと結合した西洋ワサビ
のペルオキシダーゼと２０℃で１時間反応させ、pBSで
３回洗浄して結合しなかつた抗体を除いた。次いで比色
用の基質であるＯＰＤ（ｏ−phenylene diamine）を各
くぼみに加え、結合した西洋ワサビペルオキシダーザ−
抗体コンプレツクスと１５分間反応させた。硫酸を最終
濃度が0.25Ｎになる様に加えて反応を終結させた。各く
ぼみのＯＰＤの吸光度を、自動微量力価検定プレートス
キヤナー（Titertek multiskan）を用いて測定し、希釈
曲線をプロツトした。抗−ＨＳＶ−１抗体のＣＨＯ親細
胞系への結合を、各希釈物における非特異的な結合を知
る目安とした。各培養上澄み中の先端切断ｇＤの量は、
各くぼみにおける吸光度に反比例する。白丸（○）は、
メトトレキセートで増幅する前の先端切断ｇＤ分泌細胞
によつて調整された培地の存在下における抗ＨＳＶ−１
抗体のｇＤ１２細胞への結合を表わす。黒丸（●）は、
２５０nMのメトトレキセート中での増殖に基づいて選択
されたｇＤ10.2.2細胞によつて調整された培地の存在下
での抗ＨＳＶ−１抗体のｇＤ10.2.2への結合を示すもの
である。白四角（□）は、増幅されていない先端切断ｇ
Ｄ分泌細胞から調整した１００倍濃縮培地の存在下にお
ける抗−ＨＳＶ−１抗体のｇＤ１２細胞への結合を示し
ている。この工程は、２５０nMのMtx中で増幅可能であ
り、親細胞のｇＤ10.2.細胞系よりも約２０倍多量の先
端切断ｇＤを培地に分泌することのできる増殖細胞系ｇ
Ｄ10.2.2を生産するｇＤ10.2細胞系に関して行なつた
（第１０、１１図参照）。
dhfr標識／増幅系は外来性ＤＮＡを得、安定的に取り込
むことのできる他の細胞についても用いることができ
る。
本発明において、膜との結合に関与する疎水性−親水性
カルボキシ末端領域部分を欠いた、先端を切断された形
の膜結合タンパク質を実際に示すことに成功した、とい
うことは他の免疫性膜結合型タンパク質についても同様
の結果が期待でき、かくしてウイルス、寄生虫その他の
病原性微生物に対するワクチンのより優れた供給源を与
え得る、ということを免疫学的に示唆するものである。
先の実施例において、ｇＤタンパク質のＤＮＡは、制限
部位（制限酵素切断部位）が存在するので、残基（resi
due）３００の位置で好都合に先端を切断された。その
結果、第２図のハイドロパシー図からわかる様に、カル
ボキシ末端の疎水性／親水性領域が完全に除かれた。実
際は、それに先行する残基３０１〜３３２領域も除去さ
れているが、このことは該タンパク質の免疫学的な特性
を破壊しないように思われる。従つて、このタンパク
質、およびおそらく他の免疫学的な膜結合性タンパク質
についても、そのタンパク質が周囲の培地に分泌され得
る様、膜結合性を除くのに有効である限りにおいて、そ
の切断程度を所望によりかなり少なくすることができ
る。
実施例４ 実施例４はＨＳＶ−２ｇＣタンパク質（以前はgFタンパ
ク質と命名されていた。）に関する。
細胞、ウイルス、およびＤＮＡ分離 ＨＳＶ−２（Ｇ株）を0.1インプツト多重度HEp2細胞に
感染させた後この細胞培養を、１０％ウシ胎児血清およ
び抗生物質を含有するDulbeccoの改良Eag1培地で３日
間、３３℃で増殖させた。ＨＳＶ−２ＤＮＡは、前述の
ようにプロテイナーゼｋで消化し、CSCl超遠心により分
離した(23)。
DNA操作 制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼklenow断片、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ、およびＴ４ポリヌクレチオドキナーゼはBeth
esda Research Labsから購入し、提供者の指示に従つて
使用した。
ＨＳＶ−２ＤＮＡ制限断片の分子クローニング EcoR1で消化したＨＳＶ−２ＤＮＡを５％ポリアクリル
アミドゲルで処理することにより、ＨＳＶ−２ゲノムの
地図でほぼ0.650の位置に相当するEcoR1“Ｐ”断片を分
離した。分離した断片を、EcoR1で消化したpuc9(28)へ
クローンした。このプラスミドはpuC-R1Pと呼ばれた。
次に、puC-R1Pサブクローンを、EcoR1“Ｐ”断片を含有
するＨＳＶ−２ゲノムのSac1断片の位置を突き止めるの
に使用した。サザーンブロツテイング実験(27)によつ
て、ＨＳＶ−２の4.9kb Sac1フラグメントがEcoR1
“Ｐ”断片を含有していることがわかつた。この断片を
0.7％アガロースゲルで分離し、独特のSac1部位(55)を
含有しているpBR322誘導プラスミドヘクローンした。こ
のプラスミドは“pBRSac1-E”と呼ばれた。更に、pBRSa
c1-“Ｅ”の制限酵素分析によりEcoR1“Ｐ”断片と配列
相同性を有する2.9kbのSall断片が証明され、前述と同
様にしてSallで消化されたpuC9ヘサブクローンした。こ
のプラスミドはpgC2Sa12.9と呼ばれた。
クローンしたＨＳＶ−２ＤＮＡのＤＮＡ配列解析 ＤＮＡ配列の大部分はジデオキシヌクレオチドチエーン
ターミネーシヨン法を使用して決定した。種々の断片を
複製型のm13フアージベクター、mp7、mp8、およびmp9に
サブクローンし、前述したようにＤＮＡ配列を決定した
(29)。幾つかの場合には、断片を、γ−32P-ATPと4ポリ
ヌクレアーゼを用いてその５′−位を32Pで標識し、断
片のＤＮＡ配列を化学的分解法を使用して決定した(5
6)。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコンピユータを使用
する解析はＨＯＭプログラムを用いて実施した(57)。推
定したアミノ酸配列のヒドロパシーは１２アミノ酸幅、
１ジヤンプ法を使用して解析した(31a)。
ＨＳＶ−２ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析 制限エンドヌクレアーゼでＨＳＶ−２ＤＮＡを消化し、
プラスミドＤＮＡを1.5％アガロースゲル上で分画し、
標準的な方法でニトロセルロース上にブロツト（移し換
え）した。第１２図で星印を付したSac2断片の一本鎖
は、ＤＮＡポリメラーゼ１のklenow断片で充填し、得ら
れた平滑末端断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、
Sma1で消化されたm13m7複製型(29)に連結（ライゲーシ
ヨン）した。このライゲーシヨンおよびトランスフエク
シヨンにより調製された一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのklenow断片を使用し、高い特異的活性（１×
１０9cpm/μｇ）を有する32P−標識−本鎖プローブＤＮ
Ａの合成の鋳型として使用した。ハイブリダイゼーシヨ
ンは標準的な方法を使用した(27,58)。
結果 ＨＳＶ−２ゲノムのｇＦ暗号化領域の分子クローニング ＨＳＶ−２のｇＦ遺伝子を分離するのに採られた方針
は、この遺伝子がＨＳＶ−１ｇＣ遺伝子と共直線的（コ
リニアー）であるという仮定に基づいていた。この仮定
は、ＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｃと抗原的に相関性のあ
る75,000ダルトンの糖タンパク質ｇＦがＨＳＶ−２中に
発見されたこと、およびこのタンパク質のための遺伝子
がＨＳＶ−１ｇＣ遺伝子とほぼ共直線的であると言う最
近の知見によつて支持されていた(22d、59)。また、ＨＳ
Ｖ−１ｇＣおよびＨＳＶ−２ｇＦの双方に結合する単ク
ローン性抗体が分離されたことは、この二つのタンパク
質が相互に相同的であるかも知れないことを更に示唆し
ている(22f)。従つて、ＨＳＶ−ｇＣ遺伝子と共直線的
であるＨＳＶ−２ゲノム領域のＤＮＡ配列を解析すれ
ば、ＨＳＶ−２ｇＦ遺伝子の配置を突き止めるタンパク
質配列情報の手懸りが得られるであろうと考えられた。
ＨＳＶ−２ゲノムの６００塩基対のEcoR1“Ｐ”断片は
〜0.650の位置に存在することがわかつた(12)。この領
域は、ＨＳＶ−１ゲノムの約0.630〜0.640に位置するＨ
ＳＶ−１ｇＣ遺伝子の既知の暗号化領域(59)とほぼ共直
線的である。この断片はＨＳＶ−２ＤＮＡのEcoR1消化
物から分離され、プラスミドpuc9(28)にクローンされ、
そのＤＮＡ配列が決定された(29、56)。得られた配列を
ＨＳＶ−１ｇＣ配列と比較すると(59)、EcoR1“Ｐ”断
片とＨＳＶ−１ｇＣ暗号化領域の３′−末端の間の高度
の配列相同相性が見られた。それ故、ＨＳＶ−１ｇＣ遺
伝子と相同性であるＨＳＶ−２遺伝子の残りの部分十分
に含んでいるEcoR1“Ｐ”断片と重複しているＨＳＶ−
２ゲノムＤＮＡから、Sac1制限エンドヌクレアーゼ断片
を分離するプローブとして、このEcoR1“Ｐ”を使用し
た。第１２図には、EcoR1“Ｐ”断片を含んでおり、Ｄ
ＮＡ配列解析に使用した2.9kbのSal1断片をＨＳＶ−２
ゲノムから分離するのに要した手順を図示した。
ＨＳＶ−２ゲノムのEcoR1“Ｐ”領域のＤＮＡ配列解析 EcoR1“Ｐ”断片との配列相同性に基づき、ＨＳＶ−２
ゲノムから分離した4.3kbのSac1“Ｅ”断片を更に消化
して、2.9kbのSal1断片を得て、これをpgC2Sal2.9と命
名した。第１２図は、ジデオキシヌクレオチド配列決定
法(29)または化学的分解法(56)のいずれかによりＤＮＡ
配列解析が行なわれたpgC2Sal2.9からの断片を示してい
る。更にこの図は、pgC2Sal2.9の中のEcoR1“Ｐ”断片
の位置と同時に、ＨＳＶ−２ゲノムの〜0.628の位置のB
g1II“Ｎ”断片の右側末端に相当するBg1II部位の位置
を示している(12)。
更に詳細に述べると、第１２図は、ＨＳＶ−１ｇＣと共
直線的に配置しているＨＳＶ−２領域、pgC2Sal2.9のク
ローニングを示している。〜0.61〜0.66に配置している
ＨＳＶ−ゲノムの領域は、６００塩基対のEcoR1“Ｐ”
断片をプローブとして使用し、Sac1断片（pBR-Sac
“Ｅ”）としてクローンした。pBRSac“Ｅ”のサブクロ
ーン、pgC2Sal2.9はＤＮＡ配列解析に使用した。矢印は
配列化された領域を表わし、その配列から誘導された主
な47.9アミノ酸のオープンリーデイングフレームの位置
が図示されている。EcoR1“Ｐ”断片を略示するEcoR1部
位、およびBg12“Ｎ”断片の右端にあるBg12部位（地図
の〜0.628の位置）(26)を含む種々の制限部位が示され
ている。星（★）印で示してあるSac2断片は、この領域
に出現する欠失を調べるために行なつたサザーンブロツ
テイング実験に使用した（結果参照）。Sm；Sma1，Sa；
Sac2，Rs：Rsa1，Bg；Bg12，Pv；Pvu2，R1；EcoR1など
の他の部位はＤＮＡ配列決定実験に使用した。
第１３図はpgC2Sal2.9から得られたＤＮＡ配列をＨＳＶ
−１ｇＣ領域のＤＮＡ配列(59)と比較して示している。
ＨＳＶ−１ｇＣ領域（ＨＳＶ−１）とpgC2Sal2.9から得
た配列（ＨＳＶ−２）はＨＯＭプログラム(57)を用いて
比較した。種々の欠失は配列の重複を最大化するのに使
用されたから、わかり易くするためにスペースを含むす
べての位置に番号を付けた。星印は一致しないヌクレオ
チドの上に付けた。ＨＳＶ−１配列の４３位にある下線
を引いた“Ａ”残基は、gCmRNAのほぼ転写開始部位であ
る(59)。“TATA”１、および“TATA”２は、それぞれＨ
ＳＶ−１ｇＣmRNAと７３０塩基mRNAの転写コントロール
領域と推定される(59、60)。ＨＳＶ−１配列の1728の位
置に挿入されたＴ残基は、この領域の配列再決定により
発見され（M.Jackson.未発表）、それはＨＳＶ−２の主
オープンリーデイングフレームの停止コドンと相同であ
る1735〜1737の位置にインフエース停止コドンを導入す
るものであることが明らかにされた。第２ＨＳＶ−２開
始コドンの位置が1975〜1977であるように、ＨＳＶ−１
の７３０塩基mRNA開始コドンの位置は、2032〜2034に示
されている。
再び第１３図において、ＨＳＶ−２の図示された誘導配
列をＨＳＶ−１のｇＣ遺伝子領域のＤＮＡ配列(59)と比
較すると、これら二つの断片間の全体的な配列相同性は
約６８％であつた。然しながら配列のある一定の領域を
見ると、配列相同性の程度は他に比較してはるかに高い
か、または低かつた。例えば、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の０〜５７０位の配列は僅かに５１％の相同性しか示さ
ないが、５７０〜1740位の領域は、遥かに高い配列相同
性を示した（８０％）。もう一つの相同性の高い領域
（７０％）は二つの配列の終りの1975位〜2419位に見出
された。ヌクレオチド配列の変化に加えて、二つのゲノ
ムを相互に比較すると、種々の欠失または挿入が見られ
た。最も顕著なのはＨＳＶ−１ｇＣ配列の３４６〜４２
６の位置に見られる８１塩基対の領域が、ＨＳＶ−２ゲ
ノムでは失われていることであつた。この全体的な配列
比較から、ここに配列決定を行なつたＨＳＶ−１ｇＣ領
域とＨＳＶ−２領域との間には高度の配列相同性がある
ことが示された。
Frinkら(59)は、ＨＳＶ−１ｇＣを暗号化している2,520
塩基mRNAの５′−末端が、第１３図の４３位の下線を引
いたＡ残基にマツプ（配置）することを発見した。更
に、彼らは、この残基の約２２塩基対（５′）にＡＴに
富んだ“TATA”ボツクス(60)を指摘している。第１３図
に示した二つの配列を比較すると、ＨＳＶ−１とＨＳＶ
−２の配列は共にこの領域に同一の配列、CGGGTATAAAを
含んでいることを示している。この配列は、これまで決
定された多くのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２配列中の
“TATA”ボツクス領域に存在することが見い出されてい
る先のWhittonらの報告(61)の配列と一致する。この保
存配列に続いて、両ウイルスゲノムともＧに富んだ領域
がある。この推定上の転写コントロール領域のほかに、
第２の“TATA”ボツクスが第１３図の二つの配列の1845
〜1849の位置に見出された。この第２の“ＴＡＴＡ”ボ
ツクスはＨＳＶ−１ゲノムにおいて７３０塩基mRNAの転
写をコントロールするものと推定されている(59)。ＨＳ
Ｖ−１とＨＳＶ−２は共にこの配列を含んでおり、それ
は第一の“ＴＡＴＡ”ボツクスの前にあるCGGG配列と類
似したCGGGCG配列を含むＧＣに富んだフランキング配列
に囲まれている。更に両ゲノムとも、この第２の“ＴＡ
ＴＡ”ボツクスの３′にオープンリーデイングフレーム
を暗号化しており、これについては後に論じる。
前述した８１塩基対の欠失がＨＳＶ−２ゲノムに実際に
見出されるのか、或いはクローニングまたは配列決定の
実験中に起こる人為的なものなのかどうかを決定するた
めに、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨＳ
Ｖ−２ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析を実施し
た。失われた８１塩基対の領域にまたがるSac2断片（第
１２図の断片参照）から32P−標識プローブを調製し
た。もしＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の領域を
欠失しているならば、この領域にまたがるSma1-BgIII断
片は５７６塩基対となり、Sma1断片は６６２塩基とな
り、Sac2断片は１９５塩基対となるであろう。
第１４図は、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpgC2Sal2.9ＤＮ
Ａのサザーンブロツテイング解析を示す。第１３図に示
したＨＳＶ−２配列中、脱落している８１塩基対領域に
またがる領域（ＨＳＶ−２の３４６〜４２６の位置）
を、欠失領域に重なり合う第１２図の星印で示したSac2
断片を使用して解析した。１〜３列はＨＳＶ−２ゲノム
ＤＮＡの制限消化物であり、４〜６列はpgC2Sal2.9の制
限酵素消化物である。消化されたＤＮＡは1.5％アガロ
ースゲルで電気泳動し、変性し、ニトロセルロースにブ
ロツトし、32P−標識Sac2断片でプローブした。（矢印
は、フアージλＤＮＡの５６４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ
断片の位置を示す。）。１列および６列目；Sma1＋Bg1
2：２列および５列目；Sma1：３列および４列目；Sac
2。
第１４図に示された結果から、予測した制限部位がＨＳ
Ｖ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨＳＶ−２ＤＮ
Ａの双方において、８１塩基対を欠失している領域を囲
んでいることが明らかになつた。更に、ＨＳＶ−２ゲノ
ム断片およびクローンした断片は正確に伴移動（コマイ
グレート）しており、欠失がクローニングまたは配列決
定における手技によつて人為的に起こつたものでないこ
とがわかつた。
ＨＳＶ−２の2.9kbSall断片に含まれる主要なオープン
リーデイングフレームの解析 ＨＳＶ−２の2.9kbSal1断片に含まれている潜在的暗号
化配列を解析し、第１３図に示したＨＳＶ−２配列の１
９９〜２０１の位置に暗号化されているメチオニンから
始まり、この図のＨＳＶ−２配列の1735〜1737の位置の
ＴＡＡ停止コドンに終る４７９個のアミノ酸から成るオ
ープンリーデイングフレームを明らかにした。第１３図
から判るように、ＨＳＶ−１ｇＣタンパク質とＨＳＶ−
２オープンリーデイングフレームは、共に二つの配列
の、“ＴＡＴＡ”ボツクス相同に対してほぼ同じ位置か
ら開始する。更に、最初この領域に存在するＨＳＶ−２
オープンリーデイングフレームはＨＳＶ−１ｇＣの遺伝
子の前の１２コドンで終ると考えられていたがＨＳＶ−
１Ｆ株のｇＣ遺伝子配列のカルボキシル末端領域の配列
を再決定することにより（M.Jackson、未発表）、Frink
(59)によつて報告された配列は１７２７の位置の後のチ
ミジンヌクレオチドを見落としていたこと、およびこの
残基を挿入すると、翻訳したＨＳＶ−１ｇＣタンパク質
はＨＳＶ−２オープンリーデイングフレームと同じ場所
（第１３図の1735〜1737）で終了する翻訳されたＨＳＶ
−１ｇＣ蛋白質となることが明らかになつた。このよう
にして、種々の欠失および挿入を考慮すると、第１３図
に示したように、ＨＳＶ−１ｇＣ遺伝子とＨＳＶ−２の
オープンリーデイングフレームは非常に高度の重なりを
示す。
第１５図は、ＨＳＶ−２大−オープンリーデイングフレ
ームの翻訳と、ＨＳＶ−１ｇＣアミノ酸配列との比較を
示す。アミノ酸は１文字略号法を使用して表わした。Ｈ
ＳＶ−１ｇＣはＨＳＶ−１ｇＣ配列を意味し、ＨＳＶ−
２ｇＦはＨＳＶ−２オープンリーデイングフレーム配列
を意味する。タンパク質はＨＯＭプログラムを使用して
比較し、間隙の場所は、所望により相同体を最大化して
挿入した。相同でないアミノ酸の上に星印を付した。Ｎ
−結合糖タンパク質と推定される部位（ＮＸＳまたはＮ
ＸＴ）(62)には陰影を付け、システイン残基(c)は枠で
囲んだ。空間部分（スペース）を除き、アミノ酸だけに
番号を付けた。図15Bは、２番目のＨＳＶ−２オープン
リーデイングフレームの翻訳およびＨＳＶ−１ 730塩
基mRNAタンパク質との比較を示す。７３０ORFＨＳＶ−
２は、第１３図に示したＨＳＶ−２配列の1975〜2406の
位置から誘導された第２のＨＳＶ−２オープンリーデイ
ングフレームの不完全アミノ酸配列である。730ORFＨＳ
Ｖ−１は、ＨＳＶ−１の７３０塩基mRNA(59)によつて暗
号化されたタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。
第４Ａ図および第４Ｂ図のいずれにおいても、電荷に関
して保守（コンサーブ）されているアミノ酸変化には
(c)印を、電荷に関して保守（コンサーブ）されていな
い変化には（Ｎ）印を付けた。
第１５図には、ＨＳＶ−１ｇＣ遺伝子と４７９アミノ酸
ＨＳＶ−２オープンリーデイングフレーム間の高度の配
列相同性を図示している。最初の１９個のアミノ酸は、
電荷に関してすべて保守的（コンサーバテイブ）である
最初の２５個のアミノ酸の変化を伴ない、約８０％の配
列相同性を含んでいる。ＨＳＶ−１ｇＣの１２４番目の
残基（ＨＳＶ−２配列の９０番目の残基）から両タンパ
ク質の末端まででは、電荷に関して保守的（コンサーバ
テイブ）である７５％のアミノ酸変化を伴なう約７４％
の配列相同性がある。Ｎ−連結糖付加が推定される５ケ
所の部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ(62)）は、両タンパク質
間で保守（コンサーブ）され、７個のシステイン残基は
すべてＣ末端に対し相同的な位置に局在している。タン
パク質のカルボキシル末端基の３／４における全般的な
配列の保守性（コンサーベーシヨン）に加えて、２０残
基の長さにわたる大きい領域のアミノ酸配列の偶発的な
相同性もある（即ち、ＨＳＶ−１の３８５〜４０５の位
置の配列とＨＳＶ−２の３５２〜３７２の位置の配
列）。この配列の比較からＨＳＶ−２ゲノムのこの領域
のオープンリーデイングフレームは、ＨＳＶ−１ｇＣと
相同なタンパク質を暗号化されていると結論して良い。
この領域に暗号化されているＨＳＶ−２タンパク質はＨ
ＳＶ−１ｇＣ配列と著しい配列相同性を示しているが、
一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべき差異があ
る。最も際立つた差異は、ＨＳＶ−１ｇＣ配列における
５０〜７６残基から見出される２７個のアミノ酸がＨＳ
Ｖ−２配列に欠失している（第１５図）ことであり、こ
れは先に記述した８１塩基対の欠失に対応する。この大
きい欠失のほかに、両配列には１個または２個のアミノ
酸から成る短かい欠失が見られる。これらの欠失のすべ
てはタンパク質のアミノ末端領域に見出される。これら
の欠失のほかに、ＨＳＶ−１ｇＣ配列の２９〜１２３残
基の間（ＨＳＶ−２配列の３１〜９０残基）に頻発する
タンパク質のアミノ末端領域には多くのアミノ酸の変異
がある。この領域ではアミノ酸の３０％だけが相同性で
あり、この相同の多くは保守（コンサーブ）されたプロ
リン残基に起因している。この領域に見出されるアミノ
酸置換の４３％は電荷に関して非保守的（ノンコンサー
バテイブ）である。そのような多数の変異を示す唯一の
他の領域はカルボキシル末端−疎水性領域（ＨＳＶ−１
配列の４７６〜４９６残基およびＨＳＶ−２配列の４４
３〜４６３残基）であり、そこではタンパク質の５５％
が相同性であるが、すべての変化が保守（コンサーブ）
され、荷電されず、疎水性のアミノ酸であり、また該タ
ンパク質のカルボキシル末端では配列の僅か２５％だけ
が相同であるが、全般的なアミノ酸の構成は相似してい
る（ＨＳＶ−１の５００〜５１２残基およびＨＳＶ−２
の４６７〜４７９残基）。二つのタンパク質間には五ケ
所のＮ−結合糖付加推定部位が保守（コンサーブ）され
ているが、一方ＨＳＶ−ｇＣ配列はＨＳＶ−２配列より
２ケ所含んでいる部位が多い（総計９：７）。ＨＳＶ−
１ｇＣ配列には、ＨＳＶ−２部位からは欠失している２
７個のアミノ酸中に２ケ所のＮ−結合糖付加部位と、第
１５図の１０９〜１１２残基間に１対の重複している部
位が含まれている。ＨＳＶ−２配列はＨＳＶ−１配列に
は見られない２ケ所のＮ−結合糖付加部位を含んでお
り、その１個はアミノ末端領域の近くにある。
ＨＳＶ−１配列とＨＳＶ−２配列間に起こり得る構造上
の相同性を一層充分に吟味するために、ヒドロパシー解
析を実施した(31a)。第６図に、ＨＳＶ−１ｇＣタンパ
ク質とＨＳＶ−２主−オープンリーデイングタンパク質
のヒドロパシー解析を図示する。各タンパク質のヒドロ
パシーはHoppおよびWoods(31a)のプログラムを使用して
測定した。中央線より上方は疎水性領域、中央線より下
方は親水性領域である。１２個ずつのアミノ酸を解析
し、その平均ヒドロパシー値を計算した。アスパラギン
−連結糖付加推定部位(62)を（○）印で示した。ｇＣ−
１：ＨＳＶ−１ｇＣタンパク質ヒドロパシー。ｇＣ−２
（ｇＦ）：ＨＳＶ−２主−オープンリーデイングフレー
ムヒドロパシー。
両タンパク質が、アミノ酸配列の親水性と疎水性の性質
に基づいた極度の構造上の相同性を示すことを第１６図
に示す。各図において、Ｎ−末端疎水性領域の後には親
水性のアミノ酸鎖が続いており、それぞれ総計９個のう
ち６個（ＨＳＶ−１）または総計７個のうち３個（ＨＳ
Ｖ−２）のＮ−連結糖付加推定部位を含んでいることを
示している。この親水性領域に続くピークと谷は、最後
のＮ−結合糖付加部位を含む親水性領域を含めて両タン
パク質とも非常に相似している。両タンパク質のカルボ
キシル末端領域は非常に疎水性の２０残基領域を示し、
その後にカルボキシル末端領域が続いている。ＨＳＶ−
１ｇＣにだけ見出される２７個の近接するアミノ酸は５
０〜７６残基間に比較的親水性の領域を暗号化されてい
るようである（第１６図）。以上結論すると、この解析
によつてＨＳＶ−１ｇＣとＨＳＶ−２タンパク質の両者
のヒドロパシー像は非常に相似しており、これらタンパ
ク質の最低に保守（コンサーブ）されたアミノ末端両域
は高度に糖付加を受ける電位を有する親水性領域に見出
されることが明らかにされた。
第２ＨＳＶ−２オープンリーデイングフレームの解析 第２図に示したＨＳＶ−２配列の最終４３１塩基対（19
75〜2406残基）の翻訳によつて１０５アミノ酸から成る
第２オープンリーデイングフレームが明らかに成つた。
ここに報告する配列情報は、ＨＳＶ−２第２オープンリ
ーデングフレームの全部を十分に把握しているわけでは
ないが、この配列をFrinkら(10)が報告したＨＳＶ−１
の７３０塩基mRNAにより暗号化されたオープンリーデイ
ングフレームと比較すると、この場合もまた高度の相同
性を示している。第４Ｂ図で明らかなように、二つの配
列は重なり合う領域では７５％の配列相同性を示し、ま
たそのアミノ酸変異の約９０％は電荷に関して保守的
（コンサーバテイブ）である。二つの配列の主な差異
は、ＨＳＶ−２に見られる１９アミノ酸Ｎ−末端領域が
ＨＳＶ−１配列には見出されない点である。従つてこの
領域に暗号化されている機能は不明であるが、ＨＳＶ−
１とＨＳＶ−１から得られるタンパク質はかなりの配列
相同性を示している。
考察 上記の結果は、ＨＳＶ−２ゲノムが共直線的に配置して
いるＨＳＶ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化されて
いることを証明している。ここに見出された配列の共直
線性は、ＨＳＶ−１の７３０塩基対mRNAの同族体(10)を
明らかに暗号化されているＨＳＶ−２の主−オープンリ
ーデングフレームの３′配列の発見によつて強化され
る。ＨＳＶ−２ｇＦ遺伝子の以前の地図作成(33)は、こ
こに記載した数ケ所の潜在性のＮ−結合糖付加部位と、
明らかなアミノ末端シグナル配列(5)、および推定カル
ボキシル末端膜透過領域(28)を包含するＨＳＶ−２ゲノ
ムの主・オープンリーデイングフレームの性質の双方に
よつて、ここに記載したＨＳＶ−２タンパク質は糖タン
パク質ｇＦであると結論される。更に、翻訳されたＨＳ
Ｖ−２タンパク質の大きさ（〜52,000ダルトン）は、エ
ンドグリコシダーゼＨで処理したＨＳＶ−２ｇＦの天然
の大きさとして報告されている値（54,000ダルトン）と
近似している。最後に、広範囲にわたるアミノ酸配列の
相同性と、数ケ所の潜在性Ｎ−結合糖付加部位および７
個のシステイン残基すべてのコンサーベーシヨン（保存
性）はＨＳＶ−１ｇＣとＨＳＶ−２ｇＦ間の構造的相動
性を示している。
これらの結果は、ＨＳＶ−２ｇＦとＨＳＶ−１ｇＣは主
として型特異性であるが、それらは型共通性の決定基を
有していることを証明した以前の成績（１７，２２ｄ，
２２ｆ，４３）を説明することを助ける。２，３の以前
の研究（１７，１８，４３）で、これらのタンパク質が
型特異性抗体を優勢に誘導することを証明しているの
で、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグナル
配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見出され
るのは理屈にあつている。分岐領域の潜在性のＮ−結合
糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質(62)か
ら、これらの領域がタンパク質表面に位置することが示
唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外側へ暴露
していることは、これらの分岐抗原決定基（エピトー
プ）に対する型特異性抗体の生成に対する役割りを果し
ているのかも知れない。然し、ｇＣとｇＦの間で保守
（コンサーブ）されている親水性領域がタンパク質の外
側へ暴露することができ、１例において糖付加されてい
る（ＨＳＶ−１ｇＣの３６３〜３６６残基およびＨＳＶ
−２ｇＦの３３０〜３３２残基）ことがあり得るので、
型共通性抗体もタンパク質の3/4のより高度に保守（コ
ンサーブ）されているカルボキシル末端によつて生成さ
れる可能性がある。このように、ＨＳＶ−１ｇＣとＨＳ
Ｖ−２ｇＦは型特異性および型共通性決定基の双方を共
有しているが、型特異性決定基の方がより抗原性である
ようである。
ｇＣとｇＦの型特異性および型共通決定基の説明は知ら
れていないが、タンパク質には少なくとも二つの機能、
即ち、その一つは両ウイルスの生存率に重要である型共
通性領域、またはその一つは各ウイルスの型に特異的で
ある型特異性領域である。ｇＣおよびｇＦの機能は現在
のところ不明であり、生存し得るｇＣマイナスのＨＳＶ
−１突然変異株がインビトロで分離されているが(65)、
ヒト宿主のインビボ感染期間および潜伏確立期間におい
て、ｇＣまたはｇＦのいずれが必要不可欠であるのかは
明らかでない。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の間で、感
染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物学的な差異の少
なくとも幾つかはｇＣとｇＦのアミノ末端領域間の著し
い構造的差異に由来するであろうことは考えられる。例
えこれらタンパク質の機能的な知識が全くなくても、異
なつた選択圧がｇＣおよびｇＦの分岐領域と保守（コン
サーブ）領域に作用するに違いないと結論しても良かろ
う。
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子の配列に関す
る以前の比較(58)で、アミノ末端シグナル配列(63)とカ
ルボキシル末端膜透過領域(64)は置換アミノ酸が疎水性
である限り多数の突然変異に耐容し得ることを証明し
た。ｇＣおよびｇＦの配列比較により、ｇＣの４７９〜
４９６残基とｇＦの４４３〜４６３残基からカルボキシ
ル末端、推定膜透過領域(64)で同様の知見が示された。
この領域における多くの非対応性疎水性置換体は、ｇＤ
の場合のように、脂溶性であるアミノ酸ならばこの領域
に耐容できることが示唆される。然しながら、ｇＤとは
対照的にｇＣとｇＦのアミノ末端シグナル配列は最初の
１９残基で高度に相同である。このようにこの領域は、
糖タンパク質を粗面小胞体へ指向させる以外に重要な保
守（コンサーブ）された機能を持つか(5)、或いは保守
されねばならないゲノムのこの領域に、重複する遺伝子
または他の機能的な配列がある(66)かである。
完全な比較をするにはＨＳＶ−２配列が不充分である
が、ＨＳＶ−１ｇＣmRNA転写開始への５′領域は、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２ゲノムの双方とも同じCGGGTATA
A配列を示す。更に、両配列とも、それに続いて転写開
始の直前のＧに富んだ領域がある。このように、ＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子で以前に発見された
ように、二つのウイルス型間の上流配列に相同性が存在
しており、このことはこれらの領域がこれら遺伝子の転
写調節に関与している可能性を示唆している。両ウイル
スゲノムに見出され、多分７３０塩基mRNAの転写をコン
トロールしていると思われる(59,60)“TATA”ボツクス
相同性も、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２における比較的高度
な配列相同性を示しているのは興味深い。第１３図に示
したように、この“ＴＡＴＡ”ボツクスの前にあるCGに
富んだ配列が来るが、これは第一の“ＴＡＴＡ”領域の
前にある配列と相似しているが、全く同一ではなく、そ
れらの後にいずれも〜８０％の配列相同性を示す１４塩
基対の領域が続く。全般的な配列相同性は〜７５％であ
るのに対し、この領域を囲む全領域の相同性は僅かに３
３塩基対である。もしこの領域が７３０塩基mRNAの転写
調節に関与するのならば、転写調節因子による認識には
比較的短かい配列で充分であるようである。
結論として、これらの結果はＨＳＶ−１ｇＣおよびＨＳ
Ｖ−２ｇＦ糖タンパク質が高度にホモローガスな関係に
あり、それらが型−共通性並びに型−特異性領域を暗号
化していることを証明するものである、といえる。ま
た、これらの２種のタンパク質はまさに有意な配列の相
同性を示し、しかもマツプ上で共直線性を有するように
思えるので、ＨＳＶ−２ｇＦをＨＳＶ−２ｇＣまたはｇ
Ｃ−２と改名することについてのZezulakとSpear(22)の
提案を支持するものである。さらに、ここで報告した配
列に関するデーターは、ｇＣ−１およびｇＣ−２タンパ
ク質を、これら２種のタンパク質間の種々の型特異性領
域をインビトロで相互に変換し、得られたキメラ配列を
哺乳類細胞内で発現させる(67)、あるいはこれらの領域
をウイルスに再度取り込ませる(68)ことにより、gC-1お
よびgC-2タンパク質を機能的に分析する方法を開示する
ものである。
クローンされたgC-2糖タンパク質類は、実施例１で述べ
たｇＤの発現と同様にして発現せしめることができる。
gC-1に対して型特異性である配列を有するが、gC-1およ
びgC-2に対して型共通性の配列は除外されているような
gC-2のフラグメントが、ＨＳＶ−２からＨＳＶ−１を区
別するための診断薬として極めて有用である。
以下の参考図書、および本明細書中に、その都度文字お
よび数字でそれぞれ付加的に引用した参考文献を参照と
して示した。
A.Jordan,ｅｔ ａｌ.,A.J.C.P.４６７(October 198
1)． B.Kimmel,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１９(198
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0)；Davis,ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８，5376(1981)；Weiland,ｅ
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Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８，6670(1981)． 5.Yelverton,ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ２１９，614
(1983)． 6.Watson,ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８，381(198
2)． 7.Gething,ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ２９３，620(198
1)；Liu,ｅｔ ａｌ.,ＤＮＡ１，213(1982)；Ｇｏｏｄ
ｅｎｏｗ，ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ２１５，677(19
82)；Goodenow,ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ３００，231
(1982)；Crowley,ｅｔ ａｌ.,Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃ
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80)． 16.Norrild,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６，712(1
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１，1062(1981)． 19.Pereira,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
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9． 22a.Para,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１，137(198
2)． 22b.Balachandran,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３
９，438(1981)． 22c.Para,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１，137(198
2)． 22d.Zezulak,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４７，553
(1983)． 22f.Zweig,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４７，185(19
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2)． 25.Murray,ｅｔ ａｌ.,Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５０，
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Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７，3884(1980)． 35.Ruyechan,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９，677
(1979)；Roizman,Ｃｅｌｌ２６，481(1979)． 36.Simonsen,ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０，2495(1983)． 37.Lusky,ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ２９３，79(198
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（ＵＳＡ）７７，4216(1980)． 40.Graham,ｅｔ ａｌ.,Ｖｉｒｏｌ．５２，456,(197
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ｍｍｕｎ．３４，684(1981)；モノクローナル抗−ｇＤ
抗体、１−Ｓおよび５５−ｓは、Dr.Martin Xweig of t
he Laboratory of Molecular Oncology,National Cance
r Institute,Frederick,Maryland 21701により提供され
た。
42.Cohen,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６，429(198
0)． 43.Pereira,ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８，5202(1981)． 44.Cohen,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７，172(197
8)． 45.Laemmli,Ｎａｔｕｒｅ２２７，680(1970)． 46.Honess,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１６，1308(1
975)． 47.Spear,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７，991(1976)． 48.Campadelli-Fiume,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４
３，1061(1982)；Johnson,ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ３２，
987(1983)；Cohen,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４
６，679(1983)． 49.Bloch,Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８２，629(1979)． 50.血球凝集反応阻止および補体結合反応により、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２に対して力価測定を行なつたヒ
トヘルペス血清は、Dr.John A.Stewart of the Centers
for Disease Control,Atlanta,Georgiaから提供され
た。
51.Rector,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍ
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83)． 68.Gibson,ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４８，396(19
83)．
【図面の簡単な説明】
第１図はＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子およびＨＳＶ−２ｇＤ遺
伝、およびその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列、並びに
推定的に決定したアミノ酸配列を比較して示した模式図
である。第２図はＨＳＶ−１ｇＤタンパク質およびＨＳ
Ｖ−２ｇＤタンパク質のヒドロパシー解析の結果を示す
グラフである。第３図は膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパ
ク質Ｄを発現するためのプラスミドpgD-dhfrの組立て工
程を示す模式図である。第４図は、ヒトのＨＳＶに対す
る抗体で標識したgD12細胞の位相差顕微鏡写真の模写図
（Ａ）、および同一細胞の蛍光顕微鏡写真の模写図
（Ｂ）である。第５図ＡはgD12細胞系からクローン化し
たｇＤ、およびＨＳＶ−１に感染したヒトの細胞に由来
する天然のｇＤに関する放射性免疫沈降を撮影した写真
の模写図であり、第５図ＢはgD12細胞からクローン化さ
れたｇＤの免疫沈降線を、パルス標識法で示した状態を
撮影した写真の模写図である。第６図はヒト抗ＨＳＶ抗
体の、gD12細胞、並びにその親細胞であるＣＨＯ細胞系
との結合状態を示すグラフであつて横軸に血清希釈度の
逆数、縦軸に４９２nmにおける吸光度を示す。第７図は
ＨＳＶ−１ｇＤタンパク質の模式図であつて、そのシグ
ナル配列および膜結合領域をも示す模式図である。第８
図はＨＳＶ−１ｇＤタンパク質を分泌形として発現せし
める、プラスミドｐｇＤtrunc-dhfrの組立て工程を示す
模式図である。第９図はgD10.2細胞系の、細胞内および
細胞外からの抽出物の放射免疫沈降線を撮影した写真の
模写図である。第１０図はgD10.2細胞系の増幅前および
増幅後の免疫沈殿の結果を撮影した写真の模写図であ
る。第１１図はMtxによつて達成されたgD10.2細胞系の
増幅度を示すグラフである。第１２図はpgC2Sa12.9フラ
グメントのＤＮＡ配列分析の結果を示す模式図である。
第１３図はpgC2Sa12.9(HSV-2)から導かれたＤＮＡ配列
を、ＨＳＶ−１ｇＣ領域のＤＮＡ配列との比較において
示した模式図である。第１４図は、ＨＳＶ−２ゲノムＤ
ＮＡおよびpgC2Sa12.9DNAのサザーンブロツテイング法
による解析結果を示すグラフである。第１５図は、ＨＳ
Ｖ−２のラージオープンリーデイングフレームを翻訳し
た配列を、ＨＳＶ−１ｇＣアミノ酸配列との比較におい
て示した模式図である。第１６図はＨＳＶ−１ｇＣタン
パク質とＨＳＶ−２メジヤーオープンリーデイングフレ
ームタンパク質のヒドロパシー解析の結果を示すグラフ
である。
フロントページの続き (72)発明者 ローレンス・アラン・ラスキー アメリカ合衆国カリフオルニア94116、サ ン・フランシスコ、パチエコ・ストリート 795番 (56)参考文献 特開 昭59−48095（ＪＰ，Ａ)

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単純疱疹ウイルスに対する相補的な抗体と
    特異的に結合し得る抗原決定基をもったポリペプチドか
    らなる診断用産物であって、該ポリペプチドは、該ポリ
    ペプチドを生産することのできる、安定な連続的継代組
    換え細胞系の膜に機能的に結合した膜結合ポリペプチド
    である、診断用産物。
  2. 【請求項２】該ポリペプチドが単純疱疹ウイルス１型ま
    たは２型の糖タンパク質Ｄであって、単純疱疹ウイルス
    １型および／または２型の抗体と結合することができる
    ものである第１項に記載の診断用産物。
  3. 【請求項３】該ポリペプチドが単純疱疹ウイルス１型ま
    たは２型の糖タンパク質Ｃである第１項に記載の診断用
    産物。
  4. 【請求項４】該ポリペプチドが単純疱疹ウイルス２型の
    糖タンパク質Ｃのフラグメントを含有し、単純疱疹ウイ
    ルス１型または２型に対する相補的な抗体と結合するこ
    とができるものである第３項に記載の診断用産物。
  5. 【請求項５】該ポリペプチドが単純疱疹ウイルス２型に
    対する相補的な抗体と結合できるが単純疱疹ウイルス１
    型に対する相補的な抗体とは結合し得ない糖タンパク質
    Ｃフラグメントを含有するものである第３項に記載の診
    断用産物。
  6. 【請求項６】固相表面に結合したものである第１項に記
    載の診断用産物。
  7. 【請求項７】標識に結合したものである第１項に記載の
    診断用産物。
  8. 【請求項８】該標識が酵素である第７項に記載の診断用
    産物。
  9. 【請求項９】該組換え細胞が哺乳類の細胞である第１項
    に記載の診断用産物。
  10. 【請求項１０】該相補的な抗体と特異的に結合すること
    ができる標識した抗−抗体と共に、診断試験用のキット
    中に含まれているものである第１項〜第９項のいずれか
    に記載の診断用産物。
  11. 【請求項１１】該診断用キット中に、標識化されていな
    い相補的な抗体と共に含まれているものである第１０項
    に記載の診断用産物。
  12. 【請求項１２】診断試験用キット中に、標識された相補
    的な抗体と共に含まれているものである第１項〜第８項
    のいずれかに記載の診断用産物。
  13. 【請求項１３】(a)安定な連続的継代組換え細胞系で生
    産され、単純疱疹ウイルスに対する相補的な抗体と特異
    的に結合することのできる抗原決定基を有する膜結合ポ
    リペプチドからなる診断用産物； および (b)第２の成分として該相補的な抗体、または該相補的
    な抗体と特異的に結合することのできる抗−抗体のいず
    れか、 を含有する診断試験用キット。
  14. 【請求項１４】該診断用産物が固相表面に結合したもの
    である第１３項に記載の診断試験用キット。
  15. 【請求項１５】該診断用産物が標識と結合したものであ
    る第１３項に記載の診断試験用キット。
  16. 【請求項１６】第２の成分が該相補的な抗体と特異的に
    結合することができる、標識された抗−抗体からなるも
    のである第１３項に記載の診断試験用キット。
  17. 【請求項１７】標識されていない相補的抗体をも含むも
    のである第１６項に記載の診断試験用キット。
  18. 【請求項１８】第２の成分が相補的な抗体からなるもの
    である第１３項に記載の診断試験用キット。
  19. 【請求項１９】診断用産物が、膜結合領域を失うことに
    よって膜から遊離した、先端の削除された、膜を含まな
    いポリペプチド誘導体である第１３項に記載の診断試験
    用キット。
  20. 【請求項２０】先端を削除されたポリペプチドが該ポリ
    ペプチドを生産し得る組換え真核性宿主細胞系から分泌
    されて生成されたものである第１９項に記載の診断試験
    用キット。
  21. 【請求項２１】診断用産物が、安定な連続的継代組換え
    細胞内で該細胞の膜と機能的に結合した状態で生成させ
    た後、該膜から遊離させて得た該ポリペプチドの膜遊離
    型誘導体である第１３項に記載の診断試験用キット。
  22. 【請求項２２】診断用産物が単純疱疹ウイルス１型また
    は２型の糖タンパク質からなるものである第１３項に記
    載の診断試験用キット。
  23. 【請求項２３】該糖タンパク質が単純疱疹ウイルス１型
    または２型に対する相補的な抗体のいずれか一方と結合
    することができるが、それらの両方とは結合し得ないも
    のである第２２項に記載の診断試験用キット。
  24. 【請求項２４】該診断用産物が単純疱疹ウイルス１型ま
    たは２型の糖タンパク質Ｃからなるものである第２２項
    に記載の診断試験用キット。
  25. 【請求項２５】該糖タンパク質Ｃが単純疱疹ウイルス２
    型の糖タンパク質Ｃである第２４項に記載の診断試験用
    キット。
  26. 【請求項２６】該ポリペプチドが単純疱疹ウイルス２型
    に対する相補的な抗体と結合することができるが、単純
    疱疹ウイルス１型に対する相補的な抗体とは結合できな
    い、単純疱疹ウイルス２型のフラグメントからなるもの
    である第２５項に記載の診断試験用キット。
  27. 【請求項２７】(a)単純疱疹ウイルスに対する相補的な
    抗体と特異的に結合し得る抗原決定基をもったポリペプ
    チドからなる診断用産物であって、該ポリペプチドは、
    該ポリペプチドを生産することのできる、安定な連続的
    継代組換え細胞系の膜に機能的に結合した膜結合ポリペ
    プチドである、診断用産物を、生理学的に得られた液体
    試料と接触させて診断用産物と該試料中の相補的な抗体
    とを結合させ；そして (b)段階(a)における結合を検出する、 ２段階からなる、生物学的に得られた液体試料に含まれ
    る抗体の検出方法。
  28. 【請求項２８】段階(a)における結合の測定をも行うこ
    とを特徴とする第２７項に記載の検出方法。
  29. 【請求項２９】段階(a)において、該診断用試薬を固相
    表面に結合せしめると共に、該試料を該相補的な抗体と
    特異的に結合することのできる可溶性の標識抗−抗体と
    も接触させ、該試料抗体を固相表面に、該診断用産物お
    よび該標識抗−抗体の両方と結合させて連結し、さら
    に、段階(b)に移る前に、上記固相表面を未反応の、可
    溶性標識抗体を含む溶液から分離し、次いで段階(b)で
    は、固相あるいは分離した溶液中に含まれる標識抗−抗
    体を検出することからなる第２７項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】段階(a)において該診断用産物を固相表
    面に結合せしめると共に、該試料を、同じく該診断用産
    物と特異的に結合することのできる可溶性の標識抗体と
    も接触させて該試料抗体と標識抗体とを該固相表面の該
    診断用産物に競合的に結合させ、さらに、段階(b)に移
    る前に、上記固相表面を未反応の、可溶性標識抗体を含
    む溶液から分離し、次いで段階(b)では、固相あるいは
    分離した溶液中に含まれる標識抗−抗体を検出すること
    からなる第２８項の方法。
  31. 【請求項３１】(a)生物学的に得られた液体試料を該試
    料中の抗原と同じ抗原決定基を有する、単純疱疹ウイル
    スに対する相補的な抗体と特異的に結合し得る抗原決定
    基をもったポリペプチドからなる診断用産物であって、
    該ポリペプチドは、該ポリペプチドを生産することので
    きる、安定な連続的継代組換え細胞系の膜に機能的に結
    合した膜結合ポリペプチドである、診断用産物と接触さ
    せ、次いで、 (b)競合法によって試料抗原を検出することからなる、
    生物学的に得られた液体試料中の抗原の検出法。
  32. 【請求項３２】段階(a)において該診断用産物を固相表
    面に結合せしめると共に、該試料を可溶性の標識されて
    いない相補的な抗体とも接触させて該相補的な抗体に、
    該診断用産物と試料抗原とを競合的に結合させ、さらに
    段階(b)にうつる前に、 (c)固相を溶液から分離し、そして (d)分離した固相表面または溶液を、該相補的な抗体と
    特異的に結合することのできる標識抗−抗体と結合さ
    せ、次いで、段階(b)において標識抗−抗体を検出する
    ことからなる第３１項の方法。
  33. 【請求項３３】段階(a)において該診断用産物を標識化
    すると共に、該試料を不動化された相補的な抗体とも接
    触させて標識診断用産物および試料抗原と競合的に結合
    させることからなる、第３１項に記載の方法。
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