DK171976B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af glycoprotein fra Herpes simplex virus, diagnostisk kit til detektion af Herpes simplex virus type 1 og type 2 samt fremgangsmåde til in vitro detektion af antistof eller antigen. - Google Patents

Description

DK 171976 B1

Opfindelsen angår immunologiske diagnostiske produkter afledt fra rekombinant-DNA-teknologi og fremgangsmåder til deres anvendelse. Nærmere bestemt angår opfindelsen fremgangsmåde til fremstilling af glycoprotein fra Herpes 5 simplex virus. Opfindelsen angår også et diagnostisk kit til detektion af Herpes simplex virus type 1 og type 2. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til in vitro detektion af antistof rettet mod Herpes simplex virus eller antigen afladt af samme.

10 Analyse af immunreaktionen over for en række forskellige infektiøse midler har været begrænset af, at det ofte har vist sig vanskeligt at dyrke patogener i tilstrækkelige mængder til at muliggøre isolering af vigtige celleoverfla-deanti gener.

15 Detektionen af HSVl-IgG og -IgM-antistoffer er blevet gennemført ved enzymforbundet immunosorbent prøvning (ELISA) (A,B). Ved begge disse teknikker angives ekstrakter af HSV-inficerede celler til anvendelse som antigener. Ulenpeme ved at anvende levende antigen i et laboratoriemiljø er 20 velkendte, herunder kravet om dyrkning og indslutning af de infektiøse midler.

Fremkomsten af molekylær kloning har overvundet nogle af disse begrænsninger ved at tilvejebringe et middel, hvorved genprodukter fra patogeniske midler kan udtrykkes i praktisk 25 taget ubegrænsede mængder i en ikke-patogen form.

Overfladeantigener fra sådanne virus som influenza (1), mund og klovsyge (2), hepatitis (3), vesiculær stomatitis (4), rabies (5) og herpes simplex (6) er nu blevet udtrykt i E. coli og S. cerevisise, og giver løfte om, at der i 30 fremtiden kan tilvejebringes forbedrede underenhedsvacciner. Udtrykkeisen af overfladeantigener i lavere organismer er ikke helt tilfredsstillende, fordi de potentielt vigtige antigeniske determinanter kan gå tabt på grund af fuldstændig forarbejdning (f.eks. proteolyse, glycosylering) eller 35 denaturering under rensningen af det klonede genprodukt.

2 DK 171976 B1

Dette er særligt tilfældet med membranproteiner, som på grund af hydrophobe transmembrandomæner har tendens til at aggregere og blive uopløselige, når de udtrykkes i E. coli. Klonede gener, der koder for membranproteiner, er kendte i 5 pattedyrceller, hvor værtscellen tilvejebringer de nødvendige faktorer for den rigtige forarbejdning, polypeptidfoldning og inkorporering i cellemembranen (7,8). Selv om disse undersøgelser viser, at membranproteiner kan udtrykkes på overfladen af en rekombinant værtscelle, og f.eks.

10 (8) at et afkortet membranprotein, som mangler det hydrophobe carboxylterminale domæne, kan secerneres langsomt fra værtscellen frem for at blive bundet til den, beskriver de den midlertidige udtrykkelse af det klonede gen for membranbundne proteiner og detekteringen af et sådant protein 15 ved farvning med dets komplementære mærkede antistof. Der er i disse publikationer ingen antydning af, at det membranbundne protein kunne anvendes som et immunologisk diagnostisk reagens. Endvidere gør celleliniernes ustabilitet, selv hvis der havde været en sådan antydning, de 20 membranbundne proteiner til en videnskabelig curiositet og ikke et nyttigt praktisk diagnostisk produkt.

Herpes Simplex virus (HSV) er et stort DNA-virus, som forekommer i to beslægtede, men skelnelige former ved humane infektioner. Mindst fire af det store antal virusinkodede 25 proteiner er blevet fundet at være glycosyleret og på overfladen af både virionet og de inficerede celler (9). Disse glycoproteiner, betegnet gA/B, gC, gD og gE, findes på både HSV type 1 (HSV1) og HSV type 2 (HSV2), medens der i tilfælde af HSV2 er rapporteret at være fundet et yderligere 30 glycoprotein (gF) (10). Selv om deres funktioner ikke forstås fuldt ud, synes disse glycoproteiner at være involveret i virustilknytning til celler, cellefusion og en række forskellige værtsimmunologiske reaktioner på virusinfektion (11). Selv om HSV1 og HSV2 kun viser omkring 50% DNA-sekvens -35 homologi (12), synes glycoproteinerne for hovedpartens vedkommende at være type-fælles. Således viser gA/B, gD og gE et stort antal type-fælles antigeniske determinanter (13-16), DK 171976 B1 3 medens gC, som tidligere blev antaget at være fuldstændigt type-specifikt (17, 18), også har vist sig at have nogle type-fælles determinanter. Type-specifikke antigeniske determinanter kan imidlertid påvises under anvendelse af 5 monoklonale antistoffer for nogle af glycoproteinerne (10, 19), hvilket viser, at nogle aminosyreændringer er sket, siden HSV1 og HSV2 divergerede.

Et af de vigtigste glycoproteiner med hensyn til virusneutralisering er gD (11). Der er samlet betydelige vidnesbyrd, 10 som stærkt tyder på, at de respektive gD-proteiner i HSV1 og HSV2 er beslægtede. F.eks. har rekombinationskortlægning lokaliseret de respektive gener til colineære omrader i begge virusgenomer. Aminosyreanalyse viste grov homologi mellem disse to proteiner. gD-proteinerne inducerer neutraliserende 15 antistoffer over for både type 1 og type 2 virus på en typefælles måde (19-21). Desuden er de fleste monoklonale antistoffer frembragt over for disse glycoproteiner typefælles, hvilket også tyder på en høj grad af strukturel beslægtethed mellem de to typer af glycoproteiner (20). Nogle 20 monoklonale antistoffer fandtes imidlertid at reagere typespecifikt, hvilket tyder på væsentlige forskelle mellem proteinerne (19). Peptidkort over proteinerne afslørede også med sikkerhed sådanne forskelle (22) . Selv om disse resultater tyder på, at disse polypeptider er beslægtede, er 25 de dog utilstrækkelige til at angive nøjagtig' hvor nært slægtskabet er.

For at undersøge arten af type-fællesskabet mellem HSV1 og HSV2-gD-proteiner bestemtes DNA-sekvenserne af gD-generne fra HSVl og HSV2. De afledte aminosyresekvenser viste lighed. De 30 resulterende afledte proteinsekvenser blev også analyseret for strukturforskelle ved anvendelse af et program beregnet til at bestemme hydrophobe og hydrofile områder af proteinet. Denne analyse påviste en høj grad af bevarelse på et groft strukturniveau. Selv om der fandtes flere aminosyre-35 udskiftninger mellem le to glycoproteiner, var det store 4 DK 171976 B1 flertal af disse udskiftninger bevarende, hvilket antyder et vigtigt strukturkrav hos dette glycoprotein til virusset.

I lyset af denne information om strukturen af gD-proteinet, som beskrevet mere fuldstændigt i det følgende, blev det 5 besluttet at udtrykke gD-protein-DNA i pattedyrceller for at se, om dette var muligt, og hvis det var muligt, om det udtrykte protein ville bindes til værtscellemembranen, og om en afkortet form af protein, der manglede det membranbindende domæne, ville blive secerneret fra værtscellen, og i hvert af 10 de sidstnævnte tilfælde, om udtrykkelsesprodukt-proteinerne kunne bindes med antistoffer, som var effektive over for HSV1 og/eller HSV2. Denne procedure er beskrevet fuldt ud i den sideløbende danske patentansøgning nr. 4122/84, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

15 Som vist i den ansøgning er sådanne udtrykkelsesprodukt-proteiner i stand til at fremkalde antistoffer, som er effektive over for HSV1 og/eller HSV2 og således er nyttige som vaccine. Som de heri angivne resultater vil vise, er sådanne udtrykte proteiner opnået ved rekombinant-DNA-20 processer, som er i stand til at genkendes af antistoffer over for HSV1 og/eller HSV2, også nyttige som diagnostiske produkter til detektering og/eller måling af tilstedeværelsen af antistoffer, som er karakteristiske for de virus. Kortlægningsundersøgelser (22a) tyder på, at proteinsekvensen 25 afledt fra HSV2-genomet svarer til gF, den HSV2-homologe til HSVl-gC.

HSVl-gC er blevet anset for at være type-specifikt uden homologi i HSV2, der af antistoffer over for dette glycoprotein fandtes at reagere næsten udelukkende med HSVl-gC 30 (17). Desuden kunne der ikke påvises nogen detekterbare immunologiske reaktioner mellem HSVl-gC og antisera frembragt over for HSV2-virus (18). Et protein med den samme elektrophoretiske mobilitet som HSVl-gC er blevet påvist i HSV2, men det var ikke colineært med HSVl-gC på kortet 35 (35) .

DK 171976 B1 5 I modsætning til HSV1 synes HSV2 at indkode endnu et glycoprotein, betegnet gF (22b, 10, 22c, 22d). Selv om HSV2-gF havde en elektrophoretisk mobilitet, som var meget hurtigere end HSVl-gC, afslørede kortlægningsundersøgelser med 5 rekombinante virus, at dette protein var inkodet af et område af HSV2-genomet, som var tilnærmelsesvis colineært med genet for HSVl-gC (22c, 22d). Desuden er det for nyligt blevet påvist, at et monoklonalt antistof over for HSV2-gF vil krydsreagere svagt med HSVl-gC (22f), og at et polyklonalt 10 antiserum fremstillet over for HSVl-virionhylster-proteiner udfældede gF (22d), hvilket tyder på en mulig strukturel homologi mellem de to glycoproteiner. Således syntes det, at en mulig homolog til HSVl-gC var HSV2-gF-proteinet. Dette slægtsskab blev undersøgt i overensstemmelse med den 15 foreliggende opfindelse.

Membranbundne polypeptider og glycopolypeptider kendes fra Dokumentet Chemical Abstracts 99, 2836v (1983). De i dokumentet beskrevne eksperimenter beskæftiger sig imidlertid udelukkende med forskning i relation til hæmning af 20 glycosylering af Herpes virus glycoproteiner ved brug af en glycosyleringshæmmer.

Forskning fra ét og samme laboratorium har givet anledning til to forskellige yderligere publikationer nemlig Science 218, 381 (1982) og Nature 302 72 (1983). Disse artikler 25 beskriver udtrykkelse af genet for HSVl-gD proteinet i E.

coli. Artiklen i Science indeholder dog ingen data i relation til infektion med virus. Artiklen i Nature, af de samme forfattere, er instruktiv m.h.t. hvad forskerne selv havde af tanker om deres oprindelige eksperimentelle arbejde.

30 Forfatterne har tidligere beskrevet en konstruktion, som koder for et kimærisk protein, og antyder at det giver anledning til dannelse af antistof in vitro. De indrømmer på side 74 at de i artiklen præsenterede data demonstrerer det praktisk mulige i at producere en subunit baseret vaccine mod 35 HSV-l og HSV-2 ved brug af rekombinant DNA-teknikker. At der eksisterer en praktisk mulighed er dog ikke ensbetydende med 6 DK 171976 B1 en faktisk succes i forbindelse med produktion af en vaccine som er effektiv mod infektion med virus.

I modsætning til det ovenfor citerede demonstrerer den foreliggende opfindelse for første gang produktion af en in 5 vivo vaccine, som virker effektivt mod herpes virus in vivo.

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1A og IB viser DNA'en og de afledte aminosyresekvenser af HSVl- og HSV2-gD-generne og de omgivende flankerende områder.

10 Fig. 2 viser en hydropatianalyse af gD-proteinerne fra HSVl og HSV2.

Fig. 3 er et diagram over plasmidet pgD-dhfr konstrueret til udtrykkeisen af en membranbundet form af HSVl- glycoprotein D.

15 Fig. 4 viser resultatet af mærkning af gD12-celler med humane antistoffer over for HSV, idet (A) er en visualisering med fasekontrastoptik, og (B) et fluorescensbillede af de samme celler.

Fig. 5 viser radioimmunofældninger af klonet gD fra den 20 her omhandlede gD12-cellelinie og nativt gD fra HSVl-inficerede human celler.

Fig. 6 viser bindingen af humane anti-HSV-antistoffer til gD12-celler og udgangs-DHO-cellelinien.

Fig. 7 er en skematisk gengivelse af HSVl-gD-protein og 25 belyser lokaliseringerne af signalsekvensen og det membranbindende område.

Fig. 8 er en diagram over udtrykkelsesplasmidet pgDtrunc-dhfr for en secerneret form af HSVl-gD-protein.

7..

DK 171976 B1

Fig. 9 viser radioimmunofældninger fra den her omhandlede gD10.2-cellelinie.

Fig. 10 viser radioimmunofældninger fra forforstærkede dg forstærkede gD10.2-cellelinier.

5 Fig. 11 påviser den grad af forstærkning, som opnås med Mtx-forstærket gD10.2 -cellelinie.

Fig. 12 viser fragmenterne af pgC2Sal2.9, som blev underkastet DNA-sekvensanalyse.

Fig. 13 viser DNA-sekvensen afledt fra pgC2SA12.9 sammen 10 lignet med DNA-sekvensen af HSV1-gC-området.

Fig. 14 belyser Sourthern-afdupningsanalyse af HSV2-geno-misk DNA og pgC2Sal2.9-DNA.

Fig. 15 belyser translationen af den store åbne HSV2-aflæsningsramme og sammenligning med HSVl-gC-amino-15 syresekvensen.

Fig. 16 belyser hydropatianalyse af HSVl-gC-protein og proteinet indkodet af den større åbne HSV2-aflæsningsramme.

Sammenfatning af opfindelsen I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse udnyttes 20 rekombinant-DNA-teknologi til at tilvejebringe genprodukter i store mængder i en ikke-patogenisk form til anvendelse som diagnostiske midler. Fordelene ved sådanne genprodukter belyses med henvisning til diagnosen af visse infektioner, såsom HSV. De nuværende metoder, der anvendes til at 25 diagnostisere HSV, inkluderer (a) dyrkningen af kliniske isolater, (b) anvendelsen af reagenser fremstillet ud fra levende virus eller (c) anvendelsen af monoklonale antistoffer koblet til et mærke, såsom fluorescence eller enzym. Den første metode er arbejdsintensiv og kræver typisk i [ i i 8 DK 171976 B1 flere dage til opnåelse af et resultat. Den anden arbejdsmåde er ofte ikke praktisk, fordi den kræver biokemiske procedurer udover rækkevidden af de fleste kliniske laboratorier. Den tredie metode afhænger af detektionen af en åben læsion og 5 tilgængeligheden af detektionsmidler, f.eks. et fluorescensmikroskop eller et fluorescerende mærke. På grund af dette er laboratoriebekræftelse af klinisk diagnose ikke almindeligt anvendt.

Den foreliggende opfindelse angår i et første aspekt en 10 fremgangsmåde, som omfatter fremstilling i en rekombinant, stabil pattedyrcellelinje af gC- eller gD- glycoprotein-polypeptid fra Herpes simplex virus type l eller type 2, hvorved glycoproteinet har eksponerede antigene determinanter i stand til specifikt at binde komplementære antistoffer mod 15 Herpes simplex virus type l eller type 2.

I en særlig foretrukken udførelsesform af denne fremgangsmåde, fremstilles der initielt et trunkeret derivat af et membranbundet gC- eller gD-glycoproteinpolypeptid fra Herpes simplex virus type 1 eller type 2 frit for 20 membranbindende domæne, hvorved polypeptidderivatet er frit for membranen og har de eksponerede antigene determinanter.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse et diagnostisk kit, der omfatter: (a) trunkeret membranfrit polypeptid, som kan opnås ved 25 fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrevet ovenfor, og (b) en sekundær komponent, som omfatter enten komplementært antistof overfor Herpes simplex virus type 1 og/eller type 2 eller anti-antistof, der er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof.

30 Et tredje aspekt af den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåde til detektion af antistof indeholdt i en biologisk afledt væskeprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: DK 171976 B1 9 (a) nævnte væskeprøve bringes i kontakt med et trunkeret polypeptid som opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som beskrevet ovenfor for at binde polypeptidet med komplementært antistof i 5 væskeprøven; og (b) bindingstrinnet (a) detekteres.

Det foreliggende system anvender et diagnostiske produkt et polypeptid med de samme antigeniske determinanter, men som ikke er funktionelt forbundet med overflademembranen. Som 10 anført mere detaljeret nedenfor, er et sådant polypeptid et afkortet membranfrit derivat af et membranbundet polypeptid. Derivatet dannes ved udeladelse af et membranbindende domæne fra polypeptidet, hvilket tillader det at secerneres fra det rekombinante værtscellesystem, hvori det er blevet 15 produceret.

I endnu en udførelsesform dannes polypeptidet først i funktionel forbindelse med en overflademembran, hvorefter polypeptidet opløses, fortrinsvis i et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, for at frigøre det fra membranen.

20 Som forklaret nærmere nedenfor udnyttes det diagnostiske produkt ifølge opfindelsen i stedet for det tilsvarende produkt afledt fra et levende patogen ved analoge immuno-prøvninger. I den henseende ville et kommercielt diagnostisk prøvesæt inkludere de ovennævnte diagnostiske produkter med 25 en række forskellige andre immunologiske produkter, hvoraf mindst et er mærket, til detektion af dets komplementære antistof eller andet antigen. Systemet er blevet beskrevet med hensyn til den molekylære kloning af gD-proteinerne fra HSV1 og HSV2, som har tilstrækkelige antigeniske 30 determinanter til at sætte det i stand til specifikt at binde komplementært antistof, nemlig antistof over for HSV1 og HSV2. Den specifikke teknik til kloning, sekvensbestemmelse og udtrykkelse af HSVl-gD-protein er anført i eksempel 1 w nedenfor. Som angivet deri, afslørede hydropatikurven i fig.

35 2 et hydrofilt carboxylterminalt domæne, som følger efter et i i 1° DK 171976 B1 hydrophobt område. Denne struktur er karakteristisk for et membranbundet glycoprotein. Dets funktion er at forankre proteinet i de cellulære og virale membraner.

For at undersøge beslægtetheden mellem HSVl og HSV2 er det 5 blevet bestemt, at en DNA-sekvens i et 2,29 kb område af HSV2-genomet er colineær med HSVl-gC-genet. Translation af en stor åben aflæsningsramme i dette område viser, at et protein, som har væsentlig homologi med HSVl-gC, er indkodet i dette område. Det antages, at dette område koder for HSV2-10 gF-genet, og at gF-proteinet er den HSV2-homologe til HSV1-glycoprotein c.

Som anført i denne beskrivelse betegnet et glycoprotein i HSV2, som tidligere blev betegnet som gF, mere korrekt som et gC. (Betegnelserne "HSV2-gF", MHSV2-gC" og "gC-2" vil 15 blive anvendt valgfrit om dette produkt). Det har vist sig, at et segment af gC-2 er type-fælles med HSVl-gC (eller gC- l), medens et andet segment er type-specifikt.

Et diagnostisk produkt dannet af et fragment af gC-2 indeholdende det type-specifikke segment, men under udelukkelse 20 af det type-fælles segment muliggører detektionen af HSV2 i modsætning til HSVl. Hvis den diagnostiske prøvning er positiv, har individet HSV2. Anvendelse af denne prøvning i kombination med en anden prøvning, som er fælles for HSVl og HSV2, ville muliggøre diagnose af HSVl. F.eks. svarer en 25 positiv aflæsning under anvendelse af gD ved en diagnostisk prøvning til tilstedeværelsen af HSVl og/eller HSV2. Hvis den type-specifikke gC-2-prøvning også er positiv, har individet HSV11 og HSV2; hvis den er negativ, har individet kun HSV2. Således er der for første gang blevet udviklet en diagnostisk 30 prøvning, som er i stand til at skelne HSVl fra HSV2.

Andre kendte glycoproteiner i HSVl eller HSV2, f.eks. gA, gB eller gE, eller andre, som endnu ikke er identificeret, kan anvendes til diagnostiske produkter for HSVl eller HSV2. Hvis DK 171976 B1 11 sådanne glycoproteiner inkluderer type-specifikke determinanter for HSV1 eller HSV2, så kan rekombinante teknikker, som er analoge med dem, der er anført i denne beskrivelse med hensyn til gC og gD, anvendes til at præparere 5 sådanne glycoproteiner til diagnostiske produkter, som er i stand til at skelne HSV1 fra HSV2. Hvis glycoproteineme også inkluderer type-fælles determinanter, så kan de samme rekombinans-teknikker, som er anført i denne beskrivelse med hensyn til gC-2-fremstillingen, anvendes til at isolere den 10 type-specifikke fraktion isoleret fra den type-fælles fraktion til specifik diagnose af HSV1 eller HSV2. Hvis glycoproteinet kun inkluderer type-fælles fraktioner, så kan det produceres ved rekombinante teknikker på en måde analog med gC.

15 Det antages, at kun visse teknikker for molekylær kloning producerer et polypeptid med egnede specifikke antigeniske determinanter til detektion af dets komplementære antistof. Således må polypeptidet under dannelsen formes på en måde, så det foldes rigtigt, så det glycosyleres, og så det for-20 arbejdes korrekt. Som belyst i eksempel i består en teknik til gennemførelse af produktionen af en celle med disse ønskede egenskaber i, at polypeptidet klones molekylært på en måde, så det er funktionelt forbundet med overflademembranen hos en rekombinant værtscelle. Til dette formål anses det for 25 nødvendigt at anvende et eukaryotisk værtscellesystem, og fortrinsvis et pattedyrcellesystem. Således producerer f.eks. HSV1-glycoprotein D udtrykt i kinesisk-hamster-ovarie-celler (CHO) et membranbundet gDprotein med egnede antigenegenskaber. Andre egnede rekombinante værtscellesystemer 30 inkluderer muse-L-celler osv.

I denne beskrivelse anvendes betegnelsen "rekombinant" om celler, som er blevet transficeret med vektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi og således transformeret med evnen til at producere det omhandlede 3 5 polypeptid. "Funktionel forbindelse" betyder at være i DK 171976 B1 12 bundet til membranen, typisk ved at rage ud til begge sider af membranen, på en sådan måde at der blotlægges antigeniske determinanter foldet i en nativ konformation, som er genkendelig for antistof udløst over for det native patogen.

5 "Membranbundet" med hensyn til de her omhandlede polypeptider henfører til en klasse af polypeptider, som almindeligvis produceres i eukaryotiske celler og er karakteriseret ved at have en signalsekvens, som antages at hjælpe med til dets sekretion igennem forskellige cellemembraner såvel som et 10 membranbindende domæne (sædvanligvis af hydrophob natur og forekommende ved den C-terminale ende), som menes at forhindre dets fuldstændige sekretion igennem cellemembranen. Som sådant forbliver det funktionelt forbundet med eller bundet til membranen. Denne opfindelse er særligt rettet mod 15 udnyttelsen af de membranbundne polypeptider, som er forbundet med patogene organismer, f.eks. herpes-virus.

Når først de antigeniske determinanter i polypeptiderne i-følge opfindelsen er tilvejebragt i funktionel forbindelse med overflademembranen, kan membranen fjernes fra polypep-20 tiderne uden at ødelægge de antigeniske egenskaber. Således kan det membranbundne polypeptid f.eks. fjernes fra membranen ved solubilisering med en egnet opløsning, fortrinsvis én der indeholder et ikke-ionisk overfladeaktivt middel. En fordel ved at gøre dette er at isolere polypeptidet fra fremmed 25 cellemateriale, hvilket forøger den potentielle styrke ved dets anvendelse i en vaccine. En teknik til fjernelse af membranen fra polypeptidet er beskrevet nedenfor.

I endnu en udførelsesform kan membranfrie præparater opnås ved skabelse af et sekretionssystem. Som beskrevet mere 30 detaljeret nedenfor, har et sådant secerneret polypeptid mindst nogle af de antigeniske centre, som er nødvendige for antistof-stimulering.

I endnu en udførelsesform kan membranen fjernes ved sekretion af polypeptiderne fra deres membranbundne miljø. Det har vist 35 sig, at et sådant secerneret polypeptid har mindst nogle af DK 171976 B1 13 de antigeniske centre, som er nødvendige for antigenisk detektion. En egnet teknik til gennemførelse af dette er beskrevet i eksempel 3 nedenfor.

Der er et antal kendte teknikker til bestemmelse af en u-5 kendte mængde antigen eller antistof i den biologiske væske, såsom serum eller urin, eller fra hudprøver eller lignende. I princippet udnytter den foreliggende opfindelse sådanne kendte teknikker, men anvender visse molekylært klonede diagnostiske reagenser af en type som anført ovenfor ved de 10 iøvrigt kendte procedurer. I overensstemmelse hermed vil procedurerne selv kun blive beskrevet alment med henvisning til konventionel immunologilitteratur, hvad angår detaljerne ved procedurerne. Det vil være velkendt for fagfolk, hvordan de hidtil ukendte diagnostiske produkter ifølge opfindelsen 15 kan udnyttes ved konventionel immunologisk teknik.

Af nemhedsgrunde ved beskrivelsen vil den almene betegnelse "diagnostisk produkt" blive anvendt om det antigen-funktionelle produkt ifølge opfindelsen. Betegnelsen "diagnostisk produkt" defineres som et polypeptid med antigeniske deter-20 minanter, som er i stand til specifikt at binde tilsvarende antistof induceret af den patogene organisme, og som dannes i en rekombinant værtscelle, som er i stand til at producere det, og som er afledt fra en stabil kontinuert rekombinant cellelinie. Polypeptidet kan enten være funktionelt forbundet 25 med en overflademembran i den rekombinante værtscelle eller ikke være det.

I det sidstnævnte tilfælde er polypeptidet typisk i afkortet form og dannet ved sekretion fra det rekombinante værtscellesystem eller frigjort fra membranen ved opløsning af 30 membranen i en opløsning, f.eks. af et ikke-ionisk overfladeaktivt middel.

I almindelighed kan de diagnostiske produkter anvendes til detektion af enten antistof eller antigen i en biologisk afledt væskeprøve. Til detektion af antistof bringes væske- DK 171976 B1 14 prøven i kontakt med det diagnostiske produkt for at binde denne med komplementært antistof i væskeprøven, hvorefter denne binding detekteres og, fortrinsvis, også måles. Til detektion af antigen bringes væskeprøven i kontakt med det 5 diagnostiske produkt, der har de samme antigeniske determinanter som prøveantigenet. Derpå detekteres, og fortrinsvis måles, prøveantigenet ved anvendelse af en kompetitiv prøvning.

Som anført ovenfor udnytter et kendt skema ekstrakter af HSV-10 inficerede celler som antigen ved en ELISA-sandwichtype- teknik. Den almene procedure for en sådan teknik kan anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse.

Hvad angår systemet for detektering af antistof, dannes det diagnostiske reagens typisk ved at blive bundet (f.eks. ved 15 adsorption eller kovalent binding) til en fast overflade, typisk overfladen af et hul af reagenaglas.

Andre egnede faste overflader kan inkludere en overflade, som er i stand til at immobilisere det diagnostiske reagens, såsom en småkugle.

20 Den faste overflade, som skal påføres et lag af det diagnostiske produkt, bør være tilstrækkeligt impermeabelt for væske til at tillade effektiv fjernelse af ubundet reagens ved vaskning. Den bør også muliggøre binding af det diagnostiske reagens. Hvis der ønskes kovalent binding, inklu-25 derer egnede overflader plastik, såsom polystyren. Egnet koblingsteknik mellem overfladen og det diagnostiske område er anført i US patentakrift nr. 3 720 760.

Ved sandwich-teknikken til bestemmelse af et ukendt antistof i en prøve, omsættes det bundne diagnostiske produkt med 30 antistoffet og med opløseligt mærket anti-antistof, som er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof i prøven. På denne måde bindes prøve-antistoffet på den faste overflade både til det diagnostiske produkt og det mærkede DK 171976 B1 15 anti-antistof i en sandwich. Derpå vaskes den faste overflade for at fjerne ureageret mærket antiantistof. Derefter detekteres det mærkede anti-antistof på den faste overflade eller i vaskeopløsningen som en indikation af antistofmængden 5 i prøven. Reaktionen på den faste overflade danner et reaktionsprodukt omfattende i rækkefølge; fast overflade* diagnostiskeprodukter* prøveantistof* mærket anti-antistof.

"*" betegner en binding. F.eks. kan bindingen mellem overfladen og det diagnostiske produkt være en kovalent 10 binding eller en adsorptiv binding. Bindingerne mellem det diagnostiske produkt og prøveantistoffet og mellem prøveantistoffet og det mærkede anti-antistof omfatter immunologiske bindinger.

Som det er velkendt ved ELISA, er mærket et enzym, som de-15 tekteres kolorimetrisk efter reaktion med det komplementære substrat til dannelse af en farvet form. En sådan kolometrisk detektion har den fordel, at den ikke kræver instrumentering. Andre kendte mærker inkluderer radioaktive eller fluormetriske mærkninger, som detekteres ved instrumentering.

20 Mærkning af anti-antistoffet med enzym gennemføres fortrinsvis ved konventionel teknik med sammenknytning ved hjælp af en eller flere kovalente bindinger. Sådanne kovalente bindinger kan frembringes ved tilsætning af eksterne koblings- eller brodannelsesmolekyler eller ved direkte kon-25 densation af eksisterende sidekæder. Funktionelle brodannelsesmidler til gennemførelse af dette formål er velkendte inden for faget.

Systemet ifølge opfindelsen er også anvendeligt i forbindelse med den såkaldte kompetitive bindingsteknik til im-30 munoprøvning af antistoffer, som skal detekteres i en biologisk afledt væske. I dette tilfælde bindes det diagnostiske produkt også i et lag til en fast overflade som anført ovenfor. Denne faste fase bringes i kontakt med den biologisk afledte væske indeholdende antistoffet, som skal detekteres, 35 og med frit opløseligt mærket antistof af den samme DK 171976 B1 16 immunologiske type som antistoffet, der skal detekteres. En kompetitiv immunologisk reaktion bringes i stand mellem det bundne diagnostiske produkt og både (a) antistoffet i prøven, som skal detekteres, og (b) det enzymmærkede antistof.

5 Således er koncentrationen af antistof, som skal detekteres i den biologisk afledte væske, omvendt proportional med det enzym-mærkede antistof, som er bundet til den faste overflade.

Efter den ovenstående kompetitive reaktion adskilles den 10 faste overflade fra den flydende fase. Når der anvendes et reagensglas eller et hul, består dette i vaskning af reagensglasset eller hullet. Denne vaskning fjerner ubundet mærket antistof fra overfladen.

Derpå detekteres det mærkede antistof i den faste eller 15 flydende fase som et mål for prøveantistoffet. Passende gennemføres dette ved at den fraskilte faste fase bringes i kontakt med en opløsning indeholdende opløseligt substrat for enzymet, således at substratet omdannes til en farvet form.

20 Den ovennævnte sandwich-teknik eller kompetitive teknik er særlig effektiv til måling af antistoffer for patogen i en biologisk afledt prøve ved diagnose, hvor tilstedeværelsen af antistofferne i prøven er en indikation for, at patienten er blevet inficeret med patogenet. Således er en måling af 25 antistoffer for HSV f.eks. en indikation af, at patienten er blevet inficeret.

Andre patogene antistoffer, på hvilke opfindelsen er anvendelig efter en viral infektion, er adenovirus, coxsackie, cytomegalovirus, Epstein-Barr, katte-leukæmia-virus, hepa-30 titis, svinechloera, influenza, mæslinger, "Newcastle disease "-virus, parainfluenza, rabies, respiratorisk syncytialvirus, rotavirus, rubella, sendai, varicella. Parasitiske infektioner inkluderer amøbiasis, babesia, cysticercosic echinococcosis, Leishmaniasis, onchocerciasis, malaria, DK 171976 B1 17 visceral larva migrans, toxoplasmosis, trypanosomiasis, trichinosis og schistosomiasis. Andre anvendelser af opfindelsen rækker ind i området af autoimmune sygdomme, hvor produktet omfatter et membranbundet protein fra værten og 5 anvendes til at måle antistoffer rettet mod det protein, f.eks. acetylcholinreceptorproteinet.

De diagnostiske produkter ifølge opfindelsen er også anvendelige i forbindelse med bestemmelsen af ethvert poly-peptid eller protein, patogent eller ej, i den biologisk 10 afledte prøve med de samme antigeniske determinanter som det molekylært klonede diagnostiske produkt. F.eks. er systemet anvendeligt til bestemmelse i en serumprøve af humane hormoner, såsom humant væksthormon og insulinlignende vækstfaktorer, blodprotein, såsom human vævsplasminogen-15 aktivator (tPA), samt inteferoner og lignende.

En teknik, som kan anvendes til detektion af sådanne proteiner, designerede antigener, er direkte analoge med den ovenfor beskrevne kompetitive teknik. Antistoffer bindes til den faste overflade i stedet for det diagnostiske produkt 20 ifølge opfindelsen. Ved den kompetitive teknik mærkes det diagnostiske produkt som beskrevet ovenfor, f.eks. med enzym, og blandes med det faststofbundne antistof og serumprøven indeholdende proteinet med antigeniske determinanter, som skal måles. Der sker en kompetitiv immunologisk reaktion 25 mellem det immobiliserede antistof og både antigenet, som skal detekteres, og det enzym-mærkede diagnostiske produkt. Koncentrationen af antigenet, som skal detekteres, er omvendt proportional med det enzym-mærkede diagnostiske produkt bundet på en fast overflade.

30 Efter den kompetitive reaktion adskilles den faste fase fra væskefasen, og det mærkede diagnostiske produkt måles.

Sammenknytningen af mærket med det diagnostiske produkt kan gennemføres ved de fornævnte konventionelle teknikker.' F

DK 171976 B1 18 eks. kan et enzym-mærke knyttes til gD-proteinet ved anvendelse af glutaraldehyd som tværbindingsmiddel.

Ved en anden teknik til måling af antigen i en prøve efterfølges et første bindingstrin af kompetitivt type af et andet 5 bindingstrin af sandwich-type. I det første trin bindes det diagnostiske produkt til en fast overflade som anført ovenfor. Det blandes med en væskeprøve indeholdende det ukendte antigen, som skal bestemmes, og med en kendt mængde komplementært antistof. En kompetitiv reaktion frembringes 10 mellem antigenet i den frie prøve og det diagnostiske produkt på overfladen. Derpå vaskes den faste overflade, og der sættes mærket anti-antistof, som er immunologisk reaktivt med antistoffet på den faste overflade, til systemet. Dette trin omfatter en sandwich-teknik, hvorved der dannes et 15 reaktionsprodukt omfattende i rækkefølge: fast overflade* diagnostiske produkter* antistof* mærket anti-antistof.

Mængden af mærket anti-antistof bundet til antistoffet er et mål for det ukendte antigen i væskeprøven.

Prøvningssæt, som udnytter det førnævnte diagnostiske pro-20 dukt, er nyttige til diagnose af antigener eller antistoffer ved de ovennævnte teknikker. Et sådant sæt inkluderer det diagnostiske produkt og mærket anti-antistof, som er i stand til specifikt at binde antistof, som er komplementært til de antigeniske determinanter i det diagnostiske produkts 25 polypeptid. Dette prøvningssæt er egnet til en sandwich-type-ELISA for prøveantistof.

Et andet prøvningsæt kan inkludere det diagnostiske produkt, mærket anti-antistof og umærket antistof komplementært til polypeptidets antigeniske determinanter. Dette prøvningssæt 30 er effektivt til den såkaldte kompetitive sandwich-teknik til bestemmelse af prøveantigen.

Et yderligere prøvningssæt inkluderer det diagnostiske produkt sammen med mærket antistof komplementært til polypep-tidets antigeniske determinanter. Dette prøvningssæt er egnet DK 171976 B1 19 til bestemmelse af antistof i prøven ved en kompetitiv teknik.

Det diagnostiske produkt i prøvningssættet kan være i opløsning eller bundet til den faste overflade i den form, 5 hvori det skal anvendes. F.eks. kan det diagnostiske produkt være påført som et lag på den indre overflade af et reagensglas eller et hul i en mangehullet plade til direkte anvendelse ved den endelige immunoprøvning. Denne form belyser stabilitetsfordelene ved det molekylært klonede 10 diagnostiske produkt i sammenligning med anvendelsen af det levende virus. Selvfølgelig letter det i høj grad prøvningen i et laboratorium eller i en læges praksis, fordi det molekylært klonede produkt ikke er infektiøs, som det levende patogen, der blev anvendt ved hidtil kendte immunoprøvninger, 15 ville være det.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel belyser fremgangsmåden til dannelse og karak-20 terisering af gD-proteinerne fra HSV1- og HSV2-proteiner.

Virusvækst og isolering af viral DNA

HSV1 (stamme Hzt) og HSV2 (stamme G) blev dyrket på Hep 2 celler ved henholdsvis 37 °C og 33 °C. Den virale DNA blev isoleret fra inficerede cellekulturer ved nedbrydning med 25 proteinase K og bånddannelse med CsCl (23).

Cloning af aD-generne i HSV1 og HSV2

Tidligere kortlægnings- og kloningsundersøgelser havde lokaliseret HSVl-gD-genet til et BamHI-fragment på ca. 6,6 kb (6,24). HSV1-DNA blev spaltet ved BamHI/ og 6-7 kb området 30 blev isoleret ved agarosegel-elektrophorese. Dette fragment DK 171976 B1 20 blev ligeret ind i BamHI-nedbrudt pBR322, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 (ATCC Nr. 31446). De ampicillinresistente, tetracylinfølsomme plasmider blev sigtet for det rette HSVi-fragment ved 5 restriktionsenzym-nedbrydning. Det korrekte gD-holdige Sstl-fragment blev subklonet ind i Sstl-nedbrudt plasmid pFM3 (EP offentliggørelsesskrift nr. 0068693).

Selv om gD-genet fra HSV2 tidligere var kortlagt ved rekombination med HSVI, var den nøjagtige lokalisering af dette 10 gen ukendt. Derfor blev et ca. 10 kb Hindlll-fragment fra det lille unikke område af HSV2-genomet (4) ligeret ind i Hindlll-centret på bakteriofag~kloningsvektoren 590 (25).

In vitro pakket fag blev udpladet i lav tæthed og sigtet ved Benton-Davis-proceduren med en 32P-mærket subklon af gD-15 genet fra HSVI (26). Positivt hybridiserende plakker blev dyrket, DNA'en isoleret, og gD-genet lokaliseret ved Southern-afdupning og hybridisering med det 32P-mærkede HSVI-gD-gen (27). De positivt hybridiserende, HSV2-gD-holdige fragmenter blev subklonet ind i plasmidet pUC9 20 (28) .

DNA-sekvensbestemmelse og datamat analyse.

Forskellige fragmenter fra HSVI- og HSV2-gD-generne blev subklonet ind i ml3 fag vektoren mp9 (29) og blev sekvens -bestemt ved Sanger's dideoxynudeotidmetode (30).

25 Nucleotidsekvenserne blev analyseret under anvendelse af HOM-programmet (31). Hydropatien af den afledte proteinsekvens blev analyseret under anvendelse af en bredde på 12 og et spring på 1 (31a).

Kloning af gD-områderne fra HSVI og HSV2 30 Andre undersøgelser har lokaliseret HSVI-gD-genet til 6,6 kb BamHI-J-fragmentet ifølge Roizman's nomenklatur (6, 12, 24). Isolering og sekvensbestemmelse af en del af dette fragment i DK 171976 B1 21 viste, at dette fragment indeholdt HSVl-gD-genet. Da man kunne forvente, at HSVl-gD-genets DNA-sekvenser ville være relativt homologe med HSV2-gD-genet, blev dette fragment anvendt som sonde til isolering af gD-genet fra HSV2-genomet.

5 Da de fleste af generne fra HSV1- og HSV2-genomerne viser sig at ligge colineært på kortet (35), blev området fra det lille unikke område af HSV2-genomet, som svarede til HSVl-gD-området (Hindlll L-fragmentet (12)), klonet ind i en fag lambda vektor. Sigtning af de resulterende plakker med 10 en 32P-mærket HSVl-gD-gen-subklon afslørede positivt hydri-diserende plakker, hvilket tyder på, at der virkelig var nucleinsyresekvenshomologi mellem de to virusgenomer i dette område. Isolering af fag-DNA'en og efterfølgende Southern afdupningsanalyse afslørede det område af dette fragment, som 15 svarede til gD-genet. Dette område blev subklonet til DNA-sekvensanalyse.

Kodeområderne

Fig. 1 belyser de to gD-DNA-sekvenser sammenlignet ved HOM-programmet (31). Nucleotid nummer 1 er valgt som A i ATG-20 methionin-startkodonnen. Åbninger er blevet indsat af HOM-datamatprogrammet for at maksimere sekvenahomologierne (31). Nucleotidforskelle er vist ved symbolet (*), medens amino-syreforskelle er vist indrammet. Aminosyreforskeliene mellem den her rapporterede HSVl-gD-sekvens, bestemt for Hzt-25 stammen af HSV1, og den der er rapporteret af Watson et al.

(6) for Patton-stammen, er angivet ved symbolet (+). Starten af HSVl-gD-gentranscriptionen, vist ved en pil, er fra Watson et al. (32) . Mulige N-forbundne glycosyleringscentre er vist gråtonet. To mulige "TATA"- sekvenser er vist 5' for starten 30 af gD-transcriptionen, medens en tredie mulig "TATA" - sekvens er vist r' for en anden åben aflæsningsramme ved 3'-enden af HSV2-sekvensen. To områder af ikke-kodende-sekvens -homologi bør noteres 5' for gD-generne og 5' for den anden åbne aflæsningsramme fra HSV2-r-ekvensen.

DK 171976 B1 22

Hydropatien af gD-proteiner

Hydropatien af hver glycoprotein blev analyseret under anvendelse af programmet udviklet af Hopp et al. (31a). Som vist i fig. 2 findes der et hydrophobt transmembrandomæne ved 5 genets 3'-ende. Tolv aminosyrer lange strækninger blev analyseret, og gennemsnitshydropatien blev udregnet. Rest-forskellene mellem de to glycoproteiner er vist, idet bevarende ændringer er mærket (*), og ikke-bevarende ændringer er mærket (+). A) HSVJ-gD-protein-hydropati, B) HSV2-gD-10 protein-hydropati.

DNA-sekvensanalysen viser, at HSV1- og HSV2-gD-proteinerne er 80% homologe. Hovedparten af forskellene mellem disse to proteiner fandtes at være i de amino- og carboxylterminale områder. Disse proteiners aminoterminale område indeholder et 15 højhydrophobt område, som indeholder en argininrest nær ved det aminoterminale methionin. Dette hydrophobe domæne er signalsekvensen, som er karakteristisk for secernerede og membranbundne proteiner, og som antageligvis har den funktion at dirrigere mindst en del af proteinet ind i det 20 endoplasmatiske reticulums lumen (33). En sammenligning af de første 20 aminoterminale aminosyrer viste, at der var ialt 12 forskelle mellem type 1 og type 2 generne. Praktisk taget alle forskellene er imidlertid bevarende, da. de koder for andre hydrophobe aminosyrer. Undtagelserne er· gly-arg 25 udskiftningen ved rest 3 og arg-gly udskiftningen ved rest 7. Selv om disse udskiftninger ikke er bevarende, ændrer de dog ikke signaldomænets nettostruktur. Begge gener bevarer en positivt ladet rest i de første 10 aminosyrer.

Hyrdopatikurven i fig. 2 afslørede et hydrofilt carboxyl-30 terminalt domæne, forud for hvilket der var et hydrophot område. Denne struktur er karakteristisk for membranbundne glycoproteiner og er tidligere blevet fundet i andre virale overfladeantigener (5, 34). Dens funktion er at forankre proteinet i de cellulære og viral membraner, og som sådan 35 spiller den en vigtig rolle for virusinfektion. 12 23 DK 171976 B1 aminosyreændringer fandtes i dette område af gD-proteinerne fra rest 333 til rest 362, hvoraf de fleste er bevarende.

Dette tyder på, at det eneste kriterium for aminosyreme i dette område er, at de er overvejende apolære for at spænde 5 over lipid-dobbeltlaget. Desuden viser området efter membrandomænet (resterne 363-375), som sandsynligvis tjener til at forankre proteinen i membranen (33), 5 ændringer i dets første 13 rester efterfulgt af en lang homolog strækning. Dette resultat tyder på, at de første 10-15 rester 10 i det carboxylterminale hydrofile domæne kun har en forankrende funktion og derfor kun behøver at være ladet, medens de efterfølgende 23 rester kan have en anden vigtig funktion specifikt for gD-proteinet.

Selv om der findes mange andre aminosyreændringer igennem 15 disse to proteiner, er det store flertal af ændringerne bevarende. Dette understreges af den struktur, som afsløres af det i fig. 2 viste hydropatiprogram. Som det kan ses ved denne sammenligning, viser de to glycoproteiner meget ens kurver. De aminosyreændringer, som ikke er bevarende, viser 20 sig ikke at ændre proteinets hydropati.

Udtrykkelse af HSVl-gD

For at etablerere en permanent membranbundet-gD-producerende cellelinie, blev det gD-holdige fragment ligeret (fig. 3) ind i en pattedyrudtrykkelsesvektor (36) indeholdende den 25 selekterbare markør, dehydrofolatreduktase (dhfr). Fig. 3 viser et diagram af plasmidet, pgD-dhfr, konstrueret til udtrykkelse af HSV1-glycoprotein D. Udtrykkelsesplasmidet bestod af repliseringsoriginet og β-lactamase-genet (ampr) afledt fra E. coli plasmidet pBR322 (37), en cDNA-indsætning, 30 som koder for muse-dhfr (36, 38) under styring af den tidlige SV40-promotor og et 4,6 kb HindiII-BamHI-fragment indeholdende gD-genet, også under styring af den tidlige SV40-promotor. Hindlll-enden af dette fragment ligger 74 bp til 5'-siden for start-methionincodonen og inkluderer mRNA-35 cap-centret. Hindlll-centres ligger 250 bp til 3'-siden for DK 171976 B1 24

GoldbergHogness-kassen i SV40-promotoren. Kodeområdet af det gDholdige fragment er 1179 bp langt og slutter sig til et stort (1,9 kb) 3'-område, som indeholder mindst en del af glycoprotein E genet (24, 32), en translationsstopcodon og et 5 polyadenyleringscenter.

Plasmidet pgD-dhfr blev konstrueret som følger: Hindlll-BamHI-fragmentet på 4,6 kb indeholdende hele gD-kodesekvensen blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSV1- genomet (se ovenfor). Hindlll-Sall-fragmentet på 2,0 kb indeholdende 10 en SV40-origin/tidlig promotor og ampicillin resistensgenet og DNA-repliseringsoriginet fra pBR322 blev isoleret fra plasmidet pEHBal 14. SalI-BamHI-fragmentet på 2,1 kb indeholdende en muse-dihydrofolatreductase-cDNA-klon under styring af en anden SV40-origin/tidlig promotor blev isoleret 15 fra plasmidet pE348HBV E400D22 (36). Disse tre fragmenter blev ligeret sammen ved en tredobbelt ligering under anvendelse af T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294. De resulterende kolonier blev dyrket, og plasmid DNA'en sigtet 20 ved nedbrydning med Sac 2. Den korrekte DNAkonstruktion, pgD-dhfr (fig. 3), blev anvendt til yderligere transfektions -undersøgelser.

Plasmidet blev indført i Kinesisk-Hamster-ovarie-celler (CHO) deficiente mht produktionen af dhfr (39) under anvendelse af 25 calciumphosphatfældningsmetoden (40) . Der blev opnået kolonier, som var i stand til at vokse i medier, der manglede hypoxanthin, glycin og thymidin, og 9 dhfr+ - kloner blev analyseret. Af disse kunne gD detekteres i 5 kolonier under anvendelse af anti-HSVl-antistoffer ved radioimmunofældnings-30 og indirekte-immunofluorescenc-prøvninger. En af de 5 linier (gD12) blev udpeget til yderligere undersøgelse. For at karakterisere det klonede gD-genprodukt blev gD12-celler metabolisk mærket med 35S-methionin eller 3H-glucosamin og analyseret ved radioimmunofældning. Den anvendte procedure 35 var som følger: Celler blev dyrket i Ham's F12-medium (Gibco) suppleret med 7% kommercielt dialyseret fetalt okseserum DK 171976 B1 25 (Gibco), penicillin (100 enh/ml) og streptomycin (100 enh./ml). Da kulturerne var omkring 80% konfluente, blev mediet fjernet, cellerne blev vasket to gange med phosphatpufferet saltopløsning (PBS), og der tilsattes 5 mærkende medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium indeholdende enten en tiendedel af den normale koncentration af methionin eller glycose) til en slutkoncentration på 0,064 ml/cm. Der tilsattes enten 35S-methionin (SJ.204, Amersham Inc.) (50-75/μΟϊ/ιη1) eller 3H-glucosamin (Ι00/μ0ΐ/ιηί) , og 10 cellerne blev dyrket i yderligere 18-20 timer. Efter mærkning blev mediet indhøstet, og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernes fra dyrkningsakålen ved behandling med PBS indeholdende 0,02% EDTA. Cellerne blev derpå solubiliseret i lysebuffer bestående af: PBS, 3% NP-40, 0,1% 15 okseserumalbumin, 5 x 10'5 M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12 000 x G. Til immunofældningsreaktioner blev cellelysater fortyndet 3 gange med PBS, og aliqouter (typisk 180/μ1) blev blandet med 2-5 μΐ 20 antisera og inkuberet ved 4 °C i 30 minutter. Immunkomplekser blev derpå adsorberet til fikserede S. aureusceller ved Kessler's metode (40a) og blev udfældet ved centrifugering ved 12 000 x G i 30 s. S. sureuscellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskebuffer (PBS, 1% NP-40, 0,3% 25 natriumdodecylsulfat), og immunkomplekserne blev elueret med 20 μΐ polyacrylamidgel-prøvebuffer (62,5 mM "Tris"-HC1-puffer (pH 6,8 ( indeholdende 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,01% bromphenolblat) ved 90 °C i 3 minutter. Efter centrifugering i 30 S blev supernatanterne påført 10% 30 polyacrylamidgelplader ifølge Laemmli's metode (45).

Fig. 4A sammenligner autoradiografier opnået med gD12-cellelinien og HSVl-inficerede celler: kontrolimmunofældning fra gD12-cellelysatet med normal kaninserum (bane 1); immunof ældning af nativt gDdyrket i HEL-celler (bane 2) og 35 A549-celler (bane 3) med det monoklonale anti-gD-antistof, 55-S (41); immunofældning af klonet gD fra gD12-cellelysatet med polyklonale kaninantistoffer (Dako Corp.) over for DK 171976 B1 26 HSV1 (bane 4) og med det monoklonale antistof, 55-S (bane 5); immunofældning af klonet gD fra gD12-cellerne mærket metabolisk med 3H-glucosamin med polyklonale kanin-antiHSVl-antistoffer (bane 6) .

5 Det ses (bane 4 og 5), at et diffust bånd på 59-60 kd blev specifikt fældet fra gD12-cellelinien under anvendelse af enten kanin-anti-HSVl-antistoffer eller det monoklonale anti-gD-antistof, 55-S, der er specifikt for HSV1-proteinet (41). Denne molekylvægt stemmer godt overens med den, der er 10 rapporeteret for gD isoleret fra HSV1-inficerede KB-celler (42). Det ses, at det samme monoklonale antistof fældede proteiner af lignende, men forskellige molekylvægte fra HSVi-inficerede humane cellelinier. Hovedproduktet ud- fældet fra den humane lungecarcinoma-cellelinie A549 (bane 2) var på 53 15 kd, og det, der blev udfældet fra den humane embryoniske lunge-cellelinie (HEL), var på 56 kd (bane 3). Tidligere undersøgelser (43) har vist, at molekylvægten af HSV-glycoproteinerne varierer afhængigt af værtscellen, og at disse forskelle skyldes forskelle i glycosylering. For at 20 bestemme, om det i CHO-celler producerede gD-protein faktisk var glycosyleret, blev cellerne metabolisk mærket med 3H-glucosamin. Eftersom der blev udfældet bånd af identisk molekylvægt (bane 5 og 6) efter metabolisk mærkning med 35S-methionin eller 3H-glucosamin, konkluderede vi, at gD-25 proteinet produceret i CHO-celler er glycosyleret.

De humane cellelinier A549 (ATCC CCL 185) og HEL 299 (ATCC CCL 137) blev dyrket til konfluens i 3,5 cm vævskulturskåle og blev inficeret med HSV1 ved en multiplicitet på 10 pfu or. celle. Virus-inficerede celler blev mærket ved en metode mage 30 til den, som er beskrevet af Cohen et al. (44). 4 timer efter infektionen blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket en gang med frisk medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium) og en gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS). Derpå sattes frisk medium indeholdende en tiendedel af den 35 normale koncentration af methionin til cellerne sammen med 35S-methionin (Amersham, International) til en DK 171976 B1 27 slutkoncentration på 75 μα pr. ml medium. Cellerne, blev dyrket i yderligere 20 timer og derpå indhøstet ved behandling af vaskede celler med PBS indeholdende EDTA (0,02%). Virale proteiner blev solubiliseret i lysepuffer 5 bestående af PBS, 3% NP -40, 1% okséserumalbumin, 5 x 10'5 M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TlU/ml apoprotinin. Det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12 000 x G i en mikrocentrifuge. Til immunofældningsreaktioner blev celle- eller viruslysaterne fortyndet 3 gange med 10 phosphatpufferet saltopløsning, blandet med 2-5 pil af det passende antiserum og inkuberet i 30 minutter ved 4 °C.

Antistof-antigen-komplekser blev fjernet fra reaktionsmediet ved tilsætning af 25 μΐ af en 10% opløsning af fikseret S. aureus (Kessler (402)) og blev udfældet ved centrifugering 15 ved 12 000 x G i 30 s. S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskepuffer (PBS, 1% NP-40, 0,3% natriumdodecylsulfat), og cellerne blev suspenderet i 20 μΐ polyacrylamidgel-prøvepuffer (10% glycerol, 5% 2-mercapto-ethanol, 0,0625 M m.h.t. pH 6,8 "Tris"-puffer, 0,01% brom-20 phenolblåt) og inkuberet ved 90 °C i 3 minutter. Efter centrifugering (12 000 x G) i 30 s blev supernatanterne påført 10% polyacrylamidgelplader (45) .

For yderligere at udforske den post-translationelle forarbejdning af klonet gD gennemførtes en puls-forfølgelses-25 undersøgelser. Fig. 4B viser immunofældning af klonet gD fra gD12-celler med kanin-anti-HSVl-antistoffer (Dako, Corp.) ved forskellige tider efter impulsmærkning med 35S-methionin.

Fig. 4B viser en impulsmærkning af gD12-cellerne. Ved disse undersøgelser blev celler dyrket til konfluens i 10 cm 30 vævskulturskåle og mærket med 35S-methionin som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at mærkningsreaktionen blev udført i 15 minutter på is, cellerne blev vasket 3 gange med frisk medium og derpå ført tilbage til inkubatoren og inkuberet ved 37 °C i forskellige tidsrum. Reaktionerne blev afsluttet ved 35 vaskning af cellerne i kold phosphatpufferet saltopløsning og solubilisering af cellerne som beskrevet ovenfor.. Proteiner blev immunofældet ved de følgende tider efter impulsmærkning: DK 171976 B1 28 bane 1, 5 min; bane 2, 15 min; bane 3, 30 min; bane 4, 60 min; bane 5, 120 min.

Forstadieformen af gD med en molekylvægt på 51 kd blev specifikt udfældet fra gD12-cellelinien 5 minutter efter en 5 impuls med 35S-methionin, og dette forstadium blev jagtet ind i formen med højere molekylvægt (59 kd) efter omkring 60 minutter. Ud fra disse undersøgelser bedømmer vi halveringstiden for denne post-translationelle begivenhed til at være omkring 45 minutter. Forstadie-produkt-slægtsskabet mellem 51 10 kd båndet og 59 kd båndet minder nært om det, der er rapporteret for virus-produceret gD (14, 42, 46, 47), og kinetikken for denne proces minder om den, der er beskrevet af Cohen et al. (42). I virus-inficerede celler er forskellen i molekyævægt mellem forstadiet og produktet blevet tuskrevet 15 både .N-forbundne og O-forbundne oligosaccharider (48).

For at bestemme om gD blev eksporteret til celleoverfladen udførtes indirekte immunofluorescensundersøgelser. Ved disse undersøgelser blev kanin-, muse-, og humane anti-HSV-antistoffer omsat med ufikserede celler under betingelser, 20 som ikke permeabiliserer cellemembranen (49) . gD12-celler og udgangs-CHO-cellerne (forholdet 1:1) blev udpladet på glasdækplader (2,2 x 2,2 cm) og dyrket, indtil cellerne var omkring 60% konfluente. Human serum, som man vidste indeholdt antistoffer over for HSV1 (50), blev fortyndet 40 gange med 25 phosphatpufferet saltopløsning (PBS) og 100 μΐ blev pipetteret ud på vaskede celler, og cellerne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Cellerne blev neddyppet 3 gange i PBS for at bortvaske ubundet aktivitet og blev derpå inkuberet med 100 μΐ 20 gange 30 fortyndede tetramethylrhodaminisothiocyanat-mærkede gede- antihuman-IgG-antistoffer (Cappel Laboratories) i yderligere 30 minutter. Det ubundne mærkede antistof blev vasket bort med PBS, og cellerne blev dehydratiseret i iskold 50% ethanol og 100% ethanol og rehydratiseret med glycerol på et 35 mikroskop-præparatglas (49). Cellerne blev derpå betragtet under fasekontrast og flurescencoptik i fluorescensmikroskop DK 171976 B1 29 (Zeias). Fig. 5 viser: A, gD12 og CHO-celler set visualiseret med fasekontrastoptik; B, fluorescensbillede af de samme celler som i A. Sammenligning af fasekontrastbillederne med fluorescensbillerne (fig. 5) viste, at gD12-cellerne var 5 kraftigt mærkede, medens udgangs-CHOcellerne kun bandt lidt eller intet mærket antistof. Ved kontrolforsøg med normale musesera, normale kaninsera eller humane sera, som man vidste var negative for HSV-antistoffer, kunne der ikke detekteres nogen specifik mærkning af cellerne. Disse undersøgelser 10 tyder på, at gD blev eksporteret til celleoverfladen. Forsøg med CHO- og gD12-celler, som var fikseret før mærkningen med midler, der var kendt for at permeabilisere cellemembranen (methanol eller acetone), gav et forskelligt mærkningsmønster. Ved disse undersøgelser iagttog vi kraftig 15 perinucleær mærkning af gD12-cellerne med anti-HSVl- antistoffer og ingen specifik mærkning af CHO-cellerne.

For at bestemme om gD12-celler udtrykte antigeniske determinanter relevante for humane HSV1- og HSV2-infektioner undersøgtes bindingen af antistoffer fra individer, som man 20 vidste havde anti-HSVl- eller anti-HSV2-antistoffer (50). Radioimmunofældning af lysater fra metabolisk mærkede gD12-celler gav resultater, som var sammenlignelige med dem der blev opnået med gnaver-anti-HSV-sera (fig. 4). På lignende måde gav humane anti-HSVl-sera specifik mærkning af gD12-25 celler ved en indirekte immunoflurescenaprøvning (fig. 5) og mærkede ikke udgangs-CHO-cellelinien. Taget tilsammen giver de resultater, der blev opnået med forskellige gnaver-anti-HSV1- og -HSV2-antisera, monoklonale anti-gD-antistoffer og humane anti-HSV-antisera, bevis for, at gD udtrykt på 30 overfladen af gD12-celler har et antal antigeniske determinanter fælles med det native virus, og at strukturen af disse determinanter ikke er afhængige af samvirken med andre HSVl-proteiner. Den kendsgerning at et af de prøvede monoklonale antistoffer (1-S) vides at neutralisere HSVl in 35 vitro (41) og in vivo (51) viser, at gD produceret i CHO-celler har mindst en af de neutraliserende antigeniske determinanter fælles med det native virus.

DK 171976 B1 30 EKSEMPEL 2

Dette eksempel belyser anvendelsen af gD12-celler dannet i eksempel l ved en sandwich-type immunoprøvning til kvantitativ måling af bindingen af anti-HSV-antistoffer til gD12-5 celler ved en enzymforbundet immunosorptionsprøvning (ELISA) (52). Ved disse undersøgelser blev gDl2-celler og CHO-celler udpiadet og kemisk fikseret til skiftende huller i 96 hullers mikrotiter-vævskulturplader. Forskellige antisera, som man vidste havde antistoffer over for HSV, blev derpå 10 rækkefortyndet og fik lov at reagere med de fikserede celler (se reference 52). Ved prøvningens afslutning måltes absorbansen i hvert hul, og der blev konstrueret normalbindingskurver. Den specifikke binding af antistoffer til gDl2-cellerne blev bestemt ved subtraktion af værdierne opnået med 15 udgangs-CHO-cellerne fra dem, der blev opnået med gDl2- cellerne. Specifik binding af høj-titer-sera kunne detekteres i fortyndinger på 1:10 000.

Vi sammenlignede serumtitere bestemt mder anvendelse af gD12-celle-ELISA-prøvningen med anti-HSVl- og anti-HSV2- titere 20 bestemt ved konventionelle metoder. Humane sera, som i forvejen var titreret (50) over for HSV ved konventionelle prøvninger, dvs. inhibering af hemagglutination (JHA) eller komplementfiksering (CF) blev rækkefortyndet i huller på mikrotiterplader indeholdende gD12-celler eller udgangs-CHO-25 cellelinien, og bindingen af anti-gD-antistoffer blev kontrolleret ved en ELISA-prøvning. g012-cel- lerne og udgangs-CHO-cellerne blev podet i skiftende huller på 96 hullers mikrotiter-vævskulturplader (Falcon Labuiare)Yog blev dyrket til konfluens i F12-medium (GIBCO) indeholdende 10% 30 føtalt okseserum. Cellerne blev vasket 3 gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og blev derpå kemisk fikseret med 0,0625% glutaraldehyd i PBS. Cellerne blev igen vasket 3 gange med PBS og opbevaret indtil brug ved 4 °C i PBS indeholdende 1% oks eserumalbumin, 100 mM glycin, 1 mM 35 NaN3. For at måle anti-gO-antistof-titere blev cellerne vasket med PBS, og rækkefortyndede antisera fik lov at DK 171976 B1 31 reagere med de fikserede celler (50 μΐ slutvolumen) i 1 time ved stuetemperatur. Ubundet antistof blev vasket bort, og cellerne blev inkuberet med 50 μΐ 1:2000 fortyndet gede-antihuman-IgG koblet til pebberrodperoxidase (Tago, Inc.).

5 Det énzymforbundne antistof fik lov at reagere i 1 time ved stuetemperatur, og cellerne blev derpå vasket 3 gange med PBS. Efter inkubation tilsatte peroxidasesubstratet, o-phenylendiamin (200/μ1), og reaktionen fik lov at foregå i 10 minutter. Reaktionen blev afsluttet véd tilsætning af 2,5 M 10 H2S04 (SO/ul) og absorbansen af reaktionsmediet fra hvert hul blev bestemt med et automatiseret pladeaflæsnings-spektrofotometer (Titertek). I fig. 6 udviste serummet repræsenteret ved de åbne og lukkede cirkler en HSV-CF-titer på 128 og HSVl- og HSV2-IHA-titere på 4096. Serummet 15 repræsenteret ved åbne og lukkede kvadrater udviste en HSVl-CF-titer på <8 og HSVl- og HSV2- IHA-titere på <8. A, lukket cirkel og lukket kvadrat angiver binding til gD12-celler; åben cirkel og åben kvadrat angiver binding til CHO-celler.

B, lukket cirkel og lukket kvadrat repræsenterer den 20 specifikke binding til gD12-celler udregnet ved subtraktion af værdierne i A. I fig. 6 kan det ses, at et serum med en høj anti-HSV-titer bestemt ved konventionelle prøvninger gav en høj ELISA-titer, medens et andet serum med lave anti-HSV-titere ikke gav nogen detekterbar binding ved gD12-ELISA-25 prøvningen.

De beskrevne undersøgeriser viser, at stabile cellelinier på deres overflade konstitutivt udtrykker et transficeret genprodukt, som binder sig til antistoffer frembragt af herpes-virusinfektion. En række forskellige 30 transfektionsskemaer er selvfølgelig mulige under anvendelse af en række forskellige selekterbare markører. F.eks. kan muse-L-celler nyttigt transficeret under anvendelse af et mutant dhfr-gen som selekterbar markør. gD-genet blev transficeret ind i sådanne celler via en vektor, der 35 indeholder en sådan markør.

DK 171976 B1 32

En cellelinie som gD12 kan blandt andet anvendes ved den kliniske diagnose af HSV1- og HSV2-infektioner. Muligheden af, at udvikle diagnostiske reagenser baseret på klonale cellelinier er tiltalende, fordi den eliminerer behovet for 5 dyrkning og indeslutning af infektiøse midler, medens den tilvejebringer en stabil veldefineret reproducerbar kilde til antigen. Når et cellebaseret diagnostisk system konfigureres i form af en ELISA, kan antistofbestemmelse gennemføres på 2 timer eller mindre og kræver mindre end 50 ul serum.

10 EKSEMPEL 3

Dette eksempel belyser fjernelsen af membranen fra det udtrykte membranbundne protein.

Den forudgående beskrivelse angår produktionen af membranbundet gD-protein. Imidlertid blev der som diskuteret oven-15 for i forbindelse med fig. 2, ved analyse af aminosyresek-venserne af gD-proteinet i HSVl og HSV2 i hvert tilfælde identificeret et hydrophobt/hydrofilt carboxylterminalt membranbindingsdomæne.

Et skematisk diagram af HSVl-glycoprotein D (gD) 20 Hydrophobe (gråtonede) og hydrofile (mærket ·+) områder af proteinet blev bestemt ud fra hydrpatianalysen (31a) af gD-proteinsekvensen afledt fra gensekvensen. Kun de områder, som menes at være vigtige for membranlokalisering og binding, er vist. De funktionelle domæner er: a) signalsekvensen (33), b) 25 det hydrophobe transmembrandomæne og c) det ladede membrananker. De tre formodede N-forbundne glyco-syleringscentre er vist ved bogstavet (;. Udtrykkelsesplas-midet bestod af det bakterielle repliceringsorigin og ampi-cillinresistensgen fra pBR322, en cDNA-indsætning, der koder 30 for muse-dihydrofolatreduktase-genet under transcrip- tionastyring af den tidlige SV40-promotor (53) og et Hindlll-HinfI-fragment, der koder for de første 300 aminosyrer af gD under transcriptionsstyring af en anden tidlig SV40- DK 171976 B1 33 promotor. Hindlll-centret i dette fragment ligger 74 bp til 5'-siden for start-methioninet i gD-genet. Hindlll-centret i SV40-tidligt-område-vektoren (36) ligger 250 bp til 3'-siden for SV40-promotorens Goldberg-Hogness-kasse. HindfIcentrét 5 (gjort stumpt med Klenow-DNA-polymerase og 4 deoxy- nucleotidtriphosphater) ligeres til Hpal-centret i det 3'-utranslaterede område af hepatitis B virus overfladeantigen-genet (36). Denne metode er også nyttig til fremstilling af et afkortet HSV2-gen.

10 Plasmidet pgDtrunc-dhfr blev konstrueret som følger: det gD-holdige Sacl-fragment på 2,9 kb blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSVl-genomet (se ovenfor) i plasmidet pFM3 (se ovenfor) skåret med Sad. Et Hindlll-BstNI-fragment på 1,5 kb indeholdende hele gD-genet blev subklonet ind i 15 Hindll-BstNI-nedbrudt pFM42 (EP patentansøgning nr. 68693). Dette plasmid blev derpå skåret med HinfI, gjort stumpt med Klenow-DNA-polymerase og fire deoxynedeotid- triphosphater og derpå skåret med Hindlll. Hindlll-stumpt HinfI-fragmentet på 960 bp indeholdende det afkortede gDgen blev isoleret og 20 ligeret til Hindlll-Hpal-nedbrudt pEHBall4. Den resulterende konstruktion (pgDcos-trunc) indeholdt det afkortede gD-gen med hepatitis B overfladeantigen-genet ved dets 3'-ende. Et Hindlll-BamHl-fragment på 2,3 kb indeholdende det afkortede gD-gen blev isoleret fra pgDCos-trunc. 2,8 kb fragmentet 25 indeholndende SV40-origin/tidlig promotor og ampicillinresistensgenet og det bakterielle repliceringsorigin fra pBR322 blev isoleret fra plasmidet pEHBal 14. 2,1 kb fragmentet indeholdende muse-dihydro folatreduktase-cDNA-klonen under transcriptionsstyring af en 30 anden tidlig SV40-promotor blev isoleret fra plasmidet pE348HBVE400D22 (36) . Disse tre fragmenter blev ligeret sammen med T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294. Plasmid-ONA fra de resulterende kolonier blev sigtet med SacII, og den 35 korrekte konstruktion pgDtruncdhfr (fig. 8) blev anvendt til yderligere transfektionsundersøgelser.

i } t i DK 171976 B1 34

Plasmidet pEHBal 14 blev konstrueret ved spaltning af pE342 RI (beskrevet nedenfor), en SV40-hepatitis-chimære, med Xbal, som spalter en gang i kodeområdet for HBV-overfladeantigenet, og sekventiel fjernelse af sekvenser, som omgav dette Xba I-5 center, ved anvendelse af nucleasen Bal 31. Plasmidet blev ligeret i nærværelse af det syntetiske oligonudeotid 5'-AGCTGAATTC, som forbinder HBV-DNA'en med et Hindlll-restriktionscenter.

Resulterende plasmider blev sigtet for et EcoRl-Hindlll-10 fragment på ca. 150 bp. pEHBal 14 blev sekvensbestemt, hvilket bekræftede, at der var blevet placeret et Hindlll-center ved et punkt netop ovenfor, hvor HBsAg-startkodonen normalt findes. Denne konstruktion placerer således et unikt Hindlll-center, der er egnet til kloning, ved en position, 15 hvor et kraftigt udtrykt protein (HBsAg) starter translation. Alle formodede signaler, som er nødvendige for høj udtrykkelse af et protein, bør være tilstede på denne 5'-1edersekvens.

Plasmidet pE342, som udtrykker HBV-overfladeantigen (også 20 betegnet som pHBs348-E) er blevet beskrevet af Levinson et al., EP offentliggørelsesskrift nr. 0073656, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

(Kort fortalt blev originet fra abeviruset SV40 isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hindlll og omdannelse af Hindlll-25 enderne til EcoRl-ender ved tilføjelse af en konverter (AGCTGAATTC) . Denne DNA blev skåret med PvuII og der blev tilføjet RI-linkere. Efter nedbrydning med EcoRl blev 348 bp fragmentet, som spændte over originet, isoleret ved polyacrylamidgel-elektrophorese og elektroeluering og klonet 30 i pBR322. Udtrykkelsesplasmidet pHBs348-E blev konstrueret ved kloning af det fragment på 1986 bp, som stammer fra EcoRl og BglII-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, Ch. 5, Acad. Press, N.Y. (1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAG) ind i plasmidet pML (Lusky et al., Nature, 293: 79 35 (1981)) ved EcoRl- og BamHI-centrene. (pML er et derivat pBR322, som har en deletion, der eliminerer sekvenser, som er 35 DK 171976 B1 inhiberende for plasmidreplicering i abeceller). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå lineariseret med EcoRI, og fragmentet på 348 bp, som repræsenterede SV40-origin-området, blev indført i EcoRI-centret af pRI-Bgl.

5 Originfragmentet kan indsættes i enhver af de to orienteringer. Da dette fragmen koder for både den tidlige og den sene SV40-promotor foruden repliceringsoriginet, vil HVB-gener kunne udtrykkes under styring af enhver af promotorerne afhængigt af denne orientering (pHBs348-E repræsenterer HBs 10 udtrykt under styring af den tidlige promotor). pE342 modificeres ved delvis nedbrydning med EcoRI, udfyldning i det spaltede center under anvendelse af Klenow-DNA-polymerase I og sammenligering af plasmidet igen, hvilket fjerner EcoRI-centret forud for SV40-originet i pE342. Det resulterende 15 plasmid betegnes pE3425RI.

Den resulterende sekvens skaber en stopcodon (TAA) umiddelbart efter aminosyre 300 i gD-genet. Iranscriptionsafslutnings- og polyadenylationscentrene for afkortet-gD-gen-transcripten er indkodet af det 3'-utranslaterede område af 20 hepatitis B overfladeantigen-genet (36).

Den resulterende vektor blev transficeret (40) ind i en dhfr CHO-cellelinie (39), og der blev selekteret en egnet klon gD10.2, som producerede det afkortede gD-protein og secernerede det til det omgivne medium. Proteinet blev eks-25 traheret fra mediet, og cellerne blev prøvet for immunogenisk aktivitet. Fig. 9 viser resultaterne af immunofældninger af intra- og ekstra-cellulære 35S-methionin-mærkede ekstrakter.

Radioimmunofældning af celleforbundne og secernerede former af gD.

30 Celler blev dyrket i Ham's F12-medium (Gibco) suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt okseserum (Cibco), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml). Da kulturerne var omkring 80% konfluente, blev mediet fjer net,cellerne blev vasket to gange med phosphatpufret salt- DK 171976 B1 36 opløsning (PBS), og der tilsattes mærkende medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium indeholdende en tiendedel af den normale koncentration af methionin) til en slutkoncentration på 0,05 ml/cm2 . Der tilsattes 35S-methionin (SJ.204, 5 Amersham Int.) til en slutkoncentration på 50-75 //zCi/ml, og cellerne blev dyrket i yderligere 18-20 timer. Efter mærkningen blev mediet indhøstet, og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernes fra kulturskålen ved behandling med PBS indeholdende 0,02% EDTA. Cellerne blev derpå 10 solubiliseret i lysepuffer bestående af: PBS, 3% NP-40, 0,1% okseserumalbumin, 5 x 10 M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TlU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12 000 x G. Til immunofældningsreaktioner blev cellelysaterne fortyndet tre 15 gange med PBS, og aliquoter (typisk 180/μΐ) blev blandet med 2-5 μΐ antisera og inkuberet ved 4 °C i 30 minutter. For at immunofælde den secernerede form af g6 blev 500 μΐ konditioneret medium inkuberet med 2 μΐ antisera i 30 minutter ved 4 °C. Immunkomplekser blev derpå adsorberet til 20 fikserede S. aureusceller ved Kessler's metode (40a) og blev udfældet ved centrifugering ved 12 000 x G i 30 S.

S. aureuscellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskepuffer (PBS, 1% NP -40, 0,3% natriumdodecylsulfat), og immunkomplekserne blev elueret med 20 μΐ polyacrylamidgel-prøvepuffer 25 (62,5 mM "Tris"-HC1-puffer (pH 6,8) indeholdende 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,01% bromphenolblåt) ved 90 °C i 3 minutter. Efter centrifugering i 30 s blev super-natanterne påført 10% polyacrylamidgelplader ifølge Laemmli's metode (45). A, immunofældning af fuld-længde membranbundet 30 gD fra gD12-cellelinien. B, immunofældning af den celleforbundne form af det afkortede gD fra lysater af to uafhængigt afledte cellelinier (1 og 2). C, immunofældning af den afkortede gO fra kultursupernatanterne af de to cellelinier vist i B. (-) angiver kontrol-kanin-antiserum; 35 ( + ) angiver kanin-anti-HSV1-antiserum (Dako Corp.).

DK 171976 B1 37

Der ses tydeligt en intracellulær form på 35 000 daltons og et secerneret og øjensyneligt glycosyleret ekstracellulært gD-protein.

Fremstilling af afkortet gD anvendt til immunisering 5 gD10.2-celler blev dyrket til konfluens i polystyren-vævskultur- rullef lasker (Corning 25140) i F12-medium suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt kalveserum, 50/μg/τa.l streptomycin og 0,3//ig glutamin. Efter at der var nået konfluens, blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket tre 10 gange i det samme medium uden føtalt kalveserum og suppleret med 2 mg/ml Hepespuffer (serumfrit medium). Cellerne blev derpå dyrket 3-4 dage i serumfrit medium, og det konditionerede medium blev derefter indhøstet og opbevaret ved -20 °C. Mediet blev optøet ved 37 °C og centrifugeret ved 15 5000 omdr/min. i 20 minutter i en Sorvall (GS3 rotor. Efter centrifugering blev pillen smidt væk, og supernatanten blev koncentreret i et ultrafiltreringsapparat (Amicon) udstyret med et YM-5 ultrafiltreringsmembran.

Det resulterende præparat blev koncentreret omkring 150 gange 20 i forhold til udgangsmaterialet og indeholdt tilnærmelsesvis 8 mg protein pr. liter. Præparatet blev derpå dialyseret i udstrakt grad over for phosphatpufret salt- opløsning (PBS) og anvendt til immunisering uden yderligere rensning.

Fordelene ved at anvende det afkortede protein til diagnos-25 tiske anvendelser er, at det, fordi det er secerneret til det ekstracellulære medium, er forurenet med langt færre proteiner, end der ville findes i et hel-celle-præparat.

Det vil bemærkes, at der ifølge opfindelsen anvendes en permanent cellelinie til at producere proteinet. Efter 30 transfektion inkorporeres vektoren i celleliniens genom og kan producere proteinet uden cellelyse. Cellelinien kan således anvendes til kontinuert produktion af proteinet, især i den afkortede form, som secerneres fra cellen. F.eks. kan DK 171976 B1 38 cellerne, der udtrykker afkortet protein, kontinuert anvendes i et perfusionssystem til konstant at fjerne antigenrigt medium fra cellerne og erstatte det med frisk medium.

Den bestemte cellelinie, der anvendtes her, var en CHO-linie, 5 som var deficient med hensyn til dhfr-produktion, transficeret med en vektor indeholdende en dhfr-markør. Ved at udsætte cellelininen for methotrexat (Mtx) under egnede betingelser (54) kan dhfr-produktionen og dermed den forbundne gD-produktion forstærkes. Tre cellelinier, som var 10 afledt ved transfektion af afkortet-gD-genet ind i dhfr' CHO-celler, blev udpladet parallelt, mærket med 35S-methionin og immunofældet som beskrevet i fig. 2. Banerne l og 2 angiver mængden af secerneret gD immunofældet fra 500 μΐ dyrkningsmedium konditioneret af to uafhængigt isolerede 15 cellelinier før selektion med methotrexat. Bane 3 angiver mængden af afkortet gD immunofældet fra en lige så stort volumen dyrkningsmedium fra en cellelinie (gDlO.2.2), der blev udvalgt til vækst i 250 nM methrotrexat. Kanin-anti-HSV1-antistoffer (Dako Corp.) blev anvendt til de immu-20 nofældninger, der er vist i banerne 1-3. Bane 4 repræsenterer en kontrolimmunofældning af 500 μΐ medium konditioneret af gD10.2.2.-cellelinien med normalt kaninserum.

For at kvantificere de relative mængder af afkortet gD secerneret til dyrkningsmediet af cellelinierne før og efter 25 selektion i methotrexat gennemførtes en kompetitiv ELISA- prøvning. gDl2-celler, der udtrykte en membranbundet form af gD, blev udpladet og fikseret med glutaraldehyd til overfladen af 95 hullers mikrotiterplader som tidligere beskrevet. Konditioneret medium for forskellige cellelinier, der 30 var kendt for at producere det afkortede gD, blev rækkefor-tyndet henover mikrotiterpladen og blev inkuberet med en fastsat mængde (2/μ1) kanin-anti-HSV1-antistof (Dako Corp.) i 1 time ved 20 °C. Ubundet antistof og opløselige afkortet-gO-antistof-komplekser blev fjernet ved vaskning af hvert hul 35 tre gange med PBS. Pebberrodperoxidase koblet til gede- antikanin-IgC blev derpå omsat med de fikserede celler i l DK 171976 B1 39 time ved 20 °C, og ubundet antistof blev fjernet ved vaskning 3 gange med PBS. Det kolorimetriske substrat, o-phenylendiamin, sattes derpå til hvert hul og fik lov at reagere med de bundne pebberrodperoxidase-antistofkomplekser 5 i 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af svovlsyre til en slutkoncentration på 0,25 N. Absorbansen af o-phenylendiaminet i hvert hul blev bestemt ved anvendelse af en automatiseret mikrotiterplade-scanner (Titertek multiskan), og der blev afsat fortyndingskurver. Bindingen af 10 anti-HSVl-antistoffer til udgangs-CHO-cellelinien blev anvendt til at måle graden af ikke-specifik binding ved hver fortynding. Mængden af afkortet gfi i hver kultursupernatant var omvendt proportionel med mængden af absorbans i hvert hul. Aben cirkel, binding af anti-HSVlantistoffer til gD12-15 celler i nærværelse af medium konditioneret af celler, der secernerede afkortet g5, før forstærkning med methotresat. Lukket cirkel, binding af antiHSVl-antistoffer til g012-celler i nærværelse af medium fra gD10.2.2-celler selekteret for vækst i 250 nM methotrexat. Åbent kvadrat, binding af 20 anti-HSVl-antistoffer til gDl2-celler i nærværelse af 100 gange koncentreret medium fra uforstærkede celler, der secernerede afkortet gD. Denne procedure blev udført på gD10.2-cellelinien for at frembringe en forstærket cellelinie gD10.2.2, som var i stand til at vokse i 250 nM methotrexat, 25 og som secernerede omkring 20 gange mere afkortet gO til dyrkningsmediet end udgangs-gD10.2-cellelinien (se fig. 10 og 11) .

dhfr-markør/forstærknings-systemet kan anvendes med andre celler, som er i stand til at optage og stabilt inkorporere 30 fremmed DNA.

Opfindelsens held med at påvise, at en afkortet form af et membranbundet protein, som mangler den del af det hydro-phobt/hydrophile carboxylterminale område, der er ansvarligt for at binde det til membranen, alligevel kan være immunogen, 35 viser at lignende resultater kan forventes med andre immunogene membranbundne proteiner, hvilket således DK 171976 B1 40 tilvejebringer en forbedret kilde til vaccine over for virus, parasitter og andre patogene organismer.

I det forudgående eksempel var DNA'en for gD-proteinet afkortet ved rest 300, fordi der var et hensigtsmæssigt re-5 striktionscenter der. Dette havde det resultat, at det carboxyl terminale hydrophobt/hydrofile område blev fuldstændigt fjernet, som det kan ses af hydropatikurven i fig. 2; i virkeligheden blev et yderligere forudgående område fjernet fra rest 301 til rest 332, uden at det øjensyneligt ødelagde 10 proteinets immunogene karakter. Det synes at følge heraf, at graden af afkortning med dette protein og sandsynligvis med andre immunogene membranbundne proteiner kunne være betydeligt mindre, om ønsket, så længe det har den virkning at fjerne den membranbindende karakter, således at proteinet 15 secerneres til det omgivende medium.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel angår et HSV2-gC-protein (tidligere betegnet sdm et gF-protein).

Celler, virus og DNA-isolering 20 HSV2 (stamme G) blev dyrket på HEp2 celler efter infektion af cellekulturen ved en input-multiplicitet på 0‘, 1 i 3 dage ved 33 °C i Dulbecco's modificerede Eagles medium indeholdende 10% føtalt okseserum og antibiotika. HSV2-DNA blev isoleret ved nedbrydning med proteinase K efterfulgt af CsCl-25 ultracentrifugering som beskrevet (23).

DNA-manipulationer

Restriktionsenzymer, DNA-polymerase-Klenow-fragment, T4- ONA-ligase og T4-polynucleotidkinase blev købt fra Bethesda Research Labs. og blev anvendt ifølge leverandørens ret-30 ningslinier.

DK 171976 B1 41

Molekylær kloning af HSV2-DNA-restriktionsfragmenter

EcoRI-"P"-fragmentet, som svarer til den omtrentlige kortposition 0,650 i HSV2-genomet, blev isoleret fra EcoRI-ned-brudt HSV2-DNA på 5% acrylamidgeler. Det isoelrede fragment 5 blev klonet ind i Ecorl-nedbrudt pUC9 (28). Dette plasmid blev kaldt pUC-RIP.

pUC-RIP-subklonen blev derpå anvendt til at lokalisere et SacI-fragment af HSV2-genomet, som indeholdt EcoRI-"Pn-fragmentet. Southern-afdupningsforsøg (27) afslørede, at et 10 4,9 kb SacI-fragment af HSV2 indeholdt EcoRI-nP"-fragment.

Dette fragment blev isoleret på 0,7% agarosegeler og blev klonet ind i et fra pBR322 afledt plasmid, som indeholdt et unikt Sacl-center (55). Dette plasmid blev kaldt pBRSacI-"E". Yderligere restriktionsenzymanalyse af pBRSacInE" påviste et 15 2,9 kb Sal I-fragment med sekvenser homologe med EcoRI-"P"- fragmentet, som blev subklonet ind i Sallnedbrudt pUC9 som beskrevet ovenfor. Dette plasmid blev kaldt pgC2Sal2.9.

DNA-sekvensanalyse af klonet HSV2-DNA

Hovedparten af DNA-sekvenserne blev bestemt under anvendelse 20 af dideoxynucleotid-kædeafslutnings-teknikken. Forskellige fragmenter blev subklonet ind i den replikative form af ml3-fag-vektorerne mp7, mp8 og mp9, og DNA-sekvensen blev bestemt som beskrevet tidligere (29). I nogle tilfælde blev fragmenter 32P-mærket ved deres 5'-ender med y32 ATP og T4-25 polynucleotidkinase, og fragmentets DNA-sekvens blev bestemt ved anvendelse af den kemiske degradationsmetode (56). Datamatassisteret analyse af DNA- og proteinsekvens-data blev gennemført under anvendelse af HOM-programmet (57).

Hydropatien af de afledte aminosyresekvenser blev analyseret 30 under anvendelse af en bredde på 12 aminosyrer og et spring på l (3la).

Southern-afdupningsanalyse af HSV2-DNA

DK 171976 B1 42

Restriktionsendonuclease-nedbrudt HSV2-DNA og plasmid-ONA blev fraktioneret på 1,5% agarosegeler og afduppet på nitrocellulose under anvendelse af standardprocedurer. De enkelt-strengede ender af SacII-fragmentet, markeret med en stjerne 5 i fig. 12, blev udfyldt med Klenoui-fragmentet af DNA- polymerase I, og det resulterende dump-endede fragment blev ligeret til Smal-nedbrudt replikativ form af ml3mp7 (29) med T4-DNA-ligase. Den enkeltstrengede DNA fremstillet fra denne ligering og transfektion blev anvendt som skabelon til 10 syntesen af 32P-mærket enkeltstrenget sonde-DNA med høj specifik aktivitet (l x 109 tællinger/min./μ$) under anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I. Hybridise-ringer blev gennemført under anvendelse af standardprocedurer (27, 58).

15 Resultater

Molekylær kloning af gF-kodningsområdet af HSV2-genomet

Den strategi, der blev antaget til isolering af gF-genet af HSV2, var baseret på den antagelse, at dette gen var kolineært med HSVl-gC-genet. Denne antagelse blev under-20 støttet af den nylige erkendelse af, at et 75000 dalton glycoprotein, gF, med antigenisk beslægtethed med HSV1-glycoprotein C findes i HSV2, og at genet for dette protein er tilnærmelsesvis kolineært med HSVl-gC-genert (22d, 59) . Desuden tydede isoleringen af et monoklonalt antistof, som 25 bindes til både HSVl-gC og HSV2-gF yderligere på, at disse to proteiner kunne være homologe med hinanden (22f). Det blev således sluttet, at DNA-sekvensanalyse af det område i HSV2-genomet, som er kolineært med HSV-lgC-genet, ville resultere i afledelsen af proteinsekvensinformation, som ville 30 lokalisere HSV2-gF-genet.

600 bp EcoRI-"P"- fragmentet af HSV2-genomet er blevet vist at ligge på kortet ved position ca. 0,650 (12). Dette område er tilnærmelsesvis kolineært med det kendte kodeområde af HSV1-gC-genet, som ligger på kortet mellem ca. 0,630 og ca. 0,640 DK 171976 B1 43 i HSVl-genomet (59). Dette fragment blev isoleret fra en EcoRI-nedbrydning af HSV2-DNA og blev klonet i plasmid pUC9 (28), og dets ΟΝΆ-sekvens blev bestemt (29, 56).

Sammenligning af den resulterende sekvens med HSVlgC-5 sekvensen (59) afslørede en betydelig grad af sekvenshomologi mellem EcoRI-"P"-fragmentet og 3'-enden af HSVlgC-kodeområdet. Således blev EcoRI-"P"-fragmentet derefter anvendt som sonde til at isolere et SacI-fragment fra HSV2-genomisk DNA, der overlappede EcoRI-"P"-fragmentet tilstræk-10 keligt til at inkludere resten af HSV2-genet, som var homologt med HSVl-gC-genet. Fig. 12 belyser de trin, der blev foretaget for at isolere et 2,9 kb Sall-fragment fra HSV2-genomet, der indeholdt EcoRI-"P"-fragmentet, og som blev anvendt til efterfølgende DNA-sekvensanalyse.

15 DNA-sekvensanalyse af EcoRI-"Pn-området af HSV2-genomet

SacI-"E"-fragmentet på 4,3 kb, som blev isoleret fra HSV2-genomet baseret på dets sekvenshomolog i med EcoR I-" P " -fragmentet, blev yderligere nedbrudt til opnåelse af et 2,9 kb Sall-fragment, som blev betegnet pgC2Sal2.9. Fig. 12 bely-20 ser fragmenterne fra pgC2Sal2.9, som blev underkastet DNA-sekvensanalyse under anvendelse af enten dideoxynucleotid-sekvensbestemmelses-proceduren (29) eller den kemiske nedbrydningsprocedure (56). Desuden viser denne fig. positionen af EcoRI-"Pw-fragmentet i pgC2Sal2.9 såvel som positionen af 25 et Bglll-center, som svarer til den højre ende af BglII-"N"-fragmentet ved position ca. 0,628 i HSV2-genomet (12).

Specifikt viser fig. 12 kloningne af pgC2Sal2.9, det HSV2-område, som ligger kolineært med HSVl-gC på kortet. Området af HSV2-genomet, som ligger på kortet fra ca. 0,61 til ca.

30 0,66, blev klonet som et SacI-fragment (pBRSac-"E") under anvendelse af 600 bp EcoRI-"P"- fragmentet som sonde. En Sall-subklon af pBRSac-"E", pgC2sal2.9, blev anvendt til DNA-sekvensanalyse. Pile henfører til de sekvensbestemte områder, og lokaliseringen af en større åben aflæsningsramme på 479 35 aminosyrer afledt fra sekvensen er belyst. Forskellige DK 171976 B1 44 restriktionscentre er belyst, herunder EcoRI-centrene, som afgrænser EcoRI-"P"-fragmentet, og Bglll-centret, som findes ved den højre ende af Bglll-"NB-fragmentet (kortposition ca. 0,628) (26). Sacll-fragmentet markeret med en stjerne (*) 5 blev anvendt ved Southern-afdupningsforsøg til at undersøge den deletion, som viser sig i dette område (se resultater). Andre centre blev anvendt til DNA-sekvensbestemmelsesforsøg.

Sm: Sma I, Sa: Sac II, Rs: Rsa I, Bg: Bgl II, Pv: Pvu II, RI: EcoR I.

10 Fig. 13 belyser DNA-sekvensen opnået fra pgC2Sal2.9 sammenlignet med DNA-sekvensen af HSVl-gC-området (59). HSVl-gC-området (HSV-1) og sekvensen opnået fra pgC2Sal2.9 (HSV-2) blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet (57). Eftersom forskellige deletioner blev udnyttet til at maksi-15 mere sekvensoverlapning, er alle positioner, herunder mellemrum, blevet nummereret for tydelighedsskyld. Stjerner er anbragt over ikke-overensstemmende nudeotider. Den understregede "Α''-rest ved position 43 af HSV1-sekvensen er det omtrentlige transcriptionsstartcenter for gC-mRNA (59).

20 "TATA" 1 og "TATA" 2 er de sandsynlige transcriptionssty-ringsområder for henholdsvis HSVl-gC-mRNA'en og 730 base mRNA'en (59, 60). Den indsatte T-rest ved position 1728 i HSV1-sekvensen blev opdaget ved gentagen sekvensbestemmelse af dette område (M. Jackson, upubliseret) og. fandtes at 25 indføre en i-fase stopkodon ved positionerne 1735-1737, som var homolog med stopkodonen for den større åbne HSV2-aflæsningsramme. Positionen af 730 base mRNA-startkodonen i HSV1 er vist ved position 2032-2034 ligesom positionen af en anden HSV2-startkodon ved position 1975-1977.

30 I fig. 13 blev den belyste afledte sekvens af HSV2 sammenlignet med ONA-sekvensen af gC-gen-området i HSVl (59), hvilket viste en samlet sekvenshomologi mellem disse to fragmenter på omkring 68%. Imidlertid viste visse områder af sekvensen enten en meget højere eller lavere grad af 35 sekvenshomologi end andre. F.eks. viste sekvenserne mellem positionerne 0 og 570 i HSVl- og HSV2- sekvenserne kun 51% DK 171976 B1 45 homologi, medens området mellem position 570 og position 1740 viste en meget højere grad af sekvenshomologi (80%). et yderligere højhomologt område (70%) fandtes også ved enden at de to sekvenser fra position 1975 til position 2419. Foruden 5 nucleotidsekvens-ændringerne viste de to genomer forskellige deletioner eller indsætninger, når de blev sammenlignet med hinanden. Den mest bemærkelsesværdige var et 81 bp område fundet ved position 346-426 i HSVl-gC-sekvensen, som mangler fra HSV2-genomet. Af denne samlede sekvenssammenligning 10 fremgår det, at der var en høj grad af sekvenshomologi mellem HSVl-gC-området og det her sekvensbestemte HSV2-område.

Frink et al. (59) har fundet at 5'-enden af den 2520 base mRNA, der koder for HSVl-gC, rækker til den understregede A-rest ved position 43 i fig. 13. Desuden udpegede de en AT-rig 15 "TATA"-kasse-sekvens (60) omkring 22 bp 5' for denne rest. Sammenligning af de to i fig. 13 viste sekvenser viser, at HSVl- og HSV2-sekvenserne begge indeholdt den identiske sekvens, CGGCTATAAA, i dette område. Denne sekvens er identisk med den, der er rapporteret tidligere af Whitton et 20 al. (61), som findes at forekomme ved "TATA"-kasseområderne i mange af de hidtil bestemte HSVl- og HSV2-sekvenser. Denne bevarede sekvens efterfølges også af et G-rigt område i begge virusgenomer. Foruden dette formodede transcriptions-styringsområde fandtes en anden "TATA"-kasse i begge 25 sekvenser ved position 1845-1849 i fig. 13. Den anden "TATA"-kasse er blevet forudsagt at styre transcriptionen af en 730 base mRNA i HSVl-genomet (59). Både HSVlog HV52 indeholder denne sekvens omgivet af GC-rige flankerende sekvenser, herunder en CGGGCG-sekvens, som minder om den CGGG-sekvens, 30 der går forud for den første "TATA"-kasse. Desuden koder begge genomer for åbne aflæsningsrammer 3' for disse andre "TATA"-kasser, som vil blive omtalt nedenfor.

For at bestemme om den ovenfor beskrevne 81 bp deletion faktisk fandtes i HSV2-genomet, eller om den var et kunst-35 produkt af kloning eller sekvensbestemmelse, gennemførtes Southern-afdupningsanalyse af den HSV2-genomiske DNA og den DK 171976 B1 46 klonede HSV2-DNA. En 32P-mærket sonde blev fremstillet ud fra et SacII-fragment (se fragmentet i fig. 12), som spænder over området, der mangler de 81 nudeotider. Hvis den HSV2-genomiske DNA mangler 81 bp området, så vil et Smal-bGlII-5 fragment, som spænder over dette område, være på 576 bp, et Smal-fragment vil være på 662 bp, og et Sadl-fragment vil være på 195 bp.

Fig. 14 belyser Southern-afdupningsanalyse af HSV2-genomisk DNA og pgC2Sal2.9-DNA. Området, der spænder over 81 bp 10 området, som mangler i den i fig. 13 viste HSV2-sekvens (HSV2-positionerne 346-426), blev analyseret under anvendelse af Sadl-fragmentet markeret med en stjerne i fig. 12, som overlapper det deleterede område. Banerne 1-3 er restriktionsnedbrydninger af HSV2-genomisk DNA, og banerne 4-15 6 er restriktionsenzymnedbrydninger af pgC2Sal2.9. De nedbrudte DNA'er blev underkastet elektrophorese på 1,5% agarosegeler, denatureret, afduppet på nitrocellulose og sonderet med det 32P-mærkede SacII-fragment. (Pilene viser pisitionen af 564 bp Hindlll-fragmentet fra fag-DNA).; 20 Banerne 1,6: Smal + Bgl II; banerne 2,5: Sma I; banerne 3,4: Sac II.

De i fig. 14 viste resultater påviser, at de forudsagte restriktionscentre omgav området, der mangler de 81 bp, i både den HSV2-genomiske DNA og den klonede HSV2-DNA. Desuden 25 vandrede de HSV2-genomiske fragmenter og de klonede fragmenter nøjagtigt sammen, hvilket viser, at deletionen ikke er et kunstprodukt af kloning eller sevkensbestemmelse.

Analyse af den større åbne aflæsningsramme i 2,9 kb Sall-fragmentet af HSV2 30 Analyse af de potentielle kodesekvenser i 2,9 kb SallDNA-fragmentet af HSV2 afslørede en åben aflæsningsramme på 479 aminosyrer, som begyndte med methioninet indkodet ved position 199-201 af den i fig. 13 viste HSV2-sekvens og endte ved TAA-afslutningskodonen ved position 1735-1737 i HSV2- DK 171976 B1 47 sekvensen i denne fig. Som det kan ses af fig. 13 starter både HSVl-gC-proteinet og den åbne HSV2-aflæsningsramme ved omkring den samme position i de to sekvenser i forhold til "TATA"-kasse-homologierne. Selv om det oprindeligt syntes som 5 om den åbne HSV2-aflæsningsramme, der findes i dette område, sluttede 12 kodoner før HSVlgC-genet, har gentagen sekvensbestemmelse af det carboxylterminale område af gC-gensekvensen (M. Jackson, upubliceret) i HSV1 stamme F afsløret, at den af Frink et al. (59) rapporterede sekvens 10 manglede et thymidinnucleotid efter position 1727, og at indsætning af denne rest resulterede i et translateret HV1-gC-protein, der slutter samme sted som den åbne HSV2-aflæsningsramme (1735-1737 i fig. 13) . Når man tager de forskellige deletioner og indsætninger i betragtning, som 15 belyst i fig. 13, viser HSVl-gC-genet og den åbne HSV2-aflæsningsramme således en meget høj grad af overlapning.

Fig. 15 belyser translationen af den store åbne HSV2-aflæs-ningsramme og sammenligning med HSVlgC-aminosyresekvensen. Enkelt-bogstavs aminosyresymbolerne blev anvendt. HSV-1 gC 20 henfører til HSVl-gC-sekvensen, og HSV-2 gF henfører til den åbne HSV2-aflæsningsramme-sekvens. Proteinerne blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet, som maksimerede homologier ved indsætning af åbninger, hvor det var nødvendigt (57). Stjerner er placeret over ikke-over-25 ensstemmende aminosyrer. Formodede N-forbundne glycosyle-ringscentre (NXS eller NXT) (62) er gråtonet, og cystein-rester (C) er indrammet. Kun aminosyrer og ikke mellemrum er nummereret. Fig. 1BB belyser translationen af den anden åbne HSV2-aflæsningsramme og sammenligning med 730 base mRNA-30 proteinet fra HSV1. HSV-2 730 bp ORF er den ufuldstændige aminosyresekvens af den anden åbne HSV2-aflæsningsramme fra positionerne 1975-2406 i den i fig. 13 viste HSV2-sekvens.

HSV-1 730 bp ORF er den afledte aminosyresekvens for det protein, der er indkodet af 730 base mRNA'en fra HSV1 (59).

35 Bevarende aminosyreændringer med hensyn til ladning er markeret (C) og ikke-bevarende ændringer med hensyn til ladning er markeret (N) i både fig. 15A og 15B.

DK 171976 B1 48

Fig. 15 belyser den høje grad af sekvenshomologi mellem HSVl-gC-genet og den åbne HSV2-aflæsningsramme på 479 aminosyrer.

De første 19 aminosyrer indeholder omkring 80% sekvenshomologi, hvor ændringerne i de første 25 aminosyrer 5 alle er bevarende med hensyn til ladning. Fra rest 124 i HSVl-gC (rest 90 i HSV2-sekvensen) til enden af begge proteiner er der omkring 74% sekvenshomologi, hvor 75% af aminosyreændringerne er bevarende med hensyn til ladning. 5 formodede N-forbundne glycosyleringscentre (NXS eller NXT 10 (62)) er bevaret mellem de to proteiner, og alle 7 cysteinrester er lokaliseret i homologe positioner i forhold til C-enden. Foruden den samlede bevarelse af sekvenser i de carboxylterminale trefjerdedele af proteinerne er der også store områder af sammenhængende aminosyresekvenshomologi i 15 længder på op til 20 rester (dvs. positionerne 385-405 i HSVl-sekvensen og positionerne 352-372 i HSV2-sekvensen). Det kan konkluderes af denne sevenssammenligning, at den åbne aflæsningsramme i dette område af HSV2-genomet koder for et protein, som er homologt med HSVl-gC.

20 Selv om HSV2-proteinet, der er indkodet i dette område, viser en betydelig grad af sekvenshomologi med HSVl-gC-sekvensen, er der flere bemærkelsesværdige forskelle mellem de to sekvenser. Den mest slående forskel er en deletion af 27 aminosyrer i HSV2-sekvensen, som findes i HSVl- gC-sekvensen 25 fra rest 50 til rest 75 (fig. 15), og som svarer til den ovenfor beskrevne deletion på 81 bp. Foruden denne store deletion viser begge sekvenser mindre deletioner af en eller to aminosyrer. Alle disse deletioner findes i de aminoterminale områder af proteinerne. Foruden disse 30 deletioner er der et stort antal aminosyreændringer i proteinernes aminoterminale område, hvilke ændringer er klumpet sammen mellem resterne 29 og 123 i HSVl-gC-sekvensen (resterne 31 og 90 i HSV2-sekvensen). Kun 30% af aminosyrerne i dette område er homologe, hvor meget af denne homologi 35 skyldes bevarede prolinrester. 43% af aminosyreudskift-ningerne i dette område er ikke-bevarende med hensyn til ladning. De eneste andre områder, som viser et så stort antal DK 171976 B1 49 ændringer, er et carboxylterminalt hydrophobt område (resterne 476-496 i HSV1-sekvensen og 443-463 i HSV2-sek-vensen), hvor proteinerne er 55% homologe, men hvor alle ændringerne er bevarende, uladede hydrophobe aminosyrer, og 5 carboxylenderne af proteinerne, hvor sekvenserne kun er 25% homologe, men hvor den samlede aminosyresammensætning er ens (resterne 500-512 i HSV1-sekvensen og 467-479 i HSV2-sekvensen). Medens 5 af de formodede N-forbundne glycosy-leringscentre er bevaret mellem de to proteiner, indeholder 10 HSVl-gC-sekvensen to centre flere end HSV2- sekvensen (ialt 9 mod 7). HSVl-gC-sekvensen indeholder 2 N-forbundne glycosyleringscentre i de 27 aminosyrer, som er deleteret fra HSV2-sekvensen, og et overlappende par centre mellem resterne 109 og 112 i fig. 15. HSV2-sekvensen indeholder to N-15 forbundne glycosyleringscentre, som ikke findes i HSV1-sekvensen, hvoraf det ene er proximalt til amino-enden.

For mere fuldstændigt at undersøge de mulige strukturelle homologier mellem HSV1- og HSV2- sekvenserne gennemførtes hydropatianalyse (3la). Fig. 16 belyser hydropatianalyse af 20 HSVl-gC-proteinet og proteinet fra den større åbne HSV2-aflæsningsramme. Hydropatien af hvert protein blev bestemt under anvendelse af programmet angivet af Hopp and Woods (31a). Hydrophobe områder er over midterlinien og hydrofile områder er under midterlinien. Strækninger på 12 aminosyrer 25 blev analyseret, og gennemsnitshydropatien blev udregnet. Formodede asparagin-forbundne glycosyleringscentre (62) er mærket (0). gC-1: HSVl-gC-protein-hydropati. gC-2 (gF): Hydropati af protein indkodet i den større åbne HSV2-aflæsningsramme.

30 Fig. 16 viser, at begge proteiner udviste en yderst høj grad af strukturel homogi baseret på aminosyresekvensernes hydrofile og hydrophobe egenskaber. Hvert udviser et N-terminalt hydrohobt domæne efterfulgt af en strækning af hydrofile aminosyrer, som indeholder enten 6 af ialt 9 (HSV1) 35 eller 3 af ialt 7 (HSV2) formodede N-forbundne glycosyleringscentre. Toppene og dalene, som følger dette hydrofile DK 171976 B1 50 område er meget ens i begge proteiner, herunder det hydrofile domæne indeholdende det afsluttende N-forbundne gly-cosyleringscenter. Carboxylenderne i begge proteiner viser et meget hydrophobt område på 20 rester efterfulgt af en 5 hydrofil carboxylende. Det sammenhængende område på 27 aminosyrer, som udelukkende findes i HSVl-gC-proteinet, viser sig at kode for et relativt hydrofilt område mellem resterne 50 og 76 (fig. 16)- Som konklusion afslører denne analyse, at hydropatitrækkenes hos HSVl-gC- HSV-2-proteinet er meget ens, 10 og at de mindst bevarede aminotermiale områder af proteinerne findes i hydrofile områder, som har evne til at blive stærkt glycosyleret.

Analyse af den anden åbne HSV2-aflæsningsramme

Translation af de sidste 431 bp af den i fig. 2 viste HSV2-15 sekvens (resterne 1975-2406) afslørede en anden åben aflæsning s ramme på 105 aminosyrer. Selv om den her rapporterede sekvensinformation er utilstrækkelig til at indeholde hele den anden åbne HSV2-aflæsningsramme, afslørede en sammenligning af denne sekvens med den åbne aflæsningsramme ind-20 kodet af 730 base mRNA'en i HSV1, som er rapporteret af Frink et al. (10), også en høj grad af sekvenshomologi. Som det kan ses i fig. 15B viste de to sekvenser 75% sekvenshomologi i de overlappende områder, hvor omkring 90 af aminosyreændringerne var bevarende med hensyn til ladning. Hovedforskellen mellem 25 de to sekvenser var et N-terminalt område på 19 aminosyrer, som fandtes i HSV2-sekvensen, men ikke i HSVI-sekvensen. Selv om funktionen af det i dette område indkodede protein er ukendt, viser proteinerne fra HSV1 og HSV2 således en betydelig grad af sekvenshomologi.

30 Diskussion

De ovennævnte resultater viser, at HSV2-genomet koder for en kolinieært kortlagt homolog til HSV1-glycoprotein C. Kolineariteten af de her fundne sekvenser bestyrkes af fundet af en sekvens 3' for den større åbne HSV2-aflæsningsramme, DK 171976 B1 51 som øjensyneligt koder for en homolog til 730 base mRNA'en fra HSV1 (10). Tidligere kortlægning af HSV2-gP- genet (33) sammen med her beskrevne egenskaber for den større åbne aflæsningsramme i dette område af HSV2-genomet, herunder 5 flere potentielle N-forbundne glycosyleringscentre og en tilsyneladende aminoterminal signalsekvens (5) såvel som et formodet carboxylterminalt transmembrandomæne (28), tillader den konklusion, at det her beskrevne HSV2-protein er glycoproteinet gF. Desuden er størrelsen af det translaterede 10 HSV2-protein (ca. 52000 dalton) mage til den, der er rapporteret for det med endoglycosidase H behandlede native HSV2-gF (54000 dalton) (22d). Endelig viser det store omfang af aminosyresekvenshomologi såvel som bevarelsen af flere potentielle N-forbundne glycosyleringscentre og alle 7 15 cysteinrester strukturelt homologi mellem HSVl-gC og HSV2-gF. Disse resultater tyder da stærkt på, at HSVl-gC og HSV2-gF er homologe med hinanden.

Disse resultater hjælper til at forklare tidligere resultater, som påviste, at HSV2-gF og HSVl-gC var i hovedsagen 20 type-specifikke, men at de dog havde type-fælles determinanter (17, 22d, 22f, 43). Da flere tidligere undersøgelser (17, 18, 43) viste, at disse proteiner inducerede overvejende type-specifikke antistoffer, er det rimeligt, at de fleste antigeniske områder i proteinerne findes i de mere divergente 25 N-terminale sekvenser, som følger på de formodede hydrophobe signalsekvenser. De divergente områders hydrofile natur sammen med deres høje indhold af potentielle N-forbundne glycosyleringscentre (62) tyder på, at disse områder vil være lokaliseret på proteinets overflade. Blotlæggelse af disse 30 divergente sekvenser på proteinernes yderside kan være

ansvarlige for anbringelsen af type-specifikke antistoffer rettet mod disse divergente epitoper. Imidlertid kunne der sandsynligvis også frembringes typefælles antistoffer af de mere stærke bevarede carboxylterminale tre fjerdedele af 35 proteinerne, da hydrofile områder bevaret mellem gC og gF

kunne blive udsat på proteinernes yderside og, i et tilfælde, kan være glycosyleret (resterne 363-366 i HSVl-gC og 330-332 DK 171976 B1 52 i HSV2-gF). Således har HSVl-gC og HSV2-gF både type-specifikke og type-fælles determinanter, men det synes som om de type-specifikke determinanter er mere antigeniske.

Selv om forklaringen på type-specifikke og type-fælles 5 determinanter i gC og gF ikke er kendt, er det muligt, at proteinerne har mindst to funktioner, hvoraf en er vigtig for begge virus' levedygtighed, det type-fælles domæne, og en er specifik for hver virustype, det type-specifikke domæne. Selv om funktionerne af gC og gF for tiden er ukendte og selv om 10 levedygtige gC-mutanter af HSV1 er blevet isoleret in vitro (65), er det ikke klart, at hverken gC eller gF er uundværlige for virusserne under in vivo infektion af den humane vært og etableringen af latens. Det er muligt, at mindst nogle af de biologiske forskelle mellem HSV1 og HSV2, 15 herunder forkærlighed for infektionssted og virulens, kan skyldes de udprægede strukturelle forskelle mellem de aminoterminale områder af gC og gF. Det kan konkluderes, selv i mangel af funktionelt kendskab til disse proteiner, at der må virke forskellige selektive tryk på de divergente og 20 bevarede domæner i gC og gF.

Tidligere sekvenssammenligning er gD-generne i HSV1 og HSV2 (58) viste, at den aminoterminale signalsekvens (63) og det carboxylterminale transmembrandomæne (64) var i stand til at tolerere et stort antal mutationer, så længe de substitueret 25 aminosyrer var hydrophobe.

Sekvenssammenligningen mellem gC og gF viser en lignende situation i det carboxylterminale formodede transmembrandomæne (64) fra resterne 476-496 i gC og 443-463 i gF. Det store antal heterologe hydrofobe udskiftninger i 30 dette område tyder på, at lige som i gD enhver aminosyre, som er lipidopløselig, kan tolereres i dette område. I modsætning til gD er imidlertid de aminoterminale signalsekvenser i gC og gF højhomologe i de første 19 rester. Således har dette område enten en anden vigtig bevaret funktion end dirigering 35 af glycoproteinerne end i det rå endoplasmatiske reticulum DK 171976 B1 53 (5), eller der kan være et overlappende gen eller en anden funktionel sekvens i dette område af genomet, som må bevares (66) .

Selv om der her er anført utilstrækkelig HSV2- sekvens til en 5 fuldstændig sammenligning, viser området 5' for starten af HSVl-gC-mRNA-transkriptionen en identisk CGGGTATAA-sekvens i både HSV1- og HSV2- genomet. Desuden efterfølges begge sekvenser af et G-rigt område umiddelbart forud for starten af transkriptionen. Således findes der, som det tidligere 10 blev fundet for gD-generne i HSV1 og HSV2, opstrøms-sekvenshomologier mellem de to virustyper, som antyder muligheden af, at disse områder er involveret i transkriptionsregulering af disse gener. Interessant nok viser den anden "TATA "-kasse- homologi, som findes i begge 15 viruagenomer, og som sandsynligvis kontrollerer transkriptionen af 730 base mRNA'en (59,60), også en relativt høj grad af sekvenshomologi i HSV1 og HSV2. Disse "TATA"-kasser har foran sig CG-rige sekvenser, som minder om, men ikke er identiske med dem, der går forud for de første 20 "TATA"-områder, der er vist i fig. 13, og de efterfølges begge af et 14 bp område, der viser ca. 80 % sekvenshomologi. Hele området af homologi, som omgiver dette område, er kun på 33 bp med en samlet sekvenshomologi pa ca. 75%. Hvis dette område er involveret i transkriptionsregulering af 730 bp 25 mRNA'en, så synes det som om en relativt kort sekvens kan være tilstrækkelig til genkendelse af transkriptions-regulerende elementer.

Som konklusion viser resultaterne, at glycoproteinerne HSV1-gC og HSV2-gF er højhomologe, og at de koder for type-fælles 30 og type-specifikke domæner. Da de to proteiner viser væsentlig sekvenshomologi, og da de øjensynligt findes colineært på kortet, støtter vi forslaget fra Zezulak og Spear (22d) om at omdøbe HSV2-gF til HSV2-gC eller gC-2.

Desuden åbner de her rapporterede sekvensbestemmelsesdata 35 vejen for en funktionel analyse af gC-1 og gC-2 ved gensidig ombytning af forskellige type-specifikke områder mellem de to DK 171976 B1 54 proteiner in vitro og udtrykkelse af de chimæriske sekvenser i pattedyrceller (67) eller ved reinkorporering af disse områder i viruset (68).

De klonede gC-2-glycoproteiner kan udtrykkes på en måde, som 5 er analog med den udtrykkelse af gd, der er angivet i eksempel l. Et fragment af gC-2, som inkluderer en sekvens, der er type-specifik for gC-1, men som udelukker den sekvens, der er type-fælles for gC-1 og gC-2, er meget nyttig som et diagnostisk middel, der skelner HSVl fra HSV2.

10 Referencerne, som er samlet i den følgende bibliografi, er citeret ved bogstav eller tal i parentes i den forudgående tekst, og de betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

Bibliografi 15 A. Jordan et al., A.J.C.P. 467 (October 1981).

B. Kimmel et al., J. Virol. 213 (1982).

1. Emtage et al., Nature 283. 171 (1980); Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 28, 5376 (1981); Weiland et al., Nature 292. 851 (1981).

20 2. Kupper et al.,Nature 289. 555 (1981); Kleid et al.,

Science 214, 1125 (1981).

3. Charnay et al., Nucleic Acids Research 7, 335 (1979); Valenzuela et al., Nature 298. 347 (1982).

4. Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 23, 6670 25 (1981).

5. Yelverton et al., Science 219. 614 (1983) .

6. Watson et al., Science 218. 381 (1982).

7. Gething et al., Nature 293. 620 (1981); Liu et al., DNA 1, 213 (1982); Goodenow et al., Science 215. 677 30 (1982); Goodenow et al., Nature 300, 231 (1982);

Crowley et al., Molec. and Cell. Biol. 2, 44 (1983).

8. Rose et al., Cell 22, 753 (1982).

9. Spear, P.G., (1980), Herpesviruses, -709-750, i H.A.

Blough and J.M. Tiffaney (ed)., Cell Membranes and DK 171976 B1 55

Viral Envelopes, Vol. 2., Academic Press, Inc., New York.

10. Balachandran et al., J. Virol. ££, 344 (1982).

11. Norrild, Curr. Top. Microbiol Immunol. 2£), 67 (1980) .

5 12. Roizman, Cell 1£, 481 (1979).

13. Baucke et al., J. Virol. $2., 779 (1979).

14. Cohen et al., J. Virol. 21> 172.

13. Eberle et al., J. Virol. 26, 665 (1980).

16. Norrild et al., J. Virol. 26, 712 (1978).

10 17. Powell et al., Nature 249. 360 (1974).

18. Eberle et al., Infect. Immun. 21, 1062 (1981).

19. Pereira et al., Jnfect. Immun. 2Sl, 724.

20. Sim, C., et al., J. Gen. Virol. 12, 21W(1973).

21. Showalter et al., Infect. Immun. 24, 684 (1981).

15 22. Eisenberg et al., J. Virol. 41» 1099.

22a. Para et al., J. Virol. £1, 137 (1982).

22b. Balachandran et al., J. Virol. 22.» 438 (1981).

22c. Para et al., J. Virol. £1, 137 (1982).

22d. Zezulak et al., 3. Virol. £7, 553 (1983).

20 22f. Zwei9 et al., 3. Virol. 47, 185 (1983).

23. Anderson et al., J. Virol. 20., 805 (1979).

24. Lee et al., 3. Virol. 12, 41 (1982).

25. Murray et al., friol. Genet. 150. 53 (1977).

26. Benton et al., 5cience 196. 180 (1977).

25 27. Southern, 3. Mol. Biol. 98. 503 (1975).

28. Vieira et al., Gene 19. 259 (1982) 29. Messing et al., Nuc. Acid. Res. 'Ll. 309 (1981).

30. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74.

5436 (1977).

30 31. Atlas of Protein Sequence and Structure V.5,

Supplement 2, 1976, M.O. Dayhoff, ed., The Biochemical Research Foundation, Spring, Maryland, p. 311.

31a. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 7fi, 3824 35 (1981) .

32. Watson et al. Nucl. Acid. Res. 11, 1507 (1983).

33. Blobel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 1746 (1980).

DK 171976 B1 56 34. Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 3884 (1980) .

35. Ruyechan et al., 3. Virol. £9, 677 (1979); Roizman, Cell 26, 481 (1979).

5 36. Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81» 2495 (1983) .

37. Lusky et al., Nature 293. 79 (1981).

38. Nunberg et al., Cell 1£, 355 (1980).

39. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 10 (1980).

40. Graham et al., Virol. 12, 456, (1973).

40a. Kessler, 3. Immuno. 115. 1617 (1975).

41. Showalter et al., Infect, and Immun. M, 684 (1981); Monoklonale anti-gD-antistoffer 1-S og 55-S blev 15 venligst leve- ret af Dr. Martin Zweig ved the

Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Institute, Frederick, Maryland 21701, U.S.A.

42. Cohen et al., 3. Virol. 36. 429 (1980).

43. Pereira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78.

20 5202 (1981) .

44. Cohen et al., 3. Virol. 27. 172 (1978).

45. Laemmli, Nature 227. 680 (1970) .

46. Honess et al., 3. Virol. 16. 1308 (1975).

47. Spear, 3. Virol. 17^. 991 (1976) .

25 48. Campadelli-Fiume. et al., 3. Virol. 43., 1061 (1962);

Johnson, et al., Cell 22, 987 (1983);'Cohen et al., 3. Virol. M, 679 (1983).

49. Bloch, 3. Cell. Biol, fil, 629 (1979).

50. Humant herpetisk serum titreret over for HSV1 og 30 HSV2 ved haemagglutinationsinhiberinqs- og komplementfikserings-prøvninger blev venligst leveret af Dr. John A. Stewart ved the Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, U.S.A.

51. Rector et al., Infect, and Immun. 3j), 168 (1982).

35 52. Kennett, i Monodonal Antibodies, K. Kerrett, T.

McKearn, and B. Bechtel, eds. (Plenum Press, N.Y., 1980), pp. 376-377.

Claims (10)

53. Fiers. et al., Nature 273. 113 (1978); Gluzman; Cell 21, 275 (1981) . 54. Lee et al., Nature 294. 228 (1981); Kaufrnan et al., Mol. and Cdl. Biol. 2, 1304 (1983); Kaufman et 5 al., .3. Mol. Biol. 211, 601 (1982). 55. Kleid et al., Science 214, 1125 (1981). 56. Maxam et al., Methods Enzymol. 65. 499 (1980). 57. Dayhoff, M., Ed. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.5, Supplement 2, National Biochemical 10 Research Foundation, Silver Spring, Maryland, p. 311 (1976). 58. Lasky et al., DNA, i tr ykken (1984). 59. Frink et al., 3. Virol. 45^. 634 (1983). 60. McKnight et al.. Science 217. 316 (1982). 61. Whitton et al., Nud. Acids Res. 18. 6271 (1983). 62. Hubbard et al., Ann. Rev. Biochem. j>£, 555 (1981). 63. Biobel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 22, 1491 (1980). 64. Sabatini et al., 3. Cell. Biol. 21, 1 (1982). 65. Cassai et al., Intervirology £, 212 (1975). 66. Hall et al., 3. Virol, il, 594 (1982). 67. Berman et al,., Science 222. 524 (1983). 68. Gibson et al., 3. Virol. 4£^_ 396 (1983). Patent krav:

1. Fremgangsmåde, som omfatter fremstilling i en rekombinant, 25 stabil pattedyrcellelinje af gc- eller gD- glycoprotein-polypeptid fra Herpes simplex virus type 1 eller type 2, hvorved glycoproteinet har eksponerede antigene determinanter i stand til specifikt at binde komplementære antistoffer mod Herpes simplex virus type l eller type 2.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at ved at glycoproteinet er funktionelt associeret med cellemembranen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at glycoproteinet initielt er associeret med cellemembranen, DK 171976 B1 og at i det mindste en del af polypeptidet med de antigene determinanter dernæst adskilles fra membranen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der initielt fremstilles et trunkeret derivat af et 5 membranbundet gC- eller gD-glycoproteinpolypeptid fra Herpes simplex virus type 1 eller type 2 frit for membranbindende domæne, hvorved polypeptidderivatet er frit for membranen og har de eksponerede antigene determinanter.

5. Fremgangsmåde ifølge hvilke som helst af kravene 1 til 4, 10 kendetegnet ved, at polypeptidet er fra glycoprotein D fra Herpes simplex type l eller type 2.

6. Fremgangsmåde ifølge hvilke som helst af kravene l til 4, kendetegnet ved, at polypeptidet er fra glycoprotein C fra Herpes simplex type 1 eller type 2.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidet er fra et fragment af glycoprotein C fra Herpes simplex virus type 2 og er i stand til at binde komplementære antistoffer overfor Herpes simplex virus type l eller type 2.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidet er fra et fragment fra glycoprotein C, der er i stand til at binde komplementære antistoffer mod Herpes simplex virus type 2, men ikke Herpes simplex virus type 1.

9. Fremgangsmåde, som, efter fremstilling af et 25 polypeptidprodukt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav omfatter binding af polypeptidproduktet til en fast overflade.

10. Fremgangsmåde, som efter fremstilling af et polypeptidprodukt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som 30 helst af kravene 1 til 8 omfatter fastgørelse af polypeptidproduktet til en markør. DK 171976 B1

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at markøren omfatter et enzym.

12. Fremgangsmåde som efter fremstilling af et polypeptidprodukt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som 5 helst af kravene 1 til 11 omfatter inkorporering af produktet i et diagnostisk kit sammen med et mærket antistof, der er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof.

13. Fremgangsmåde, som efter fremstilling af et polypeptidprodukt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som 10 helst af kravene 1 til 11 omfatter inkorporering af produktet i et diagnostisk kit sammen med et ikke-mærket antistof, som er komplementært til Herpes simplex virus type 1 og/eller type 2.

14. Fremgangsmåde som efter fremstilling af et 15 polypeptidprodukt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 11 omfatter inkorporering af polypeptidet i et diagnostisk kit sammen med mærket komplementært antistof.

15. Diagnostisk kit, der omfatter: 20 (a) trunkeret membranfrit polypeptid, som kan opnås ved fremgangsmåden ifølge krav 4, og (b) en sekundær komponent, som omfatter enten komplementært antistof overfor Herpes simplex virus type l og/eller type 2 eller anti-antistof, der er i stand til 25 specifikt at binde det komplementære antistof.

16. Diagnostisk kit ifølge krav 15, hvori nævnte polypeptid (a) er bundet til en fast overflade.

17. Diagnostisk kit ifølge krav 15, hvori nævnte polypeptid (a) er bundet til en markør. DK 171976 B1

18. Diagnostisk kit ifølge krav 15, hvor den sekundære komponent omfatter mærket antistof, der er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof.

19. Diagnostisk kit ifølge krav 18, som endvidere omfatter 5 ikke-mærket komplementært antistof.

20. Diagnostisk kit ifølge krav 15, hvor den sekundære komponent omfatter det komplementære antistof.

21. Diagnostisk kit ifølge hvilket som helst af kravene 15 til 20, hvor polypeptidet (a) er fra gD-glycoprotein fra

10 Herpes simplex type 1 eller type 2.

22. Diagnostisk kit ifølge hvilket som helst af kravene 15 til 20, hvor polypeptidet (a) er fra glycoprotein C fra Herpes simplex type 1 eller type 2.

23. Diagnostisk kit ifølge krav 22, hvor glycoprotein C er 15 fra Herpes simplex virus type 2.

24. Diagnostisk kit ifølge krav 23, hvor polypeptidet (a) er i stand til at binde Herpes simplex type 2, men ikke Herpes simplex type 1.

25. Fremgangsmåde til detektion af antistof indeholdt i en 20 biologisk afledt væskeprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) nævnte væskeprøve bringes i kontakt med et polypeptid som opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 4 for at binde polypeptidet med komplementært antistof i væskeprøven; og 25 (b) bindingstrinnet (a) detekteres.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 25, hvor bindingstrinnet (a) også måles.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 25, hvor polypeptidet i trin (a) er bundet til en fast overflade, og prøven også bringes i DK 171976 B1 kontakt med opløseligt, mærket anti-antistof, der er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof, for at forårsage binding af antistoffet på den faste overflade til både polypeptidet og til det mærkede anti-antistof; og hvor 5 fremgangsmåden før trin (b) endvidere omfatter separation af den faste overflade fra opløsningen indeholdende uomsat, opløst antistof; og hvor det mærkede anti-antistof i trin (b) detekteres enten i den faste fase eller i den derfra adskilte opløsning.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 26, hvor polypeptidet i trin (a) er bundet til en fast overflade, og hvor prøven også er i kontakt med opløst antistof, der endvidere er i stand til specifikt at binde polypeptidet, for at få prøveantistoffet og det mærkede antistof til at binde kompetitivt til 15 polypeptidet på den faste overflade; hvilken fremgangsmåde før trin (b) endvidere omfatter separation af den faste overflade fra opløsningen, der indeholder uomsat opløst, mærket antistof, og hvor det mærkede anti-antistof i trin (b) detekteres enten i den faste fase eller i den derfra adskilte 20 opløsning.

29. Fremgangsmåde til detektion af antigen indeholdt i en biologisk afledt væskeprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) væskeprøven bringes i kontakt med et polypeptid 25 som opnået ved fremgangsmåde ifølge krav 4; hvilket polypeptid har antigene determinanter til fælles med prøveantigenet; og (b) prøveantigenet detekteres under anvendelse af et kompetitivt assay.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, hvor polypeptidet i trin (a) er bundet til en fast overflade, og prøven også er i kontakt med opløst ikke-mærket komplementært antistof, for at forårsage kompetitiv binding overfor det komplementære antistof af polypeptidet og prøveantigenet, hvilken 35 fremgangsmåde før trin (b) endvidere omfatter følgende trin: DK 171976 B1 c) den faste overflade skilles fra opløsningen; og d) den adskilte faste overflade eller opløsning bringes i kontakt med mærket anti-antistof, der er i stand til specifikt at binde det komplementære antistof, og hvori 5 det mærkede anti-antistof detekteres i trin (b).

31. Fremgangsmåde ifølge krav 29, hvor polypeptidet er mærket og prøven i trin (a) også bringes i kontakt med immobiliseret komplementært antistof for at etablere en kompetitiv binding mellem det mærkede diagnostiske produkt og prøveantigenet.

10 SAMMENDRAG Et molekylært klonet diagnostisk produkt omfatter et polypeptid med antigeniske determinanter, som er i stand til specifikt at binde komplementært antistof, hvilket polypeptid er udtrykt fra en stabil konti- nuert cellelinie. Med et 15 glycoprotein 0 fra herpes simplex virus (HSV) som polypeptidet detekteres HSV-antistof i en prøve ved en immunologisk procedure. Ved et fragment af et glycoprotein C fra HSV type 2 kan HS\1 type 2 skelnes fra HSV type 1.