FI66020C - Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 - Google Patents

Description

viSr*l ΓβΙ /hv KUUUUTUSjULKAISU .

^8||Γα 1 J ' UTLAGGN INGSSKRIFT 6 6020 • C /45V Patentti r.yonnetty 10 C8 1984

Patent ncddelat (51) Ky.lk?/lnt.a.3 C 12 N 7/04, A 61 K 39/245 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — PttentmMcnlng 782769 . . (22) Hikemlapllvl— Aneeknlnfsdag 1 1 .09.78 (23) Alkupilvt — GUtlghetadag 1 ) .09.78 (41) Tullut |ulkb«lul — Hiivit offentHg on no yq

Patentti· ja rekisterihallitut ' ' _ . . . ,_ (44) NihtivUcalpanon |a kuuLjulkatsun pvm. —

Patent· och registerstyrelten Anaokan utlagd oeh uti.skrtften publicerad 30.04.84 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird priorltet 19.09.77 USA(US) 834598 (71) Merck δ Co., Inc., 126 E. Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey, USA(US) (72) Vivian Larson, Har1eysvi11 e, Pennsylvania, Ernest Dale Lehman, North Wales, Pennsylvania, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä antigeenisten, immunogeenisten HSV-l ja HSV-2 subunitien valmistamiseksi - Förfarande för framstal1 ning av antigeniska, immunogeniska subunits av HSV-1 och HSV-2.

Herpes-viruksia on luonnossa lähes kaikkialla; niiden luonnollisia isäntiä ovat mm. sammakko, kana, hiiri, marsu, kissa, koira, sika, lehmä, hevonen, apxna ja ihminen. Ihminen on luonnollinen isäntä Herpes simplex-tyypille 1 ja 2, varicella/zoster-lajille, sytomegalo- ja Epstein Barr-virukselle (EBV), ja ihminen voi olla tilapäisesti isäntä apinan Herpes B-virukselle, mistä on yleensä vakavat seuraukset. Herpes-virukset aiheuttavat sairauksia, joihin ei ole saatavissa tehokasta ehkäisyä. Herpes simplex tyypit 1 ja 2 ovat antigeenisesti toistensa kaltaisia, mutta aiheuttavat infektioita eri kohtiin. Herpes simplex tyyppi 1 (HSV1 esiintyy suun ja hengityselinten alueella aiheuttaen usein suussa rakkuloita ja haavaumia. Herpes simplex tyyppi 2 (HSV 2) siirtyy sukuelinten välityksellä ja on herpes genitalis- ja neonataalisen herpestaudin aiheuttaja. Näiden virusten merkitystä kroonisen taudin aiheuttajana ei ole selvitetty. On kuitenkin selviä viitteitä siitä, että HSV2:lla ja sukuelinten syövällä on syy-yhteys; tähän ____— ——— - - I ' "" _____ .

O

L·.

6 -:-020 on päädytty (a) seroepidemiologisten löydösten perusteella, (b) osoittamalla kasvainkudoksessa esiintyvän herpes-virusantigeenejä tai virusten nukleiinihappoja ja (c) osoittamalla in vitro erilaisissa soluissa, myös ihmisen soluissa, tapahtuvan muutoksia säteilytettyjen virusten vaikutuksesta.

Herpes-virukset ovat suhteellisen suuria vaipallisia eet-terisensitiivisiä DNA-viruksia. Herpes simplex tyypin 1 virusten on osoitettu tyypillisesti sisältävän kahta vallitsevaa vaippa-glykoproteiinien molekyylipainoryhmää, kun sen sijaan tyypin 2 virusten on osoitettu tyypillisesti sisältävän kolmea vallitsevaa vaippaglykoproteiinien molekyylipainoryhmää. Joitakin näistä gly-koproteiineista on eristetty, ja niiden on osoitettu saavan aikaan neutraloivaa vasta-aineen muodostusta eläimissä.

Herpes-virus-rokotteen, varsinkin ihmisille tarkoitetun rokotteen kehittäminen on osoittautunut ongelmalliseksi. Yleisesti virusrokotteita, jotka voivat sisältää eläviä, heikennettyjä viruksia tai tapettuja, inaktivoituja viruksia, valmistetaan isän-täeläimen kehon nesteessä tai soluviljelmässä olevista viruksista tai niistä saaduista viruskonsentraateista. Herpes-virukset näyttävät kuitenkin yleensä olevan kiinteämmin soluun sitoutuneita kuin useimmat muut virukset eivätkä siten ole irrotettavissa nesteisiin. Lisäksi jotkut tämän ryhmän jäsenistä ovat siksi vaikeasti viljeltäviä, ettei niillä saada rokotteiden suuressa mittakaavassa tapahtuvaan valmistukseen riittävän korkeata virionitasoa. Joidenkin herpes-virusten, kuten HSV2- ja EBV-virusten epäillään olevan kasvaimia aiheuttavia ihmisillä. Rokotteiden valmistus tällaisista viruksista on erityisen ongelmallista, koska rokotteella el saa olla viruksiin liittyvää geneettistä informaatiota, joka pystyy aiheuttamaan syöpää. Myös inaktivoitujen, kokonaisia viruksia sisältävien rokotteiden katsotaan olevan mahdollisesti vaarallisia tässä suhteessa, koska ne sisältävät virusten nukleiinihappoja. Äskettäin virusrokotteiden kehitystyön tuloksena on valmistettu subunit-rokotteita eli "pilkottuja" rokotteita, joista on vähennetty tai poistettu ei-toivottuja isännän tai viruksen komponentteja. Tästä esimerkkinä on influenssa-subunit-rokotteen valmistus infektoidusta kananmunan allantoisnesteestä, jolloin saadaan vähemmän myrkyllinen, pyrogeenivapaa rokote (US-patenttijulkaisu 3 962 421). Tällaisten rokotteiden valmistuksessa ei kuitenkaan ole

6 '5 O 2 O

voitu poistaa ja/tai inaktivoida virusten geneettistä informaatiota, mikä olisi tarpeen virusten mahdollisen syöpää aiheuttavan etiologisen vaikutuksen kannalta.

Kudosviljelmää, joka on infektoitu HSV1:llä tai HSV2:lla, käsitellään viruksen pintaglykoproteiinien uuttamiseksi ja väke-vöimiseksi, niiden erottamiseksi ei-toivotusta materiaalista ja niiden käsittelemiseksi siten, että ne ovat turvallisia rokotteina käytettäviksi.

Menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSVl:llä, joka pystyy kasvamaan kudosvil jelmällä: b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketuksiin ei-ionisen tai anionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoimalla, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan immunogeeninen HSV-1 tai HSV-2 subunit, joista HSV-1 subunit sisältää kaksi ryhmää virusten pintaglykoproteiineja (molekyylipainot: non 123 000 ja noin 60 000 daltonia) ja HSV-2 subunit vastaavasti kolme ryhmää (molekyylipainot: 110 000 - 130 000, 83 000 - 90 000 ja 55 000 - 60 000 daltonia).

Saadut tuotteet ovat käyttökelpoisia HSV1- ja KSV2-rokot-teita. Yleinen menetelmä on sovellettavissa muihin herpes-virus-ryhmän jäseniin, kun viruksia kasvatetaan sille sopivassa isäntä-soi usysteemissä .

Kuvio 1: HSV2-antigeenin, joka eristettiin Lens culinaris-kasvin lektiini-Sepharose-affiniteettikromatografia 11a, polypep-tidikoostumus. Elektroforeesi suoritettiin siten kuin Courtney, McCombs ja Melnick (Virology 43, 356-365, 1971) ovat kuvanneet. Polypeptidit värjättiin Coomassien-sinisellä ja densitometripiir-ros saatiin geelistä mittauksella aaltopituudella 540 nm. Piikkien kohdalla olevat luvut ovat molekyylipainoja.

Kuvio 2: HSV2-antigeenin, joka eristettiin Lens culinaris-kasvin lektiini-Sepharose-affiniteettikromatografiällä, glykopo- 4 6-5020 lypeptidikoostumus. Virusglykoproteiinit merkittiin in vitro li- 3 säämällä ( H)-glykosamiinia infektoituihin soluihin 4 tuntia infektion jälkeen. Elektroforeesi suoritettiin kuten kuviossa 1 kuvattiin ja radioaktiivisuusprofiili saatiin viipaloimalla geeli 2 mm:n segmenteiksi, liuottamalla polyakryyliamidi 30 %:iseen vetyperoksidiin ja mittaamalla radioaktiivisuus nestetuikespektro-metrillä.

Kuvio 3: HSV1-antigeenin, joka eristettiin con-A-Sepharo-se-affiniteettikromatografiällä, polypeptidikoostumus. Elektroforeesi suoritettiin kuvion 1 yhteydessä kuvatulla tavalla.

Kuvio 4: HSV1-antigeenin, joka eristettiin con-A-Sepha-rose-affiniteettikromatografiällä, glykopolypeptidikoostumus. Analyysi suoritettiin kuvion 2 yhteydessä kuvatulla tavalla.

Keksinnön mukaan lähtömateriaalina on Herpes simplex tyypin I tai II viruksilla infektoituja soluja, joita on kasvatettu soluviljelmässä. Solut voivat olla mitä tahansa soluja, joita voidaan infektoida kyseisillä herpes-viruksilla ja jotka pystyvät tuottamaan haluttuja virusantigeenejä ja joita pidetään sopivina rokotteen valmistukseen. Ihmiselle tarkoitettujen HSV1- ja HSV2-rokotteiden tuottamiseen sopiva soluviljelmä on esimerkiksi primaariset kanansikiösolut kasvatettuina yksikerrosviljelmänä pyörivissä pulloissa. Solut infektoidaan HSV1- tai HSV2-viruksilla, joilla on alhainen infektion moninkertaistumista ilmaiseva kerroin (MOI - viruspartikkeleiden lukumäärä solua kohti), kuten suuruusluokkaa noin 0,001 - noin 1,0, edullisesti noin 0,01, oleva kerroin, ja viljelmiä inkuboidaan, kunnes sytopatogeeninen vaikutus on havaittavissa suuressa osassa soluja, tyypillisesti noin 75 %:ssa soluista. Inkubaatiojakson päätyttyä soluviljelyväliaine poistetaan ja soluyksikerros mahdollisesti pestään tasapainotetulla suolaliuoksella. Vaihtoehtoisesti solut voidaan koota vil-jelyastiasta mekaanisesti, pestä tasapainotetulla suolaliuoksella, hajottaa esim. ultraäänikäsittelyllä ja saatu hajotettuja soluja sisältävä suspensio voidaan kirkastaa esim. linkoamalla alhaisella nopeudella. Esillä olevan keksinnön menetelmää virusten membraaniin sidottujen glykoproteiinien liuottamiseksi ja uuttamiseksi viruksella infektoiduista soluista voidaan soveltaa yhtä tehokkaasti edellä kuvattuihin ehjien solujen yksikerrosviljelmiin kuin hajotettujen solu-uutteiden käsittelyyn. Ehjien yksikerrossoluviljel-

5 6 j O 2 O

mien suoralla kemiallisella uutolla on suuren mittakaavan rokote-valmistuksessa käytännön etuja, koska siinä ei tarvitse mekaanisesti poistaa soluja niiden kasvupinnalta. Sen on myös havaittu johtavan parempiin proteiinisaantoihin, koska mekaaniseen solujen kokoamiseen liittyvät fysikaaliset häviöt jäävät pois, ja koska ultraäänikäsittely ja alhaisella nopeudella suoritettu linkoami-nen voidaan jättää pois. Kunnolla säädetyissä olosuhteissa tällä menetelmällä saadaan antigeenisen selektiivisen uuton ansiosta puhtaampia antigeenejä, so. vähemmän DNA:ta tulee uutetuksi verrattuna mekaanisessa talteen otossa ja ultraäänikäsittelyssä mukaan joutuneeseen DNA:hän.

Uutossa käytetty pinta-aktiivinen aine voi olla ei-ioninen tai anioninen. Edullisesti käytetään ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, esimerkiksi polyoksietyleenialkyylifenoleja, kuten poly-oksietyleenioktyylifenolia.

Uuttoon käytetty anioninen pinta-aktiivinen aine voi olla sappihapon suola, esim. natriumdeoksikolaatti, natriumkolaatti tai natriumtaurokolaatti.

Edullinen uutossa käytettävä ei-ioninen pinta-aktiivinen aine on polyoksietyleenialkyylifenoli, jonka alkyyliryhmässä on noin 6 - noin 12 hiiliatomia, esim. Triton X-100 tai Nonidet P-40. Käsitellyllä ei-ionisella pinta-aktiivisella aineella saadaan vi-rusglykoproteiinit uutettua. Kun käsittelyyn käytetään ei-ionista pinta-aktiivista ainetta yhdessä suolan kanssa, jota on läsnä noin 0,1 - noin 2-m riippuen viruksesta, virusglykoproteiinien uutto tehostuu. Suola voi olla alkalisuola, maa--alkalisuo2 o tai kolme-arvoisen kationin suola. Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat KC1, NaCl, MgC^ tai CaC^· Uutto suoritetaan edullisesti neutraalissa pH:ssa, jolloin tarvittaessa voidaan käyttää puskuria, esim. tris-HCl-puskuria. Mukana voidaan haluttaessa käyttää proteolyyt-tistä inhibiittoria, esim. fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Uutto voidaan suorittaa lämpötila-alueella jääkaappiläm-pötilasta inkubaattorin lämpötilaan, so. noin 4 - noin 37°C:ssa noin 15 minuutista useampaan vuorokauteen. Uuttojakso voi jatkua aina siihen asti, kunnes antigeeniaine on pilkkoutunut. Tavallisesti ei kuitenkaan saavuteta mitään etua sillä, että uuttoa jatketaan pitempään kuin parin tunnin ajan. Tyypillisesti uuto suo- 6 65020 ritetaan 20-23°C:ssa 1--4 tunnin aikana uuttoliottimessa, joka sisältää 2-% Triton X-100, 0,15-1-m NaCl, 10-mmol tris HC1, pH 7,5 ja 2-mmol PMSF.

Uutossa saatu neste lingotaan liukenemattomien aineiden poistamiseksi, so. solujätteiden, solutumien ja virusnukleokapsi-dien poistamiseksi. Linkoaminen voidaan suorittaa noin 50 000 x g:ssä tai sen yli ajan jaksona noin 15 minuutista useampaan tuntiin, tyypillisesti 100 000 x g:ssä noin 1 tunnin ajan. Liukoinen uute ei pysty infektoimaan, mutta sisältää jonkin verran ehjää (kaksisäikeistä) DNArta ja RNA:ta. Kaksisäikeinen (ehjä) DNA ja RNA määritetään etidiumbromidikokeella (Karsten et ai., Anal. Bio-chem., 46, 135-148, 1971). Kokeen avulla havaitaan niinkin pienet DNA-määrät kuin 50 ng ja RNA-määrät 100 ng. Kokonais-DNA (yksi-ja kaksisäikeinen DNA ja DNA-fragmentit) mitataan Kissane'n et ai., J. Bioi. Chem., 233, 184-188, 1958, esittämällä menetelmällä, jolla havaitaan niinkin alhaiset määrät kuin 50 ng asti.

Uutosta saatua liukoista materiaalia käsitellään DNA: aasilla jäännös-DNA:n nydrolysoimiseksi, jolloin saadaan tuotetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan ehjää kaksisäikeistä DNA:ta (alle 50 ng/100 /ug proteiinia).

Ei-ionisella pinta-aktiivisella aineella uuttamisen jälkeen saatu liukoinen materiaali on erityisen sopivaa lähtöainetta membraaniin sitoutuneiden herpes-virus-glykoproteiinien kromatografiseen puhdistukseen. Kromatografisesta fraktioinnista pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa on tuloksena virus-glykoproteiini-en rikastuminen, DNA-fragmenttien poisto ja/tai RNA:n ja muiden ei-toivottujen proteiinien väheneminen. Liukoisen materiaalin frak- ' tiointi voidaan suorittaa tunnetulla tavalla anioninvaihtokromato-grafialla. Anioninvaihtajana voi olla esim. DEAE-sellulossa. Jos DNA:aasi-käsittely jätetään pois, niin DEAE-selluloosakromatogra-fialla saadaan tuote, joka ei olennaisesti sisällä kaksisäikeistä DNArta (<50 ng/100 pg proteiinia), mutta saattaa sisältää jäännöksenä kokonais-DNA:ta (1 pg/100 ^ug proteiinia) Edullisimmin liukoinen materiaali fraktioidaan affiniteettikromatografisesti immobili-soidulla lektiinilla tunnetulla tavalla. Lektiinit ovat soluja agglutinoivia proteiineja, joita esiintyy yleisimmin palkokasvien siemenissä, mutta myös kasvin muissa osissa ja myös muissa kuin palkokasveissa sekä eläimissä. Lektiinit aiheuttavat agglutinaation 6 '3 0 2 0 sitomalla hiilihydraatteja solun pinnalle, ja tämän ominaisuuden vuoksi niitä voidaan käyttää hiilihydraatteja sisältävien makromolekyylien, kuten glykoproteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen. Käytettäessä lektiinejä glykoproteiinien puhdistusreagenssina ne tehdään yleensä liukenemattomiksi ja immobilisoidaan sitomalla kovalenttisesti inerttiin matriisiin, kuten dekstraaneihin, aga-roosiin, selluloosaan tms. Edullisesti lektiini immobilisoidaan pylväässä.

Lektiineistä voidaan mainita esimerkkeinä Lens culinaris lektiini, Concanavalin A (Canavalia enisformis lektiini), soija-papuagglutiniini (Glycine max lektiini), vehnäalkioagglutiniini, Dolichos biflorus lektiini, Loktus tetragonolobus lektiini, Phase-olus lunatus lektiini, Phaseolus vulgaris lektiini, maapähkinä-iektiini, Pisum sativum lektiini (palkohernelektiini), Vicia gra-minea lektiini, Robinia pseudoacacia lektiini, Vicia faba lektiini, Ulex europeus lektiini, Vicia cracca lektiini, Solanum tuberosum lektiini (perunalektiini)f Abrus precatorius lektiini, Triticum vulgaris lektiini (vehnälektiini) , Momordia charantia lektiini, Agaricus campestris lektiini, Sesanum insicum lektiini, Helix po-matia lektiini (viinitarhaetanalektiini), Wisteria floribunda lektiini, Laburnum alpinum lektiini, Sophora japonica lektiini, Phaseolus limensis lektiini ja Limulus polyphemus lektiini (mo-lukkirapu lektiini). HSV2:lle edullinen lektiini on Lens culinaris lektiini ja HSV1:lle edullinen lektiini on Concanavalin A. Lek-tiiniaffiniteettikromatografoinnin jälkeen tuote ei olennaisesti sisällä kaksisäikeistä eikä kokonais-DNA:ta (<50 ng/100 ^g pro-teniinia) ja ilman DNA:aasi-käsittelyäkin se ei sisällä havaittavaa määrää RNA:ta (<100 ng/100 pg proteiinia).

Immobilisoiduilla lektiineillä eristettyä virus-subunitia voidaan haluttaessa käsitellä aineella, joka pystyy adsorboimaan adsorbentista mahdollisesti irronneen lektiinin. Tällainen materiaali voi olla polymeroitua dekstraania, esimerkiksi Sephadex-geeliä.

Virussuunnatut glykoproteiinit, jotka on eristetty joko ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiällä, voidaan edelleen puhdistaa ja erottaa adsorboimalla kalsiumfosfaattia sisältäville adsorbenteille, esim. brusiitille (CaHPO^.2^0) tai edullisemmin hydroksyyliapatiitille /^JCa^Q (PO^ ) g ) OH) . Adsorptiokromatograf ia ___ - Γ~ ‘ -— 8 ό -5020 suoritetaan tuunetulla tavalla pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa.

Anioninvaihtohartsikäsittelystä tai affiniteettikromatogra-fiakäsittelystä immobilisoidulla lektiinillä saatu virus-subunit-antigeeni ei sisällä haviattavaa määrää kaksisäikeistä DNA:ta, ja sitä voidaan käyttää rokotteena neutraloivien vasta-aineiden ja soluvälitteisten immuuvasteiden aikaansaamiseksi ja laboratorioeläin-ten suojaamiseen herpes-viruksen aiheuttamaa halvausta ja kuolemaa vastaan. Lekt.iiniadsorption avulla eristetty virus-subunit ei sisällä edellä mainituilla kokeilla todettavaa DNA:ta tai RNA:taf kun taas anioninvaihtajalle adsorboitu virus-subunit sisältää noin 1 % kokonais-DNA-fragmentteja tai RNA:ta.

Virus-subunit-rokote voidaan steriilisuodattaa ja se voidaan mahdollisesti turvallisuussyistä inaktivoida, kuten esim. kuumentamalla, UV-säteilyllä, DNA:aasilla, formaliinilla tai natriumetyyli-merkuritiosalisylaatilla. Virus-subunit-rokotteen immunointitehoa voidaan vahvistaa adsorboimalla virus-subunit-antigeeni alunalle tai käyttämällä muita immunologisia adjuvantteja. Rokotekäyttöön virus-subunit-antigeenit eivät saa olennaisesti sisältää pinta-aktiivista ainetta. Adsorboiminen alunalle on sopiva keino mahdollisen sitoutumattoman pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi.

Keksinnön mukaista rokotetta voidaan haluttaessa käyttää yhdessä rokotteen valmistuksessa tavanomaisten stabiloijien ja ro-koteadjuvanttien kanssa. Tyypillisiä stabiloijia ovat esimerkiksi gelatiini, kaseiini ja albumiini. Adjuvanteista esimerkkinä on aluna. Adjuvanttikoostumus voidaan valmistaa maapähkinäöljystä, iso-mannidi-mono-oleaatista ja aluminiummonostearaatista. Keksinnön mukaista rokotetta voidaan varastoida jäähdytettynä, jäädytettynä tai lyofilisoituna. Antigeenit ovat imettäväisiäjeille immunogeeni-sia ja niitä voidaan käyttää rokotteina. Ne aiheuttavat vasta-aineiden muodostusta marsuissa, marakateissa ja Cebusapinoissa, kissoissa ja ne suojaavat kuolettavia homologisia viruksia vastaan hiirillä.

Farmakologiset kokeet A. Kolmelle ryhmälle marsuja annettiin lihaksensisäisenä in jektiona 4 viikon väliajoin 1,0 ml annos erilaisia määriä keksinnön mukaisesti valmistettuja HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvan-tilla. Seuraavassa taulukossa I on ilmoitettu eri eläinryhmille annetut annokset injektiokertaa kohti sekä niiden eläinten lukumäärä koko ryhmästä, joilla oli vasta-aineen muodostusta 0, 28, 56 ja 84 vrk kuluttua.

9 6 502 0

Taulukko I

Rvhma Rokoteannos [Niiden eläinten lukumäärä, joilla oli vasta-(pg/ml) aineen muodostusta (päivä no.) ! _0 | 28__56 | 84 j jA 10 0/12 | 9/12 12/12 j 12/12 | 'B 1 I 0/12 | 1/10 6/10 10/10 ! C 0,1 ! 0/12 I 0/12 j 0/12 ! 3/11 i

Kaikilla marsuilla oli merkitsevää vasta-aineen muodostusta kahden 10 jugtn rokoteannoksen jälkeen ja kolmen pg:n rokoteannoksen jälkeen.

B. Kolmelle hiiriryhmälle (20 hiirtä ryhmää kohti) annettiin injektiona intraperitoneaalisesti kaksi kertaa 4 viikon välein 0,5 ml keksinnön mukaisesti valmistettua HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla tai vastaavasti plasebo-rokotetta. 2 viikon kuluttua viimeisestä rokoteinjektiosta eläimiin infektoitiin jalkapohjan kautta eläviä HSV2-viruksia. Seuraavassa taulukossa on kullekin eläinryhmälle kullakin injektiokerralla annetun annoksen suuruus sekä niiden eläinten lukumäärä koko ryhmän lukumäärästä, jotka kuolivat infektoinnin jälkeen, keskimääräinen hengissä pysymysaika ja rokotteella saatu suojavaikutus.

Taulukko II

Ryhmä ! Rokote- [Niiden hiirien lukumäärä,jotka j Keskimääräinen, Suojavaikutus annos .kuolivat HSV2 infektoinnin jäi- i hengissäpysy- ; 28 vrk:n ku-:(pg/0,05ml)keen (päivä no.)_ ! misaika (vrk) luttua (mer- _|__0 | 7 j 14 21 I 28 |__, kitsevyys) , ! j A 40 0/20 ; 0/20 | 2/20 j 5/20 I 7/20 ΐ 26 62 %(p=0,0008)! B 10 .0/20 | 0/20 I 1/20 | 8/20 j 8/20i 26 50 %(p=0,0022): C* 0 0/20 : 0/20 j16/20 ;18/20 | 18/20' 12 =__1 I 1 : ;__; ♦plasebo

Yli 50 % eläimistä, jotka saivat kaksi kertaa rokotetta an-nostasoilla 10 tai 40 jug, säilyi hengissä, kun sensijaan plasebo-rokotetta saaneet eläimet kuolivat kaikki. Lisäksi hengissäpysymys-aika kasvoi. rokotteen vaikutuksesta yli kaksinkertaiseksi.

___=. - Γ" "... .......

10 6 '502 0 C. Kolmelle niiriryhmälle (20 eläintä ryhmää kohti) annettiin injektiona intraperitoneaalisesti kaksi kertaa 4 viikon välein 0,5 ml rokotetta, joka sisälsi erilaisia määriä HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla, tai vastaavasti plasebo-rokotetta. Kahden viikon kuluttua viimeisestä rokote-injektiosta eläimiin infektoitiin eläivä HSV2-viruksia intrakerebraalisesti. Seuraavasta taulukosta III nähdään eri hiiriryhmille kullakin injektiokerralla annettu annos. Henkiin jääneiden eläinten lukumäärä ryhmässä koko ryhmän lukumäärään verrattuna, keskimääräinen hengissäpysymysaika ja rokotteella saatu suojavaikutus.

Taulukko III

Ryhmä Rokote- iNiiden hiirien lukumäärä, Keskimääräinen Suojavaikutus annos jjotka kuolivat HSV2 infektoin- hengissäpysy- 21 vrk:n ku- (pg/0,5 ml) |nin jälkeen (päivä no.)_ misaika luttua(merkit- '__:_! 0 ~ 7 | 14 21 ^____sevyys)__ 1 ' 1 ! i A 40 I 0/20 2/20 ! 5/20 : 7/20 ; 16 65 %(p>0,0001) i B ! 10 , 0/20 ' 5/20 | 10/20 11/20 ’ 13 45 %(p>0,0012) ' C* 0 0/20 10/20 I 17/20 20/20 8 -:-1-:----1 *plasebo

Yli 50 % niistä eläimistä, jotka saivat rokoteannoksen 40 /ug, säilyi hengissä kun sensijaan plasebo-rokotetta saaneet eläimet kuolivat kaikki. Hengissäpysymisaika kasvoi keskimäärin kaksinkertaiseksi. Rokoteannoksella 10 ^ug saatiin myös suojavaikutus, joka oli kuitenkin vähäisempi.

D. Kahdelle ryhmälle karvattomia hiiriä (HRS-hiiriä) annettiin intraperitoneaalisesti injektiona 4 viikon välein 0,5 ml keksinnön mukaisesti valmistettua 20 jug HSV2-subunit-rokotetta aluna-ad juvan--tilla tai vastaavasti plasebo-rokotetta. Kahden viikon kuluttua viimeisestä rokoteannoksesta eläinten naamaan infektoitiin raaputtamalla eläviä HSV1-viruksia. Ihovauriot infektiokohdassa, kuolleisuus ja latentti kolmoishermoganglioinfektio on esitetty seuraa-vassa taulukossa IV.

11

6 :5 O 2 O

Taulukko IV

HSV1 infektoinnin vaikutukset ——--:-1--:--: iRokote |lhovauriot Kuolleisuus Latentti, kolmoishermo- i j(päivä 6) (päivä 21) ganglioinfektio |__j____(päivä 21-23)_ HSV2 rokote i ; (20 /jg annos)1; 4/19 0/19 1/19

Plasebo 1 38/40 8/40 ! 24/32 j ; ! ....... - ______ »___»

Verrattuna plasebo-rokotetta saaneiden eläinten ryhmään esiintyi HSV2-subunit-rokotetta saaneilla eläimillä heterologisen HSV1-infektoinnin aiheuttamana selvästi vähemmän ihovaurioita (p<0,0001), tai latenttia ganglioinfektiota (p<0,0001), ja eläinten kuolleisuus oli alhaisempi (p<0,0009).

E. Kolmelle ryhmälle marsuja (12 eläintä ryhmää kohti) annettiin lihaksensisäisenä injektiona 4 viikon välein 1,0 ml eri suuruisia annoksia keksinnön mukaisesti valmistettua HSV1-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla. Seuraavassa taulukossa V on esitetty eri ryhmille kulloinkin annetut annokset, niiden eläinten lukumäärä koko ryhmästä, joilla esiintyi vasta-aineen muodostusta 0, 28, 56 ja 84 vrk:n kuluttua.

Taulukko IV

iRyhmä ι Rokoteannos Niiden eläinten lukumäärä, joilla oli ! I tyig/ml) vasta-aineen muodostusta__ j___päivä 0 päivä 28 päivä 56 päivä 84 j ! A 10 0/12 12/12 12/12 ! 12/12 \

i I

B j 1 ! 0/12 8/12 i 10/101 12/12 .

I c ! 0,1 j 0/12 3/12 : 6/12 12/12 i , i ,___:__i_i_!__ kahdella eläimellä ei suoritettu koetta _____ ____ - τ~.

12 6 5 0 2 0

Kaikilla marsuilla oli rokoteannoksella 10 pg vasta-aineen muodostusta yhden annoksen jälkeen ja rokoteannoksella 1 pg kahden annoksen jälkeen sekä annoksella 0,1 pg kolmen annoksen jälkeen.

Rokotteen valmistus

Esimerkissä 4 valmistettua tuotetta sisältävää fosfaattipus-kuroitua suolaliuosta (800 ml, 100 pg/ml esimerkin 4 tuotetta) sekoitettiin dekantterissa. Liuokseen lisättiin hitaasti 68 ml 10-%:sta alunaliuosta (A1K(SO^)^ ·12^0) ja samanaikaisesti tipoittain 1-n NaOH-liuosta siten, että suspension pH pysyi arvossa alle 5,2.

Alunan lisäämisen päätyttyä suspension pH säädettiin 10-n NaOH-liuoksella arvoon 6,8. Suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1-2 tuntia, sitten suspensio siirrettiin sopiviin sentrifugipulloi-hin, ja suspensiota lingottiin 10 minuuttia 270 x g:ssä. Neste dekan-toitiin ia heitettiin menemään, pelletti suspendoitiin pyrogeeni-vapaaseen fysiologiseen suolaliuokseen siten, että saadun suspension tilavuus oli sama kuin alkuperäisen antigeeniliuoksen.Triton^L-lOOrn konsentraation saamiseksi mahdollisimman alhaiseksi voidaan alunalle adsorboitu rokote pestä 1-2 kertaa suolaliuoksella ennen uudelleen suspendoimista.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 HSV2:n Curtis-kanta saatiin tri A.J.Nahmias'ilta, Emory University, Atlanta, Georgia, ja sille oli suoritettu 3 pasasointia primaarisissa kaniinin munuaissoluissa. Virukselle suoritettiin vielä 3 pasasointia kaniinin munuaissoluissa ja sitten se adaptoitiin 8:11a peräkkäisellä pasasoinnilla kanan sikiösoluilla.

11 vuorokautta haudotuista, leukoosia sairastamattomien kanojen munista saadut kanan sikiöt trypsinoidaan, ja saatu yksisolu-suspensio viedään pyöriviin pulloihin väliaineeseen 199, joka sisältää 2 % vasikansikiöseerumia ja 50 pg/ml neomysiiniä ja pyöriviä-pulloja inkuboidaan 36°C:ssa.

Neljäntenä päivänä yksikerrosviljelmät infektoidaan HSV2-viruksella (MOI = 0,01, adsorptioaika 2 tuntia). Infektoituja viljelmiä inkuboidaan 34°C:ssa pyörivissä myllyissä, kunnes noin 75 %:ssa soluista havaitaan sytopaattinen vaikutus, so. noin 44-48 tuntia.

Viljelvväliaineen päällä oleva neste heitetään pois ja yksikerrosvil jelmät pestään varovasti (3 x 50 ml) PBS:llä samalla pyörittäen pyörivää myllyä kaiken vasikansikiöseerum.in poistamiseksi.

13

o -5 O 2 O

Pesun jälkeen pulloihin, joita pyöritetään myllyssä 20-23°C:ssa, lisätään liuosta, jossa on 2 % Triton X-100, 1-m NaCl, 50 mmol tris-HCl, pH 7,5, 2 mmol PMSF ja 4,75 % etanolia ja uutetaan 30 minuutin ajan. Uute kootaan, astiat pestään uudella liuoksella ja pesuneste lisätään alkuperäiseen uutteeseen. Yhdistettyä solu-uutetta pidetään 20-23°C:ssa vähintään tunnin ajan, joka aika lasketaan alkavaksi liuoksen ensimmäisestä lisäyksestä soluviljelmäpulloihin, sitten solu-uute lingotaan 105 000 g:ssa tunnin ajan 20-23°C:ssa.

Päällä olevan nesteen pH säädetään 7,0:ksi, siihen lisätään MgCl2:a lopulliseen pitoisuuteen 0,005-m, ja härän haimasta valmistettua deoksiribonukleaasia (1 mg/ml deionoidussa vedessä) lopulliseen pitoisuuteen 50 pg/ml. Seosta inkuboidaan 20-23°C:ssa 4 tuntia. Seoksessa ei ole tällöin käytännöllisesti katsoen lainkaan vapaata ehjää (kaksisäikeistä) DNA:ta.

Seos fraktioidaan Lens culinaris lektiini-affiniteettipyl-väässä. Lens culinaris lektiini-Sepharose-affiniteettiadsorbentti valmistetaan sitomalla kovalenttisesti tunnetulla tavalla Lens culinaris lektiini CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia, Ruotsi) tai aktivoituun Sepharose 4B:hen tai aktivoituun CH-Sepharose 4B:hen. Adsorbentti suspendoidaan liuokseen, jossa on 1 % Triton X-100, 1,0-m NaCl, 50 mmol tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri) ja kaadetaan kromato-grafiapylvääseen; adsorptiokerroksen lopulliset mitat ovat 2,6 cm (sisäläpimitta) x 10 cm (kerroksen tilavuus 53,1 ml). Adsorbentti pestään 250 ml:11a 0,2-m <X-metyyli-D-mannosidia lähtÖpuskurissa ja tämän jälkeen vähintään viidellä pylvään tilavuudella lähtöainepusku-ria. Valumisnopeus pylväässä säädetään peristalttipumpun avulla 100 ml:ksi/tunti.

Seos pumpataan adsorbenttipylvääseen ja pylväs pestään sitten viidellä pylvään tilavuudella lähtÖpuskuria. Tämän jälkeen virus-suunnatut glykoproteiinit desorboidaan pylväästä viidellä pylvään tilavuudella 0,2-m 0(’-metyyli-D-mannosidia lähtÖpuskur issa. Fraktio, johon glykoproteiini on rikastettu sisältää pääasiassa 6 polypepti-diä ja lisäksi vähäisiä määriä 5-8 muuta polypeptidiä (ks. kuvio 1 ja 2 joissa on kolme glykoproteiiniryhmää: noin 110 000-130 000 dalto-nia; noin 83 000-90 000 daltonia ja noin 55 000-60 000 daltonia).

Tämä fraktio sisältää ζ 50 ng DNA:ta ja <100 ng RNA:ta per 100 pg proteiinia. Elektronimikroskoopilla ei voida havaita ehjiä tai hajonneita viruksia eikä nukleokapsideja, eikä kudosviljelymenetelmällä saatu eristettyä eläviä viruksia.

_ __ - _ 1 14 6 5 0 2 0

Lens culinaris Lektiini-Sepharose-pylväästä saatu glykoprote-iinifraktio kromatografoidaan pienessä, polymeroitua dekstraania, so. Sephadex G-50 sisältävässä pylväässä mahdollisen affiniteettiadsor-bentista irronneen lektiinin poistamiseksi ja adsorboitumaton fraktio otetaan talteen. Tämä käsittely ei ole välttämätön ja se voidaan jättää väliin.

Adsorboitumaton HSV2-glykoproteiinifraktio steriilisuodate-taan Nuclepore-suotimella <huokoskoko 0,2 μ, Nucleopore (corp. USA) ja laimennetaan sopivaan konsentraatioon steriilillä, pyrigeeni-vapaalla, fysiologisesti hyväksyttävällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Liuokseen lisätään mahdollisesti formaliinia pitoisuuteen 100 pg/ml ja seosta inkuboidaan 72 tuntia 36°C:ssa sen varmistamiseksi, ettei läsnä ole enää infektiokykyisiä HSV2:n jäännöksiä ja mahdollisen jäljelle jääneen yksisäikeisen DNA:n inaktivoimiseksi.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 menetelmä toistetaan muuten paitsi, että infektoidut solut poistetaan mekaanisesti viljelyastioista ja pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), sp. liuoksella, jossa on 0,15-m NaCl, 0,0063-m natriumfosfaattia, pH 7,2. Pestyt solut suspendoidaan jälleen pyrogeenivapaaseen tislattuun veteen solupi-toisuuteen noin 1-2 x 10^ solua/ml ja solut hajotetaan ultraääni-käsittelyllä (3 kierrätystä nopeudella 150 ml/min) käyttäen lämmön-vaihdinta lämpötilan pitämiseksi noin 4°C:ssa. Hajotetut solut lin-gotaan 800 g:ssä 20 minuuttia 4°C:ssa ja päällä olevat nesteet yhdistetään. Päällä olevaan nesteeseen lisätään Triton X-100:aa 2 %,

NaCl 1,0-m, tris-HCl, pH 7,5, 50-mmol, PMSF:ää 2-mmol, ja etanolia 4,75 % (PMSF:n liuottamiseksi) ja Lowry-proteiinia noin 2 mg/ml.

Seos suspendoidaan kudoshomogenisaattorilla 20-23°C:ssa tunnin ajan aina välillä homogenoiden, sitten se lingotaan 105 000 g:ssä tunnin ajan 20-23°C:ssa. Päällä oleva neste kootaan ja sen jatkokäsittely on sama kuin esimerkissä 1.

Esimerkki 3

Esimerkin 1 ja esimerkin 2 menetelmä toistetaan muuten paitsi, että Lens culinaris lektiini-affiniteettikromatografiän sijasta käytetään DEAE-selluloosakromatografiaa ja Sephadex G-50 kromatografia jätetään pois. Triton X-100 uutteen päällä oleva neste dialysoidaan liuosta vastaan, jossa on 1 % Triton X-100, 10 mmol tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri) 4°C:ssa. Dialysoitu uute viedään DEAE-selluloosapyl-vääseen, joka on tasapainotettu lähtöpuskurilla ja kromatografoidaan 15 6-3020 4°C:ssa. Kun koko näyte on lisätty pylvääseen, pylväs pestään lähtö-puskurilla adsorboitumattoman proteiinin poistamiseksi, ja adsorboituneet proteiinit eluoidaan 0-0,6-m NaCl-gradientilia lähtöpuskuris-sa. 25-200 mmclaariset NaCl-fraktiot sisältävät eniten glykoproteii-nia ja ne yhdistetään. Yhdistetyissä fraktioissa ei voida havaita kaksisaikeistä DNA:ta, mutta se sisältää noin 1 % yksisäikeistä DNA:ta tai DNA-fragmentteja ja 1-3 % RNA:ta. Se sisältää > 30 poly-peptidiä molekyylipainoalueella 17 000-322 000. Fraktiot sisältävät kolme ryhmää glykoproteiineja: noin 110 000-130 000 daltonia; noin 83 000-90 000 daltonia ja noin 55 000-60 000 daltonia. Fraktiossa ei voida elektronimikroskoopilla havaita ehjiä tai hajonneita viruksia tai nukleosideja, eikä eläviä viruksia voida eristää kudosviljely-menetelmil1ä.

Esirnerkki 4

Valmistetaan Herpes simplex tyypin 1 (HSV1) infektoituja soluja muuten samoin kuin esimerkissä 1, paitsi käyttämällä HSVlctä HSV2:n sijasta. Infektoidut solut otetaan talteen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla paitsi, että ultraäänikäsiteltyjen solujen alhaisella kierrosluvulla ljngotusta liemestä saatu päällä oleva neste lingotaan 105 000 g:ssä tunnin ajan 4°C:ssa viruksen konsentroimiseksi ja että Triton X-100-uuttoliuos, johon saatu viruspelletti suspendoidaan, sisältää 0,15-m NaCl eikä 1,0-m kuten HSV2:lla. Saatu uute fraktioidaan 1ektiini-concanavalin A:11a seuraavasti:

Kaupallisesti saatavana oleva affiniteettiadsorbentti Con A-Sepharose (concanavalin A, joka on kovalenttisesti sidottu Sepha-roseen) (Pharmacia, Ruotsi) suspendoidaan liuokseen, jossa on i % Triton X-100, 0,15-m NaCl, 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri). Suspensio viedään 1,6 cm:n (sisäläpimitta) kromatografiapylvääseen, ja sen annetaan laskeutua korkeudelle 3,3 cm. Adsorbentti pestään (20 ml/tunt.i) 20 mltlla 0,2-m b(-metyyl i-D-mannosidia lähtöpuskuris-sa, sitten 2-m NaCl:.llä lähtöpuskur issa ja lopuksi neljällä pylvään tilavuudella lähtöpuskuria.

Uute pumpataan adsorbentille ja adsorbentti pestään 20 ml :11a lähtöpuskuria. Glykoproteiinifraktio eluoidaan adsorbentilta 30 ml:lla 0,2-m o(-metyyli-D-mannosidia lähtöpuskurissa. Adsorboitunut fraktio sisältää 3 tärkeätä ja kuusi vähemmän tärkeätä polypep-tidiä, (kuvio 3), joiden polypeptidien joukossa ovat esim. glyko-proteiinit, joiden molekyylipainot ovat 123 000 ja 60 000 (kuvio 4).

_ — - f 16

e :5 O 2 O

Elektronimikroskoopilla ei voida havaita ehjiä tai hajonneita viruksia tai nukleokapsideja, eikä eläviä viruksia saada eristettyä kudosviljelymenetelmillä.

Esimerkki 5

Esimerkin 1 menetelmä toistettiin muuten paitsi, että uuttoaineena käytettiin 2 % natriumdodekyylisulfaattia, 0,125-m tris-HC1 (pH 6,8) ja 5 % 2-merkaptoetanolia sisältävää liuosta, joka ei sisältänyt natriumkloridia. Koe-eläiminä käytetyt marsut saivat injektiona jokainen 10 μg uutetta, joka sisälsi noin 4 ^g glykoproteiinia. 3 injektion jälkeen 33 %:lla eläimistä todettiin vasta-aineen muodostusta.

Claims (2)

17 6 3 0 2 0

1. Menetelmä antigeenisen, imunogeenisen Herpes simplex tyypin I (HSV1) subunitin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSV1:llä, joka pystyy kasvamaan kudosviljelmällä; b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketukseen ei-ionisen tai unionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoimalla, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan antigeeninen, immunogeeninen HSV-1 subunit, joka sisältää kaksi ryhmää virusten pintaglykoproteiineja, joista ensimmäinen ryhmä käsittää glykoproteiinit, joiden molekyylipaino on noin 123 000 daitonia, ja toinen ryhmä glykoproteiinit, joiden molekyylipaino on noin 60 000 daitonia.

2. Menetelmä antigeenisen, immunoqeenisen Herpes simplex tyypin II (HSV2) subunitin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSV2:lla, joka pystyy kasvamaan kudosviljelmällä; b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketuksiin ei-ionisen tai unionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoima1la, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan antigeeninen, immunogeeninen HSV-2 subunit, jossa on kolme ryhmää virusten pintaglykoproteiineja, joista ensimmäinen ryhmä käsittää suuruusluokkaa 110 000 - 130 000 daitonia olevia glykoproteiineja, toinen ryhmä suuruusluokkaa 83 000 - 90 000 daitonia olevia glyko-proteiineja ja kolmas ryhmä suuruusluokkaa 55 000 - 60 000 daitonia olevia glykoproteiineja. — -· τ~ 18 Patentkrav 6 50 2 0