FI66020C - Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 Download PDFInfo
- Publication number
- FI66020C FI66020C FI782769A FI782769A FI66020C FI 66020 C FI66020 C FI 66020C FI 782769 A FI782769 A FI 782769A FI 782769 A FI782769 A FI 782769A FI 66020 C FI66020 C FI 66020C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cells
- glycoproteins
- extract
- vaccine
- lectin
- Prior art date
Links
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title claims description 32
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims description 23
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 23
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 21
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 8
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 28
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 28
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 10
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 10
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 9
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 8
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 5
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 4
- 235000010666 Lens esculenta Nutrition 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144619 Abrus precatorius Species 0.000 description 1
- 240000007440 Agaricus campestris Species 0.000 description 1
- 235000004570 Agaricus campestris Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000225069 Calyptocephallela gayi Species 0.000 description 1
- 241000220451 Canavalia Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282668 Cebus Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101001022682 Glycine max Lectin Proteins 0.000 description 1
- 108010058611 Helix lectin Proteins 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 229940124841 Herpesvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000219728 Laburnum alpinum Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- JDRAOGVAQOVDEB-MGMRWDBRSA-N O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)CO[C@@H]21 Chemical compound O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)CO[C@@H]21 JDRAOGVAQOVDEB-MGMRWDBRSA-N 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 244000100170 Phaseolus lunatus Species 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 108010036337 Robinia lectin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000046101 Sophora japonica Species 0.000 description 1
- 235000010586 Sophora japonica Nutrition 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 241000492514 Tetragonolobus Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 235000010730 Ulex europaeus Nutrition 0.000 description 1
- 244000104977 Vicia cracca Species 0.000 description 1
- 235000010733 Vicia cracca Nutrition 0.000 description 1
- 101001022688 Vicia faba Favin Proteins 0.000 description 1
- 108010038211 Vicia lectins Proteins 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052599 brucite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 108010039433 dolichos biflorus agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 108010048090 soybean lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 108010043166 wisteria lectin Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
viSr*l ΓβΙ /hv KUUUUTUSjULKAISU .
^8||Γα 1 J ' UTLAGGN INGSSKRIFT 6 6020 • C /45V Patentti r.yonnetty 10 C8 1984
Patent ncddelat (51) Ky.lk?/lnt.a.3 C 12 N 7/04, A 61 K 39/245 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — PttentmMcnlng 782769 . . (22) Hikemlapllvl— Aneeknlnfsdag 1 1 .09.78 (23) Alkupilvt — GUtlghetadag 1 ) .09.78 (41) Tullut |ulkb«lul — Hiivit offentHg on no yq
Patentti· ja rekisterihallitut ' ' _ . . . ,_ (44) NihtivUcalpanon |a kuuLjulkatsun pvm. —
Patent· och registerstyrelten Anaokan utlagd oeh uti.skrtften publicerad 30.04.84 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird priorltet 19.09.77 USA(US) 834598 (71) Merck δ Co., Inc., 126 E. Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey, USA(US) (72) Vivian Larson, Har1eysvi11 e, Pennsylvania, Ernest Dale Lehman, North Wales, Pennsylvania, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä antigeenisten, immunogeenisten HSV-l ja HSV-2 subunitien valmistamiseksi - Förfarande för framstal1 ning av antigeniska, immunogeniska subunits av HSV-1 och HSV-2.
Herpes-viruksia on luonnossa lähes kaikkialla; niiden luonnollisia isäntiä ovat mm. sammakko, kana, hiiri, marsu, kissa, koira, sika, lehmä, hevonen, apxna ja ihminen. Ihminen on luonnollinen isäntä Herpes simplex-tyypille 1 ja 2, varicella/zoster-lajille, sytomegalo- ja Epstein Barr-virukselle (EBV), ja ihminen voi olla tilapäisesti isäntä apinan Herpes B-virukselle, mistä on yleensä vakavat seuraukset. Herpes-virukset aiheuttavat sairauksia, joihin ei ole saatavissa tehokasta ehkäisyä. Herpes simplex tyypit 1 ja 2 ovat antigeenisesti toistensa kaltaisia, mutta aiheuttavat infektioita eri kohtiin. Herpes simplex tyyppi 1 (HSV1 esiintyy suun ja hengityselinten alueella aiheuttaen usein suussa rakkuloita ja haavaumia. Herpes simplex tyyppi 2 (HSV 2) siirtyy sukuelinten välityksellä ja on herpes genitalis- ja neonataalisen herpestaudin aiheuttaja. Näiden virusten merkitystä kroonisen taudin aiheuttajana ei ole selvitetty. On kuitenkin selviä viitteitä siitä, että HSV2:lla ja sukuelinten syövällä on syy-yhteys; tähän ____— ——— - - I ' "" _____ .
O
L·.
6 -:-020 on päädytty (a) seroepidemiologisten löydösten perusteella, (b) osoittamalla kasvainkudoksessa esiintyvän herpes-virusantigeenejä tai virusten nukleiinihappoja ja (c) osoittamalla in vitro erilaisissa soluissa, myös ihmisen soluissa, tapahtuvan muutoksia säteilytettyjen virusten vaikutuksesta.
Herpes-virukset ovat suhteellisen suuria vaipallisia eet-terisensitiivisiä DNA-viruksia. Herpes simplex tyypin 1 virusten on osoitettu tyypillisesti sisältävän kahta vallitsevaa vaippa-glykoproteiinien molekyylipainoryhmää, kun sen sijaan tyypin 2 virusten on osoitettu tyypillisesti sisältävän kolmea vallitsevaa vaippaglykoproteiinien molekyylipainoryhmää. Joitakin näistä gly-koproteiineista on eristetty, ja niiden on osoitettu saavan aikaan neutraloivaa vasta-aineen muodostusta eläimissä.
Herpes-virus-rokotteen, varsinkin ihmisille tarkoitetun rokotteen kehittäminen on osoittautunut ongelmalliseksi. Yleisesti virusrokotteita, jotka voivat sisältää eläviä, heikennettyjä viruksia tai tapettuja, inaktivoituja viruksia, valmistetaan isän-täeläimen kehon nesteessä tai soluviljelmässä olevista viruksista tai niistä saaduista viruskonsentraateista. Herpes-virukset näyttävät kuitenkin yleensä olevan kiinteämmin soluun sitoutuneita kuin useimmat muut virukset eivätkä siten ole irrotettavissa nesteisiin. Lisäksi jotkut tämän ryhmän jäsenistä ovat siksi vaikeasti viljeltäviä, ettei niillä saada rokotteiden suuressa mittakaavassa tapahtuvaan valmistukseen riittävän korkeata virionitasoa. Joidenkin herpes-virusten, kuten HSV2- ja EBV-virusten epäillään olevan kasvaimia aiheuttavia ihmisillä. Rokotteiden valmistus tällaisista viruksista on erityisen ongelmallista, koska rokotteella el saa olla viruksiin liittyvää geneettistä informaatiota, joka pystyy aiheuttamaan syöpää. Myös inaktivoitujen, kokonaisia viruksia sisältävien rokotteiden katsotaan olevan mahdollisesti vaarallisia tässä suhteessa, koska ne sisältävät virusten nukleiinihappoja. Äskettäin virusrokotteiden kehitystyön tuloksena on valmistettu subunit-rokotteita eli "pilkottuja" rokotteita, joista on vähennetty tai poistettu ei-toivottuja isännän tai viruksen komponentteja. Tästä esimerkkinä on influenssa-subunit-rokotteen valmistus infektoidusta kananmunan allantoisnesteestä, jolloin saadaan vähemmän myrkyllinen, pyrogeenivapaa rokote (US-patenttijulkaisu 3 962 421). Tällaisten rokotteiden valmistuksessa ei kuitenkaan ole
6 '5 O 2 O
voitu poistaa ja/tai inaktivoida virusten geneettistä informaatiota, mikä olisi tarpeen virusten mahdollisen syöpää aiheuttavan etiologisen vaikutuksen kannalta.
Kudosviljelmää, joka on infektoitu HSV1:llä tai HSV2:lla, käsitellään viruksen pintaglykoproteiinien uuttamiseksi ja väke-vöimiseksi, niiden erottamiseksi ei-toivotusta materiaalista ja niiden käsittelemiseksi siten, että ne ovat turvallisia rokotteina käytettäviksi.
Menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSVl:llä, joka pystyy kasvamaan kudosvil jelmällä: b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketuksiin ei-ionisen tai anionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoimalla, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan immunogeeninen HSV-1 tai HSV-2 subunit, joista HSV-1 subunit sisältää kaksi ryhmää virusten pintaglykoproteiineja (molekyylipainot: non 123 000 ja noin 60 000 daltonia) ja HSV-2 subunit vastaavasti kolme ryhmää (molekyylipainot: 110 000 - 130 000, 83 000 - 90 000 ja 55 000 - 60 000 daltonia).
Saadut tuotteet ovat käyttökelpoisia HSV1- ja KSV2-rokot-teita. Yleinen menetelmä on sovellettavissa muihin herpes-virus-ryhmän jäseniin, kun viruksia kasvatetaan sille sopivassa isäntä-soi usysteemissä .
Kuvio 1: HSV2-antigeenin, joka eristettiin Lens culinaris-kasvin lektiini-Sepharose-affiniteettikromatografia 11a, polypep-tidikoostumus. Elektroforeesi suoritettiin siten kuin Courtney, McCombs ja Melnick (Virology 43, 356-365, 1971) ovat kuvanneet. Polypeptidit värjättiin Coomassien-sinisellä ja densitometripiir-ros saatiin geelistä mittauksella aaltopituudella 540 nm. Piikkien kohdalla olevat luvut ovat molekyylipainoja.
Kuvio 2: HSV2-antigeenin, joka eristettiin Lens culinaris-kasvin lektiini-Sepharose-affiniteettikromatografiällä, glykopo- 4 6-5020 lypeptidikoostumus. Virusglykoproteiinit merkittiin in vitro li- 3 säämällä ( H)-glykosamiinia infektoituihin soluihin 4 tuntia infektion jälkeen. Elektroforeesi suoritettiin kuten kuviossa 1 kuvattiin ja radioaktiivisuusprofiili saatiin viipaloimalla geeli 2 mm:n segmenteiksi, liuottamalla polyakryyliamidi 30 %:iseen vetyperoksidiin ja mittaamalla radioaktiivisuus nestetuikespektro-metrillä.
Kuvio 3: HSV1-antigeenin, joka eristettiin con-A-Sepharo-se-affiniteettikromatografiällä, polypeptidikoostumus. Elektroforeesi suoritettiin kuvion 1 yhteydessä kuvatulla tavalla.
Kuvio 4: HSV1-antigeenin, joka eristettiin con-A-Sepha-rose-affiniteettikromatografiällä, glykopolypeptidikoostumus. Analyysi suoritettiin kuvion 2 yhteydessä kuvatulla tavalla.
Keksinnön mukaan lähtömateriaalina on Herpes simplex tyypin I tai II viruksilla infektoituja soluja, joita on kasvatettu soluviljelmässä. Solut voivat olla mitä tahansa soluja, joita voidaan infektoida kyseisillä herpes-viruksilla ja jotka pystyvät tuottamaan haluttuja virusantigeenejä ja joita pidetään sopivina rokotteen valmistukseen. Ihmiselle tarkoitettujen HSV1- ja HSV2-rokotteiden tuottamiseen sopiva soluviljelmä on esimerkiksi primaariset kanansikiösolut kasvatettuina yksikerrosviljelmänä pyörivissä pulloissa. Solut infektoidaan HSV1- tai HSV2-viruksilla, joilla on alhainen infektion moninkertaistumista ilmaiseva kerroin (MOI - viruspartikkeleiden lukumäärä solua kohti), kuten suuruusluokkaa noin 0,001 - noin 1,0, edullisesti noin 0,01, oleva kerroin, ja viljelmiä inkuboidaan, kunnes sytopatogeeninen vaikutus on havaittavissa suuressa osassa soluja, tyypillisesti noin 75 %:ssa soluista. Inkubaatiojakson päätyttyä soluviljelyväliaine poistetaan ja soluyksikerros mahdollisesti pestään tasapainotetulla suolaliuoksella. Vaihtoehtoisesti solut voidaan koota vil-jelyastiasta mekaanisesti, pestä tasapainotetulla suolaliuoksella, hajottaa esim. ultraäänikäsittelyllä ja saatu hajotettuja soluja sisältävä suspensio voidaan kirkastaa esim. linkoamalla alhaisella nopeudella. Esillä olevan keksinnön menetelmää virusten membraaniin sidottujen glykoproteiinien liuottamiseksi ja uuttamiseksi viruksella infektoiduista soluista voidaan soveltaa yhtä tehokkaasti edellä kuvattuihin ehjien solujen yksikerrosviljelmiin kuin hajotettujen solu-uutteiden käsittelyyn. Ehjien yksikerrossoluviljel-
5 6 j O 2 O
mien suoralla kemiallisella uutolla on suuren mittakaavan rokote-valmistuksessa käytännön etuja, koska siinä ei tarvitse mekaanisesti poistaa soluja niiden kasvupinnalta. Sen on myös havaittu johtavan parempiin proteiinisaantoihin, koska mekaaniseen solujen kokoamiseen liittyvät fysikaaliset häviöt jäävät pois, ja koska ultraäänikäsittely ja alhaisella nopeudella suoritettu linkoami-nen voidaan jättää pois. Kunnolla säädetyissä olosuhteissa tällä menetelmällä saadaan antigeenisen selektiivisen uuton ansiosta puhtaampia antigeenejä, so. vähemmän DNA:ta tulee uutetuksi verrattuna mekaanisessa talteen otossa ja ultraäänikäsittelyssä mukaan joutuneeseen DNA:hän.
Uutossa käytetty pinta-aktiivinen aine voi olla ei-ioninen tai anioninen. Edullisesti käytetään ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, esimerkiksi polyoksietyleenialkyylifenoleja, kuten poly-oksietyleenioktyylifenolia.
Uuttoon käytetty anioninen pinta-aktiivinen aine voi olla sappihapon suola, esim. natriumdeoksikolaatti, natriumkolaatti tai natriumtaurokolaatti.
Edullinen uutossa käytettävä ei-ioninen pinta-aktiivinen aine on polyoksietyleenialkyylifenoli, jonka alkyyliryhmässä on noin 6 - noin 12 hiiliatomia, esim. Triton X-100 tai Nonidet P-40. Käsitellyllä ei-ionisella pinta-aktiivisella aineella saadaan vi-rusglykoproteiinit uutettua. Kun käsittelyyn käytetään ei-ionista pinta-aktiivista ainetta yhdessä suolan kanssa, jota on läsnä noin 0,1 - noin 2-m riippuen viruksesta, virusglykoproteiinien uutto tehostuu. Suola voi olla alkalisuola, maa--alkalisuo2 o tai kolme-arvoisen kationin suola. Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat KC1, NaCl, MgC^ tai CaC^· Uutto suoritetaan edullisesti neutraalissa pH:ssa, jolloin tarvittaessa voidaan käyttää puskuria, esim. tris-HCl-puskuria. Mukana voidaan haluttaessa käyttää proteolyyt-tistä inhibiittoria, esim. fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Uutto voidaan suorittaa lämpötila-alueella jääkaappiläm-pötilasta inkubaattorin lämpötilaan, so. noin 4 - noin 37°C:ssa noin 15 minuutista useampaan vuorokauteen. Uuttojakso voi jatkua aina siihen asti, kunnes antigeeniaine on pilkkoutunut. Tavallisesti ei kuitenkaan saavuteta mitään etua sillä, että uuttoa jatketaan pitempään kuin parin tunnin ajan. Tyypillisesti uuto suo- 6 65020 ritetaan 20-23°C:ssa 1--4 tunnin aikana uuttoliottimessa, joka sisältää 2-% Triton X-100, 0,15-1-m NaCl, 10-mmol tris HC1, pH 7,5 ja 2-mmol PMSF.
Uutossa saatu neste lingotaan liukenemattomien aineiden poistamiseksi, so. solujätteiden, solutumien ja virusnukleokapsi-dien poistamiseksi. Linkoaminen voidaan suorittaa noin 50 000 x g:ssä tai sen yli ajan jaksona noin 15 minuutista useampaan tuntiin, tyypillisesti 100 000 x g:ssä noin 1 tunnin ajan. Liukoinen uute ei pysty infektoimaan, mutta sisältää jonkin verran ehjää (kaksisäikeistä) DNArta ja RNA:ta. Kaksisäikeinen (ehjä) DNA ja RNA määritetään etidiumbromidikokeella (Karsten et ai., Anal. Bio-chem., 46, 135-148, 1971). Kokeen avulla havaitaan niinkin pienet DNA-määrät kuin 50 ng ja RNA-määrät 100 ng. Kokonais-DNA (yksi-ja kaksisäikeinen DNA ja DNA-fragmentit) mitataan Kissane'n et ai., J. Bioi. Chem., 233, 184-188, 1958, esittämällä menetelmällä, jolla havaitaan niinkin alhaiset määrät kuin 50 ng asti.
Uutosta saatua liukoista materiaalia käsitellään DNA: aasilla jäännös-DNA:n nydrolysoimiseksi, jolloin saadaan tuotetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan ehjää kaksisäikeistä DNA:ta (alle 50 ng/100 /ug proteiinia).
Ei-ionisella pinta-aktiivisella aineella uuttamisen jälkeen saatu liukoinen materiaali on erityisen sopivaa lähtöainetta membraaniin sitoutuneiden herpes-virus-glykoproteiinien kromatografiseen puhdistukseen. Kromatografisesta fraktioinnista pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa on tuloksena virus-glykoproteiini-en rikastuminen, DNA-fragmenttien poisto ja/tai RNA:n ja muiden ei-toivottujen proteiinien väheneminen. Liukoisen materiaalin frak- ' tiointi voidaan suorittaa tunnetulla tavalla anioninvaihtokromato-grafialla. Anioninvaihtajana voi olla esim. DEAE-sellulossa. Jos DNA:aasi-käsittely jätetään pois, niin DEAE-selluloosakromatogra-fialla saadaan tuote, joka ei olennaisesti sisällä kaksisäikeistä DNArta (<50 ng/100 pg proteiinia), mutta saattaa sisältää jäännöksenä kokonais-DNA:ta (1 pg/100 ^ug proteiinia) Edullisimmin liukoinen materiaali fraktioidaan affiniteettikromatografisesti immobili-soidulla lektiinilla tunnetulla tavalla. Lektiinit ovat soluja agglutinoivia proteiineja, joita esiintyy yleisimmin palkokasvien siemenissä, mutta myös kasvin muissa osissa ja myös muissa kuin palkokasveissa sekä eläimissä. Lektiinit aiheuttavat agglutinaation 6 '3 0 2 0 sitomalla hiilihydraatteja solun pinnalle, ja tämän ominaisuuden vuoksi niitä voidaan käyttää hiilihydraatteja sisältävien makromolekyylien, kuten glykoproteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen. Käytettäessä lektiinejä glykoproteiinien puhdistusreagenssina ne tehdään yleensä liukenemattomiksi ja immobilisoidaan sitomalla kovalenttisesti inerttiin matriisiin, kuten dekstraaneihin, aga-roosiin, selluloosaan tms. Edullisesti lektiini immobilisoidaan pylväässä.
Lektiineistä voidaan mainita esimerkkeinä Lens culinaris lektiini, Concanavalin A (Canavalia enisformis lektiini), soija-papuagglutiniini (Glycine max lektiini), vehnäalkioagglutiniini, Dolichos biflorus lektiini, Loktus tetragonolobus lektiini, Phase-olus lunatus lektiini, Phaseolus vulgaris lektiini, maapähkinä-iektiini, Pisum sativum lektiini (palkohernelektiini), Vicia gra-minea lektiini, Robinia pseudoacacia lektiini, Vicia faba lektiini, Ulex europeus lektiini, Vicia cracca lektiini, Solanum tuberosum lektiini (perunalektiini)f Abrus precatorius lektiini, Triticum vulgaris lektiini (vehnälektiini) , Momordia charantia lektiini, Agaricus campestris lektiini, Sesanum insicum lektiini, Helix po-matia lektiini (viinitarhaetanalektiini), Wisteria floribunda lektiini, Laburnum alpinum lektiini, Sophora japonica lektiini, Phaseolus limensis lektiini ja Limulus polyphemus lektiini (mo-lukkirapu lektiini). HSV2:lle edullinen lektiini on Lens culinaris lektiini ja HSV1:lle edullinen lektiini on Concanavalin A. Lek-tiiniaffiniteettikromatografoinnin jälkeen tuote ei olennaisesti sisällä kaksisäikeistä eikä kokonais-DNA:ta (<50 ng/100 ^g pro-teniinia) ja ilman DNA:aasi-käsittelyäkin se ei sisällä havaittavaa määrää RNA:ta (<100 ng/100 pg proteiinia).
Immobilisoiduilla lektiineillä eristettyä virus-subunitia voidaan haluttaessa käsitellä aineella, joka pystyy adsorboimaan adsorbentista mahdollisesti irronneen lektiinin. Tällainen materiaali voi olla polymeroitua dekstraania, esimerkiksi Sephadex-geeliä.
Virussuunnatut glykoproteiinit, jotka on eristetty joko ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiällä, voidaan edelleen puhdistaa ja erottaa adsorboimalla kalsiumfosfaattia sisältäville adsorbenteille, esim. brusiitille (CaHPO^.2^0) tai edullisemmin hydroksyyliapatiitille /^JCa^Q (PO^ ) g ) OH) . Adsorptiokromatograf ia ___ - Γ~ ‘ -— 8 ό -5020 suoritetaan tuunetulla tavalla pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa.
Anioninvaihtohartsikäsittelystä tai affiniteettikromatogra-fiakäsittelystä immobilisoidulla lektiinillä saatu virus-subunit-antigeeni ei sisällä haviattavaa määrää kaksisäikeistä DNA:ta, ja sitä voidaan käyttää rokotteena neutraloivien vasta-aineiden ja soluvälitteisten immuuvasteiden aikaansaamiseksi ja laboratorioeläin-ten suojaamiseen herpes-viruksen aiheuttamaa halvausta ja kuolemaa vastaan. Lekt.iiniadsorption avulla eristetty virus-subunit ei sisällä edellä mainituilla kokeilla todettavaa DNA:ta tai RNA:taf kun taas anioninvaihtajalle adsorboitu virus-subunit sisältää noin 1 % kokonais-DNA-fragmentteja tai RNA:ta.
Virus-subunit-rokote voidaan steriilisuodattaa ja se voidaan mahdollisesti turvallisuussyistä inaktivoida, kuten esim. kuumentamalla, UV-säteilyllä, DNA:aasilla, formaliinilla tai natriumetyyli-merkuritiosalisylaatilla. Virus-subunit-rokotteen immunointitehoa voidaan vahvistaa adsorboimalla virus-subunit-antigeeni alunalle tai käyttämällä muita immunologisia adjuvantteja. Rokotekäyttöön virus-subunit-antigeenit eivät saa olennaisesti sisältää pinta-aktiivista ainetta. Adsorboiminen alunalle on sopiva keino mahdollisen sitoutumattoman pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi.
Keksinnön mukaista rokotetta voidaan haluttaessa käyttää yhdessä rokotteen valmistuksessa tavanomaisten stabiloijien ja ro-koteadjuvanttien kanssa. Tyypillisiä stabiloijia ovat esimerkiksi gelatiini, kaseiini ja albumiini. Adjuvanteista esimerkkinä on aluna. Adjuvanttikoostumus voidaan valmistaa maapähkinäöljystä, iso-mannidi-mono-oleaatista ja aluminiummonostearaatista. Keksinnön mukaista rokotetta voidaan varastoida jäähdytettynä, jäädytettynä tai lyofilisoituna. Antigeenit ovat imettäväisiäjeille immunogeeni-sia ja niitä voidaan käyttää rokotteina. Ne aiheuttavat vasta-aineiden muodostusta marsuissa, marakateissa ja Cebusapinoissa, kissoissa ja ne suojaavat kuolettavia homologisia viruksia vastaan hiirillä.
Farmakologiset kokeet A. Kolmelle ryhmälle marsuja annettiin lihaksensisäisenä in jektiona 4 viikon väliajoin 1,0 ml annos erilaisia määriä keksinnön mukaisesti valmistettuja HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvan-tilla. Seuraavassa taulukossa I on ilmoitettu eri eläinryhmille annetut annokset injektiokertaa kohti sekä niiden eläinten lukumäärä koko ryhmästä, joilla oli vasta-aineen muodostusta 0, 28, 56 ja 84 vrk kuluttua.
9 6 502 0
Taulukko I
Rvhma Rokoteannos [Niiden eläinten lukumäärä, joilla oli vasta-(pg/ml) aineen muodostusta (päivä no.) ! _0 | 28__56 | 84 j jA 10 0/12 | 9/12 12/12 j 12/12 | 'B 1 I 0/12 | 1/10 6/10 10/10 ! C 0,1 ! 0/12 I 0/12 j 0/12 ! 3/11 i
Kaikilla marsuilla oli merkitsevää vasta-aineen muodostusta kahden 10 jugtn rokoteannoksen jälkeen ja kolmen pg:n rokoteannoksen jälkeen.
B. Kolmelle hiiriryhmälle (20 hiirtä ryhmää kohti) annettiin injektiona intraperitoneaalisesti kaksi kertaa 4 viikon välein 0,5 ml keksinnön mukaisesti valmistettua HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla tai vastaavasti plasebo-rokotetta. 2 viikon kuluttua viimeisestä rokoteinjektiosta eläimiin infektoitiin jalkapohjan kautta eläviä HSV2-viruksia. Seuraavassa taulukossa on kullekin eläinryhmälle kullakin injektiokerralla annetun annoksen suuruus sekä niiden eläinten lukumäärä koko ryhmän lukumäärästä, jotka kuolivat infektoinnin jälkeen, keskimääräinen hengissä pysymysaika ja rokotteella saatu suojavaikutus.
Taulukko II
Ryhmä ! Rokote- [Niiden hiirien lukumäärä,jotka j Keskimääräinen, Suojavaikutus annos .kuolivat HSV2 infektoinnin jäi- i hengissäpysy- ; 28 vrk:n ku-:(pg/0,05ml)keen (päivä no.)_ ! misaika (vrk) luttua (mer- _|__0 | 7 j 14 21 I 28 |__, kitsevyys) , ! j A 40 0/20 ; 0/20 | 2/20 j 5/20 I 7/20 ΐ 26 62 %(p=0,0008)! B 10 .0/20 | 0/20 I 1/20 | 8/20 j 8/20i 26 50 %(p=0,0022): C* 0 0/20 : 0/20 j16/20 ;18/20 | 18/20' 12 =__1 I 1 : ;__; ♦plasebo
Yli 50 % eläimistä, jotka saivat kaksi kertaa rokotetta an-nostasoilla 10 tai 40 jug, säilyi hengissä, kun sensijaan plasebo-rokotetta saaneet eläimet kuolivat kaikki. Lisäksi hengissäpysymys-aika kasvoi. rokotteen vaikutuksesta yli kaksinkertaiseksi.
___=. - Γ" "... .......
10 6 '502 0 C. Kolmelle niiriryhmälle (20 eläintä ryhmää kohti) annettiin injektiona intraperitoneaalisesti kaksi kertaa 4 viikon välein 0,5 ml rokotetta, joka sisälsi erilaisia määriä HSV2-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla, tai vastaavasti plasebo-rokotetta. Kahden viikon kuluttua viimeisestä rokote-injektiosta eläimiin infektoitiin eläivä HSV2-viruksia intrakerebraalisesti. Seuraavasta taulukosta III nähdään eri hiiriryhmille kullakin injektiokerralla annettu annos. Henkiin jääneiden eläinten lukumäärä ryhmässä koko ryhmän lukumäärään verrattuna, keskimääräinen hengissäpysymysaika ja rokotteella saatu suojavaikutus.
Taulukko III
Ryhmä Rokote- iNiiden hiirien lukumäärä, Keskimääräinen Suojavaikutus annos jjotka kuolivat HSV2 infektoin- hengissäpysy- 21 vrk:n ku- (pg/0,5 ml) |nin jälkeen (päivä no.)_ misaika luttua(merkit- '__:_! 0 ~ 7 | 14 21 ^____sevyys)__ 1 ' 1 ! i A 40 I 0/20 2/20 ! 5/20 : 7/20 ; 16 65 %(p>0,0001) i B ! 10 , 0/20 ' 5/20 | 10/20 11/20 ’ 13 45 %(p>0,0012) ' C* 0 0/20 10/20 I 17/20 20/20 8 -:-1-:----1 *plasebo
Yli 50 % niistä eläimistä, jotka saivat rokoteannoksen 40 /ug, säilyi hengissä kun sensijaan plasebo-rokotetta saaneet eläimet kuolivat kaikki. Hengissäpysymisaika kasvoi keskimäärin kaksinkertaiseksi. Rokoteannoksella 10 ^ug saatiin myös suojavaikutus, joka oli kuitenkin vähäisempi.
D. Kahdelle ryhmälle karvattomia hiiriä (HRS-hiiriä) annettiin intraperitoneaalisesti injektiona 4 viikon välein 0,5 ml keksinnön mukaisesti valmistettua 20 jug HSV2-subunit-rokotetta aluna-ad juvan--tilla tai vastaavasti plasebo-rokotetta. Kahden viikon kuluttua viimeisestä rokoteannoksesta eläinten naamaan infektoitiin raaputtamalla eläviä HSV1-viruksia. Ihovauriot infektiokohdassa, kuolleisuus ja latentti kolmoishermoganglioinfektio on esitetty seuraa-vassa taulukossa IV.
11
6 :5 O 2 O
Taulukko IV
HSV1 infektoinnin vaikutukset ——--:-1--:--: iRokote |lhovauriot Kuolleisuus Latentti, kolmoishermo- i j(päivä 6) (päivä 21) ganglioinfektio |__j____(päivä 21-23)_ HSV2 rokote i ; (20 /jg annos)1; 4/19 0/19 1/19
Plasebo 1 38/40 8/40 ! 24/32 j ; ! ....... - ______ »___»
Verrattuna plasebo-rokotetta saaneiden eläinten ryhmään esiintyi HSV2-subunit-rokotetta saaneilla eläimillä heterologisen HSV1-infektoinnin aiheuttamana selvästi vähemmän ihovaurioita (p<0,0001), tai latenttia ganglioinfektiota (p<0,0001), ja eläinten kuolleisuus oli alhaisempi (p<0,0009).
E. Kolmelle ryhmälle marsuja (12 eläintä ryhmää kohti) annettiin lihaksensisäisenä injektiona 4 viikon välein 1,0 ml eri suuruisia annoksia keksinnön mukaisesti valmistettua HSV1-subunit-rokotetta aluna-adjuvantilla. Seuraavassa taulukossa V on esitetty eri ryhmille kulloinkin annetut annokset, niiden eläinten lukumäärä koko ryhmästä, joilla esiintyi vasta-aineen muodostusta 0, 28, 56 ja 84 vrk:n kuluttua.
Taulukko IV
iRyhmä ι Rokoteannos Niiden eläinten lukumäärä, joilla oli ! I tyig/ml) vasta-aineen muodostusta__ j___päivä 0 päivä 28 päivä 56 päivä 84 j ! A 10 0/12 12/12 12/12 ! 12/12 \
i I
B j 1 ! 0/12 8/12 i 10/101 12/12 .
I c ! 0,1 j 0/12 3/12 : 6/12 12/12 i , i ,___:__i_i_!__ kahdella eläimellä ei suoritettu koetta _____ ____ - τ~.
12 6 5 0 2 0
Kaikilla marsuilla oli rokoteannoksella 10 pg vasta-aineen muodostusta yhden annoksen jälkeen ja rokoteannoksella 1 pg kahden annoksen jälkeen sekä annoksella 0,1 pg kolmen annoksen jälkeen.
Rokotteen valmistus
Esimerkissä 4 valmistettua tuotetta sisältävää fosfaattipus-kuroitua suolaliuosta (800 ml, 100 pg/ml esimerkin 4 tuotetta) sekoitettiin dekantterissa. Liuokseen lisättiin hitaasti 68 ml 10-%:sta alunaliuosta (A1K(SO^)^ ·12^0) ja samanaikaisesti tipoittain 1-n NaOH-liuosta siten, että suspension pH pysyi arvossa alle 5,2.
Alunan lisäämisen päätyttyä suspension pH säädettiin 10-n NaOH-liuoksella arvoon 6,8. Suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1-2 tuntia, sitten suspensio siirrettiin sopiviin sentrifugipulloi-hin, ja suspensiota lingottiin 10 minuuttia 270 x g:ssä. Neste dekan-toitiin ia heitettiin menemään, pelletti suspendoitiin pyrogeeni-vapaaseen fysiologiseen suolaliuokseen siten, että saadun suspension tilavuus oli sama kuin alkuperäisen antigeeniliuoksen.Triton^L-lOOrn konsentraation saamiseksi mahdollisimman alhaiseksi voidaan alunalle adsorboitu rokote pestä 1-2 kertaa suolaliuoksella ennen uudelleen suspendoimista.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.
Esimerkki 1 HSV2:n Curtis-kanta saatiin tri A.J.Nahmias'ilta, Emory University, Atlanta, Georgia, ja sille oli suoritettu 3 pasasointia primaarisissa kaniinin munuaissoluissa. Virukselle suoritettiin vielä 3 pasasointia kaniinin munuaissoluissa ja sitten se adaptoitiin 8:11a peräkkäisellä pasasoinnilla kanan sikiösoluilla.
11 vuorokautta haudotuista, leukoosia sairastamattomien kanojen munista saadut kanan sikiöt trypsinoidaan, ja saatu yksisolu-suspensio viedään pyöriviin pulloihin väliaineeseen 199, joka sisältää 2 % vasikansikiöseerumia ja 50 pg/ml neomysiiniä ja pyöriviä-pulloja inkuboidaan 36°C:ssa.
Neljäntenä päivänä yksikerrosviljelmät infektoidaan HSV2-viruksella (MOI = 0,01, adsorptioaika 2 tuntia). Infektoituja viljelmiä inkuboidaan 34°C:ssa pyörivissä myllyissä, kunnes noin 75 %:ssa soluista havaitaan sytopaattinen vaikutus, so. noin 44-48 tuntia.
Viljelvväliaineen päällä oleva neste heitetään pois ja yksikerrosvil jelmät pestään varovasti (3 x 50 ml) PBS:llä samalla pyörittäen pyörivää myllyä kaiken vasikansikiöseerum.in poistamiseksi.
13
o -5 O 2 O
Pesun jälkeen pulloihin, joita pyöritetään myllyssä 20-23°C:ssa, lisätään liuosta, jossa on 2 % Triton X-100, 1-m NaCl, 50 mmol tris-HCl, pH 7,5, 2 mmol PMSF ja 4,75 % etanolia ja uutetaan 30 minuutin ajan. Uute kootaan, astiat pestään uudella liuoksella ja pesuneste lisätään alkuperäiseen uutteeseen. Yhdistettyä solu-uutetta pidetään 20-23°C:ssa vähintään tunnin ajan, joka aika lasketaan alkavaksi liuoksen ensimmäisestä lisäyksestä soluviljelmäpulloihin, sitten solu-uute lingotaan 105 000 g:ssa tunnin ajan 20-23°C:ssa.
Päällä olevan nesteen pH säädetään 7,0:ksi, siihen lisätään MgCl2:a lopulliseen pitoisuuteen 0,005-m, ja härän haimasta valmistettua deoksiribonukleaasia (1 mg/ml deionoidussa vedessä) lopulliseen pitoisuuteen 50 pg/ml. Seosta inkuboidaan 20-23°C:ssa 4 tuntia. Seoksessa ei ole tällöin käytännöllisesti katsoen lainkaan vapaata ehjää (kaksisäikeistä) DNA:ta.
Seos fraktioidaan Lens culinaris lektiini-affiniteettipyl-väässä. Lens culinaris lektiini-Sepharose-affiniteettiadsorbentti valmistetaan sitomalla kovalenttisesti tunnetulla tavalla Lens culinaris lektiini CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia, Ruotsi) tai aktivoituun Sepharose 4B:hen tai aktivoituun CH-Sepharose 4B:hen. Adsorbentti suspendoidaan liuokseen, jossa on 1 % Triton X-100, 1,0-m NaCl, 50 mmol tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri) ja kaadetaan kromato-grafiapylvääseen; adsorptiokerroksen lopulliset mitat ovat 2,6 cm (sisäläpimitta) x 10 cm (kerroksen tilavuus 53,1 ml). Adsorbentti pestään 250 ml:11a 0,2-m <X-metyyli-D-mannosidia lähtÖpuskurissa ja tämän jälkeen vähintään viidellä pylvään tilavuudella lähtöainepusku-ria. Valumisnopeus pylväässä säädetään peristalttipumpun avulla 100 ml:ksi/tunti.
Seos pumpataan adsorbenttipylvääseen ja pylväs pestään sitten viidellä pylvään tilavuudella lähtÖpuskuria. Tämän jälkeen virus-suunnatut glykoproteiinit desorboidaan pylväästä viidellä pylvään tilavuudella 0,2-m 0(’-metyyli-D-mannosidia lähtÖpuskur issa. Fraktio, johon glykoproteiini on rikastettu sisältää pääasiassa 6 polypepti-diä ja lisäksi vähäisiä määriä 5-8 muuta polypeptidiä (ks. kuvio 1 ja 2 joissa on kolme glykoproteiiniryhmää: noin 110 000-130 000 dalto-nia; noin 83 000-90 000 daltonia ja noin 55 000-60 000 daltonia).
Tämä fraktio sisältää ζ 50 ng DNA:ta ja <100 ng RNA:ta per 100 pg proteiinia. Elektronimikroskoopilla ei voida havaita ehjiä tai hajonneita viruksia eikä nukleokapsideja, eikä kudosviljelymenetelmällä saatu eristettyä eläviä viruksia.
_ __ - _ 1 14 6 5 0 2 0
Lens culinaris Lektiini-Sepharose-pylväästä saatu glykoprote-iinifraktio kromatografoidaan pienessä, polymeroitua dekstraania, so. Sephadex G-50 sisältävässä pylväässä mahdollisen affiniteettiadsor-bentista irronneen lektiinin poistamiseksi ja adsorboitumaton fraktio otetaan talteen. Tämä käsittely ei ole välttämätön ja se voidaan jättää väliin.
Adsorboitumaton HSV2-glykoproteiinifraktio steriilisuodate-taan Nuclepore-suotimella <huokoskoko 0,2 μ, Nucleopore (corp. USA) ja laimennetaan sopivaan konsentraatioon steriilillä, pyrigeeni-vapaalla, fysiologisesti hyväksyttävällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Liuokseen lisätään mahdollisesti formaliinia pitoisuuteen 100 pg/ml ja seosta inkuboidaan 72 tuntia 36°C:ssa sen varmistamiseksi, ettei läsnä ole enää infektiokykyisiä HSV2:n jäännöksiä ja mahdollisen jäljelle jääneen yksisäikeisen DNA:n inaktivoimiseksi.
Esimerkki 2
Esimerkin 1 menetelmä toistetaan muuten paitsi, että infektoidut solut poistetaan mekaanisesti viljelyastioista ja pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), sp. liuoksella, jossa on 0,15-m NaCl, 0,0063-m natriumfosfaattia, pH 7,2. Pestyt solut suspendoidaan jälleen pyrogeenivapaaseen tislattuun veteen solupi-toisuuteen noin 1-2 x 10^ solua/ml ja solut hajotetaan ultraääni-käsittelyllä (3 kierrätystä nopeudella 150 ml/min) käyttäen lämmön-vaihdinta lämpötilan pitämiseksi noin 4°C:ssa. Hajotetut solut lin-gotaan 800 g:ssä 20 minuuttia 4°C:ssa ja päällä olevat nesteet yhdistetään. Päällä olevaan nesteeseen lisätään Triton X-100:aa 2 %,
NaCl 1,0-m, tris-HCl, pH 7,5, 50-mmol, PMSF:ää 2-mmol, ja etanolia 4,75 % (PMSF:n liuottamiseksi) ja Lowry-proteiinia noin 2 mg/ml.
Seos suspendoidaan kudoshomogenisaattorilla 20-23°C:ssa tunnin ajan aina välillä homogenoiden, sitten se lingotaan 105 000 g:ssä tunnin ajan 20-23°C:ssa. Päällä oleva neste kootaan ja sen jatkokäsittely on sama kuin esimerkissä 1.
Esimerkki 3
Esimerkin 1 ja esimerkin 2 menetelmä toistetaan muuten paitsi, että Lens culinaris lektiini-affiniteettikromatografiän sijasta käytetään DEAE-selluloosakromatografiaa ja Sephadex G-50 kromatografia jätetään pois. Triton X-100 uutteen päällä oleva neste dialysoidaan liuosta vastaan, jossa on 1 % Triton X-100, 10 mmol tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri) 4°C:ssa. Dialysoitu uute viedään DEAE-selluloosapyl-vääseen, joka on tasapainotettu lähtöpuskurilla ja kromatografoidaan 15 6-3020 4°C:ssa. Kun koko näyte on lisätty pylvääseen, pylväs pestään lähtö-puskurilla adsorboitumattoman proteiinin poistamiseksi, ja adsorboituneet proteiinit eluoidaan 0-0,6-m NaCl-gradientilia lähtöpuskuris-sa. 25-200 mmclaariset NaCl-fraktiot sisältävät eniten glykoproteii-nia ja ne yhdistetään. Yhdistetyissä fraktioissa ei voida havaita kaksisaikeistä DNA:ta, mutta se sisältää noin 1 % yksisäikeistä DNA:ta tai DNA-fragmentteja ja 1-3 % RNA:ta. Se sisältää > 30 poly-peptidiä molekyylipainoalueella 17 000-322 000. Fraktiot sisältävät kolme ryhmää glykoproteiineja: noin 110 000-130 000 daltonia; noin 83 000-90 000 daltonia ja noin 55 000-60 000 daltonia. Fraktiossa ei voida elektronimikroskoopilla havaita ehjiä tai hajonneita viruksia tai nukleosideja, eikä eläviä viruksia voida eristää kudosviljely-menetelmil1ä.
Esirnerkki 4
Valmistetaan Herpes simplex tyypin 1 (HSV1) infektoituja soluja muuten samoin kuin esimerkissä 1, paitsi käyttämällä HSVlctä HSV2:n sijasta. Infektoidut solut otetaan talteen esimerkissä 2 kuvatulla tavalla paitsi, että ultraäänikäsiteltyjen solujen alhaisella kierrosluvulla ljngotusta liemestä saatu päällä oleva neste lingotaan 105 000 g:ssä tunnin ajan 4°C:ssa viruksen konsentroimiseksi ja että Triton X-100-uuttoliuos, johon saatu viruspelletti suspendoidaan, sisältää 0,15-m NaCl eikä 1,0-m kuten HSV2:lla. Saatu uute fraktioidaan 1ektiini-concanavalin A:11a seuraavasti:
Kaupallisesti saatavana oleva affiniteettiadsorbentti Con A-Sepharose (concanavalin A, joka on kovalenttisesti sidottu Sepha-roseen) (Pharmacia, Ruotsi) suspendoidaan liuokseen, jossa on i % Triton X-100, 0,15-m NaCl, 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5 (lähtöpuskuri). Suspensio viedään 1,6 cm:n (sisäläpimitta) kromatografiapylvääseen, ja sen annetaan laskeutua korkeudelle 3,3 cm. Adsorbentti pestään (20 ml/tunt.i) 20 mltlla 0,2-m b(-metyyl i-D-mannosidia lähtöpuskuris-sa, sitten 2-m NaCl:.llä lähtöpuskur issa ja lopuksi neljällä pylvään tilavuudella lähtöpuskuria.
Uute pumpataan adsorbentille ja adsorbentti pestään 20 ml :11a lähtöpuskuria. Glykoproteiinifraktio eluoidaan adsorbentilta 30 ml:lla 0,2-m o(-metyyli-D-mannosidia lähtöpuskurissa. Adsorboitunut fraktio sisältää 3 tärkeätä ja kuusi vähemmän tärkeätä polypep-tidiä, (kuvio 3), joiden polypeptidien joukossa ovat esim. glyko-proteiinit, joiden molekyylipainot ovat 123 000 ja 60 000 (kuvio 4).
_ — - f 16
e :5 O 2 O
Elektronimikroskoopilla ei voida havaita ehjiä tai hajonneita viruksia tai nukleokapsideja, eikä eläviä viruksia saada eristettyä kudosviljelymenetelmillä.
Esimerkki 5
Esimerkin 1 menetelmä toistettiin muuten paitsi, että uuttoaineena käytettiin 2 % natriumdodekyylisulfaattia, 0,125-m tris-HC1 (pH 6,8) ja 5 % 2-merkaptoetanolia sisältävää liuosta, joka ei sisältänyt natriumkloridia. Koe-eläiminä käytetyt marsut saivat injektiona jokainen 10 μg uutetta, joka sisälsi noin 4 ^g glykoproteiinia. 3 injektion jälkeen 33 %:lla eläimistä todettiin vasta-aineen muodostusta.
Claims (2)
1. Menetelmä antigeenisen, imunogeenisen Herpes simplex tyypin I (HSV1) subunitin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSV1:llä, joka pystyy kasvamaan kudosviljelmällä; b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketukseen ei-ionisen tai unionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoimalla, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan antigeeninen, immunogeeninen HSV-1 subunit, joka sisältää kaksi ryhmää virusten pintaglykoproteiineja, joista ensimmäinen ryhmä käsittää glykoproteiinit, joiden molekyylipaino on noin 123 000 daitonia, ja toinen ryhmä glykoproteiinit, joiden molekyylipaino on noin 60 000 daitonia.
2. Menetelmä antigeenisen, immunoqeenisen Herpes simplex tyypin II (HSV2) subunitin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kudosviljelmän solut infektoidaan HSV2:lla, joka pystyy kasvamaan kudosviljelmällä; b) infektoitua kudosviljelmää inkuboidaan, kunnes solujen pääosalla havaitaan sytopaattinen vaikutus; c) infektoidut solut saatetaan kosketuksiin ei-ionisen tai unionisen pinta-aktiivisen aineen kanssa, jolloin saadaan uute; d) olennaisesti kaikki uutteessa oleva ehjä kaksisäikeinen DNA hydrolysoidaan; ja e) uute fraktioidaan kromatografoima1la, käyttäen edullisesti ioninvaihto- tai affiniteettikromatografiaa, jolloin saadaan antigeeninen, immunogeeninen HSV-2 subunit, jossa on kolme ryhmää virusten pintaglykoproteiineja, joista ensimmäinen ryhmä käsittää suuruusluokkaa 110 000 - 130 000 daitonia olevia glykoproteiineja, toinen ryhmä suuruusluokkaa 83 000 - 90 000 daitonia olevia glyko-proteiineja ja kolmas ryhmä suuruusluokkaa 55 000 - 60 000 daitonia olevia glykoproteiineja. — -· τ~ 18 Patentkrav 6 50 2 0
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83459877A | 1977-09-19 | 1977-09-19 | |
| US83459877 | 1977-09-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI782769A7 FI782769A7 (fi) | 1979-03-20 |
| FI66020B FI66020B (fi) | 1984-04-30 |
| FI66020C true FI66020C (fi) | 1984-08-10 |
Family
ID=25267310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI782769A FI66020C (fi) | 1977-09-19 | 1978-09-11 | Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0001365B2 (fi) |
| JP (1) | JPS5484024A (fi) |
| CA (1) | CA1114294A (fi) |
| DE (1) | DE2862086D1 (fi) |
| DK (1) | DK411878A (fi) |
| FI (1) | FI66020C (fi) |
| IE (1) | IE47364B1 (fi) |
| IT (1) | IT1110864B (fi) |
| NO (1) | NO153692C (fi) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374127A (en) * | 1977-09-19 | 1983-02-15 | Merck & Co., Inc. | Herpes sub unit vaccine |
| US4452734A (en) * | 1980-02-11 | 1984-06-05 | Merck & Co., Inc. | Herpes subunit vaccine |
| FR2483779A1 (fr) * | 1980-06-05 | 1981-12-11 | Synthelabo | Procede pour isoler des antigenes glycoproteiques viraux et son application a la preparation de vaccins |
| US4317811A (en) * | 1980-09-11 | 1982-03-02 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type 1 subunit vaccine |
| US5219567A (en) * | 1982-03-24 | 1993-06-15 | The University Of Birmingham | Vaccine against herpes viruses |
| IL68219A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Univ Birmingham | Vaccine against dna viruses |
| CA1201987A (en) * | 1982-03-24 | 1986-03-18 | Gordon R.B. Skinner | Vaccine against dna viruses |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| NZ209307A (en) * | 1983-08-30 | 1990-07-26 | Genentech Inc | Diagnostic product: antigenic peptide produced by recombinant dna techniques |
| US7264817B1 (en) | 1983-08-30 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it |
| JPS6051120A (ja) * | 1983-08-31 | 1985-03-22 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニットワクチン |
| JPS6153226A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-03-17 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
| EP0312164A1 (en) * | 1987-10-16 | 1989-04-19 | Merck & Co. Inc. | Purification of recombinant epstein-barr virus antigens from vero cells, yeast cells or L cells |
| US5081010A (en) * | 1989-02-09 | 1992-01-14 | Eastman Kodak Company | Extraction composition, test kit and their use to extract or determine herpes simplex viral antigen |
| DE4033446A1 (de) * | 1990-10-20 | 1992-04-23 | Bayer Ag | Impfstoffe gegen equine herpesviren und ihre herstellung |
| US5334503A (en) * | 1991-10-08 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Test kit and method for the detection of microorganisms associated with periodontal diseases using surfactant mixture as extraction composition |
| WO2019086463A1 (en) | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Baxalta GmbH | Environmentally compatible detergents for inactivation of lipid-enveloped viruses |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3962421A (en) * | 1973-06-18 | 1976-06-08 | American Home Products Corporation | Method for the disruption of lipid-containing viruses |
-
1978
- 1978-09-11 FI FI782769A patent/FI66020C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-09-13 CA CA311,199A patent/CA1114294A/en not_active Expired
- 1978-09-14 DE DE7878400098T patent/DE2862086D1/de not_active Expired
- 1978-09-14 EP EP19780400098 patent/EP0001365B2/en not_active Expired
- 1978-09-15 IT IT5111678A patent/IT1110864B/it active
- 1978-09-18 NO NO783143A patent/NO153692C/no unknown
- 1978-09-18 IE IE1880/78A patent/IE47364B1/en unknown
- 1978-09-18 DK DK411878A patent/DK411878A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-09-19 JP JP11420278A patent/JPS5484024A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO153692B (no) | 1986-01-27 |
| IT7851116A0 (it) | 1978-09-15 |
| EP0001365B2 (en) | 1987-09-23 |
| DE2862086D1 (en) | 1982-12-16 |
| EP0001365A1 (en) | 1979-04-04 |
| EP0001365B1 (en) | 1982-11-10 |
| NO783143L (no) | 1979-03-20 |
| JPS5484024A (en) | 1979-07-04 |
| DK411878A (da) | 1979-03-20 |
| CA1114294A (en) | 1981-12-15 |
| IE47364B1 (en) | 1984-03-07 |
| NO153692C (no) | 1986-05-07 |
| FI66020B (fi) | 1984-04-30 |
| IT1110864B (it) | 1986-01-06 |
| FI782769A7 (fi) | 1979-03-20 |
| IE781880L (en) | 1979-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI66020C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 | |
| US4452734A (en) | Herpes subunit vaccine | |
| Morein et al. | Effective subunit vaccines against an enveloped animal virus | |
| KR100703571B1 (ko) | 인플루엔자에 대한 펩티드-기초 백신 | |
| KR100186783B1 (ko) | 적혈구와 표면-결합된 항원을 포함하는 경구용 백신 | |
| US4374127A (en) | Herpes sub unit vaccine | |
| Meignier et al. | Immunization of experimental animals with reconstituted glycoprotein mixtures of herpes simplex virus 1 and 2: protection against challenge with virulent virus | |
| Lin et al. | Absence of M protein in a cell-associated subacute sclerosing panencephalitis virus | |
| JP2002186494A (ja) | 組換えワクシニアウイルス | |
| KR20200040899A (ko) | 헨드라 및 니파 바이러스 ｇ 당단백질 면역원성 조성물 | |
| CA1244766A (en) | Herpes simplex virus subunit vaccine | |
| US4317811A (en) | Herpes simplex type 1 subunit vaccine | |
| Kaaden et al. | Vaccination against Marek's disease: Immunizing effect of purified turkey herpes virus and cellular membranes from infected cells | |
| Klein et al. | Efficacy of a virion envelope herpes simplex virus vaccine against experimental skin infections in hairless mice | |
| Klockmann et al. | Preclinical investigations of the safety, immunogenicity and efficacy of a purified, inactivated tick-borne encephalitis vaccine | |
| US4322404A (en) | Process for the production of new mutants of herpes simplex virus type 1 and type 2 | |
| Epstein | Vaccination against Epstein-Barr virus: current progress and future strategies | |
| Wiktor et al. | Localized rabies infection in mice | |
| EP0413637A1 (en) | Attenuated live hepatitis A vaccine (H2 Strain) and its method of preparation | |
| JPH10512151A (ja) | Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物 | |
| WO2005014803A1 (ja) | 西ナイルウイルスワクチン | |
| US4540669A (en) | Herpes simplex type I subunit vaccine | |
| CN1621417A (zh) | 一种抗SARS－CoV IgY抗体及其制备方法 | |
| Rager-Zisman et al. | Therapy of a fatal murine cytomegalovirus infection with thymic humoral factor (THF-γ2) treated immune spleen cells | |
| KR0135614B1 (ko) | 약독화 수두 생바이러스 백신 및 그의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC | Name/ company changed in patent |
Owner name: KONINKLIJKE PHILIPS ELECTRONICS N.V. |
|
| TC | Name/ company changed in patent |
Owner name: KONINKLIJKE PHILIPS ELECTRONICS N.V. |
|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MERCK & CO., INC. |