NO153692B - Fremgangsmaate ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (hsv1) eller type 2 subenhet (hsv2) - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (hsv1) eller type 2 subenhet (hsv2) Download PDFInfo
- Publication number
- NO153692B NO153692B NO783143A NO783143A NO153692B NO 153692 B NO153692 B NO 153692B NO 783143 A NO783143 A NO 783143A NO 783143 A NO783143 A NO 783143A NO 153692 B NO153692 B NO 153692B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- subunit
- type
- hsv2
- daltons
- hsv1
- Prior art date
Links
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title claims description 27
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 16
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 150000008378 aryl ethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 21
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 14
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 14
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 14
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 7
- 235000010666 Lens esculenta Nutrition 0.000 description 7
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- -1 Aliphatic ether adducts Chemical class 0.000 description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 4
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 240000007440 Agaricus campestris Species 0.000 description 2
- 235000004570 Agaricus campestris Nutrition 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000237369 Helix pomatia Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 244000100170 Phaseolus lunatus Species 0.000 description 2
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 2
- 244000104977 Vicia cracca Species 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- QWGLNWHWBCINBS-UHFFFAOYSA-N 3-nonylphenol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC(O)=C1 QWGLNWHWBCINBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144619 Abrus precatorius Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000220451 Canavalia Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000282668 Cebus Species 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000219728 Laburnum alpinum Species 0.000 description 1
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 240000005110 Lotus tetragonolobus Species 0.000 description 1
- 235000010642 Lotus tetragonolobus Nutrition 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000219822 Macrotyloma axillare Species 0.000 description 1
- 235000001504 Macrotyloma uniflorum var. uniflorum Nutrition 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N Nonylphenol Natural products CCCCCCCCCC1=CC=C(O)C=C1 IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDRAOGVAQOVDEB-MGMRWDBRSA-N O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)CO[C@@H]21 Chemical compound O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)CO[C@@H]21 JDRAOGVAQOVDEB-MGMRWDBRSA-N 0.000 description 1
- 208000025157 Oral disease Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 235000015622 Pisum sativum var macrocarpon Nutrition 0.000 description 1
- 244000148807 Pisum sativum var. macrocarpon Species 0.000 description 1
- 241001493421 Robinia <trematode> Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 244000046101 Sophora japonica Species 0.000 description 1
- 235000010586 Sophora japonica Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 235000010730 Ulex europaeus Nutrition 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 235000010733 Vicia cracca Nutrition 0.000 description 1
- 235000005055 Vicia cracca subsp. cracca Nutrition 0.000 description 1
- 235000002092 Vicia cracca subsp. grossheimii Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- 244000042312 Wisteria floribunda Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical compound [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- XAAHAAMILDNBPS-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].OP([O-])([O-])=O XAAHAAMILDNBPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940055577 oleyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 1
- 108010048090 soybean lectin Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (HSV1) eller type 2 subenhet (HSV2), hvilken fremgangs-
måte er kjennetegnet ved at man
a) infiserer cellene av en vevkultur med et herpes simplex virus type 1 (HSV1) eller type 2 (HSV2) som er i stand til å
vokse i vevkulturen,
b) inkuberer den infiserte vevkultur inntil en vesentlig del av cellene oppviser cytopatisk virkning, c) bringer de infiserte celler i kontakt med et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel for å erholde et ekstrakt, d) hydrolyserer i det vesentlige alt intakt dobbeltstrenget DNA i ekstraktet, og e) fraksjonerer ekstraktet ved ionebytter- eller affinitetskromatografi og at når det 1) anvendes herpes simplex type 1,
fåes en antigen, immunogen HSVl subenhet som inneholder to grupper av viralrettede, membranbundne glycoproteiner som er oppløselige i nærvær av et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel, hvor den første gruppe har molekylvekt på 123.000 dalton og den andre gruppe på 60.000 dalton, og hvor subenheten er fri for påvisbart DNA og i stand til å fremkalle nøytraliserende antistoff, eller når det 2) anvendes herpes simplex type 2, fåes en antigen, immunogen HSV2 subenhet som inneholder tre grupper av viral-rettede, membranbundne glycoproteiner som er oppløselige i nærvær av et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel, hvor den første gruppe har molekylvekt på fra 110.000 til 130.000 dalton, den andre gruppe på fra 83.000 til 90.000 dalton, og den tredje på fra 55.000 til 60.000 dalton, og hvor subenheten er fri for påvisbart DNA og i stand til å fremkalle nøytraliserende antistoff.
De resulterende produkter er nyttige som HSVl og HSV2 vaksiner .
Herpesvirus er ubikvitære av natur idet naturlige verter innbefatter frosk, kylling, mus, marsvin, katt, hund, svin, kveg, hest, ape og menneske. Menneske er den naturlige vert for Herpes simplex type 1 og 2, vannkopper/helvetesild, cytomegalovirus og Epstein-Barr virus (EBV) og kan være en temporær vert for herpes B virus i aper med alvorlige konse-kvenser. Klinisk sykdom bevirket av herpesvirus utgjør et be-tydelig helseproblem overfor hvilket en effektiv behandling ikke er tilgjengelig. Herpes simplex type 1 og 2 er anti-genisk relatert, men fremkaller generelt infeksjoner på forskjellige steder. Herpes simplex type 1 (HSVl) overføres oralt-respiratorisk og er som oftest forbundet med orale lesjoner. Herpes simplex type 2 (HSV2) overføres venerisk og er vanligvis ansvarlig for herpes genitalis og neonatal herpes. Den rolle disse virus spiller ved kronisk sykdom er ikke blitt fastslått. Imidlertid er HSV2 implisert i genitalcancer på basis av: (2) seroepidemiologiske observasjoner, (b) påvis-ning av herpesvirusantigener eller viral nucleinsyre i neo-plastisk vev, og (c) in vitro-overføring av et utall av celler, innbefattende humane celler, ved bestrålt virus.
Medlemmer av herpesvirusgruppen er relativt store om-hyllede ether-følsomme DNA virus. Herpes simplex type 1 virus har karakteristisk vist seg å inneholde to dominerende mole-kyl vektgrupper av omhyllende glycoproteiner, mens type 2 virus har karakteristisk vist seg å utvise tre dominerende molekyl-vektgrupper av omhyllende glycoproteiner. Enkelte av disse glycoproteiner er blitt isolert og har vist seg å fremkalle nøytraliserende antistoff i dyr.
Herpesvirus skaper særpregede og individuelle problemer når det gjelder vaksineutvikling, spesielt for anvendelse i mennesker. Generelt fremstilles virale vaksiner, enten disse er levende svekkede vaksiner eller drepte inaktiverte vaksiner, fra virus inneholdt i dyrevert-væsker eller cellekultur-væsker eller virale konsentrater avledet derfra. Imidlertid er herpesvirus generelt tilbøyelig til å være mer celle-assosiert enn mange andre virus, dvs. de er ikke tilbøye-
lig til å spre seg ut i væskene, og spesielt enkelte med-
lemmer av gruppen vil ikke formere seg til et tilstrekkelig høyt nivå av virioner som er nødvendig for fremstilling av vaksine i stor målestokk. I tillegg er visse herpesvirus slik som HSV2 og EBV, mistenkt for å være oncogenisk for mennesker. Fremstilling av vaksiner fra slike virus utgjør et spesielt problem ved at vaksinen må være fri for enhver viral genetisk informasjon som er i stand til å fremkalle cancer. Selv inaktiverte helvirusvaksiner betraktes som potensielt farlige i slike tilfeller fordi de inneholder viral nucleinsyre. Nylig er det gjort anstrengelser for å tilveiebringe forbedrede virale vaksiner, og dette har ført til utvikling av subenhet- eller "splitt"-vaksiner for å
redusere eller fjerne uønskede vert- eller viralkomponenter i vaksinene. Et eksempel er fremstilling av influensa-viral-subenhetvaksine fra infisert kyllingegg-allantoinvæske for å redusere toksisiteten og pyrogenisiteten, slik som beskrevet i US patentskrift 3 962 421.
CA TS: 16540 k (1971) beskriver behandling av herpes simplex virus som resulterer i tap av membranbundne glycoproteiner. Tapet av disse glycoproteiner resulterer i et produkt som ikke er i stand til å fremkalle dannelse åv nøy-traliserende antistoff på grunn av at de omhyllende glycoproteiner er de antigener som er ansvarlige for å fremkalle dannelse av virusnøytraliserende antistoffer. De virale nucleo-kapsider som dannes ved behandlingen beskrevet i den motholdte publikasjon, er ikke noen subenhet fordi de omhyllende glycoproteiner som er ansvarlige for å fremkalle dannelse av virus-nøytraliserende antistoff, er blitt fjernet.
CA 7_8: 13591 d (1973) beskriver isolering av forskjellige virale proteiner ved ekstraksjon av infiserte, humane tumor-celler med NP-40.
Ekstraktet elektroforesebehandles i acrylamidgeler, antigen-antistoff-komplekser dannes ved å føre de oppløseliggjorte proteiner over en immunoadsorberende kolonne, og de absorberte radioaktivt merkede glycoproteiner elueres med 8M urea og 0,15% SDS (natriumdodecylsulfat). Det er ikke vist at anti-genene er immunogene. De strenge betingelser som anvendes,
dvs. 8M urea og 0,15% SDS, vil i realiteten denaturere pro-teinene og resultere i tap av biologisk aktivitet.
Figur 1 i de medfølgende tegninger illustrerer polypeptidsammensetning(R)av HSV2 antigen isolert ved Lens culinaris lectin-Sepharosé-^af f initetskromatograf i. Elektroforese ble utført som beskrevet i Courtney, McCombs og Melnick, Virology 43, 356-365 (1971). Polypeptider ble farvet med "Coomassie blue", og densitometerkurven ble erholdt ved sveiping av gelen ved en bølgelengde på 540 nm. Tallene på toppene er molekylvekter. Figur 2. Glycopolypeptidsammensetning av HSV2 antigen isolert ved Lens culinaris leetin-Sepharose affinitetskromatografi. De virale glycoproteiner ble merket in vitro ved å til-sette ( 3H)glucosamin til de infiserte celler 4 timer efter infis-ering. Elektroforese ble utført som beskrevet i figur 1, og den radioaktive profil ble erholdt ved å skjære gelen i 2 mm seg-menter, oppløse polyacrylamidet i 30%-ig hydrogenperoxyd og undersøke på radioaktivitet i et seintillasjonsspektrometer. Figur 3- Polypeptidsammensetning av HSVl antigen isolert ved con A-Sepharose^(concanavalin A covalent bundet til Sepharose^ affinitetskromatografi. Elektroforese ble ut-ført som beskrevet i figur 1. Figur 4. Glycopolypeptidsammensetning av HSVl antigen isolert ved con A-Sepharose^affinitetskromatografi. Ana-
lysen ble utført som beskrevet i figur 2.
I henhold til foreliggende oppfinnelse er utgangsmateri-alet herpesvirusinfiserte celler formert i en cellekultur.
For HSVl og HSV2 vaksiner for mennesker er f.eks. et
egnet cellekultursystem primære hønsefosterceller formert som monoskikt i rulleflasker ved alminnelig kjente metoder. Cellene infiseres med HSVl eller HSV2 vira ved en lav multiplisitetsinfeksjon (MOI, dvs. antallet viruspartikler pr. celle), som en MOI på fra 0,001 til 1,0, fortrinnsvis
ca. 0,01, ved metoder vanligvis anvendt i faget, og kulturene inkuberes inntil viral cytopatogen virkning observeres i en stor del av cellene, typisk ca. 75% av cellene. Ved enden av inkuba-sjonsperioden fjernes cellekulturmediet, og celle-monoskiktet vaskes eventuelt med en balansert saltoppløsning. Alternativt kan cellene samles fra kulturkaret ad mekanisk vei, vaskes med en balansert saltoppløsning, sprenges ved metoder som lydbehandling, og den erholdte sprengte cellesuspensjon klares i en lavhastighets-sentrifuge eller lignende. Fremgangsmåten for
å oppløse og ekstrahere viral-rettet membran-bundne glycoproteiner fra virusinfiserte celler kan anvendes like effektivt på de oven-for beskrevne intakte celler i monoskikt som på de sprengte celleekstrakter. Direkte kjemisk ekstraksjon av de intakte monoskikt-cellekulturer byr på en betraktelig praktisk fordel ved vaksine-fremstilling i stor målestokk da den ikke krever mekanisk fjernelse av cellene fra cellevekstflaten. Den har også vist seg å gi et høyere proteinutbytte ved å nedsette fysikalske tap involvert i mekanisk høstning av celler, og den -billater eliminering av lyd-behandlingstrinnet og lavhastighets-sentrifugeringstrinnet. Under riktig regulerte betingelser forbedrer denne metode antigen-renheten ved selektiv ekstraksjon av antigener, dvs. mindre DNA ekstraheres sammenlignet med den mekaniske høstning og lydbehand-lingsmetode.
Det overf lateakt ive middel som anvendes for ekstraksjon kan tilhøre den ikke-ioniske eller anioniske kategori. Det an-vendte ikke-ioniske overflateaktive middel kan være f.eks. ett eller flere av de følgende typer: 1. Aryletheraddukter av ethylenoxyd som polyoxyethylen-alkylfenoler. Spesifikke eksempler på denne type er polyoxyethylen-octylfenol (Triton® X-100, Nonidei® P-40, "Beloid EMP"), polyoxyethylen-9-9, 5-nonylf enol (Renex® 698), polyoxyethylen-9-10-nonylfenol (Triton® N101) og polyoxyethylen-10,5-nonyl-fenol (Tergitol<®> NPX) . 2. Alifatiske etheraddukter av ethylenoxyd, som polyoxyethylen-alifatiske alkoholer. Spesifikke eksempler på denne type er polyoxyethylen-10-oleylalkohol ("Brij 9 6"); polyoxyethylen-7-trimethylen-7-lineær alkohol C-^-C^ (Tergitol® 15-S-7) . 3. Esteraddukter av ethylenoxyd, som polyoxyethylen-fettsyrer. Et spesifikt eksempel på denne type er polyethylen-glycol 400 monolaurat ("Cithrol 4ML 400"). 4. Aminaddukter av ethylenoxyd som polyoxyethylen-fettaminer. Spesifikke (rek)sempler på denne type er polyoxyethylen-15-stearylamin (Ethomeerr-^ 18/25) , polyoxyethylen-15-kokos-fettaminer, gjennomsnittlig molekylvekt 860 (Ethomeen® C/25),
og polyoxyethylen-5-soyafettaminer (Ethomeen® S/15).
Det anioniske overflateaktive middel anvendt for eks-trahering, kan være et gallesalt som f.eks. natrium-deoxycholat, natriumcholat eller natriumtaurocholat.
For ekstraksjon er en foretrukken type av ikke-ionisk overflateaktivt middel en polyoxyethylen-alkylfenol hvor alkyl-gruppen har fra ca. 6 til ca. 12 carbonatomer, f.eks.
TritorP^C-100 eller Nonider^P-40 . Behandling med det ikke-ioniske overflateaktive middel ekstraherer virale glycoproteiner, mens behandling med det ikke-ioniske overflateaktive middel eventuelt i nærvær av salt, typisk fra 0,1M opptil ca. 2M salt avhengig av viruset, øker ekstraksjon av virale glycoproteiner. Saltet kan være et alkalisalt , et jordalkalisalt eller et salt av en treverdig kation. Eksempler på slike salter er KC1, NaCl, NH^Cl, MgCl2 eller CaCl^. Ekst raksjonen finner fortrinnsvis sted ved nøytral pH, og en puffer, f.eks. Tris-HCl, kan anvendes for å innstille pH om nødvendig. En proteolytisk inhibitor, f.eks. fenyl-methyl-sulfonyl-fluorid (PMSF), er eventuelt tilstede. Ekstraksjonen kan finne sted ved kjøleskapstemperatur opptil inkubatortemperatur, dvs. fra 4°C til 37°C i fra ca. 15 minutter til flere dager. Ekst raksjonstiden kan strekke seg opptil den tid ved hvilken nedbrytning av det ønskede antigen-holdige materiale inntrer. Det er imidlertid i alminnelighet ingen fordel ved en ekst raksjonstid på mere enn noen få timer. Typisk utføres ekstraksjonen i 2% Triton<§>k-100 , 0,15M - IM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 2 mM PMSF ved 20-23°C i 1 - k timer.
Efter ekstraksjon sentrifugeres ekstraktmediet for å fjerne uoppløselige stoffer: celleavfall, cellekjerner og virale nucleocapsider. Sentrifugeringen kan utføres ved fra ca.
50.000 x g til høyere i fra 15 minutter til flere timer, typisk
ved ca. 10O.000 x g i ca. 1 time. Det oppløselige ekstrakt er ikke-infiserende, men inneholder noe gjenværende intakt (dobbelt - strenget) DNA og RNA. Dobbeltstrenget (nativ) DNA og RNA måles ved ethidiumbromidbestemmelsen ifølge Karsten et al., Anal. Biochem. , 4_6, 135-148, 1972. Bestemmelsen påviser DNA i mengder så lave som 50 ng og RNA i mengder så lave som 100 ng. Total DNA (enkelt- og dobbelt st renget DNA, og DNA-fragmenter) måles ved metoden ifølge Kissane et al., J. Biol. Chem., 233, 184-188, 1958, som påviser mengder så lave som 50 ng.
Eventuelt kan det oppløselige materiale som fåes fra ekstraksjonen, behandles på dette trinn eller senere under fremgangsmåten, med DNase for å hydrolysere eventuelt gjenværende DNA og gi et produkt som er i det vesentlige fritt for intakt (dobbeltstrenget) DNA (under 50 ng/lOO \ ig protein).
Det oppløselige materiale som fåes fra ekstraksjons - behandlingen med det ikke-ioniske overflateaktive middel, er særlig egnet som utgangsmateriale for kromatografisk rensning av membranbundet herpesvirus-glycoproteiner. Kromatografisk frak-sjonering i nærvær av det overflateaktive middel resulterer i anrikning av de virale glycoproteiner, fjernelse og/eller reduk-sjon av DNA-fragmenter, RNA og andre uønskede proteiner. Frak-sjonering av det oppløselige materiale kan utføres ved anionbytte-kromatografi ved kjente metoder. Anionbyttemediet kan være f.eks. DEAE-cellulose. Hvis DNase-oppslutningen sløyfes, er. produkt et fra DEAE-cellulosekromatografi i det vesentlige fritt for dobbeltstrenget DNA ( < 50 ng/100 jig protein), men kan inneholde gjenværende total DNA (1 [ig/100 U-g protein). Hvis DNase-oppslutning ut-føres før kromatografering, er produktet i det vesentlige fritt for all DNA (< 50 ng/lOO ug protein). Mere fordelaktig kan det oppløselige materiale fraksjoneres ved affinitetskromatografi på et immobilisert lectin ved kjente metoder. Lectiner er celle-agglutinerende proteiner som forekommer meget alminnelig i frø av belgplanter, men de finnes også i andre deler av plantene, i andre planter enn belgplanter, og i dyr. Lectiner bevirker agglutiner-. ing ved binding til carbohydrater på celleoverflater, og det er denne spesifisitet som gjør lectiner nyttige ved isoleringen og rensningen av carbohydratholdige makromolekyler som glycoproteiner. Ved deres anvendelse som glycoproteinrensende reagenser blir lectinene vanligvis uoppløseliggjort og immobilisert ved at de bindes covalent til en inert matriks som f.eks. dextraner, agarose, cellulose og lignende. Fortrinnsvis immobiliseres lectinet på en kolonne.
Spesifikke lectiner er f.eks. Lens culinaris leet in, Concanavalin A (Canavalia enisformis leetin), soyabønne-agglutinin (Glycine max leetin), hvetespire-agglutinin, Dolichos biflorus leetin, Lotus tetragonolobus leetin, Phaseolus lunatus leetin, Phaseolus vulgaris leetin (havebønne-leetin) , jordnøtt-leetin, Pisum sativum leetin (sukkerert-leetin), Vicia graminea leetin, Robinia pseudoacacia leetin (storrobinia-leetin), Vicia faba
leetin (bønnevikke-leet in), Ulex europeus leetin (gulltorn-lectin), Vicia cracca leetin (fuglevikke-lectin), Solanum tuberosum leetin (potet-leetin), Abrus precatorius leetin,
Triticum vulgaris leetin (hvete-lectin), Momordia charantia
leetin, Agaricus campestris leetin (marksjampinjong-leet in), Sesanum indicum leetin, Helix pomatia leetin (vingårdsnegl-lectin), Wisteria floribunda leetin, Laburnum alpinum leetin, Sophora japonica leetin, Phaseolus limensis leetin og Limulus polyphemus leetin, (hesteskokrabbe-lectin). For HSV2 er et foretrukket leetin Lens culinaris, og for HSVl er et foretrukket leetin concanavalin A. Produktet erholdt fra leetin-affinitets-kromatogra.fi er i det vesentlige fritt for dobbelt st renget og total DNA (<50 ng/100 ug protein) selv uten DNase-behandling og inneholder intet påvisbart RNA ( <100 ng/100 ug protein).
Eventuelt kan den virale subenhet isolert ved adsorpsjon på det immobiliserte leetin behandles med et materiale som er i stand til å adsorbere lectiner som kan ha løsnet fra adsorpsjons-midlet. Et slikt materiale kan være et polymerisert dextran, som en av Sephadex^-gelene.
De viral-rettede glycoproteiner isolert ved enten ione-bytting eller affinitetskromatografi kan eventuelt renses ytterligere og skilles ved adsorpsjon på calciumfosfatholdige adsorp-sjonsmidler, f.eks. brushit (CaHPO^-2H20) eller heller hydroxyl-apati<t> C(Ca10(POZf)6(OH)2]. Adsorpsj onskromatografi utføres i nærvær av et overflateaktivt middel ved kjente fremgangsmåter.
Det virale subenhet santigen som fåes ved behandling med enten anionbytteharpiksen eller det immobiliserte leetin, er fritt for påvisbart dobbeltstrenget DNA og kan anvendes som en vaksine for å bevirke nøytralisering av antistoff eller cellebevirkede immunresponser og for å beskytte laboratoriedyr mot paralyse og død bevirket av herpesvirus. Den virale subenhet isolert ved leetinadsorpsjon inneholder ikke noe påvisbart DNA eller RNA bestemt ved de ovenstående metoder, mens den virale subenhet isolert ved adsorpsjon på anionbyttemedium inneholder ca. 1,0% totale DNA-fragmenter eller RNA.
Den virale subenhetsvaksine kan sterilfiltreres og eventuelt behandles med inaktiveringsmidler, som f.eks. varme,
UV, DNase, formalin eller thimerosal for å garantere sikkerhet.
Den immuniserende virkning av den virale subenhetsvaksine kan forsterkes ved å adsorbere det virale subenhetsantigen på alun eller ved å anvende andre immunologiske hjelpestoffer. For anvendelse som en vaksine må de virale subenhetsantigener være i det vesentlige frie for overflateaktivt middel. Adsorpsjonen av antigenet på alun gir en særlig bekvem måte for å fjerne eventuelt ubundet gjenværende overflateaktivt middel.
De immunogene antigener fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles'" f or vaksineanvendelse ved forening med et fysiologisk godtagbart preparat, som f.eks. PBS, saltvann eller destillert vann og sterilfiltrering. Et antimikrobielt konser-veringsmiddel, f.eks. thimerosal, kan eventuelt være tilstede. Likeledes kan et inaktiveringsmiddel, f.eks. formaldehyd, være tilstede for å drepe eventuelt gjenværende levende virus, og for å inaktivere eventuell enkeltstrenget nucleinsyre.
Vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes,
om ønskes, sammen med vaksinestabilisatorer og vaksinehjelpestoffer. Typiske stabilisatorer er f.eks. gelatin, casein og albumin. Et eksempel på et hjelpestoff er alun. Et hjelpestoffpreparat kan fremstilles fra jordnøttolje, isomannid-monooleat og aluminium-
monostearat. Vaksinen kan lagres i kjøleskap eller i frossen eller lyofilisert form. Disse antigener er immunogene i patte-dyrarter og er nyttige som vaksiner basert på induksjon av antistoff i marsvin, marmosett og Cebus aper, katter og basert på beskyttelse mot letale, homologe virusinfeksjoner i mus.
De følgende eksempler belyser foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Curtis-stammen av HSV2 ble mottatt fra dr. A. J. Nahmias ved Emory University, Atlanta, Georgia, med en passasjehistorie på 3 passasjer i primær kaninnyre. Dette virus ble passert ytterligere 3 ganger i kaninnyreceller og derpå avpasset til hønse-fosterceller ved 8 seriepassasjer.
Hønsefostere fra 11 dager gamle befruktede egg fra en leucosis-fri flokk trypsiniseres, og den erholdte enkeltcelle-suspensjon plantes i rulleflasker i medium 199 inneholdende 2% kalvefosterserum og 50 ug/ml neomycin og inkuberes ved 36°C på en rullemølle.
På den fjerde dag infiseres monoskiktskulturene med HSV2 virus ved en MOI på 0,01 med en begynnelsesadsorpsjonsperiode på 2 timer. De infiserte kulturer inkuberes ved 34°C på rulle-møller inntil cytopatisk virkning iakttaes i ca. 75% av cellene, ved ca. 44-48 timer.
Det overstående vekstmedium kastes, og monoskiktkulturene vaskes forsiktig (3 x 50 ml) med PBS under rotering på rulle-møllen for å fjerne gjenværende kalvefosterserum. Efter vasking tilsettes et ekstraktivt medium inneholdende 2% Triton<S>^C-lOO , IM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM fenylmethylsulfonyl-fluorid (PMSF) og 4,75% ethanol til flaskene under rotering på møllen ved en temperatur på 20 - 23°C, og ekstraksjonen får lov til å fortsette i ca. 30 minutter. Ekstraksjons-
mediet oppsamles, karene vaskes med ytterligere ekstrak-sjonsmedium, og vaskevæsken tilsettes til det opprinnelige eks-tråksjonsmedium. De forenede celleekstrakter holdes ved en temperatur på 20 - 23°C i en totaltid på ikke under 1 time fra tids-punktet for den første tilsetning av ekst raksjonsmedium til celle-kulturflaskene og sentrifugeres så ved 105.000 gil time ved 20 - 23°C
Den overstående væske innstilles på pH 7,0, magnesium-klorid tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0,005M, og deoxy-ribonuclease fra kveg-pancreas (1 mg/ml i avionisert, destillert vann) tilsettes for å få en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml. Blandingen inkuberes ved 20 - 23°C i 4 timer. Blandingen er nu i det vesentlige fri for intakt (dobbeltstrenget) DNA.
Blandingen fraksjoneres på en Lens culinaris lectin-affinitetskolonne. Lens culinaris leetin-Sepharose^affinitets-adsorbenten fremstilles ved kovalent binding av Lens culinaris leetin til CNBr-aktivert Sepharose-^4B eller aktivert CH-Sepharose^fB ved kjente metoder. Adsorbenten suspenderes i 0,1% Tritor^X-100 , 1,0M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (utgangspuffer) og helles i en kromatografikolonne. Sluttdimensjonene på det adsorberte lag er 2,6 cm (innvendig diameter) x 10 cm (53,1 ml lagvolum). Adsorbenten vaskes med 250 ml 0,2M a-methyl-D-mannosid i utgangspuffer, og dette følges av minst 5 kolonnevolum utgangspuffer. Strømningshastigheten i kolonnen holdes ved 100 ml/h med en peristaltisk pumpe.
Blandingen pumpes på den adsorberende kolonne, og kolonnen vaskes derpå med 5 kolonnevolum utgangspuffer. Derpå desorberes de viral-rettede glycoproteiner fra kolonnen med 5 kolonnevolum 0,2M a-methyl-D-mannosid i utgangspuffer. Den glycoprotein-anrikede fraksjon inneholder 6 hoved- og 5-8 mindre polypeptider som vist på figur 1 som innbefatter 3 grupper viral-rettede glycoproteiner: ca. 110.000 - 130.000 dalton; ca. 83-000 - 90.000 dalton; og ca. 55.000 - 60.OOO dalton som vist på figur 2. Denne fraksjon inneholder under 50 ng DNA og under 100 ng RNA pr. 100 ug protein. Ingen intakte eller sprengte virus eller nucleocapsider
er påvisbare ved elektronmikroskopi, og ingen levende virus isoleres ved vevkulturmetoder.
Glycoproteinfraksjonen fra Lens culinaris leetin-Sepharose-
kolonnen kromatograferes på en liten kolonne av polymerisert
(R)
dextran, dvs. Sephadex^G-50 for å fjerne eventuell leetin som kan være lekket fra affinitetsadsorbentene, og den uadsorberte fraksjon oppsamles. Behandlingen er valgfri og kan sløyfes.
Den uadsorberte HSV2 glycoproteinfraksjon sterilfiltreres gjennom et 0,2 u porøsitets "Nuclepore"-filter og fortynnes til protein-bruksnivået med steril pyrogenfri fysiologisk godtagbar fosfatpufret saltvann. Eventuelt tilsettes formalin til en konsentrasjon på 100 ug/ml, og blandingen inkuberes i 72 timer ved 36 C for ytterligere sikring mot muligheten for nærvær av gjenværende infiserende HSV2 virus og for å inaktivere eventuelt gjenværende enkeltstrenget DNA.
For anvendelse som en vaksine adsorberes HSV2 subenhet - antigenet på alun, og det ubundne Triton^X-100 fjernes ved følgende metode. Antigenet innstilles på det ønskede protein-bruksnivå, og 10%-ig A1K(SO^)2•12H20 (alun) tilsettes for å få en endelig alunkonsentrasjon på 8,5 mg/ml. Under tilsetningen av alun anvendes IN natriumhydroxyd for å opprettholde en pH på
5,2 - 6,0. Efter omrøring ved værelsetemperatur i 1 time sentrifugeres blandingen i 10 minutter ved 270 g. Den overstående væske fjernes, og proteinet måles (Lowry) i både den overstående væske og alunvaksinen for å bestemme den adsorberte mengde.
Alunet resuspenderes til et volum likt den opprinnelige antigen-oppløsning i steril fysiologisk saltvann (pyrogenfri) eller i saltvann inneholdende 1:20.000 thimerosal. Den alunadsorberte vaksine kan vaskes en eller to ganger med saltvann for å redusere
Tritotøc -100 —konsentrasjonen til minimale mengder før resuspen-dering. Den alunadsorberte vaksine lagres ved 4°C.
Eksempel 2
Fremgangsmåten i eksempel 1 gjentaes unntatt at de infiserte celler fjernes mekanisk fra kulturkarene og vaskes med fosfatpufret saltvann (PBS), dvs. 0,15M NaCl, 0,0063M nat riumfosfat,
pH 7,2. De vaskede celler resuspenderes i pyrogenfritt^ destillert
00 o 7
vann for a få en cellekonsentrasjon på ca. 1-2 x 10 celler/ml
og sprenges ved strømningslydbehandling (3 cykler ved 150 ml/min) med en varmeveksler for å opprettholde temperaturen på ca. 4°C.
De sprengte celler sentrifugeres ved 800 g i 20 minutter ved 4°C, og de overstående væsker forenes. Den overstående væske innstilles på en sluttkonsentrasjon på 2% Tritor)TX-100/ 1,0M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM PMSF, 4,75% ethanol (for å oppløse PMSF), og en Lowry-protein-konsentrasjon på ca. 2 mg/ml. Blandingen suspenderes med en vev-homogenisator og inkuberes ved 20 - 23 C i 1 time under intermitterende homogenisering, og sentrifugeres så ved 105.000 gil time ved 20 - 23°C. Den overstående væske oppsamles og behandles videre som beskrevet i eksempel 1.
Eksempel 3
Fremgangsmåten i eksempel 1 og eksempel 2 gjentaes unntatt at DEAE-cellulose-kromatografi anvendes istedenfor Lens culinarus lectin-affinitetskromatografi og SephadexrG-50 —kromatografi sløyfes. Den overstående væske av Trit orrX-100 —ekstraktet dialyseres mot 1% Tritor^X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (utgangspuffer) ved 4°C. Det dialyserte ekstrakt påføres på en DEAE-cellulosekolonne brakt i likevekt i begynnelsespuffer og kromatograferes ved 4°C. Efter at hele prøven har gått inn i kolonnen, vaskes den med utgangspuffer for å fjerne uadsorberte proteiner og adsorberte proteiner elueres med en 0 - 0,6M NaCl-gradient i utgangspuffer. 25 - 200 mM NaCl-fraksjonene, som er rikest på virale glycoproteiner, forenes. Denne forenede opp-løsning er fri for påvisbar dobbeUstrenget DNA, men inneholder ca. ca. 1% enkelt strenget DNA eller DNA-fragmenter og 1 - 2% RNA. Der er over 30 polypeptider varierende i molekylvekt fra lik eller under 17.000 til lik eller over 322.000. Fraksjonene inneholder også 3 grupper av viral-rettede glycoproteiner: ca. 110.000 - 130.000 dalton; ca. 83-000 - 90.000 dalton; og ca. 55-000 - 60.OOO dalton. Ingen intakte eller sprengte virus eller nucleocapsider er påvisbare i fraksjonen ved elektronmikroskopi, og ingen levende virus isoleres ved vevkulturmetoder.
Eksempel 4
Herpes simpleks type 1 (HSVl) infiserte celler fremstilles i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1 unntatt at HSVl anvendes istedenfor HSV2. De infiserte celler høstes og ekstraheres i det vesentlige som beskrevet i eksempel 2 unntatt at den lavhastighets-overstående væske fra de lydbehandlede celler sentrifugeres ved 105-OOO^q i 1 time ved 4°C for å konsentrere viruset, og TritorPx-lOO —ekstraksjonsmediet hvori pelleten resuspenderes, inneholder 0,15M NaCl istedenfor 1,0M som anvendt for HSV2. Det. erholdte ekstrakt fraksjoneres på leetin concanavalin A som beskrevet nedenfor.
Affinitetsadsorbenten, Con A-Sepharose<®>(concanavalin A covalent bundet til Sepharose® erholdt fra en kommersiell kilde, suspenderes i 1% Triton^X-lOO; 0,l5M NaCl, 50 mM Tris-HCl,
pH 7,5 (utgangspuffer). Den anbringes i en 1,6 cm (innvendig diameter) kromatografikolonne og får lov til å avsette seg til en høyde på 3,3 cm. Adsorbenten vaskes (20 ml/h) med 20 ml 0,2M a-methyl-D-mannosid i utgangspuffer, fulgt av 2M NaCl i utgangspuffer og vaskes til slutt med 4 lagvolum utgangspuffer.
Ekstraktet pumpes på adsorbenten, og adsorbenten vaskes med 20 ml utgangspuffer. Glycoproteinfraksjonen elueres fra adsorbenten med 30 ml 0,2M a-methyl-D-mannosid i utgangspuffer. Den adsorberte fraksjon inneholder tre hoved- og seks mindre polypeptider som vist i figur 3, blant hvilke de hoved-viral-rettede glycoproteiner med 123.000 og 60.000 molekylvekt er vist i figur 4- Ingen intakte eller sprengte virus eller nucleocapsider er påvisbare ved elektronmikroskopi, og ingen levende virus isoleres ved vevkulturmetoder.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (HSVl) eller type 2 subenhet (HSV2), karakterisert ved at man
a) infiserer cellene av en vevkultur med et herpes simplex virus type 1 (HSVl) eller type 2 (HSV2) som er i stand til å vokse i vevkulturen, b) inkuberer den infiserte vevkultur inntil en vesentlig del av cellene oppviser cytopatisk virkning, c) bringer de infiserte celler i kontakt med et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel for å erholde et ekstrakt, d) hydrolyserer i det vesentlige alt intakt dobbeltstrenget DNA i ekstraktet, og e) fraksjonerer ekstraktet ved ionebytter- eller affinitetskromatografi og at når det 1) anvendes herpes simplex type 1,
fåes en antigen, immunogen HSVl subenhet som inneholder to grupper av viralrettede, membranbundne glycoproteiner som er oppløselige 1 nærvær av et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel, hvor den første gruppe har molekylvekt på 123.000 dalton og den andre gruppe på 60.000 dalton, og hvor subenheten er fri for påvisbart DNA og i stand til å fremkalle nøytraliserende antistoff, eller når det 2) anvendes herpes simplex type 2, fåes en antigen, immunogen HSV2 subenhet som inneholder tre grupper av viral-rettede, membranbundne glycoproteiner som er oppløselige i nærvær av et ikke-ionisk eller anionisk overflateaktivt middel, hvor den første gruppe har molekylvekt på fra 110.000 til 130.000 dalton, den andre gruppe på fra 83.000 til 90.000 dalton, og den tredje på fra 55.000 til 60.000 dalton, og hvor subenheten er fri for påvisbart DNA og i stand til å fremkalle nøytraliserende antistoff.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det som overflateaktivt middel anvendes et aryletheraddukt av ethylenoxyd..
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2,
karakterisert ved at ekstraksjonen utføres i nærvær av salt, fortrinnsvis i en konsentrasjon på fra 0,1 til 2 molar.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83459877A | 1977-09-19 | 1977-09-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO783143L NO783143L (no) | 1979-03-20 |
| NO153692B true NO153692B (no) | 1986-01-27 |
| NO153692C NO153692C (no) | 1986-05-07 |
Family
ID=25267310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO783143A NO153692C (no) | 1977-09-19 | 1978-09-18 | Fremgangsmaate ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (hsv1) eller type 2 subenhet (hsv2). |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0001365B2 (no) |
| JP (1) | JPS5484024A (no) |
| CA (1) | CA1114294A (no) |
| DE (1) | DE2862086D1 (no) |
| DK (1) | DK411878A (no) |
| FI (1) | FI66020C (no) |
| IE (1) | IE47364B1 (no) |
| IT (1) | IT1110864B (no) |
| NO (1) | NO153692C (no) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374127A (en) * | 1977-09-19 | 1983-02-15 | Merck & Co., Inc. | Herpes sub unit vaccine |
| US4452734A (en) * | 1980-02-11 | 1984-06-05 | Merck & Co., Inc. | Herpes subunit vaccine |
| FR2483779A1 (fr) * | 1980-06-05 | 1981-12-11 | Synthelabo | Procede pour isoler des antigenes glycoproteiques viraux et son application a la preparation de vaccins |
| US4317811A (en) * | 1980-09-11 | 1982-03-02 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type 1 subunit vaccine |
| US5219567A (en) * | 1982-03-24 | 1993-06-15 | The University Of Birmingham | Vaccine against herpes viruses |
| IL68219A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Univ Birmingham | Vaccine against dna viruses |
| CA1201987A (en) * | 1982-03-24 | 1986-03-18 | Gordon R.B. Skinner | Vaccine against dna viruses |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| NZ209307A (en) * | 1983-08-30 | 1990-07-26 | Genentech Inc | Diagnostic product: antigenic peptide produced by recombinant dna techniques |
| US7264817B1 (en) | 1983-08-30 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it |
| JPS6051120A (ja) * | 1983-08-31 | 1985-03-22 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニットワクチン |
| JPS6153226A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-03-17 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
| EP0312164A1 (en) * | 1987-10-16 | 1989-04-19 | Merck & Co. Inc. | Purification of recombinant epstein-barr virus antigens from vero cells, yeast cells or L cells |
| US5081010A (en) * | 1989-02-09 | 1992-01-14 | Eastman Kodak Company | Extraction composition, test kit and their use to extract or determine herpes simplex viral antigen |
| DE4033446A1 (de) * | 1990-10-20 | 1992-04-23 | Bayer Ag | Impfstoffe gegen equine herpesviren und ihre herstellung |
| US5334503A (en) * | 1991-10-08 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Test kit and method for the detection of microorganisms associated with periodontal diseases using surfactant mixture as extraction composition |
| WO2019086463A1 (en) | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Baxalta GmbH | Environmentally compatible detergents for inactivation of lipid-enveloped viruses |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3962421A (en) * | 1973-06-18 | 1976-06-08 | American Home Products Corporation | Method for the disruption of lipid-containing viruses |
-
1978
- 1978-09-11 FI FI782769A patent/FI66020C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-09-13 CA CA311,199A patent/CA1114294A/en not_active Expired
- 1978-09-14 DE DE7878400098T patent/DE2862086D1/de not_active Expired
- 1978-09-14 EP EP19780400098 patent/EP0001365B2/en not_active Expired
- 1978-09-15 IT IT5111678A patent/IT1110864B/it active
- 1978-09-18 NO NO783143A patent/NO153692C/no unknown
- 1978-09-18 IE IE1880/78A patent/IE47364B1/en unknown
- 1978-09-18 DK DK411878A patent/DK411878A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-09-19 JP JP11420278A patent/JPS5484024A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT7851116A0 (it) | 1978-09-15 |
| EP0001365B2 (en) | 1987-09-23 |
| DE2862086D1 (en) | 1982-12-16 |
| EP0001365A1 (en) | 1979-04-04 |
| EP0001365B1 (en) | 1982-11-10 |
| NO783143L (no) | 1979-03-20 |
| JPS5484024A (en) | 1979-07-04 |
| DK411878A (da) | 1979-03-20 |
| CA1114294A (en) | 1981-12-15 |
| IE47364B1 (en) | 1984-03-07 |
| NO153692C (no) | 1986-05-07 |
| FI66020B (fi) | 1984-04-30 |
| IT1110864B (it) | 1986-01-06 |
| FI782769A7 (fi) | 1979-03-20 |
| FI66020C (fi) | 1984-08-10 |
| IE781880L (en) | 1979-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4452734A (en) | Herpes subunit vaccine | |
| US4374127A (en) | Herpes sub unit vaccine | |
| NO153692B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av en antigen, immunogen subenhet av herpes simplex type 1 (hsv1) eller type 2 subenhet (hsv2) | |
| NO813087L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av herpes simplex type i-vaksine | |
| CN109568573A (zh) | 疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN107320720A (zh) | 一种疫苗组合物、试剂盒及应用 | |
| CN113308441A (zh) | 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用 | |
| CN111808826B (zh) | 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用 | |
| RU2447898C2 (ru) | Вакцина ipv-dpt | |
| CN106929480A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 | |
| CN107541501A (zh) | 犬细小病毒毒株、疫苗组合物及其应用 | |
| CN116813718B (zh) | 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 | |
| CN106563125A (zh) | 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法 | |
| CN111000995A (zh) | 猪用三联灭活疫苗及其制备方法和应用 | |
| JPH0813269B2 (ja) | 非特異免疫誘発剤の製造法 | |
| AU649728B2 (en) | Vaccines against equine herpesviruses and the preparation thereof | |
| US4540669A (en) | Herpes simplex type I subunit vaccine | |
| WO2005014803A1 (ja) | 西ナイルウイルスワクチン | |
| RU2181295C1 (ru) | Вирионная цитомегаловирусная вакцина и способ ее получения | |
| KR920010872B1 (ko) | Dna 비루스에 대한 백신의 제조방법 | |
| CN1059836C (zh) | 应用金黄地鼠肾原代细胞生产流行性出血热灭活疫苗 | |
| RU2279474C1 (ru) | Штамм тк-а/к вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов | |
| EP0591384A1 (en) | Attenuated revertant serotype 1 marek's disease vaccine | |
| CN113151190A (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒强毒株 | |
| Homan | Latency of bovine herpesvirus-1. |