CN113308441A - 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猫疱疹病毒I型病毒株及其应用，属于生物制品技术领域。所述病毒株保藏编号为：CCTCC NO:V202126，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。该病毒株属于中国(武汉)的分离毒株，具有较高的病毒滴度，病毒滴度为10^7.65TCID₅₀/mL，对家猫有较强的致病性，具备成为疫苗候选株的基本潜质，将该病毒株制备成疫苗可用于猫传染性鼻气管炎疾病防治中，以为我国猫疱疹病毒I型的防控提供重要的疫苗病毒源，实现猫疱疹病毒I型的有效防控。

Description

一株猫疱疹病毒I型病毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，涉及一株猫疱疹病毒I型病毒株及其应用。

背景技术

猫传染性鼻气管炎又称为猫鼻支，是一种以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病，具体症状包括：角膜结膜炎、上呼吸道感染和流产，但以打喷嚏、过度流涎、眼鼻分泌物增多等上呼吸道症状为主。本病临床常见于猫，猫的发病率高达100％，病死率在不同年龄段的猫中差异很大，成年猫一般不引起死亡，但幼仔猫的死亡率可达50％。患病动物可终生带毒排毒，且在一定条件刺激下反复感染。Crandell和Maurer于1958年首次从仔猫中分离到该病毒，随后在越南、荷兰、英国、日本、匈牙利、瑞士、加拿大、西班牙等地分离到此病毒。近年来在我国也已多次发现临床病例。2006年，王文利通过PCR方法确诊了1例感染猫鼻支的病例。之后，2008年至2010年，屈哲、杜艳、张硕等先后在临床疑似病猫的眼、鼻分泌物中分离到病毒，2016年，刘健、李鑫、徐锋等也从13份疑似感染猫鼻支的临床病料中分离鉴定了5株FHV-1。这些均表明我国已存在FHV-1感染。

猫鼻支的病原为猫疱疹病毒I型(FHV-1)，FHV-1属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。疱疹病毒主要由核心(Core)、衣壳(Capsid)、间层(Tegument)及囊膜(Envelope)4部分组成。病毒衣壳为立体对称的正二十面体，外观呈六角形。FHV-1全基因组大小约为126kbp-134kbp，由99kbp的长独特区(U_L)和27kbp的短片段组成，其中短片段由7-8.5kbp的反向重复序列夹心8-9kbp的短独特序列(U_S)组成。U_S区包含gG、gD、gI和gE等基因，U_L区包括：gC、gH、gB、TK等基因。FHV-1基因组编码多种蛋白质，已报道了17种病毒特异性蛋白和3种具有免疫原性的糖蛋白。其中的gB是主要免疫原性蛋白，在哺乳动物细胞中表达，引起细胞融合和多核体形成，是病毒复制所必需的；gD在病毒与细胞牢固吸附中起主要作用，在机体免疫中是主要的中和抗体。gC是一种重要的囊膜糖蛋白，通过和宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素受体结合，实现FHV-1对细胞的粘附。gC还有免疫抑制的功能，能够结合补体，抑制补体介导的细胞杀伤作用。此外，gC也是FHV-1重要的免疫原性蛋白，能够诱导细胞免疫和中和抗体。

目前，我国尚无自主研发的FHV-1疫苗，主要依靠接种进口疫苗防治猫鼻支。有研究表明，临床宠物猫免疫FHV-1疫苗后中和抗体合格率只有60％，抗体滴度达不到抵抗病毒感染的效价，表明进口商品化疫苗可以在一定程度上减轻猫在感染FHV-1后所导致的临床症状，但其免疫效果不佳，不能有效控制当前我国FHV-1的流行。这可能是因为临床中所用的疫苗株并非是我国当前流行毒株，疫苗免疫后抗体滴度达不到要求。因此，基于现有技术中存在的问题，亟需一种能够针对我国流行的FHV-1毒株的疫苗出现以用于有效防治我国猫鼻支的流行。

发明内容

本发明的目的是提供一株猫疱疹病毒I型病毒株及其应用，以解决背景技术存在的技术问题，该毒株滴度较高，对家猫具有较强的致病性，可构建出作为防治猫传染性鼻气管炎疾病的疫苗，有效防控我国猫疱疹病毒I型的流行。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一株猫疱疹病毒I型(Feline Herpesvirus-I)病毒株，命名为：猫疱疹病毒I型FHV-1/WH/2020，其保藏编号为：CCTCC NO:V202126，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

优选的是，所述毒株的免疫原性基因gC的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的猫疱疹病毒I型病毒株或所述的如SEQ ID NO：1所示的免疫原性基因gC在制备疫苗中的应用。

优选的是，所述疫苗为防治猫传染性鼻气管炎疾病的疫苗。

优选的是，所述疫苗为全病毒灭活疫苗、减毒疫苗或基因工程疫苗。

本发明还提供一种疫苗，包括所述的猫疱疹病毒I型病毒株或所述的如SEQ IDNO：1所示的免疫原性基因gC。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从我国确诊FHV-1感染猫的眼鼻拭子样本中分离出一株新的FHV-1病毒株-FHV-1/WH/2020，通过毒价测定、主要毒力基因及免疫原性基因测序分析、致病性试验等方面的研究，确定了该分离株具有较高的病毒滴度(10^7.65TCID₅₀/mL)，主要毒力基因及免疫原性基因与其它历史分离株相比高度保守，对家猫有较强的致病性，具备成为疫苗候选株的基本潜质。因此，本发明公开的FHV-1/WH/2020毒株可以用于制备防治FHV-1感染的疫苗制品中，以有效防治FHV-1的流行。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为FHV-1/WH/2020在CRFK细胞上的病变情况；

图2为PCR检测FHV-1/WH/2020的特异性条带电泳图；其中，M：DL2000；1-3：FHV-1/WH/2020P₁；4-6：FHV-1/WH/2020P₂；7-9：FHV-1/WH/2020P₃；10-12：FHV-SH(阳性对照)；13-15：ddH₂O阴性对照；

图3为FHV-1/WH/2020在CRFK上的间接免疫荧光检测结果；

图4为对FHV-1/WH/2020的噬斑纯化结果；

图5为FHV-1/WH/2020的生长曲线测定结果；

图6为FHV-1/WH/2020株主要毒力基因及免疫原性基因与历史分离株对应基因的核苷酸同源性比对结果；A：TK基因比对结果；B：gG基因比对结果；C：gE基因比对结果；D：gB基因比对结果；E：gD基因比对结果；F：gC基因比对结果；

图7为家猫感染FHV-1/WH/2020株后的体温变化分析图；

图8为家猫感染FHV-1/WH/2020株后的体重变化分析图；

图9为家猫感染FHV-1/WH/2020株后的临床症状；其中，A-B：对照；C：眼鼻浆液性分泌物；D-F：眼鼻脓液性分泌物；

图10为家猫感染FHV-1/WH/2020株后的死亡率。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1FHV-1/WH/2020病毒株的分离及鉴定

一、实验方法

1、病毒分离

(1)从中国武汉某宠物医院收集确诊FHV-1感染猫的眼鼻拭子样本，加入无血清DMEM培养液(含1％双抗)制成1：5悬液，5000r/min离心10min，取上清，经0.22μM微孔滤膜过滤除菌，分装至无菌EP管中，作为分离病毒的接种物，-80℃保存。

(2)在6孔培养板中将FHV-1易感细胞CRFK培养至单层，将上步处理后的病料样品按照培养液体积的1/10接种至CRFK中，在37℃培养箱中吸附1-2h后弃掉培养液，用PBS洗三遍CRFK细胞。加入含2％胎牛血清的DMEM维持液继续于37℃静置培养4-6d，逐日观察有无细胞病变。

(3)4-6d后第一代若未出现病变，则将第一代的培养物取出在-80℃与常温之间反复冻融3次，8000rpm，4℃离心15min，取上清，按照1:10的比例接于长满单层的CRFK上，吸附2h，换成2％的维持液，培养4-6d，观察有无病变。如此盲传3-5代，直至出现病变。

(4)将出现病变的代次同样冻融3次，离心，取上清，分装至无菌EP管中，即为原始毒，记为P₀代毒。

2、病毒鉴定

(1)PCR鉴定：取出现病变的病毒液200μL，利用

ViralDNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取FHV-1分离株(FHV-1/WH/2020)、FHV-1阳性株(FHV-1/SH/01/2014)的DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。以提取的病毒DNA为模板，以高度保守的gD引物(上游引物FHV-gd-F：gcattgatatcagagccggat；下游引物FHV-gd-R：cagttcatcgtctgttaggaac)扩增gD序列进行PCR鉴定，鉴定体系为：2×MIX 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板2μL，ddH₂O 6μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。反应结束后，将PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)间接免疫荧光(IFA)鉴定：将CRFK细胞接种至24孔培养板，待细胞长成单层，弃掉培养液，用PBS洗孔3遍，每孔按0.01MOI接种病毒液，同时设置不接毒的CRFK细胞作为阴性对照，吸附2h后，将培养液更换为2％的维持液，放入培养箱培养24小时。弃上清，用PBS清洗3遍后加入4％多聚甲醛室温固定30min；弃掉废液，用PBS洗3次后加入千分之一的Triton通透10min，弃废液，用PBS洗3次后加入2％BSA封闭液，在37℃静置作用1h左右；PBS洗3次后加入1：500稀释的一抗(FHV-1兔多克隆抗体)，37℃静置1h；PBS洗4次后，按照1：1000加入羊抗兔荧光二抗，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS洗三次，加入1：1000稀释的DAPI染料，常温作用3min；弃掉DAPI，PBS洗三遍，每孔加入500μLPBS，在荧光显微镜下观察并采集图片。

2、实验结果

(1)将猫鼻支疑似病例的眼鼻拭子样品处理后接种CRFK单层细胞，2d后出现明显的细胞病变(CPE)，如图1所示。从图1中可看出，细胞发生病变后，细胞聚集，膨大变圆，随后细胞逐渐脱落，成功分离到一株FHV-1，命名为FHV-1/WH/2020。

(2)使用FHV-1特异性引物进行PCR扩增，得到预期大小的特异性条带，如图2所示。

(3)以FHV-1多克隆抗体进行IFA鉴定，结果如图3所示，病毒感染的细胞单层中出现特异性绿色荧光，对照组细胞则无荧光。

实施例2FHV-1/WH/2020的噬斑纯化

1、实验方法

(1)将CRFK消化均匀后调节细胞密度，以1×10⁵个/mL接种6孔板，当细胞长至单层，准备病毒液，进行十倍连续梯度稀释，获得五个稀释度的病毒液。弃掉孔中培养液，用PBS洗孔3遍后分别向每个孔里接种病毒液800μL，37℃吸附2h，每隔15min摇动一次板子，使病毒液充分吸附均匀，2h后吸弃病毒液，PBS洗三遍。

(2)制备2％的低熔点琼脂糖溶液，72℃融化，置于42℃水浴锅中保温待用，2×DMEM也置于37℃水浴锅中预热。

(3)将上述2％低熔点琼脂糖溶液与2×DMEM维持液(2％血清，1％双抗)按照1:1的比例混匀后，加入各孔中，2ml/孔，将6孔板于室温静置10min，使其凝固。待琼脂糖凝固后，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。分别于24、36小时后观察病变。

(4)待噬斑形成后，对光观察，对噬斑做标记，选取合适大小的噬斑连同琼脂一起使用黄色枪头吸起，溶解在适量细胞培养液中，用作病毒的下一轮增殖与纯化。如此重复3轮。

2、实验结果

将FHV-1/WH/2020分离株在CRFK细胞中通过蚀斑纯化3轮，获得了一株单一纯合的病毒株，如图4所示。

实施例3FHV-1/WH/2020生长动力学的测定

1、实验方法

(1)将CRFK细胞传代接种于24孔板中，待细胞长至单层，以0.01MOI病毒感染细胞，同时将培养液换成2％的维持液，置于37℃培养箱中培养。

(2)接毒后分别在12、24、36、48、60、72小时收取上清样品，用CRFK细胞测定病毒TCID₅₀。

(3)将细胞传代接种于96孔板中，待细胞密度达到约50％，用细胞维持液将病毒按10倍倍比稀释后，每孔加入100μL病毒液，每个稀释度8个重复，放入培养箱中培养。

(4)每隔24h观察1次，记录发生细胞病变的病毒稀释度和孔数，4-5d后停止观察，记录最终发生细胞病变的的稀释度和孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

2、实验结果

如图5所示，以0.01MOI病毒量接种CRFK，其在接种后60h病毒滴度达到最高，为10^7.65TCID₅₀/mL。

实施例4FHV-1/WH/2020主要毒力基因及免疫原性基因测序分析

1、实验方法

(1)目的基因扩增

取FHV-1/WH/2020病毒液200μL，利用

ViralDNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。

以提取的病毒DNA为模板，以TK(上游引物TK-CX-F：tcggtacgtggttcgtatg；下游引物TK-CX-R：tggcgtgtcgtcagatatc)、gG(上游引物gG-CX-F：gatgaagactccagcgattc；下游引物gG-CX-R：gctctgatatcaatgccacc)、gE(上游引物gE-CX-F：tggttatggatggcaccac；下游引物gE-CX-R：cggatagagtttcatccgc)、gB(上游引物gB-CX-F：tctggcgtcacaacaactc；下游引物gB-CX-R：tgttggattgatcggcgc)、gD(上游引物gD-CX-F：agcacaccacatgacacac；下游引物gD-CX-R：agatgaaggctatcgacgac)、gC(上游引物gC-CX-F：agatcacggattggagtcg；下游引物gC-CX-R：cgcggttgtgtctaataactg)引物扩增各基因序列，扩增体系均为5×SF Buffer 10μL，dNTP Mix 1μL，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH₂O 32μL。将上述试剂充分混匀，均按下列程序扩增各基因：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃3min，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。

(2)测序：将扩增的目的基因PCR产物送往生物测序公司测序。

(3)基因序列分析：FHV-1/WH/2020分离株与FHV-1标准株C-27、临床常用两个疫苗株及国内外具有代表意义的12株FHV-1分离株核苷酸序列进行同源性分析。

2、实验结果

对FHV-1/WH/2020分离株的主要毒力基因及免疫原性基因进行了测序分析，其基因序列见SEQ ID NO：1-6所示。

如图6所示，结果表明FHV-1/WH/2020株的主要毒力基因及免疫原性基因与其它国内外历史分离株相比序列高度保守，其毒力基因TK(SEQ ID NO：2)、gG(SEQ ID NO：3)、gE(SEQ ID NO：4)及免疫原性基因gB(SEQ ID NO：5)、gD(SEQ ID NO：6)与国内外历史分离株的同源性高达99％以上，另一免疫原性基因gC(SEQ ID NO：1)与其它历史分离株的同源性为92％，其有78bp的插入片段，有可能增强该分离株的免疫原性。因此，预测其疫苗产品将可产生较高的中和抗体滴度，对国内外大部分FHV-1流行毒株的感染产生保护作用，可广泛用于国内外猫鼻支的防控。

gC基因(SEQ ID NO：1)：

ttataatcgccggggatgagaataatataaacataatgccgtaataaagataaagactgtgatgagaacagctcctagtattacagcaacgacactaaccaacattgattcactgacgatttcaggggacgcgtcgtagacttgtgtgtcgtaaaatcccggtagaattggtgggtatccgatggtctgacaggtataactcacgggtccatccgtttctgatatatcacacatactctgaatgttgaccaaacctggacgttctatacacggacctgtgatcagtatatcagcactcattgcttttggtagatggtagttaccaattttccacatcaaggatatcccgtcccgtggtacacatttaacatcacatatagcccgtgtatcagcgaaggtaacagacacagtaggtgggtaatagacgtccggggctacacttttcgtgaatctcttataggacacaggactttcatgccattccaaatcacatcgtatatctggtttctcggaatctgttttagttgttggaatagccaacacagaacttctggtgatgagtccatctatccatacacttgccgtatctgaaatgtattgcctttctattggcttcccgtcaagataccatgttagtttcgtggatcgcggggggaagtaattcgccactgcacataccgcctcaaaggtcttattaaatagactggcgcgtggtgtaagatttacgctcggggggtgatatgccactacagatacatttacctgtcctagcactgttttatttagtccatctccaccatagacccgccatgtataaacaccggacgtggcagattccacagatttgattcccaatgacatcgcttcggtatgttgtatgggaatattatataatgtgtaatctggtatcctagattgtaggatcccgagtgtcgcgtccccaagatccatggaattaacactcccattacggctgctaaatagtaatatgctggtgcgggtatgattccctacgaagtcttctttatccccaagaaaatccccaaatctggtgcgtggtttaaaccagatctcgaagtcaatagggttggtaatatgaggttctgtgggtagagtacagtttagctgaagagggctaaaatacggtctgtagataacccccttatatccacaatctaatttaaatctggccccgttattcttattctttttacgctttggtttttttgttgttttgagtaaagtggtattggaatcggtagatgatcctatgaatgtggctgcctgggtggtactcggacttgtagctatagttgtcgagcttctagttagagtagttaatgtagatgttggctgggatgcctgggtggtactcggacttgtagctatagttgtcgagcttctagttagagtagttaatgtagatgttggctgggatgcctgggtggtactcgaacttgtagctatatttgtagatcttctagttggagtagtgaatggagatgttggctgggatatcggggtggtagcggacatgctggtagatgataacatctccgcagtactattatcactattttcaatactgaccgcggttgtcgacgaagtaccaaactggagatatgtatataacagacagatatagagaaggtagattccgcgtcccatcctatatcgtctcat

TK基因(SEQ ID NO：2)：

atggcgagtggaaccatccccgttcagaatgaagagattattaaatcacaggtgaatactgtccgcatttacatagatggtgcctatggaataggtaagagtttaacggcgaagtacctggtcagagcggatgaaaatcgaccgggatatacttactacttcccagaaccaatgctatactggcgtagtctctttgaaactgatgttgtcggtggtatctatgccgtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatcagctgaagatgctgcctatatcaccgcccactatcaagcaagatttgccgcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaagttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgtttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagtctaatggcaacacttccacgagaacctcctggtggaaatctagttgtaacaaccttgaatatcgaggaacatttgaagcgtctcaggggacgctcaagaaccggagaacagatagacatgaagctaattcacgcactacgcaatgtatatatgatgttggtacatactaagaaatttttaacaaaaaatactagttggcgtgatgggtgggggaagcttaaaattttctcccactatgaacggaataggctcgtggaaactacaatagtttccgattcgacggagtcagatttatgtgacacattattcagtgttttcaaagcccgggagctctccgaccaaaatggagatctacttgacatgcatgcatgggtcctcgatggacttatggaaaccctccaaaatttacagatctttactttaaatctggaaggaacccctgatgaatgtgccgccgccttgggagcactgagacaagatatggatatgacatttatagccgcatgtgatatgcaccgtataagtgaagccttgacgatataccattaa

gG基因(SEQ ID NO：3)：

atgggaaatcgtatacatattttaatatgcattgcagcattctacataaccatcgcggctgctaggaatgccccaatggatctctgttacgccgaccccagagatacatcaccacaacccataggacatcctaattataaacaagtgaatatcaacgatccactacccgcaccaaagtggggatatgttgaacattccagtggatgtgaattacgtttattggacccgagagttgatgtctcttcaagatcaccagagaaggcagacgctacgattgcttggacttttgatctcggaacatgtcaaatacctatcgcgtatagagaatattataactgtactgggaatttaataccctccccagaaacttgcgaagggtattccgcgacctccatacgcttcgaaggtctaaccatctataccttggtaaatataagtctactccttcaaccaggaatattcgattccgggagtttcctgtattcatttatatatggtcaaaatagatacaatggacgtattatagttcatgtagaaaaaaatactgattatccctgcaaaatgtatcatggactcatggctccatttgaccatcatccccaaagccacgttgaaactccgaatgataagaatcatcgtagagggcggggatgttttcccgaattggtggaacctgttctatgggttaatatcagcagtgatcttattggtggtccacctttcgactataatcatgaagatgaggctgatattgagagtgatgagctcccggaggaggatatacataactactcagattgtcgtgcgactaatatgtttgttccgagagagcccctcagtcaagttcttggttctcaaagtctactggttggtagtttaggtttccagataattactcaaccctggcaactgaagcagaatgaaagttatgatggactaagaaatgcctctcttgaaccccgacaccttgactccagtaacgatcgtgatctactagatgaaactgaaatgattggatcgattattacgactccaccaccaacccatccaaaaggtgtcaatgggggtttcctccaagatctaccaattatcgagcctacgaccgaaccatgcttagtacatacaaagatcattgggatcggaacagtagtcgttgtatttttgttatttattctcatatccctatgtgtttatacttgcgttctacgatcccgcatcggtatggtagatcgcgcctatgtgaaacaagtacgatttaattccaatccatcatatcaacagttgacaagatacccccaaccataa

gE基因(SEQ ID NO：4)：

atgggactgcttgttaccatcctcgtgatattattgattgttacttcatcaagttctactattcatcaagtaacgatgacagaaggtgccgcacttttagtcgatggggatgggatcgacccacctttaaacaaaacttcacattttttgcgaggttggacatttctagagactccgaaaggatgtacaggagaggtgagtgttctaaaagtatgtatagatcgtggggtatgtccggatgatatcgttataaataagagatgtggtcacaaaatgcttgaaaccccactagcgttggcggaatttggaatttctaatagttctctcatcagaaccaaagacgtatatttcgtgaataagaccgtgtttccaattctcacacccgaaaaaagtggccttggtattcagggggccactacgaatatatccgggatatataccctgcatgagcacggtgataatggatggagtcatcaatctacattttttgtgaccgtaaaggcaaaacatcccggaccatcgttaaccccagcaccggttcacttaataacaccacatcgccatggggcacatttccacgtaagaaactatcattcgcatgtctacattccgggagataagttcttattagaaatgcacctcaaatcagatatctatgatccagaattttcagcaacaatagactggtattttatggagactgatataaaatgcccagtttttagaatttatgaaacttgtatatttcacccccatgccgcatcctgtctacatccggaagatccctcatgcagttttacatcaccacttcgagcggtatctttaattaatagattttatccaaaatgcgatcacagatatgccgattggacatccagatgtatcaacactccaagtataaatcatatgccatatatcgaacagccggccaataacgtggatctaaagtttatcaatgtacccaccaacgcttctgggttgtacgtattcatacttcgttataatggacatccggaagaatggacctatacactcatatcaacaggagctaaatttttgaatgtgattagggatctgacacgcccacgtcttggtagtcatcaaatagagaccgatattagcacatcttcgcagtcgcctaccacggagacaccacgaaacatacatataacgtgggcgagacgttatctaaaggttatcataggaataatttgcgtagctggtatccttttgattgtaatctctatcacatgttatattcgatttcgtcatatgcgatataaaccatatgaagtgatcaacccattccctgcggtatataccagcattcctagtaacgatcccgacgaactctactttgaacgtatcgcatcgaacgacgaagaatcggcagatgattcttttgatgaatcagatgaggaggagccattgaataatcatcatatttcaacaacccaacatactgatattaatccagaaaaatccggatctgggtacagtgtatggtttcgtgatacagaagatacatcacctcagcccctacacgctcctccagattacagtcgcgtagttaaaagattaaagtctattttaaaatga

gB基因(SEQ ID NO：5)：

atgtccactcgtggcgatcttgggaagcggcgacgagggagtcgttggcagggacacagtggctattttcgacagagatgttttttcccttctctactcggtattgcagcgactggctccagacatggtaacggatcgtcgggattaaccagactagctagatatgtttcatttatctggatcgtactattcttagtcggtccccgtccagtagagggtcaatctggaagcacatcggaacaaccccggcggactgtagctacccctgaggtagggggtacaccaccaaaaccaactacagatcccaccgatatgtcggatatgagggaagctctccgtgcgtcccaaatagaggctaacggaccatcgactttttatatgtgtccaccaccttcaggatctactgtcgtgcgtttagagccaccacgggcctgtccagattataaactagggaaaaattttaccgagggtatagctgtaatatttaaagaaaatatagcgccatataaattcaaggcaaatatatactataaaaacattattatgacaacggtatggtctgggagttcctatgccgttacaaccaaccgatatacagacagggttcccgtgaaagttcaagagattacagatctcatagatagacggggtatgtgcctctcgaaagctgattacgttcgtaacaattatcaatttacggcctttgatcgagacgaggatcccagagaactgcctctgaaaccctccaagttcaacactccagagtcccgtggatggcacaccaccaatgaaacatacacaaagatcggtgctgctggatttcaccactctgggacctctgtaaattgcatcgtagaggaagtggatgcaagatctgtatatccatatgactcatttgctatctccactggtgacgtgattcacatgtctccattctttgggctgagggatggagcccatgtagaacatactagttattcttcagacagatttcaacaaatcgagggatactatccaatagacttggatacgcgattacaactgggggcaccagtttctcgcaattttttggaaactccgcatgtgacagtggcctggaactggaccccaaagtctggtcgggtatgtaccttagccaaatggagggaaatagatgaaatgctacgcgatgaatatcagggctcctatagatttacagccaagaccatatccgctactttcatctccaatacttcacaatttgaaatcaatcgtatccgtttgggggactgtgccaccaaggaggcagccgaagccatagaccggatttataagagtaaatatagtaaaactcatattcagactggaaccctggagacctacctagcccgtgggggatttctaatagctttccgtcccatgatcagcaacgaactagcaaagttatatatcaatgaattagcacgttccaatcgcacggtagatctcagtgcactcctcaatccatctggggaaacagtacaacgaactagaagatcggtcccatctaatcaacatcataggtcgcggcgcagcacaatagaggggggtatagaaaccgtgaacaatgcatcactcctcaagaccacctcatctgtggaattcgcaatgctacaatttgcctatgactacatacaagcccatgtaaatgaaatgttgagtcggatagccactgcctggtgtacacttcagaaccgcgaacatgtgctgtggacagagaccctaaaactcaatcccggtggggtggtctcgatggccctagaacgtcgtgtatccgcgcgcctacttggagatgccgtcgccgtaacacaatgtgttaacatttctagcggacatgtctatatccaaaattctatgcgggtgacgggttcatcaacgacatgttacagccgccctcttgtttccttccgtgccctcaatgactccgaatacatagaaggacaactaggggaaaacaatgaacttctcgtggaacgaaaactaattgagccttgcactgtcaataataagcggtattttaagtttggggcagattatgtatattttgaggattatgcgtatgtccgtaaagtcccgctatcggagatagaactgataagtgcgtatgtggatttaaatcttactctcctagaggatcgtgaatttctcccactcgaagtttatacacgagctgagctggaagataccggccttttggactacagcgagattcaacgccgcaaccaactccacgccttaaaattttatgatatagacagcatagtcagagtggataataatcttgtcatcatgcgtggtatggcaaatttttttcagggactcggggatgtgggggctggtttcggcaaggtggtcttaggggctgcgagtgcggtaatctcaacagtatcaggcgtatcatcatttctaaacaacccatttggagcattggccgtgggactgttaatattagctggcatcgtcgcagcattcctggcatatcgctatatatctagattacgtgcaaatccaatgaaagccttatatcctgtgacgactaggaatttgaaacagacggctaagagccccgcctcaacggctggtggggatagcgacccgggagtcgatgacttcgatgaggaaaagctaatgcaggcaagggagatgataaaatatatgtccctcgtatcggctatggagcaacaagaacataaggcgatgaaaaagaataagggcccagcgatcctaacgagtcatctcactaacatggccctccgtcgccgtggacctaaataccaacgcctcaataatcttgatagcggtgatgatactgaaacaaatcttgtctaa

gD基因(SEQ ID NO：6)：

atgatgacacgtctacatttttggtggtgtggaatctttgcggtcctgaaatatctggtatgtacttcaagccttacgaccacgccaaaaacaactacggtttatgtgaagggatttaatatacctccactacgctacaattatactcaagccagaatcgtgccaaaaattccccaggcgatggatccgaagataacagctgaagtacgttatgtaacatcaatggattcatgtgggatggtggcattgatatcagagccggatatagacgctactattcgaaccatacaactatctcaaaaaaaaacatataacgcgactataagttggtttaaggtaacccagggttgtgaataccctatgtttcttatggatatgagactttgtgatcctaaacgggaatttggaatatgtgctttacggtcgccttcatattggttggaacctttaacaaagtatatgttcctaacagacgatgaactgggtttgattatgatggccccggcccaatttaatcaaggacaatatcgaagagttataaccatcgatggttccatgttttatacagattttatggtacaactatctccaacgccatgttggttcgcaaaacccgatagatacgaagagattctacatgaatggtgtcgaaatgttaaaactattggccttgatggagctcgtgattaccactattattgggtaccctataacccacaacctcaccataaagccgtactcttatattggtatcggactcatggccgagaacccccagtaagattccaagaggccattcgatatgatcgtcccgccataccgtctgggagtgaggattcgaaacggtccaacgactctagaggagaatcgagtggacccaattggatagacattgaaaattacactcctaaaaataatgtgcctattataatatctgacgatgacgttcctacagcccctcccaagggcatgaataatcagtcagtagtgatacccgcaatcgtactaagttgtcttataatagcactgattctaggagtgatatattatattttgagggtaaagaggtctcgatcaactgcatatcaacaacttcctataatacatacaactcaccatccttaa

实施例5FHV-1/WH/2020分离株致病性试验

1、实验方法

(1)分组及攻毒：选取出生2-3个月的健康家猫(经母源中和抗体测定、IFA鉴定血清抗体为阴性，眼鼻拭子PCR检测FHV-1阴性)随机分为两组，其中感染组3只，对照组1只，采用滴鼻的方式进行攻毒，剂量为1mL(1×10^6.66TCID₅₀/mL)，对照组接种等量无菌DMEM。

(2)临床观察家猫状态：感染之后每天监测体重、体温，观察家猫的状态及临床症状。

2、实验结果

将扩增的FHV-1/WH/2020病毒液通过滴鼻的方式对2-3月龄的家猫进行攻毒，剂量为1mL(1×10^6.66TCID₅₀/mL)。接种后11天内，感染组家猫陆续表现出体温升高(如图7所示)、体重下降(如图8所示)、精神萎靡、打喷嚏、食欲减退并伴有浆液性眼鼻分泌物，继而发展为厌食，浆液性眼鼻分泌物转为粘稠脓性分泌物等症状(如图9所示)并最终死亡，感染组家猫死亡率达100％(如图10所示)。表明FHV-1/WH/2020分离株对2-3月龄的家猫具有较强的致病性，具备成为疫苗候选株的基本潜质，并可为猫传染性鼻气管炎疫苗评价提供效力检验用强毒。

实施例6FHV-1/WH/2020分离株灭活疫苗制备以及应用

1、实验方法

(1)病毒抗原的制备：将FHV-1/WH/2020分离株接种于长成单层的CRFK，接毒量为0.01MOI。37℃吸咐2h，吸附完成后将培养液换成2％的维持液，置于37℃培养箱中培养。接种后约60h，当细胞病变(CPE)达90％以上时，终止培养。经反复冻融3次后，收取病毒液。经无菌检验，且对CRFK细胞的TCID₅₀≥10⁷/ml的病毒液混合，加入40％的甲醛溶液充分混匀后(甲醛溶液的最终浓度为千分之一)，置37℃作用36h，然后放室温(25℃左右)继续作用12h即制成苗用抗原。

(2)病毒灭活效果检查：取灭活后的病毒液，接种于CRFK细胞单层3瓶，37℃培养观察7d再盲传二代，应无CPE。

(3)油乳剂灭活苗的制备：I油相的制备：取10号药用白油94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝2份(以克为单位)，边加边搅拌，直到完全透明为止。再加入6份司本80(以毫升为单位)。充分混匀后，高压蒸气灭菌备用。II水相制备：在100份灭活的病毒悬液中加入4份灭菌吐温-80，充分摇动直到吐温-80彻底溶解。III乳化：取6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速搅拌，同时徐徐加入3份水相，加完后以8000-10000r/min，乳化2.5min，然后加入1份水相，继续搅拌30s，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一。乳化成油包水型乳剂灭活苗。

(4)灭活疫苗安全性及免疫原性评价

I测定疫苗批的毒价，每只猫免疫10⁶TCID₅₀的剂量，皮下多点注射颈背部皮肤。

II免疫之后每天监测体重、体温，观察临床症状，评估疫苗的安全性。

III每周对猫进行前肢静脉采血，通过中和实验检测中和抗体水平。

中和实验：将采得的静脉血4℃过夜，析出血清，4500rpm离心5min，取上清，7000rpm离心5min，取上清，56℃灭活30min。使用DMEM将血清进行2倍比稀释(4个重复)，加入96孔板，50μL/孔。将病毒液稀释到100TCID₅₀/50μL，与稀释好的血清等量混合，加入96孔板，50μL/孔，37℃感作1h。感作完成后，取出96孔板，同步接种加入细胞，100μL/孔细胞液，使细胞密度在60％-70％，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中培养5d，显微镜下观察细胞病变。一半以上细胞出现CPE的孔视为阳性，该血清稀释倍数即为血清效价。待检血清的中和指数大于50，即可判为阳性，10～49为可疑，小于10为阴性。

2、结果

(1)安全性评价：免疫后14天内，动物无不良反应，体温、体重正常，说明灭活的FHV-1/WH/2020疫苗株具有良好的安全性。

(2)免疫原性评价：免疫之后每隔7天进行一次前肢静脉采血，检测中和抗体水平。在免疫后1-3周内有中和抗体产生，随着免疫时间的延长，中和抗体水平逐渐上升，最终中和指数大于50且能持续较长时间，说明FHV-1/WH/2020灭活苗具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可以很好的刺激动物机体产生针对FHV-1/WH/2020的保护性中和抗体。

实施例7FHV-1/WH/2020分离株gC基因疫苗制备以及应用

1、实验方法

(1)FHV-1/WH/2020gC基因真核表达质粒的构建与鉴定

①gC基因片段的获取

取FHV-1/WH/2020病毒液200μL，利用

ViralDNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。

以提取的病毒DNA为模板，以引物gC-F：ACTAGTCCAGTGTGGTGGatgagacgatataggatgggac，gC-R：TAAACGGGCCCTCTAGACttataatcgccggggatgag扩增gC基因全序列，扩增体系为5×SF Buffer 10μL，dNTP Mix 1μL，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH₂O 32μL。将上述试剂充分混匀，按程序扩增gC基因：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃3min，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。反应结束后，加入5μL10×Loading Buffer混匀，1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下切割回收含有大小约为1600bp的基因片段的凝胶，将切割回收的含gC基因片段的凝胶按omega琼脂糖凝胶回收试剂盒操作说明进行回收纯化。

②真核表达载体pcDNA3.1(+)的线性化

将抽提的pcDNA3.1(+)载体按照下述酶切体系以EcoR I和Xho I进行双酶切线性化：EcoR I和Xho I各1μL，10×H Buffer 2μL，pcDNA3.1(+)载体1μg，补加ddH₂O至总体积20μL，轻轻混勾后，3000r/min短暂离心，37℃水浴反应3-4h后，加入2μL10×Loading Buffer终止酶切反应。1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外光下切割回收含有大小约为5400bp的基因片段的凝胶，将凝胶按omega琼脂糖凝胶回收试剂盒操作说明进行回收纯化。

③线性化pcDNA3.1(+)载体和gC基因片段的同源重组

将胶回收纯化的gC基因片段和线性化pcDNA3.1(+)载体参照Vazyme说明书所述体系进行同源重组：线性化pcDNA3.1(+)载体XμL，gC基因片段YμL，Exnase II 2μL，5×CE IIBuffer 4μL，ddH₂O to 20μL(X/Y根据公式计算得到载体和插入片段用量)，依次将上述连接体系的各试剂加入微量反应管中，轻轻混匀后，短暂离心将反应液收集至管底，置于37℃反应30min，降至4℃或立即置于冰上冷却。

④重组质粒的转化

取上述同源重组产物的一半(10μL)加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴热激90s后，再在冰上放置3min，加入500μL无抗LB液体培养基，37℃以120r/min振荡培养40min，3000r/min离心5min后弃去500μL上清，留100μL上清将菌体重悬，将菌液均匀涂布于LB/Amp平板培养基上，37℃培养12-16h，挑取单菌落接种于1mL LB/Amp液体培养基中，37℃以120r/min振荡培养3-4h，待菌液变浑浊后以引物gC-F/R进行菌液PCR鉴定，鉴定体系为：2×MIX 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液模板2μL，ddH₂O 6μL。将上述各组分充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。反应结束后，将PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，将鉴定正确的菌液取300μL送往生物公司测序。

⑤重组质粒pcDNA-gC的抽提

接种阳性菌株：将测序正确的菌液接种于15mL LB/Amp液体培养基中，37℃以120r/min振荡过夜，以扩大培养。

保存菌种：取扩大培养的菌液及50％的甘油各500μL于1.5mL的EP管中，颠倒混匀后作好标记，置于-20℃保存。

菌体收集：将保菌后余下的菌液用50mL离心管集菌，5000r/min离心5min，弃上清。

菌体悬浮：往离心管中加入solution I 500μL，重悬菌体，然后将菌液分装于2支1.5mL的EP管中。

裂解菌体：每支EP管中加入solution II 250μL，温和旋转离心管4-6次(剧烈混合会使DNA断裂，降低质粒纯度)，获得澄清的裂解液，室温孵育2min。

沉淀染色质DNA和蛋白质：每支EP管加入solution III 350μL，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000r/min离心10min。

挂柱：小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2mL离心管的吸附柱中，保证没有吸入沉淀和碎片。室温10000r/min离心1min，至裂解液完全通过吸附柱。

去除蛋白：弃滤过液，每支EP管加入500μL HBC Buffer，10000r/min离心1min，清洗吸附柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度以备后续实验使用。

漂洗：弃滤过液，用无水乙醇稀释的750μL DNA Wash Bufferr清洗吸附柱，10000r/min离心1min，弃滤液。重复该操作1次。

洗净：将吸附柱10000r/min离心2min，确保乙醇被除去。

晾干：将吸附柱放入干净的1.5mL EP管中，于室温放置10min以晾干残余乙醇。

洗脱：加30-50μL Elution Buffer或无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，室温静置1-2min，10000r/min离心1min。将EP管中液体吸回吸附柱滤膜上，再次10000r/min离心1min，丢弃吸附柱。

浓度测定：用Elution Buffer(溶解DNA的溶剂)清洗超微量分光光度计，检空白调零后取1.2μL待检样品测定其浓度，-20℃保存备用。

⑥间接免疫荧光法检测pcDNA-gC在真核细胞中的表达

I真核表达质粒pcDNA-gC的转染

将CRFK细胞接种至6孔培养板，待细胞长至60％-80％，将培养液更换为2％DMEM。转染前，先按照三孔所需要的量配制转染试剂：每孔200μL

buffer，2μg质粒pcDNA-gC，4μL

reagent，轻轻涡旋10s混匀后室温孵育10min，每孔逐滴加入孵育后的混合液200μL，同时设置只加转染试剂和Buffer的对照及细胞对照，轻轻十字混匀后置于37℃含5％CO₂培养箱作用6h后吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃含5％CO₂培养箱作用48h。

II间接免疫荧光法检测gC基因表达

转染48h后，吸弃细胞维持液，用PBS(pH 7.4)轻轻洗涤细胞3次；加入4％多聚甲醛室温固定30min；弃掉废液，用PBS洗3次后加入千分之一的Triton通透10min，弃废液，用PBS洗3次后加入2％BSA封闭液，在37℃静置作用1h左右；PBS洗3次后加入1：500稀释的一抗(FHV-1gC兔多克隆抗体)，37℃静置1h；PBS洗4次后，按照1：1000加入羊抗兔荧光二抗，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS洗三次，加入1：1000稀释的DAPI染料，常温作用3min；弃掉DAPI，PBS洗三遍，每孔加入500μLPBS，在荧光显微镜下观察并采集图片。

(2)定量PCR检测猫疱疹病毒gC基因疫苗在猫体内分布规律

①真核表达质粒pcDNA-gC的制备

I碱裂解法大量制备质粒

参照《分子克隆实验指南》(第三版)所述方法用SDS碱裂解法大量制备pcDNA-gC质粒DNA。

II聚乙二醇沉淀法纯化大抽质粒

参照《分子克隆实验指南》(第三版)所述方法用聚乙二醇沉淀法纯化大抽后的pcDNA-gC质粒DNA。

III猫疱疹病毒gC基因疫苗的鉴定

将经过高密度发酵、质粒大抽、聚乙二醇纯化后的真核表达质粒pcDNA-gC进行酶切分析和琼脂糖电泳，同时结合超微量分光光度计检测结果分析质粒的浓度、纯度及其酶切图谱，以确定该质粒作为基因疫苗的“身份”。

②基因枪“子弹”的制备及初步使用

参考Bio-Rad产品说明书制备及初步使用基因枪“子弹”。

③壳聚糖/pcDNA-gC复合物的制备

参照Mao和蒋金凤所述方法进行，具体方法如下:

A.取壳聚糖0.1g溶于1％的醋酸溶液，加入在锥形瓶中搅拌24h，加入1％的氨水，过滤，沉淀放于-80℃，真空冷冻干燥；

B.重复上述步骤；

C.将纯化后的壳聚糖溶于微热的1％醋酸溶液，用1％NaOH调节pH值到5.5，再稀释成0.03％(m/V)，再用1％NaOH调节pH值到5.5，并使NaAc终浓度为5mM，使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用；

D.以终浓度100μg/mL的比例将适量质粒pcDNA-gC溶于10mmol/L的Na₂S0₄(总体积控制在250μL以内)；

E.分别将配制好的壳聚糖溶液(0.03％，m/V)和质粒溶液(pcDNA-gC质粒浓度100μg/mL)置于55℃水浴预热30min后，等体积混合(电荷比—N/P为3:1)，涡旋震荡lmin使溶液充分混匀。

④脂质体/pcDNA-gC复合物制备

参照Rosada和蒋金凤所述方法进行，具体操作步骤如下：

A.将所需量的大豆卵磷脂/胆固醇/十八胺(摩尔比5/4/1)，亲脂性抗氧化剂(VE)和氯仿加入梨形圆底烧瓶中(脂质浓度控制在15mg/mL以内)；

B.将烧瓶置旋转蒸发仪上，46℃减压旋转蒸发，干燥成膜；

C.在相转变温度(Tc)之上水化脂质膜，超声波破碎，直至得到略不透明的混悬液，再依次通过0.45um和0.22um聚碳酸酯膜15次；

D.将制备好的阳性脂质体混悬液与稀释好的质粒溶液(按质粒与脂质体质量比1/50)及适量蔗糖混合，真空冷冻干燥过夜，相转变温度(Tc)之上水化，4℃保存备用。

⑤试验分组与免疫

表1实验动物分组

Table 1The groups of experimental animal

56只2-3月龄健康幼猫随机分为14组，按照表1所述免疫试剂、接种剂量、接种途径分组进行接种，免疫完成后参照实施例6所述方法评估gC基因疫苗的安全性和免疫原性。注意于免疫前一天，肌肉注射各组接种猫在注射部位处用0.5％盐酸普鲁卡因对其进行预处理；滴鼻和口服各组接种前12h禁食；基因枪组表皮除毛消毒后使用基因枪进行轰击。

⑥样品采集

免疫接种后1h、4h、8h、12h、ld、7d、28d(4W)、70d(10W)，每组随机取2只，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、气管、鼻甲骨和注射部位肌肉等组织，采集样品先置于液氮，后贮存于-80℃待用。

⑦模板DNA的提取

利用

ViralDNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取各组织样品DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。各组织样品DNA的提取严格按照“等量、同步、处理一致”的原则进行。

⑧定量PCR检测猫疱疹病毒gC基因疫苗在猫体内的动态分布规律

取各组织样品DNA，稀释至100μg/mL，取2μL作为模板DNA，进行定量PCR检测。将获得的Ct值，通过标准曲线换算出各检测样品中pcDNA-gC的拷贝数(copies/ug DNA)。

2、结果

(1)gC基因疫苗鉴定结果：酶切、琼脂糖凝胶等鉴定结果表明质粒pcDNA-gC具有较高的纯度和浓度，可以作为基因疫苗使用。

(2)gC基因疫苗的安全性及免疫原性：与实施例6预期结果相似，FHV-1/WH/2020分离株gC基因疫苗各试验组及质粒载体和生理盐水各对照组，免疫接种后猫的饮食、行为、体温体重、精神状态等未见异常且能监测到中和抗体产生并持续升高，最终稳定在较高水平且能持续较长时间，表明gC基因疫苗具有良好的安全性及免疫原性。

(3)gC基因疫苗在接种猫体内分布情况：实时荧光定量PCR结果显示为在接种后1h时，各待检组织均可检测到质粒pcDNA-gC的存在，10w后除个别组织外其它待检组织依然能够检测到质粒的存在，而生理盐水和空载体pcDNA3.1(+)对照组的各组织器官所有时间点均为阴性，即结果表明gC基因疫苗可在接种猫体内疱疹病毒易感脏器肺、气管、鼻甲、脑等处持续存在并产生中和抗体以降低乃至清除相应组织的病毒载量。

(4)最适免疫程序的选择：采用不同的接种试剂、接种剂量、接种途径，gC基因疫苗在接种猫体内分布有所差异，故可根据质粒pcDNA-gC在FHV-1各易感组织器官内的分布情况及疫苗免疫原性等筛选出最适免疫程序。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株猫疱疹病毒I型病毒株及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttataatcgc cggggatgag aataatataa acataatgcc gtaataaaga taaagactgt 60

gatgagaaca gctcctagta ttacagcaac gacactaacc aacattgatt cactgacgat 120

ttcaggggac gcgtcgtaga cttgtgtgtc gtaaaatccc ggtagaattg gtgggtatcc 180

gatggtctga caggtataac tcacgggtcc atccgtttct gatatatcac acatactctg 240

aatgttgacc aaacctggac gttctataca cggacctgtg atcagtatat cagcactcat 300

tgcttttggt agatggtagt taccaatttt ccacatcaag gatatcccgt cccgtggtac 360

acatttaaca tcacatatag cccgtgtatc agcgaaggta acagacacag taggtgggta 420

atagacgtcc ggggctacac ttttcgtgaa tctcttatag gacacaggac tttcatgcca 480

ttccaaatca catcgtatat ctggtttctc ggaatctgtt ttagttgttg gaatagccaa 540

cacagaactt ctggtgatga gtccatctat ccatacactt gccgtatctg aaatgtattg 600

cctttctatt ggcttcccgt caagatacca tgttagtttc gtggatcgcg gggggaagta 660

attcgccact gcacataccg cctcaaaggt cttattaaat agactggcgc gtggtgtaag 720

atttacgctc ggggggtgat atgccactac agatacattt acctgtccta gcactgtttt 780

atttagtcca tctccaccat agacccgcca tgtataaaca ccggacgtgg cagattccac 840

agatttgatt cccaatgaca tcgcttcggt atgttgtatg ggaatattat ataatgtgta 900

atctggtatc ctagattgta ggatcccgag tgtcgcgtcc ccaagatcca tggaattaac 960

actcccatta cggctgctaa atagtaatat gctggtgcgg gtatgattcc ctacgaagtc 1020

ttctttatcc ccaagaaaat ccccaaatct ggtgcgtggt ttaaaccaga tctcgaagtc 1080

aatagggttg gtaatatgag gttctgtggg tagagtacag tttagctgaa gagggctaaa 1140

atacggtctg tagataaccc ccttatatcc acaatctaat ttaaatctgg ccccgttatt 1200

cttattcttt ttacgctttg gtttttttgt tgttttgagt aaagtggtat tggaatcggt 1260

agatgatcct atgaatgtgg ctgcctgggt ggtactcgga cttgtagcta tagttgtcga 1320

gcttctagtt agagtagtta atgtagatgt tggctgggat gcctgggtgg tactcggact 1380

tgtagctata gttgtcgagc ttctagttag agtagttaat gtagatgttg gctgggatgc 1440

ctgggtggta ctcgaacttg tagctatatt tgtagatctt ctagttggag tagtgaatgg 1500

agatgttggc tgggatatcg gggtggtagc ggacatgctg gtagatgata acatctccgc 1560

agtactatta tcactatttt caatactgac cgcggttgtc gacgaagtac caaactggag 1620

atatgtatat aacagacaga tatagagaag gtagattccg cgtcccatcc tatatcgtct 1680

cat 1683

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgagtg gaaccatccc cgttcagaat gaagagatta ttaaatcaca ggtgaatact 60

gtccgcattt acatagatgg tgcctatgga ataggtaaga gtttaacggc gaagtacctg 120

gtcagagcgg atgaaaatcg accgggatat acttactact tcccagaacc aatgctatac 180

tggcgtagtc tctttgaaac tgatgttgtc ggtggtatct atgccgtcca ggaccggaaa 240

cgacgtggtg aattatcagc tgaagatgct gcctatatca ccgcccacta tcaagcaaga 300

tttgccgcac cataccttct tttacattcc agactatcca caataacagg atatcagaaa 360

gttgtatgtg aggaacaccc cgacgtgacc ctaatcatag atagacaccc tctcgcctct 420

ctggtctgtt tcccactcgc aagatatttt gtgggtgata tgactcttgg gtctgtactt 480

agtctaatgg caacacttcc acgagaacct cctggtggaa atctagttgt aacaaccttg 540

aatatcgagg aacatttgaa gcgtctcagg ggacgctcaa gaaccggaga acagatagac 600

atgaagctaa ttcacgcact acgcaatgta tatatgatgt tggtacatac taagaaattt 660

ttaacaaaaa atactagttg gcgtgatggg tgggggaagc ttaaaatttt ctcccactat 720

gaacggaata ggctcgtgga aactacaata gtttccgatt cgacggagtc agatttatgt 780

gacacattat tcagtgtttt caaagcccgg gagctctccg accaaaatgg agatctactt 840

gacatgcatg catgggtcct cgatggactt atggaaaccc tccaaaattt acagatcttt 900

actttaaatc tggaaggaac ccctgatgaa tgtgccgccg ccttgggagc actgagacaa 960

gatatggata tgacatttat agccgcatgt gatatgcacc gtataagtga agccttgacg 1020

atataccatt aa 1032

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggaaatc gtatacatat tttaatatgc attgcagcat tctacataac catcgcggct 60

gctaggaatg ccccaatgga tctctgttac gccgacccca gagatacatc accacaaccc 120

ataggacatc ctaattataa acaagtgaat atcaacgatc cactacccgc accaaagtgg 180

ggatatgttg aacattccag tggatgtgaa ttacgtttat tggacccgag agttgatgtc 240

tcttcaagat caccagagaa ggcagacgct acgattgctt ggacttttga tctcggaaca 300

tgtcaaatac ctatcgcgta tagagaatat tataactgta ctgggaattt aataccctcc 360

ccagaaactt gcgaagggta ttccgcgacc tccatacgct tcgaaggtct aaccatctat 420

accttggtaa atataagtct actccttcaa ccaggaatat tcgattccgg gagtttcctg 480

tattcattta tatatggtca aaatagatac aatggacgta ttatagttca tgtagaaaaa 540

aatactgatt atccctgcaa aatgtatcat ggactcatgg ctccatttga ccatcatccc 600

caaagccacg ttgaaactcc gaatgataag aatcatcgta gagggcgggg atgttttccc 660

gaattggtgg aacctgttct atgggttaat atcagcagtg atcttattgg tggtccacct 720

ttcgactata atcatgaaga tgaggctgat attgagagtg atgagctccc ggaggaggat 780

atacataact actcagattg tcgtgcgact aatatgtttg ttccgagaga gcccctcagt 840

caagttcttg gttctcaaag tctactggtt ggtagtttag gtttccagat aattactcaa 900

ccctggcaac tgaagcagaa tgaaagttat gatggactaa gaaatgcctc tcttgaaccc 960

cgacaccttg actccagtaa cgatcgtgat ctactagatg aaactgaaat gattggatcg 1020

attattacga ctccaccacc aacccatcca aaaggtgtca atgggggttt cctccaagat 1080

ctaccaatta tcgagcctac gaccgaacca tgcttagtac atacaaagat cattgggatc 1140

ggaacagtag tcgttgtatt tttgttattt attctcatat ccctatgtgt ttatacttgc 1200

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<210> 4

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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ggatgtacag gagaggtgag tgttctaaaa gtatgtatag atcgtggggt atgtccggat 240

gatatcgtta taaataagag atgtggtcac aaaatgcttg aaaccccact agcgttggcg 300

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accgtgtttc caattctcac acccgaaaaa agtggccttg gtattcaggg ggccactacg 420

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acattttttg tgaccgtaaa ggcaaaacat cccggaccat cgttaacccc agcaccggtt 540

cacttaataa caccacatcg ccatggggca catttccacg taagaaacta tcattcgcat 600

gtctacattc cgggagataa gttcttatta gaaatgcacc tcaaatcaga tatctatgat 660

ccagaatttt cagcaacaat agactggtat tttatggaga ctgatataaa atgcccagtt 720

tttagaattt atgaaacttg tatatttcac ccccatgccg catcctgtct acatccggaa 780

gatccctcat gcagttttac atcaccactt cgagcggtat ctttaattaa tagattttat 840

ccaaaatgcg atcacagata tgccgattgg acatccagat gtatcaacac tccaagtata 900

aatcatatgc catatatcga acagccggcc aataacgtgg atctaaagtt tatcaatgta 960

cccaccaacg cttctgggtt gtacgtattc atacttcgtt ataatggaca tccggaagaa 1020

tggacctata cactcatatc aacaggagct aaatttttga atgtgattag ggatctgaca 1080

cgcccacgtc ttggtagtca tcaaatagag accgatatta gcacatcttc gcagtcgcct 1140

accacggaga caccacgaaa catacatata acgtgggcga gacgttatct aaaggttatc 1200

ataggaataa tttgcgtagc tggtatcctt ttgattgtaa tctctatcac atgttatatt 1260

cgatttcgtc atatgcgata taaaccatat gaagtgatca acccattccc tgcggtatat 1320

accagcattc ctagtaacga tcccgacgaa ctctactttg aacgtatcgc atcgaacgac 1380

gaagaatcgg cagatgattc ttttgatgaa tcagatgagg aggagccatt gaataatcat 1440

catatttcaa caacccaaca tactgatatt aatccagaaa aatccggatc tgggtacagt 1500

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agtcgcgtag ttaaaagatt aaagtctatt ttaaaatga 1599

<210> 5

<211> 2847

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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ggctattttc gacagagatg ttttttccct tctctactcg gtattgcagc gactggctcc 120

agacatggta acggatcgtc gggattaacc agactagcta gatatgtttc atttatctgg 180

atcgtactat tcttagtcgg tccccgtcca gtagagggtc aatctggaag cacatcggaa 240

caaccccggc ggactgtagc tacccctgag gtagggggta caccaccaaa accaactaca 300

gatcccaccg atatgtcgga tatgagggaa gctctccgtg cgtcccaaat agaggctaac 360

ggaccatcga ctttttatat gtgtccacca ccttcaggat ctactgtcgt gcgtttagag 420

ccaccacggg cctgtccaga ttataaacta gggaaaaatt ttaccgaggg tatagctgta 480

atatttaaag aaaatatagc gccatataaa ttcaaggcaa atatatacta taaaaacatt 540

attatgacaa cggtatggtc tgggagttcc tatgccgtta caaccaaccg atatacagac 600

agggttcccg tgaaagttca agagattaca gatctcatag atagacgggg tatgtgcctc 660

tcgaaagctg attacgttcg taacaattat caatttacgg cctttgatcg agacgaggat 720

cccagagaac tgcctctgaa accctccaag ttcaacactc cagagtcccg tggatggcac 780

accaccaatg aaacatacac aaagatcggt gctgctggat ttcaccactc tgggacctct 840

gtaaattgca tcgtagagga agtggatgca agatctgtat atccatatga ctcatttgct 900

atctccactg gtgacgtgat tcacatgtct ccattctttg ggctgaggga tggagcccat 960

gtagaacata ctagttattc ttcagacaga tttcaacaaa tcgagggata ctatccaata 1020

gacttggata cgcgattaca actgggggca ccagtttctc gcaatttttt ggaaactccg 1080

catgtgacag tggcctggaa ctggacccca aagtctggtc gggtatgtac cttagccaaa 1140

tggagggaaa tagatgaaat gctacgcgat gaatatcagg gctcctatag atttacagcc 1200

aagaccatat ccgctacttt catctccaat acttcacaat ttgaaatcaa tcgtatccgt 1260

ttgggggact gtgccaccaa ggaggcagcc gaagccatag accggattta taagagtaaa 1320

tatagtaaaa ctcatattca gactggaacc ctggagacct acctagcccg tgggggattt 1380

ctaatagctt tccgtcccat gatcagcaac gaactagcaa agttatatat caatgaatta 1440

gcacgttcca atcgcacggt agatctcagt gcactcctca atccatctgg ggaaacagta 1500

caacgaacta gaagatcggt cccatctaat caacatcata ggtcgcggcg cagcacaata 1560

gaggggggta tagaaaccgt gaacaatgca tcactcctca agaccacctc atctgtggaa 1620

ttcgcaatgc tacaatttgc ctatgactac atacaagccc atgtaaatga aatgttgagt 1680

cggatagcca ctgcctggtg tacacttcag aaccgcgaac atgtgctgtg gacagagacc 1740

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ctacttggag atgccgtcgc cgtaacacaa tgtgttaaca tttctagcgg acatgtctat 1860

atccaaaatt ctatgcgggt gacgggttca tcaacgacat gttacagccg ccctcttgtt 1920

tccttccgtg ccctcaatga ctccgaatac atagaaggac aactagggga aaacaatgaa 1980

cttctcgtgg aacgaaaact aattgagcct tgcactgtca ataataagcg gtattttaag 2040

tttggggcag attatgtata ttttgaggat tatgcgtatg tccgtaaagt cccgctatcg 2100

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gtcagagtgg ataataatct tgtcatcatg cgtggtatgg caaatttttt tcagggactc 2340

ggggatgtgg gggctggttt cggcaaggtg gtcttagggg ctgcgagtgc ggtaatctca 2400

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gcaaatccaa tgaaagcctt atatcctgtg acgactagga atttgaaaca gacggctaag 2580

agccccgcct caacggctgg tggggatagc gacccgggag tcgatgactt cgatgaggaa 2640

aagctaatgc aggcaaggga gatgataaaa tatatgtccc tcgtatcggc tatggagcaa 2700

caagaacata aggcgatgaa aaagaataag ggcccagcga tcctaacgag tcatctcact 2760

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gatgatactg aaacaaatct tgtctaa 2847

<210> 6

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgatgacac gtctacattt ttggtggtgt ggaatctttg cggtcctgaa atatctggta 60

tgtacttcaa gccttacgac cacgccaaaa acaactacgg tttatgtgaa gggatttaat 120

atacctccac tacgctacaa ttatactcaa gccagaatcg tgccaaaaat tccccaggcg 180

atggatccga agataacagc tgaagtacgt tatgtaacat caatggattc atgtgggatg 240

gtggcattga tatcagagcc ggatatagac gctactattc gaaccataca actatctcaa 300

aaaaaaacat ataacgcgac tataagttgg tttaaggtaa cccagggttg tgaataccct 360

atgtttctta tggatatgag actttgtgat cctaaacggg aatttggaat atgtgcttta 420

cggtcgcctt catattggtt ggaaccttta acaaagtata tgttcctaac agacgatgaa 480

ctgggtttga ttatgatggc cccggcccaa tttaatcaag gacaatatcg aagagttata 540

accatcgatg gttccatgtt ttatacagat tttatggtac aactatctcc aacgccatgt 600

tggttcgcaa aacccgatag atacgaagag attctacatg aatggtgtcg aaatgttaaa 660

actattggcc ttgatggagc tcgtgattac cactattatt gggtacccta taacccacaa 720

cctcaccata aagccgtact cttatattgg tatcggactc atggccgaga acccccagta 780

agattccaag aggccattcg atatgatcgt cccgccatac cgtctgggag tgaggattcg 840

aaacggtcca acgactctag aggagaatcg agtggaccca attggataga cattgaaaat 900

tacactccta aaaataatgt gcctattata atatctgacg atgacgttcc tacagcccct 960

cccaagggca tgaataatca gtcagtagtg atacccgcaa tcgtactaag ttgtcttata 1020

atagcactga ttctaggagt gatatattat attttgaggg taaagaggtc tcgatcaact 1080

gcatatcaac aacttcctat aatacataca actcaccatc cttaa 1125

Claims (6)

1.一株猫疱疹病毒I型病毒株，其特征在于，其保藏编号为：CCTCC NO:V202126，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

2.如权利要求1所述的猫疱疹病毒I型病毒株，其特征在于，所述毒株的免疫原性基因gC的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1所述的猫疱疹病毒I型病毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO：1所示的免疫原性基因gC在制备疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为防治猫传染性鼻气管炎疾病的疫苗。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疫苗为全病毒灭活疫苗、减毒疫苗或基因工程疫苗。

6.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的猫疱疹病毒I型病毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO：1所示的免疫原性基因gC。

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