CN111690688B - 表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其应用 - Google Patents

表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其应用。本发明构建了靶向REV基因组序列的CRISPR/Cas9系统，通过对设计的靶向REV的sgRNAs进行筛选，获得了具有最佳敲除效果的sgRNA。研究发现，靶向REV的CRISPR/Cas9能够有效阻止REV对宿主细胞的感染。将上述CRISPR/Cas9表达框架插入MDV基因组，构建了表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组MDV；该重组病毒能够有效阻止REV对宿主细胞的感染，并对REV强毒的攻击具有明显的预防和病毒清除作用。本发明提出的一种表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组MDV有望作为一种新型疫苗用于禽网状内皮组织增生病的防控。

Description

表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种表达靶向禽网状内皮组织增生病病毒的CRISPR/Cas9系统的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，本发明属于医学或兽医学技术领域。
背景技术
禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)群的反转录病毒引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一群病理综合征，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其他组织慢性肿瘤。近些年流行病学调查研究显示，REV在我国的流行与分布十分广泛。REV感染后造成机体免疫抑制，影响其他疫苗的免疫效果，并造成感染鸡易于继发其他细菌和病毒感染，给我国养禽业造成了严重的直接和间接经济损失。REV在现地养殖过程中，常与其他禽免疫抑制性病毒以及禽肿瘤病毒发生混合感染。多种病毒混合感染常发生协同致病作用，使得上述疫病防控难度进一步增加。疫苗免疫是防控动物疫病的主要手段。然而，目前国内外还没有有效的商品化疫苗用于RE的预防。
CRISPR/Cas9技术是近年研究发现的一种全新的基因编辑技术。该技术由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组或非同源末端链接，进而实现在目的DNA上进行编辑。与ZFN和TALEN技术相比，该技术不仅更为简便、快捷，而且可以在一个细胞内同时进行多个基因的编辑，成倍的提高了基因编辑的效率。2013年末，CRISPR/Cas9技术被美国科学杂志评选为2013年年度十大突破之一。病毒感染细胞后，其基因组通过复制、转录、翻译等过程完成其生活周期。某些DNA病毒或逆转录病毒基因组会整合到宿主基因组中，成为CRISPR/Cas9系统作用的靶标。
马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。MDV属于α-疱疹病毒亚科马立克氏病样病毒属，是一种细胞结合性疱疹病毒，其基因组为线状双股DNA，约为180kb。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡，同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。MDV包括三种血清型，血清1型病毒包括弱毒疫苗株和具有致病性的强毒株。鸡的非致瘤病毒分离株和火鸡疱疹病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV。
MDV是一种疱疹病毒，该病毒基因组较大，可供外源基因插入或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。MDV作为疫苗载体还具有其独特的自身优势。MDV疫苗是在1日龄进行免疫接种，因而有助于尽早在机体内表达CRISPR/Cas9相关基因，发挥预防作用；MDV可持续性感染，有利于在体内持久表达外源基因，发挥长期效用；MDV为专一的细胞结合型病毒，通过细胞与细胞之间的直接接触进行传播，因此受母源抗体干扰较小。然而，目前国内外均没有将MDV及其他疱疹病毒作为CRISPR/Cas9递呈载体的报道。CRISPR/Cas9系统的有效性取决于对靶向病毒基因组序列的sgRNAs的设计以及对其表达元件的合理选择与优化。靶向REV的CRISPR/Cas9系统是否具有预防和清除REV感染的作用，CRISPR/Cas9系统元件能否成功插入MDV基因组，拯救获得重组MDV病毒，并在鸡体内发挥抗病毒效果，这些在本发明提出之前均是无法预见的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种靶向禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)的CRISPR/Cas9系统及其在抑制禽网状内皮组织增生病病毒中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其在预防和治疗禽网状内皮组织增生病中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种靶向REV的CRISPR/Cas9系统，所述的系统包括：
(1)靶向REV病毒基因组的sgRNAs的表达质粒，其中，所述的表达质粒为表达具有SEQ ID NO.6所示序列sgRNAs的表达质粒；
(2)Cas9基因表达质粒；或
靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒。
其中，优选的，所述的靶向REV病毒基因组的sgRNAs的表达质粒为两个sgRNAs表达质粒的组合，所述的sgRNAs表达质粒的组合包括表达具有SEQ ID NO.6所示序列sgRNAs的表达质粒，还包括表达具有SEQ ID NO.1所示序列sgRNAs的表达质粒或表达具有SEQ IDNO.21所示序列sgRNAs的表达质粒；或
所述的共表达质粒为具有SEQ ID NO.6所示序列sgRNAs与具有SEQ ID NO.1所示序列sgRNAs或具有SEQ ID NO.21所示序列sgRNAs以及Cas9基因共表达的质粒。
其中，优选的，Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.27示。
其中，优选的，表达具有SEQ ID NO.6所示序列sgRNAs的表达质粒通过以下方法制备得到：
(1)构建含有sgRNAs表达框架的质粒
将sgRNAs表达框架与pGEM-T载体连接，获得含有sgRNAs表达框架的质粒，命名为pGEM-T-U6，其中所述的sgRNAs表达框架具有SEQ ID NO.26所示的序列；
(2)以质粒pGEM-T-U6为模板，通过融合PCR方法获得具有SEQ ID NO.6所示序列sgRNAs的表达质粒，方法如下：1)以U6F和gLTR6R为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR6-1片段；2)以gLTR6F和GEMTR为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR6-2片段；3)分别纯化上述得到的2个DNA片段gLTR6-1和gLTR6-2，并以此2个片段为模板，以U6F和GEMTR为引物，通过融合PCR方法扩增得到gLTR6表达框架，将得到的gLTR6表达框架利用SpeI和NheI酶切位点克隆入pGEM-T载体，获得的表达载体命名为pGEM-T-gLTR6，即为具有SEQ IDNO.6所示序列sgRNAs的表达质粒；
其中，所用的引物序列如下所示：
U6F：TTTACTAGTGTACAAAAAAGCAGGCTT；
GEMTR：TTTGCTAGCTCTCCCATATGGTCGACCT；
gLTR6R：TCCTACACATTGTTGTGACGCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gLTR6F：GCGTCACAACAATGTGTAGGAGTTTTAGAGCTAGAAATA；
表达具有SEQ ID NO.1所示序列sgRNAs的表达质粒pGEM-T-gLTR1或表达具有SEQID NO.21所示序列sgRNAs的表达质粒pGEM-T-gPol1按照上述步骤(1)和步骤(2)相同的方法制备，但所用引物序列不同，其中用于制备表达具有SEQ ID NO.1所示序列sgRNAs的表达质粒的引物为：
gLTR1R：CCCGGAGCTCCCTCCCACATCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gLTR1F：GATGTGGGAGGGAGCTCCGGGGTTTTAGAGCTAGAAATA；
其中用于制备表达具有SEQ ID NO.21所示序列sgRNAs的表达质粒的引物为：
gPol1R：CGATAATTGCTACAGATTCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gPol1F：GAGAATCTGTAGCAATTATCGGTTTTAGAGCTAGAAATA。
其中，优选的，靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒通过以下方法制备得到：
以构建的pGEM-T-gLTR1为模板，PCR扩增gLTR1表达框架，两端加入BamH1和BglII酶切位点；通过BglII酶切位点将gLTR1表达框架插入pENTR1载体，获得gLTR1表达质粒pENTR1-gLTR1；以构建的pGEM-T-gLTR6为模板，PCR扩增gLTR6表达框架，两端加入BglII和SalI酶切位点；通过BglII和SalI酶切位点将gLTR6表达框架插入pENTR1-gLTR1载体，获得gLTR1共表达质粒pENTR1-gLTR1/6；PCR扩增Cas9基因并插入pCAGGS质粒，构建Cas9表达质粒pCAGGS-Cas9；用SalI和HindIII对pCAGGS-Cas9进行酶切，获得Cas9基因表达框架；通过SalI和HindIII酶切位点将Cas9表达框架插入pENTR1-gLTR1/6载体，获得共表达gLTR1、gLTR6以及Cas9的质粒，命名为pENTR1-Cas9-gLTR1/6，即为靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒。
进一步的，本发明还提出所述的CRISPR/Cas9系统在制备抑制禽网状内皮组织增生病病毒试剂中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)，其是通过以下方法构建得到：
(1)含有CRISPR/Cas9表达框架的重组突变粘粒p814-Cas9-gLTR1/6的构建：
将构建得到的CRISPR/Cas9入门表达质粒pENTR1-Cas9-gLTR1/6与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用
Figure BDA0002498807690000041
LR ClonaseTM II Enzyme Mix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-Cas9-gLTR1/6质粒中的CRISPR/Cas9表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CRISPR/Cas9表达框架的重组粘粒p814-Cas9-gLTR1/6；
(2)重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6的拯救
用质粒试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-Cas9-gLTR1/6五个重组粘粒DNA；通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rMDV-Cas9-gLTR1/6。
其中，优选的，p814-5US2KanccdB、p814-1、p814-2、p814-3、p814-4按照公开号为CN104946678B，发明名称为马立克氏病病毒感染性重组克隆系统及其构建方法和应用的中国专利申请中记载的方法进行构建。
更进一步的，本发明还提出了所述的表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒在制备预防和治疗禽网状内皮组织增生病药物中的应用。
其中，优选的，所述的药物为疫苗。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
CRISPR/Cas9系统是一种新型的基因编辑技术，现已广泛用于动物、植物和微生物的基因组编辑，在病毒性疾病的基因治疗中具有潜在应用价值。本发明通过设计构建针对REV基因组功能区域和病毒基因的sgRNAs以及Cas9表达质粒，构建靶向REV的CRISPR/Cas9系统，探索其在REV预防中的应用。本发明通过体外细胞水平的分析，首先筛选获得对REV基因组具有最佳敲除活性的sgRNAs，进而研究该系统阻止REV感染宿主细胞的能力。本发明首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于REV的预防，探索其对REV感染的预防作用，为REV的防控提供了新的思路。
采用合适的表达系统对CRISPR/Cas9元件进行表达与递呈，使其在动物体内发表进而发挥作用，是目前CRISPR/Cas9研究的重要目标，同时也是该研究领域的难点之一。本发明选用疱疹病毒载体进行CRISPR/Cas9系统的递呈，构建表达CRISPR/Cas9系统元件的重组疱疹病毒，这在世界上尚属首次。本研究发现，重组MDV能够高效表达靶向REV的CRISPR/Cas9系统元件，使该系统能够在动物体内发挥抗病毒作用。以MDV弱毒疫苗株为载体，体内递呈靶向REV的CRISPR/Cas9系统，构建重组病毒疫苗株，不仅可以作为REV的预防和治疗手段，还可以对MDV提供良好的保护，从而有助于解决REV和MDV混合感染的实际问题。
附图说明
图1为REV病毒基因组及sgRNA位置示意图；
图2为靶向REV病毒基因组的sgRNA的敲除活性鉴定和筛选；
图3为靶向REV的sgRNAs组合使用的敲除效果；
图4为靶向REV的CRISPR/Cas9对REV感染宿主细胞的抑制作用；
图5为表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组MDV的构建示意图；
图6为重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6表达Cas9蛋白情况检测；
图7为重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6抵抗REV感染宿主细胞的作用；
图8为重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6与亲本病毒rMDV接种REV感染鸡后试验鸡增重情况；
图9为重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6与亲本病毒rMDV接种REV感染鸡后试验鸡法氏囊发育情况；
图10为重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6与亲本病毒rMDV接种REV感染鸡后试验鸡胸腺发育情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：靶向REV的CRISPR/Cas9系统的设计及最佳sgRNA的筛选
1.1靶向REV的sgRNAs的设计
根据REV HLJR0901株病毒基因组序列，设计25条分别靶向REV病毒基因组U3、R、U5区域及Pol基因的sgRNAs(图1)。每条sgRNA的靶向序列长度为20bp，下游为3bp的NGG(PAM)序列(表1)，即5’-N20NGG-3’模式。以质粒pGEM-T-U6(其上含有sgRNA表达框架，SEQ IDNO.26所示)为模板，用表2所示引物，通过融合PCR方法获得sgRNAs表达框架，方法如下：1)以U6F和gLTR1R为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR1-1序列；2)以gLTR1F和GEMTR为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR1-2序列；3)分别纯化上述得到的2个DNA片段gLTR1-1和gLTR1-2，并以此2个片段为模板，以U6F和GEMTR为引物，扩增得到gLTR1表达框架。将得到的gLTR1表达框架利用SpeI和NheI酶切位点克隆入pGEM-T载体，获得pGEM-T-gLTR1。采用同上方法分别构建获得其余24条sgRNAs的表达质粒。
表1靶向REV的sgRNA
Figure BDA0002498807690000071
Figure BDA0002498807690000081
a划线部分为PAM序列.
表2用于构建sgRNAs表达框架的引物序列
Figure BDA0002498807690000082
Figure BDA0002498807690000091
Figure BDA0002498807690000101
1.2靶向REV的最佳sgRNA的筛选
将上述构建的sgRNAs表达质粒分别与Cas9基因表达质粒pspCas9以及REV报告病毒质粒pREV-EGFP共同转染DF1细胞。转染后3天，裂解细胞，通过流式细胞仪检测GFP基因表达水平。如图2所示，与转染gEmpty的对照细胞孔相比，转染靶向REV的sgRNA的细胞孔中GFP蛋白的表达水平显著降低，说明靶向REV的CRISPR/Cas9系统能够明显的抑制REV病毒蛋白的表达。比较设计的各sgRNAs的敲出效果可见，gLTR6的敲除效果最佳。为了分析筛选获得的敲除效果较好的sgRNAs组合使用是否会增强对病毒蛋白表达的抑制效果，我们对sgRNA进行了组合使用。将gLTR6和gLTR1、gLTR6和gPol1与pspCas9、pREV-GFP共同转染DF1。转染后3天，裂解细胞，通过流式细胞仪检测GFP基因表达水平。如图3所示，与单独使用gLTR6相比，gLTR1/gLTR6、gLTR6/gPol1转染组的GFP表达水平进一步降低，说明gRNA组合使用增强了靶向REV的CRISPR/Cas9的敲除效果。
实施例2：靶向REV的CRISPR/Cas9阻止病毒感染宿主细胞的作用
2.1靶向REV的gRNA与Cas9基因共表达质粒的构建
以pGEM-T-gLTR1为模板，PCR扩增gLTR1表达框架，两端加入BamH1和BglII酶切位点；通过BglII酶切位点将gLTR1表达框架插入pENTR1载体，获得gLTR1表达质粒pENTR1-gLTR1。以pGEM-T-gLTR6为模板，PCR扩增gLTR6表达框架，两端加入BglII和SalI酶切位点；通过BglII和SalI酶切位点将gLTR6表达框架插入pENTR1-gLTR1载体，获得gLTR1共表达质粒pENTR1-gLTR1/6。PCR扩增Cas9基因(SEQ ID NO.27所示)并插入pCAGGS质粒，构建Cas9表达质粒pCAGGS-Cas9；用SalI和HindIII对pCAGGS-Cas9进行酶切，获得Cas9基因表达框架；通过SalI和HindIII酶切位点将Cas9表达框架插入pENTR1-gLTR1/6载体，获得共表达gLTR1/gLTR6以及Cas9的质粒pENTR1-Cas9-gLTR1/6。
2.2靶向REV的CRISPR/Cas9系统对REV感染宿主细胞的抑制作用
将筛选获得的最佳gRNA表达质粒组合gLTR1/gLTR6与Cas9的共表达质粒pENTR1-Cas9-gLTR1/6转染DF1细胞，转染后接种REV病毒，同时设置对照组。分别在感染后1、3、5天取病毒感染细胞上清液，滴定感染细胞中REV病毒的TCID50。如图4所示，与转染空白gRNA的对照组相比，双sgRNAs转染组的病毒复制水平显著性降低，表明靶向REV的CRISPR/Cas9对REV感染宿主细胞具有明显的抑制作用。
实施例3：表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组MDV的构建和鉴定
3.1含有CRISPR/Cas9表达框架的重组突变粘粒p814-Cas9-gLTR1/6的构建
将上述构建的CRISPR/Cas9入门表达质粒pENTR1-Cas9-gLTR1/6与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB(构建方法请参见公开号为CN104946678B，发明名称为马立克氏病病毒感染性重组克隆系统及其构建方法和应用的中国专利申请)利用
Figure BDA0002498807690000121
LR ClonaseTMII Enzyme Mix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-Cas9-gLTR1/6质粒中的CRISPR/Cas9表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CRISPR/Cas9表达框架的重组粘粒p814-Cas9-gLTR1/6(图5)。
3.2重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6的拯救
用质粒试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4(构建方法请参见公开号为CN104946678B，发明名称为马立克氏病病毒感染性重组克隆系统及其构建方法和应用的中国专利申请)、p814-Cas9-gLTR1/6五个重组粘粒DNA。通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染CEF，具体地：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×105细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。在1.5ml EP管中混合灭菌水、五个重组粘粒DNA、2M CaCl2；在另一个1.5ml EP管中加入2×HBS缓冲液；将CaCl2-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，室温孵育30min。将制备的磷酸钙-DNA沉淀加入到制备的CEF细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rMDV-Cas9-gLTR1/6。
3.3重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6的鉴定
将上述拯救获得的重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6与原MDV疫苗株病毒以100PFU接种培养于六孔板中的CEF细胞，培养120h后收集细胞，用Cas9蛋白单克隆抗体和FITC标记的抗鼠二抗进行间接免疫荧光试验。过程如下：将接毒细胞用无水乙醇室温固定20min。用PBS将固定好的培养板洗一遍。加入1:100稀释的Cas9单克隆抗体，37℃湿盒中孵育1h。用PBS洗5遍。加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃湿盒中孵育1h。用PBS洗5遍，于荧光显微镜下观察结果。结果如图6所示，重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6感染细胞中可以检测到明显的绿色荧光信号，表明Cas9蛋白成功表达。
3.4重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6对REV感染宿主细胞的抑制作用
将表达靶向REV的CRISPPR/Cas9的重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6接种CEF，接种后24小时感染REV。分别在感染后1、3、5天取病毒感染细胞上清液，滴定感染细胞中REV病毒的TCID50。如图7所示，与感染亲本病毒的对照组相比，重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6接种组的REV病毒复制水平显著性降低，表明重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6能够明显抵抗REV对宿主细胞的感染。
实施例4：重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6对REV感染鸡的预防和与治疗作用
4.1重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6对REV感染鸡的预防作用
取1日龄SPF鸡30只，随机分为3组，每组10只。组1和组2试验鸡分别于1日龄接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6和亲本病毒rMDV，4000PFU/只，组3试验鸡不接种作为对照组。8日龄时，组1和组2分别攻毒REV HLJR0901株病毒(104TCID50/只)，组3试验鸡不攻毒。攻毒REV后7、14、21、28天，每组各取10只鸡，采集抗凝血，将血浆接种CEF细胞；接种CEF后6天，利用REV gp90蛋白单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验，检测REV感染鸡的病毒血症情况。结果表明，亲本病毒rMDV接种组试验鸡攻毒REV后7、14、21、28天，病毒血症阳性率分别为6/10、4/10、1/10、0/10；而重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6接种组试验鸡攻毒REV后7、14、21、28天，病毒血症阳性率分别为210、1/10、0/10、0/10，以上结果说明接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6能够预防REV感染引起的病毒血症。
4.2重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6对REV感染鸡的治疗作用
取1日龄SPF鸡75只，随机分为3组，每组25只。组1和组2试验鸡分别于1日龄接种REV HLJR0901株病毒(104TCID50/只)，组3试验鸡不接种作为对照组。8日龄时，组1接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6，组2接种亲本病毒rMDV，4000PFU/只。接种MDV后7、14、21、28天，每组各取5只鸡称重，剖检后称取法氏囊和胸腺重量，计算法氏囊/体重比和胸腺/体重比：法氏囊或胸腺/体重比＝1000×法氏囊或胸腺重量(g)/体重(g)。接种MDV后7、14、21、28天，每组各取10只鸡，采集抗凝血，将血浆接种CEF细胞；接种CEF后6天，利用REV gp90蛋白单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验，检测REV感染鸡的病毒血症情况。
试验结果表明，REV感染后引起试验鸡生长迟缓，试验鸡体重显著低于正常对照组；与亲本病毒rMDV接种组相比，REV感染鸡接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6后体重增加正常，与健康对照组试验鸡无显著差异(图8)，说明该重组病毒能够抑制REV感染导致的矮小综合征。同时研究发现，REV感染的试验鸡发生法氏囊和胸腺的萎缩，表现为法氏囊和胸腺重量与体重比显著低于健康对照组；而接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6后，试验鸡法氏囊和胸腺发育正常，未出现明显的萎缩症状(图9-10)。对REV感染鸡病毒血症检测结果发现，REV感染后接种亲本病毒rMDV的试验组，在接种7、14、21、28天的病毒血症阳性率分别为8/10、8/10、6/10、7/10；而接种重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6的试验组，病毒血症阳性率明显降低，在接种7、14、21、28天的病毒血症阳性率分别为7/10、4/10、3/10、3/10，以上结果说明重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6能够明显降低REV感染引起的病毒血症。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒及其应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atgtgggagg gagctccggg ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
agctccgggg ggaatagcgc tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ccgccattgt acttgatata ttt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
tcggaatcgg catcaagagc agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ccaggtgcat ctcttgctcg ggg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
ccgtcctaca cattgttgtg acg 23
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
cctacacatt gttgtgacgt gcg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ctacacattg ttgtgacgtg cgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
cccagattcg aatctgtaat aaa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
tttcttctat atcctcagat tgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
gtgttggctg gcctactggg tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
cctactgggt ggggtaggga tcc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
ggactgaatc cgtagtattt cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 14
ccgtagtatt tcggtacaac att 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 15
tatttcggta caacatttgg ggg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 16
cctactgttt cttcgaactc cgg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 17
cctcgcgagg gtttgggagg atc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 18
ccgtctctaa gacggtgata cta 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 19
ccttgtgttt gttcgtcact tgt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 20
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<211> 23
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<213> artificial sequence
<400> 21
agaatctgta gcaattatcg ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 22
ccccccgaaa tacggacaga agg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 23
ccccggggtt ggcatccaca caa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 24
cctgcgcgaa actattcgca aat 23
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 25
cctccctgtg cgaaagtccg gca 23
<210> 26
<211> 487
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 26
actagtgtac aaaaaagcag gctttaaagg aaccaattca gtcgactgga tccggtacca 60
aggtcgggca ggaagagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca 120
aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa 180
atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta 240
aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata 300
tcttgtggaa aggacgaaac accggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 360
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcta gacccagctt 420
tcttgtacaa agttggcatt aatcactagt gcggccgcct gcaggtcgac catatgggag 480
agctagc 487
<210> 27
<211> 4158
<212> DNA
<213> Cas9
<400> 27
atggtacccg gggccaccat ggataaaaaa tacagcattg gtctggacat tggcacgaat 60
agcgttggtt gggcagtgat taccgatgaa tacaaagtcc cgtcgaaaaa attcaaagtg 120
ctgggtaaca ccgatcgcca tagcattaag aaaaacctga tcggtgcgct gctgtttgat 180
tctggcgaaa ccgcggaagc aacgcgtctg aaacgtaccg cacgtcgccg ttacacgcgc 240
cgtaaaaatc gtatttgcta tctgcaggaa atctttagca acgaaatggc gaaagtcgat 300
gactcatttt tccaccgcct ggaagaatcg tttctggtgg aagaagataa aaaacatgaa 360
cgtcacccga ttttcggcaa tatcgttgat gaagtcgcgt accatgaaaa atatccgacg 420
atttaccacc tgcgtaaaaa actggtggat tctaccgaca aagccgatct gcgcctgatt 480
tatctggcac tggctcatat gatcaaattt cgtggtcact tcctgattga aggcgacctg 540
aacccggata atagtgacgt cgataaactg tttattcagc tggtgcaaac ctataatcag 600
ctgttcgaag aaaacccgat caatgcaagt ggtgttgatg cgaaagccat tctgtccgct 660
cgcctgagta aatcccgccg tctggaaaac ctgattgcac agctgccggg tgaaaagaaa 720
aacggtctgt ttggcaatct gatcgctctg tcactgggcc tgacgccgaa ctttaaatcg 780
aatttcgacc tggcagaaga tgctaaactg cagctgagca aagataccta cgatgacgat 840
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gcgccgctgt cagcctcgat gattaaacgc tacgatgaac atcaccagga cctgaccctg 1020
ctgaaagcac tggttcgtca gcaactgccg gaaaaataca aagaaatttt ctttgaccaa 1080
agtaaaaatg gttatgcagg ctacatcgat ggcggtgctt cccaggaaga attctacaaa 1140
ttcatcaaac cgatcctgga aaaaatggat ggtacggaag aactgctggt gaaactgaat 1200
cgtgaagatc tgctgcgtaa acaacgcacc tttgacaacg gtagcattcc gcatcagatc 1260
cacctgggcg aactgcatgc gattctgcgc cgtcaggaag atttttatcc gttcctgaaa 1320
gacaaccgtg aaaaaatcga aaaaatcctg acgtttcgca tcccgtatta cgttggtccg 1380
ctggcacgtg gtaatagccg cttcgcatgg atgacccgca aatctgaaga aaccattacg 1440
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atgaccaatt tcgataaaaa cctgccgaat gaaaaagtgc tgccgaaaca ttctctgctg 1560
tatgaatact ttaccgttta caacgaactg acgaaagtga aatatgttac cgagggtatg 1620
cgcaaaccgg cgtttctgag tggcgaacag aaaaaagcca ttgtggatct gctgttcaaa 1680
accaatcgta aagttacggt caaacagctg aaagaagatt acttcaagaa aattgaatgt 1740
ttcgacagcg tggaaatttc tggtgttgaa gatcgtttca acgcctctct gggcacctat 1800
catgacctgc tgaaaatcat caaagacaaa gattttctgg ataacgaaga aaacgaagac 1860
attctggaag atatcgtgct gaccctgacg ctgttcgaag atcgtgaaat gattgaagaa 1920
cgcctgaaaa cgtacgcaca cctgtttgac gataaagtta tgaaacagct gaaacgccgt 1980
cgctataccg gttggggccg tctgagccgc aaactgatta atggtatccg cgataaacaa 2040
tcaggcaaaa cgattctgga tttcctgaaa tcggacggct ttgccaaccg taatttcatg 2100
cagctgatcc atgacgattc cctgaccttt aaagaagaca ttcagaaagc acaagtgtca 2160
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tacctgcaaa atggtcgtga catgtatgtg gatcaggaac tggacatcaa ccgcctgtct 2520
gactatgatg tcgaccacat tgtgccgcag agctttctga aagacgattc tatcgataac 2580
aaagttctga cccgtagtga taaaaaccgc ggcaaaagcg acaatgtccc gtctgaagaa 2640
gttgtgaaga aaatgaaaaa ctactggcgt caactgctga atgcgaaact gattacgcag 2700
cgtaaattcg ataacctgac caaagcggaa cgcggcggtc tgtccgaact ggataaagcc 2760
ggttttatca aacgtcaact ggttgaaacc cgccagatta cgaaacatgt cgcccagatc 2820
ctggattcac gcatgaacac gaaatacgac gaaaacgata aactgatccg tgaagtcaaa 2880
gtgatcaccc tgaaaagtaa actggtttcc gatttccgta aagactttca gttctacaaa 2940
gtccgcgaaa ttaacaatta ccatcacgca cacgatgctt atctgaatgc agtggttggt 3000
accgctctga tcaaaaaata tccgaaactg gaaagcgaat ttgtgtatgg cgattacaaa 3060
gtctatgacg tgcgcaaaat gattgcgaaa tccgaacagg aaatcggcaa agcgaccgcc 3120
aaatactttt tctattcaaa catcatgaac tttttcaaaa ccgaaattac gctggcaaat 3180
ggtgaaattc gtaaacgccc gctgatcgaa accaacggtg aaacgggcga aattgtgtgg 3240
gataaaggcc gtgacttcgc gaccgttcgc aaagtcctgt cgatgccgca agtgaatatc 3300
gtgaagaaaa ccgaagtgca gacgggcggt tttagtaaag aatccatcct gccgaaacgt 3360
aacagcgata aactgattgc gcgcaaaaaa gattgggacc cgaaaaaata cggcggtttt 3420
gatagtccga cggttgcata ttccgtcctg gtcgtggcta aagtcgaaaa aggtaaaagt 3480
aaaaaactga aatccgtgaa agaactgctg ggcattacca tcatggaacg tagctctttt 3540
gagaaaaacc cgattgactt cctggaagcc aaaggttaca aagaagtgaa aaaagatctg 3600
atcatcaaac tgccgaaata tagcctgttc gaactggaaa acggccgtaa acgcatgctg 3660
gcatctgctg gtgaactgca gaaaggcaat gaactggcac tgccgagtaa atatgttaac 3720
tttctgtacc tggctagcca ttatgaaaaa ctgaaaggtt ctccggaaga taacgaacag 3780
aaacaactgt tcgtcgaaca acataaacac tacctggatg aaatcatcga acagatctca 3840
gaattctcga aacgcgtgat tctggcggat gccaatctgg acaaagttct gagcgcgtat 3900
aacaaacatc gtgataaacc gattcgcgaa caggccgaaa atattatcca cctgtttacc 3960
ctgacgaacc tgggcgcacc ggcagctttt aaatacttcg ataccacgat cgaccgtaaa 4020
cgctatacct caacgaaaga agttctggat gctaccctga ttcatcaatc gatcaccggt 4080
ctgtatgaaa cgcgtattga tctgagtcag ctgggcggtg acagcagggc tgaccccaag 4140
aagaagagga aggtgtga 4158

Claims (8)

1.一种靶向禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述的系统包括：
（1）靶向REV病毒基因组的sgRNAs表达质粒，其中，所述的表达质粒为表达SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs的表达质粒；
（2）Cas9基因表达质粒；或
靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒。
2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述的靶向REV病毒基因组的sgRNAs的表达质粒为两个sgRNAs表达质粒的组合，所述的sgRNAs表达质粒的组合包括表达SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs的表达质粒，还包括表达SEQ ID NO.1所示序列的sgRNAs的表达质粒或表达SEQ ID NO.21所示序列的sgRNAs的表达质粒；或
所述的共表达质粒为SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs与SEQ ID NO.1所示序列的sgRNAs或SEQ ID NO.21所示序列的sgRNAs以及Cas9基因共表达的质粒。
3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，Cas9基因的核苷酸序列如SEQID NO.27示。
4.如权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，表达SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs的表达质粒通过以下方法制备得到：
（1）构建含有sgRNAs表达框架的质粒
将sgRNAs表达框架与pGEM-T载体连接，获得含有sgRNAs表达框架的质粒，命名为pGEM-T-U6，其中所述的sgRNAs表达框架的序列如SEQ ID NO.26所示；
（2）以质粒pGEM-T-U6为模板，通过融合PCR方法获得SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs的表达质粒，方法如下：1）以U6F和gLTR6R为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR6-1片段；2）以gLTR6F和GEMTR为引物，以pGEM-T-U6为模板，扩增获得gLTR6-2片段；3）分别纯化上述得到的2个DNA片段gLTR6-1和gLTR6-2，并以此2个片段为模板，以U6F和GEMTR为引物，通过融合PCR方法扩增得到gLTR6表达框架，将得到的gLTR6表达框架利用SpeI和NheI酶切位点克隆入pGEM-T载体，获得的表达载体命名为pGEM-T-gLTR6，即为SEQ ID NO.6所示序列的sgRNAs的表达质粒；
其中，所用的引物序列如下所示：
U6F：TTTACTAGTGTACAAAAAAGCAGGCTT；
GEMTR：TTTGCTAGCTCTCCCATATGGTCGACCT；
gLTR6R：TCCTACACATTGTTGTGACGCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gLTR6F：GCGTCACAACAATGTGTAGGAGTTTTAGAGCTAGAAATA；
表达SEQ ID NO.1所示序列的sgRNAs的表达质粒pGEM-T-gLTR1或表达SEQ ID NO.21所示序列的sgRNAs的表达质粒pGEM-T-gPol1按照上述步骤（1）和步骤（2）相同的方法制备，但所用引物序列不同，其中用于制备表达SEQ ID NO.1所示序列的sgRNAs的表达质粒的引物为：
gLTR1R：CCCGGAGCTCCCTCCCACATCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gLTR1F：GATGTGGGAGGGAGCTCCGGGGTTTTAGAGCTAGAAATA；
其中用于制备表达SEQ ID NO.21所示序列的sgRNAs的表达质粒的引物为：
gPol1R：CGATAATTGCTACAGATTCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC；
gPol1F：GAGAATCTGTAGCAATTATCGGTTTTAGAGCTAGAAATA。
5.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒通过以下方法制备得到：
以权利要求4构建的pGEM-T-gLTR1为模板，PCR扩增gLTR1表达框架，两端加入BamH1和BglII酶切位点；通过BglII酶切位点将gLTR1表达框架插入pENTR1载体，获得gLTR1表达质粒pENTR1-gLTR1；以权利要求4构建的pGEM-T-gLTR6为模板，PCR扩增gLTR6表达框架，两端加入BglII和SalI酶切位点；通过BglII和SalI酶切位点将gLTR6表达框架插入pENTR1-gLTR1载体，获得gLTR1共表达质粒pENTR1-gLTR1/6；PCR扩增Cas9基因并插入pCAGGS质粒，构建Cas9表达质粒pCAGGS-Cas9；用SalI和HindIII对pCAGGS-Cas9进行酶切，获得Cas9基因表达框架；通过SalI和HindIII酶切位点将Cas9表达框架插入pENTR1-gLTR1/6载体，获得共表达gLTR1、gLTR6以及Cas9的质粒，命名为pENTR1-Cas9-gLTR1/6，即为靶向REV病毒基因组的sgRNAs与Cas9基因共表达的质粒。
6.权利要求1-5任一项所述的CRISPR/Cas9系统在制备抑制禽网状内皮组织增生病病毒试剂中的应用。
7.一种表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV），其特征在于，通过以下方法构建得到：
（1）含有CRISPR/Cas9表达框架的重组突变粘粒p814-Cas9-gLTR1/6的构建：
将权利要求4构建得到的CRISPR/Cas9入门表达质粒pENTR1-Cas9-gLTR1/6与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用Gateway®LR Clonase™ II Enzyme Mix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-Cas9-gLTR1/6质粒中的CRISPR/Cas9表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CRISPR/Cas9表达框架的重组粘粒p814-Cas9-gLTR1/6；
（2）重组病毒rMDV-Cas9-gLTR1/6的拯救
用质粒试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-Cas9-gLTR1/6五个重组粘粒DNA；通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rMDV-Cas9-gLTR1/6。
8.权利要求7所述的表达靶向REV的CRISPR/Cas9的重组马立克氏病病毒在制备预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用，其中，所述的药物为疫苗。
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