CN102988969B

CN102988969B - 表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN102988969B
Application number: CN2012104953854A
Authority: CN
Inventors: 王笑梅; 高宏雷; 祁小乐; 高玉龙; 秦立廷; 王永强
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2032-11-28
Also published as: CN102988969A

Abstract

本发明公开了一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明将REV gp90基因根据鸡偏嗜密码子进行密码子优化，基因两端设计两个酶切位点，克隆入pUC19载体中，得到pUC19-optigp90重组质粒，将其进行双酶切，将获得的optigp90基因亚克隆至pCAGGS表达载体中，构建了pCAGoptigp90重组表达质粒，将该重组质粒免疫SPF鸡，实验结果表明：该DNA疫苗可以诱导SPF鸡产生REV抗体，抗体阳转率为83%，免疫保护率为75%。本发明DNA疫苗既有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有弱毒疫苗或重组疫苗同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。

Description

表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗及其构建方法和应用，特别涉及一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis，RE）是由网状内皮组织增生病病毒（REV）群的反转录病毒引起的禽类的病理综合征，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其它组织慢性肿瘤。

REV属于哺乳动物C型反转录病毒属，基因大小为9.0kb，主要编码核心蛋白（gag）、酶蛋白（pol）和囊膜蛋白（env）。其中env基因编码两种糖蛋白gp90和gp20，gp90为表面蛋白，是病毒的免疫原蛋白，可诱导机体产生中和抗体。RE不仅能引起禽生长迟缓、废弃淘汰率升高和死亡，还能引起免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，引起免疫失败，并易继发感染其它禽病，造成巨大的经济损失，现已引起广大研究者的高度重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。

为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明中，优选的，所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID NO.1所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。

进一步的，本发明还提供了一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据鸡偏嗜密码子将REV gp90基因进行密码子优化，优化后的REV gp90基因序列如SEQ ID NO.1所示，在优化后的基因两端分别设计酶切位点，合成基因；

（2）将合成的基因克隆到pUC19载体中，构建pUC19-optigp90重组质粒；

（3）将pUC19-optigp90重组质粒进行酶切，获得optigp90基因；

（4）将optigp90基因克隆到用同样酶酶切后的pCAGGS表达载体中，构建得到pCAGoptigp90重组表达质粒，即为所述的DNA疫苗。

在本发明的一个具体实施例中，步骤（1）中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI。

在本发明中，更优选的，所述的构建方法还包括对所述重组表达质粒pCAGoptigp90进行提取纯化。

更进一步的，本发明还提供了所述的DNA疫苗在制备治疗或预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。

与传统疫苗相比，本发明DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。

附图说明

图1为重组质粒pCAGoptigp90PCR和酶切鉴定结果；

图2为质粒转染DF-1细胞48h后间接免疫荧光检测结果；

图3为质粒转染DF-1细胞48h后Western blot检测结果；

图4为REV DNA疫苗pCAGoptigp90免疫后各周鸡体内抗体滴度检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。

实施列1表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建及表达

1材料和方法

1.1病毒株和细胞

REV HLJR0901株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组分离鉴定并保存。pUC19载体、pCAGGS载体和DF-1细胞由本实验室保存，可通过商业途径购买得到。

1.2仪器与试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自omega公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；紫外分光光度计购自GE公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自invitrogen；RIPA裂解液购自碧云天公司；血液基因组提取试剂盒购自Omega公司；REVgp90单克隆抗体、大肠杆菌感受态Top10F’有本实验室保存。

1.3表达禽网状内皮组织增增病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建步骤：

（1）根据鸡偏嗜密码子将REV gp90基因进行密码子优化，优化后的REV gp90基因的序列如SEQ ID NO.1所示，在优化后的基因的两端设计有EcoRI和ClaI酶切位点，送金斯特公司合成。

（2）将合成的REV gp90基因片段与载体pUC19分别用EcoRI和ClaI双酶切，回收。将载体与外源片段以摩尔比1：3的比例混合，用T4DNA连接酶于22℃连接过夜，然后转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，提取质粒，以EcoRI和ClaI双酶切及PCR进行鉴定，并测序确证，鉴定阳性克隆，获得重组质粒pUC19-optigp90。

（3）将重组质粒pUC19-optigp90和表达载体pCAGGS分别用EcoRI和ClaI双酶切，回收基因片段optigp90和载体片段pCAGGS，凝胶回收操作按试剂盒说明书进行。将载体与外源片段以摩尔比1：3的比例混合，用T4DNA连接酶于22℃连接过夜，然后转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，提取质粒，以EcoRI和ClaI双酶切及PCR进行鉴定，并测序确证，鉴定阳性克隆，获得重组表达质粒pCAGGSoptigp90。

(4)使用Endofree质粒大题试剂盒对重组质粒pCAGGSoptigp90进行提取纯化，按使用说明书进行。

1.4体外表达实验

将DF-1细胞饲养于六孔板内，所用培养液是含10%PAA胎牛血清的DMEM。待细胞生长至60-80%时，吸去培养液，用无双抗的Hank’s液将细胞洗三次，再用少量的opti-MEM培养基将待转染孔细胞洗一次，然后每孔加入1.5mL opti-MEM，于37℃ CO₂培养箱孵育1h，将4μL重组质粒pCAGoptigp90(质粒浓度为lμg/μL)稀释于246μL opti-MEM中；同时，取10μL Lipofectamine 2000稀释于240μL opti-MEM中，轻微混匀，室温孵育5min；将稀释的质粒和Lipofectamine 2000在一个EP管中轻微混匀，室温孵育20min；将质粒和Lipofectamine 2000混合液滴加于刚才处理过的DF-1细胞单层上，置37℃ CO2培养箱孵育；10h后，吸去培养液，用含双抗的Hank’s液将细胞洗二次，每孔细胞加入2mL DMEM(含10%PAA胎牛血清和100U/mL双抗)置37℃ CO₂培养箱继续培养。48h后收获细胞，进行Western blot和间接免疫荧光试验。同时设立pCAGGS空载体转染孔和正常细胞孔两个阴性对照。

2结果

2.1重组质粒pCAGoptigp90的构建

PCR及双酶切鉴定均显示重组表达质粒pCAGoptigp90构建正确（图1），测序结果表明目的片段及读码框均正确。

2.2重组质粒pCAGoptigp90在DF-1细胞中的瞬时表达

重组质粒pCAGoptigp90在转染DF-1细胞后，经间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下可见特异的的荧光，两种阴性对照均未见特异的荧光（图2）。收集转染后48h的DF-1细胞，用gp90单抗进行western blot分析，结果pCAGoptigp90质粒转染孔可检测出分子量约为44-62kDa的gp90蛋白，阴性对照孔未检测到特异性条带（图3）。其中44KDa的条带为未糖基化的gp90蛋白，62KDa条带为正确糖基化的gp90蛋白，44-62KDa之间的条带为部分糖基化的gp90蛋白。

实施例2本发明的DNA疫苗的免疫试验

1材料和方法

1.1试剂

REV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.2SPF鸡

SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，3周龄SPF鸡试验期间饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中

1.3、方法

将3周龄SPF鸡随机分为2组，12只/组，第1组注射100μg重组质粒pCAGoptigp90，第2组注射100μg pCAGGS，体积均为200μL，腿肌两点注射。3周龄首次免疫，首次免疫后3周以同样剂量和方式加强免疫。免疫后每周采集血清，用REV抗体检测试剂盒（IDEXX）检测REV抗体滴度。在二免后3周各组均攻毒REV(HLJR0901株)10⁴TCID₅₀/只，攻毒后7天采集抗凝血，提取DNA，应用Real-time PCR检测血液病毒载量。

2、结果

REV DNA疫苗pCAGoptigp90以100μg剂量免疫3周龄SPF鸡，二免之前REV抗体为阴性，二免后抗体滴度和阳转率迅速升高，并于二免后2周达到最高。二免后3周，REV抗体滴度为3924，抗体阳性率为83%（图4）。pCAGGS空载体免疫组在试验期间REV抗体均为阴性。二免后3周，各组鸡均攻毒REV(HLJR0901株)10⁴TCID₅₀/只，攻毒后7天，采集抗凝血检测病毒血症，结果表明，在每组12只鸡中，pCAGGS免疫组有11只为阳性，pCAGoptigp90免疫组仅有3只为阳性，保护率为75%。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中，禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通过将SEQID NO.1所示的序列克隆入pCAGGS表达载体中得到的。

3.一种表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（3）将pUC19-optigp90重组质粒进行酶切，获得optigp90基因；

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤（1）中所述的酶切位点为EcoRI、ClaI。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于还包括对所述重组表达质粒pCAGoptigp90进行提取纯化。

6.权利要求1或2所述的DNA疫苗在制备治疗或预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。