CN105039373A - 重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物基因工程与动物病毒学技术领域，特别涉及重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。本发明构建了高效表达猪蓝耳病病毒GP5蛋白的重组杆状病毒毒株BacSC-Dual-GP5，使其具有更好的免疫原性。本发明重组毒株所表达的重组蛋白除去融合部分，其产物表达产量非常高。用研制的PRRSV-GP5亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验结果表明，所有疫苗免疫后28天抗体检测全部转阳；强毒攻击试验结果表明，1ml和2ml免疫组均获得100％保护，0.5ml组获得80％(4/5)保护。<pb pnum="1" />

Description

重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及动物基因工程与动物病毒学技术领域，特别涉及重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种严重危害猪群的病毒病。主要特征表现母猪繁殖障碍及育肥猪和小猪呼吸困难。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能够诱导中和抗体产生及免疫保护。因此作为研究对抗PRRS的基因工程疫苗的主要靶位点。虽然灭活和修饰后的活疫苗可以利用，但是其保护性不再完整。因此为了研究对抗PRRSV感染的有效疫苗，须发展一种新的技术。

作为RNA病毒，PRRSV的基因在合成时容易出现内在性错误，灭活疫苗诱导细胞免疫的能力较弱，产生的保护作用较短，蓝耳病还存在“抗体依赖性增强作用”。因此用于发展预防PRRS的灭活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的弊端。基于此，利用基因工程方法研制PRRSV的亚单位疫苗具有更好的免疫原性，将成为防治该病的重要方向。因此，该亚单位疫苗在猪蓝耳病的防制方面将具有很广泛的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明提供重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗。该重组病毒毒株高效表达猪蓝耳病病毒GP5蛋白，使其具有更好的免疫原性，并且制得了免疫效果好的亚单位疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组质粒，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与质粒载体重组构建而成。

根据PRRSVGP5基因序列，利用PCR扩增结合DNA拼接、克隆的方法(参见：J.萨姆布鲁克等，王嘉等译.分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年版)对ORF基因进行修饰，通过PCR方法去除GP5基因其N端信号肽的31个氨基酸。将GP5基因插入到杆状病毒表达载体中，构建重组表达质粒。引物A1(如SEQIDNo.5所示核苷酸序列)、A2(如SEQIDNo.6所示核苷酸序列)用于扩增GP64编码的序列；引物B1(如SEQIDNo.7所示核苷酸序列)、B2(如SEQIDNo.8所示核苷酸序列)用于扩增GP64TM-CTD编码的序列；引物C1(如SEQIDNo.2所示核苷酸序列)、C2(如SEQIDNo.3所示核苷酸序列)用于扩增PRRSV-ORF5基因，获得目的片段。

在本发明的一些具体实施方案中，重组质粒中所述PRRSVGP5基因片段的扩增引物组由如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明还提供了一种重组病毒载体，其由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与病毒载体重组构建而成。

在本发明的一些具体实施方案中，重组病毒载体中所述PRRSVGP5基因片段的扩增引物组由如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明的一些具体实施方案中，重组病毒载体中所述病毒载体为昆虫杆状病毒表达质粒载体。

在本发明中，构建了一种新型的pBacSC载体。编码gp64SS，HIS6的序列、多克隆位点(BssHII，NcoI位，NHE位和SphI位)集中在HIS6与杆状病毒gp64CTD之间，杆状病毒细胞进入是通过gp64蛋白介导，在宿主细胞表达后，gp64蛋白SS直接穿过细胞膜，并以三聚体的形式出现于受感染细胞表面，该融合蛋白的表达与本体的糖蛋白gp64启动后，转入质膜，进入杆状病毒包膜内。以假型杆状病毒作为一个潜在的疫苗传递系统的方法已被广泛使用。

本发明还提供了一种重组病毒毒株，由本发明提供的上述重组病毒载体经包装细胞包装而成。

本发明首先扩增PRRSV-ORF5基因，获得507bp目的基因片段(如SEQIDNo.1所示核苷酸序列)，将其与昆虫杆状病毒表达载体质粒连接，通过酶切反应鉴定及序列分析得到重组表达质粒；测序表明，扩增得到507bp的PRRSV-ORF5基因，与已发表的PCV2序列同源性达到97％以上，表明该基因具有很高的保守性。将所得到的重组表达质粒与线性化杆状病毒DNA共浴，加入细胞转染试剂，取转感细胞培养上清做蚀斑克隆与筛选试验，采用病毒培养物上清，接种昆虫细胞，筛选获得一株稳定、高效表达PRRSV-GP5蛋白的重组杆状病毒毒株(BacSC-Dual-GP5)。

本发明提供的病毒株的生物保藏编号为CGMCCNo.2467或CGMCCNo.2657。

在本发明的一些具体实施方案中，包装细胞为昆虫细胞，优选为sf-9细胞。

本发明还提供了上述重组杆状病毒毒株在制备预防和/或治疗PRRSV感染相关疾病的药物制剂的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，上述重组杆状病毒毒株在制备预防和/或治疗PRRSV感染相关疾病的药物制剂应用中，所述PRRSV感染相关疾病为猪繁殖与呼吸综合征。

本发明还提供了上述重组病毒毒株表达的重组蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。

本发明重组毒株所表达的重组蛋白除去融合部分，其产物表达产量比未用杆状病毒做载体的高30％。由于本发明在重组蛋白的C末端设计了His-6序列，该序列具有强烈的亲和作用，该序列被加在表达的蛋白的两端，容易在亲和层析柱中洗脱下来，达到较好的分离效果。为下一步重组蛋白的纯化奠定了基础。

该重组毒株可以在昆虫细胞高效表达重组PRRSV-GP5蛋白，所表达的重组PRRSV-GP5蛋白具有良好的免疫反应活性，可作为猪蓝耳病病毒亚单位疫苗。

本发明还提供了一种亚单位疫苗，其包含：

(I)如上述重组病毒毒株表达的重组蛋白或与其同源性达80％以上的蛋白；

和/或

(II)如上述重组蛋白或与其同源性达80％以上的蛋白。

本发明构建了一种高效表达猪蓝耳病病毒GP5蛋白的重组杆状病毒毒株BacSC-Dual-GP5，使其具有更好的免疫原性。本发明重组毒株所表达的重组蛋白除去融合部分，其产物表达产量非常高。此外，本发明在重组蛋白的C末端设计了His-6序列，该序列具有强烈的亲和作用，被加在表达蛋白的两端，容易在亲和层析柱中洗脱下来，达到较好的分离效果，为下一步重组蛋白纯化奠定基础。用研制的PRRSV-GP5亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验结果表明，所有疫苗免疫后28天抗体检测全部转阳；强毒攻击试验结果表明，1ml和2ml免疫组均获得100％保护，0.5ml组获得80％(4/5)保护。

生物保藏说明

重组杆状病毒BacSC-Dual-GP5。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.2467。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示蓝白斑筛选重组杆状病毒的结果；其中，图1(A)示野生型杆状病毒包涵体；图1(B)示重组型杆状病毒(蓝斑)；

图2示重组毒株感染sf-9细胞后形成的病毒包涵体；其中，E示野生型杆状病毒包涵体；F示重组杆状病毒包涵体；

图3示重组PRRSV-GP5蛋白用亲和层析柱纯化结果；其中，M：蛋白分子量标记物；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8分别为：96h、72h、60h、48h、36h、24h、12h、6h的表达产物结果；

图4示表达产物的Westernblot分析结果；

图5示本发明获得的重组质粒图谱。

具体实施方式

本发明公开了重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的重组质粒、重组病毒载体、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及含有该蛋白的亚单位疫苗中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：本发明重组杆状病毒(BacSC-Dual-GP5)的构建和重组蛋白的表达

1材料与方法

1.1病毒、细胞及抗血清

猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株：系由吉林大学动物医学学院传染病教研室丁壮教授赠送。细胞培养采用DMEM培养液，添加8-12％胎牛血清和100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素。按常规方法进行细胞培养，接种病毒当Marc-145细胞长到培养表面单层75-80％时，细胞传代效果好(兰海楠，赵小丽，etal.猪蓝耳病CH-IR株(PRRSV-CH-IR)在侯肾细胞(marc-145)中的培养[J].动物传染病与兽医公共卫生，2008.231-234)。利用Grace氏昆虫细胞培养基和昆虫sf-9细胞在27℃环境中培养杆状病毒载体，同时添加胎牛血清、同时添加10％、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素。

1.2重组质粒的构建

PRRSV-ORF5基因序列扩增：取100μl病毒培养物，加入2μl蛋白酶K(20mg/ml)于37℃消化2h，经水浴煮沸5min，12000r/min离心10min，取上清用于DNA扩增。引物A1(如SEQIDNo.5所示核苷酸序列)、A2(如SEQIDNo.6所示核苷酸序列)用于扩增GP64编码的序列；引物B1(如SEQIDNo.7所示核苷酸序列)、B2(如SEQIDNo.8所示核苷酸序列)用于扩增GP64TM-CTD编码的序列；引物C1(如SEQIDNo.2所示核苷酸序列)、C2(如SEQIDNo.3所示核苷酸序列)用于扩增PRRSV-ORF5基因，获得目的片段。扩增后的目的片段通过酶切、连接，转化，最后PCR产物经鉴定后克隆到昆虫杆状病毒表达载体上，基因克隆及序列分析参考文献(萨姆布鲁克，DW拉塞尔著(黄培堂等译).分子克隆实验指南[M].第3版，科学出版社，2002.)。利用纯化柱进行纯化重组质粒DNA，最后进行DNA序列分析和数据处理。

1.3DNA转染与蚀斑试验

纯化的质粒DNA与线性化杆状病毒DNA共浴按照3∶2的比例混合，加入5％细胞转染试剂(Cellfection，Invitrogen)，按说明书操作。取转感细胞培养上清做蚀斑克隆与筛选试验。筛选试验：采用10倍系列稀释的病毒培养物上清，接种昆虫细胞，于28℃敢作1h，吸出接种液后用终浓度为1％琼脂糖-Grace氏完全培养液覆盖，凝固后倒置于28℃培养箱培养4日，逐日观察深蓝色蚀斑的出现，用毛细玻璃管挑取蓝斑，置0.5ml无血清Grace氏培养液中吹打，以此接种新培养的sf-9细胞，反复进行3次重组杆状病毒的蚀斑克隆筛选，获得的重组病毒滴度按蚀斑形成单位(pfu/ml)计算。

1.4重组蛋白质表达分析

重组杆状病毒基础种子毒的制备：取新培养的sf-9细胞，接种剂量为0.1个感染单位，接种5～7日后收获病毒细胞培养物。重组蛋白表达时，接种剂量为5个感染单位，按不同时间点(0、24、48、72、96和120h)收取细胞培养物。收取的细胞用PBS离心洗涤3次，加入SDS-PAGE样品缓冲液，经煮沸5min处理后，12.5％的分离胶电泳，考马斯亮蓝R250染色，薄层扫描仪测定蛋白含量。免疫印迹试验用于检测重组蛋白的免疫活性反应，方法见文献(萨姆布鲁克，DW拉塞尔著(黄培堂等译).分子克隆实验指南[M].第3版，科学出版社，2002.)。

2实验结果

2.1PRRSV-ORF5基因扩增与克隆PCR扩增获得的DNA产物，大小与预期设计一致(507bp)，删除病毒蛋白终止密码子。用限制性内切酶对重组质粒分析结果表明，构建的重组质粒含有PRRSV-ORF5基因，连接方向正确。

2.2DNA序列分析结果对3个重组质粒进行的DNA测序分析结果一致，表明克隆的PCR产物未发生错配现象。序列数据与GenBank登陆的PRRSV毒株基因序列同源性达到97％以上。PRRSV-ORF5基因全长为603bp，编码约200个氨基酸，其推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位(邹敏，吴发兴等.2007-2009年部分猪群PRRSVORF5和Nsp2基因的克隆与序列分析.[J].西北农林科技大学学报.2010年10期)。

2.3重组杆状病毒的克隆筛选结果经3个循环蚀斑克隆，获得一株稳定、高效表达PRRSV-GP5蛋白的重组杆状病毒(BacSC-Dual-GP5)，病毒滴度达到1.28×108pfu/ml。重组病毒产生的蚀斑呈深蓝色反应(图1B)，野性型杆状病毒产生的蚀斑呈乳白色反应(图1A)。

从图2可以看出，重组杆状病毒接种sf-9细胞后，可导致细胞内出现独特的大型包涵体(图2F)；而野生型杆状病毒感染细胞时产生数十个小型包涵体(图2E)；正常对照细胞无此现象。

2.4重组蛋白的表达结果重组杆状病毒接种sf-9细胞，按不同时间收取样品进行SDS-PAGE电泳鉴定。见图3显示，在分子量27.8kDa处出现目的基因表达蛋白，随取样时间的推移，蛋白表达量逐渐增加。接种后48h，重组蛋白开始表达，96h达到峰值。健康细胞核野生型病毒接种组在相同位置无此蛋白条带出现。

2.5重组蛋白的免疫活性鉴定结果采用免疫印迹试验对重组蛋白的免疫活性进行了鉴定，如图4所示，在SDS-PAGE电泳图中(图3)表现的27.8kDa蛋白条，48～120h直接收获的样品均能与PCV2抗血清产生特异性免疫染色反应，健康细胞和野生型病毒接种组无染色。结果证实，获得的重组蛋白属于PCV2-Cap蛋白。

实施例2用本发明构建的重组杆状病毒株(BacSC-Dual-GP5)表达的PRRSV-GP5蛋白制备亚单位疫苗

以本发明构建的重组杆状病毒株(BacSC-Dual-GP5)，接种昆虫细胞表达的PRRSV-GP5蛋白产物为抗原，制备亚单位疫苗。研究试验对制备重组蛋白在昆虫细胞的表达参数进行了优化，用5感染单位种毒接种昆虫细胞，用表达的5批次重组蛋白作为抗原进行了亚单位疫苗的研制，将重组蛋白培养物与免疫佐剂乳化制备亚单位疫苗。按兽用生物制品规程要求进行了半成品与成品疫苗的检验，用检验合格制品进行临床试验。

试验结果：用研制的PRRSV-GP5亚单位疫苗2倍剂量(4ml/头)肌肉接种25日龄仔猪5头，临床观察28天未见异常反应，证明疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验是采用0.5ml、1ml、2ml三种剂量免疫25日龄仔猪，每组5头，设未接种疫苗对照猪3头。

本试验采用猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作方法对18份血清样品进行检测，IRPC＞20判定为阳性，IRPC≤20判定为阴性，试剂盒批号：5-TTVETPRA-049。

具体试验操作：

样品处理：阳性对照、阴性对照不必稀释，样本需要用样本稀释液进行200倍稀释。

A.将试剂放在室温，并轻摇或者倒置混匀。

B.将样品和对照加入板孔中。阳性对照和阴性对照必须是双份。

1)加入50ul阳性和阴性对照，及200倍稀释的样品在反应板孔。

2)盖上膜，在37℃作用60分钟。

3)去膜，用300ul的洗液洗3遍，并在吸水纸上将平板弄干(颠倒，在纸上轻敲)。

4)在每个孔中加入50ul酶标抗体。

5)盖上膜在37℃反应60分钟。

6)去掉膜，用洗液(300uL)洗3次，弄干。

7)加入50uL的底物，轻摇板2秒。

8)将平板放在黑暗中在20-25℃作用10分钟。

9)加入50uL的终止液，轻敲平板混匀。

10)用柔软的东西轻拭平板上的脏物，在450nm下读数并记录结果。

结果分析：

实验成立条件：阳性对照的平均值OD₄₅₀＞0.6，而且阳性对照平均值/阴性对照平均值＞4.0。结果用IRPC表示，计算公式如下：

试验具体数据见表1。

表1PRRSV-GP5亚单位疫苗制品ELISA试验抗体检测结果

注：1号为0.5mL免疫组，2号为1.0mL免疫组，3号为2.0mL免疫组。

所有疫苗免疫后28天抗体检测全部转阳；强毒攻击试验结果表明，1ml和2ml免疫组均获得100％保护，0.5ml组获得80％(4/5)保护率。

本发明提供的病毒株的生物保藏编号为CGMCCNo.2467或CGMCCNo.2657。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与质粒载体重组构建而成。

2.一种重组病毒载体，其特征在于，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSVGP5基因片段与病毒载体重组构建而成。

3.根据权利要求2所述的重组病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为昆虫杆状病毒表达质粒载体。

4.一种重组病毒毒株，其特征在于，由如权利要求3或4所述的重组病毒载体经包装细胞包装而成。

5.根据权利要求4所述的重组病毒毒株，其特征在于，其生物保藏编号为CGMCCNo.2467。

6.根据权利要求4或5所述的重组杆状病毒毒株在制备预防和/或治疗PRRSV感染相关疾病的药物制剂的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PRRSV感染相关疾病为猪繁殖与呼吸综合征。

8.一种如权利要求4或5所述的重组病毒毒株表达的重组蛋白。

9.根据权利要求8所述的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。

10.一种亚单位疫苗，其特征在于，包含：

(I)如权利要求4或5所述的重组病毒毒株表达的重组蛋白或与其同源性达80％以上的蛋白；

和/或

(II)如权利要求8所述的重组蛋白或与其同源性达80％以上的蛋白。