CN103421843A - 编码h5n1亚型禽流感同义血凝素(ha)蛋白以及同义神经氨酸酶(na)蛋白的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，其中所述同义血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述同义神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述重组表达载体通过将编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列插入到同一个表达载体中构建而成。本发明提供包含有效量的上述重组表达载体的DNA疫苗，所述疫苗可以有效预防和/或治疗H5亚型禽流感病毒的感染。本发明同时涉及所述蛋白或其编码核苷酸序列作为H5亚型流感灭活疫苗以及其他基因工程疫苗的免疫原基因的应用。

Description

编码H5N1亚型禽流感同义血凝素(HA)蛋白以及同义神经氨酸酶(NA)蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明提供一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，包含有效量的上述重组表达载体的DNA疫苗，所述疫苗可以有效预防和/或治疗H5亚型禽流感病毒的感染。 

背景技术

禽流感(Avian influenza virus，AIV)是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，至今该病已经遍布世界各地，而H5亚型高致病性禽流感(HPAI)又以其高发病率和高死亡率，对养禽业造成重大威胁。到目前为止，已经报道过多起人感染H5N1亚型的禽流感事件，且死亡率可高达60％。H5N1亚型高致病性禽流感作为一种具有严重危害的人畜共患病，具有重要的经济和公共卫生学意义(Mukhtar et al.，2007)。 

疫苗免疫是防控禽流感最有效的手段。目前大量使用的是鸡胚生产的全病毒灭活疫苗。这种疫苗的生产依赖于大量的鸡胚，并且在新毒株出现的时候很难根据疫情的变化做出迅速的反应，且不同毒株之间交叉保护性较差，这使得疫苗株不得不经常更新(Subbarao and Joseph，2007)，个别地区甚至需要同时使用针对不同抗原群的多种疫苗，这无疑又增大了禽流感疫情的防控难度。研制一种能够同时抵御不同抗原群病毒攻击的“通用型”禽流感疫苗成为当前AIV疫苗研究的新热点。 

DNA疫苗与传统疫苗相比，具有十分显著的优势。DNA疫苗能够同时诱导细胞免疫和体液免疫；不受母源抗体的影响，不会影响免疫检测；制备简单，可以任意组成联合疫苗和多价疫苗等(Gurunathan et al.，2000；Jiang et al.，2007；Liu，2010a；Shah et al.，2010)。因此，DNA疫苗被认为是防控流感的理想疫苗。本研究通过分析禽流感病毒血凝素蛋白(HA)和 神经氨酸酶(NA)这两个变异频繁的保护性抗原基因，将不同毒株抗原性蛋白最大使用频率的氨基酸“聚合”到一条氨基酸序列中，以期获得一种能够同时抵御不同分支禽流感病毒攻击的新型疫苗，并探索其最佳的免疫程序，为DNA疫苗的推广应用和我国禽流感的防控提供技术储备。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种能够有效预防或治疗多种分支的H5N1亚型禽流感病毒的感染的DNA疫苗。 

在第一方面，本发明人以我国2008年-2011年间流行的百余株H5N1亚型禽流感病毒为基础，分析其HA氨基酸序列和NA氨基酸序列。使用Clustal W1.8.3软件进行多序列比对及分析，将每个位点出现频率最高的氨基酸确定为该位点的氨基酸，获得了一条同义血凝素(HA)氨基酸序列和一条同义神经氨酸酶(NA)氨基酸序列，并分别命名为Cons-CHA5(SEQ ID NO：1)和Cons-CNA5(SEQ ID NO：2)，可以将其相应的编码核苷酸序列按照宿主细胞的密码子偏好性进行密码子优化，然后分别人工合成密码子优化的编码核苷酸序列，按照常规的分子克隆方法，将上述两种编码核苷酸序列克隆到同一表达载体中。 

在优选的实施方案中，可以将上述相应的编码核苷酸序列的密码子优化为鸡体偏嗜的密码子，通过人工合成获得H5亚型AIV同义Cons-CHA基因(SEQ ID NO：4，为优化后的序列)，Cons-CNA5基因(SEQ ID NO：5，为优化后的序列)，按照常规的分子克隆方法，将上述两种编码核苷酸序列克隆到适于在禽类中表达的同一表达载体中，得到能够预防或治疗禽类的禽流感感染的DNA疫苗。所用的表达载体可以为任何一种真核表达载体，例如，但不限于pCAGGS。 

本领域技术人员应该理解，包含本发明第一方面所述的重组表达载体的细胞也在本发明的保护范围之内。 

在第二方面，本发明提供包含有效量的第一方面所述的重组表达载体的DNA疫苗，所述疫苗有效预防和/或治疗下述分支的H5亚型禽流感病毒的感染：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a。 

优选地，所述疫苗有效预防和/或治疗下述H5亚型禽流感病毒的感染： 

A/duck/Guangdong/S1322/2010(属于clade2.3.2.c)， 

A/duck/Hubei/S1513/2010(属于clade2.3.2.b)， 

A/chicken/Shandong/A-10/2011(属于clade7.2)或 

A/duck/Fujian/31/2007(属于clade2.3.4a)。 

可以使用所述DNA疫苗进行有效的免疫预防的个体包括，但不限于，禽类，例如，鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等；哺乳动物，例如，小鼠、猪、恒河猴、人等；优选人。 

在第三方面，本发明提供第一方面所述的重组表达载体在制备用于有效预防和/或H5亚型禽流感病毒的感染的DNA疫苗中的应用，所述H5亚型禽流感病毒选自下述分支：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a。 

优选地，H5亚型禽流感病毒选自下述禽流感病毒株： 

A/duck/Guangdong/S1322/2010(属于clade2.3.2.c)， 

A/duck/Hubei/S1513/2010(属于clade2.3.2.b)， 

A/chicken/Shandong/A-10/2011(属于clade7.2)或 

A/duck/Fujian/31/2007(属于clade2.3.4a)。 

在第四方面，本发明涉及同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合或编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合在制备H5亚型流感灭活疫苗或其他基因工程疫苗中的应用，其中所述同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合作为免疫原，或者编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合作为免疫原基因。 

在第五方面，本发明还涉及用于预防或治疗H5亚型禽流感病毒感染的方法，所述方法包括给待免疫个体施用有效量的本发明第一方面所述的重组表达载体或本发明第二方面所述的DNA疫苗。 

因此，本发明提供下述各项： 

1.一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，其中所述同义血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述同义神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述重组表达载体通过将编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：2 的核苷酸序列插入到同一个表达载体中构建而成。 

2.根据第1项所述的重组表达载体，其中编码所述同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码所述同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸序列针对所用的宿主细胞进行密码子优化。 

3.根据第1项所述的重组表达载体，其中编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，二者以相反的表达方向插入到同一表达载体中。 

4.根据第1项所述的重组表达载体，其中所用的表达载体为pCAGGS，所得到的重组表达载体命名为pCons-CHANA，pCons-CHANA的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。 

5.包含第1-4项中任一项所述的重组表达载体的细胞。 

6.一种DNA疫苗，所述疫苗包含有效量的第1-4项中任一项所述的重组表达载体。 

7.根据第6项所述的DNA疫苗，所述疫苗有效预防和/或治疗下述分支的H5亚型禽流感病毒的感染：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a，优选地，所述疫苗有效预防和/或治疗下述H5亚型禽流感病毒的感染： 

A/duck/Guangdong/S1322/2010， 

A/duck/Hubei/S1513/2010， 

A/chicken/Shandong/A-10/2011或 

A/duck/Fujian/31/2007。 

8.第1-4项中任一项所述的重组表达载体在制备用于有效预防和/或H5亚型禽流感病毒的感染的DNA疫苗中的应用，所述H5亚型禽流感病毒选自下述分支：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a，优选地，所述H5亚型禽流感病毒选自： 

A/duck/Guangdong/S1322/2010， 

A/duck/Hubei/S1513/2010， 

A/chicken/Shandong/A-10/2011或 

A/duck/Fujian/31/2007。 

9.根据第8项所述的应用，其中感染所述H5亚型禽流感病毒的受试 者为禽类或哺乳动物，优选人。 

10.同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合或编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合在制备H5亚型流感灭活疫苗或其他基因工程疫苗中的应用，其中所述同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合作为免疫原，或者编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合作为免疫原基因。 

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 

图1显示本发明的重组表达载体的构建流程； 

图2显示pCons-CHA的PCR鉴定；M：DNA Marker DL2000；泳道1：pCons-CHA的PCR扩增产物；泳道2：阴性对照； 

图3显示pCons-CHA的酶切鉴定；M：DNA Marker DL2000；泳道1：pCons-CHA经EcoR I和Xho I酶切的产物；泳道2：pCons-CHA； 

图4显示pCI-CNA的PCR鉴定；M：DNA Marker DL2000；泳道1：pCI-CNA的PCR扩增产物；泳道2：阴性对照； 

图5显示pCI-CNA的酶切鉴定；M1：DNA Marker DL2000；泳道1：pCI-CNA经EcoR I和Not I酶切的产物；泳道2：pCI-CNA；M2：DNA Marker DL15000； 

图6显示p-CNA的PCR扩增鉴定；泳道1：p-CNA的PCR扩增产物；M：500bp DNA Marker；泳道2：阴性对照； 

图7显示pCons-CHANA的PCR鉴定，M：DNA Marker DL2000；泳道1：pCons-CHANA的PCR扩增产物(HA)；泳道2：阴性对照；泳道3：pCons-CHANA的PCR扩增产物(NA)；泳道4：阴性对照； 

图8显示pCons-CHANA的酶切鉴定，泳道1：pCons-CHANA经EcoR I酶切的产物；泳道2：pCons-CHA经EcoR I酶切的产物；泳道3：pCons-CHANA；M：DNA Marker DL15000； 

图9显示IFA检测共表达质粒中同义蛋白的表达情况，A：Cons-CHA5蛋白与A/duck/Guangdong/S1322/2010阳性血清的反应情况；B： Cons-CNA5蛋白与Cons-CNA5蛋白单因子阳性血清的反应情况；C：阴性对照； 

图10显示DNA疫苗的电泳检测，M：DNA Mark DL15000；1：pCons-CHANA； 

图11显示pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Guangdong/S1322/2010的HI抗体变化； 

图12显示pCons-CHANA免疫后NA-ELISA抗体的变化； 

图13显示pCons-CHANA对致死剂量A/duck/Guangdong/S1322/2010攻毒攻击的保护效力； 

图14显示pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Hubei/S1513/2010的HI抗体变化； 

图15显示pCons-CHANA免疫后NA-ELISA抗体的变化； 

图16显示pCons-CHANA对致死剂量A/duck/Hubei/S1513/2010攻毒攻击的保护效力； 

图17显示pCons-CHANA免疫后针对A/chicken/Shandong/A-10/2011的HI抗体变化； 

图18显示pCons-CHANA免疫后NA-ELISA抗体的变化； 

图19显示疫苗免疫后用A/chicken/Shandong/A-10/2011攻毒后的发病与死亡情况； 

图20显示疫苗免疫后针对A/duck/Fujian/31/2007的HI抗体变化； 

图21显示pCons-CHANA免疫后NA-ELISA抗体的变化； 

图22显示疫苗免疫后用A/duck/Fujian/31/2007攻毒后的发病与死亡情况。 

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。 

本领域技术人员还应该理解，实施例中所用的试剂如无特殊说明，均为市售分析纯级别的试剂。 

1.1材料与方法 

1.1.1菌株、细胞与质粒 

大肠杆菌JM109感受态细胞购自北京全式金生物公司；293T细胞(人胚胎肾细胞(CRL-11268)，购自ATCC)，表达质粒pCAGGS为一高效真核表达载体(由美国威斯康辛大学的Yoshihiro Kawaoka教授馈赠，目前由本实验室保存，参见Yongping Jiang，et al.Enhanced protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector.Antiviral Research.2007，75：234-241.)，pCI(E1731，Genebank登记号：U47119)为Promega公司产品，以及原核表达质粒pGEX-6P-1(28-9546-48)为GE Healthcare公司产品，目前上述材料均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室保存。 

1.1.2酶及主要试剂 

DNA分子量Marker，LA-Taq酶购于宝生物(TaKaRa)公司；EcoR I，Xho I，Hind III，Not I限制性内切酶，Phusion高保真DNA聚合酶以及T4 DNA连接酶购自New England Biolabs(NEB)公司；In-fusion HD Cloning Kit购自Clontech公司；DNA胶回收试剂盒及小量质粒DNA提取试剂盒购自于Axygen公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒，质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司；Lipofectamine^TM2000，青链霉素双抗购自Invitrogen有限公司；DMEN，Opti-MEM细胞培养液均购自GIBCO公司；氨苄霉素购自Biosharp公司；引物合成由上海英潍捷基有限公司完成；基因测序试剂盒购自ABI公司；本实验中所使用的其他试剂均为国产分析纯或者进口分装。 

1.1.3抗体 

FITC标记的兔抗鸡IgG(IgG-FITC)荧光二抗，辣根过氧化物酶HR标记的羊抗鸡IgG(IgG-HRP)-二抗；羊抗鸡IgG DyLight^TM680标记二抗(Anti-Chicken IgG(H&L)(GOAT)Antibody DyLight^TM680 Conjugated) (IgG-DyLight^TM68)，均购自Rockland公司。 

1.1.4病毒、抗原 

攻毒使用H5亚型HPAIV A/duck/Guangdong/S1322/2010(属于clade2.3.2.c)、A/duck/Hubei/S1513/2010(属于clade2.3.2.b)、A/chicken/Shandong/A-10/2011(属于clade7.2)以及A/duck/Fujian/31/2007(属于clade2.3.4a)，这四种禽流感病毒株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室的工作人员自行采集得到，其中前两种禽流感病毒株由邓国华采集得到，后两种禽流感病毒株由李雁冰采集得到，(具体信息可参见遗传资源来源信息披露表)。目前，这四种禽流感病毒株以及其标准抗原均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室暨农业部动物流感重点开放实验室保存。 

一般来说，属于同一分支(clade)的不同禽流感病毒，在基因分型上属于同一基因型，在抗原性上属于同一抗原群，因此，一般在同一分支的病毒中会选择出代表性病毒株。经过系统的基因型和抗原性分析表明，A/duck/Guangdong/S1322/2010为我国clade2.3.2.c的代表性病毒株，A/duck/Hubei/S1513/2010为我国clade2.3.2.b的代表性病毒株，A/chicken/Shandong/A-10/2011为我国clade7.2的代表性病毒株，A/duck/Fujian/31/2007为我国clade2.3.4a的代表性病毒株。 

1.1.5SPF鸡胚和SPF鸡 

实验所有的9-11日龄SPF鸡胚和1日龄SPF鸡均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，试验期间所有SPF鸡均饲养于负压隔离器中。 

1.1.6主要仪器 

小型离心机，梯度PCR仪为Eppendorf公司产品；凝胶电泳成像仪，酶标仪为美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；荧光显微镜为蔡司公司产品；其余仪器均为国产。 

1.1.7H5亚型禽流感病毒的同义HA蛋白及同义NA蛋白的氨基酸同义序列分析与合成 

以我国2008年-2011年间流行的百余株H5N1亚型禽流感病毒为基础，分析其HA氨基酸序列和NA氨基酸序列。使用Clustal W1.8.3软件进行多序列比对及分析，将每个位点出现频率最高的氨基酸确定为该位点的氨基酸，获得了一条同义HA氨基酸序列和一条同义NA氨基酸序列，并分别命名为Cons-CHA5(SEQ ID NO：1)和Cons-CNA5(SEQ ID NO：2)，将其相应的核苷酸序列的密码子优化为鸡体偏嗜的密码子，通过人工合成获得H5亚型AIV同义Cons-CHA基因(SEQ ID NO：4，为优化后的序列)，Cons-CNA5基因(SEQ ID NO：5，为优化后的序列)，在优化后的基因两端分别添加EcoR I和Xho I限制酶酶切位点，并由大连宝生物有限公司合成，合成的序列分别连接在pMD18T载体上。 

1.1.8共表达同义HA和NA基因重组质粒pCons-CHANA的构建与鉴定 

1.1.8.1pCons-CHA的构建 

使用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别处理pCAGGS载体与合成的在pMD18T载体上的Cons-CHA基因，16℃连接，连接产物转化JM109大肠杆菌感受态，使用限制性内切酶EcoR I和Xho I对重组质粒进行双酶切鉴定以及PCR鉴定(所用的引物如下： 

上游引物：5’-CAACGTGCCCGAGTGGAGCTACATC-3’， 

下游引物：5’-CATCAGCACCAGCAGCTCGGCGTTGTAG-3’)。 

1.1.8.2pCI-CNA的构建 

使用限制性内切酶EcoR I和Not I处理在pMD18T载体上的Cons-CNA5和pCI质粒，连接并转化大肠杆菌；对重组质粒进行双酶切(EcoR I和Not I)鉴定和PCR鉴定(上游引物：5’-CGAGCCCATCCGCAACACCAACTTC-3’；下游引物：5’-GAAGCTGAAGCCCTTGATGCCGTAG-3’)。 

1.1.8.3pCons-CHANA的构建 

用PCR方法将pCI-CAN载体中含有启动子、Cons-CNA5片段以及polyA终止序列的完整表达框进行扩增，将该表达框按照HA表达方向的 反向(即反式表达)插入到线性化后的pCons-CHA中。即NA基因的表达框与HA基因的表达框为背对背式的反式表达(trans-expression)，这样的反式表达方式比两个表达框以相同方向串联的顺式表达(cis-expression)更稳定。 

根据所构建pCI-CNA载体的序列，使用Oligo6.0设计一对特异性引物，上游引物开始于pCI载体的启动子，下游引物开始于pCI载体的polyA终止序列： 

上游引物： 

5’-CCTGCAGCCCAAGCTGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCCCGGATCCT-3’； 

下游引物： 

5’-TGATTACGCCAAGCTTGGCTCGACAGATCTTCAATATTGGCCATTA-3’： 

使用Phusion高保真DNA聚合酶扩增包含启动子和SV40终止序列的NA片段，命名为p-CNA；按照In-fusion HD Cloning Kit(购自Clontech公司)将扩增好的p-CAN片段同经Hind III处理过的pCons-CHA按照使用说明书进行连接反应，之后转化JM109大肠杆菌感受态。通过酶切和PCR反应对重组质粒进行鉴定，重组质粒明名为pCons-CHANA(完整的重组质粒序列为SEQ ID NO：3所示)。载体构建流程见图1。 

1.1.9间接NA-ELISA检测方法的建立 

1.1.9.1NA蛋白原核表达载体的构建与鉴定 

为了获得重组同义NA蛋白，使用限制性内切酶EcoR I和Xho I处理Cons-CNA5和p-GEX-6P-1(购自GE Healthcare公司)，连接并转化JM109大肠杆菌感受态，进行PCR和酶切鉴定，阳性克隆命名为p-GEX-CNA。 

1.1.9.2间接NA-ELISA检测方法的建立 

原核表达载体p-GEX-CNA转化BL21大肠杆菌感受态，该重组蛋白产物带有GST标签；将纯化的NA蛋白用包被缓冲液稀释成1μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，7.5μg/mL，10μg/mL，包被96孔酶标反应板，每孔100μL，4℃过夜；取出后用PBST洗板3次，每次5min；每孔加入200μL 5％脱脂乳，37℃封闭1h；取出后用PBST洗板3次，每次5min；以H5亚型禽流感病毒阳性血清作为一抗，用PBS按照1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800倍进行稀释，每孔100μL，37℃孵育1h；取出后用PBST洗板3次，每次5min；每孔加入100μL PBST稀释(1∶10000)的IgG-HRP作为二抗，37℃孵育1h；PBST洗板3次，每次5min；每孔加入OPD显色液100μL，37℃避光显色15min，之后每孔加入终止液50μL，读取490nm处的OD值；之后对20份阴性血清进行检测，确定阴阳性临界值。 

1.1.10重组质粒体外表达的间接免疫荧光鉴定 

1.1.10.1转染质粒的提取 

将上述鉴定为阳性的质粒转化JM109感受态，涂于含氨苄抗性的固体LB平板，挑取阳性克隆，加入到100mL含100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基中，37℃ 200rpm培养16h并收获菌体，按照QIAGEN质粒中量提取试剂盒提取pCons-CHANA。 

1.1.10.2重组质粒的瞬时转染 

使用含10％胎牛血清和1％青链霉素双抗的DMEM培养基于CO₂(5％)培养箱中培养293T细胞，待细胞密度达到80％时将细胞转接至多聚赖氨酸包被的六孔板中用于转染构建的重组表达载体pCons-CHANA，转染按照Lipofectamine TM 2000说明书进行，并设置转染pCAGGS空载体的293T细胞作为阴性对照。 

1.1.10.3间接免疫荧光鉴定 

转染之后12h换液；36小时收获细胞，弃掉培养液，PBST清洗3次细胞，每次5分钟；使用3％的对聚甲醛对细胞室温固定30min；PBST清洗细胞3次，每次5min；1％BSA室温封闭细胞30min；弃掉封闭液，5％BSA稀释的H5亚型禽流感阳性血清(500倍稀释)作为一抗，37℃作用1h；PBST清洗3次细胞，每次5min；1％BSA稀释的兔抗鸡IgG-FITC(300倍稀释)作为二抗，37℃避光作用1h；PBST清洗细胞3次，每次5分钟；弃掉清洗液，用PBS清洗一次之后加入碱性甘油(pH＝9.8)，置于荧光显 微镜下观察。 

1.1.11病毒鸡胚半数致死量EID50的测定 

将病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010、A/duck/Hubei/S1513/2010、A/chicken/Shandong/A-10/2011以及A/duck/Fujian/31/2007的尿囊液用无菌PBS进行10倍连续倍比稀释至10^-10，将其中10^-5到10^-10六个稀释度接种9日龄鸡胚，每个稀释度做4个重复，37℃孵化48h；之后收取50μL尿囊液进行血凝试验，根据Reed-Meunch法计算病毒的EID₅₀。 

1.1.12免疫用DNA质粒的制备 

将质粒pCons-CHANA转化JM109感受态细胞，均匀涂布于含氨苄抗性的固体LB平板上，37℃培养过夜；将单个阳性菌落接种于5mL含氨苄的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h；之后接种于500mL含氨苄的液体LB培养基中，37℃震荡培养16h；按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒(Maxi Endofree)说明书进行质粒的大量提取；对所提取质粒进行浓度测定；进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并分析超螺旋含量；免疫前使用无菌PBS对DNA质粒进行稀释。 

1.1.13试验分组情况 

按照下表对共表达质粒pCons-CHANA进行异源攻毒保护实验(攻毒毒株与剂量如表1)，以评价该疫苗对不同分支毒株攻击的保护情况。 

表1  实验分组情况 

Table1 Experiment Design 

1.1.14SPF鸡免疫方法与免疫程序 

本实验采用两点法肌肉注射，每个位点注射0.1mL重组表达载体pCons-CHANA，免疫总体积为0.2mL，免疫剂量为30μg(如表1所示)。 

免疫程序：所有实验组SPF鸡在3周龄时进行首次免疫，首免3周之后按照相同的剂量进行一次加强免疫。 

1.1.15HI抗体的测定 

自首次免疫开始每周采集一次血清；将25μL血清加入到96孔V型血凝板中，用无菌PBS做连续2倍倍比稀释至2^-12，其中阳性对照孔加入阳性血清，阴性对照孔加入PBS；之后加入25μL 4单位抗原(每组血清采用与攻毒毒株对应的抗原进行检测)，室温作用20min；加入25μL 1％红细胞悬液，室温静置20min，观察并记录最终结果。 

1.1.16NA-ELISA抗体的测定 

按照1.1.9确定的反应条件对pCons-CHANA组的SPF鸡血清样本进行检测，以确定NA抗体的变化情况。 

1.1.17攻毒保护实验 

每组实验鸡和对照鸡均在加免后第二周攻毒，攻毒剂量为10⁵EID₅₀，攻毒毒株如表1所示；攻毒之后的观察期为14天，观察期内每天观察和记录免疫组和对照组鸡的发病和死亡情况。 

1.1.18病毒分离与滴定 

攻毒后第3天，第5天和第7天采集喉头拭子和泄殖腔拭子，每个拭子使用含有双抗(包含浓度为2000U/mL的青霉素和浓度为2000μg/mL的链霉素)的无菌PBS做10倍倍比稀释(2个稀释度)，每个稀释度接3个9-11日龄SPF鸡胚，37℃孵化48h；之后每个鸡胚收取50μL尿囊液，加入等体积1％红细胞，进行血凝试验，根据Reed-Meunch法计算所分离病毒的滴度。 

1.2结果 

1.2.1重组质粒pCons-CHANA的鉴定 

1.2.1.1pCons-CHA的鉴定 

PCR结果显示，扩增产物大小约为1707bp(图2)，与预期相符；经EcoR I和Not I双酶切(图3)，获得了大小约为1707bp的片段，经测序验证，重组质粒构建成功。 

1.2.1.2pCI-CNA的鉴定 

PCR结果显示，扩增产物大小约为1368bp(图4)，与预期相符；经EcoR I和Not I双酶切(图5)，获得了大小约为1368bp的片段，经测序验证，重组质粒构建成功。 

1.2.1.3p-CNA的扩增 

使用Phusion高保真DNA聚合酶扩增包含启动子和SV40终止序列的NA片段，进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得了大小约为2677bp的片段，结果与预期相符(图6)。 

1.2.1.4pCons-CHANA的PCR和酶切鉴定 

对重组质粒pCons-CHANA进行PCR鉴定(图7)，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，pCons-CHANA经HA的特异性引物扩增之后均出现大小约为1707bp的HA片段，经NA的特异性引物扩增之后均出现大小约为1368bp的NA片段。 

重组质粒pCons-CHANA使用EcoR I进行单酶切，进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得了大小约为5297bp和3849bp的两个片段，结果与预期相符(图8)；测序结果显示，重组质粒构建成功。 

1.2.2间接免疫荧光(IFA)检测结果 

将pCons-CHANA转染239T细胞，36小时之后进行间接免疫荧光检测，分别用AIV A/duck/Guangdong/S1322/2010阳性血清与Cons-CNA5蛋白单因子血清作为一抗，从而鉴定共表达质粒中Cons-CHA5蛋白和ConsC-NA5蛋白的表达情况(图9)。结果显示，Cons-CHA5蛋白和Cons-CNA5蛋白可以在293T细胞中高效表达。 

1.2.3鸡胚半数致死量EID50的测定 

将病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010、A/duck/Hubei/S1513/2010、A/chicken/Shandong/A-10/2011以及A/duck/Fujian/31/2007的尿囊液用无菌PBS进行10倍连续倍比稀释至10^-10，将其中10^-5到10^-10六个稀释度接种9-11日龄鸡胚，每个稀释度做4个重复，37℃孵化48h；之后收取50μL尿囊液进行血凝试验，结果如表2。 

表2  各病毒的EID₅₀

Table2 The EID₅₀ of each virus 

1.2.4DNA疫苗超螺旋含量的检测 

免疫前对质粒进行超螺旋含量进行检测，每种质粒取1μL进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，使用Bio-Rad Image Lab凝胶成像系统进行检测并分析超螺旋含量，结果显示，pCons-HANA的超螺旋含量为95.3％，完全符合免疫要求(图10)。 

1.2.5pCons-CHANA对A/duck/Guangdong/S1322/2010的免疫保护效力评估 

1.2.5.1pCons-CHANA免疫后及A/duck/Guangdong/S1322/2010攻毒后HI抗体的变化 

30μg的pCons-CHANA免疫3周龄的SPF鸡，免疫后第四周(即加免后第一周)针对A/duck/Guangdong/S1322/2010的HI抗体转阳率达到100％。(表3)。 

表3  pConsHANA免疫后针对A/duck/Guangdong/S1322/2010的HI抗体的转阳率(阳性数/总数) 

Table3 The seroconversion rate of HI antibodies to A/duck/Guangdong/S1322/2010immunized with pCons-CHANA(Positive/Total) 

HI抗体水平方面，pCons-HANA免疫组的平均HI抗体水平达到5.4log₂(表4，图11)。 

表4  pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Guangdong/S1322/2010的HI抗体的平均滴度(log₂) 

Table4 Average HI antibodies to A/duck/Guangdong/S1322/2010immunized with pCons-CHANA(log₂) 

§：鸡死亡(The chicken died)。 

1.2.5.2.免疫与攻毒后NA-ELIA抗体的检测 

采用间接ELISA方法检测免疫后血清中NA抗体的水平，结果显示，NA-ELISA抗体水平总体呈上升趋势(图12)。 

1.2.5.3发病与死亡情况 

加强免疫后两周攻毒，攻毒后的观察期为14天，观察期内每天记录各组的发病和死亡情况。结果显示，对照组SPF鸡在3天内全部死亡，免疫组无发病，无死亡(图13)。 

1.2.5.4病毒分离与拭子滴定 

A/duck/Guangdong/S1322/2010攻击之后，免疫组的攻毒保护率均为100％，但在攻毒后第5天和第7天均有个别鸡存在排毒现象(表5)。 

表5  A/duck/Guangdong/S1322/2010攻击后的病毒分离结果 

Table5 Virus shedding and titers after challenge with A/duck/Guangdong/S1322/2010 

注：§：鸡死亡。 

1.2.6pCons-CHANA对A/duck/Hubei/S1513/2010的免疫保护效率评估 

1.2.6.1pCons-CHANA免疫后及A/duck/Hubei/S1513/2010攻毒后HI抗体的变化 

30μg的pCons-CHANA免疫3周龄的SPF鸡，pCons-CHANA免疫组在加免后第二周HI抗体100％转阳(表6)。 

在HI抗体水平方面，HI抗体水平均呈现逐渐上升的趋势，针对A/duck/Hubei/S1513/2010的HI抗体水平最高为5.3log₂(图14，表7)。 

表6  pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Hubei/S1513/2010的HI抗体的转阳率(阳性数/总数) 

Table6 The seroconversion rate of HI antibodies to A/duck/Hubei/S1513/2010(Positive/Total) 

表7  pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Hubei/S1513/2010的HI抗体的平均滴度(log₂) 

Table7 Average HI antibodies to A/duck/Hubei/S1513/2010 immunized with pCons-CHANA(log₂) 

注：§：鸡死亡。 

1.2.6.2.免疫与攻毒后NA-ELIA抗体的检测 

在NA-ELISA抗体方面，NA抗体呈上升趋势，但是幅度不大(图15)。 

1.2.6.3发病与死亡情况 

加强免疫后第二周攻毒，在观察期中，对照组SPF鸡在3天内全部死亡，而免疫组无发病，无死亡，攻毒保护率为100％(图16)。 

1.2.6.4病毒分离与滴定 

所采集的拭子样本经适当的稀释之后接种SPF鸡胚，48h之后收取50μL进行血凝试验，结果显示，pCon-CsHANA免疫组则有3只鸡在第5天的喉头部位分离到病毒(表8)。 

表8  A/duck/Hubei/S1513/2010攻击后的病毒分离结果 

Table8 Virus shedding and titers after challenge with A/duck/Huhei/S1513/2010 

注：§：鸡死亡。 

1.2.7pCons-CHANA对A/chicken/Shandong/A-10/2011的免疫保护效率评估 

1.2.7.1pCons-CHANA免疫后及A/chicken/Shandong/A-10/2011攻毒后HI抗体的变化 

将剂量分别为30μg的pCons-CHANA免疫3周龄SPF鸡，在免疫后第一周对A/chicken/Shandong/A-10/2011的HI抗体100％转阳(表9)。 

表9  pCons-CHANA免疫后针对A/chicken/Shandong/A-10/2011的HI抗体的转阳率(阳性数/总数) 

Table9 The seroconversion rate of HI antibodies to A/chicken/Shandong/A-10/2011(Positive/TotaI) 

在HI抗体水平方面，免疫后针对A/chicken/Shandong/A-10/2011的HI抗体水平最高为4.6log₂；而在攻毒之后，HI抗体升至7log₂以上(图17，表10)。 

表10  pCons-CHANA免疫后针对A/chicken/Shandong/A-10/2011的HI抗体的平均滴度 

Table10 Average HI antibodies to A/chicken/Shandong/A-10/2011 immunized with pCons-CHANA 

注：§：鸡死亡。 

1.2.7.2.免疫与攻毒后NA-ELIA抗体的检测 

在NA抗体方面，除个别个体抗体较高外，加免前的抗体均维持在较低水平，加强免疫之后抗体水平均上升(图18)。 

1.2.7.3发病与死亡情况 

攻毒之后，对照组3天内全部死亡；pCons-CHANA免疫组实现对SPF鸡的完全保护，即无死亡，无发病和无排毒(图19)。 

1.2.7.4病毒分离与滴定 

所采集的拭子样本经适当的稀释之后接种SPF鸡胚，48h之后收取50μL进行血凝试验，结果显示，免疫组鸡无排毒现象，为完全保护(表11)。 

表11  A/chicken/Shandong/A-10/2011攻击后的病毒分离结果 

Table11 Virus shedding and titers after challenge with A/chicken/Shandone/A-10/2011 

注：§：鸡死亡。 

1.2.8pCons-CHANA对A/duck/Fujian/31/2007的免疫保护效率评估 

1.2.8.1pCons-CHANA免疫后及A/duck/Fujian/31/2007攻毒后HI抗体的变化 

将剂量为30μg的pCons-CHANA免疫3周龄SPF鸡，结果显示，pCons-CHANA免疫组在首次免疫后第二周便实现对DK/FJ/31/2007的HI抗体100％转阳(表12)。 

表12  pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Fujian/31/2007的HI抗体的转阳率 

Table12 The seroconversion rate of HI antibodies to A/duck/Fuiian/31/2007immunized with pCons-CHANA 

在HI抗体水平方面，免疫组针对DK/FJ/31/2007的HI抗体水平最高为6.3log₂(图20，表13)。 

表13  pCons-CHANA免疫后针对A/duck/Fujian/31/2007的HI抗体的平均滴度 

Table13 Average HI antibodies to A/duck/Fujian/31/2007immunized with pCons-CHANA 

注：§：鸡死亡。 

1.2.8.2.免疫与攻毒后NA-ELIA抗体的检测 

在NA抗体方面，抗体水平呈总体上升趋势，但在加强免疫后第二周的抗体水平出现集体下降(图21)。 

1.2.8.3发病与死亡情况 

对照组在攻毒后三天内全部死亡，免疫组在攻毒之后的保护率为100％(图22)。 

1.2.8.4病毒分离与滴定 

所采集的拭子样本经适当的稀释之后接种SPF鸡胚，48h之后收取50μL进行血凝试验，结果显示，免疫组均未检测到排毒，这表明该疫苗均能够对A/duck/Fujian/31/2007的攻击提供100％完全保护(表14)。 

表14  A/duck/Fujian/31/2007攻击后的病毒分离结果 

Table14 Virus shedding and titers after challenge with A/duck/Fujian/31/2007 

注：§：鸡死亡。 

1.3讨论 

流感病毒的频繁变异是其疫苗研发的主要障碍。本研究中，我们对我国2008年至2011年间分离得到的AIV毒株进行了分析，分别获得了一条基于HA基因的同义序列和一条基于NA基因的同义序列，并按照鸡密码子的偏嗜性对序列进行了优化，构建了重组表达质粒pCons-CHANA，将其转染293T细胞进行体外表达验证，间接免疫荧光实验结果表明，质粒均与不同分支病毒的阳性血清发生特异性反应，同义HA蛋白和同义NA蛋白都可以在293T细胞中高效表达；Western Blot结果表明，同义HA蛋 白的大小约为64ku，同义NA蛋白的大小约为49ku，并且能与不同分支病毒的阳性血清进行反应，这说明本研究构建的基于同义序列质粒所表达的蛋白具有同天然蛋白相似的反应原性，并且交叉反应性良好，为进一步对DNA疫苗质粒pCons-CHANA的免疫保护力奠定了基础。 

H5N1亚型禽流感病毒在野鸟和家禽中广泛流行，至今已经报道过上百起人感染H5N1亚型禽流感事件，且致死率将近60％(Chen et al.，2008)。而2013年春季在我国长三角地区发生的人感染H7N9亚型禽流感事件更是表明，禽流感病毒很可能会获得在人际传播的能力，从而引起广泛的大流行。因此，对禽流感的有效防控，无论对养禽业，还是对公共卫生，都具有十分重大的意义。但由于禽流感病毒变异频繁，且不同毒株之间交叉保护力存在较大的差异，这就使得疫苗株必须要经常更换，有些地区甚至需要同时使用针对不同抗原群的禽流感疫苗，这给禽流感的防控带来一定的困难。因此研制可以对不同抗原群禽流感病毒均能提供免疫保护的通用性疫苗成为禽流感疫苗研究的重要课题(Jiang et al.，2007)。 

HA基因和NA基因是流感病毒中变异频率最高的两个基因。其中，HA基因编码的血凝素蛋白是免疫保护最主要的靶标，针对HA蛋白的抗体能够通过组织病毒吸附和进入宿主细胞而保护机体免受病毒的感染(Lee et al.，2006)。针对NA蛋白的抗体能够将病毒聚集在细胞表面，从而减少受感染细胞中病毒粒子的释放(Sylte and Suarez，2009)。抗HA抗体和抗NA抗体均在抗禽流感病毒感染过程中发挥重要作用。 

本研究通过对我国近年分离得到的禽流感病毒毒株进行分析，获得了一条同义HA蛋白序列和一条同义NA蛋白序列，通过密码子优化，获得了同义HA基因序列和同义NA基因序列。这两条序列代表了我国近年来流行的禽流感毒株HA和NA基因序列最为保守的组成模式，通过将同义HA基因和同义NA基因插入到同一个载体上，构建pCons-CHANA并评价其对不同分支病毒的免疫保护效力，以期获得一种能够对不同分支病毒均具有免疫保护力的通用型禽流感疫苗。 

试验结果表明，pCons-CHANA免疫组对不同分支病毒的攻击均能够提供100％的免疫保护，其中对Clade7.2和Clade2.3.4a病毒的攻击均可以提供完全保护，对Clade2.3.2c和Clade2.3.2b分支的攻击虽然不能阻 止一过性的低剂量排毒，但可阻止发病和死亡。NA抗体水平虽然呈上升的趋势，但是产生的抗体水平均不高。 

本实验室之前曾根据NCBI流感病毒数据库中截止2009年底的5000多HA氨基酸序列进行过分析，获得了一条HA同义序列，构建了pCACons-HA5并对该疫苗进行了免疫评估(常晓飞，2012)。结果表明，30μg pCACons-HA5免疫SPF鸡可对2.3.2b和2.3.4a分支病毒的攻击提供完全保护，对7.2分支病毒攻击只能提供60％的免疫保护，对2.3.2c分支病毒攻击的免疫保护率为70％。氨基酸序列分析表明，该同义HA蛋白序列同A/duck/Guangdong/S1322/2010(属于clade2.3.2.c)、A/duck/Hubei/S1513/2010(属于clade2.3.2.b)、A/chicken/Shandong/A-10/2011(属于clade7.2)以及A/duck/Fujian/31/2007(属于clade2.3.4a)这几个我国主要流行分支病毒代表株的同源性分别为94.5％，93.5％，95.6％和95.4％，其同源性均不高，并且免疫保护力同氨基酸序列同源未呈现出明显的关系。而本研究中构建的同义HA DNA疫苗pCons-CHANA中的HA氨基酸序列同以上四个分支病毒代表株氨基酸序列的同源性分别为97.7％，97％，93.8％和93.8％，且对不同分支的病毒均可以提供100％的免疫保护，这表明，基于同义序列的DNA疫苗的免疫保护率同获得该同义序列的“集合”有较大的关系。来源于我国近年分离毒株序列集合的同义DNA疫苗对我国流行毒株的保护率较好，而来自NCBI数据库集合的同义序列，由于病毒分支过于复杂，其中包括了大量非我国流行毒株的序列，这些序列不对疫苗的免疫保护力做出任何贡献，因此，基于同义序列的DNA疫苗需要根据流行毒株的变化调整分析同义序列的“集合”，从而使所获得的同义序列更具代表性和针对性。 

本研究表明，DNA疫苗质粒pCons-CHANA可以对不同分支病毒的攻击提供100％的免疫保护，并且均可以产生较高水平的HI抗体，这表明基于同义序列的DNA疫苗具有较强的交叉免疫保护力，因此研制基于同义序列的禽流感DNA疫苗是研制抗禽流感通用疫苗的有效手段。由于禽流感病毒是不断进化的，因此基于同义序列的疫苗也需要根据流行毒株的变化而进行有针对性的优化和更新，从而实现对不同抗原群病毒攻击的完 全免疫保护。 

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。 

参考文献 

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Claims (10)

1.一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，其中所述同义血凝素蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：1，所述同义神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述重组表达载体通过将编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列插入到同一个表达载体中构建而成。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中编码所述同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码所述同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸序列针对所用的宿主细胞进行密码子优化。

3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，二者以相反的表达方向插入到同一表达载体中。

4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中所用的表达载体为pCAGGS，所得到的重组表达载体命名为pCons-CHANA，pCons-CHANA的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

5.包含权利要求1-4中任一项所述的重组表达载体的细胞。

6.一种DNA疫苗，所述疫苗包含有效量的权利要求1-4中任一项所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，所述疫苗有效预防和/或治疗下述分支的H5亚型禽流感病毒的感染：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a，优选地，所述疫苗有效预防和/或治疗下述H5亚型禽流感病毒的感染：

A/duck/Guangdong/S1322/2010，

A/duck/Hubei/S1513/2010，

A/chicken/Shandong/A-10/2011或

A/duck/Fujian/31/2007。

8.权利要求1-4中任一项所述的重组表达载体在制备用于有效预防和/或H5亚型禽流感病毒的感染的DNA疫苗中的应用，所述H5亚型禽流感病毒选自下述分支：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a，优选地，所述H5亚型禽流感病毒选自：

A/duck/Guangdong/S1322/2010，

A/duck/Hubei/S1513/2010，

A/chicken/Shandong/A-10/2011或

A/duck/Fujian/31/2007。

9.根据权利要求8所述的应用，其中感染所述H5亚型禽流感病毒的受试者为禽类或哺乳动物，优选人。

10.同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合或编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合在制备H5亚型流感灭活疫苗或其他基因工程疫苗中的应用，其中所述同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的组合作为免疫原，或者编码同义血凝素蛋白的核苷酸序列和编码同义神经氨酸酶蛋白的核苷酸的组合作为免疫原基因。

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