CN102533798A - 表达a型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达A型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用。本发明将SEQIDNo.1所示的编码A型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作性连接得到重组腺病毒穿梭表达载体；将该重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将其线型化后转染细胞，获得本发明重组复制缺损型腺病毒。本发明重组复制缺损腺病毒滴度高，在复制过程中能够形成A型口蹄疫病毒空衣壳并在病毒传代过程中稳定地表达口蹄疫病毒空衣壳，所表达的口蹄疫病毒空衣壳在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体并可抵抗口蹄疫病毒的攻击，可将其制备成预防或治疗口蹄疫疫苗。

Description

表达A型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用

技术领域

本发明涉及重组腺病毒，尤其涉及表达A型口蹄疫病毒空衣壳的重组复制缺损型腺病毒及其构建方法，本发明进一步涉及该重组复制缺损型腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫疫苗中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。口蹄疫的临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大的经济损失。因此世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的动物传染病。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，其最大颗粒直径为28纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个血清型A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，中国流行的口蹄疫主要为O、A、C三种血清型。

口蹄疫病毒各血清之间没有交叉保护，即使是同一血清型的不同亚型之间抗原差异程度也较大，以至于一种亚型的疫苗可能不完全保护同一血清型中其它亚型FMDV的感染，给口蹄疫的防治带来了极大的困难。疫苗接种是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗灭活疫苗和两种。

合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位点，利用病毒的主要抗原位点的一部份氨基酸序列合成具有一定结构的多肽，用于免疫动物诱导中和抗体而达到保护的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位点上发生关键氨基酸的突变，就会导致合成肽疫苗免疫保护效力的丧失。

FMD灭活疫苗在消灭欧洲的口蹄疫以及控制世界其他国家的口蹄疫过程中发挥了重要作用。但是，灭活疫苗在生产中需要密闭设施来繁殖有毒力的病毒，存在活病毒逃逸的潜在风险，世界上一些地区FMD的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关。此外，制备FMD灭活疫苗的抗原未经提纯，含有病毒非结构蛋白，难于进行感染动物和免接种动物的鉴别诊断。如今成为研究热点的口蹄疫候选疫苗包括减毒活疫苗，蛋白质亚单位疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗和重组病毒疫苗等。到目前为止，证明最有效的FMD新型疫苗是人5型复制缺损型腺病毒(Ad5)表达的口蹄疫病毒空衣壳。Ad5作为一个理想的载体的重要原因是因为其免疫动物后不产生针对Ad5的中和抗体，排除了二次免疫的干扰。

鉴于FMD灭活疫苗的上述缺点，国内外研究者都在寻求一种更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗应具有病毒的完整抗原谱，其免疫原性类似于天然的病毒颗粒，并且没有病毒的核酸，不能自主复制等特点。以缺损型腺病毒(Ad5)为载体的口蹄疫病毒空衣壳疫苗完全满足了上述要求，可被视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，这样既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺陷，又可以诱导全面而持久的免疫反应，而且其免疫动物后不产生针对Ad5的中和抗体，排除了二次免疫的干扰。

发明内容

本发明的目的之一是提供编码A型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C；

本发明的目的之二是提供一株携带所述亚基因组P1-2A-3C并能够稳定表达A型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒；

本发明的目的之三是提供一种构建上述重组缺损型腺病毒的方法；

本发明目的之四是将所构建的重组缺损型腺病毒应用于制备成预防或治疗A型口蹄疫的疫苗或试剂。

为了实现上述之目的，本发明首先提供了编码A型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

构建FMD病毒空衣壳的前提是必须保证得到完整、精确的FMDV基因组结构，在此基础上才能正确拼接FMDV的P1-2A和3C亚基因组，否则将对口蹄疫病毒空衣壳的形成造成很大的影响。只有口蹄疫P1-2A-3C亚基因组序列的拼接正确，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前体蛋白并完成病毒衣壳组装，这对后期的动物免疫试验的效果会产生重要甚至决定性影响。此外，本发明在拼接口蹄疫P1-2A-3C亚基因组序列时加入了非结构蛋白2B片段，该片段起到了免疫佐剂作用，能提高口蹄疫病毒空衣壳对本动物尤其是猪的免疫保护效果。还需要说明一点的是，在拼接编码口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组时，本发明中所用的A型FMDV序列与国内外在拼接编码口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组时所用到的FMDV序列不属同一基因型。

Mayr等(Mayr，G.A.，Chinsangaram，J.，Grubman，M.J.，1999，Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing thecapsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as avaccine candidate.Virology 263，496-506.)构建了含A型FMDV基因组P1-2A-3C的重组腺病毒，并对其中构建的一株重组腺病毒的3C蛋白酶基因进行了突变，从而使3C蛋白酶不能发挥裂解蛋白的作用，在后期的动物免疫试验中此株重组腺病毒就不能够诱导动物产生中和抗体。

本发明将所拼接的编码口蹄疫病毒空衣壳的P1-2A-3C亚基因组序列导入到腺病毒中筛选得到稳定表达FMD病毒空衣壳的重组腺病毒，该重组腺病毒免疫的小鼠产生了高水平的口蹄疫病毒中和抗体，这也进一步说明了本发明在体外正确地拼接了编码口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C。

筛选获得稳定、高效表达A型FMDV空衣壳的重组腺病毒是本发明的另一重要之目的。为此，本发明提供了一株携带有SEQ ID No.1所示的编码A型口蹄疫病毒空衣壳亚基因组的重组缺损型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)；本发明将所筛选的滴度为7.9×10⁸PFU/ml的第8代重组缺损型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)提交专利认可的微生物保藏机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.5718；分类命名是：人血清5型复制缺损型腺病毒；保藏时间是：2012年1月16日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

将本发明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C在HEK-293细胞上培养，用FMDV共享表位单克隆抗体4B2进行免疫荧光检测为阳性，其培养上清用Western blot检测呈现中等强度的阳性反应，表明重组腺病毒所携带的编码A型口蹄疫病毒空衣壳亚基因组在HEK-293细胞内实现了稳定、高效的表达。本发明采用一步生长曲线测定重组腺病毒rAdV-A-P12A3C在HEK-293细胞中的复制能力，病毒在接种后60h复制水平达到高峰；本发明重组腺病毒的滴度达7.9×10⁸PFU/ml。重组腺病毒rAdV-A-P12A3C所携带的外源基因在病毒传代过程中稳定表达表达A型口蹄疫病毒的衣壳蛋白并形成口蹄疫病毒空衣壳。

将本发明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C接种小鼠，在一免后3周出现中和抗体(1∶11)，随后抗体水平逐渐升高，加强免疫后5周(一免后11周)中和抗体达到高峰(1∶223)，之后抗体水平逐渐下降，到第23周接种鼠的中和抗体水平接近阴性。试验研究表明，中和试验预测疫苗效力的精确度大于80.0％，虽然不同实验室的测定结果存在一定的差异。例如，预测保护率在73。6％～87％时的中和抗体滴度，一个实验室为1.3log10，而另一个实验室的测定值为1.68log10；Leonard B等在巴西、英国和德国进行试验，数据来源于765头猪的攻毒试验结果，统计分析表明，在95％的置信度，平均中和抗体滴度大于1.74log10时，动物的保护率大于62.5％。中和滴度检测结果表明，本发明所构建的表达A型口蹄疫病毒空衣壳的缺损腺病毒在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体，作为预防A型口蹄疫的疫苗具有重要的开发价值。

总之，本发明所构建的重组缺损腺病毒rAdV-A-P12A3C滴度高，在病毒传代过程中稳定地表达口蹄疫病毒空衣壳，所表达的口蹄疫病毒空衣壳在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体并可抵抗病毒的攻击，可作为预防O型口蹄疫的疫苗。本发明重组缺损腺病毒所制备的疫苗不含有口蹄疫病毒遗传物质，因此不具有感染性；不必加佐剂，安全性更高，副作用更小；本发明疫苗接种动物后，可获得更持久的免疫反应和较长的免疫保护期；本发明疫苗以复制缺损型腺病毒作为载体，其在体内不复制，再次接种时不干扰疫苗的免疫效果。

本发明还提供了一种构建所述重组缺损型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)的方法，包括以下步骤：

将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作性的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染细胞，获得重组缺损型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)。

其中，所述的腺病毒穿梭质粒选自p-Shuttle，p-Shuttle-CMV，pAdTrack或pAdTrack-CMV；所述的病毒骨架载体质粒选自pAdEasy-1或pAdEasy-2。

附图说明

图1重组腺病毒rAd-A-P12A3C感染HEK-293细胞引起的细胞病变；(A)感染rAdV-A-P12A3C的HEK-293细胞；(B)正常HEK-293细胞。

图2重组腺病毒rAd-A-P12A3C在HEK-293细胞中的PCR鉴定；1：DL10,000DNA Marker；2-4：第4代，6代和8代rAdV-A-P12A3C；5：腺病毒对照Ad5。

图3间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAd-A-P12A3C感染的HEK-293细胞；A.rAd-A-P12A3C感染的HEK-293细胞；B.Ad5感染的HEK-293细胞。

图4用Western blot分析FMDV空衣壳在重组腺病毒rAd-A-P12A3C感染细胞中的表达；1：Marker；2：人5型缺损型腺病毒感染的HEK-293细胞；3-5：第4代、6代和8代rAd-A-P12A3C感染的HEK-293细胞；6：FMDV。

图5重组腺病毒rAdV-A-P12A3C的一步生长曲线。

图6重组腺病毒rAdV-A-P12A3C接种BALB/c小鼠中和抗体的动态变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

质粒、载体和生化试剂

腺病毒骨架载体pAdEasy-1、腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、大肠杆菌BJ5183感受态菌以及HEK-293细胞均购自Stratagene公司。大肠杆菌JM109、DH5α感受态细胞由本发明人试验室保存。PmeI和PacI均为NEB公司产品。转染试剂Effectene Transfection Reagent购自QIAGEN公司。口蹄疫病毒VP2单克隆抗体4B2(Yongzhong Yu，Haiwei Wang，Lei Zhao，Chunyuan Zhang，Zhigang Jiang，Li Yu*.Fine Mapping of a Foot-and-Mouth Disease VirusEpitope Recognized by Serotype-independent Monoclonal Antibody 4B2.The Journal of Microbiology，2011，49(1)：94-101.)由本发明人实验室制备并保存。无外源基因表达的腺病毒(Ad5)由本发明人实验室构建并保存。

实施例1  重组腺病毒的构建和鉴定

1.A型FMDV亚基因组P1、2A2B和3C基因的合成

根据A型FMDV的基因组序列，合成P1-2A2B-3C亚基因组(SEQ ID No.1)，测序正确的重组质粒命名为p-A-P12A3C。质粒p-A-P12A3C含有kozka序列和起始密码子ATG和终止密码子TAG。

2.重组腺病毒穿梭载体的构建

将p-A-P12A3C质粒和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV进行SalI和EcoRV双酶切，胶回收纯化酶切后的产物，与穿梭载体连接，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。测序正确的质粒命名pShuttle-A-P12A3C。

3.重组腺病毒质粒的获得

将pShuttle-A-P12A3C用限制性内切酶PmeI线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用PacI酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒进行测序，验证正确的命名为pAdV-A-P12A3C。

4.转染

将质粒pAdV-A-P12A3C转化DH5α感受态菌，大量增殖重组质粒。用中量质粒提取试剂盒提取重组腺病毒质粒，用PacI酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干，用无菌超纯水溶解沉淀，使质粒的终浓度为1-2g/L。用QIAGEN公司转染试剂Effectene Transfection Reagent进行转染，具体操作按说明书进行。

5.重组腺病毒的纯化与鉴定

将获得的初代重组腺病毒(命名为rAdV-A-P12A3C)反复冻融后，离心取上清，接种HEK-293细胞，连续传8代，观察细胞病变情况；转染重组腺病毒质粒后10d，HEK-293细胞出现细胞病变特征，细胞变圆、变大、并脱落。当80％的细胞出现CPE时收获病毒，反复冻融3次后接种HEK-293细胞，连续传8代。在传至第5代时，细胞于接种病毒后24-48h开始出现CPE(图1A)，而对照组(图1B)细胞单层完整，形态规则。

取2代、4代、6代和8代病毒，用蛋白酶K处理后，用PCR检测目的基因。取第2代、4代、6代和8代重组腺病毒，用DNA提取试剂盒提取重组病毒DNA，用引物A-U(5’TTG TCG ACC CAC CAT GGG GGC AGG GCA ATC TAG C 3’)和A-L(5’TAG ATA TCT TAC TAT TCA TGG TGT GGC TCA GGG T 3’)扩增A型口蹄疫病毒P1-2A、2B和3C基因，检测外源基因在重组腺病毒内的稳定性。由图2可见，第2代、4代、6代和8代重组腺病毒均能检出3.5kb的目的基因，说明目的基因在重组腺病毒中稳定存在。

同时取4代、6代和8代重组腺病毒感染的HEK-293细胞，用口蹄疫病毒非血清型依赖的单抗4B2进行间接免疫荧光试验及Western blot分析，以检测目的基因的表达情况。

间接免疫荧光试验

将HEK-293细胞铺于96孔板中，当长到90％单层时，接种15MOI(Multiplicities of infection)rAdV-A-P12A3C，24h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，将rAdV-A-P12A3C感染的HEK-293细胞用预冷的无水乙醇固定15min，加入抗FMDV的单克隆抗体4B2，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入荧光标记羊抗鼠IgG(Sigma)于37℃作用45min，PBST洗涤后自然干燥，加入缓冲甘油，于荧光显微镜下观察。

试验结果表明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C感染的细胞在荧光显微镜下出现特异的绿色荧光(图3A)，而对照细胞则检测不到荧光(图3B)，表明重组腺病毒所携带的目的基因(SEQ ID No.1)在HEK-293细胞中得到稳定的表达。

试验例1P12A3C基因在重组腺病毒感染细胞中的表达和稳定性分析

1、Western blot

用单克隆抗体4B2对第4代、6代、8代的重组腺病毒rAdV-A-P12A3C进行Western blot分析：将感染rAdV-A-P12A3C的HEK-293细胞进行SDS-PAGE分析，同时设立口蹄疫全病毒蛋白作为阳性对照，野生型腺病毒感染的HEK-293细胞作为阴性对照，之后转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶封闭后，加入抗FMDV的单克隆抗体4B2(1∶1000稀释)，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(Sigma，1∶10,000稀释)，37℃作用1h，洗涤后加入DAB溶液显色。

试验结果表明，与单克隆抗体4B2发生免疫反应的条带与FMDV空衣壳VP0、VP3、VP1的分子量大小相当(图4)，说明rAd-A-P12A3C在感染的HEK-293细胞中复制能产生口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1、VP3，并且稳定地表达。

2、重组腺病毒增殖滴度的测定

分别用10MOI剂量的第8代重组腺病毒(rAdV-A-P12A3C)和野生型腺病毒(Ad5)接种HEK-293细胞，在接种后12h、24h、36h、48h、60h和72h收取病毒并进行毒价测定(Kleina L G.，Grubman M J.1992.Antiviral Effects ofa Thiol Protease Inhibitor on Foot-and-Mouth Disease Virus.J.Virol.66：7168-7175.)，建立重组腺病毒与野生型腺病毒的一步生长曲线。分别用10MOI剂量的第4代、6代、8代和10代重组腺病毒(rAdV-A-P12A3C)接种HEK-293细胞，在接种后60h收取病毒并进行毒价测定，检测不同代次重组病毒的病毒滴度。

经病毒滴度测定，绘制出第8代重组腺病毒rAdV-A-P12A3C与其亲本病毒的一步生长曲线，即病毒增殖滴度与生长时间的相关性曲线，反映病毒生长繁殖的规律。试验结果见图5，结果表明，随着重组腺病毒感染HEK-293细胞时间的延长，病毒滴度逐渐升高，在60h时，病毒的滴度达到峰值，随后开始下降。

试验例2  BALB/c鼠的免疫接种

在获得稳定高效表达A型口蹄疫空衣壳的重组腺病毒后，首先在BALB/c小鼠体内检测该重组腺病毒的免疫原性。

7周龄BALB/c鼠25只，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，用免疫荧光方法检测人腺病毒5型抗体为阴性。实验动物随机分成5组，每组5只。A组接种5×10⁷PFU第8代的重组腺病毒rAdV-A-P12A3C，部位为后腿肌肉，用PBS稀释，在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；B组接种加法国佐剂ISA 206的重组腺病毒rAdV-A-P12A3C，免疫剂量、免疫次数及间隔时间同A组，佐剂与病毒比例为1∶1，即100μl病毒+100μl佐剂/mouse；C组接种100μl A型口蹄疫BEI灭活疫苗，在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；D组接种100μl A型口蹄疫商品化灭活疫苗。E组接种100μl Ad5腺病毒。免疫1周后采血以后每隔2周采血一次直到23周。

1.微量细胞中和试验

(1)病毒毒价的测定：将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75％以上，收获病毒悬液冻融3次，以3000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml于1.5ml EP管置-70℃保存备用，选用的病毒对细胞有较稳定的致病力。从-70℃冰箱取一EP管保存的病毒，将病毒在96孔培养板上作10系列稀释，即10^-1，10^-2，10^-3……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100μl细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度可以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5％CO₂温箱37℃培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID₅₀。(殷震，刘景华，动物病毒学，第2版，北京：科学出版社，1997，336～340.)，举例说明见表1。

表1  TCID₅₀计算(接种剂量50μl)

Ig TCID₅₀＝高于50％病毒稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数；高于50％病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为-1。

IgTCID₅₀＝-6+0.26×(-1)

        ＝-6.3

则TCID₅₀＝10^-6.3，即病毒作10^-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数培养细胞发生病变。

(2)中和试验：动物血清中含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清或腹水须经56℃加热30min灭活处理。取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64等等，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。取-70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID₅₀稀释(与等量血清混合，其毒价为100TCID₅₀)。如病毒价为10^-6.3，50μl。所以应将病毒作2×10^-4.3稀释。每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清中和病毒1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置37℃温箱(5％CO₂)培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照。阳性和阴性(sp2/0)腹水与待检腹水进行平行试验，阳性腹水对照应不出现细胞病变，而阴性腹水对照应出现细胞病变。每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID₅₀稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。0.1TCID₅₀应不引起细胞病变，而且100TCID₅₀必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。为检查被检腹水本身对细胞有无毒性作用，设立被检腹水对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检腹水(相当于中和试验中被检腹水的最低稀释度)。即不接种病毒和待检腹水的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，赋税毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检腹水孔出现100％CPE判为阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结举例说明见表2。

表2  固定病毒-稀释血清法测定中和抗体效价的计算

用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果：

IgPD₅₀＝高于50％血清稀释度的对数-距离比例×稀释系

数的对数

IgPD₅₀＝-1.5-0.5×(-0.3)＝-1.35

则PD₅₀＝10^-1.36/50μl

因10^-1.35＝1/22，即1∶22的血清可保护50％细胞不产生病变，1∶22就是该份血清的中和抗体效价。

本发明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C(第8代)免疫组(A组)，加佐剂的本发明重组腺病毒组(第8代)(B组)，A型口蹄疫BEI灭活病毒组(C组)，A型口蹄疫商品化灭活苗组(D组)和Ad5腺病毒组(E组)均在接种后23周期间内采集血清，用微量中和试验检测血清抗体的动态水平，腺病毒Ad5免疫组作为对照。从图6可看出，本发明重组腺病毒免疫组(A组)，加佐剂的本发明重组腺病毒组(B组)，A型口蹄疫BEI灭活病毒组(C组)和A型口蹄疫商品化灭活苗组(D组)的小鼠在首次免疫后均可诱导产生口蹄疫特异性中和抗体，A组在一免后3周出现中和抗体(1∶11)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后5周(一免后11周)中和抗体达到高峰(1∶223)，之后抗体水平逐渐下降，到第23周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；B组在一免后5周出现中和抗体(1∶16)，随后抗体水平逐渐升高，在加强免疫后的5周(一免后11周)中和抗体达到高峰(1∶128)，之后抗体水平逐渐下降，但在一免后17周比A组的中和抗体水平高，到第23周接种鼠的中和抗体水平接近阴性；C组在一免后3周出现中和抗体(1∶16)，在加强免疫后的5周(一免后11周)中和抗体达到高峰(1∶128)，之后抗体水平逐渐下降，到第23周接种鼠的中和抗体水平接近阴性。D组在加强免疫后3周才出现特异性中和抗体(一免后9周)，之后抗体水平没有明显升高，一直维持在很低的水平，到第17周接种鼠的中和抗体水平接近阴性。Ad5野生型腺病毒接种小鼠(E组)没有产生任何针对口蹄疫的特异性中和抗体。

概括起来，免疫小鼠诱导中和抗体具有如下明显特征：其一，加强免疫能够明显诱导接种鼠产生口蹄疫特异性中和抗体，A、B、C和D这4组鼠分别在一免后的3周、5周、3周和9周开始产生中和抗体。其二，中和抗体的应答水平与鼠免疫的疫苗种类有关，疫苗接种诱导鼠产生中和抗体水平的高低和持续时间的长短排序，依次为：本发明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C、加佐剂的本发明重组腺病毒rAdV-A-P12A3C、A型口蹄疫病毒BEI灭活疫苗、A型口蹄疫病毒商品化灭活疫苗。

<110>  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

 

<120>  表达A型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用

<130>  DQXL-0016

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  3558

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgggggcag ggcaatctag ccctgccacc gggtcacaga accagtcagg caataccggc       60

 

agcattatta acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac acaacttggt      120

 

gacaacgcca tcagcggagg atccaacgag gggtccacgg acacaacctc tacccacaca      180

 

accaacaccc aaaacaatga ctggttctca aaactggcaa gttctgcgtt caccggtctt      240

 

ttcggcgcac tgctcgccga caagaagacc gaagagacaa ctcttctgga ggaccgtatc      300

 

ctcaccactc gtaatggaca caccacttct acaactcagt cgagtgtggg ggtcacctac      360

 

gggtattcaa ctggtgagga ccacgtttct ggacctaaca catcaggttt ggagacgcgg      420

 

gtggtacaag ctgaaaggtt cttcaagaag cacttatttg attggacgac ggacaaaccc      480

 

tttggtcaca ttgaaaagct ggaacttccc actgatcaca aaggtgtcta cggacagctg      540

 

gtggactcct ttgcatacat gagaaatggc tgggacgtgg aggtgtctgc tgttggcaac      600

 

cagttcaacg gcgggtgcct tctcgtggcc atggtacctg agtttaagga gttcaccaca      660

 

cgtgaaaagt accagctcac cctgttcccc caccagttca ttagccccag aaccaacatg      720

 

accgcgcaca tcacggtccc gtaccttggt gtgaacaggt atgaccagta caacaaacac      780

 

aaaccctgga cgttggtggt gatggtggtt tcaccactta ccactagctc cattggtgca      840

 

tcacagatta aggtctacac caacatcgcc ccgacccacg ttcacgtggc tggcgagctc      900

 

ccgtcgaaag aggggatcgt gccggtcgcc tgctcggacg ggtacggtgg cctggtgaca      960

 

acagacccta aaacagctga ccctgcttac ggtatggtgt acaacccacc taggaccaac     1020

 

taccccgggc ggtttacaaa cttgttggac gtggcagagg cgtgtcccac cttcctctgt     1080

 

ttcgacgacg ggaaaccgta tgttgtgaca agaacggatg agcagcgcct cttggccaag     1140

 

tttgaccttt cccttgctgc aaagcacatg tcaaacacct acctttcagg gatagcacag     1200

 

tactacgcac agtactctgg caccatcaat ttgcacttca tgtttactgg ttccactgac     1260

 

tcaaaggccc gttacatggt ggcttacgtc ccgcctggcg tgacaacgcc accggacacg     1320

 

cctgagagag ctgcgcactg catccacgca gaatgggaca cggggctaaa ctccaaattc     1380

 

actttttcaa tcccgtacgt atctgctgca gattacgcgt acacagcgtc cgatgtggca     1440

 

gacacaacaa acgtacaggg atgggtttgc atctaccaaa tcacccacgg gaaggccgaa     1500

 

caagacacct tggtcgtgtc ggtcagcgcc ggcaaagact ttgagctgcg cctccccatt     1560

 

gacccccgtg cgcaaaccac cgccaccggg gaatcagcag accccgtcac aaccaccgtc     1620

 

gagaactacg gtggtgagac acaagtgcag cgacgccacc acaccgacgt cagctttata     1680

 

atggacaggt ttgtgcagat caagcctgtg agccccacac atgtcattga cctcatgcaa     1740

 

acacaccaac acgggctggt gggcgctatg ttgcgcgcgg ccacctacta cttttctgat     1800

 

cttgagattg tggtgaacca cacaggtcgc ctaacgtggg tacccaacgg agcaccagag     1860

 

gcagcactgg acaacacgag caaccccact gcttaccaca aagcaccgtt cacaaggctt     1920

 

gcactccctt acaccgcgcc acaccgcgtg ttggcaaccg tgtacaacgg gactagcagg     1980

 

tactctgcgc ctgcaacacg gcgaggtgac ttggggtctc ccgcggcgag gctcgccgca     2040

 

cagcttcctg cctccttcaa ctacggcgcg gttcgagcca cggagatcca agaactcctc     2100

 

gtgcgcatga agcgcgccga gctctactgc cccaggccac tgctggcggt ggaggtgacg     2160

 

tcacaagaca gacacaagca gaaaatcatt gcccctgcaa agcaactcct gaaccttgat     2220

 

ctgctcaagt tggcgggaga cgttgagtcc aaccctgggc ctttcttctt ctccgacgtt     2280

 

aggtcaaatt tcaccaaact ggttgaaacc attaaccaga tgcaagagga catgtcaaca     2340

 

aaacacgggc ctgactttag ccggttggtg tccgcgtttg aggaattggc cgccggggtg     2400

 

aaagccatca ggaacggtct cgacgaggcc aagccctggt ataagctcat caaactccta     2460

 

agccgcttgt catgcatggc cgctgtagca gcacggtcca aggacccagt ccttgtggcc     2520

 

atcatgctgg ctgacaccgg ccttgagatt ctggacagca cgtttgtcgt gaagaagatc     2580

 

tccgactcgc tctccagtct ctttcacgtg ccggcccccg tctttagttt cggagctccg     2640

 

atcctattgg ctgggttggt caaggtcgcc tcgagtttct tccggtccac gcccgaagac     2700

 

ctcgagagag cagaaaaaca gaagcttcgt cagaaacctc tgaaagtgaa agccaagctg     2760

 

ccacaacagg agggacccta cgctggtccg atggagagac agaaaccact gaaagtgaaa     2820

 

gtaaaagccc cggtcgtgaa ggaaggacct tacgaaggac cggtgaagaa gcctgtcgct     2880

 

ttgaaagtaa aagctaagaa cctgattgtc actgaaagtg gtgccccccc gaccgacttg     2940

 

caaaagatgg ttatgggcaa caccaaaccc gttgagctca tcctcgatgg gaagacagta     3000

 

gccatttgct gcgctactgg agtgttcggc actgcctacc tcgtgcctcg tcatcttttc     3060

 

gctgagaagt atgacaagat catgttggat ggtagagcca tgacagacag tgactacaga     3120

 

gtgtttgagt ttgaaattaa ggtaaaagga caggacatgc tttcagacgc tgcgctcatg     3180

 

gtgttgcacc gtgggaatcg cgtgagagac atcacgaaac actttcgtga cacagcaaga     3240

 

atgaagaaag gcacccccgt cgtcggcgta ataaacaacg ctgatgttgg tagactgatt     3300

 

ttctctggtg aggcccttac ctacaaagac attgtagtgt gcatggatgg agacaccatg     3360

 

ccgggcttgt ttgcctacag agccgccacc aaggctggtt actgtggagg agctgttctt     3420

 

gccaaagacg gagctgacac attcatcgtc ggcactcact ccgcaggtgg caatggggtt     3480

 

gggtactgct cgtgcgtatc cagatccatg cttttgaaga tgaaggcaca cattgaccct     3540

 

gagccacacc atgaatag                                                   3558

Claims (10)

1.编码A型口蹄疫病毒空衣壳的的亚基因组，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的亚基因组编码的蛋白。

3.携带有权利要求1所述的亚基因组的重组腺病毒。

4.按照权利要求3所述的重组腺病毒rAdV-A-P12A3C，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.5718。

5.一种构建权利要求3或4所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得了以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染细胞，获得重组缺损型腺病毒。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的腺病毒穿梭质粒选自p-Shuttle、p-Shuttle-CMV、pAdTrack或pAdTrack-CMV。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的病毒骨架载体质粒选自pAdEasy-1或pAdEasy-2。

8.权利要求1所述亚基因组在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。

9.权利要求2所述蛋白在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。

10.权利要求3或4所述的表达A型口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。

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