CN101754975A - 针对蓝舌病毒的重组疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫原性或疫苗组合物，其用于在对BTV感染易感的动物中诱导针对环状病毒(更具体地，蓝舌病毒(BTV))的免疫应答或保护性免疫应答。所述组合物可以包含制药学或兽医学上可接受的运载体或赋形剂以及载体。所述载体可以包含异源核酸分子，并在所述动物体内表达BTV抗原、免疫原或其表位，例如BTV VP2；BTV VP2和VP5；BTV VP2和VP5和VP3和/或VP7。所述组合物可以包含佐剂，例如卡波姆。本发明还考虑了用于制备和使用此类组合物的方法，其包括初激-加强方案以及包括鉴别诊断。

Description

针对蓝舌病毒的重组疫苗

相关申请/通过提及而合并入

本申请要求于2006年6月1日提交的美国专利申请11/444,698的利益。

上述申请中的每一个申请与其中所引用的每一篇文献一起，以及在其中所引用的文献中所参考或引用的每一篇文献，均通过提及而合并入本文。

本文所引用的每一篇文献(“申请引用的文献”)，和在每一篇申请引用的文献中所引用或参考的每一篇文献，以及关于在本文和任何合并入本文的文献中所提及的任何产品的任何厂商说明书或指导，均通过提及而合并入本文；并且，可以在本发明的实施过程中使用通过提及而合并入本文的每一篇文献中的技术。

技术领域

本发明涉及：包含呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)(更具体而言，蓝舌病毒(或BTV))的至少一种多核苷酸或者编码至少一种BTV抗原、免疫原或表位的至少一种核酸分子的载体(vector)，例如可以包含并表达BTV的至少一种多核苷酸的体内和体外表达载体，或者可以包含并表达至少一种BTV抗原、免疫原或表位的体内和体外表达载体；以及针对蓝舌病的免疫原性组合物和疫苗，例如这样的组合物或疫苗，其可以包含所述载体中的一种或多种和/或所述载体的表达产物中的一种或多种。本发明还涉及使用所述载体、组合物和疫苗的方法，其包括针对该病毒进行免疫接种和疫苗接种，表达出所述多核苷酸的表达产物，在测定法中使用所述表达产物或用于产生在测定法中可用的抗体；本发明还涉及制备尤其是所述多核苷酸、载体、组合物、疫苗、测定法的方法。

背景技术

蓝舌病(BT)是反刍动物的由节肢动物传播的传染性病毒疾病。牛和山羊可容易被致病BTV感染，但是未呈现广泛的血管损伤，因此这些物种通常不会显示出明显的临床迹象。相反地，绵羊中的该疾病的特征在于口、鼻和前胃的粘膜的卡他性炎症，以及蹄的冠状带和板(laminae)的炎症。上皮发生脱落，并最终发生口腔粘膜坏死；肿胀且发炎的舌和口可以呈现蓝色，该病由此而得名(Spreull 1905)。据估计，绵羊中的死亡率为1-30％。

BTV是环状病毒属(呼肠孤病毒科)的原型病毒，并且由至少24种不同的血清型构成(Wilson和Mecham 2000)。已经在全球的热带和温带地区各处鉴定出BTV的不同毒株。在欧洲远至北纬45度、在亚洲和北美洲远至北纬50度以及南至南纬35度处都发生过BTV感染。在反刍动物之间BTV并不是接触传染的，因此BTV的分布取决于库蠓属(Culicoides sp.)的节肢动物媒介物(vector)物种(蠓)的存在，在世界不同地区存在不同的媒介物物种。近期的数据表明，遗传漂变和建立者效应有助于BTV野生株的个体基因区段的多样化(Bonneau，Mullens等人2001)。已经显示，BTV血清阳性的动物对于同源BTV血清型的再感染具有抗性。

反刍动物的BTV感染是暂时的，而库蠓属昆虫媒介物的感染是持久的。病毒血症的持续时间取决于动物的种类和BTV的毒株。已经报道，绵羊中的病毒血症可以是非常短暂的，在BTV感染的个体绵羊中病毒血症可以持续至多41天，在山羊中病毒血症可以持续至多42天，而在牛中病毒血症可以持续至多100天。由于牛的BTV感染通常导致延长的但并非持续的病毒血症，因此牛起到了储库的作用，从中病毒可以被库蠓属媒介物摄取，然后传播给其他反刍动物(Anderson，Stott等人1985；MacLachlan 1994；MacLachlan和Pearson 2004)。人们对许多库蠓属媒介物物种的生态学了解得较少，它们的繁殖地点大部分没有被表征，并且它们的散布速度也是未知的。在北美洲，Culicoides sonorensis是BTV的主要媒介物。雌性库蠓属昆虫持续地被BTV感染，并可以在至多14天的外潜伏期后传播该病毒(Mullens，Tabachnick等人1995)。在温带，BTV可以通过垂直感染的昆虫媒介物而越冬，虽然近期的数据表明，在所述昆虫媒介物的幼虫阶段中的持续BTV感染过程中，外部衣壳基因的表达降低(White，Wilson等人2005)。

BTV病毒粒子的直径为～69nm，其具有双壳层外壳(衣壳)，所述双壳层外壳有时被来源于受感染细胞的细胞膜的脂蛋白“假包膜”所包围。BTV基因组包含10个不同的双链RNA区段，它们共同编码了7个结构蛋白(VP1至VP7)和4个非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)(Roy 1996)；其中9个基因组区段为单顺反子，而区段10利用第二个框内起始密码子而编码NS3和NS3A。在二十面体病毒粒子颗粒中，基因组RNA通过双层蛋白质衣壳而壳体化(Verwoerd，Els等人1972)。二十面体的核心由两个主要蛋白质(VP3和VP7)和三个次要蛋白质(VP1、VP4、VP6)组成，并且被外部衣壳所包围，所述外部衣壳由VP2和VP5(分别由基因组区段2和5编码)组成(Roy 1996)。VP2负责BTV的结合和进入细胞、中和、血清型特异性以及血细胞凝集。多聚体形式的VP2(二聚体和三聚体)装饰了位于病毒颗粒外表面上的VP5支架结构的大部分表面(Hassan和Roy 1999)。在24种BTV血清型中，VP2的变化最大，并且抗VP2抗体的水平与在体外和体内的病毒中和有关(Huismans和Erasmus 1981)。在BTV的不同血清型和毒株之间，VP5也显著地变化(de Mattos，de Mattos等人1994；DeMaula，Bonneau等人2000)，并且虽然到目前为止还没有鉴定出VP5特异性的中和性MAb，但是已经有数据表明，该蛋白质通过其对VP2的构象影响而在中和和血清型决定中起着作用(Huismans和Erasmus 1981；Roy，Urakawa等人1990；DeMaula等人，2000)。将纯化的VP2(其通过用BTV抗核心血清进行免疫吸附而除去痕量的VP7)注射到绵羊中。50微克VP2的初始剂量足以诱导沉淀VP2的抗体以及中和性和抑制血细胞凝集的抗体。这些绵羊完全受到保护而能够抵抗相同BTV血清型的强毒株的攻击。即使在攻击之前没有检测到中和抗体，较低剂量的VP2仍提供了显著水平的保护(Huismans，vander Walt等人1987)。进来的数据显示，VP2和NS1表现出被细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)所识别的表位(Andrew，Whiteley等人1995)，而VP7和VP5不可能具有CTL表位。到目前为止，VP3、VP4、VP6、NS2和NS3没有在绵羊中激发CTL应答(Lobato，Coupar等人1997)。下表1(从(Wilson和Mecham 2000)进行了修正)概括了BTV的基因及其蛋白质功能：

表1.蓝舌病毒基因及所编码的蛋白质

(其中包括蛋白质的位置、性质和功能)

基因组区段	蛋白质	位置	性质和功能
				L1(3954bp)(150kDa)	VP1	在5重轴上的亚核心内	RNA依赖性RNA聚合酶
L2(2926bp)(111kDa)	VP2	外部衣壳(三聚体)	外部衣壳，血清型特异性抗原，哺乳动物细胞附着蛋白，中和表位
				L3(2770bp)(103kDa)	VP3	亚核心衣壳层(T＝2对称)	最内部的蛋白质衣壳壳层，亚核心衣壳层，自组装，保持二十面体对称，结合RNA的，与内部次要蛋白质相互作用
M4(2011bp)(76kDa)	VP4	在5重轴上的亚核心内(二聚体)	加帽酶，鸟苷酸转移酶
				M5(1638bp)(59kDa)	VP5	外部衣壳(三聚体)	内部外部衣壳蛋白，可以影响病毒血清型特征
M6(1769bp)(64kDa)	NS1	细胞质	在细胞质中形成小管
				S7(1156bp)(38kDa)	VP7	外部核心(T＝13对称，三聚体)	外部核心表面蛋白质，免疫显性的主要血清群特异性抗原，用于媒介物昆虫细胞的附着蛋白，与“核心中和性”抗体反应
S8(1124bp)(41kDa)	NS2	细胞质，病毒内含体(VIB)	重要的病毒内含体基质蛋白，结合ssRNA的，磷酸化的，可以与外部衣壳相联系
				S9(1046bp)(36kDa)	VP6	在5重轴上的亚核心内	结合ssRNA和dsRNA的，解旋酶，NTP酶
S10(822bp)(24kDa)	NS3，NS3a	细胞膜	糖蛋白，膜蛋白，参与离开细胞(cell exit)

Lobato和Coupar(Lobato，Coupar等人1997)研发出基于痘苗病毒的表达载体以用于体内和体外研究，所述表达载体包含各种插入片段，这些插入片段相应于编码的BTV结构蛋白VP2、VP5和VP7的核苷酸序列。将这些表达载体施用给兔和绵羊，以在ELISA和中和抗体滴度方面来评价免疫应答，并且在绵羊中测试VP2和VP5构建体的保护效力。由痘苗病毒所表达的VP2、VP5和VP2+VP5具有保护作用，并且在使用VP2和VP5二者进行免疫接种的动物中产生了最大的、可重现的保护作用，但是即使使用这种构建体，保护作用也是可变的。

有利的是，提供针对BTV的经改善的免疫原性和疫苗组合物，以及制备和使用此类组合物(包括用于不同的诊断方法、测定法和试剂盒的组合物)的方法。

本申请中任何文献的引用或确认并不是承认所述文献可用作关于本发明的现有技术。

本发明的目的和/或概述

本发明提供了用于在对BTV或相关病毒易感的动物中诱导针对环状病毒(尤其是，蓝舌病毒(BTV))的免疫应答或保护性免疫应答的免疫原性或疫苗组合物，该组合物包含或基本上由制药学或兽医学上可接受的运载体(vehicle)或赋形剂以及载体(vector)组成，所述载体包含或基本上由异源核酸分子组成，并且在所述动物体内表达环状病毒-BTV蛋白、抗原、免疫原或其表位，例如但不限于：BTV VP2(L2)和BTV VP5(M5)多肽。

所述载体可以为重组DNA质粒或重组病毒，例如重组腺病毒、疱疹病毒或痘病毒(例如禽痘病毒，如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒)。所述动物可以选自由绵羊、牛、猪、山羊、羚羊、马、骆驼等组成的有蹄类动物组。

有利地，所述核酸分子分别包含或基本上由编码BTV VP2(L2)的核苷酸20-2887(SEQ ID NO：3和1)和编码BTV蛋白VP5(M5)的核苷酸30-1610(SEQ ID NO：4和2)组成。优选的实施方案包括或由经哺乳动物密码子优化的核酸分子组成。

所述免疫原性或疫苗组合物可以进一步包含佐剂(adjuvant)，例如卡波姆。

所述免疫原性或疫苗组合物可以进一步包含：所述动物的除了BTV之外的其他病原体的抗原或免疫原或其表位；或者载体，所述载体包含并在所述动物体内表达编码所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子；或者灭活或减毒的除了BTV之外的其他病原体。

本发明另外还涉及试剂盒，其包含或基本上由以下部分组成：(a)所述免疫原性或疫苗组合物；和(b)所述动物的除了BTV之外的其他病原体的抗原或免疫原或其表位，或者载体，所述载体包含并在所述动物体内表达编码所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子，或者所述动物的灭活或减毒的除了BTV之外的其他病原体，其中(a)和(b)在分开的容器中，并且所述试剂盒可选地包含关于(a)和(b)的混合和/或施用的说明书。

本发明还包括用于在动物中诱导针对BTV的免疫学或保护性免疫应答的方法，该方法可以包括向所述动物施用包含编码所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子的所述免疫原性或疫苗组合物。

本发明进一步包括用于在动物中诱导针对BTV的免疫学或保护性免疫应答的方法，该方法可以包括向所述动物施用(a)所述免疫原性或疫苗组合物，和(b)分离的BTV抗原、免疫原或其表位，其中在初激-加强方案(prime-boost regimen)中在(b)之前施用(a)，或者在初激-加强方案中在(a)之前施用(b)，或者将(a)和(b)顺次地或以混合形式一起施用。本发明还涉及用于施行上述方法的试剂盒，其可以包含：在分开的容器中的(a)和(b)；以及可选地，关于混合和/或施用的说明书。

本发明更进一步包括针对BTV的初激-加强免疫接种或疫苗接种，其中使用DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物来进行初激，所述DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成并且在体内表达所述BTV免疫原、抗原或表位；以及使用疫苗或免疫学或免疫原性组合物(其为BTV灭活、减毒或亚单位(抗原、免疫原和/或表位)制剂)和/或重组或修饰的病毒疫苗或免疫学或免疫原性组合物(其包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述BTV免疫原、抗原或表位)来进行加强。因此，本发明提供了针对BTV的初激-加强免疫接种或疫苗接种的方法，例如这样的初激-加强免疫接种或疫苗接种，其可以包括向目标物种动物施用本发明的DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物(其包含或基本上由编码BTV抗原、免疫原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述BTV抗原、免疫原或表位)(作为初激)，然后施用灭活的BTV和/或减毒的BTV或BTV亚单位(抗原、免疫原和/或表位)制剂和/或重组或修饰的病毒疫苗或免疫学或免疫原性组合物(其可以包含编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子，并且在体内表达所述BTV免疫原、抗原或表位)(作为加强)，有利的是，在体内表达BTV免疫原、抗原或表位的重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物。有利地，可以将加强(boost)与初激(prime)相匹配，例如所述加强包括下列组分或基本上由下列组分组成或表达下列组分：至少一种通过所述初激而表达出的抗原、表位或免疫原。

根据本发明的初激-加强方案可以用于任何年龄的动物，有利地年幼动物(例如，具有可检测的母源性抗体和/或正在吃奶或哺育或母乳喂养的动物)、成年前的动物(比年幼动物年龄大但是还没有达到成熟或成年或者交配或繁殖年龄的动物)、成年动物(例如达到交配或繁殖年龄、或者已经超过一生中这一时期的动物)，并且有利的是在怀孕的雌性动物中或者在生产、产卵或授精之前的雌性动物中采用所述初激-加强方案。

本发明还涉及适合于在此类初激-加强方案中使用的此类免疫原性和疫苗组合物及其试剂盒，以及初激-加强方案。可以对其实施所述初激-加强方案的宿主或目标物种可以包括易患由环状病毒感染引起的疾病的任何动物(目标或宿主)物种，包括哺乳动物、爬行动物、鸟类，特别是人、伴侣哺乳动物或动物(例如但不限于犬类动物、猫类动物、马类动物)、动物园哺乳动物或动物(例如水栖哺乳动物如海豹、猫类动物、马类动物)、动物园爬行动物(例如蛇、鳄鱼、短吻鳄)和鸟类物种。

在年幼动物中实施所述初激-加强方案是特别有利的，这是因为这允许在早期年龄时进行疫苗接种或免疫接种，例如当对年幼动物进行实施时，初激-加强方案中的第一次施用可以在年幼动物具有母源性抗体时的年龄。所述方案的另一个优点在于，其可以向与所述年幼动物或彼此处于同一场所或密切接近的怀孕雌性动物提供一定程度的安全性。因此，本发明提供了针对BTV的初激-加强免疫接种或疫苗接种方法，并且该方法可以对年幼动物(例如小羊羔、小狗或小猫)进行实施，其中所述初激在年幼动物具有针对BTV的母源性抗体之时进行，而所述加强有利地在母源性抗体逐渐减少或降低或通常不存在之时(例如哺育、母乳喂养后的时期)进行。

因此，本发明还涉及用于实施初激-加强方案的试剂盒，其包含或基本上由下列组分组成：在分开的容器中的初激性疫苗或免疫学或免疫原性组合物和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物；以及可任选地，关于混合和/或施用的说明书。

此外，本发明提供了鉴别诊断方法，其包括：向动物施用免疫原性或疫苗组合物和/或BTV抗原、免疫原或表位；以及就不由所述免疫原性或疫苗组合物所表达的和/或不存在于所述BTV抗原、免疫原或表位中的BTV蛋白或其抗体的存在或不存在来测试所述动物。本发明还涉及用于施行该方法的试剂盒，其包含：在分开的容器中的所述免疫原性或疫苗组合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和用于就所述BTV蛋白的存在或不存在进行测试的测定法；以及可选地，关于施用所述免疫原性或疫苗组合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和/或关于施行所述测定法的说明书。

应当注意，在本公开内容中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”、“所包含的”、“包括”等的术语，和诸如“基本上由......组成”和“基本上由......构成”的术语具有归于美国专利法中这些术语的含义，例如，这些术语允许未确切叙述的要素，但是排除了在现有技术中发现的或者影响本发明的基础或新颖特征的要素。

这些和其他的实施方案在以下的发明详述中公开或者从以下的发明详述中而显而易见，并且由以下的发明详述所涵盖。

附图简述

通过实施例而给出但并不希望将本发明完全限定于具体实施方案的下列详细描述可以结合附图而得到最好的理解。

图1显示了BTV-17天然VP2的核酸序列(SEQ ID NO：3)对合成的BTV17经密码子优化的VP2的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示了BTV-17天然VP5的核酸序列(SEQ ID NO：4)对合成的BTV17经密码子优化的VP5的核酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3为示意图，其显示了编码经优化的合成的BTV VP2蛋白的质粒043004pPCR-Script的构建。

图4为示意图，其显示了pNVH6C5LSP-18供体质粒的限制性核酸内切酶图谱。

图5为示意图，其显示了pCXL148.2(ALVAC供体质粒)的构建。

图6提供了pCXL148.2供体质粒的核酸序列(SEQ ID NO：13)。

图7为示意图，其显示了pALVAC C5H6p-合成的BTV VP2(pLH2030.2)(供体质粒)的构建。

图8为示意图，其显示了编码经优化的合成的BTV VP5蛋白的质粒043005pPCR-Script的构建，以将昆虫痘病毒(桑红缘灯蛾(Amsactamoorei))的42Kp合成启动子序列添加至BTV-VP5片段。

图9为示意图，其显示了在pCR2.1TOPO克隆/穿梭载体中42Kp启动子-驱动的经优化的合成的BTV VP5的克隆流程(产生pCR2-42KpVP5)，以用于扩增42KpVP5盒。

图10为示意图，其显示了最终供体同源性载体pC5H6pVP242KpVP5(pLH2078.15)的构建，所述最终供体同源性载体包含由H6启动子驱动的经优化的VP2和由42K启动子驱动的经优化的BTV VP5，与ALVAC的C5R区域具有载体同源性。

图11提供了关于pLH2078.15(pC5H6p合成的BTV-VP2 42Kp合成的BTV-VP5)(用于产生重组ALVAC+BTV的最终同源性载体)的核酸和蛋白质序列数据。A以表观次序分别公开了SEQ ID NO：20-21。 B公开了编码SEQIDNO：20-21的SEQIDNO：19。C公开了编 码 SEQ ID NO：20-21的SEQ ID NO：19的核苷酸1800-6293。D公开 了SEQ ID NO：22。

图12显示了流程图，其图解说明了编码BTV经优化的合成的VP2和VP5的重组ALVAC病毒载体(vCP2289)的构建。

图13为从质粒和ALVAC核酸序列产生的重组ALVAC-BTV vCP2289的理论RE消化图谱，其由Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad，CA)制作。

图14为经染色的琼脂糖凝胶，其显示了从ALVAC+BTV重组病毒vCP2289制得的基因组DNA的限制性核酸内切酶消化(与在上述图13中所示的理论上的预期带型相比较)。

图15显示了使用BTV特异性DNA探针来探测的经限制性核酸内切酶消化的vCP2289基因组DNA的Southern印迹分析。

图16显示了在使用vCP2289的两种不同分离物进行感染后制备的CEF裂解物和上清液级分的Western印迹，其中就从ALVAC重组病毒的VP5表达进行探测。一抗探针为处于1∶2000稀释度的兔抗BTV-17VP5特异性多克隆血清。

图17为在用强毒野生型BTV-17攻击后，与WNV-CP对照疫苗相比较而言，使用vCP2289进行免疫接种的绵羊的平均体温的图。

图18为显示了在用强毒野生型BTV-17攻击后，与WNV-CP对照疫苗相比较而言，使用vCP2289进行免疫接种的绵羊的平均白细胞计数(WBC)的图。

图19为显示了在用强毒野生型BTV-17攻击后，与WNV-CP对照疫苗相比较而言，使用vCP2289进行免疫接种的绵羊的平均淋巴细胞计数的图。

图20为显示了在用强毒野生型BTV-17攻击后，与WNV-CP对照疫苗相比较而言，使用vCP2289进行免疫接种的绵羊的平均血小板计数的图。

发明详述

如本文所讨论的，本发明涉及：包含BTV的至少一种多核苷酸或者编码至少一种BTV抗原、免疫原或表位的至少一种核酸分子的载体，例如包含BTV的至少一种多核苷酸的体内和体外表达载体，或者包含并表达至少一种BTV抗原、免疫原或表位的体内和体外表达载体；以及针对蓝舌病的免疫原性组合物和疫苗，例如这样的组合物或疫苗，其包含所述载体中的一种或多种和/或所述载体的表达产物中的一种或多种。

有利地，所述免疫原、抗原包含外部衣壳蛋白VP2(L2)或外部衣壳蛋白VP5(M5)，或者其表位或组合，例如VP2和VP5；VP2；和VP5，或它们的片段。所述组合可以为分开的蛋白质或多蛋白。因此，所述组合物或疫苗可以包含表达超过一种所述蛋白质(例如不同的蛋白质)的一种或多种载体。所述组合物或疫苗可以包含来自BTV的不同毒株或分离物的蛋白质，或者表达所述蛋白质的载体。因此，所述组合物或疫苗可以包含VP2、VP5或其组合，或者表达VP2、VP5或其组合的载体，其中所述VP2和VP5来自不同的毒株或分离物。

在此方面，应当注意，存在血清型17BTV分离物或毒株，例如野生分离物(作为区段保存在GenBank中：(de Mattos，de Mattos等人1994)[VP2]分离物17B81，SEQ ID No.S72158；(Mecham和Johnson2005)[VP5]分离物FL99，SEQ ID No：AY855281)；和/或美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)VR-875^TM(作为BTV血清型17进行保藏；来自患有典型蓝舌病的绵羊的血液，Wyoming，1962)。由于BTV基因组的分节段性质，对于每个血清型区段独个地测定每个区段的基因组核苷酸序列。表2列出了对于BTV血清型17可获得的序列。

表2.BTV-17——对于BTV血清型17可获得的RNA序列的数目。

此外，应当注意，在血清型内的VP2序列的比较系统发生分析表明了一定程度的同源性，但存在足够的固有变异性，从而允许在单种血清型内区别病毒谱系。BTV血清型主要受由基因组区段2所编码的病毒外部衣壳蛋白VP2控制。可以设想，区段2的序列分析不仅可以用于鉴定病毒血清型，而且还可以用于通过与参照毒株的序列进行比较来鉴定各个病毒毒株的起源。

有利地，在涉及在本发明组合物或疫苗中存在的或者由本发明组合物或疫苗中的载体所表达的至少一种表位的实施方案中，所述表位来自VP2、VP5或其组合，并且所述表位可以来自不同的毒株或分离物。在这方面，应当注意，人们可以在BTV抗原或免疫原，例如VP5蛋白，例如参见(Martinez-Torrecuadrada，Langeveld等人1999)和(Wang，Du Plessis等人1995)；VP2蛋白(Heidner，Rossitto等人1990；Rossitto和MacLachlan 1992；DeMaula，Bonneau等人2000)；以及VP1蛋白(Huang，Hwang等人1995))中对表位进行定位或作图。

此外，如本文所讨论的，本发明涉及使用所述载体、免疫学组合物和疫苗的方法，其包括针对该病毒进行免疫接种和疫苗接种，表达出由所述多核苷酸编码的多肽；和在测定法中使用所述表达产物或产生在测定法中可用的抗体的方法；以及涉及制备尤其是所述多核苷酸、载体、组合物、疫苗、测定法的方法。

因此，本发明涉及用于预防和/或抗击由BTV引起的疾病的手段，从而减轻或消除临床迹象和/或病毒血症和/或损伤。

本发明涉及适合于在易患由BTV引起的疾病的不同动物(目标或宿主)物种中使用的此类免疫原性和疫苗组合物，其中所述动物物种包括但不限于：哺乳动物、爬行动物、鸟类，特别是人、伴侣哺乳动物或动物(例如犬类动物、猫类动物、马类动物)、动物园哺乳动物或动物(例如水栖哺乳动物、猫类动物、马类动物)、动物园爬行动物和鸟类物种。

本发明进一步涉及用于目标或宿主物种的免疫接种和疫苗接种方法，其包括所述免疫原性和疫苗组合物。在本发明的这一方面，可以提及，关于野生或非驯养的动物，例如但不限于野生或非驯养的鸟类或哺乳动物，包含一种或多种表达一种或多种BTV表位或抗原或免疫原的载体的组合物可以通过食物递送，例如诱饵滴状物，或者哺乳动物或鸟类食物，其被留下用于供野生或非驯养的鸟类或哺乳动物消耗，它们包含或含有一种或多种载体，从而能够通过消耗所述食物的哺乳动物或鸟类来进行口服施用。当所述一种或多种载体为一种或多种痘病毒，例如，禽痘病毒，例如减毒的金丝雀痘病毒如ALVAC，或减毒的鸡痘病毒如TROVAC；或者痘苗病毒，例如减毒的痘苗病毒如NYVAC时，这种施用途径可能是有利的。因此，本发明设想了口服或粘膜施用，以及包含一种或多种本发明载体的可食用的组合物，类似于MERIAL狂犬病产品RABORAL^TM。根据本公开内容以及本领域知识，本领域技术人员可以配制用于鸟类或哺乳动物的可食用的动物饲料，其包含合适剂量的一种或多种本发明载体。此外，本发明包括含有载体的组合物的局部施用(关于载体组合物的局部施用，参见例如美国专利号6,348,450)，以及用于向野生或非驯养的动物局部施用组合物的装置(关于用于啮齿动物和鸟类的此类装置，参见例如WO01/95715，美国申请系列号10/374,627，于2003年2月26日提交)，这些文献中的每一篇文献，与那里所引用或参考的每一篇文献一起，以及本文所引用的每一篇文献和每一篇本文所引用的文献中所参考或引用的每一篇文献均通过提及而合并入本文。

本发明进一步涉及使得能够进行鉴别诊断的手段和方法，例如使得能够进行或允许区别被致病性BTV感染的动物和施用了根据本发明的疫苗或免疫原性组合物的动物的方法。

除了编码VP2和VP5的多核苷酸以外，根据本发明的表达载体可以包含编码BTV的其他蛋白质(优选地，BTV的结构蛋白)的一种或多种其他多核苷酸，并且所述序列优选地选自编码结构病毒蛋白质的那些序列。

所述载体优选地包含编码例如相应于VP2，VP5，或有利地VP2和VP5，或其表位的区域的多核苷酸；即，认为表达多种蛋白质或其表位是有利的。包含几种编码不同蛋白质(例如，VP2和/或VP5或其表位)的分开的多核苷酸的载体也落在本发明的范围内。载体，尤其是用于体内表达的载体，还可以包含相应于超过一种BTV血清型、毒株或分离物的多核苷酸，例如两种或更多种编码VP2或VP5或其表位的不同毒株的多核苷酸。来自所有不同的血清型，例如但不限于血清型1、2、4、9、10、11、13、16和17。

同样地，免疫原性或疫苗组合物可以包含一种或多种载体，其用于表达相应于超过一种BTV血清型、毒株或分离物的多核苷酸，例如两种或更多种编码VP2或VP5或其表位的不同毒株的多核苷酸。载体，尤其是用于体内表达的载体，另外还可以包含一种或多种编码其他致病因子的免疫原和/或细胞因子的核苷酸序列。

术语“编码BTV蛋白的多核苷酸”主要是指编码所述蛋白质的DNA片段或分离的DNA分子，或其互补链；但是不排除RNA，这是因为本领中了解，DNA序列中的胸苷(T)被认为相当于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，用于在本发明中使用(例如，用于在RNA载体中使用)的RNA序列可以通过将DNA序列中的胸苷(T)认为相当于RNA序列中的尿嘧啶(U)而来源于DNA序列。

术语“蛋白质”包括肽和多肽。如果一旦施用给宿主，就能够激发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答，那么在这种意义上而言，所述蛋白质片段是免疫学活性的。优选地，蛋白质片段是这样地，即其具有与整体蛋白质基本上相同的免疫学活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包括或基本上由或由至少一个表位或抗原决定簇组成。术语“表位”是指能够诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的蛋白质位点。

因此，所述多核苷酸的最小结构是这样的，即其包含或基本上由或由编码BTV蛋白的表位或抗原决定簇的核苷酸组成。编码整体蛋白质的片段的多核苷酸更有利地包含下列核苷酸或基本上由下列核苷酸组成或由下列核苷酸组成：编码所述整体蛋白质或多蛋白的序列的最少21个核苷酸，有利地至少42个核苷酸，和优选地至少57、87或150个连续或邻接的核苷酸。如之前所提及的，表位确定过程，例如产生重叠肽文库(Hemmer，Pinilla等人1998)，Pepscan(Geysen，Meloen等人1984)；(Geysen，Barteling等人1985)；(Vander Zee，Van Eden等人1989)；(Geysen 1990)；

Peptide SynthesisKits de Chiron)以及算法(De Groot和Rothman 1999)可用于实施本发明，而无需过多的实验。关于确定免疫原或抗原的表位并由此确定编码此类表位的核酸分子的方法，还可以参考本文所引用和合并入本文的其他文献。

用于表达所述多核苷酸的元件有利地存在于本发明的载体中。以最低限度的方式，这包括下列元件或基本上由下列元件组成或由下列元件组成：起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及可选地还有用于某些载体例如质粒和某些病毒载体(例如除了痘病毒之外的其他病毒载体)的聚腺苷酸化序列。当所述多核苷酸编码蛋白质片段(例如，有利地在载体中)时，ATG位于阅读框的5′端，而终止密码子位于3′端。可以存在用于调控表达的其他元件，例如增强子序列、稳定化序列和允许蛋白质分泌的信号序列。

用于制备和/或施用用于在体内或体外表达本发明基因的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可以是任何所需的方法，例如在下列文献中公开的方法，或者类似于在下列文献中公开的方法的方法，或者在下列文献所引用的文献中公开的方法：美国专利号6,130,066；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,312,683；6,348,450；4,603,112；4,769,330；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；5,591,639；5,589,466；4,945,050；5,677,178；5,591,439；5,552,143；和5,580,859；于1986年10月16日提交的美国专利申请系列号920,197；WO 94/16716；WO 96/39491；WO91/11525；WO 98/33510；WO 90/01543；EP 0 370 573；EP 265785；(Paoletti 1996)；(Moss 1996)；Richardson(Ed)(1995)Methodsin Molecular Biology 39，“Baculovirus Expression Protocols，”Humana Press Inc.；(Smith，Summers等人1983)；(Pennock，Shoemaker等人1984)；(Roizman 1996)；(Andreansky，He等人1996)；(Robertson，Ooka等人1996)；(Frolov，Hoffman等人1996)；(Kitson，Burke等人1991)；(Ballay，Levrero等人1985)；(Graham 1990)；(Prevec，Schneider等人1989)；(Felgner，Kumar等人1994)；(Ulmer，Donnelly等人1993)；(McClements，Armstrong等人1996)；(Ju，Edelstein等人1998)；和(Robinson和Torres 1997)。因此，本发明中的载体可以为任何合适的重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)，腺病毒(例如犬腺病毒)，疱疹病毒，杆状病毒，逆转录病毒等(如在通过提及而合并入文本中的文献中所述的)；或者所述载体可以为质粒。在本文所引用的和通过提及而合并入文本中的文献中，除了提供可用于实施本发明的载体的实例之外，还可以提供非BTV蛋白或其表位，例如非BTV免疫原或其表位，细胞因子等的来源，它们由在本发明的多价或鸡尾酒免疫原性组合物或疫苗中的载体所表达或者包含于本发明的多价或混合式(cocktail)免疫原性组合物或疫苗中。

本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如疫苗或免疫原性组合物。所述制剂可以在制药学或兽医学上可接受的载体(carrier)、赋形剂或运载体中包含、基本上由或由一种或多种载体(例如表达载体，如体内表达载体)组成，所述载体包含、基本上由或由一种或多种BTV多核苷酸组成(和有利地表达一种或多种BTV多核苷酸)，所述BTV多核苷酸编码VP2、VP5或其组合或多蛋白，尤其是如上文所提及的(例如，VP2，VP5，VP2和VP5，或者至少其表位)；并且，有利地，所述载体包含并表达这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含、基本上由或由编码BTV VP2和/或VP5的编码区组成。因此，根据本发明的一个实施方案，在所述制剂中的其他载体包含、基本上由或由编码BTV的一种或多种其他蛋白质(例如VP2、VP5或其表位)的多核苷酸组成，并且在合适的情况下所述载体表达BTV的一种或多种其他蛋白质(例如VP2、VP5或其表位)。

根据另一个实施方案，在所述制剂中的载体包含或基本上由或由编码一种或多种BTV蛋白或其表位(例如一种或多种BTV血清型、毒株或分离物的一种或多种BTV蛋白或其表位)的多核苷酸组成；并且，有利地，在合适的宿主细胞中或者在合适的条件下，所述载体表达由所述多核苷酸编码的多肽。本发明的制剂有利地包含、基本上由或由至少两种载体组成，其中所述载体包含、基本上由或由经来自不同BTV血清型、毒株或分离物的多核苷酸(其编码相同蛋白质和/或不同蛋白质，但优选编码相同蛋白质)编码的多肽组成，并且有利地还表达所述多肽，优选地在适宜的条件或合适的条件下或者在合适的宿主细胞中在体内表达所述多肽。关于包含一种或多种载体的制剂，其中所述载体包含、基本上由或由编码BTV VP2或VP5或其表位的多核苷酸组成并且优选地表达(有利地在体内)所述BTV VP2或VP5或其表位，优选的是所述表达产物来自两种、三种或更多种不同的BTV血清型、毒株或分离物，有利地毒株。本发明还涉及载体的混合物，所述载体包含、基本上由或由不同毒株的VP2或VP5的编码序列组成，并且表达不同毒株的VP2或VP5。优选的是，在这样的混合物中，至少一种载体包含、基本上由或由VP2的编码序列组成，并且表达VP2。

根据另外一个实施方案以及如下文将更详细地显示的，在所述制剂中的其他载体包含并且表达一种或多种细胞因子和/或一种或多种其他致病因子的一种或多种免疫原。细胞因子、其他致病因子的免疫原或其表位、以及编码它们的核酸分子的来源可以在本文所引用的文献中，以及在WO02096349，WO0208162，WO0020025，WO00152888，WO0145735，WO00127097，WO0116330，WO0077210，WO0077188，WO0077043，WO9842743，WO9833928，WO9749826，WO9749825，美国专利号6,387,376、6,306,400、6,159,477、6,156,567、6,153,199、6,090,393、6,074,649、6,033,670中找到。

本发明还涉及本文所公开的不同实施方案的各种组合，例如包含各种不同载体的组合物或疫苗，包含载体和蛋白质(BTV和/或非BTV)和/或细胞因子的组合物或疫苗，等等。

包含体外或体内表达载体的制剂构成了本发明的优选实施方案，所述表达载体包含并且表达编码VP2和VP5的多核苷酸。

根据另一个有利的实施方案，另外的结构蛋白VP7和/或VP3中的一种或多种与根据本发明的VP2和VP5结构蛋白共同表达，通过同一个表达载体或者通过它们自己的表达载体。优选地，它们基于单个多核苷酸而一起表达(例如，作为多蛋白)。也就是说，在某些实施方案中，所述载体进一步包含、基本上由或由编码VP7和/或VP3的一种或多种核苷酸组成，或者组合物或疫苗进一步包含、基本上由或由一种或多种另外的载体组成，其中所述载体包含、基本上由或由编码VP7和/或VP3的一种或多种核苷酸组成；该载体或这些载体有利地表达结构蛋白；并且，VP7和VP3有利地共同表达，并且更有利地表达为多蛋白。

根据另一个有利的实施方案，非结构蛋白NS1、NS2和NS3和/或VP1、VP4中的一种或多种与根据本发明的VP2和VP5结构蛋白共同表达，通过同一个表达载体或者通过它们自己的表达载体。也就是说，在某些实施方案中，所述载体进一步包含、基本上由或由编码VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3的一种或多种核苷酸组成，或者组合物或疫苗进一步包含、基本上由或由一种或多种另外的载体组成，其中所述载体包含、基本上由或由编码VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3的一种或多种核苷酸组成；该载体或这些载体有利地表达结构蛋白；并且，有利地表达VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3。因此，本发明还涉及载体，例如体内或体外表达载体，所述载体包含、基本上由或由编码VP1、VP4、NS1、NS2和NS3以及它们的组合(包括它们的多蛋白)的多核苷酸组成。所述载体可以为包含、基本上由或由编码一种或多种结构蛋白(例如，VP2、VP5、VP7和/或VP3组合及其多蛋白)的多核苷酸组成的上述载体之一，例如包含或基本上由编码结构蛋白或其表位的多核苷酸组成的此类载体还可以包含或基本上由编码一种或多种非结构蛋白、其组合、其多蛋白质或其表位的多核苷酸组成。作为备选方案，本发明涉及如上文所描述的制剂，其还引入了至少一种包含编码并且有利地表达非结构蛋白的多核苷酸的载体，以及可选地制药学或兽医学上可接受的载体、运载体或赋形剂。

关于制备根据本发明的载体例如表达载体，本领域技术人员具有可得的各种BTV血清型、毒株和分离物，以及它们的基因组核苷酸序列的描述，例如参见本文中的讨论，还可以提到其中核酸序列信息可得的24种BTV血清型(Wilson和Mecham 2000)。

例如，可提及毒株BTV-17。对于每种蛋白质，提供了相应的核苷酸序列(de Mattos，de Mattos等人1994；Huang，Hwang等人1995；Bernard，Israel等人1997)。通过这些序列的比较和对比，可以容易地确定在另一种BTV血清型或毒株中编码这种蛋白质的多核苷酸。

如本文所讨论的，术语“多核苷酸”被理解为是指编码对特定BTV毒株特异的蛋白质或其片段或其表位的核酸序列；并且，等价地，术语“多核苷酸”被理解为包括不同BTV毒株的相应的核苷酸序列以及由于密码子简并性而不同的核苷酸序列。因此，编码BTV VP2的多核苷酸被理解为包含、基本上由或由下列序列组成：(a)BTV-17的nt20-2887(SEQ ID NO：3)；(b)不同BTV毒株的相应的序列；和(c)编码BTV VP2但由于密码子简并性而不同于(a)和(b)的核苷酸序列。

编码外部衣壳蛋白VP2的BTV的L2基因在全世界的BTV毒株之间具有最大程度的遗传变异性。这并不另人惊讶，因为该蛋白质负责病毒中和以及血清型特异性(Mecham，Dean等人1986；Roy 1992)并且可能受到遗传漂变和建立者效应选择的影响。遗传漂变和建立者效应可以导致具有增强的毒力的变体(Bernard，Israel等人1997)。已经鉴定出多种中和决定子(Ghiasi，Fukusho等人1987；DeMaula，Heidner等人1993；Jewell和Mecham 1994)。已显示，VP2为主要负责附着和进入哺乳动物宿主细胞的蛋白质(Hassan和Roy 1999)。当采用系统发生分析时，血清型之间的变异通常导致基于血清型的病毒的隔离，而与分离的地理学起源无关(Pritchard和Gould 1995；Bonneau，Zhang等人1999)。BTV的M5基因编码内部外部衣壳蛋白VP5，并且具有在BTV基因中第二大程度的遗传变异性，其在给定的血清群中显示出51-71％的同一性。VP5能够引起外部衣壳结构的构象改变，以及中和特征的变化(Cowley和Gorman 1989；DeMaula，Bonneau等人2000)。VP5还可以有助于宿主细胞识别(Roy 1992)。

由于在血清型之内和之外的固有遗传变异性，本发明涵盖了编码这样的蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与所述蛋白质的共有BTV氨基酸序列的序列同一性或同源性展现出功能等价性。例如，所表达的VP2衣壳蛋白可以与从下列序列表达的多肽的相应的衣壳序列具有大于20％的同一性：(a)BTV-17区段2的核苷酸20-2887(SEQ ID NO：3)；(b)不同BTV毒株的相应的序列；和/或(c)编码BTV VP2但由于密码子简并性而不同于(a)和(b)、以及由于毒株、血清型和血清群遗传变异性而来自(a)和(b)的核苷酸序列。尽管这种变异性，但是从功能上而言，所述多核苷酸编码VP2衣壳多肽。

因此，本发明包括表达此类在功能上同源的多肽的多核苷酸；以及那些多核苷酸与编码多肽(同源多肽与所述多肽具有同源性或同一性)的多核苷酸的相应程度的同源性或同一性。同源多肽有利地包含与之存在同一性或同源性的多肽的一种或多种表位，从而使得同源多肽展现出和与之存在同一性或同源性的多肽的免疫学相似性或同一性，例如，所述同源多肽引发和与之存在同一性或同源性的多肽相似的或比其更好的免疫应答(对于熟悉技能的免疫学者而言)，和/或所述同源多肽结合由与之存在同一性或同源性的多肽所引发的和/或所结合的抗体，并且有利地不结合其他抗体。

因此，设想了使同源多肽和与之存在同一性或同源性的多肽的片段，有利地那些对于同源多肽或与之存在同一性或同源性的多肽展现出免疫学相似性或同一性的片段进行表达，并因而本发明还设想了并且在本发明中可使用代表了同源多肽和与之存在同一性或同源性的多肽的多核苷酸片段的多核苷酸。

术语“序列同一性”表示两个相等长度的氨基酸序列之间或者两个相等长度的核苷酸序列之间的同源性程度的定量量度。如果待比较的两个序列不具有相等的长度，则它们必须尽可能合适地进行比对，其中可能插入缺口或者备选地在蛋白质序列的末端截短。可以将序列同一性计算为((N_ref-N_dif)/N_ref)×100，其中N_dif为当进行比对时这两个序列中非同一的残基的总数目，并且其中N_ref为所述序列之一中残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将具有75％的序列同一性(N_dif＝2和N_ref＝8)。缺口被计为特定残基的非同一性，即，DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC将具有75％的序列同一性(N_dif＝2和N_ref＝8)。备选地，序列同一性可以通过BLAST程序例如BLASTP程序(Pearson和Lipman 1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)来计算。在本发明的一个方面中，如(Thompson，Higgins等人1994)所描述的，使用在http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/处可获得的序列比对方法ClustalW(采用缺省参数)来进行比对。因此，多核苷酸可以为任何核酸分子，包括DNA、RNA、LNA(锁定核酸)、PNA、RNA、dsRNA、RNA-DNA-杂合物以及非天然存在的核苷。

根据本公开内容，有利地，由本发明的载体所表达的蛋白质或多肽为免疫学活性肽和多肽，例如，相对于BTV-17的多肽或蛋白质而言，由本发明的载体所表达的蛋白质或多肽可以为：

a)相应于一种或多种不同BTV血清型、毒株或分离物的蛋白质或多肽；

b)不同于BTV-17和/或a)，但与天然BTV蛋白保持等于或大于20％的同一性的蛋白质。因此，当提及BTV蛋白时，可以包括本文所讨论的另外的蛋白质。

不同的BTV血清型和毒株可以在保藏中心处获得，特别是在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，例如以登录号VR-875、VR-1231、VR-187、VR-873、VR-983、VR-1231AF或VR-1231CAF，并且另外如本文中所讨论的，还可以化学合成全基因。

在本发明中，优选地，所述多核苷酸还包含编码信号肽的核苷酸序列(位于所表达的蛋白质的编码区的上游)，从而有助于蛋白质的分泌；因此，本发明包括表达具有前导序列或信号序列的BTV多肽，例如BTV抗原、免疫原或其片段如表位。前导序列或信号序列可以为内源序列，例如BTV多肽的天然信号序列。前导序列或信号序列还可以为异源序列，因而其由对于BTV而言异源的核苷酸序列编码。例如，前导序列或外源序列可以对于所述载体而言是内源的，或者是对于所述载体和BTV而言异源的前导序列或信号序列，例如组织纤溶酶原激活物(tPA)例如人tPA的信号肽，因此所述载体或其中的多核苷酸可以包含编码前导肽或信号肽的序列，例如人组织纤溶酶原激活物(tPA)的前导肽或信号肽(Hartikka，Sawdey等人1996)。有利地，将编码信号肽的核苷酸序列按阅读框插入，并且插入在编码BTV多肽(例如，VP2、VP5或组合，如VP2和VP5)的序列的上游。

根据本发明的一个实施方案，所述载体，例如体内表达载体，为病毒载体。

病毒载体(例如病毒表达载体)有利地为：痘病毒，例如痘苗病毒或减毒的痘苗病毒(例如，MVA，其为Ankara牛痘毒株在鸡胚胎成纤维细胞上传代超过570代后获得的经修饰的Ankara毒株；参见(Stickl和Hochstein-Mintzel 1971；Sutter和Moss 1992)；可以ATCC VR-1508而获得；或者NYVAC，参见美国专利号5,494,807，例如美国专利号5,494,807的实施例1至6等等，其讨论了NYVAC的构建，以及通过从Copenhagen毒株痘苗病毒基因组中删除额外的ORF，及将异源编码核酸分子插入该重组体的位点中，和还使用匹配的启动子而得到的NYVAC的变化形式；还可参见WO96/40241)、禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、鸽痘病毒(dovepox)、家鸽痘病毒(pigeonpox)、鹌鹑痘病毒、ALVAC或TROVAC；参见例如美国专利号5,505,941、5,494,807)、猪痘病毒、浣熊痘病毒、骆驼痘病毒或粘液瘤病病毒；腺病毒，例如禽腺病毒、犬腺病毒、猪腺病毒、牛腺病毒、人腺病毒；或疱疹病毒，例如绵羊疱疹病毒(OHV 1和2)、马疱疹病毒(EHV血清型1和4)、犬疱疹病毒(CHV)、猫疱疹病毒(FHV)、牛疱疹病毒(BHV血清型1和4)、猪疱疹病毒(PRV)、马立克氏病病毒(MDV血清型1和2)、火鸡疱疹病毒(HVT或MDV血清型3)或鸭疱疹病毒。当使用疱疹病毒时，对于鸟类物种的疫苗接种而言载体HVT是优选的，对于牛的疫苗接种而言牛载体是优选的，对于绵羊的疫苗接种而言羊载体是优选的，和对于马的疫苗接种而言载体EHV是优选的。

更一般地，在某些实施方案中，可能有利的是，将载体与宿主相匹配，例如将马病毒(例如EHV)用于马中，或者将为鸟类病原体(例如鸡痘病毒、HVT、MDV或鸭疱疹病毒)的载体用于鸟类(例如家禽或鸡)中，或者将为羊病原体(例如OHV)、牛病原体(例如BHV)的载体用于牛(例如奶牛)中，或者将为猪病原体(例如猪疱疹病毒)的载体用于猪中，或者将为犬病原体(例如犬腺病毒或犬疱疹病毒)的载体用于犬类(例如狗)中，或者将为猫病原体(例如FHV)的载体用于猫类中，因为这可以允许产生针对所述载体的免疫应答，并因而除了针对环状病毒的免疫应答之外，还提供了针对宿主或目标物种的病原体的免疫应答。

然而，还应当注意，可能有利的是，所述载体不是宿主的天然病原体，例如，从而使得所述载体可以具有外源序列例如BTV编码序列的表达，但只有有限的复制或没有复制；例如，在哺乳动物宿主中使用禽痘病毒载体，如美国专利号5,174,993中所述。还应当注意，本发明包括疫苗、免疫学和免疫原性组合物，其中这些术语以它们在本领域中的意义来使用；参见例如本文所引用的文献，例如美国专利号6,497,883。

根据本发明的另一个实施方案，所述痘病毒载体(例如表达载体)为金丝雀痘病毒或鸡痘病毒载体，有利地为减毒的金丝雀痘病毒或鸡痘病毒。在这方面，需提及可以以登录号VR-111从ATCC获得的金丝雀痘病毒。减毒的金丝雀痘病毒描述于美国专利号5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中。许多鸡痘病毒疫苗接种毒株也是可获得的，例如由MERIAL出售的DIFTOSEC CT毒株，和由Intervet出售的NOBILISVARIOLE疫苗；并且，还可以参考美国专利号5,766,599，其涉及减毒的鸡痘病毒毒株TROVAC。

对于关于痘病毒和如何产生其重组体和如何施用其重组体的信息，本领域技术人员可以参考文本所引用的文献以及WO90/12882，例如关于痘苗病毒，尤其可提及美国专利号4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,494,807和5,762,938；关于鸡痘病毒，尤其可提及美国专利号5,174,993、5,505,941和US-5,766,599；关于金丝雀痘病毒，尤其可提及美国专利号5,756,103；关于猪痘病毒，尤其可提及美国专利号5,382,425；关于浣熊痘病毒，尤其可提及WO00/03030。

当所述表达载体为痘苗病毒时，用于待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点、血凝素(HA)基因或插入位点、编码A型内含体(ATI)的区域处；还可参见本文所引用的文献，特别是涉及痘苗病毒的那些文献。在金丝雀痘病毒的情况下，插入位点有利地为ORF C3、C5和/或C6；还可参见本文所引用的文献，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些文献。在鸡痘病毒的情况下，插入位点有利地为ORF F7和/或F8；还可参见本文所引用的文献，特别是涉及鸡痘病毒的那些文献。关于MVA病毒的插入位点有利地如在各种出版物中所述，包括(Carroll，Overwijk等人1997)，(Stittelaar，Wyatt等人2000)，(Sutter，Wyatt等人1994)；并且，在这方面，还应当注意，完整的MVA基因组描述在(Antoine，Scheiflinger等人1998)中，这使得本领域技术人员能够使用其他插入位点或其他启动子。

优选地，当所述表达载体为痘病毒时，将待表达的多核苷酸插入在特异性的痘病毒启动子的控制下，例如痘苗病毒启动子7.5kDa(Cochran，Puckett等人1985)，痘苗病毒启动子I3L(Riviere，Tartaglia等人1992)，痘苗病毒启动子HA(Shida 1986)，牛痘病毒启动子ATI(Funahashi，Sato等人1988)，痘苗病毒启动子H6(Taylor，Weinberg等人1988)，(Guo，Goebel等人1989)，(Perkus，Limbach等人1989)等等。

优选地，对于哺乳动物的疫苗接种，所述表达载体为金丝雀痘病毒或鸡痘病毒。这样，可以表达异源蛋白质，例如BTV蛋白，只有有限的生产性复制或没有生产性复制。优选地，对于鸟类(例如鸡、鸭、火鸡和鹅)的疫苗接种，所述表达载体为金丝雀痘病毒或鸡痘病毒。

当所述表达载体为火鸡疱疹病毒或HVT时，有利的插入位点位于HVT的BamHI I片段或BamHI M片段中。HVT BamHI I限制性片段包含几个开放阅读框(ORF)和三个基因间区域，并且包含几个优选的插入区，例如三个基因间区域1、2和3(其为优选的区域)以及ORF UL55(参见例如FR-A-2 728 795，美国专利号5,980,906)。HVT BamHI M限制性片段包含ORF UL43，其也是优选的插入位点(参见例如FR-A-2728 794，美国专利号5,733,554)。

当所述表达载体为EHV-1或EHV-4疱疹病毒时，有利的插入位点包括TK、UL43和UL45(参见例如EP-A-668355)。

优选地，当所述表达载体为疱疹病毒时，将待表达的多核苷酸插入在真核启动子的控制之下，例如强的真核生物启动子，优选为CMV-IE(鼠或人)启动子；也就是说，在此处的实施方案中，将待表达的多核苷酸可操作地与启动子相连接，并且在疱疹病毒实施方案中，有利地将待表达的多核苷酸可操作地与强的真核启动子例如mCMV-IE或hCMV-IE启动子相连接。本文在涉及作为载体的质粒时也讨论了强启动子。

根据本发明的其他实施方案，所述载体，例如体内表达载体，为质粒载体或DNA质粒载体，例如在已知为DNA疫苗的疫苗中使用的质粒载体的类型(与在同源重组中使用以形成重组病毒的转染质粒不同，所述转染质粒不用于DNA疫苗中)。

术语“质粒”涵盖了以多核苷酸序列形式的任何DNA转录单元，其包含根据本发明的多核苷酸以及对于在所希望的宿主或目标的细胞中体内表达由所述多核苷酸所编码的蛋白质所必需的元件；并且，在这方面，应当注意，存在超螺旋和非超螺旋的环状质粒，以及线性和多聚体形式，所有这些都将包括在本发明的范围之内。

除了编码病原体(例如BTV(或者BTV和另一种病原体))的抗原或表位的多核苷酸之外，每种质粒包含或含有或基本上由用于在宿主细胞中表达该多核苷酸的启动子组成；并且，使所述多核苷酸可操作地与启动子连接，或者处于启动子的控制之下，或者依赖于启动子。一般地，有利的是使用真核启动子，例如强的真核启动子。优选的强真核生物启动子为人源或鼠源(或者可选地具有其他来源，例如大鼠或豚鼠)的即时早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)。CMV-IE启动子可以包含实际的启动子部分，该部分可以与增强子部分相关联或者不相关联。可以参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，美国专利号5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT WO 87/03905。CMV-IE启动子优选地为人CMV-IE(Boshart，Weber等人1985)或鼠CMV-IE。

更一般地，启动子可以具有病毒或细胞来源。除了CMV-IE之外的其他可有用地用于实施本发明的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于实施本发明的强细胞启动子为细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa，van Kampen等人2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki，Takaki等人1989)。

这些启动子的功能性亚片段，即保持了足够的启动活性的这些启动子的部分，被包括在本发明的范围内，例如根据WO98/00166或美国专利号6,156,567所描述的截短的CMV-IE启动子可用于实施本发明。因此，实施本发明所用的启动子包括全长启动子的衍生物和亚片段，其保持了足够的启动活性并因此发挥启动子的功能，优选地与从中衍生出所述衍生物或亚片段的实际或全长启动子实质上类似的启动活性，例如类似于相比于全长CMV-IE启动子的活性的美国专利号6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性。因此，在实施本发明中使用的CMV-IE启动子可以包含或基本上由或由全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分、以及衍生物或亚片段组成。

优选地，所述质粒包含或基本上由其他表达调控元件组成。特别有利的是，引入稳定化序列，例如内含子序列，优选兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen，van den Berg等人1979)。

关于用于质粒和病毒载体(除了痘病毒之外)的聚腺苷酸化信号(polyA)，可以更多地使用牛生长激素(bGH)基因的polyA信号(参见美国专利号5,122,458)，或者兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号，或者SV40病毒的poly(A)信号。

关于质粒中可用的其他表达调控元件，可以考虑可用于疱疹病毒表达载体的表达调控元件。

根据本发明的另一个实施方案，所述表达载体为用于在合适的细胞体系中体外表达蛋白质的表达载体。可以在分泌之后或不在分泌之后在培养物上清液中或者从培养物上清液中收获经表达的蛋白质(如果没有分泌，则通常发生或进行细胞裂解)，可选地通过浓缩方法例如超滤进行浓缩和/或通过纯化手段例如亲和、离子交换或凝胶过滤型层析方法进行纯化。

蛋白质的生产可以通过下列方式来进行：通过用质粒转染哺乳动物细胞，通过在哺乳动物细胞或鸟类细胞中使病毒载体进行复制或表达(非生产性复制)，或者通过杆状病毒复制(参见例如美国专利号4,745,051；(Vialard，Lalumiere等人1990)；Luckow(Luckow和Summers 1988)，例如苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒AcNPV，对于昆虫细胞(例如Sf9草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞，ATCC CRL 1711；还可参见美国专利号6,228,846、6,103,526)。可以使用的哺乳动物细胞有利地为仓鼠细胞(例如CHO或BHK-21)或猴细胞(例如COS或VERO)。因此，本发明相应地包括掺入了根据本发明的多核苷酸的表达载体，以及通过体外表达而如此产生的或表达的BTV蛋白或其片段，和包含它们的制剂。

因此，本发明还涉及BTV蛋白得到浓缩和/或纯化的制剂。当所述多核苷酸编码几种蛋白质时，这些蛋白质被切割，那么此时前述制剂包含经切割的蛋白质。

本发明还涉及针对BTV的免疫原性组合物和疫苗，其包含至少一种根据本发明的体内表达载体以及制药学或兽医学上可接受的赋形剂或载体或运载体，和可选地佐剂。

免疫原性组合物涵盖了一旦施用给目标物种后便诱导针对BTV的免疫应答的任何组合物。术语“疫苗”被理解为表示能够诱导有效保护的组合物。所述目标物种包括哺乳动物，例如马类动物(equine)、犬类动物(canine)、猫类动物(feline)、牛类动物(bovine)、羊类动物(ovine)、猪类动物和人类；爬行动物；以及鸟类或禽类。这一列表意在包括繁殖动物、产卵动物、生产动物和伴侣动物。

所述制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂可以为0.9％的NaCl盐水溶液或磷酸盐缓冲液。所述制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂可以为有助于施用所述载体(或在体外从本发明载体表达的蛋白质)的任何化合物或化合物的组合；有利地，所述载体、运载体或赋形剂可以有助于转染和/或改善所述载体(或蛋白质)的保存。在本文中，剂量和给药体积以免疫接种和疫苗接种方法的一般描述来进行讨论，并且还可以由本领域技术人员通过阅读本公开内容并结合本领域知识来确定，而无需经过过多的实验。

根据本发明的免疫原性组合物和疫苗优选地包含或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的特别合适的佐剂为：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酸酐与烯基衍生物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman，Yi等人1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如在由M.Powell，M.Newman出版的“Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach”(Powell和Newman 1995)的第147页中所描述的SPT乳剂，和在相同著作的第183页中所描述的乳剂MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，或(7)在本申请中所引用的和通过提及而合并入本申请中的任何文献之中所讨论的其他佐剂，或者(8)它们的任何组合或混合物。

特别适合于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于：

-轻质液体石蜡(欧洲药典类型)，

-类异戊二烯油，例如角鲨烷、角鲨烯，

-由烯烃例如异丁烯或癸烯的寡聚化而产生的油，

-具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或

-分支的脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。

将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如：

-一方面是山梨聚糖、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇与另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯可选地被乙氧基化，

-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如L121。

在类型(1)佐剂聚合物中，交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物是优选的。这些化合物称为卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no.2，June 1996)。本领域技术人员也可参考美国专利号2,909,462，其提供了通过多羟基化合物交联的此类丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个此类基团，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基替代。优选的基团是包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其他烯键式不饱和基团。不饱和基团也可包含其他取代基例如甲基。以Carbopol这一名称进行销售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P和971P。

关于马来酸酐-烯基衍生物共聚物，EMA(Monsanto)是优选的，其为直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，它们例如通过二乙烯醚交联。还可以参考(Regelson，Kuhar等人1960)。

关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单元形成：

其中：

-R₁和R₂(其可以是相同或不同的)代表H或CH₃

-x＝0或1，优选地x＝1

-y＝1或2，同时x+y＝2。

对于EMA，x＝0且y＝2，和对于卡波姆，x＝y＝1。

这些聚合物可溶于水或生理盐水溶液(20g/l NaCl)，并且可例如用苛性钠(NaOH)将pH调节至7.3至7.4，从而提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。在最终的疫苗组合物中聚合物浓度可在0.01至1.5％w/v，有利地0.05至1％w/v和优选地0.1至0.4％w/v的范围内。

有利地但非专一地适用于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质(4)优选地是具有下式的脂质：

其中R₁是具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基，R₂是包含2或3个碳原子的另一种脂族基，和X是胺或羟基基团。

在这些阳离子脂质中，DMRIE(N-(2-羟基乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)是优选的，优选地，其与中性脂质，优选地与DOPE(二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)相结合，从而形成DMRIE-DOPE。

优选地，临时形成质粒与佐剂的混合物，并且优选地在与施用制剂同时或在即将施用制剂之前形成；例如在即将施用前或施用前，形成质粒-佐剂混合物，有利地以便在施用前为混合物形成复合物提供足够的时间，例如施用前大约10至大约60分钟，例如施用前大约30分钟。

当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE的摩尔比优选地是大约95∶大约5至大约5∶大约95，更优选地大约1∶大约1，例如1∶1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒重量比可在大约50∶大约1和大约1∶大约10之间，例如大约10∶大约1和大约1∶大约5之间，和优选地大约1∶大约1和大约1∶大约2之间，例如1∶1和1∶2之间。

细胞因子(5)可以以蛋白质的形式存在于免疫原性或疫苗组合物中，或者可以在宿主中与免疫原或其表位共表达。通过与表达免疫原或其表位的载体相同的载体来共表达细胞因子或者为此通过分开的载体来共表达细胞因子是优选的。

所述细胞因子可以选自：白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素15(IL-15)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α(Marshall，Woolford等人1997)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)。特别可提及鸟类细胞因子，例如鸡的细胞因子，如cIL-18(Schneider，Puehler等人2000)、cIL-15(Xin，Hamajima等人1999))；和马细胞因子，例如马GM-CSF(WO00/77210)。优选地，使用待进行疫苗接种的物种的细胞因子；也就是说，有利地，将细胞因子与目标或宿主物种相匹配，并且可提及例如犬GM-CSF(WO00/77043的实施例8)、猫GM-CSF(WO00/77043的实施例9)。

WO00/77210提供了相应于马GM-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列，体外GM-CSF产生，以及允许体内马GM-CSF表达的载体(例如质粒和病毒载体)的构建。这些蛋白质、质粒和病毒载体可以用于根据本发明的免疫原性组合物和马类动物疫苗。例如，可以使用在WO00/77210的实施例3中所描述的质粒pJP097，或者可以使用WO00/77210的教导，以便产生其他载体或者在体外产生马GM-CSF，并将所述载体或马GM-CSF掺入根据本发明的免疫原性组合物或马类动物疫苗中。

本发明还涉及免疫原性组合物和所谓的亚单位疫苗，其掺入或包含或基本上由蛋白VP2和可选地一种或多种本文所述的其他BTV蛋白(例如VP5或VP7)以及制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂组成，有利地所述蛋白质以本文所述方式通过体外表达来产生。

所述制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂可以由本领域技术人员通过本文公开内容和本领域知识(例如通过参考本文所引用和合并入本文的文献，或者在本文所引用的文献中所参考和通过提及而合并入的文献)来确定，而无需过多的实验；并且，所述制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂可以例如为0.9％NaCl盐水溶液或磷酸盐缓冲液。

根据本发明的免疫原性组合物和亚单位疫苗优选地包含或基本上由一种或多种佐剂组成。特别适合于在本发明中使用的为：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，或马来酸酐与烯基衍生物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman，Yi等人1996)，(3)水包油乳剂，例如在由M.Powell，M.Newmann出版的“Vaccine Design，The Subunit andAdjuvant Approach”(Powell和Newman 1995)的第147页中所描述的乳剂SPT，和在相同著作的第183页中所描述的乳剂MF59，(4)油包水乳剂(EP-A-639 071)，(5)皂苷，例如Quil-A，或者(6)氢氧化铝或等价物。(1)、(2)和(3)中所定义的不同类型的佐剂已经在本文中在涉及基于表达载体的疫苗和免疫原性组合物时进行了更详细的描述。

在本文中，剂量和给药体积以与免疫接种和疫苗接种方法的一般描述相联系的方式来进行讨论。

使用根据本发明的免疫原性组合物或疫苗进行免疫接种的动物形成针对BTV的特异性免疫，相比于未进行疫苗接种的对照动物而言，所述特异性免疫在BTV感染过程中涉及减轻病毒血症，并且实际上能够完全阻断病毒。本发明的这一有利的方面可以用于阻止BTV的传播从而限制哺乳动物病毒储库的存在，并防止蓝舌病的爆发。

本发明的另一个有利的方面为，保护性免疫可以从经疫苗接种的受试者传递给后代。

根据本发明，在疫苗接种程序的框架内，针对BTV的疫苗接种可以与其他疫苗接种相结合，以免疫接种或疫苗接种试剂盒或方法的形式，或者以多价免疫原性组合物和多价疫苗(即，包含或基本上由至少一种针对BTV的疫苗组分和至少一种针对至少一种其他致病因子的疫苗组分组成)的形式。此外，这还包括通过相同的表达载体来表达至少两种致病因子(包括BTV)的基因。

因此，本发明还涉及针对BTV和针对目标物种的至少一种其他病原体的多价或“混合式”免疫原性组合物或者多价或“混合式”疫苗，其中使用包含并表达至少一种根据本发明的BTV多核苷酸和至少一种表达另一种病原体的免疫原的多核苷酸的相同的体内表达载体。关于组合的或多价的或“混合式”的免疫原性组合物或疫苗，以及存在于此类组合物或疫苗中的或由此类组合物或疫苗表达的免疫原或抗原或其表位，可以关注本文所引用的和通过提及而合并入本文的文献，以及美国专利号5,843,456和6,368,603。

由本发明载体所表达的或者在多价或“混合式”组合物或疫苗中所使用的“免疫原”被理解为表示蛋白质、糖蛋白、多肽、肽、表位或衍生物，例如融合蛋白，其诱导免疫应答，优选为具有保护性质的免疫应答。

如本文所讨论的，这些多价组合物或疫苗还可以包含或基本上由制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂以及可选地佐剂组成。

本发明还涉及包含至少一种体内表达载体和至少一种第二表达载体的多价免疫原性组合物或多价疫苗，其中在所述体内表达载体中插入(并在体内表达)蓝舌病毒的至少一种多核苷酸，和在所述第二表达载体中插入(并在体内表达)编码另一种致病因子的免疫原的多核苷酸。此类多价组合物或疫苗还包含或基本上由制药学或兽医学上可接受的载体或运载体或赋形剂以及可选地佐剂组成。

关于被包含在多价免疫原性组合物或疫苗中或者由多价免疫原性组合物或疫苗表达的抗原或免疫原或表位(除了BTV抗原、免疫原或表位之外的)，包括关于确定或查明表位，本领域技术人员可以参考本文所引用的文献以及在本文所引用的文献中所引用的文献，所有这些文献均通过提及而合并入本申请中。

对于羊类动物多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的羊类动物病原体(关于此，另外的羊类动物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：绵羊疱疹病毒1型(OHV-1)、绵羊疱疹病毒2型(OHV-2)、边界病病毒(BDV)、博尔纳病病毒、小反刍兽疫病毒、内罗皮绵羊病病毒(NSDV)、深脓疱病病毒(绵羊副痘病毒)、狂犬病病毒(弹状病毒)、猫细小病毒(FPV)、绵羊轮状病毒、绵羊瘟病毒、绵羊腺病毒、口蹄疫病毒(FMDV)、雷付脱谷热病毒以及它们的混合物。适合于在本发明组合物中使用的另外的抗原包括来源于绵羊的细菌和病毒病原体的抗原。优选的细菌和寄生虫抗原包括：小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、衣原体属(Chlamydia)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetti)、梭菌属物种(Clostridium sp.)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、布鲁氏菌数(Brucella)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、捻转血矛线虫(Haemonchuscontortis)、奥斯脱线虫(Ostertagia)、球虫亚纲(Coccidia)和大肠杆菌(Escherichia coli)。

对于牛类动物多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的牛类动物病原体(关于此，另外的牛类动物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：牛疱疹病毒1型(BHV-1)(也称为传染性牛鼻气管炎病毒(IBR))、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、粘膜病病毒(牛病毒性腹泻病毒或者BVDV-1和BVDV-2)(也称为牛瘟病毒1型或2型)、和副流感病毒3型，以及对于每个价，一种或多种选自下列的基因：牛疱疹病毒的gB和gD，牛呼吸道合胞病毒的F和G，粘膜病病毒的E2、C+E1+E2和E1+E2，以及副流感病毒3型的HN和F。适合于在本发明的组合物中使用的另外的抗原包括来源于牛的细菌和病毒病原体的抗原。优选的细菌抗原包括：梭菌抗原，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)C和D，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)A、B、C和D型，败毒梭菌(Clostridiumsepticum)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)，诺氏梭菌(Clostridium novyi)B型，索氏梭菌(Clostridium sordellii)，溶血梭菌(Clostridiumhaemolyticum)；钩端螺旋体抗原，例如，问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)，例如哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)，波摩那钩端螺旋体(Leptospira Pomona)，哥本哈根钩端螺旋体(Leptospira copenhageni)，扎诺尼钩端螺旋体(Leptospirazanoni)，塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)；巴斯德氏菌抗原，例如多杀巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌；棒杆菌抗原，例如假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、牛肾盂炎棒杆菌(Corynebacterium renale)、膀胱炎棒杆菌(Corynebacterium cystitis)、多毛棒杆菌(Corynebacteriurnpilosum)和牛棒杆菌(Corynebacterium bovis)；和嗜血菌抗原，例如睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)和大叶性肺炎嗜血菌(Haemophilus pleuropneumoniae)；纤毛节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus pilus)；支原体抗原，例如无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)、牛支原体(Mycoplasma bovis)和羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)。优选的病毒抗原包括：牛病毒性腹泻(BVD)病毒抗原、传染性牛鼻气管炎病毒(IBR)抗原、副流感病毒-3抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原和牛暂时热(BEF)病毒抗原。因此，本发明包括使用编码此类免疫原的免疫学活性片段或表位的多核苷酸。

对于马类动物多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的马类动物病原体(关于此，另外的马类动物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：马流感(EI)病毒、非洲马瘟病毒([AHSV]，优选地与免疫原VP2和VP5相组合)、马器质性脑病病毒([EEV]，也与VP2和VP5相组合)、西方马脑炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西尼罗河病毒(WNV)、破伤风梭菌(破伤风)以及它们的混合物。优选地，对于AHSV，免疫原为VP2和/或VP5；对于EIV，免疫原有利地为HA、NP和/或N；对于脑炎病毒，免疫原有利地为C和/或E2；对于破伤风梭菌，免疫原为破伤风毒素的亚基C的全部或部分。因此，本发明包括使用编码此类免疫原的免疫学活性片段或表位的多核苷酸。

对于犬类动物多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的犬类动物病原体(关于此，另外的犬类动物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：麻疹病毒、犬腺病毒1(CAV-1)、犬腺病毒2(CAV-2)、犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒2型(CPI-2)、犬疱疹病毒1型(CHV-1)、狂犬病病毒(棒状病毒)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、钩端螺旋体属(Leptospira)以及它们的混合物。优选地，对于CDV，免疫原有利地为F和/或HA(关于CDV免疫原和构建体，还可参见美国专利号6,309,647、5,756,102)；对于CPV，免疫原有利地为VP2；对于CCV，免疫原有利地为S和/或M；对于CHV-1，免疫原有利地为gB和/或gC和/或gD(关于CHV免疫原和构建体，还可参见美国专利号5,688,920、5,529,780)；对于狂犬病病毒，免疫原有利地为G(关于狂犬病联合组合物，还可参见美国专利号5,843,456)；对于布氏疏螺旋体，免疫原有利地为OspA(关于OspA联合组合物，还可参见美国专利号6,368,603)。因此，本发明包括使用编码此类免疫原的免疫学活性片段或表位的多核苷酸。

对于猫类动物多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的猫类动物病原体(关于此，另外的猫类动物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：猫疱疹病毒1型(FHV-1)、猫杯状病毒(FCV)、狂犬病病毒(棒状病毒)、猫细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、衣原体属以及它们的混合物。优选地，对于FeLV，免疫原有利地为A和/或B和/或gag和/或pol，例如gag/pol；对于FPV，免疫原有利地为VP2；对于FIPV，免疫原有利地为S和/或M和/或N，例如S和M和/或N(还可参见美国专利号6,348,196和5,858,373，以及免疫原及其构建体)；对于FHV，免疫原有利地为gB和/或gC和/或gD，例如gB和gC和/或gD(还可参见美国专利号5,338,683、6,183,750；关于疱疹免疫原以及表达该免疫原的构建体)；对于FCV，免疫原有利地为C；对于FIV，免疫原有利地为env和/或gag和/或pro，例如gag/pro、env、或者env和gag/pro(还可参见于1996年11月14日提交的Tartaglia等人的美国申请系列号08/746,668中所讨论的免疫原和构建体)；对于狂犬病病毒，免疫原有利地为G。因此，本发明包括使用编码所述免疫原的免疫学活性片段或表位的多核苷酸。

对于禽类多价免疫原性组合物和多价疫苗，另外的禽类病原体(关于此，另外的禽类抗原或免疫原或其表位被包含在所述多价免疫原性组合物和多价疫苗中和/或由所述多价免疫原性组合物和多价疫苗所表达)有利地选自：马立克氏病病毒(MDV)(例如，血清型1和2，优选血清型1)、新城疫病毒(NDV)、甘保罗病病毒(Gumboro diseasevirus)或传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性贫血病毒或鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、脑脊髓炎病毒或禽脑脊髓炎病毒(AEV，或禽造白细胞组织增生病毒ALV)、火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、肺病毒病病毒(TRTV)、禽瘟疫病毒(禽流感病毒)、鸡积水性心包炎病毒、禽呼肠孤病毒、大肠杆菌、鸡支原体(Mycoplasma gallinarum)、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、鸟嗜血菌(Haemophilus avium)、鸡巴斯德氏菌(Pasteurella gallinarum)、鸡杀多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida gallicida)以及它们的混合物。优选地，对于MDV，免疫原有利地为gB和/或gD，例如gB和gD；对于NDV，免疫原有利地为HN和/或F，例如HN和F；对于IBDV，免疫原有利地为VP2；对于IBV，免疫原有利地为S(更有利地，S1)和/或M和/或N，例如S(或S1)和M和/或N；对于CAV，免疫原有利地为VP1和/或VP2；对于ILTV，免疫原有利地为gB和/或gD；对于AEV，免疫原有利地为env和/或gag/pro，例如env和gag/pro或者gag/pro；对于HEV，免疫原有利地为100K蛋白和/或六邻体；对于TRTV，免疫原有利地为F和/或G；以及对于禽瘟疫病毒，免疫原有利地为HA和/或N和/或NP，例如HA和N和/或NP。因此，本发明包括使用编码所述免疫原的免疫学活性片段或表位的多核苷酸。

例如，在根据本发明的多价免疫原性组合物或多价疫苗(如本文所讨论的，已经向其中可选地添加了一种或多种佐剂(因此，所述组合物包含或基本上由或由一种或多种佐剂组成)，并且其打算用于马类物种)中，可以掺入一种或多种在WO98/03198中所描述的质粒(有利地，在该专利的实施例8至25中所讨论的那些)，和/或在WO00/77043中所描述的且涉及马类物种的质粒(有利地，在该专利的实施例6和7中所描述的那些)，因此所述组合物或疫苗可以包含或基本上由或由一种或多种所述质粒组成。对于犬类物种而言，多价组合物或疫苗可以包含或基本上由或由一种或多种在WO98/03199中所描述的质粒(有利地，在该专利的实施例8至16中所讨论的那些)，和/或在WO00/77043中所描述的且涉及犬类物种的质粒(有利地，在该专利的实施例2、3和4中所描述的那些)组成；并且，此类组合物或疫苗可以包含、基本上由或由一种或多种佐剂组成。对于猫类物种而言，多价组合物或疫苗可以包含或基本上由或由一种或多种在WO98/03660中所描述的质粒(有利地，在该专利的实施例8至19中所描述的那些)，和/或在WO00/77043中所描述的且涉及猫类物种的质粒(有利地，在该专利的实施例5中所描述的那些)组成；并且，此类组合物或疫苗可以包含、基本上由或由一种或多种佐剂组成。对于鸟类物种而言，多价组合物或疫苗可以包含或基本上由或由一种或多种在WO98/03659中所描述的质粒(有利地，在该专利的实施例7至27中所描述的那些)组成；并且，此类组合物或疫苗可以包含、基本上由或由一种或多种佐剂组成。

本文所讨论的免疫原性组合物或疫苗还可以与至少一种常规疫苗(例如灭活疫苗、活的减毒疫苗或亚单位疫苗)相组合，其中所述常规疫苗针对所述组合物或疫苗所指向的物种的相同病原体或者至少一种其他病原体。本文所讨论的免疫原性组合物或疫苗可以在所述常规疫苗之前或之后进行施用，例如在“初激-加强”方案中。

本发明进一步包括使用了根据本发明的免疫原性组合物和亚单位疫苗的联合疫苗接种。因此，本发明还涉及多价免疫原性组合物和多价疫苗，其包含一种或多种根据本发明的蛋白质，以及至少一种其他致病因子(有利地，来自在本文中所描述的以及在本文中所引用和通过提及而合并入本文的文献中所描述的那些)的一种或多种免疫原(如本文所讨论的术语“免疫原”)，和/或以灭活或减毒形式的或作为亚单位的另一种致病因子。按照上文所述方式，这些多价疫苗或组合物还包含、基本上由或由制药学或兽医学上可接受的运载体或赋形剂以及可选地一种或多种佐剂组成。

本发明还涉及对目标物种进行免疫接种和疫苗接种的方法，例如如本文所讨论的。

本发明还涉及采用初激-加强方案来对目标物种进行免疫接种和/或疫苗接种的方法。术语“初激-加强”是指顺次施用共同具有至少一种免疫原的两种不同的疫苗类型或者免疫原性或免疫学组合物类型。初激性施用(初激)是施用第一种疫苗或免疫原性或免疫学组合物类型，并且可以包括一次、两次或更多次施用。加强性施用是施用第二种疫苗或免疫原性或免疫学组合物类型，并且可以包括一次、两次或更多次施用，例如可以包括或基本上由每年施用一次组成。

根据本发明的针对BTV的初激-加强免疫接种或疫苗接种的实施方案为这样的初激-加强免疫接种或疫苗接种，其中给动物第一次施用(初激)DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物，其包含或基本上由BTV的至少一种免疫原、抗原或表位组成，并且在体内表达BTV的至少一种免疫原、抗原或表位；然后，给动物施用(加强)第二种类型的疫苗或免疫原性或免疫学组合物，其包含或基本上由至少一种与所述初激性疫苗或免疫原性或免疫学组合物共同具有的免疫原、抗原或表位组成，或者表达所述免疫原、抗原或表位。这种第二种类型的疫苗可以是灭活的或减毒的或亚单位的疫苗或免疫原性或免疫学组合物或者载体，例如具有体内表达的重组或修饰的病毒疫苗或免疫原性或免疫学组合物(例如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒)。可以有利地使用痘病毒，例如减毒的痘苗病毒(如MVA或NYVAC)和禽痘病毒(如金丝雀痘病毒和鸡痘病毒)。

有利地，希望所述DNA疫苗诱导对于所表达的免疫原、抗原或表位特异的初激免疫应答，或者“DNA诱导的免疫应答”(例如，对于所表达的免疫原、抗原或表位特异的γ-干扰素+(IFN_γ+)T细胞记忆应答)，其能够通过随后施用(加强)灭活的疫苗或免疫学组合物或活的重组疫苗(其包含或基本上由病毒载体例如活的重组痘病毒组成)而得到加强(可以被加强)，其中所述灭活的疫苗或免疫学组合物或活的重组疫苗至少包含或基本上由经所述DNA疫苗所表达的相同的免疫原或抗原或表位组成，并且在体内表达所述免疫原或抗原或表位。可以在使用外周血单核细胞(PBMC)的定量酶联免疫斑点(enzyme-linked immune spot，ELISPOT)测定法中显示对于所表达的BTV免疫原特异的IFN_γ+T细胞记忆应答(Laval，Paillot等人2002)。

可以在“初激”后大约2周至大约6个月，例如在初激后大约3周至大约8周，有利地在初激后大约3周至大约6周，更有利地在初激后大约4周时进行“加强”。

对于羊类动物、牛类动物或马类动物而言，可以使用根据本发明的DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述核酸分子；和有利地，使用这样的疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行加强，其中所述疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含重组活病毒载体(例如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒)，例如重组鸡痘病毒或重组金丝雀痘病毒，重组体OHV-1或OHV-2，BHV-1或BHV-2，EHV-1或EHV-4，所述重组活病毒载体包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子组成：编码并且在体内表达至少一种与所述DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物所表达的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一个实施方案中，这些初激性和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物)和佐以

(用于加强性重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物)。

可以对可具有针对BTV(针对其进行免疫接种或疫苗接种)的母源性抗体的年幼绵羊、小牛或马驹进行初激。有利地，向从出生直至约16周龄(包括16周龄)，例如从出生直至约8周龄(包括8周龄)，例如从出生直至约6周龄(包括6周龄)，例如从出生直至约4周龄(包括4周龄)的年幼动物施用所述DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物。

对于猫类动物而言，可以使用根据本发明的DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述核酸分子；和有利地，使用这样的疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行加强，其中所述疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由重组活病毒载体(例如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，有利地重组鸡痘病毒或重组金丝雀痘病毒、重组FHV、重组犬腺病毒)组成，所述重组活病毒载体包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子组成：编码并且在体内表达至少一种与所述DNA疫苗所表达的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一个实施方案中，这些初激性和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物)和佐以

(用于加强性重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物)。

可以对可具有针对BTV(针对其进行免疫接种或疫苗接种)的母源性抗体的年幼小猫进行初激。可以向从出生直至约12周龄(包括12周龄)，例如从出生直至约8周龄(包括8周龄)，有利地从出生直至约6周龄(包括6周龄)，例如从出生直至约4周龄(包括4周龄)的年幼小猫施用所述DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物。

对于犬类动物而言，可以使用根据本发明的DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述核酸分子；和有利地，使用这样的疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行加强，其中所述疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由重组活病毒载体(例如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，有利地重组鸡痘病毒或重组金丝雀痘病毒、重组CHV、重组犬腺病毒)组成，所述重组活病毒载体包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子组成：编码并且在体内表达至少一种与所述DNA疫苗所表达的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一个实施方案中，这些初激性和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物)和佐以

(用于加强性重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物)。

可以对可具有针对BTV(针对其进行免疫接种或疫苗接种)的母源性抗体的年幼小狗进行初激。可以向从出生直至约12周龄(包括12周龄)，例如从出生直至约8周龄(包括8周龄)，有利地从出生直至约6周龄(包括6周龄)，例如从出生直至约4周龄(包括4周龄)的年幼小狗施用所述DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物。

对于鸟类而言，可以使用根据本发明的DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由编码BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子组成，并且在体内表达所述核酸分子；和有利地，使用这样的疫苗或免疫原性或免疫学组合物来进行加强，其中所述疫苗或免疫原性或免疫学组合物包含或基本上由重组活病毒载体(例如痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，有利地重组鸡痘病毒或重组金丝雀痘病毒、重组HVT、重组MDV、重组禽腺病毒)组成，所述重组活病毒载体包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子组成：编码并且在体内表达至少一种与所述DNA疫苗所表达的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一个实施方案中，这些初激性和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物)和佐以

(用于加强性重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物)。

在一个实施方案中，所述初激性DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物包含或基本上由编码并表达VP2、VP5、或者VP2和VP5多肽的质粒组成，例如质粒pLH2078.15(图10)，在该质粒中已经引入了遍在真核启动子，即人巨细胞病毒即时早期(CMV-IE)启动子，以便获得VP2和VP5蛋白的高效表达；并且用于加强免疫的重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物包含或基本上由痘病毒(例如金丝雀痘病毒，如重组金丝雀痘病毒vCP2289(实施例9))组成。在另一个实施方案中，这些初激性和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以加有佐剂：包含质粒pLH2078.15(图10)(所述质粒包含但不限于CMV-IE启动子)的DNA疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以佐以DMRIE-DOPE，如美国专利申请号20050255127所描述的；以及，包含vCP2289的重组疫苗或免疫学或免疫原性组合物可以佐以

如美国专利申请号20050255127所描述的。

本发明还涉及用于施行初激-加强方法的试剂盒，其在包含下列组分或基本上由下列组分组成：在分开的容器中的初激性疫苗或免疫学或免疫原性组合物和加强性疫苗或免疫学或免疫原性组合物；以及可选地，关于混合和/或施用的说明书。

在初激和加强中所施用的量(剂量)以及用于初激和加强的施用途径可以如本文所讨论的，这样根据本公开内容和本领域知识，可以实施初激-加强方案而无需过多的实验。此外，根据本公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以针对任何本文所提及的目标物种来实施所述方法、试剂盒等。

这些方法可以包括下列步骤、基本上由下列步骤组成或由下列步骤组成：施用有效量的根据本发明的免疫原性组合物或疫苗。该施用可以通过肠胃外途径，例如通过皮下、皮内或肌内施用，和/或通过口服和/或鼻途径来进行。有利地，该施用为肌内或皮下施用。可以进行一次或多次施用，例如2次施用。

疫苗或免疫原性组合物可以通过无针的液体喷射注射器或粉末喷射注射器来进行注射。对于质粒而言，还可以使用用质粒进行包被的金颗粒，并将金颗粒以可以渗透到待免疫接种的受试者的皮肤细胞中的方式进行喷射(Tang，DeVit等人1992)。关于本发明的疫苗或免疫原性组合物的施用方法和装置，可以参考本文所引用的和通过提及而合并入本文的其他文献。所述无针注射器还可以例如为Biojector2000(Bioject Inc.，Portland OR，USA)。

有利地，根据本发明的免疫原性组合物和疫苗包含或基本上由或由有效量的本文所讨论的一种或多种表达载体和/或多肽组成，所述有效量足以引发免疫学应答，例如但不限于，中和抗体和/或保护性免疫学应答；并且，有效量可以根据本公开内容(包括合并入本文的文献)和本领域知识来确定，而无需进行过多的实验。有利地，根据本发明的免疫原性组合物和疫苗包含或基本上由或由有效量的本文所讨论的一种或多种表达载体和/或多肽组成，所述有效量足以产生保护性应答，例如但不限于，减轻或消除临床症状(例如但不限于，高热、白细胞减少、淋巴细胞减少、血小板减少)和/或减轻或消除病毒血症。

在基于质粒载体的免疫原性组合物或疫苗的情况下，剂量可以包含下述量、基本上由下述量组成或由下述量组成：一般地，约10μg至约2000μg，有利地约50μg至约1000μg。给药体积可以为约0.1至约2ml，优选地约0.2至约1ml。

这些剂量和给药体积适合于马类和其他目标物种(其为哺乳动物，例如羊类动物、牛类动物、犬类动物、猫类动物)的疫苗接种。

对于鸟类的疫苗接种或免疫接种而言，剂量有利地为约10μg至约500μg，和优选地约50μg至约200μg。给药体积可以为约0.1至约1ml，优选地约0.2至约0.5ml。

本领域技术人员可以根据本公开内容和本领域知识来确定用于每种免疫接种或疫苗接种方案和物种的有效质粒剂量。

在基于痘病毒的免疫原性组合物或疫苗的情况下，剂量可以为约10²pfu至约10⁹pfu。

对于羊类动物、牛类动物、马类动物和其他目标物种(其为哺乳动物，例如猫类动物和犬类动物)而言，当所述载体为痘苗病毒时，剂量更有利地为约10⁴pfu至约10⁹pfu，优选地约10⁶pfu至约10⁸pfu；和当所述载体为金丝雀痘病毒时，剂量更有利地为约10⁵pfu至约10⁹pfu，优选地约10^5.5pfu或约10⁶pfu至约10⁸pfu。

对于鸟类而言，当所述载体为诸如金丝雀痘病毒的痘病毒时，剂量更有利地为约10³pfu至约10⁷pfu，优选地约10⁴pfu至约10⁶pfu；和当所述载体为诸如鸡痘病毒的痘病毒时，剂量更有利地为约10²pfu至约10⁵pfu，优选地约10³pfu至约10⁵pfu。根据本公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以确定当所述载体为诸如鸽痘病毒、家鸽痘病毒等的其他禽痘病毒时的合适剂量。

在用于哺乳动物目标物种的、基于除了痘病毒之外的其他病毒载体(例如疱疹病毒或腺病毒)的免疫原性组合物或疫苗的情况下，剂量通常为约10³pfu至约10⁸pfu；并且，在用于鸟类物种的此类基于非痘病毒病毒载体的免疫原性组合物或鸟类疫苗的情况下，剂量通常为约10³pfu至约10⁶pfu。对于用于大型目标哺乳动物物种例如大型猫类(例如饲养在动物园中的)或马类的此类基于非痘病毒病毒载体的免疫原性或疫苗组合物而言，例如在马类动物免疫原性或疫苗组合物的情况下，剂量有利地为约10⁶pfu至约10⁸pfu。

用于哺乳动物目标物种的基于病毒载体的免疫原性和疫苗组合物(例如基于非痘病毒病毒载体的免疫原性或疫苗组合物)的给药体积，例如马类动物免疫原性或疫苗组合物的给药体积，通常为约0.5至约2.5ml，例如约0.5至约2.0ml，优选地约1.0至约2.0ml，优选地约1.0ml。用于鸟类的、基于病毒载体的免疫原性或疫苗组合物的给药体积，例如基于非痘病毒病毒载体的鸟类免疫原性或疫苗组合物的给药体积，通常为约0.1至约1.0ml，优选地约0.1至约0.5ml，更有利地约0.2至约0.3ml。此外，与此类疫苗或免疫原性组合物相关，根据本公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以确定用于每种免疫接种或疫苗接种方案的施用次数、施用途径和剂量，而无需进行过多的实验。例如，对于绵羊、牛或马可以进行两次施用，两次施用间隔例如35天。

在亚单位免疫原性组合物或亚单位疫苗的情况下，关于活性成分例如亚单位(抗原、免疫原、表位)的量，剂量包含下述量、基本上由下述量组成或由下述量组成：一般地，约10μg至约2000μg，有利地约50μg至约1000μg。用于哺乳动物目标物种(例如用于马)的此类免疫原性或疫苗组合物的给药体积通常为约1.0至约2.0ml，优选地约0.5至约2.0ml，更有利地约1.0ml。用于鸟类的此类免疫原性或疫苗组合物的给药体积通常为约0.1至约1.0ml，优选地约0.1至约0.5ml，和更有利地0.2至0.3ml。此外，对于此类疫苗或免疫原性组合物，根据本公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以确定用于每种免疫接种或疫苗接种方案的施用次数、施用途径和剂量，而无需进行过多的实验。

本发明还涉及根据本发明的体内表达载体或载体和/或多肽的制剂在配制免疫原性组合物或疫苗中的用途，所述免疫原性组合物或疫苗旨在保护目标物种或者在目标物种引发针对BTV，和(在某些实施方案中)针对至少一种其他致病因子的免疫学应答。

根据本发明的基于质粒的疫苗或者表达一种或多种BTV蛋白的病毒疫苗或者BTV亚单位疫苗不会在经免疫接种或疫苗接种的动物中诱导针对该病毒的其他蛋白质的抗体，所述其他蛋白质并不存在于所述免疫原性组合物或疫苗中或者并不由所述免疫原性组合物或疫苗来提供(例如并不存在于所述免疫原性组合物或疫苗中和/或并不由所述免疫原性组合物或疫苗所表达)。通过这一特征，本发明提供了鉴别诊断方法。本发明使得能够区分被BTV的致病性野生毒株感染的动物与用根据本发明的疫苗或组合物进行疫苗接种或免疫接种的动物。在前者中，存在蛋白质和/或针对其的抗体，并且所述蛋白质和/或针对其的抗体可以通过抗原-抗体反应来检测。在后者(根据本发明进行疫苗接种或免疫接种的动物)中，并非如上述情况那样，动物在关于不存在于所述免疫原性或疫苗组合物中或不由所述免疫原性或疫苗组合物来提供的蛋白质或者其抗体的抗原-抗体反应中保持阴性。为了实现这种区分，所述诊断方法采用了不呈现在所述疫苗或免疫原性组合物中或者不由所述疫苗或免疫原性组合物来提供(不存在和/或不被表达)的蛋白质，例如蛋白VP7、NS1、NS2或NS3，当其不呈现在所述疫苗或免疫原性组合物中时。

因此，本发明包括了诊断测定法或试剂盒，所述诊断测定法或试剂盒使用了不存在于本发明的疫苗或免疫原性组合物中或者不由本发明的疫苗或免疫原性组合物来提供的蛋白质或其抗体；以及，包含此类诊断测定法或试剂盒以及此类疫苗或免疫原性组合物的试剂套盒，由此，用户可以对动物进行接种和/或疫苗接种，然后对该动物进行测试，以确定已暴露于BTV的那些动物与仅针对BTV进行了免疫接种和/或疫苗接种的那些动物。

因此，本发明涉及根据本发明的载体、制剂和多肽在制备免疫原性组合物和疫苗中的用途，所述免疫原性组合物和疫苗使得能够区分经疫苗接种或免疫接种的动物与被感染的动物。

本发明还涉及与允许进行此类区分的诊断方法相关的免疫接种和疫苗接种方法。

被选择用于所述诊断的蛋白质或者其片段或表位之一在所述诊断测试中用作抗原，和/或用于产生多克隆或单克隆抗体。

本领域技术人员具有足够的实践知识来产生这些抗体以及在常规诊断方法(例如ELISA测试)中使用抗原和/或抗体，并由此实施根据本发明的鉴别诊断测试。

现在，通过下列非限定性实施例来进一步描述和举例说明本发明。

实施例

所有构建都是采用Sambrook J等人(Sambrook and Russell 2001)所描述的标准分子生物学方法(克隆，使用限制酶进行消化，互补单链DNA的合成，聚合酶链式反应，通过DNA聚合物来延伸寡核苷酸，等等)来进行的。用于本发明这些实施例的所有限制性片段，以及各种聚合酶链式反应(PCR)产物都是采用Qiagen凝胶提取或PCR纯化试剂盒来分离和纯化的。

实施例1：蓝舌(BTV)攻击病毒的培养

由始至终都使用BTV血清型17，其为最初从来自Tulare County，CA(USA)的、死于蓝舌病的绵羊血液中分离出的毒株。使该病毒在血清阴性的牛中传代两次，然后在初级牛肺微血管内皮细胞中分离该病毒。为了进行扩增，将BTV血清型17的该毒株(Bonneau，DeMaula等人2002；DeMaula，Leutenegger等人2002)在可以以登录号CCL-10获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的BHK-21细胞(幼仓鼠肾细胞)中进行培养。

将BHK-21细胞培养于补充有10％胎牛血清(HycloneLaboratories)、10％胰蛋白

磷酸盐肉汤以及1％青霉素和链霉素的Eagle培养基(EMEM)中。将所述细胞于+37℃在5％CO₂气氛下进行培养。

3天内，细胞单层汇合。然后，将该培养基替换为补充有10％FBS以及BTV(以大约5pfu/细胞的比例加入)的新鲜EMEM培养。当致细胞病变效应(CPE)完成时(通常在培养开始后48至72小时)，收获病毒悬浮液，然后通过离心进行澄清，并冷冻于-70℃。对于产生贮存于-70℃下的病毒批料需要一次或两次连续传代。

实施例2：经优化的BTV VP2和VP5的合成

不同物种中的密码子偏好可以是显著不同的。为了增强利用金丝雀痘病毒表达体系(ALVAC)的外源蛋白质(即，BTV VP2和VP5)在羊类/牛类/马类哺乳动物细胞中的表达水平，极为重要的是调整外源蛋白质的密码子频率，以使其与宿主表达体系相匹配(Kim，Oh等人1997)。关于密码子优化，生物信息学家考虑了许多其他因素，例如二级结构、GC含量、重复密码子、限制性核酸内切酶位点等等，并开发出拥有专利权的算法。Geneart GmbH(Regensburg，Germany)已经开发出拥有专利权的GeneOptimizer^TM软件(专利未决)，该软件在一个单一操作中实施多参数优化。通过平行地考虑最重要的参数，所述软件在进化方法中产生目标序列的总计高达500,000个经优化的变体，并且选择出最合适的一个。已经报道，与原始基因序列相比，此类经优化的基因的表达产量可增加高达100倍(Bradel-Tretheway，Zhen等人2003；Disbrow，Sunitha等人2003)。

将关于BTV-17 VP2的核酸序列信息(SEQ ID NO：3)(de Mattos，de Mattos等人1994)和关于BTV-17 VP5的核酸序列信息(SEQ ID NO：4)提交给Geneart以用作“天然”BTV-17序列。将该序列信息应用到Geneart的GeneOptimizer^TM软件中，并衍生出经优化的关于VP2和VP5的合成序列。图1提供了VP2天然核酸序列(SEQ ID NO：3)与经优化的(通过Geneart)VP2合成核酸序列(SEQ ID NO：1)的比较/比对。图2提供了VP5天然核酸序列(SEQ ID NO：4)与经优化的VP5合成核酸序列(SEQ ID NO：2)的比较/比对。所述经优化的VP2和VP5序列被Geneart用作用于化学合成高度精确的寡核苷酸的阵列的基础，其中所述寡核苷酸在一起包括了关于每个基因的完整的合成编码序列。然后，基于产生完整的合成VP2和VP5编码序列的策略，通过采用PCR(聚合酶链式反应)来装配关于每个基因的寡核苷酸。

实施例3：经优化的BTV-17合成VP2和合成VP5的pPCR-Script克隆

合成的VP2。通过使用限制性核酸内切酶(RE)Sac I和Kpn I在其多克隆位点(MCS)区域处进行切割，来使可获自Stratagene(SanDiego，CA，USA)的克隆载体pPCR-

Amp SK(+)线性化。然后，使用T4DNA连接酶，将具有2,913个核苷酸的、线性的、完全装配好的合成VP2编码序列连接到所述质粒载体中，其中所述合成VP2编码序列包含紧邻ATG起始密码子上游的H6启动子的3’末端。将经连接的DNA用于转化感受态大肠杆菌细胞。选择具有氨苄青霉素抗性(携带有质粒载体)以及含有VP2合成基因序列(依据其在XGal指示剂平板上的“白色”表型(由于在pPCR-

的MCS中插入了VP2而破坏了β-半乳糖苷酶基因))的阳性转化体，以用于进一步的表征。分离出一个克隆，043004pPCR-Script(5,779bp)，并通过DNA序列分析来确定其是否正确。图3图解说明了上述克隆策略。将043004克隆用于随后的克隆操作中。

合成的VP5。通过使用RE Sac I和Kpn I在其MCS区域中进行切割，来使可获自Stratagene(San Diego，CA，USA)的克隆载体pPCR-

Amp SK(+)线性化。然后，使用T4DNA连接酶，将具有1,638个核苷酸的、线性的、完全装配好的合成VP5编码序列连接到所述质粒载体中。将经连接的DNA用于转化超感受态(ultracompetent)大肠杆菌细胞。选择具有氨苄青霉素抗性(携带有质粒载体)以及含有VP5合成基因序列(依据其在XGal指示剂平板上的“白色”表型(由于在pPCR-

的MCS中插入了VP2而破坏了β-半乳糖苷酶基因))的阳性转化体，以用于进一步的表征。分离出一个克隆，043005pPCR-Script(4,492bp)，并通过DNA序列分析来确定其是否正确。图8图解说明了上述克隆方案。将该克隆用于随后的克隆策略中。

实施例4：pNVQH6C5LSP-18ALVAC供体质粒

描述了ALVAC供体质粒pNVQH6C5LSP-18的构建(美国专利申请20050255127)。鉴定出了金丝雀痘病毒DNA的编码称为C5的ORF的5kb基因座，其起始于该病毒基因组的位置1864处和终止于位置2187处。下文描述了通过下述方式来构建的C5插入质粒：删除C5 ORF的大部分，并用H6启动子、多克隆位点(MCS)以及转录和翻译终止序列(在所有阅读框中)来替代之。使用引物C5A1和C5B1，从基因组金丝雀痘病毒DNA中扩增出包含上游C5R臂的1590bp PCR片段：

(SEQ ID NO：5)C5A：

-5′GGCCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTT 3′

(SEQ ID NO：6)C5B1：

-5′CCCGGGATCGATGGATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCACGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAGCTA 3′。

扩增出的片段包含在5′-末端处的EcoR I位点，终止序列，和在3′-末端处的含有BamH I、Cla I和Xma I位点的MCS。

使用引物C5C1和C5D1，从基因组金丝雀痘病毒DNA中扩增出包含上游C5L臂的458bp PCR片段：

(SEQ ID NO：7)C5C1：

-5′GGATCCATCGATCCCGGGTTTTTATGACTAGTTAATCACGGCCGCTTATAAAGATCTAAAATG CAT 3′

(SEQ ID NO：8)C 5D1：

-5′GGCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGAT 3′。

扩增出的片段包含5′BamH I、Cla I和Xma I限制性核酸内切酶位点，终止序列，和在3′-末端处的Pst I位点。

通过使用引物C5A和C5D(如上)进行再次扩增而将上述PCR片段融合在一起，从而产生2,030bp EcoR I-Pst I片段，将该片段克隆到pUC 8质粒载体中，从而产生pUC/C5L/B Cia Xm/C5R。使用下列寡核苷酸，通过将寡核苷酸插入到EcoR I位点中来在C5R臂的5′-末端处引入唯一的Not I序列，从而产生pUC/Not I/C5R/MCS/C5L：用于引入Not I的寡核苷酸为5′AATTGCGGCCGC 3′(SEQ ID NO：18)。

痘苗H6启动子包含于质粒pBSH6-1中。

使用引物H6A1和H6B1，扩增出包含H6启动子和用于多克隆位点(包含Asp718 I、Xho I、Xba I、Cla I和Sma I)的识别序列的176bp片段(H6片段)：

(SEQ ID NO：9)H6A1：

-5′TCGTTAATTAATTAGAGCTTCTTTAT-TCTATACTTAAAAAG 3′(SEQ ID NO：10)H6B1：

-5′AAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCTACGATACAAACTTAACGGATA 3′。

将编码H6的片段(如上)汇集起来，并使用和H6B1再次扩增，从而产生232bp H6p/MCS片段，然后将该片段在BamH I和Xma I位点之间插入到pUC/C5L/B Cla Xm/C5R中。图4显示了所得的质粒pNH6C5LSP-18，其为包含H6启动子、转录和翻译终止子(在所有阅读框中有功能的)和MCS的C5插入质粒。

实施例5：pCXL148.2ALVAC供体质粒的构建

pNVQH6C5LSP-18供体质粒的核苷酸序列分析表明，相对于ALVAC病毒载体(序列未提供)，在ALVAC供体质粒pNVQH6C5LSP-18(如美国申请20050255127中所述)的C5R区域中存在单个碱基突变。

因此，如下创建pCXL148以修饰供体质粒序列，以便使其与经克隆的(经噬斑纯化的)ALVAC的序列精确匹配，从而使得在创建源自重组体的蓝舌ALVAC病毒构建体的过程中可能出现的任何序列差异最小化。图5图解说明了该构建策略。

使用限制性核酸内切酶SnaBI+BsrGI对质粒pNVQH6C5LSP-18(美国申请20050255127)进行消化，从而产生3,923bp片段和962bp片段。将所述RE消化产物通过琼脂糖凝胶电泳进行解析，并从凝胶中切出3,923bp片段。根据制造商所述，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，USA；Cat.#28704)来纯化所述片段DNA。

然后，将ALVAC基因组DNA用作模板，以用于使用引物组7634CXL和7521CXL(参见下文)的PCR反应，从而产生跨越病毒的C5R区域的1.89kb PCR片段。

(SEQ ID NO：11)7521CXL(正向)：

-5’TTATTTAGAAATTATGCATTTTAGA

(SEQ ID NO：12)7634CXL(反向)：

-5’GTTCTCGTAGGAGAGAACTATTGAC。

使用SnaBI+BsrGI对1.89kb的经PCR扩增出的片段进行消化，从而产生三个片段：361bp、569bp和962bp。通过琼脂糖凝胶电泳来呈现该RE消化产物，和从凝胶中切出962bp片段，并根据制造商所述，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，USA；Cat.#28704)来纯化该DNA。

通过按照下列方式组合RE片段来重新构建ALVAC供体质粒pNVQH6C5LSP-18，其中在供体质粒的C5R编码区中的经突变的“T”核苷酸被相应的ALVAC野生型核苷酸“C”替代，从而创建出pCXL148.2：

a.使用T4 DNA连接酶，将通过pNVQH6C5LSP-18的RE(SnaBI+BsrGI)消化而得到的经纯化的3,923bp片段有方向性地连接至源自ALVAC的经PCR扩增的C5R区域的962bp SnaBI+BsrGI片段。

b.将连接反应产物用于转化感受态大肠杆菌细胞，并使转化反应产物在氨苄青霉素选择下进行生长。

选择转化体，并通过RE消化来表征它们的质粒DNA。发现一个候选克隆pCXL148.2的核苷酸序列在所述C5R区域中具有正确的“C”核苷酸。该新的C5供体质粒pCXL148.2与在ALVAC病毒载体中的相应序列具有准确的同源性。图6提供了pCXL148.2供体质粒的核酸序列(SEQID NO：13)。

实施例6：pC5H6pVP2的构建

使用EcoR V+Xho I对质粒VP2 BTV 17(043004，图3)进行RE消化，从而产生独特的2,913bp片段，其包含：5’EcoR V位点，随后是全长的、合成的、经密码子优化的BTV-VP2，随后是3’Xho I位点。通过琼脂糖凝胶电泳来呈现该RE消化产物，和从凝胶中切出2,913bp片段，并根据制造商所述，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，USA；Cat.#28704)来纯化该DNA。

使用EcoR V和Xho I来消化pCXL148.2(pC5供体质粒，参见图5)，从而产生线性化的4879bp同源性载体，其包含C5右臂、H6启动子和C5左臂。

使用T4 DNA连接酶，将通过043004pVP2BTV 17的RE(Eco RV+XhoI)消化而得到的经纯化的2,913bp片段有方向性地连接至4879bp的、经Eco RV+Xho I消化的且线性化的pCXL-148.2供体ALVAC质粒。使用所述连接反应产物来转化感受态大肠杆菌细胞，并使转化反应产物在氨苄青霉素选择下进行生长。选择转化体，使其生长，并通过RE消化来表征它们的质粒DNA。在使用VP2特异性核酸寡核苷酸的Southern印迹上探测具有正确的RE图谱的克隆。选择出一个阳性克隆，pALVAC C5H6p-合成的BTV VP2，用于随后的克隆操作。图7提供了前述克隆策略。

实施例7：掺入了42K启动子的VP5的PCR扩增

选择昆虫痘病毒(桑红缘灯蛾)42K启动子(Barcena，Lorenzo等人2000)来调控经优化的合成VP5基因的表达。采用基于PCR的策略(其中，将42K启动子嵌入正向合成引物的5’末端中)，将42K启动子的核酸序列(参见下文：启动子序列为斜体和加下划线的)放置于邻近所述合成VP5基因的5’ATG起始密码子。与反相引物相结合地使用这种引物，使得能够直接从质粒VP5 BTV 17(043005)(其用作模板)中进行扩增(参见图8)。在PCR反应中使用引物对13247.JY/13248.JY(参见下文和图21)来扩增DNA片段，该DNA片段包含侧翼为Xho I位点的42Kp-VP5表达盒。

用于扩增42Kp-BTV VP5表达盒的引物为：

(SEQ ID NO：14)13247.JY正向：

-5’GCGCTCGAGTTTTTATTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGGGCAAGATCATCAAGAGCCTG

(SEQ ID NO：15)13247.JY反向：

-5’ATCTCGAGATAAAAATCATCAGGCGTTCCTCAGGAACAGGGGCACGTC。

使用上述引物来进行逆转录酶聚合酶链式反应(PCR反应)，并根据制造商的说明书(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，将所得的PCR产物克隆到2.1-TOPO克隆载体的XhoI位点中，从而形成pLH2033.1(pCR2.142Kp合成的BTV-VP5)。经证实，该构建体包含正确的序列。图9中图解说明了该克隆策略。扩展pLH2033.1克隆，以便如随后克隆活性中所需要的来扩大质粒产量。

实施例8：供体同源性载体pLH2078.15(pC5H6VP242KpVP5)的构建

用Xho I切割含有42Kp-合成的BTV VP5序列的pLH2033.1，这释放出编码BTV VP5的1,647bp片段。通过琼脂糖凝胶电泳来呈现该Xho I消化产物，和从凝胶中切出1,647bp VP2片段，并根据制造商所述，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，USA；Cat.#28704)来纯化该DNA。

使用Xho I来消化pLH2030.2(pALVAC C5H6p-合成的BTV VP2，pC5供体质粒，参见图7)，从而产生线性化的7,744bp同源性载体，其包含C5右臂、H6启动子、合成的BTV VP2和C5左臂。

使用T4DNA连接酶，将通过pLH2033.1的Xho I消化而得到的经纯化的1,647bp片段连接至7,744bp的经Xho I线性化的pLH2030.2供体ALVAC质粒。使用所述连接反应产物来转化感受态大肠杆菌细胞，并使转化反应产物在氨苄青霉素选择下进行生长。选择转化体，使其生长，并通过RE消化来表征它们的质粒DNA。由于所述连接是非方向性的，所以克隆选择的基本组成部分需要在供体质粒中42Kp-合成的VP5插入片段相对于H6pVP2具有合适的方向，在这种实施方案中，优选的方向为头至尾，例如在所述质粒上VP2和VP5以相同的5’至3’方向进行转录和翻译。选择具有正确的RE图式的克隆用于进一步的表征。选择出一个阳性克隆，pLH2978.15，并对其进行测序。图10中提供了用于构建最终的ALVAC-BTV供体质粒的所描述的克隆策略。图11中提供了pLH2978.15的经注释的核苷酸序列。

实施例9：ALVAC BTV(vCP2289)的产生和表征

为了产生基于ALVAC的BTV重组体，使用与FuGENE-6转染试剂(Roche)相混合的15μg Not I-线性化的pLH2078.15供体质粒DNA(pC5 H6p-BTV VP2-42Kp-BTV VP5)来转染原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。然后以10的MOI使用ALVAC(6.3×10⁹pfu/ml HM1372)作为拯救病毒(rescue virus)来感染经转染的细胞。24小时后，收获经转染的-经感染的细胞，进行超声处理，并用于噬斑纯化和重组病毒筛选。铺板在新鲜的CEF上后24-48小时，将重组噬斑转移至尼龙膜上，并根据制造商的方案(Amersham Cat#RPM3001)，标记有辣根过氧化物酶的BTV特异性DNA探针进行杂交。在连续4轮的噬斑纯化后，扩增单个噬斑，从而产生原种(stock)，其被指定为vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1。通过杂交证实，重组病毒对于BTV插入片段而言是100％阳性的，和对于空的C5位点而言是100％阴性的。

由最后一轮的噬斑纯化中选择出单个噬斑，并进行扩展，以获得P1(T-25烧瓶)、P2(T-75烧瓶)和P3(滚瓶)原种，从而扩增vCP2289.1.2.1.1和vCP 2289.1.1.1。在P2水平上通过杂交再次证实和发现，所述重组体对于插入片段而言是100％阳性的，和对于空的C5位点而言是100％阴性的。从滚瓶中收获经感染的细胞培养液并进行浓缩，从而产生病毒原种(1.8ml 1.25×10¹⁰pfu/ml的vCP2289.1.2.1.1，和1.9ml 1.0×10¹⁰pfu/ml的vCP2289.2.1.1.1)。图12显示了用于构建重组体ALVAC+BTV VP2和VP5(vCP2289)的流程图。

实施例10：ALVAC BTV(vCP2289)的表征

1.遗传纯度的证实。通过杂交再次证实，P3原种对于BTV插入片段而言是100％阳性的，和对于空的C5位点而言是100％阴性的。

2.基因组分析

a.限制性酶切图谱：

i.在Vector NTI(Invitrogen，USA)中产生关于基因组DNA的理论上的限制性核酸内切酶(RE)凝胶电泳片段分析，并且显示在图13中。

ii.从vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1中提取基因组DNA，用BamH I、Hind III或Pst I进行消化，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。结果揭示了外源基因序列的正确插入(参见图14)。

b.Southern印迹：将经BamH I、Hind III或Pst I消化的基因组DNA转移至尼龙膜上，并通过用BTV探针进行探测来进行Southern印迹分析。在预期的大小处观察到BTV-特异性的9508bpBamH I、14974bp Hind III和2901bp Pst I条带。结果表明，BTV插入片段正确地插入到C5基因座中。图15提供了Southern印迹的结果。

3.表达分析：

a.Western印迹。以10的MOI用vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的P3原种来感染1°CEF细胞，并在37℃下温育24小时。然后，收获细胞和培养物上清液。在10％SDS-PAGE凝胶上分离样品蛋白质，将电印迹转移至Immobilon尼龙膜上，并用稀释度为1∶2000的兔抗BTV17 VP5的经亲和纯化的IgG(University ofCalifornia，Davis，USA)来进行探测。将缀合有过氧化物酶的山羊抗兔抗血清用作二抗，并用Amersham检测试剂来显现条带。在vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的细胞粒状沉淀中检测出位于47KDa和60KDa之间的两个蛋白质条带，这表明表达出了BTV-17 VP5蛋白(参见图16)。经表达的BTV-17 VP5蛋白没有被分泌到细胞培养基中。

b.免疫荧光。使用四种小鼠抗BTV-17 VP2抗体(ABX IgG 17.81α-BTV 17；PA IgG17.815 α-BTV 17；PA IgG 17.85 α-BTV 17；PAIgG 17.813 α-BTV-17，得自University of California，Davis，USA)的混合物，就VP2表达而进行的Western印迹和免疫噬斑测定法均是阴性的，这可能是由于所述试剂的构象敏感度以及由转移和杂交所施加的“变性样”环境。因此，以0.1的MOI用vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的P3原种来感染1°CEF细胞，并在37℃下温育24小时。然后，将所述细胞用3％低聚甲醛固定，并用0.5％Tritoh X-100进行透化。以1∶100稀释度使用四种小鼠抗BTV17 VP2抗体(ABX IgG17.81抗BTV 17，PA IgG17.815抗BTV 17，PA IgG 17.85抗BTV 17，PA IgG 17.813抗BTV-17，得自University of California，USA)的混合物作为一抗，并使用缀合有FITC的山羊抗小鼠抗体作为二抗。在Nikon Eclipse TE300荧光显微镜下显现出发强绿色荧光的细胞，这表明表达出了BTV VP2蛋白(数据未显示)。

4.序列分析。通过C5基因座的侧翼臂和BTV插入片段的PCR扩增和序列分析来对P3原种基因组DNA进行更详细的分析。使用位于C5基因座的臂之外的引物7931.DC和7932.DC来扩增完整的C5R-BTV插入片段-C5L片段。

用于PCR扩增vCP2289 C5臂+插入片段的引物：

(SEQ ID NO：16)7931.DC：

-5GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT

(SEQ ID NO：17)7932.DC：

-5TGATTATAGCTATTATCACAGACTC。

结果表明，在vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1中，BTV插入片段的序列以及在BTV插入片段附近的C5左臂和右臂的序列是正确的。

实施例11：重组疫苗的生产

为了制备羊类动物、牛类动物或马类动物疫苗，将所述重组金丝雀痘病毒vCP2289病毒(实施例9)佐以卡波姆溶液，即由BF Goodrich，Ohio，USA生产的Carbopol^TM974P(分子量为约3,000,000)。

首先，在含有1g/l氯化钠的蒸馏水中制备1.5％Carbopol^TM974P母液。然后，将该母液用于在生理盐水中制备4mg/ml Carbopol^TM974P溶液。在单个步骤中或者在几个连续的步骤中将所述母液与适当体积的生理盐水相混合，在每个步骤中用1N(或者更加浓的)氢氧化钠溶液调节pH值，以便获得7.3至7.4的最终pH值。

将以这种方式获得的即用型Carbopol^TM974P溶液用于吸收冻干的重组病毒或者用于稀释浓缩的重组病毒母液。例如，为了获得包含10⁸pfu/1ml剂量的病毒悬浮液，稀释病毒母液以获得10^8.3pfu/ml的滴度，随后用所述即用型4mg/ml Carbopol^TM974P溶液以相等的份额进行稀释。

实施例12：用于羊类动物、牛类动物或马类动物的DNA疫苗的生产

对于DNA免疫接种，要构建质粒，其中经密码子优化的BTV VP2核苷酸序列(图1，SEQ ID NO：1)位于其中一种质粒上，而BTV VP5核苷酸序列(SEQ ID NO：2)位于分开的质粒上。BTV序列从每种质粒上的表达可以由(但不限于)CMV-IE启动子(人CMV或鼠CMV)来驱动。在每种质粒中，将聚腺嘌呤(polyA)序列信号(得自牛生长激素基因或者兔β珠蛋白基因，但是不限于这些基因)引入至BTV编码序列的3’末端。

可以希望从同一质粒表达BTV VP2和VP5，以确保BTV蛋白在同一细胞中的共表达。在这种情况下，构建类似于pLH2078.15(实施例8，图10)的质粒，其中痘病毒启动子已经被(但不限于)遍在真核启动子(例如人CMV-IE启动子)所替代。BTV VP2和VP5的表达需要由不同的启动子调控。将PolyA信号序列包含在每个BTV核苷酸序列的3’末端。

以Sambrook等人(1989)所描述的方式，通过乙醇沉淀来浓缩包含上文所述质粒的DNA溶液。用0.9％NaCl溶液来吸收所述DNA粒状沉淀，从而获得1mg/ml的浓度。通过用合适的无菌H₂O体积来吸收DMRIE-DOPE冻干物，从而制备0.75mM DMRIE-DOPE溶液。

通过用在0.9％NaCl中的1mg/ml DNA溶液以相等份额地稀释所述0.75mM DMRIE-DOPE溶液(1∶1)，从而形成质粒-脂质DNA复合物。借助于26G卷曲的针(crimped needle)，沿着装有阳离子脂质溶液的烧瓶的壁，逐步地引入所述DNA溶液，从而防止泡沫形成。一旦两种溶液相混合，就开始进行温和的搅拌。最后，获得包含0.375mMDMRIE-DOPE和500μg/ml质粒的组合物。

对于本文所描述的所有操作而言，希望所有溶液均在环境温度下使用。在对动物进行免疫接种之前，DNA/DMRIE-DOPE复合过程在环境温度下进行30分钟。

实施例13：使用重组金丝雀痘病毒来对绵羊进行疫苗接种

由位于CA西北部(无BTV感染的地区)的供应商处购得11只无角陶赛特(Dorset)羊羔(9只雄性，2只雌性)。在进行所述研究的整个过程中，这些动物都被饲养在不受昆虫侵扰的隔离设施中，并且在疫苗接种之前，通过竞争性ELISA证实，这些动物都不具有针对BTV的抗体。在大约13个月大的时候(11/22/05)，将其中6只羊羔各自用在PBS中稀释的大约1ml BTV-CP以SQ/IM方式进行接种(0.2ml未稀释的[10^9.5TCID₅₀/ml]vCP2289/绵羊＝～6.3×10⁸病毒颗粒)，而5只羊羔用表达西尼罗河病毒的preM和E蛋白的重组金丝雀痘病毒(vCP/WNV；Recombitek)来进行疫苗接种，其中所述重组金丝雀痘病毒是重构的，并且根据制造商的说明书进行施用。在22天后(12/14/05)，所有绵羊都用与初次免疫接种相同剂量的各自的疫苗构建体进行再次疫苗接种。将所述动物共同饲养，而不管疫苗类型。

实施例14：滴定抗BTV中和抗体

在细胞培养型96孔平板中，在添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中，以3的比例对于每种血清制备系列稀释。向0.05ml经稀释的血清中加入0.05ml包含大约100 CCIP₅₀/ml BTV的培养基。将该混合物在包含5％CO₂的气氛中在烘箱中于37℃温育2小时。

然后，向每种混合物中加入0.15ml含有大约100,000个细胞/ml的BHK-21细胞悬浮液。在包含5％CO₂的气氛中于37℃培养4至5天之后，通过相差显微镜观察致细胞病变效应(CPE)。采用

方法来计算每种血清的中和滴度。该滴度以抑制50％的孔中的致细胞病变效应的最大稀释度的形式给出。所述滴度以log10 VN₅₀表示。对于每种血清滴定至少2次，优选4次。

实施例15：绵羊的BTV感染以及样品收集

在第二次疫苗接种之后34天，通过皮下接种10^5.5TCID₅₀的BTV-17来对所有11只羊羔进行攻击。在接种后的3个星期中，每天都就蓝舌病的表现来对动物进行评价。在接种前以及在接种后3、6、9、13和16天(days post-inoculation，DPI)收集用于血液学的血液(收集在EDTA中)，以用于全血细胞计数(CBC)。在0、1、3、5、7、9、11、14和21 DPI时，收集血液样品(柠檬酸葡萄糖)，以用于病毒分离。在即将进行疫苗接种之前，每周一次从所有绵羊中收集血清(“Tiger Top”，血清分离器)。在攻击暴露于BTV后25天，将所有绵羊以人道方式安乐死。

实施例16：BTV病毒的分离

如先前所述的(Bonneau，Mullens等人2001；Bonneau，DeMaula等人2002；DeMaula，Leutenegger等人2002)，从绵羊全血中分离病毒。简而言之，在4℃下，将Vacutainer管以2,500G离心10分钟。倾析出血清并丢弃。将红/白细胞用5ml的无菌PBS(1x)洗涤1次，再次离心，并将细胞粒状沉淀重悬浮于等体积的无菌双蒸水(ddH₂O)中。将经洗涤/裂解的血细胞超声处理1-2分钟，然后在EMEM中进行稀释(10^-1至10^-4)，并将其接种(0.25ml/孔)至在24孔平板中的汇合的BHK-21单层上。当添加维持培养基时，将培养物在37℃下温育1小时。每天对培养物进行检测并持续10天，以及通过Reed和Münch的方法来测定病毒滴度。

实施例17：BTV-vCP2289重组ALVAC在绵羊中的免疫原性

在疫苗接种之前，通过竞争性ELISA和BTV-17微量中和测定法，所有绵羊对于BTV均是血清反应阴性的(数据未显示)。使用vCP/BTV表达载体进行疫苗接种的绵羊产生出针对BTV-17的中和抗体，而使用vCP/WNV进行免疫接种的那些绵羊则没有产生出所述抗体(参见下表3)。所有绵羊在疫苗接种后均保持健康并且未表现出副作用。

表3.BTV 17中和抗体的滴度

实施例18：使用BTV-CP进行免疫接种的绵羊在攻击后的保护作用

通过在攻击暴露于BTV-17后比较在用vCP/BTV vCP2289和vCP/WNV进行免疫接种的绵羊的血液中的BTV-17滴度，来评价vCP/BTV保护性地对绵羊进行免疫的能力。

表4.在用表达蓝舌病毒(vCP/BTV)或西尼罗河病毒(vCP/WNV)的外壳蛋白的重组金丝雀痘病毒进行免疫接种后，在用蓝舌病毒攻击的绵羊血液中的蓝舌病毒滴度

表4：在用表达蓝舌病毒(BTV-CP)或西尼罗河病毒(WNV-CP)的外壳蛋白的重组金丝雀痘病毒进行免疫接种后，在用BTV-17攻击的绵羊血液中的蓝舌病毒滴度

^*表示没有从50ul经洗涤和经裂解的血细胞中分离出病毒

结果(上表4)显示，对照绵羊(WNV-CP)在攻击后3天被BTV攻击主动感染。对照绵羊直至在攻击后21天(在此时实验结束)时仍持续表现出病毒血症。

由于在所述研究的21天的持续时间中，在经免疫接种的绵羊血液中不能检测出BTV，所以用BTV-CP疫苗进行免疫接种的绵羊在实验性攻击感染之后表现出强烈的对抗病毒血症的保护作用。所有6只经BTV-CP免疫接种的绵羊都对于烈性病毒攻击具有完全的抵抗力，这表明了所述疫苗的有效性。

实施例19：被BTV感染的绵羊的临床应答

下文提供了在用BTV-17进行攻击后使用BTV-CP(经疫苗接种者)和WNV-CP(对照)进行疫苗接种的绵羊的临床应答的比较：

1.体温(BT)。在攻击后的14天中，每天对所有6只用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊和所有5只对照(用WNV-CP进行免疫接种的)绵羊的体温进行监测。得自受攻击的绵羊的体温数据显示在下表5和图17中。所述数据显示，在对照中在攻击后第3天时平均BT升高～1℃，而在用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊中平均BT没有变化。在第6天时，在对照动物中观察到4℃温度尖峰(105℃)。这是受BTV感染的病毒血症动物的典型应答。经BTV-CP免疫接种的动物展现出与攻击前的动物没有显著偏离的正常温度。这些结果确证了疫苗(BTV-CP)的功效。

表5.BTV 17攻击温度数据

2.白细胞计数。在攻击后的16天中，在第0天并且以大约3天的间隔直至第16天，监测所有6只用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊和所有5只对照(用WNV-CP进行免疫接种的)绵羊的白细胞(WBC)计数。得自受攻击的绵羊的WBC数据显示在下表6和图18中。所述数据显示，在对照中，在直到攻击后第8天平均WBC最初略微降低，和在攻击后第9-16天平均WBC持续升高；而在用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊中，平均WBC没有变化。在攻击后延迟的WBC升高是受BTV感染的病毒血症动物的典型应答。经BTV-CP免疫接种的动物展现出与攻击前的动物没有显著偏离的正常WBC。这些结果确证了疫苗(BTV-CP)的功效。

表6.BTV 17攻击研究——WBC数据

3.淋巴细胞计数。在攻击后的16天中，在第0天并且以大约3天的间隔直至第16天，监测所有6只用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊和所有5只对照(用WNV-CP进行免疫接种的)绵羊的淋巴细胞计数。得自受攻击的绵羊的淋巴细胞数据显示在下表7和图19中。所述数据显示，在对照中，在直到攻击后第8天平均淋巴细胞计数最初略微降低，和在攻击后第9-16天平均淋巴细胞计数持续升高；而在用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊中，平均淋巴细胞数目没有变化。在攻击后延迟的淋巴细胞计数升高是受BTV感染的病毒血症动物的典型应答。经BTV-CP免疫接种的动物展现出与攻击前的动物没有显著偏离的正常淋巴细胞计数。这些结果确证了疫苗(BTV-CP)的功效。

表7.BTV 17攻击研究——淋巴细胞数据

4.血小板计数。在攻击后的16天中，在第0天并且以大约3天的间隔直至第16天，监测所有6只用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊和所有5只对照(用WNV-CP进行免疫接种的)绵羊的血小板计数。得自受攻击的绵羊的血小板数据显示在下表8和图20中。所述数据显示，在对照中，在直到攻击后第8天血小板计数最初降低，和在攻击后第9-16天平均血小板计数持续升高。在用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊中，在所述研究的整个过程中血小板逐渐升高。在用BTV-CP进行疫苗接种的绵羊中，在所述研究的整个过程中血小板计数均比对照高。在攻击后血小板计数降低是受BTV感染的病毒血症动物的典型应答。经BTV-CP免疫接种的动物展现出正常的血小板计数。这些结果确证了疫苗(BTV-CP)的功效。

表8.BTV血小板计数

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至此，已经详细描述了本发明的优选实施方案，应当理解，由所附权利要求书所定义的本发明并不局限于上述描述中所列出的具体细节，因为其许多明显的变化形式也是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

公开内容的概要

本发明涉及免疫原性或疫苗组合物，其用于在对BTV感染易感的动物中诱导针对环状病毒(更具体地，蓝舌病毒(BTV))的免疫应答或保护性免疫应答。所述组合物可以包含制药学或兽医学上可接受的运载体或赋形剂以及载体。所述载体可以包含异源核酸分子，并在所述动物体内表达BTV抗原、免疫原或其表位，例如BTV VP2；BTV VP2和VP5；BTV VP2和VP5和VP3和/或VP7。所述组合物可以包含佐剂，例如卡波姆。本发明还考虑了用于制备和使用此类组合物的方法，其包括初激-加强方案以及包括鉴别诊断。

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Claims (30)

1.用于在易患环状病毒疾病的动物中诱导针对环状病毒属病毒(0V)的免疫应答的免疫原性组合物，其包含载体，所述载体包含编码并在所述动物体内表达环状病毒外部和/或内部衣壳蛋白、多肽和表位的重组病毒或DNA质粒。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述环状病毒外部衣壳多肽为VP2、VP5及其遗传同源物；并且其中所述环状病毒内部衣壳多肽为VP7、VP3及其遗传同源物。

3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述环状病毒为蓝舌病毒(BTV)。

4.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述重组病毒为重组腺病毒、疱疹病毒或痘病毒。

5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述重组病毒为重组痘病毒。

6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述重组痘病毒为重组禽痘病毒。

7.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述重组禽痘病毒为金丝雀痘病毒。

8.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述金丝雀痘病毒为ALVAC。

9.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述重组病毒或DNA质粒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码VP2，VP5，VP2和VP5，VP3，VP7，VP3和VP2和VP5，VP7，VP2和VP5，VP3和VP7和VP2和VP5的ORF。

10.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述重组病毒或DNA质粒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码VP2和VP5，VP2，VP5，VP3，VP7的ORF。

11.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述重组病毒或DNA质粒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码多肽VP2和V5，VP2，VP5，VP3，VP7的ORF。

12.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含编码BTV VP2的核苷酸(SEQ ID NO：3)；以及权利要求1的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含编码BTV的核苷酸(SEQ ID NO：4)。

13.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含编码BTV VP 2的核苷酸，并且其中所述核酸分子包含编码BTV VP2的经密码子优化的核苷酸(SEQ ID NO：1)；以及权利要求1的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含编码BTV VP5的核苷酸，并且其中所述核酸分子包含编码BTV VP5的经密码子优化的核苷酸(SEQ ID NO：2)。

14.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

15.权利要求14的免疫原性组合物，其中所述佐剂为卡波姆。

16.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含：所述动物的除了BTV之外的其他病原体的抗原或免疫原或其表位；或者载体，所述载体包含并在所述动物体内表达编码所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子；或者所述动物的灭活或减毒的除了BTV之外的其他病原体。

17.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述动物为羊类动物、牛类动物、猫类动物或马类动物。

18.用于在动物中诱导针对BTV的免疫学或保护性免疫应答的方法，其包括向所述动物施用权利要求1的免疫原性或疫苗组合物。

19.用于在动物中诱导针对BTV的免疫学应答的方法，其包括向所述动物施用权利要求18的免疫原性或疫苗组合物。

20.权利要求19的方法，其中所述佐剂包括卡波姆佐剂。

21.用于在动物中诱导针对BTV和针对所述动物的另一种病原体的免疫学应答的方法，其包括向所述动物施用权利要求20的免疫原性组合物。

22.用于在动物中诱导针对BTV的免疫学应答的方法，其包括向所述动物施用(a)权利要求1的免疫原性组合物，和(b)分离的BTV抗原、免疫原或其表位，其中在初激-加强方案中在(b)之前施用(a)，或者在初激-加强方案中在(a)之前施用(b)，或者将(a)和(b)顺次地或以混合形式一起施用。

23.权利要求18、21或22中任一项的方法，其中所述动物为羊类动物、牛类动物、猫类动物或马类动物。

24.鉴别诊断方法，其包括：向动物施用权利要求1的免疫原性组合物，和/或BTV抗原、免疫原或表位；以及就不由所述免疫原性或疫苗组合物所表达的或不作为所述BTV抗原、免疫原或表位进行施用的BTV蛋白或其抗体的存在或不存在来测试所述动物。

25.权利要求24的方法，其中所述动物为羊类动物、牛类动物、猫类动物或马类动物。

26.用于施行权利要求24的方法的试剂盒，其包含：在分开的容器中的(a)和(b)；以及可选地，关于混合和/或施用的说明书。

27.用于施行权利要求25的方法的试剂盒，其包含：在分开的容器中的所述免疫原性组合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和用于就所述BTV蛋白的存在或不存在进行测试的测定法；以及可选地，关于施用所述免疫原性或疫苗组合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和/或关于施行所述测定法的说明书。

28.试剂盒，其包含：(a)权利要求1的免疫原性组合物；和(b)所述动物的除了BTV之外的其他病原体的抗原或免疫原或其表位，或者载体，所述载体包含并在所述动物体内表达编码所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子，或者所述动物的灭活或减毒的除了BTV之外的其他病原体，其中(a)和(b)在分开的容器中，并且所述试剂盒可选地包含关于(a)和(b)的混合和/或施用的说明书。

29.权利要求26或28的试剂盒，其中所述动物为猫类动物或马类动物。

30.质粒，其编码并在对蓝舌病毒易感的动物体内表达BTV VP2；BTV VP5；BTV VP2和VP5；BTV VP3，BTV VP7，BTV VP2和VP5和VP3，BTV VP2和VP5和VP7。

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