CZ20014392A3 - Vakcína AND pro domácí a sportovní zvířata - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vakcin ADN přizpůsobených pro domácí a sportovní zvířata, obzvláště oři psy, kočky a koně.

Dosavadní stav techniky

Využití molekul desoxyribonukleové kyseliny (ADN) k vakcinaci je známo už od 90. roku (Wolf a kol., Science 247 str. 1465 až 1468, 1990). Tento způsob vakcinace zavádí imunizaci buněčnou a humorální pro transfekci in vivo buněk vakcinovaného subjektu molekulami ADN nebo ARN kódujícími a expresujícími aktivní imunologicky působící proteiny.

Vakcinu ADN tvoří alespoň jeden plasmid, který může být expresován buněčným mechanismem vakcionovaného subjektu a farmakologicky vhodný nosič nebo excipient. Nukleotidová sekvence tohoto plasmidu kóduje nebo expresuje jeden nebo několik imunogenú, jako jsou proteiny nebo glykoproteiny. schopných vyvolávat ve vakcínovaném subjektu buněčnou imunitní odezvu (mobilizaci lymfocytů T) a humorální (stimulaci produkce protilátek specificky zaměřených proti ímunogenu) (Davis H.L., Current Opinion Biotech. 8, str. 635 až 640, 1997).

Všechny imunogeny, pocházející z patogenu, nejsou dosatatečně přírodně účinnými protilátkami k vyvolání optimální imunitní ochranné odezvy ve zvířeti určenému k vakcinaci. Je tedy nutno imunitní odezvu zlepšit.

Každý způsob podávání přináší své vlastní překážky a obtíže; tak vakcina ADN účinná při jednou druhu podání může být neúčinná při jiném gruhu podání.

• * · · · · • · β · · · • · · « • * · · « • · · « ········ ··

Volba způsobu podání musí vsít v úvahu potřeby ošetřujícího a chovatelů a potíže související s komfortem zvířat a s povahou produktu.

Jakkoliv se může používat intramuskulárního způsobu, představuje subkutánní způsob velkou výhodu pro vakcinaci domácích zvířat, především zvířat ných.

menšího vzrůstu a obtížně ovládatelVakciny ADN je proto třeba vylepšit, aby umožňovaly účinné podán í různým i způsoby.

Vakciny ADN byly již experimentálně ověřeny, obzvláště uakcina ADN kódující hemagglutinin (HA) viru červenky (Etchar a kol., J. Gen. Virol. 78, str. 1577 až 1580, 1997), jehož intranasální podávání u myší se ukázalo jako účinnější než podání orální. Jiným příkladem je vakcina ADN kódující protein obalu (Env) víru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV), jehož subkutánní podání nebylo účinné ve srovnání s intramuskulárnim podáváním (Ishii a kol., AIDS Res. Hub, Retro. 13, str. 1421 až 1428, 1997).

Vakcin ADN bylo také experimentálně využito u viru zvířat, sajměna proti viru nemoci Carreovy nemoci (CDV). O některých imunogenech CDV je známo, že chrání hlavně proti nukleokapsidu (N), proteinu matrice (M) proteinu fúse (F) a hemagglutininu (HA) (W0-A-97/41236). Subkutánní podávání vakciny ADN, kódující hemagglutinin a fúzní protein CDV, neumožnilo zjistit produkci protilátek u myší a mimořádně slabou produkci protilátek po intramuskulárním podáváníní této vakciny ADN (Sixt a kol., J. Virol. 7Í sts

8472 až 8476, 1998),

Vyvolání imunitní odezvy a poměrů mezi různými prvky imunitního systému zprostředkovaných při této odezvě mohou být u jednotlivých druhů zvířat různé. Četné poznatky ze zkušeností f unkce přímo že je získaných na myších modelech umožnily lepší poznání imunitního systému u myší, avšak tyto poznatky nejsou převeditelné na jiné druhy živočichů, zejména proto, snazší vyvolat imunitní odezvu u myši než u jiných druhů živočichů (van Drunen Little-van den Hurk a kol., J. Gen. Virol. 79, str. 831 až 839, 1998; Bohm a kol., až 954, 1998).

Vaccine 16, str. 949

Byly navrženy různé druhy podávání vakciny ADN (intraperitoneální, intravenozní, intramuskulární , subkutánní, intradermální a sliznícové). Byly též navrženy různé prostředky podání, jmenovitě zlatými částicemi obalenými ADN a vstřelovánými k proniknutí do buněk kůže vakcionovaného subjektu (Tang a kol., Nátuře 356, str. 152 až 154, 1992) a ínjektory tryskání kapaliny, umožňující proniknout najednou do buněk kůže a do buněk podkožních tkání (Furth a kol., Analytical Bioch. 205, str. 365 až 368, 1992).

K transfekci ADN in vitro se používá chemických sloučenin:

A) Kationtové lipidy

Kat iontové lipidy jako takové se dělí do čtyř podskupin·'

1) Kationtové lipidy obsahující kvarterní anoniové soli, jako je například DOTKÁ (dioleoyloxypropyltriaethylaffloniua, produkt

Gibco pod názvem Lipofektin) -encyloxy)-1 -propanamoni um;

DOTAP (trimethyl-2,3-(oktadec-9Gregoriadis a kol., FEBS Letters 402, str. 107 až 110, 1997), DMRIE (N-(2-hydroxyethyl)-N.N-dimethyl-2,3-bis(tetradecy1oxy)- 1 -propanamoni um; WO-A-96/34109), DLRIE (N-(2-hydroxyethyl)-N,N-di methyl-2,3-bis~( dodecyloxy)- 1 -propanamoninua; Felgner a kol. , Ann. N Y Acad, Sci, 772, str. 126 až 139. 1995).

Tyto kationtové lipidy obsahující kvarterní amoniov soli • · · · · • · · * »»······ ·· mohou být popřípadě spojeny s doplňujícím neutrálním lipidem, jako je DOPC (díoleoylfosfátidylcholin) nebo DOPE (dioleoylfosfatidylethanolamin) (Behr. J.P., Bioconjugate Chemístry 5, str. 382 až 389. 1994).

2) Lipoaminy, jako například DOGS (dioktadecy1amidoglycy1spermin, produkt Promega pod označení» Transfectam; Abdallah a kol., Biol. Cell. 85, str. 1 aá 7, 1995). DC-Chol (dimethyla®inoethankarbamoylcholesterol Gao a Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, str. 280 aá 285. 1991), BGSC (bisguanidinspermidincholesterol), BGTC (bisguanidintrencholesterol) CVigneron a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, str.9682 až 9686, 1996).

3) Kationtové lipidy obsahující kvartemí aaoniové soli a lípoasiny, jako například DOSPA (N,N-dimethy1 -N-(2-sper»inkarboxamido)ethyl)-2,3-bis(dioleoyloxy)-1-propanimidiumpentahyd rochlorid, obchodní produkt LipofectAmin^R společností Gibco; Hawley-Nelson a kol., Focus 15, str.73 až 79, 1993), GAP-DLRIE ( N- ( 3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium; Wheeler a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 93, str. 11454 aá 1Í459, 1996); Norman a kol., Vacine 15, str. 801 až 803, 1997).

4) Lipidy obsahující amidinové soli, jako například ADPDE, ADODE (Ruysschaert a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, str. 1622 až 1628, 1994).

B) Polymery jako je například SuperFect™ (aktivované molekuly dendrimerů, produkt Quiagen; Xu a kol., Mol. Genet. Metab. 64, str. 193 až 197, 1998) a

C) Biochemická činidla, jako jsou například toxiny, svláště toxiny cholerové.

Některých z těchto sloučenin bylo použito ve formulaci vakcin ADN s výsledky více neš průměrnými. Poznatky transfekce in vitro nejsou přenositelné na vakcinaci ADN, kde konečným účelem je zaručit imunitní ochrannou reakci. Negativní účinky při zavádění účinné imunitní ochrany se také konstatovaly s prostředky o nichž je známo, že podporují transfekci in vitro. Některé chemické složky prostředků jsou ve velkých dávkách pro transfektované buňky toxické.

V již citovaných Etchartových publikacích (Etchart a kol., J. Gen, Virol. 78, str. 1577 až 1580, 1997), nemělo použití DOTAPu účinek adjuvantu při podání vakciny ADN intranasálním způsobem jako při podáni orálním, DOTAPu bylo také použito ve vakcínách ADN kódujících heaagglutinín (HA) chřipkového viru na modelu myši s podání nasálním (Ban a kol., Vaccine 15, str. 811 až 813, 1997), avšak přísada DOTAPu inhibovala imunitní odezvu. Použití DC-Chol nebo DOTAP/DOPE ve vakcínách ADN, kódujících povrchový protein (S) viru hepatitidy typu B, na myším modelu s intramuskulárním podáním umožňovalo zvýšit odezvu v proti 1átkách, zatímco použití Lipofektinu (nebo DOTMA) tuto odezvu nezvyšovalo (Gregoríadis a kol.. FEBS Letters 402, str. 107 až 110, 1997), DC-Chol/DOPE se také požilo ve vakcínách ADN proti viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV, protein Env) na myším modelu, kde intramuskulární podání vyvolávalo účinnější imunitní odezvu, přičemž sufakutánní a intradermální podání ji nezvyšovalo (Ishil a kol.., AIDS Res. Hum. Retro, 13, _-r.

1997).

Rovněž v patentovém spise číslo WO-A-98 40499 se navrhuje realizovat komplexy nukleové kyseliny s kationtovými lipidy ke transfektováni sliznicového epitelu savců pro genovou terapii nebo expresi antigenu určeného k vyvolání imunitní odezvy. Tento dokument navrhuje slíznicové podání inhalací, například plicním epitelem. Autor upřesňuje, že výsledky se liší od dřívějších prací. Dodává, že pro intramuskulární podání (pa€>

renterální) je samotná ADN účinnější než směs ADN + lipid.

Přidávání některých cytokinů, zejména interleukinu nebo interferonů může dovolovat zlepšení imunitní odezvy vyvolané obzvláště vakcinami ADN. Každý cytokin spouští reakcí, která je mu vlastní a orientuje více méně imunitní odezvu na odezvu buněčnou nebo humorální (Pasquini a kol., Iaaunol. Cell. Biol. 75, str. 397 až 401, 1997; Kin a kol., J. Interferon Cytokine Res. 19, str. 77 až 84, 1999). Adjuvantní účinky cytokinů, pocházejícího z daného druhu, nejsou nutně stejné, jestliže se imunitní kontex mění, jmenovitě je-li tento cytokin podáván jinému druhu, tedy do systému imunitně heterogenního. Podávání cytokinů nemusí mít rovněž žádný adjuvantní účinek, případně se muže zvrtnout na účinek opačný než je žádoucí, tedy na snížení nebo inhibici imunitní odezvy. Podobně vakcina ADN, kódující jednoduchý řetězec imunoglobulinu fúzovaného s GM-CSF nezvyšuje imunitní odezvu, ačkoli přímé podávání tohoto fúzního proteinu u myší je účinné, stejné jako je podávání fúzního proteinu tvořeného Fv a cytokinem IL-lp nebo podávání vakciny ADN kódující tento fúzní protein (Hakim a kol. 3. Immunol. 257, str. 5503 až 5511, 1969). Použití plasmidů společně expresujícíh cytokin IL-2 a protein obalu viru hepatítidy typu B ve fúzované nebo nefúzované formaci vede ke zvýšení humorální a buněčné imunitní odezvy (Chov a kol., 3. Vi rol. 71, str. 169 až 78, 1997). Avšak použití biscistronického plasmidu, kódujícího glykoprotein gp 120 viru získané lidské imunitní nedostaečnosti (HIV-1), a cytokinů IL-2 vyvolává specifickou ímunitní odezvu anti-gp 120 slabší, než je odezva získaná použitím monocistronickébo plasmidu, kódujícího výhradně gp 120 íBarouch a kol., 3. Immunol, 161, str. 1875 až 1882, 1998). Společná injekce do myši dvou expresních vektorů, jednoho kódujícího glykoprotein G viru vztekliny, druhého pro myší GM-CSF, stimuluje aktivitu lymfocytů B a T, zatímco společná injekce s plasmídem kódujícím interferon gama (místo myšího GM-CSF) má za následek snížení imunitní odezvy (Xiang a kol..

• ·

·. · · • · • · · ’

Immunity 2, str. 129 až 135. 1995).

Některé modifikace na antigenů, jako jsou vypuštění jedné části nukleotidové sekvence kódující antigen, začlenění fragmentu ADN do nukleotidové sekvence kódující antigen nebo do nepřeložené oblasti dopředu nebo dozadu mohou rovněž zlepšit účinnost vakcin ADN, obzvláště zlepšením úrovně exprese antigenů nebo jeho prezentace.

V praxi však mohou manipulace v oblasti nuekleotidní sekvence kódující antigen přinést snížení nebo ztrátu počáteční imunologické aktivity. Podobně vypuštění transmembránové domény v genu kódujícím antigen G viru vztekliny snížilo míru ochrany u myšího modelu po podání intramuskulární cestou vakciny ADR kódující modifikovaný antigen (Xiang a kol., Viro. 209, str. 569, 1995). Vypuštění transmembránové domény v genu kódujícím glykoprotein gD víru hovězího herpes (BHV) nedovolilo zvýšit proti 1átkovou odezvu a vyvolalo jen částečnou ochranu u dobytka vakcionovaného intramuskulární cestou (van Drunen Líttle van de Hurk a kol., J. Gen. Virol. 79, str. 831 až 839, 1998). Humorální a buněčné imunitní odezvy a udělená ochrana jsou stejné u zkoušených morčat poté, když byla imunizována pomoci buď vakciny ADN kódující glykoprotein GP viru Ebola, nebo pomocí vakciny ADN kódující tento glykoprotein GP avšak v sekretované formě (Xu a kol.. Nátuře Medícine 4, str. 37 až 42, 1998).

Začlenění signální sekvence lidského tkáňového aktivátoru plasminogenu (anglicky human tissue Plasmínogen Activator ou human tPA) do genu kódujícího antigen Pf332 malárie neumožnilo zvýšit odezvu protilátek u myší vakcinovaných intramuskulární cestou (Haddad a kol,, FEMS 18, str. 193 až 202, 1997). Přísada fáze sekvence tPA do genu kódujícího antigen VP7 myšího rotaviru rovněž nedovolila 2výšit odezvu protilátek u myší vakcionovaných inbradermální četou, když fúzní protein vy8 • · tvořený antigenem VP4 a tPA toto zvýšení umožnil, avšak bez zavedení účinné ochrany (Choi a kol., Virology 250, str. 230 až 240, 1998).

Modifikace provedené na nukleotidové sekvenci antigenu se nemohou obecně přímo přenášet na jiný antigen, jelikož antigeny nemají vždy stejné strukturální uspořádání.

Úkolem vynálezu je zlepšit účinnost vakcinace ADN. Hlavně se má dosáhnout lepší imunitní odezvy a zejména účinné ochrany u domácích a sportovních zvířat, jmenovitě psů, koček a koní vakcinaci ADN různými cestami podání a zejména cestou subkutánn í.

Úkolem vynálezu je vytvořit zlepšené vakcíny ADN vyvolávající imunitní účinnou a ochrannou odezvu proti viru Carreovy nemoci (CDV), viru dýchacího komplexu a kašle (virus parachřipky-2 nebo CPI-2), psího viru herpes (CHV-l) u psů.

Úkolem vynálezu je vytvořit zlepšené vakcíny ADN vyvolávající imunitní účinnou a ochrannou odezvu proti kočičímu viru herpes (FHV-Í) u koček.

Úkolem vynálezu je vytvořit zlepšené vakcíny ADN vyvolávající imunitní účinnou a ochrannou odezvu proti koňskému viru herpes typu 1 (EHV-1), koňskému viru herpes typu 4 (EHV-4) u kon í .

Úkolem vynálezu je také vytvořit zlepšené vakcíny ADN umoěňující získat účinnou ochranu u psů zahrnující alespoň jednu účinost v souboru zahrnujícím virus CDV, virus CPI-2, virus CHV-l, virus vztekliny (rhabdovirus). psí parvovirus (CPV), psi coronavirus (CCV) a Borrelia burgdorferi.

Úkolem vynálezu je vytvořit zlepšené vakcíny ADN umožňu9 • · • · · · ···· jící získat účinnou ochranu koček zahrnující alespoň jednu liči nnost v souboru zahrnujícím kočičí virus herpes (FHV-1), kočičí kalicívirus (FCV), virus vztekliny (rhabdovirus), nakažlivý kočičí virus (FPV), virus infekční kočičí infekční perítonitidy (FIPV), virus kočičí leukemie (FeLV) a virus kočičího syndromu získané imunitní nedostatečnosti (FIV).

Úkolem vynálezu je také vytvořit zlepšené vakciny ADN umožňující získat účinnou ochranu koní zahrnující alespoň jednu účinnost v souboru zahrnujícím koňský virus herpes typu 1 (EHV-1), koňský virus herpes typu 4 (EHV-4) chřipky, virus koňské východní encefalitidy, encefalitidy, kozské venezuelské encefalitidy, ny, Clostrídium tetani a Borrelia burgdorferi.

virus koňské koňské západn í virus vztekliÚkolem vynálezu jsou zlepšené vakciny ADN umožňující získat účinnou ochranu proti alespoň jednomu patogenu infikujícímu domácí a sportovní zvířata, zejména psy, kočky a koně. Vakcina ADN je zlepšována: buď formulací, nebo přísadou GM-CSF, nebo optimalizací antigenu nebo antigenů, nebo kombinací těchto opatření.

S výhodou je vakcina ADN zlepšována formulací a případně buď přísadou GM-CSF, nebo optimalizací antigenu nebo antigenů, nebo přísadou GM-CSF a optimalizací antigenu nebo antigenů.

Podle definice obsahuje vakcina ADN jako účinnou látku plasmid kódující a expresující gen nebo fragment genu. Pojmem plasmid je míněna transkripční jednotka ADN obsahující polynukleodovou sekvenci, obsahující sekvenci genu k expresi a prvky potřebné k jeho expresi in vivo. Přednost se dává cirkulační formě plasmidů popřípadě superzavinuté. Do rámce vynálezu spadá také lineární forma.

Každý plasmid představuje promotor schopný zaručit v hos10 • ·

titelských buňkách expresi insertovaného genu na něm závislého. Obecně jde o silný eukaryotický promotor a obzvláště předčasný promotor cytomegalov iru CMV-IE, lidského nebo myšího původu nebo také případně jiného původu, jako je krysí nebo morčatový. Obecněji je promotor buď vírového nebo buněčného původu. Jako virový promotor, jiný než CMV-IE, se uvádí předčasný nebo zpožděný viru SV40 a promotor LTR viru Rousova sarkomu. Může jít také o promotor viru, z něhož pochází gen, například čistě promotor genu. Jako buněčný promotor je možno uvést promotor genu cytoskeletu. jako je například promotor desmi nu nebo také promotor aktinu. Jelikož je v tomtéž plasmidu obsaženo více promotorů, mohou se vyskytovat v téže transkrípční jednotce nebo ve dvou různých jednotkách.

Především se vakcíny ADN podle vynálezu formulují přísadou adjuvantu, kationtových lipidů obsahujících kvarterní amoniovou sůl, zvláště DMRIE, spojenou výhodně s neutrálním lipidem, zvláště DOPE k vytvoření s výhodou komplexu DMRIE-DOPE.

Podstata vynálezu

Vakcina ADN proti pathogenu postihujícímu domácí zvířata nebo zvířata sportovní, jmenovitě psy, kočky nebo koně, sestává podle vynálezu z plasmidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující imunogen pathogenu uvažovaného druhu zvířat za podmínek umožňujících expresi in vivo těchto sekvencí a z kationtového lipidu obsahujícího kvarterní amoniovou sůl obecného vzorce

CHz

Rí-O-CH3-CH-CH3-N* - Rs-X

ORi CH₃ kde znamená

Rí alifatickou, lineární skupinu nasycenou nebo nenasycenou • · • · • · s 12 až 18 atomy uhlíku.

Ra jinou alifatickou skupinu se 2 až 3 atomy uhlíku a X skupinu hydroxylovou něho asinoskupinu, přičemž lipidem je s výhodou N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecy1oxy)- 1 -propanasoni um (DMRIE) .

Lipidem je tedy s výhodou N-(2-hydroxyethyl)-N, N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaffloniuB (DMRIE) (WO-A-96/ 34109), zvláště spolu s neutrálním lipidem, především s dioleoylfosfatidylethanolaffiinea (DOPE), tedy DMRIE-DOPE.

S výhodou se směs rekombinantního vektoru s tímto adjuvantem připravuje improvizovaným způsobem a před aplikací zvířeti se doporučuje ponechat takto sestavené směsi čas na vytvoření komplexu, například 10 až 60 minut, zvláště přibližně 30 minut.

V takové směsi je výhodný molární poměr DMRIE:DOPE 95:5 až 5=95, zvláště 1:1. Hmotnostní poměr plasmid:adjuvant DMRIE nebo DMRIE:DOPE může být 50=1 až 1 = 10, zvláště 10:1 až 1^;5. s výhodou 1:1 až 1:2.

Vynález se také týká vakcín obsahujících GM-CSF (anglicky Granulocyte aacrophage-colony stimulating factor: Clark S.C. a kol., Science 230, str. 1229, 1987: Grant S.M. a kol., Drugs 53, str. 516, 1992). přičemž set začleňuje protein GM-CSF přímo do vakcinačního prostředku, nebo se s výhodou začleňuje sekvence kódující GM-CSF do expresním vektoru za podmínek utnožňujících jeho expresi ín vivo. Jako expresního vektoru se doporučuje použít plasmidu, například plasmidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující příslušný antigen nebo antigeny nebo jiný plasmid. GM-CSF se volí v závislosti na druhu zvířete určeného k vakcinaci; pro psy se použije psí GM-CSF, pro kočky kočičí GM-CSF a pro koně koňský GM-CSF.

Vynález se také týká nukleotidové sekvence kódující íraunogeny v optimalizované formě. Pod pojmem optima1 izovaný se míní celá modifikace nukleotidové sekvence, projevující se alepoň zvýšenou hladinou exprese této nukleotidové sekvence, zvýšením stability mediátoru ARN kódujícího tento antigen, vysekrecf vyvolanou antigenem v extrabuněčném prostředí a zvyšující přímo nebo nepřímo vyvolanou imunitní odezvu.

Podle vynálezu je optimalizace sledovaného antigenu založena na preferenci delece fragmentu z nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu příslušného antigenu (delecí se míní úplná delece nebo částečná delece postačující k tomu, aby transmembránová doména jíž nebyla nebo v podstatě jíž nebyla funkční) aZnebo na přidání do fáze jedné nukleidové sekvence kódující signál tPA (anglicky tíssue plasminogen activator; Montgomery a kol,, Cell. Mol. Biol. 43, str. 285 až 292, 199?; Harris a kol.. Mol. Biol. Med 3, str. 279 až 292, 1986) a/nebo na začlenění intronového stabilizátoru na horní konec expresovaného genu. Delece fragmentu ADN, kódující transmembránovou doménu příslušného antigenu, podporuje sekrecí do extracelulární ho prostředí takto zkomolených antigenu a tím zvyšuje možnost styku s buňkami imunitního systému. Začlenění nukleotidové sekvence, kódující signál tPA, usnadňuje transdukci mediátoru ARN, ke kterému je signál tPA připojen, a zvyšuje tak hladinu exprese tohoto mediátoru ARN a tedy produkci antígenů, Signál tPA má význam také v sekreci syntetizovaného antigenu. Inzerce intronového stabilizátoru do genu, kódujícího příslušný antigen, se vyhýbá odchylné episáže jeho mediátotoru ARN a zachovává jeho fyzickou celistvost.

S výhodou je signál tPA lidského původu. Nukleotidová sekvence signálu lidského tPA je dosažitelná v databázi genové banky pod číslem NM-000930. Intronem je s výhodou intron II genu králičího β-glóbi nu (van Ooyen a kol., Science 206, str. 337 až 344, 1979), jehož nukleotidová sekvence je dosažitelná

• · ···· · · · · v databázi genové banky pod číslem V00882 jako intron č. 2.

Vynález se týká zlepšené vakciny ADN schopné vyvolávat imunitní účinnou a ochrannou odezvu u psů proti viru Carreovy nemoci (anglicky Canine Distemper Virus CDV), Virus Carreovy nemoci je MorbiIivirus, člen rodiny Paraayxoviridae. Tento virus napadá psy ale také divoké kočky (Harder a kol., J. Gen. Virol.77, str, 397 až 405, 1996),

Vynález se týká účinné vakciny ADN chránící před Carreovou nemocí psů především podávané subkutánní cestou, která je dosud cestou vyvolávající okrajovou míru ochrany (Sixt a kol.. J. Virol. 72, str. 8472 až 8476, 1998).

Podle vynálezu je vakcina ADN proti CDV s výhodou zlepšena svou formulací s adjuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE s výhodou s DMRIE-DOPE. Případně může být kombinována buď přísadou psí GM-CSF (Nash a kol,, Blood 78, str. 50 až 56, 1991) nebo optimalizací alespoň jedním antigenem CDV. nebo přísadou psí GM-CSF a optimalizací alepoň jedním antigenem CDV .

Nukleotidová sekvence kódující psí GM-CSF je dostupná v databázi GenBank pod číslem S49738.

Přísadu psího GM-CSF lze uskutečnit začleněním polypeptidu GM-CSF do vakcinačního prostředku nebo s výhodou začleněním nukleotidové sekvence, kódující psí GM-SCF, do expresního vektoru in vivo, s výhodou do plasmidu. Nukleotidová sekvence, kódující psí GM-CSF, je s výhodou začleněna do druhého expresního plasmidu, odlišného od plasmidu (nebo plasmidu). ve kterých je (nebo jsou) začleněny geny kódující antigen nebo antigeny CDV.

K optimalizaci antigenů, pocházejících z CDV, dochází • ·

substitucí signální sekvencí, jmenovitě signálu tPA lidského původu (číslo v genové bance NM-000930), sekvence signálního peptidu hemaglutini nu (HA) a/nebo fúzního proteinu (F) a/nebo vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu HA a/nebo F a/nebo začleněním intronu, jmenovitě intronu II genu králičího 0-globinu (jehož nukleotidová sekvence, pojmenovaná intron č.2 je dostupná v databázi genové banky pod číslem V00882) na začátku nukleotidová sekvence kódující HA a/nebo F. Vakcina ADN proti CDV podle vynálezu může tedy kódovat a expresovat samotný antigen CDV optimalizovaný HA a/nebo F.

Optimálně může být sekvence kódující matricový (ií) protein CDV v nativní formě (bez modifikace) a/nebo nukleotidová sekvence kódující nuk1eoproteiη (N) CDV v nativní formě (bez modifikace) rovněž začleněna a expresována do plasmidu a napojena na plasmidy obsahující optimalizovaný HA a/nebo optimalizovaný F.

Nukleotidové sekvence kódující antigeny CDV, použitelné podle vynálezu, a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech a v patentovém spise WO-A 98/ 03199 a zejména v příkladech 8 a 9 a na obr. 2 a 3.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti CDV pro podání intramuskul ární cestou formulována s DříRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu (například pNS024, obr. 4) kódujícího antigen HA CDV optimalizovaného substitucí signální sekvence HA peptídovou signální sekvencí lidské tPA, vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu HA a začleněním intronu II králičího genu β-globinu na začátek genu HA a ze druhého expresního plasmidu (například pNS021. obr. 3) kódujícího antígen F optimalizovaného CDV vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu a začleněním intronu II králičího genu β-globinu na začátek genu F.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti CDV pro podání subkutánní cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající 2 expresního plasmidu kódujícho psí GM-CSF a se dvou shora definovaných plasmidú (například pNS024 a pNS021).

Vynález se týká také zlepšené vakciny ADN schopné vyvolat účinnou imunitní a ochrannou odezvu u psa proti potížím komplexu dýchacího systému (psího viru parachřipky-2 nebo CPI-2).

Virus CP-2 je Paramyxovirus, rovněž člen rodiny Paramyxoviridae (Bittle a kol., J. A. Vet. Med. Assoc, 156, str. 1771 až 1773, 1970; Moloney a kol., Aust. Vet. J. 62, str. 285 až

286, 1985).

Přednostně se vakcina ADN proti CP-2 formuluje s adjuvantea podle vynálezu, jmenovitě s DMRIE v výhodou s DMRIE-DOPE. Může být popřípadě kombinována bud s přísadou psí DM-CSF nebo optimalizována alespoň jednním antigenem CPI-2, nebo přísadou psího GM-CSF a optimaližací alespoň jedním antigenem CPI-2.

Psí GM-CSF se může přidávat stejně jako je popsáno pro CDV.

K optimalizaci antigenú, pocházejících z CPI-2, dochází substitucí signální sekvencí, zvláště sekvencí tPA lidského původu, signální sekvencí peptidu hemaglutininu (HN) CPI-2 a/nebo fúzního proteinu (F) CPI-2 a/nebo vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu HN a/nebo F a/nebo insercí intronu, zvláště intronu II genu králičího fJ-globinu na začátek nukleotidové sekvence kódující HN a/nebo F. Vakci na ADN proti CPI-2 podle vynálezu může tedy kódovat a expresovat samotný antigen CPI-2 optimalizovaný HN a/nebo F.

Nukleotidové sekvence, kódující antigeny CPI-2, použitelné podle vynálezu, a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti CPI-2 pro podání intramuskulární cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu (například pSB034, obr. 6) kódujícího antigen HN CPI-2 optimalizovaného insercí signální sekvence lidské tPA místo signální sekvence HN, vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu a insercí intronu II králičího genu β-globinu na začátek HN a ze druhého expresního plasmidu (například pSB032, obr. 5) kódujícího antigen F optimalizovaného CPI-2 vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu F a začleněním intronu II genu králičího 0-globinu na začátek genu F.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti CPI-2 pro podání subkutánní cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu kódujícho psí GM-CSF a dva shora definovanmé plasmidy (například pSB034 a pSB032).

Vynález se týká také zlepšené vakciny ADN, schopné vyvolat účinnou imunitní a ochrannou odezvu u psa proti psímu viru herpes typ 1 (HV-1).

Virus CHV-1 je členem rodiny Alphaherpesvírínae. Tento virus je zodpovědný za virový zánět nosu a průdušnice psu. Nukleotidové sekvence, kódující glykoprotein gB, gC a gD, jsou známé (Limbách a kol. Gen.Virol. 75, str. 2029 až 2039, 1994).

Přednostně se vakcina ADN proti CHV-1 formuluje s adjuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE s výhodou s DMRIE-DOPE. Může být popřípadě kombinována bud s přísadou psí DM-CSF nebo optínalizována alespoň jedním antigenem CHV-1. nebo přísadou psí GM-CSF a optimalizována alespoň jedním antigenem CHV-1,

Psí GM-CSF se může přidávat stejně jako popsáno pro CDV.

K optimalizaci antigenú, pocházejících z CHV-1, dochází vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu glykoprotei nu gB a/nebo glykoproteinu gC a/nebo g1ykoproteinu gD CHV-1, Vakcína ADN proti CHV-1, zlepšená podle vynálezu, může tedy kódovat a expresovat samotný antigen optimalizované CHV-1 (gB, gC nebo gD) nebo dvěma z nich nebo všemi třemi.

Nukleotidové sekvence kódující antigeny CHV-1, použitelné podle vynálezu, a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech a v patentovém spise číslo W0-A-98/03199, zvláště v příkladech 7 a 8 a na obr. 13 a 14..

Výhodným provedením vynálezu je vakcína ADN proti CHV-1 pro podání intramuskulární cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu (například pSB016, obr. 7) kódujícího antigen gB CHV-1, optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu, ze druhého expresního plasmidu (např. pSB019, obr. 8) kódujícího antigen gC optiffializovaného CHV-1 vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu a ze třetího expresního pasmidu (např. pSB017, obr.9) kódujícího antigen gD CHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu.

Výhodným provedením vynálezu je vakcína ADN proti CHV-1 pro podání subkutánní cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu kódujícho psí GM-CSF a tři shora definované plasmidy (například pSBOló a pSB019 a pSB017),

Vynález se týká také zlepšené vakciny ADN schopné vyvolat účinnou imunitní a ochrannou odezvu u kočky proti kočičímu viru herpes typu 1 (FHV-1).

Virus FHV-1 je členem rodiny A1phaherpesvirinae. Tento virus je zodpovědný za virový zánět nosu a průdušnice u koček (Fargeaud a kol., Arch. Virol. 80, str. 69 až 82, 1984).

» · · · · ···»·»·· ··

Přednostně se vakcina ADN proti FHV-1 formuluje s adjuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE s výhodou s DMRIE-DOPE. Může být popřípadě kombinována bud s přísadou kočičí GM-CSF nebo optimalizována alespoň jedním antigenem FHV-1, nebo přísadou kočičí GM-CSF a optimalizací alespoň jednoho antigenu FHV-1.

Kočičí GM-CSF se může přidávat začleněním kočičího polypeptidu GM-CSF do vakcinačního prostředku nebo začleněním jedné nukleotidové sekvence kódující kočičí GM-CSF (dostupný v genové bance pod číslem AF053007) do expresním vektoru in vivo, s výhodou do plasmidů, Nukleotidové sekvence, kódující kočičí GM-CSF, se s výhodou začlení do druhého expresního plasmidů odlišného od plasmidů, do kterého je začleněn gen nebo geny kódující antígen FHV-1

K optimalizaci antigenů, pocházejících z FHV-1, dochází vypuštěním fragmentu ADN, kódujícího Lransmembránové domény glykoproteinu gB a/nebo glykoproteinu gC a/nebo glykoproteinu gD FHV-1. Vakcina ADN proti FHV-1, zlepšená podle vynálezu, může tedy kódovat a expresovat samotný antígen optimalizované FHV-1 (gB.gC nebo gD) nebo dvěma z nich nebo všemi třemi.

Nukleotidové sekvence, kódující antigeny CHV-1, použitelné podle vynálezu a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech a v patentovém spise číslo WO-A-98/03660, zvláště v příkladech 14 a 15 a na obr. 11 a 12.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti FHV-1 pro podání intramuskulární cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidů (například pSB021, obr.10) kódujícího antígen gB FHV-1, optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu, ze druhého expresního plasmidů (např. pSB023, obr. 11) kódujícího antígen gC FHV-1 optima1 izovaný vypuštěním fragmentu nuk19 leotidové sekvence kódující transmerabránovou doménu a ze třetího expresního pasmidu (mapříklad pSB024, obr.12) kódujícího antigen gC FHV-1 optiaalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu.

Výhodným provedením vynálezu je vakcina ADN proti FHV-1 pro podání subkutánní cestou formulovaná s DMRIE-DOPE a sestávající z expresního plasmidu kódujícho kočičí GM-CSF a ze tří shora definovaných plasmidu (například pSB021, pSB023 a PSB024).

Vynález se týká zlepšené vakciny ADN schopné vyvolávat účinnou imunitní a ochrannou odezvu koně proti koňskému víru herpes typu í (EHV-1)

Virus EHV-1 je členem rodiny Alphaherpesvirinae. Tento virus EHV-1 je zodpovědný za virovou potratovost koní (Crab a kol., Adv. Virus Res. 45, str. 153-190, 1995). Úplný genom viru byl popsán v roce 1992 (Telford a kol., Virology 189, str. 304 až 316, 1992).

Přednostně se vakcina ADN proti EHV-1 formuluje s adiuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE s výhodou s DMRIE-DOPE. Může být popřípadě kombinována bud s přísadou koňské GM-CSF nebo optimalizována alespoň jedním antigenem EHV-1. nebo přísadou koňské GM-CSF a optimalizací alespoň jednoho antigenů EHV-1.

Koňská GM-CSF se může přidávat začleněním koňského polypeptidu GM-CSF do vakcinačni ho prostředku nebo začleněním jedné nukleotidové sekvence (například SEQ ID No 69, obr. 26) kódující koňskou GM-CSF do expresního vektoru in vivo, s výhodou plasmidu. Nukleotidové sekvence, kódující koňskou GM-CSF, se s výhodou začlení do druhého expresního plasmidu odlišného od plasmidu, do kterého je začleněn gen nebo geny kódující anti20 ···· gen nebo antigeny EHV-1.

K optimalizaci antigenu, pocházejících z EHV-1, dochází vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránové domény glykoprotsinu gB a/nebo glykoproteinu gC a/nebo glykoproteinu gD EHV-1. Vakcina ADN proti EHV-1, zlepšená podle vynálezu, může tedy kódovat a expresovat samotný antigen optimalizované EHV-1 (gB,gC nebo gD) nebo dvěma z nich nebo všemi třemi.

Nukleotidové sekvence kódující antigeny EHV-1, použitelné podle vynálezu, a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech a v patentovém spise číslo WG-A-98/03198, zvláště v příkladech 8 a 10 a na obr.2 a 4.

Pro koně je výhodným způsobem podání intramuskulární cesta. Podle vynálezu je s výhodou vakcina ADN proti EHV-1, podávaná intramuskulárně, formulována s DMRIE-DOPE a sestává z expresního plasmidu (například pSB028, obr. 13) kódujícího antigen gB EHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu, ze druhého expresního plasmidu (například pSB029, obr.14) kódujícího antigen gC EHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotídové sekvence kódující transmembránovou doménu a ze třetího expresního pasmidu (mapříklad pSB030, obr.15) kódujícího antigen gD EHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotídové sekvence kódující transmembránovou doménu.

Je mošno ostatně použít subkutánní cesty podání. V tom případě je vakcina ADN proti EHV-1 formulována s DMRIE-DOPE a sestává z expresního plasmidu kódujícho koňskou GM-CSF a ze tří shora definovanmých plasm id, (například pSB028, pSB029 a PSB030).

Vynález se týká zlepšené vakcíny ADN schopné vyvolávat účinnou imunitní a ochrannou odezvu koní proti koňskému viru herpes typu 4 (EHV-4)

Virus EHV-4 je členem rodiny Alphaherpesvirinae. Tento virus EHV-1 je zodpovědný za virální zánět nosu a průdušnice koní (Crabba kol., Adv. Virus Res. 45, str. 153-190, 1995). Úplný genom viru byl popsán v roce 1998 (Telford a kol. , J. Gen. Virology 79, str. 1197 až 1203, 1998).

Přednostně se vakcina ADN proti EHV-4 formuluje s adjuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE s výhodou s DMRIE-DOPE. Může být popřípadě kombinována bud s přísadou koňské GM-CSF nebo optimalizována alespoň jedním anti genem EHV-4, nebo přísadou koňské GM-CSF a optimalizována alespoň jedním anti genem EHV-4.

Koňská GM-CSF se může přidávat jako je popsáno pro EHV-Í.

K optimalizaci anti genů pocházejících z EHV-4 dochází vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu glykoproteinu gB a/nebo glykoprotei nu gC a/nebo glykoprotei nu gD EHV-4. Vakcina ADN proti EHV-4, zlepšená podle vynálezu, může tedy kódovat a expresovat samotný antigen optimalizovaný EHV-4 ÍgB.gC nebo gD) nebo dvěma z nich nebo všemi třemi.

Nukleotidové sekvence, kódující anti geny EHV-4, použitelné podle vynálezu, a různé konstrukce expresních vektorů jsou objasněny v přiložených příkladech a v patentovém spise číslo W0-A-98/03198, zvláště v příkladech 9 a 11 a na obr.3 a 5.

Pro koně je výhodným způsobem podání intramuskulární cesta. Podle vynálezu je s výhodou vakcina ADN proti EHV-1, podávaná intramuskulárně, formulována s DMRIE-DOPE a sestává z expresního plasmidu (například pSB025, obr. 16) kódujícího antigen gB EHV-4 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu, ze druhého • < · ·

expresního plasmidů (například pSB026, obr.17) kódujícího antígen gC EHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu a ze třetího expresního pasaidu (mapříklad pSB027, obr.18) kódujícího antigen gD EHV-1 optimalizovaného vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kóduj ící transmembránovou doménu.

Je možno ostatně použít subkutánní cesty podání. V tom případě je vakcina ADN proti EHV-4 formulována s DMRIE-DOPE a sestává z expresního plasmidů kódujícho koňskou GM-CSF a ze tří shora definovanmých plasmidů (například pSB025, pSB026 a pSB027).

I když je vynález popsán v souvislosti s určitými vakcinaai ADN, používá se také s vakcinami ADN zaměřenými proti jiným patogenům živočišných druhů. Tak se mohou různé mocnosti, zde popsané, stát předmětem zlepšené vakciny. zvláště přidáním adjuvantu podle vynálezu nebo GM-CSF nebo případnou optimalizací genu nebo kombinacemi těchto opatření, jak je zde popsáno pro některé případy.

Stejně mohou být kombinovány vakciny ADN podle vynálezu pro určitý druh zvířat proti ostatním patogenům pro stejný druh zvířat.

Podobně se vynález týká také zlepšených několikaúčelových vakcin ADN umožňujících získat účinnou ochranu u psů proti alespoň dvěma psím patogenům se souboru zahrnujícího CDV, CPI-2, CHV-1, virus vztekliny <rhabdovirus), psí parvovirus (CPV), psí koronavirus (CCV) a Borrelia burgdorferi.

Vynález se týká také zlepšených několikaúče1ových vakcin ADN umožňujících získat účinnou ochranu u koček proti alespoň dvěma kočičím patogenům ze souboru zahrnujícícho FHV-1, kočičí calicivirus (FCV), virus vztekliny (rhabdovirus), koči č í • · · · · · · • · · « · · · · » ·· • « · · * ··· • •A····· ·» »· · ·· ··· parvovirus (FPV), virus kočičího infekčního perilonitu (FIPV). virus kočičí leukeaie (FeLV), virus kočičí získané imunitní nedostatečnosti (FIV).

Vynález se týká také zlepšených něko1 ikaúče1ových vakcin ADN umožňujících získat účinnou ochranu koní proti alespoň dvěma koňským patogenům se souboru zahrnujícího EHV-1, EHV-4, virus koňské chřipky, virus koňské východní encefalitidy, virus koňské západní encefalitidy, virus koňské venezuelské encefalitidy, virus vztekliny, Clostridium tetani a Borrelia burgdorferi.

Něko1íkaúčelové vakciny ADN mohou být zlepšeny jejich formulací s adjuvantem podle vynálezu, zvláště s DMRIE a s výhodou s DMRIE-DOPE. Mohou být popřípadě kombinovány bud přísadou GM-CSF jak shora popsáno, nebo optimalizací alespoň jednoho antigenů EHV-4, nebo přísadou GM-CSF a optimalizací alespoň jednoho příslušného antigenů.

Několikaúčelové zlepšené vakciny ADN podle vynálezu sestávají z jednoho nebo z několika expresních plasmidu toho druhu, še tyto vakciny vedou k expresi in vivo alespoň jednoho imunogenu prvního patogenu a alespoň jednoho imunogenu alespoň jednoho jiného patogenu infikujícího stejný zvířecí druh. Jeden nebo několik těchto iisunogenů je s výhodou ze souboru zahrnuj ícího:

-F CDV, HA CDV, F CPI-2, HN CPI-2, gB CHV-1, gC CHV-1 a gD CHV-1 pro psy.

-gB FHV-1, gC FHV-i a gD FHV-1 pro kočky.

-gB EHV-1, gC EHV-1, gD EHV-1, gB EHV-4, gC EHV-4, gD EHV-4 pro koně.

Jednoúčelové a několikaúčelové vakciny ADN, zlepšené podle vynálezu, mohou být také kombinovány s alespoň jednou klasickou vakcinou (neaktivovanou, živou zeslabenou, podjednotkovou) nebo s rekombinovanou vakcinou používající expresní vektor in vivo (například poxvirus, adenovirus, herpesvirus) proti alespoň jednomu patogenu, zvláště různému činidlu infikujícímu stejný druh.

Pro pracovníky v oboru mohou být informacemv patentovém spisu číslo W0-A-9803198 o způsobech konstruování plasmidů účinných pro koně, v patentovém spise číslo W0-A-9803660 pro kočiky a v patentovém spise číslo W0-A-9803199 pro psi.

Vynález se týká také způsobu vakcinace domácích a sportovních zvířat, zvláště psů, koček a koní. Tento způsob vakcinace spočívá v podávání jedné ze zlepšených jednoúčelových nebo několikaúče1ových vakcin ADN, shora popsaných. Tento způsob vakcinace spočívá v podávání jedné nebo několika dávek zlepšené vakciny.

Množství použité ADN ve vakcinách podle vynálezu je přibližně 10 až přibližně 1000 μ?, s výhodou přibližně 50 až přibližně 500 jjg pro daný plasmid. Pracovnici v oboru stanoví přesně účinnou dávku ADN k použití v každém protokolu vakcinace. Objemy dávek mohou být s výhodou 0,5 až 5 ml, zvláště 1 až 3 ml ,

Vakciny ADN, zlepšené podle vynálezu, se mohou podávat způsobem vakcinace podle vynálezu různými cestami podání doporučovanými v oboru pro polynukleotidovou vakcinaci a pomocí známých technik podávání.

S výhodou se podle vynálezu podává vakcina ADN, zlepšená podle vynálezu intramuskulárně nebo subkutánně.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí následujících obrázků;.

Seznam obrázků na výkresech

Obr. Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr,

Obr.

Obr.

Obr. Obr.

Obr.

Obr.

Obr.

Obr. Obr, Obr. Obr. Obr.

Obr.

č. 1	plasmid	pfiBl10
č. 2 ;	plas®i d	PVR1012
č. 3 ;	plas®i d	PNS021
č. 4 ;	plasai d	PNS024
č. 5 ;	plasa i d	PSB032
č. 6 ;	plas®i d	PSB034
č. 7 ;	plas®id	pSBOl6
č. 8 ;	plasmid	pSBOl9
č. 9 :	plasmid	pSBOl7
č. 10 ;	plas®i d	PSB021
č. 11 ·	plasmi d	pSB023
σ. 12 ;	plasmid	PSB024
č. 13 ;	plasm i d	pSBP28
č. 14 ;	plasm i d	PSB029
č. 15 ;	plasm i d	PSB030
č. 16 ;	plasmid	PSB025
č. 17 ;	plasm i d	PSB026
č. 18 ;	: plasmid	PSB027
č. 19 ;	P1 asm i d	PJP084
č.20 ;	sekvence genu G!
č. 21 ;	plasmid	PJP089
č. 22 ;	: sekvence genu G!
č.23 ;	• plasmid	PJP090
č.24 ;	; sekvence genu Gí
č. 25 ;	: plasmid	PJP097

č.26 : sekvence genu GM-CSF koně č.27 ; sekvence genu CPI-2F č.28 · sekvence genu CPX-2HN

Sezná® sekvencí

SEQ ID NO 1 : oligonukleobid NS030 SEQ ID NO 2 = oligonukleobid NS031

• · · · · · · · · ·· • · · · 4 · · · · · · · • ···· ·· * • ···· · · · · · • · ·»· ··· ······· «· ··· ·· · · · ·

SEQ	ID	NO	3 :	oligonukleotí d	NS034
SEQ	ID	NO	4 =	ol i gonukleot id	NS035
SEQ	ID	NO	5 :	oligonukleot íd	NS036
SEQ	ID	NO	6	oligonukleotid	NS037
SEQ	ID	NO	7 ··	oli gonukleot i d	SB090
SEQ	ID	NO	8 :	o1í gonuk1eot i d	SB091
SEQ	ID	NO	9 :	o1 i gonuk1eot i d	PB326
SEQ	ID	NO	10	= oligonukleot id	PB329
SEQ	ID	NO	11	•Ό1 i gonuk 1 eot i d	PB381
SEQ	ID	NO	12	o1 igonuk1eot i d	PB382
SEQ	ID	NO	13	:o1 i gonuk1eot1d	PB383
SEQ	ID	NO	14	:oligonukleot i d	PB384
SEQ	ID	NO	15	o1 igonuk1eot i d	SB101
SEQ	ID	NO	16	:o1 igonuk1eot i d	SB102
SEQ	ID	NO	17	:o1 igonuk1eot i d	SB103
SEQ	ID	NO	18	o1ígonuk1eot i d	SB104
SEQ	ID	NO	19	:o11gonuk1eot i d	SB105
SEQ	ID	NO	20	' o 1 i gonuk 1 eot i d	SB1O6
SEQ	ID	NO	21	:o1 igonuk1eot i d	SB107
SEQ	ID	NO	22	ol 1 gonukleot i d	SB108
SEQ	ID	NO	23	o1 igonuk1eot i d	SB1 09
SEQ	ID	NO	24	:o1 igonuk1eot i d	SB1 10
SEQ	ID	NO	25	:oligonukleotid	SB1 11
SEQ	ID	NO	26	:o1 igonuk1eot i d	SB112
SEQ	ID	NO	·->*-? Ca i	oligonukleot id	SB113
SEQ	ID	NO	28	'· o 1 i gonuk 1 eot i d	SB1 14
SEQ	ID	NO	29	o1 igonuk1eot id	SB1 15
SEQ	ID	NO	30	:oligonuk1eot id	SB1 16
SEQ	ID	NO	31	: o 1 igonuk1eot i d	SB117
SEQ	ID	NO	32	oligonukleot id	SBí 18
SEQ,	ID	NO	33	’· o l i gonuk 1 eot i d	AB325
SEQ	ID	NO	34	= oligonukleotid	AB326
SEQ	ID	NO	35	:oligonuk1eot i d	AB327
SEQ	ID	NO	36	:o1 igonuk1eot i d	AB328
SEQ	ID	NO	37	:o1 igonuk1eot i d	AB329

SEQ	ID	NO	38	;oli gonukleoti d	AB330
SEQ	ID	NO	39	o 1 i gonuk 1 eot i d	NS003
SEQ	ID	NO	40	:o1 igonuk1eot i d	NS004
SEQ	ID	NO	41	:oligonukleot id	NS005
SEQ	ID	NO	42	• o1 igonuk1eot i d	NS006
SEQ	ID	NO	43	:o1 i gonuk1eot id	NS007
SEQ	XD	NO	44	:oligonukleot id	NS008
SEQ	ID	NO	45	:oligonukleot i d	SB119
SEQ	ID	NO	46	:oligonukleot i d	SB12Q
SEQ	ID	HO	47	:oli gonukleot i d	SB121
SEQ	ID	NO	48	:oligonukleotid	SBí 22
SEQ	ID	NO	49	:oligonuk1eot i d	SB123
SEQ	ID	NO	50	:oligonukleot id	SB124
SEQ	ID	NO	51	:oli gonukleot i d	SBí 25
SEQ	ID	NO	52	• oligonukleot id	SB126
SEQ	ID	NO	53	:oligonukleotid	SB127
SEQ	ID	HO	54	:o1 igonuk1eot i d	SB128
SEQ	ID	NO	55	:oligonukleot i d	SB129
SEQ	ID	NO	56	:o1 igonuk1eot i d	SB130
SE»Q	i D	NO	5?	oligonukleot i d	SB131
SEQ	ID	NO	58	;o1 igonukleot i d	SBÍ32
SEQ	ID	NO	59	· o 1 i gonuk 1 eot i d	SB133
SEQ	ID	NO	60	;o1 igonuk1eot i d	SB134
SEQ	ID	NO	61	:o1 i gonuk1eot i d	SB135
SEQ	ID	NO	62	:o1 igonuk1eot id	SB136
SEQ	ID	NO	63	'ol i gonukl eot i d	SB137
SEQ	ID	NO	64	o1 igonuk1eot i d	JP578
SEQ	ID	NO	65	:oligonuk1eot i d	JP579
SEQ	ID	NO	66	:sekvence genu	GM-CSF
SEQ	ID	NO	67	= sekvence genu	GM-CSF
SEQ	ID	NO	68	sekvence genu	GM-CSF
SEQ	ID	NO	69	;sekvence genu	GM-CSF
SEQ	ID	NO	70	:o1 igonuk1eot i d	JP734
SEQ	ID	NO	71	'ol i gonukl eot i d	JP735
SEQ	ID	NO	72	;sekvence genu	CPI-2F

psa (viz obr. 20) kočky 3R3 (viz obr. kočky 3R4 (viz obr. koně (víz obr, 26) (viz obr. 27)

22)

24)

di vokých prote i nů v transmembránových

SEQ ID NO 73 ^:sekvence genu CPI-2HN (viz obr. 28)

Příklady provedení___vynálezu

Pro každý z uvažovaných patogenů, se stane každý gen, kódující hlavní povrchové antigeny (nativní a modifikované formy), předmětem zvláštní konstrukce v plasmidu exprese eukaryotu. Sekretované formy povrchových antigenů se získají delecí fragmentů genů kódujících transmembránové a cytoplasmové domény. Ve všech případech se transmemránové domény glykoproteinů identifikují na bázi profilů hydropatie odpovídajících proteinových sekvencí. Tabulka v příkladu 11 je souhrnem tvarů (v aminokyselinách) poloh definovaných doménách, tvarů zkomolených proteinů, stejně jako označení odpovídajících expresních plasmidů.

Příklad 1

Plasmidová konstrukce báze

PÍ asm id exprese eukaryotu pVR1020 CC. J. Luke a kol . J. of Infectious Diseases 175, str.95 až 97, 1997), odvozený z plasmidu pVR1012 (obr. i, příklad 7 patentového spisu WO-A-98/ 03199, obr. 2 této přihlášky), obsahuje kódující fázi signální sekvence aktivátoru lidského tkáňového plasminogenu (tPA). Plasmid vVR1020 byl modifikován digesci BamHI-BglII a inzercí -jedné sekvence obsahující několik klónovacích míst í BamHI. Notl, EcoRI, Xbal, Pml1, Pstl, BglII) a vycházejících se spárování následujících oligonuk1eotidů:

PB326 (40 mer) (SEQ ID NO 9)

5GATCTGCAGCACGTGZCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC3' a

PB329 (40 mer) (SEQ ID NO 10)

GATCCGCGGGCCGCGAATTCGATATVVTCTAGACACGTGCT3 .

Výsledný vektor pABllO (obr. 1) slouží ke konstrukci plas29

midů obsahujících zkomolené tvary genu kódujících hemagglutinin (HA) viru nemoci Carreovy nemoci (CDV) a hemagglutininneuraminidázy (HN) viru para inf1uenza typu 2 (CPI-2).

Intron II genu králičího /3-globinu se klonuje do vektoru pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, (JSA) po získání fragmentu ADN odpovídajícího PCR pomocí následujících oligonukleotidů

SB090 (21 mer) (SEQ ID NO 7)

5'TTGGGGACCCTTGATTGTTC3' a

SB091 (20 mer) (SEQ ID NO 8) ' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC3' s použitím jako matrice genomové ADN buněk periferní králičí krve. Výsledný plasmid je označen pNS050.

Příklad 2

PÍ asmidy kódující různé formy antigenú CDV

Geny, kódující fúzní protein (F) a hemagglutinin (HA) kmen Snyder Hill (SH), se získají RT-PCR z virové ARN kmen DH (dosažitelné v kmenové bance American Tissue Cul ture Collection pod číslem ATCC VR-526).

2.1 Plasmidy kódující různé formy CDV-F

2.1.1 pPB229: gen F (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

Pomocí kapsle PB383 se syntetizuje ADN genu F CDV a zesílí se reakcí PCR pomocí dvojice následujících oligonukleotidů: PB383 (26 mer) (SEQ ID NO 13)

5'TTTCTAGACAGCCGAGCCCATGCAC3’ a

PB384 (30 mer) (SEQ ID NO 14)

5‘TTGGATCCGATATATGACCAGAATACTTCA3·.

Produkt PCR se digeruje BamHI a Xbal a klonuje se do expresního vektoru pVR1012 (příklad 1) předběžně digerovaného BamHI a Xbal. generujícího plasmid pPB229 (6925 párů bází nebo pb). Divoký gen F CDV kóduje protein 662 zbytků.

2.1.2 pNS021: gen F (forma β-globinu F deltaTM) klónovaný do vektoru pVR1012

Plasmid pNS013 (6735 pb), obsahující zkomolený gen F transmembránové domény, a C-zakomčeni se získá ligací fragmentu Bsu361-BamHI (6593 pb) pocházejícího z plasmidu pPB229 (příklad 2.1.1) a z jednoho fragmentu 142 pb získaného pomocí PCR z matrice pPB229 pomocí následujících oligonukleotidů'· NS030 (21 mer) (SEQ ID NO 1)

5'ATGAGCCCACTCTTACAACAA 3' a

NS031 (35 mer) (SEQ ID NO 2)

5' TTTCGCGGATCCATTAAAGGAAGAGCGCCTAACCG 3' a digerovaných Bsu361-BamHI. Zkomolený gen F CDV kóduje protein 605 zbytků.

Sekvence, odpovídající intronu II genu králičího β-globinu, se inzeruje na začátek sekvence kódující zkomolený gen F v místě Sall plasmidu pNS013. Fragment ADN, odpovídající intronu (573 pb) se získá z PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

NS036 (34 mer) (SEQ ID NO 5)

5' TTTACGCGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' &

NS037 (36 mer) (SEQ ID NO 6)

5' TTTACGCGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGCAT 3' na matrici pNS050 (příklad 1), následujících digescí Sall k uvolnění extremit kompatibi 1ních Sall. Derivát plasmidu pNS013 obsahující intron II genu β-globinu a označené pNS021 (7308 pb) (obr. 3).

• 9

2.2. Plasmidy kódujicí různé formy CDV-HA

2.2.1. pNSO18= gen HA (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

ADNc genu HA CDV se syntetizuje pomocí kapsle PB381 a zesílí se reakcí PCR pomocí následujících oligonukleotidových dvoj ic:

PB381 (30 mer) (SEQ ID NO 11)

5' TTCTGCAGATGCTCTCCTACCAAGAYAAGG 3' a

PB382 (28 mer) (SEQ ID NO 12)

5' TTGTCGACATGTGTATCATCATMCTGTC 3'.

Produkt PCR se klonuje do vektoru pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) generujícího plasmid pPB235. Fragment Pstl-Sall 1846 pb plasmidu pPB235, obsahujícího gen HA, se pak klónuje do expresního vektoru pVR1012 (příklad 1) digeruje se s Pstl-Sall generující plasmid pNSO18 (6748 pb). Divoký gen HA CDV kóduje protein 607 zbytků.

2.2.2. pNS024 gen HA (forma β-globinu tPAde1taTMHA) klonovaný do vektoru pVR1012

Zkomolená forma genu HA CDV se získá vypuštěním fragmentu ADN kódujícího 60 prvních zbytků proteinu HA. Když jsou sekvenční a transmembránový signál tohoto proteinu smiseny, je vyloučení zkomoleného produktu zajištěno získáním fúze ve fázi mezi signální sekvencí aktivátoru lidského tkáňového plasninogenu (tPA) a zkomoleného genu HA. Plasmid pNS019, odvozený od PNS018 kódujícího produkt fúze se signálem tpPA, se získá vazbou tří následujících fragmentů ADN:

- Fragment A se získá digescí BamHI-EcoRV pABllO (příklad 1)

- Fragment B se získá reakcí PCR na matrici pNS018 (příklad 2.2.1) pomocí následujících oligonukleotidů=

NS034 (30 mer) (SEQ ID NO 3)

5' TTTCGCGGATCCCACAAAGŤATCAACTAGC 3* a NS035 (23 mer) (SEQ ID NO 4)

5’ GGGATTTGCTGCCGATGCAATAG 3' po čemž následuje di gesce BamHI-SapI produktu PCR.

- Fragmentem C je fragment digesce SapI-EcoRV pNS018.

Hybridní gen tPA deltaTNHA kóduje protein zbytku 574 (1725 pb).

Intron genu králičího β-globinu (příklad 2.1.2) se začlení na začátek fáze kódující gen HA do místa Sáli pNS019 k vytvoření plasmidu pNS024 (obr.4)

Příklad 3

Plasmidy kódující různé formy antigenú viru psího chřipkového onemocnění (parainfluence) typu 2 (CPI-2)

Geny F a HN kmene CPI-2 D008 (MERIAL) se získají pomocí RT-PCR z virové ARN.

3.1. Plasmidy kódující různé formy CPI-2F

3.1.1 pAB115^; gen F (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

ADN genu F CPI-2 se syntetizuje a zesílí RT-PCR pomocí dvojice následujících oligonukleotidů:

5’ AAAÁACGCGTCGÁCATGGGTACTÁTAATTCAATTTCTG 3'

SB132 (38 mer) (SEQ ID NO 58)

5’ TTTTCTAGTCTAGATTATTTATGATAAACAAAATTCTC 3’.

Produkt PCR se digeruje pomocí Sáli Xbal generováním

fragmentu 1594 pb a klonuje se do expresního vektoru pVR1012 (příklad 1) předběžně digerovaného stejnými enzymy, vytvářením plasmidu pAB115 (6479 pb). Divoký gen F CPI-2 (SEQ ID NO 72) (obr. 27) klonovaný do tohoto plasmidu kóduje protein se 529 zbytky.

3.1.2. pSB032= gen F (forma β-globinu F deltaTM) klonovaný do vektoru pVR1012

Plasmid pSBO31, obsahující zkomolený gen F transmembránových domén a cytoplasmové C-zakončení, se získá takto: provede se reakce PCR s matricí pAB115 (příklad 3.1.1) pomocí následujících oligonukleotidů:

SB131 (SEQ ID NO 57) a SB133 (41 mer) (SEQ ID NO 59)

5’ TTTTCTAGTCTAGATTAGTATGTGTCACTTTGTGCTAAGTG 3’ ke generaci fragmentu PCR přibližně 1450 pb. Tento fragment se digeruje Sáli a Xbal k izolování restrikčního fragmentu SallXbal se 1436 pb. Tento fragment se liguje s vektorem pVR1012 (příklad 1) předběžně digerovaným se Sal1 a Xbal k získáni plasmidu pSB031. Gen F zkomolený CPI-2 kóduje protein 473 zbytků.

Sekvence odpovídající intronu II genu králičího p-globinu se inzeruje na začátek sekvence kódující F zkomolený gen F CPI-2, v místě Sall plasmidu pSB031. Fragment ADN odpovidahící intronu (573 pb) se získá PCR pomocí oligonukleotidu NS036 (SEQ ID NO 5) a NS037 (SEQ ID NO 6) na matrici pNS050 (příklad 1), následovaný digescí Sall k uvolnění kompatibilních extremit Sall. Tento restrikční fragment Sall-Sall se liguje s plasmidem pSB031 předběžně digerovaným se Sall, pak se zbaví fosforu k získání plasmidu pSB032 (6884 pb) (obr. 5).

3.2 Plasmídy kódující různé formy CPI-2 HN

3.2.1 pAB114= gen HN (nativní forma) klonovaný do vektoru

PVR1012

ADNc genu HN CPI-2 se syntetizuje a zesílí pomocí následujících oligonukleotidů:

SB134 (41 mer) (SEQ ID NO 60)

5’ AAAAACGCGTCGACATGGTTGCAGAAGATGCCCCTGTTAGG 3’

SB135 (35 mer) (SEQ ID NO 61)

5’ TTTTGGAAGATCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3’.

k vytvoření fragmentu PCR přibližně 1720 pb. Tento fragment se digeruje Sáli a BglII k izolování restrikčního fragmentu SallBglI se 1704 pb. Tento fragment se liguje s vektorem pVR1012 (příklad 1) předběžně digerovaným Sall a BglII k získání plasmidu pAB114 (6566 pb). Divoký gen HN, zkomolený CPI-2 (SEQ ID NO 73) obr. 28), klonovaný na tomto plasmidu kóduje protein 565 zbytků.

3.2.2. pSB034'· gen HN (forma β-globinu HNtPA deltaTM) klonovaný do vektoru pVR1012

Zkomolená forma genu HN CPI-2 se získá delecí fragmentu ADN kódujícího 40 prvních zbytků proteinu HN. Když jsou sekvenční a transmembránový signál tohoto proteinu smíseny, je sekrece zkomoleného produktu zajištěna získáním fúze ve fázi mezi signální sekvencí aktivátoru lidského tkáňového plasminogenu (tPA) a zkomoleného genu HN. Plasmid pSB033, odvozený od pAB114 (příklad 3.2.1), kódujícího produkt fúze s tPA, se získá ligací fragmentu EcoRI-Pmll pABllO (příklad 1), derivátu pVR1012 obsahujícího jednu fázi otevřenou čtení kódující signální sekvenci tPA a fragment (1599 pb) získaný PCR pomocí následujících oligonuk1eotidů=

SB136 (37 mer) (SEQ ID NO 62)

5’ TTAAAAGAATTCGACCCAAAAGCAAATCATGAGCCAC 3’

SB137 (33 mer) (SEQ ID NO 63)

5’ TTAAAAGGCCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3’ na matrici pAB 114 a digerované EcoRI a EcoRV.

Intron II genu králičího β-globinu se inzeruje na začítek fáze kódující gen HN do místa Sáli pBS033 ke generaci plasmidů pSB034 (obr.6). Fragment Sall obsahující intron se získá PCR pomocí oligonukleotidů NS036 (SEQ ID NO 5) a NS037 (SEQ ID NO 6) na matrici pNSOSO (příklad 1).

Příklad 4

Plasmid kódující různé formy g1ykoproteinů viru CHV-1

Geny kódující glykoproteiny gB, gC a gD kmene Carmichael králičího viru herpes typu 1 (CHV-1) se izolují PCR z virového genomu. Klonování genů kódujících gB a gD ve vektoru pVR1012 bylo jiz popsáno v patentovém spise číslo W0-A-98/03199 (plasmidy pAB037 na obr. 7 a pAB038 na obr. 8a v příkladech 13 a 14). Klonování genu kódujícího gC je naopak popsána v tomto dokumentu.

4.1 Plasmid kódující zkomolenou formu CHV-gB

4.1.1. pSBOló: gen gB (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je 1rasmembránová doména proteinu gB CHV-1 (878 aminokyselin) umístěna mezi zbytky 702 a 769. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gB, se získá ligací tří následujících framentů ADN ^: (a) vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného dvojí dígescí Pstl-Xbal, (b) fragmentu 1997 pb získaného dígescí Pstl-Nsil pAB037 (příklad 4) a (c) fragmentu 225 pb sískanho PCR pomocí následujících oligonukleotídů:

··· ·· ···

SB10Í (22 mer) (SEQ ID NO 15)

5’TATATTGAAGGACAACTTGGGG 3’ ^a

SB102 (36 mer) (SEQ ID NO 16)

5’ CTAGTCTAGATTAATTATTATCAACTTTTACAACAC 3’ s použitím plasmidu pAB037 jako matrice digerované Nsil a Xbal. Výsledný plasmid, pSB016 (6983 pb) (obr. 7) obsahuje zkomolený gen gB kódující protein se 701 zbytky.

4.2 Plasmidy kódující různé formy CHV-gC

4.2.1. pSB018= gen gC (nativní forma) klónovaný do vektoru PVR1012

Fragment ADN obsahující otevřenou fázi čtení genu gC CHV-1, se získá z PCR pomocí následujících oligomukleotidů= SB105 (32 mer) (SEQ ID NO 19)

5’AAAACTGCAGATGAGTTTTAAAAATTTTTATC 3’ -a

SB106 (30 mer) (SEQ ID NO 20)

5’CTAGTCTAGATTAGATCTTATTATTTTTTG 3’ s použitím virové ADN jako matrice. Produkt PCR se digeruje pomocí Pstl a Xbal za generace fragmentu 1400 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pSB018 (6253 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gC se 459 zbytky.

4.2.2. pSB019‘· gen gC (forma delta TN) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gC umístěna mezi zbytky 422 a 452. Plasmid obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gD se získá 1igováním tří následujících fragmentů ADN'· (a) vektoru pVR1012 (příklad 1)

ineari2ovaného dvojí digescí Pstl-Xbal, (b) fragmentu 934 pb, získaného digescí Pstl-Stul pSBOIS (předchozí příklad) a (c) fragmentu 335 pb získaného PCR pomocí následujících oligonuk1eot i dů^:

SB107 (24 mer) (SEQ ID NO 21)

5’TGGATTGACGGTOTTATAACACGC 3’ ta

SB108 (37 mer) (SEQ ID NO 22)

5’ CTAGTOTAG ATT AATTTTC ATCCG ATGCATC AAAC AC 3’ s použitím plasmidu pSB018 jako matrice digerované se Stul a Xbal. Výsledný plasmid, pSB019 (6139 pb) (obr. 8), obsahuje zkomolený gen gC kódující protein se 421 zbytky.

4.3 Plasmid kódující zkomolenou formu CHV-gD

4.3.1. pSB017= gen gD (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Transmembránová doména proteinu gD CHV-1 (345 aminokyselin) je umístěna mezi zbytky 310 a 328. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gD, se získá ligováním tří fragmentů ADN: (a) vektoru pVR1012 (příklad 1) 1inearizovaného dvojí digescí Pstl-Notl, (b) fragmentu 663 pb získaného digescí Pstl-Avall pSB038 (příklad 4) a (c) fragmentu 415 pb získaného PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

SB103 (25 mer) (SEQ ID NO 17)

5'CGAGAAACTTGTTATTTTTCTAAAG 3’ a

SB104 (51 mer) (SEQ ID NO 18)

5’ATAAGAATGCGGCCGCAAAGGCTATATATTTTTTGGGGTATTATTTATTGG

3’ s použitím plasmidu pAB038 jako matrice digerované s Aval a Notl. Výsledný plasmid, pSB017 (5819 pb) (obr. 9) obsahuje

zkomolený gen gD kódující protein se 308 zbytky.

Příklad 5

Plasmid kódující různé formy gyk1oproteinů FHV-1

Geny. kódující g1ykoproteiny gB, gC a gD kmene CO viru kočičího herpes typu 1 (FHV-1), se izolují PCR z virového genomu. Ve zvláštním případě genu kódujícího gD. jehož nuk1eoti dová sekvence je identická se sekvencí kmene C-27, se použilo plasmidu pAB029 odvozeného z pVR1012 obsahujícího odpovídající gen klonovaný 2 kmene C-27 a popsaný v patentovém spise číslo WO-A-98/03660 (plasmid pAB029, obr. 12 a příkilad 15).

5.1 Plasmid kódující různé formy FHV-gB

5.1.1 pSB020 gen gB (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

Fragment ADN obsahující otevřenou fázi čtení genu gB FHV-1 se získá z PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

5’TTTTCTGCAGATGTCCACTCGTGGCGATCTTGGG 3’ a SB114 (40 mer) (SEQ ID NO 28)

5’ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAAGATTTGTTTCAGTATC 3’ s použitím virové ADN jako matrice. Produkt PCR se digeruje pomocí Pstl a Notl s vytvořením fragmentu 2849 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) linearizo váného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pSB020 (7728 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gB s 949 zbytky.

5.1.2. pSB021: gen gB (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

• · η • · · ♦ » * · « « · · • » · • 4 « · t 4

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gB FHV-1 umístěna mezi zbytky 781 a 834. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gB, se získá 1igací tří následujících fragmentů ADN: (a) vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného dvojí digescí Pst 1-Notl, (b) fragmentu 1839 pb, získaného digescí Pstl-Hindi 1 pSB020 (předchozí příklad) a (c) fragmentu 447 pb získaného z PCR pomocí následujících o1 igonukleotidů =

SB109 (24 mer) (SEQ ID NO 23)

5’ CTGTGGACAGAGACCCTAAAACTC 3’ a

SB110 (50 mer) (SEQ ID NO 24)

5’ TTTCCTTTTGCGGCCGCTTATATGCTGTCTATATCATAAAATTTTAAGGC 3’ s použitím plasmidu pSB020 jako matrice a digerované Hindi 1 a Notl. Výsledný plasmid, pSB021 (7164 pb) (obr.10), obsahuje zkomolený gen gB kódující protein se 760 zbytky.

5.2 Plasmidy kódující různé formy fHV-gC

5.2.1. pSB022 P gen gC (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

Fragment ADN, obsahující otevřenou fázi čtení genu gC FHV-1, se získá z PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

SB115 (34 mer) (SEQ ID NO 29)

5’TTTTCTGCAGATGAGACGATATAGGATGGGACGC 3’ a SB116 (34 mer) (SEQ ID NO 30)

5’AGTTTAGCGGCCGCTTATAATCGCCGGGGATGAG 3’ s použitím virové ADN jako matrice. Produkt PCR se digeruje pomocí Pstl a Notl za generace fragmentu 1605 pb. který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pSB022 (6483 pb) obsa40 huje gen kódující glykoprotein gC s 534 zbytky.

5.2.2. pBS023: gen gC (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gC FHV-1 obsažena mezi zbytky 495 a 526. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gC, se získá 1 igací dvou následujících fragmentů ADN ^: (a) fragmentu 6198 pb získaného digescí Bcll-Notl pSB022 (předchozí příklad) a (b) fragmentu 168 pb získaného z PCR pomocí následujících oligonuk1eot i dů:

SB117 (24 mer) (SEQ ID NO 31)

5’GTTAAATGTGTACCACGGGACGGG 3’ a

SB118(41 mer) (SEQ ID NO 32)

5’AGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGGGGACGCGTCGTAGACTTG 3’ s použitím plasmidu pSB022 jako matrice a digerované Bolí a Notl. Výsledný plasmid, pSB023 (6366 pb) (obr.11) obsahuje zkomolený gen gC kódující protein se 494 zbytky.

5.3 Plasmid kódující zkomolenou formu FHV-gD

5.3.1. pSB024: gen gD (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Transmembránová doména proteinu gD FHV-1 (374 aminokyselin) je umístěna mezi zbytky 328 a 353. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gD, se získá ligací následujících dvou fragmentů ADN (a) fragmentu 5712 pb, získaného digescí Xbal-Bglll pAB029 (příklad 5) a (b) fragmentu 129 pb, získaného PCR pomocí následujících ol igonukleot idů '

SB111 (24 mer) (SEQ ID NO 25)

5’GATCGTCCCGCCATACCGTCTGGG 3’ a SB112 (39 mer) (SEQ ID NO 26) 5’TTTGGAAGATCTTTACTGATTATTCATGCCCTTGGGAGG 3’

·· · »· · · ···· s použitím plasmidů pAB029 jako matrice digerované Xbal a Bgl11. Výsledný plasmid, pSB024 (5841 pb) (obr. 12), obsahuje zkomolený gen gD kódující protein se 327 zbytky.

Příklad 6

PÍ asmidy kódující různé forny g1ykoproteinů EHV-1

Geny kódující glykoproteiny gB, gC a gD kmene 2234/88-2 EHV-1 se izolují PCR z vyčištěné virové ADN.

6.1 PÍ asm idy kódující různé formy EHV-1 gB

6.1.1. pAB127: gen gB (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

Fáze kódující gen gB EHV-1 se zesílí PCR pomocí následujících o1ogonukleotidů:

NS003 (30 mer) (SEQ ID NO 39)

5' TTCTGCAGATGTCCTCTGGTTGCCGTTCGT 3' &

NS004 (30 mer) (SEQ ID NO 40)

5* TTTCTAGATTAAACCATTTTTTCATTTTCC 3',

Získaný fragment ADN se digeruje Pstl a Xbal, 1iguje se do vektoru pVFR10132 (příklad 1), 1 inearizovaného Pstl a Ybal, za vytvoření plasmidů pAB127 (7818 pb). Gen gB kóduje protein s 980 aminokyselinami.

6.1.2. pSB028: gen gB (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gB FHV-1 umístěna mezi zbytky 801 a 875. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gB, se získá liga42

cí dvou EMjgjiedu j í c í ch fragmentů ADN : (a) plasmidu pAB127 (příklad 6.1.1) digerovaného Afel a Xbal a (b) fragmentu 278 pb získaného z PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

SB125 (24 mer) (SEQ ID NO 51)

5' AACAACAGAGGGTCGATAGAAGGC 3' a

SB126 (39 mer) (SED ID NO 52)

5* AAI l l I ICTAGATTACACGTTGACCACGCTGTCGATGTC 3' s použitím plasmidu pAB127 jako matrice a digerovaného Afel a Xbal. Výsledný plasmid, pSB028 (7279 pb) obsahuje zkomolený gen gB EHV-1 kódující protein se 800 zbytků.

6.2 Plasmidy kódující různé formy EHV-1 gC

6.2.1 pAB129'· gen gC (nativní rorma) klonovaný do vektoru

PVR1012

Fragment ADN obsahující otevřenou fázi čtení genu gC z EHV-1 se získá PCR pomocí následujících ol i gonukl eot i dů ·'

NS005 (31 mer) (SEQ ID NO 41)

5' TTGTCGACATGTGGTTGCCTAATCTCGTGAG 3' a

NS006 (33 mer) (SEQ ID NO 42) . ·

5’ TTGGATCCCTAAAAGTCAGACTTGTTGTACGGC 3'.

Tento produkt PCR se digeruje Sall a BanHI generující fragment 1412 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pAB129 (6281 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gC EHV-1 se 468 zbytky.

6.2.2. pSB029= gen gC (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gC EHV-1 umístěna me2i zbytky 429 a 455. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gC, se získá ligací dvou následujících fragmentů ADN ^: (a) plasmidu pAB129 (příklad 6.2.1) 1 inearizovaného dvojí digescí Aspl- BamHI, a (b) fragmentu 287 pb získaného PCR pomocí následujících oligonukleot idů:

SB127 (24 mer) (SEQ ID NO 53)

5’ GATCCGGAGGAGGAATACACACCC 3‘ a

SB128 (39 mer) (SEQ ID NO 54)

5' AATTTTGGATCCCTAAACCGGCCTGTCCTCAACAATCGG 3’ s použitím plasmidu pAB129 jako matrice digerované Aspl a BamHI. Výsledný plasmid. pSB029 (6161 pb) obsahuje zkomolený gen gC kódující protein se 428 zbytky.

6.3. Plasmidy kódující zkomolenou formu EHV-1 gD

6.3.1.pAB131: gen gD (nativní forma )klonovaný do vektoru PVR1012

Fragment ADN obsahující otevřenou fázi čtení genu gD z EDV-1 se získá PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

NS007 (33 mer) (SEQ ID.NO 43)

5' TTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCTTATGATGG 3’ 'a

NS008 (32 mer) (SEQ ID NO 44)

5' TTGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAAC 3'.

Tento produkt PCR se digeruje Sall a BanHI generující fragment 1214 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pAB138 (6083 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gD se 402 zbytky.

6.3.2.pSB030= gen gD (forma delta TM) klonovaný do vektoru pVR1012

Podle hydropatíckého profilu je trasmembránová doména proteinu gD EHV-1 umístěna mezi zbytky 348 a 371. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gD, se získá ligací tří následujících fragmentů ADN ^: (a) plasmidu pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného dvojí digescí Sall-BamHI, (b) fragmentu 825 pb pocházejícího z di gesce pAB131 (příklad 6.3.1.) Sall a Baml a (c) fragmentu 239 pb získaného PCR pomocí následujících oligonukleotidů:

SB129 (24 mer) (SEQ ID NO 55)

5' CGGTTTCTŤGGTGAATTCAACTTC 3‘ a SB130 (42 mer) (SEQ ID NO 56)

5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTCTTAGACGTTTTTGG 3' s použitím plasmidu pAB131 jako matrice digerované Bsml a BamHI. Výsledný plasmid, pSB030 (5921 pb), obsahuje zkomolený gen gD kódující protein se 347 zbytků.

Příklad 7

Plasmidy kódující různé forny g1ykoproteinů EHV-4

Geny kódující glykoproteiny gB, gC a gD kmene KYT445/2 EHV-4 se izolují PCR z vyčištěné virové ADN

7.1 Plasmidy kódující různé formy EHV-4 gB

7.1.1. pAB136·’ gen gB (nativní forma) klonovaný do vektoru PVR1012

Fáze, kódující gen gB EHV-4, se zesílí PCR pomocí následujících oligonukleotidu=

AB325 (35 mer) (SEQ ID NO 33)

5' TTTCTGCÁGATGTCCACTTGTTGCCGTGCTATTTG 3' a AB326 (31 mer) (SEQ ID NO 34)

5* TTTTCTAGATTAAACCATTTTTTCGCTTTCC 3‘,

Získaný fragment ADN se digeruje Pstl a Xbal se liguje do vektoru pV4R1012 (příklad 1), 1 inearizovaného Pstl a Xbal, za generace plasmidu pAB136 (7801 pb). Gen gB EHV-4 kóduje protein s 975 aminokyselinami.

7.1.2. pSB025: gen gB (forma delta TM) klonovaný do vektoru

PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gB EHV-4 umístěna mezi zbytky 797 a 867. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gB, se získá ligováním dvou následujících fragmentů ADN: (a) plasmidu pAB136 (příklad 7.1.1) digerovaného SpII a Xbal a (b) fragmentu 231 pb získanéého z PCR pomocí následujících ol i gonukl eot i dů ’

SB119 (36 mer) (SEQ ID NO 45)

5' TTTTGGTOTAGATTAGTCCACGTTGACAACGCTGTC 3' 'a

SB120 (23 mer) (SEQ ID NO 46)

5' CGCAAGOTTATCGAGCCGTGCGC 3' s použitím plasmidu pAB136 jako matrice a digerované Spi 1 a Xbal. Výsledný plasmid, pSB025 (7264 pb) obsahuje zkomolený gen gB kódující protein se 796 zbytky.

7.2 Plasmidy kódující různé formy EHV-4 gC

7.2.1 pAB137·’ gen gC (nativní rorma) klonovaný do vektoru

PVR1012

Fragment ADN obsahující otevřenou fázi ctění genu gC z EHV-4 se získá PCR pomocí následujících oligonukleobidů:

• <» · · · ··· ·····«'·· · · «·· ·· ····

AB327 (32 mer) (SEQ ID NO 35)

5' TTTGTCGACATGGGTTTGGTAAATATAATGCG 3' a

AB328 (33 mer) (SEQ ID NO 36)

5* TTTGGATCCTTAGAAGTCTGCTTTCTTGTAGGG 3'.

Tento produkt PCR se digeruje Sall a BanHI vytvářející fragment 1463 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pAB137 (6330 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gC EHV-1 se 485 zbytky.

7.2.2. pAB026: gen gC (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gC EHV-4 umístěna mezi zbytky 425 a 472. Plasmid obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gC se získá vazbou dvou následujících segmentů ADN; (a) plasmídu pAB137 (příklad 7.2.1) 1 inearizovaného dvojí digescí Acll- BamHI, a (b) fragmentu 237 pb získaného PCR pomocí následujících oligonuk 1 eot i dů '·

SB121 (24 mer) (SEQ ID NO 47)

5’ GTATCAATCCCAGCTGACCCCGÁC 3' a SB122 (41 mer) (SEQ ID NO 48)

5’ AATTTTGGATCCTTAGCCGTCCGGGTAACCCTCTATGATGC 3* s použitím plasmídu pAB137 jako matrice digerované Acll a BamHI. Výsledný plasmid, pSB026 (6147 pb) obsahuje zkomolený gen gB kódující protein se 424 zbytky.

7.3. Plasmidy kódující zkomolenou formu EHV-4 gD

7.3.1.pAB138: gen gD (nativní forma )klonovaný do vektoru PVR1012

Fragment ADN obsahující jednu fázi otevřenou čtení genu gD z EDV-4 se získá PCR pomocí následujících oligonuk1eotidů:

AB329 (33 mer) (SEQ ID NO 37)

5' TTTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCCTATGATG 3* a

AB330 (33 mer) (SEQ ID NO 38)

5' TTTGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3*.

Tento produkt PCR se digeruje Sall a BanHI generující fragment 1214 pb, který se okamžitě liguje do vektoru pVR1012 (příklad 1) 1 inearizovaného stejnou dvojí digescí. Výsledný plasmid pAB138 (6081 pb) obsahuje gen kódující glykoprotein gD se 402 zbytky.

7.3.2 . pSB027 · gen gC (forma delta TM) klonovaný do vektoru PVR1012

Podle hydropatického profilu je trasmembránová doména proteinu gD EHV-4 umístěna mezi zbytky 348 a 371. Plasmid, obsahující zkomolenou formu genu kódujícího gD, se získá ligací dvou následujících fragmentů ADN (a) plasmidu pVR138 (pří7.3.1) 1 inearizovaného dvojí digescí EcoRI-BamHI, a (b) fragmentu 310 pb získaného PCR pomocí následujících oligonukleotidů^:

SB123 (24 mer) (SEQ ID NO 49)

5' TTTTCCGTAACAATTCCGAGCAGC 3' a

SB124 (39 mer) (SEQ ID NO 50)

5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTATTAGACGCTGG 3' s použitím plasmidu pAB138 jako matrice digerované EcoRI a BamHI. Výsledný plasmid, pSB027 (5919 pb) obsahuje zkomolený gen gD kódující protein se 347 zbytků.

Příklad 8

Plasmídy kódující psí GN-CSF

8.1 Příprava celkové ARN psích lymfocytů stimulovaných in

vitro mitogeny

Psí krev se shromáždí do zkumavky obsahující EDTA po jednom odběru krve od psa Beagle. Mononukleové buňky se shromáždí odstředěním na gradientu Ficoll, načež se vnesou do kultury v Petri ho misce o průměru 60 mm. Psí mononukleové buňky se pak stimulují konkanava1 inem A (conA) (s konečnou koncentrací přibližně 5 jjg/ml) a fyto-hemagg1uti ninem (PHA) (s přibližnou koncentrací přibližně 10 pg/ml). Po stimulaci se shromáždí lymfoblasty ConA” a PHA odškrabáním kultivačních misek a celkové ARN těchto buněk se extrahuje za použití kitu mRNA isolation kit for White Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Cat M 1934 325).

8.2 Izolování genu kódujícího psí GM-CSF a konstrukce plasmidu PJP074

Celková ARN, extrahovaná ze psích lymfoblastů, stimulovaných ConA nebo PHA (příklad 8.1) slouží jako matrice pro syntézu první větve komplementární ADN. První větev komplementární ADN se vytvoří prodloužením oligonukleotidů p(dT) 15 (Boehringer/ Mannhe i m/ Roche Cat tt 814 270). Získaná jednoduchá větev komplementární ADN se vzápětí použije jako matrice pro realizací ACP s následujícími oligonukleotidy:

JP578 (SEQ ID NO 64) (33 mer)

5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' a JP579 (SEQ ID NO 65) (36 mer)

5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' k zesílení fragmentu ACP přibližně 450 páru bází (pb) . Tento fragment se vyčistí elektroforézou na agarovém gelu, načež se liguje na vektor pCR2.1 (inVitrogen, Carlsbad, Ca, USA) k získání plasmidu pJP074. Zjišťuje se, že sekvence genu psího GM-CSF, klonovaná do plasmidu pJP074, je ekvivalentní se sek49

věnci psího GM-CSF, získateIného z genové banky (číslo # S49738).

8.3 Konstrukce plasmidu pJP084 a sekvence genu psího Gtt CSF

Plasmid pJP074 (příklad 8.2) se digeruje Notl k izolování po e1ektroforéze agarového gelu, fragment Notl-Notl o přibližně 450 pb obsahující psí gen GM-CSF. Tento fragment se liguje s plasmidem pVR1012 (příklad 1). Klon, obsahující sekvenci psího GM-CSF (SEQ ID NO 66, obr. 20) v dobré orientaci se zřetelem k promotoru hCMV/ΙΕ je identifikován jako pJPP84. Tento plasmid má 5364 pb (obr. 19).

Příklad 9

Plasmid kódující kočičí GM-DSF

9.1 Příprava celkové ARN kočičích lymfocytů stimulovaných in vitro mitogeny

Kočičí krev se shromáždí odběrem krve do zkumavky obsahující EDTA. Mononukleové buňky se shromáždí odstředěním na gradientu Ficoll, načeš se vnesou do kultury v Petriho misce o průměru 60 mm. Kočičí mononukleové buňky se pak stimulují konkanavalinem A (ConA) (s konečnou koncentrací přibližně 4 yg/ml) a fyto-hemagglutininem (PHA) (s koncentrací přibližně 1O ug/ml) . Po stisaulacei se shromáždí lymřoblasty ConA” a PHA odškrabáním kultivačních misek a celkové ARN těchto buněk se extrahuje za použití kitu mRNA isolation kit for Vbité Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Cat tt 1934 325).

9.2 Izolování genu kódujícího kočičí GM-CSF a konstrukce plašší i du pJP089 a pJP090

Celková ARN, extrahovaná z kočičích lymfoblastů stimulo50 váných ConA nebo PHA (příklad 9.1), slouží jako matrice pro syntesu první větve komplementární ADN. Tato první větev komplementární ADN se vytvoří prodloužením oligonuk1eotidu p(dT) 15 (Boehringer/Mannheim/Roche Cat tt 814 270). Získaná jednoduchá větev komplementární ADN se vzápětí použije jako matrice pro reakci ACP s následujícími oligonuk1eotidy^;

5* TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3’ a JP579 (SEQ ID NO 65) (36 mer)

5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' k zesílení fragmentu ACP přibližně 450 párů bází (pb). Tento fragment se digeruje Notl k izolování po e1ektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Notl-Notl 450 pb. Tento fragment se liguje s plasmidem pVR1012 (příklad 1). Dva klony, obsahující sekvenci kočičí GM-CSF (SEQ ID NO 67 a SEQ ID NO 68) v dobré orientaci se zřetelem k promotoru hCMV/IE se identifikují jako pJP089 a pJP090 Tyto oba plasmidy mají tvar 5364 pb (obr. 21 a 23) .

Sekvence kočičího genu GM-CSF, klonovaná do plasmidů pJP089, obsahuje 13 rozdílů nukleotidové hldiny se sekvencí kočičího GM-CSF získatelného z genové banky (pod číslem AF053007). Nejvýznačnější změnou je změna C >T, která představuje změnu leucin >fenylalanin pro aminokyselinu (první báze kódonu aminokyseliny tt 107, obr. 22). Sekvence genu kočičího GM-CSF klonovaného do plasmidů pJP090 je ekvivalentní se sekvencí obsaženou v plasmidů pJP089, s tou výjimkou, že změna leucin Xenylalanin neexistuje pro aminokyselinu tt 107 (obr. 24). Ověření sekvence 3' kočičího genu GM-CSF alespoň v kitu 3’RACE ukázalo, že v této poloze 107 je možno u téže kočky pozorovat aminokyselinu leucin nebo aminokyselinu fenylalanin.

·· * · · < · · · • ·· · · ··· · · · • · · · · ·· ··· ·· · · ·

Příklad 10

Plasmid kódující koňský GM-CSF

10.1. Příprava celkové ARN koňských Iymfocytů in vitro mitogeny

Koňská krev se shromáždí do zkumavky obsahující EDTA odběrem krve z krční žíly. Mononukleové buňky se shromáždí odstředěním na gradientu Ficoll. načež se vnesou do kultury v Petři ho misce o průměru 60 mm. Koňské mononukleové buňky se pak stimulují buď konkanavalinem A (ConA) (s konečnou koncentrací přibližně 5 Mg/ml) nebo fyto-hemagg1utininem (PHA) (s přibližnou konečnou koncentrací 10 jug/ml) . Po stimulaci se shromáždí lymfoblasty ConA a PHA odškrabáním kultivačních misek a celkové ARN těchto buněk se extrahuje za použití kitu mRNA isolation kit for White Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Cat tt 1934 325).

10.2 Izolování genu kódujícího kňský GM-CSF

Celková ARN, extrahovaná z koňských lymfoblastů stimulovaných ConA nebo PHA (příklad 10.1), slouží jako matrice pro syntézu první větve komplementární ADN. Tato první větev komplementární ADN se vytvoří prodloužením oligonukleotidu p(dT) 15 (Boehringer/Mannheim/Roche Cat # 814 270). Získaná jednoduchá větev komplementární ADN se vzápětí použije jako matrice pro reakci ACP s následujícími oligonukleotidy^:

JP734 (SEQ ID NO 70) (44 mer)

5' CATCATCATGT.CGACGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCT 3‘ :a JP735 (SEQ ID NO 71) (41 mer) • 5' CATCATČATGCGGCCGCTACTTCTGGGCTGCTGGCTTCCAG 3’ k zesílení frgmentu ACP přibližně 500 párů bází ( pb) . Tento fragment se čistí elektroforézou na agarovém gelu.

·· ·· ·· · ·· · · • · · · · ··· · · · · • ···· ·· · • · ··· ··· ········ ·· ··· ·· ····

10.3 Konstrukce plasmidů pJP097 a sekvence genu koňského GM-CSF

Vyčištěný fragment ACP, získaný podle příkladu 10.2, se digeruje s Notl k izolování po elektroforéze v agarovém gelu fragmentu Notl-Notl přibližně 450 pb obsahujícího gen koňského GM-CSF. Tento fragment se 1iguje s plasmidem pVR1012 (příklad 1). Klon obsahující sekvenci koňského GM-CSF (SEQ ID NO 69 obr. 26) v dobré orientaci se zřetelem k promotoru hCMV/IE se identifikuje jako pJP097. Tento plasmid má tvar 5334 pb (obr. 25) .

Příklad 11

Přehledná tabulka plasmidů

r	II	III	IV	V	VI
CDV	F	662	606-626	605	pPB229 et pNS021*
	HA	607	1-60**	574	pNS018 et pNS024*
CPI-2	F	529	474-517	473	pAB115et pSB032*
	HN	565	1-40**	557	pAB114 et pSB034*
CHV-1	gB	878	702-769	701	pAB037 et pSB016*
	gC	459	422-452	421	pSB018etpSB019*
	gD	345	310-328	309	pAB038 et pSB017*
FHV-1	gB	949	761-834	760	pSB020 et pSB021*
	gc	534	495-526	494	pSB022 et pSB023‘
	gD :	374	328-353	327.	pÁB029 et pSB024‘
EHV-1	gB	980	801-875	800	pAB127 et pSB028*
	gc	468	429-455	428	PAB129 et pSB029*
	gD	402	348-371	347	pAB131 etpSB030*
EHV-4	gB	975	797-867	796	pAB136 et pSB025*
	gC	485	425-472	424	pAB137 et pSB026*
	gD	402	348-371	347	pAB138 et pSB027*

• · *· ·· · ·· · · • · · · · ··· · ·· 9

9 9 9 9 · · · ·«······ 9 9 999 99 9999

Ve sloupci I je uveden patogen, ve sloupci II antígen, ve sloupci III Číslo zbytku v nativní formě, ve sloupci IV doména TM, ve sloupci V číslo zbytku ve zkomoleném tvaru, a ve sloupci VI expresní plasmidy.

χ Plasmidy kódující zkomolené formy antigenů xx Tyto zvláštní geny HA CDV a HN CPI-2? transmembránové doména a sekvence smíšených signálů

Příklad 12

Metody molekulární biologie

Kultivace a čištění víru

Viry se kultivují na vhodných buněčných systémech až k dosažení cytopatického efektu. Pracovníkům v oboru jsou dobře známy buněčné systémy používané pro každý virus. Vhodné buňky se naočkkují studovaným virovým kmenem na několikanásobQ nou infekci 1 a inkubují se při teplotě 37 C po dobu nutnou k dosažení cytopatického efektu (alespoň 36 hodin).

V případě virů ADN se po kultivaci se roztok nad buňkami a lysované buňky shromáždí a buněčné úlomky se odstraní od středěním při 1000 g 10 minut pří teplotě 4 C. Virové částice se shromáždí ultraodstřeďováním při 400 000 g 1 hodinu pří teplotě 4 C. Sraženiny se přenesou do pufru o minimálním objemu (Tris 10 mM EDTA 1 mM) , Virové ARN se čistí standardními v oboru známými způsoby.

Extrakce genomové virové ADN

Koncentrované suspense virů se zpracují proteinázou K (100 mg/ml) v přítomnosti dodecy1sulfátu sodného (SDS) (5%) o

během 2 hodin při teplotě 37 C. Virová ADN se pak extrahuje ·· · · · * · · · · · • · · · · ··· · · · • · ··· · · · ·····»·· ·· ··· ·» ··· pomocí směsi fenol/chlorofora, načeš se vysráší dvěma objemy

Q absolutního ethanolu pří teplotě -20 C během 16 hodin a pak o

se odstřeďuje při 10 000 g po dobu 15 minut při teplotě 4 C. Shluky ADN se vysuší, načeš se vyjmou do minimálního objemu ultračisté sterilní vody.

Izolace virové genomové ARN

Genomová ARN každého viru se extrahuje za použití guanidinumthiokyanát/fenol-chloroformu, kterou popsalí Chomczynski a N. Sacchi (Ana1.Biochem. 162, str. 156 až 159, 1987).

Techniky molekulární biologie

Všechny konstrukce plasmidů se provádějí za použití standardních způsobů molekulární biologie, které popsal Sambrook a kol. (Molecular Cloninhg: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spríng Harbor Laboratory, Cold Spríng Harbor, New York, 1989). Všechny restrikční fragmenty, použité v tomto vynálezu, se izolují za použití kitu Geneclean (BI0101 lne. La Jolla, CA.). R těmto konstrukcím se klonované fragmenty ADN, stejně jako spojení s expresními vektory, sekvencují způsobem, který popsal Sanger (Sambrook a kol. 1989),

PCR a RT-PCR

Specifické oligonuleotidy genů nebo klonovaných fragmentů genů se syntetizují, přičemž některé z nich nesou v určitých případech na svém vnějším zakončení 5 restrikční místa usnadňující klonování zesílených fragmentů. Reakce transkripční inverze (RT) a řetězcové zesílení polyaerázou (PCR) se provedou standardními způsoby (Sambrook a kol. 1989).

Čištění plasmidů ve velkém měřítku

Produkce stupně několika desítek mg vyčištěných

5ο

plasmidu.. vstupujících do vakcinových komposic, se provádí způsobe® gradientů chlorid cesia-brid ethidia (Sambrook a kol. 1989).

Příklad 13

Formulace vakcinačních plasmidu

Roztok ADN, obsahující jeden nebo několik plasmidu podle příkladů 2 až 10, se koncentruje ethanolovým vysrážením jak to popsal Sambrook a kol. (1989). Sraženina ADN se vyjme do 0,9% roztoku chloridu sodného k získání koncentrace 1 mg/ml. Roztok DMRIE-DOPE s 0,75 mM se připraví vyjmutím lyofilizátu DMRIE-DOPE na objem upravený sterilní vodou.

Plasmídicko-1ipidové komplexy ADN se připraví ředěním stejných dílů roztoku DMRIE-DOPE 0,75 mM roztokem ADN ma 1 mg/ml v 0,9% chloridu sodné®. Roztok ADN se zavádí postupně pomocí sterilní jehly 26G podél stěny flakonu obsahujícího roztok kationtového lipidu způsobem k vyloučení tvorby pěny. Postupuje se mírným mícháním až do dosažení směsi obou roztoků. Nakonec se získá kompozice, obsahující 0,375 mM DMRIE-DOPE a 500 ug/ml plasmidu.

Doporučuje se udržovat soubor používaných roztoků na teplotě okolí pro dále popsané operace. Konplexace ADN/DMRIE-DOPE se provádí při teplotě okolí během 30 minut před provedením imunizace zvířat.

Příklad 14

Imunizace psu proti CDV

Subkutánní nebo intramuskulární cestou se injektují 2 ml a injekce se opakuje po 28 dnech. Celkové množství použitého « *4 4 * * *9 ** • » » 4 ·»·· »··« » 4 · * · ♦ » <

4 4 4 4 « 4 ® * · · Λ 4 4 · * · ···> Ι·(» «44 4« 4·»« plasmidu při každé imunizaci je 100, 500, 1000 nebo 2000 ng podle vakcin. Pracovníci v oboru mají potřebné znalosti k upravení objemu nebo koncentrace v závislosti na dávce potřebného plasmidu.

14.1 Zkouška virulence

Použitý zkušební kmen odpovídá předchozímu odběru ze psa infikovaného virem nemoci Carreovy, kmene Snyder Hill desetinásobně zředěnému pufrem PBS. Roztok se konservuje až do použití na sekaném ledu. Po celkové anestezi se zkušební kmen. zředěný na desetinu, podá íntrakraniální cestou v ojemu 0,5 ml 49 dní po první injekci.

14.2 Klinický posup po zkoušce

Denní klinický postup se provádí během 21 dní po zkoušce a pro každého psa znamená klinickou zkoušku ke zjištění eventuálních klinických známek nemocí Carreovy nemoci a zjitění rektální teploty.

Klinická zkouška zahrnuje:

- pozorování celkového stavu zvířete ve 4 stupních:

“dobrý stupeň 0, apatický stupeň 1, depresivní“ stupeň 2 a úplné vysílení stupeň 3. Uhynutí zvířete má klinické označení stupeň 10;

- vyhodnocení okulo-nasálních symptomů (sledování výtoku sérového nebo hnisavého rýmy a/nebo spoj i vek) : sérový spojívkovo-rýmový s nosní® výtokem se hodnotí jako stupeň 1, výtok hnisavý jako stupeň 2;

- vyhodnocení zažívacích symptomů (zjištění známek zánětu střevní sli zníce): mírné se hodnotí jako stupeň 1, závažné jako stupeň 2;

- vyhodnocení nervových symptomů (zjištění myoklonií, křečí a ochrnutí): jedna myoklonie odpovídá stupni 1, jedna křeč ·· * · ·· · ·» · -e • · · · · ··· · · « » • · · · · «· · • ···· ···· · • · · · · ··· ········ ·· ··· ·· ···· stupni 2 a ochrnutí stupni 3;

- důsledky tělesné teploty zvířete:

e teplota nižší nebo rovná 37,5 C odpovídá stupni 3. teplota

37,5 až 39,5 C odpovídá stupni 0, teplota 39,5 C nebo 39,5 až 40 C odpovídá stupni 1, teplota 40 C nebo 40 až 40,5 C oda povídá stupni 2 a teplota vyšší než 40,5 C se hodnotí jako stupeň .

U zvířat podrobených zkoušce se odebrání se zjišťuje výskyt viru Carreovy nemoci imunof1uorescencí.

Globální s klinický stupeň se vypočte takto'· pro každý klinický význak se stanoví průměrný stupeň pro skupinu zvířat ve sledovaném období a celkový stupeň je součtem jednotlivých stupňů pro 5 uvažovaných klinických význaků.

Výsledky zkoušek po imunizaci psů intramuskulární cestou:

Plasaid	Foriulaee	; Antigen Dávka	Cytokiny Mortalita Klinický Odezva x
		»9	stupeň protilátek
kontroli	li -	-	4/4 26, i	0.3 í 0.3
pBSOÍ8	-	Ha naliv. 50	4/5 21.6	0.3 í 0,2
pPB229		F naliv, 50
pHS0i8	DMRIE-	Ha naliv. 50	í/5 7.8	0.8 í 0.3
PPB229	DOPE	F naliv. 500
PHS024	DMRIE-	HA optia. 50	1/5 7.2	1.9 í 0.8
P8S02!	DOPE	ř opii®. 50

pt)S024 DMRIE- BA optia. 50

0/5 0.6 1,5 í 0.3

PSS021 DOPE F optis. 50 χ průaěr í střední odchylka

Plassíd Forsulace Antigen Dávka Cytokíny Mortalita Klinický Odezva χ

Mg stupeň protilátek

kontrolní -	Ha naliv, 50 ř naliv. 50	4/4	25,0	0,2 +1.0
pHSOlS PPB229	DilRIE- DOPE	5/5	24,4	0.2 í 0.0
pBSOIS	DMRIE-	Ha naliv. 500	3/5	19.0	0.4	i 0.2
PPB229	DOPE	F naliv. 500
pBS024	DMRIE-	HA optis. 500	1/5	9,2	0.6	í 0,7
pBS02i	DOPE	F optis. 500
pHS024	DMRIE-	HA optis. 500	0/5	2.4	1,7	í 0.9
pMSG2i	DOPE	F optis. 500
pJP084		200 Gtt-CSí
pIlSOS-í DMRIE-DOPE HA optíb.500	0;5	0,8	1.4	í 1.0
PÍ1S024	DMRIE-	HA opii». 500	0/5	5,0	i, 4	í 1,3
přiSOSi	DOPE	ř optií. 500
přtSOí 6		K naliv. 500
pííSOí 7		K naliv, 500

χ prúeěr i střední odchylka

Plasmidy pNS016 a pNSOí? začleňující nativní gen M a na • · #> · · ··· ······· · · ··· ·· ···· tivní gen N jsou konstruovány stejným způsobem jako pNSOlS.

Lze konstatovat, že získané výsledky ochrany se samotným optima1 izovaným HA jsou lepší nebo rovné výsledkům získaným s optimalizovaným Ha a F nebo s optimalizovaným Ha a F + nat ivn í M a N.

Je zřejmé, že vynález definovaný připojenými patentovými nároky není omezen shora popsanými způsoby provedení, avšak zahrnuje upravená provedení v rámci vynálezu.

Pr-ůays I ová využ i te 1 nost

Sloučeniny pro výrobu vakcin pro domácích zvířata, zvláště pro psy a kočky a pro sportovní koně proti jejich nejčastějším chorobám,

Claims (44)

1. Vakcina ADN proti pathogenu post ihujíaípó domácí zvířata nebo zvířata sportovní, zvláště psy, kočky nebo koně, vyznačující se t í m, že jí tvoří plasmid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující imunogen pathogenu uvažovaného druhu zvířat v podmínkách umožňujících expresi in vivo těchto sekvencí a kationtový lipid obsahující quaternární aaioniovou sůl obecného vzorce I

   CH₃

   Rí-O-CHa-CH-CHa-N'

   Ra - i ( I) i i

   ORi CH₃ kde znamená

   Ri alifatickou, lineární skupinu nasycenou nebo nenasycenou s 12 až 18 atomy uhlíku,

   Rs jinou alifatickou skupinu se
2. 2 až
3. 3 atomy uhlíku a X skupinu hydroxylovou nebo aminoskupinu, přičemž lipidem je s výhodou H-(2-hydroxyethy1)-N,N-dimethy1 -2, 3-bis<tetradecyloxy)-l-propanaaonjuB (DMRIE).

   81,

   Vakcina podle nároku 1, vyznačující se obsahuje také dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE).

   Vakcina podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj í c í obsahuje také protein GM-CSF uvažovaného druhu zví řat
4. 4. Vakcina podle nároku 1 nebo 2. vyznačuj í c í se t i ®, Se obsahuje také expresní vektor obsahující gen kódující protein GM-CSF uvažovaného druhu zvířat v podmínkách umožňujících expresi in vivo této sekvence.

   Vakcina podle nároku vyznač tím, Se expresním vektorem je plasmid.
5. 6. Vakci na podle nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, kódující ímunogen patogenu, je sekvencí genu, z něhož byla vypuštěna část kódující transmetnbránovou doménu.
6. 7. Vakcina podle nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že plasmid, nesoucí nukleotidovou sekvenci kódující ímunogen patogenu, nese také nukleotidovou sekvenci kódující tPA.
7. 8. Vakcina podle nároku 1 až 7, vyznačující se t ί ®. že plasmid, nesoucí nukleotidovou sekvenci kódující imunogen patogenu, nese také stabilizační intron.
8. 9. Vakci na podle nároku 7, vyznačuj í c í t í m, že intronem je intron II genu králičího /3-globinu.

   Vakci na podle nároku 1 vyznačuj t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci CDV.
9. 1 1 t í m, že sekvencí,

   Vakc i na podle- nároku 10, vyznačuj íci se obsahuje sekvenci genu HA optimízovanou signální zvláště sekvencí signálu tPA lidského původu, místo signální sekvence peptidu HA a/nebo vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu HA a/nebo začleněním intronu II genu králičího β-globínu na začátku genu HA.
10. 12. Vakci na podle nároku 10, vyznačuj ící se tím. Se obsahuje sekvenci genu F optifflizovanou signální sekvencí, zvláště sekvencí signálu tPA lidského původu. místo signální sekvence peptidu F a/nebo vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu F a/nebo začleněním intronu II genu králičího β-globinu na začátku genu F.

    «· ·· ·· * ·· ·· • ·· · · «·· · «· · • · ··· ··· ········ · · ··· ·· ····
11. 13. Vakcina podle nároku 10 aš 12, vyznačuj ící se Lim, že obsahuje ve stejném plasmidu nebo v jiném plasmidu sekvenci genu M nebo N.
12. 14. Vakcina podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje DMRIE-DOPE, expresní plasmid kódující antigen HA CDV optimalizovaný substitucí signální sekvence HA peptidovou signální sekvencí lidské tPA, vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu HA a začleněním intronu II genu králičího β-globinu na začátku genu HA, druhý expresní plasmid kódující antigen F optimalizované CDV vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódujcí transmeabránovou doménu F & začleněním intronu II genu králičího β-globinu na začátku genu F.

    i na podle nároku 14, vyznačuj i c i obsahuje expresní plasmid kódující psí GM-CDSF.
13. 16. Vakcina podle nároku 1 až 5, vyznačuj í se obsahuje nuk1eoti dovou sekvenci CPI-2.
14. 17. Vakcina podle nároku 16, vyznačující se t í m. že obsahuje sekvenci genu F CPI-2 optimizovanou substitucí signální sekvencí, zvláště tPA lidského původu, signální sekvenci proteinu F a/nebo vypuštění© fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu F a/nebo začleněním intronu, svláště intronu II genu králičího β-globinu na začátek genu F.
15. 18, Vakcina podle nároku 16, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje sekvenci genu HN CPI-2 optimizovanou substitucí signální sekvencí, zvláště tPA lidského původu, signální sekvencí proteinu HN a/nebo vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu F a/nebo začleněním intronu, zvláště intronu II genu králičího β-globinu na začátek genu

    HN.
16. 19.

    Vakcina podle nároku 16, vyznačuj ící tím, že obsahuje DMRIE-DOPE, expresní plasmid kódující antigen F CPI-2 optimizovanou vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence F kódujícího transmembránovou doménu a začleněním intronu, zvláště intronu II gersu králičího 0-globinu na začátek F a druhý expresní plasmid kódující antigen HN CPI-2 optimalizovaný začleněním signální sekvence lidské tPA místo signální sekvence HN vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu HN a začleněním intronu II genu králičího £5-glób i nu na začátek HN .
17. 20. Vakcina podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje expresní plasmid kódující psí GM-CSF.
18. 21. Vakcina podle nároku 1 až 5, v y z n a dující s < t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci CHV-1.
19. 22. Vakcina podle nároku 21, vyznačuj ící se t í m, še obsahuje sekvenci genu gB CHV-1 optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gB.
20. 23. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se tím, še obsahuje sekvenci genu gC CHV-1 opt i si i zovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gC.
21. 24. Vakcina podle nároku 21, v yznačující se t i m, še obsahuje sekvenci genu gD CHV-1 optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gD.
22. 25. Vakcina podle nároku 21, vyznačuj ící se t í m. Se obsahuje DMRIE-DOPE. expresní plasmid kódující antigen gB, druhý plasmid kódující antigen gC, třetí plasmid kódující antigen gD, přičemž gB, gC a gD jsou optimalizovány vypuštěním fragmentu nukleotidové sekvence kódující transmembránovou doménu.

    • · · · · · · · · ·· • »· · · · · · · ·· ·
23. 26. Vakcina podle nároku 25, vyznačující se tím, že obsahuje expresní plasmid kódující psí GM-CSF.
24. 27. Vakcina podle nároku 1 aš 5, vyznačující se tím, še obsahuje nukleotidovou sekvenci FHV-1.
25. 28. Vakcina podle nároku 27, vyznačující se tím, še obsahuje sekvenci genu gB FHV-1 optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gB.
26. 29. Vakcina podle nároku 27, vyznačující se t í m, še obsahuje sekvenci genu gC FHV-1 optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transieabránovou doménu gC.
27. 30. Vakcina podle nároku 27, vyznačující se t í m, še obsahuje sekvenci genu gD FHV-1 optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gD.
28. 31. Vakcina podle nároku 27, vyznačující se t í m, še obsahuje DMRIE-DOPE, expresní plasmid kódující antigen gB, druhý plasmid kódující antigen gC, třetí plasmid kódující antigen gD, přičemž gB, gC a gD jsou optiBali2ovány vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu.
29. 32. Vakcina podle nároku 31, vyznačující se t í m, že obsahuje expresní plasmid kódující kočičí GM-CSF.
30. 33. Vakcina podle nároku í až 5, vyznačuj í c í se t í m, Se obsahuje nukleotidovou sekvenci EHV-1.
31. 34. Vakcina podle nároku 33, vyznačující se t l m, že obsahuje sekvenci genu gB optimizovanou vypuštěním fragsentu ADN kódujícího transaeibránovou doménu gB.
32. 35. Vakcina podle nároku 33, vyznačující se t I m, še obsahuje sekvenci genu gC optímizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gC.
33. 36. Vakcina podle nároku 33, vyznačující se t í m, že obsahuje sekvenci genu gD opt i nt i zovanou vypuštění® fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gD.
34. 37. Vakcina podle nároku 33, vyznačující se tím, že obsahuje DMRIE-DOPE, expresní plasmid kódující antígen gB, druhý plasmid kódující antígen gC, třetí plasmid kódující antígen gD, přičemž gB, gC a gD jsou optimalizovány vypuštěním fragmentu nukleidové sekvence kódující transmembránovou doménu.

    3R t í ffi,

    Vakcina podle nároku. 37, vyznačuj ící obsahuje expresní plasmid kódující koňský GM-CSF.

    Vakcina podle nároku í aš 5, v y z n a O u j í c í s t í m že obsahuje nukleotidovou sekvenci EHV- 4. 40 . Vakcina podle nároku v y z n a č u j í o í s e

    t í a. že obsahuje sekvenci genu gB opti mízovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gB.
35. 41, Vakcina podle nároku 33, vyznačující se t í m, že obsahuje sekvenci genu gC opti®ízavanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gC.
36. 42. Vakcina podle nároku 33, vyznačuj ící se t í m, Se obsahuje sekvenci genu gD optimizovanou vypuštěním fragmentu ADN kódujícího transmembránovou doménu gD.
37. 43. Vakcina podle nároku 33, vyznačující se t í m, že obsahuje DMRIE-DOPE, expresní plasmid kódující antígen gB, druhý plasmid kódující antígen gC, třetí plasmid kódující antígen gD, přičemž gB, gC a gD jsou optimalizovány vypuštěním fragmentu nukleidové sekvence kódující transmembráriovou doménu.

    Vakcina podle nároku 37, v y tím, že obsahuje expresní plasmid kódující koňský GM-CSF.
38. 45. Vakcína podle nároku 1 až 5, vyznačující se t í m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující imunogen patogenu voleného ze souboru zahrnujuícího: virus vztekliny, CPV, CCV, Borrelia burgdorferí, FCV, FPV, FIPV, FeLV, FIV, virus koňské chřipky, virus východní koňské encefalitidy, virus západní koňské encefalitidy, virus Venezuelské koňské encefalitidy a Clostridium tetani.
39. 46, Vakcína proti psím patologiím, vyznačuj ící se tím, že obsahuje dvě nebo tři vakciny ze souboru zahrnujícího vakciny podle nároku 10 až 15, vakcínu podle jednoho z nároků 16 až 20 a vakcínu podle nároku 21 až 26.
40. 47. Vakcína protni koňskému viru herpes, vyznačuj ία í se tím, že obsahuje vakcínu podle nároku 39 až 44.
41. 48, Několikaúčelová vakcína, vyznačující se t í m, že obsahuje kteroukoli z vakcin podle nároku 1 aě 47 a klasickou vakcínu typu neaktiviované vakciny, vakciny zesílené v živém stavu, nebo vakciny podjednotkové nebo rekombínované používající expresní vektor in vivo.
42. 49. Vakcína podle nároku 1 až 47, vyznačující se t í m, že obsahuje množství ADN s obsahem 10 až 1000 ug, s výhodou 50 aě 500 ug pro každý plasmid.
43. 50. Použi t í k přípravbě vakciny ADN podle kteréhokoli nároku 1 až 47 a 49 vakciny určené k podávání intramuskulární cestou.
44. 51. Použití vakciny ADN podle kteréhokoli nároku 1 až 47 k přípravbě vakciny určené k podávání subkutánní cestou