CN117721150A

CN117721150A - 一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用

Info

Publication number: CN117721150A
Application number: CN202211129212.0A
Authority: CN
Inventors: 徐建青; 张晓燕; 白诗梦
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2024-03-19

Abstract

本文提供了一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用。本文具体提供了一种狂犬病免疫原核酸表达载体，其从5'端至3'端依次包含：(a)5'‑UTR元件；(b)编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV‑G)的开放阅读框元件；(c)3'‑UTR元件；(d)总长度为120nt以上的多聚腺苷酸尾元件；还提供了包含该狂犬病免疫原核酸表达载体狂犬病疫苗；以及所述表达载体和疫苗的制备和应用。

Description

一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用

技术领域

本公开属于生物医药产业领域，尤其涉及基因工程药物和疫苗制造。具体而言，本公开涉及一种高效表达狂犬病免疫原的mRNA疫苗、其构建以及在狂犬病防治中的应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)感染引起的急性传染病，潜伏期一般为1至3个月。多数情况下携带狂犬病病毒的犬、猫等动物唾液中的RABV会沿着被其咬伤者的周围神经系统播散并最终感染中枢神经系统(CNS)。一旦出现明显的临床症状，患者的死亡率几乎达100％。即便感染RABV后存活的患者亦通常伴随有严重的神经元损伤。全球每年因狂犬病病毒感染导致约59,000人死亡，主要发生在亚洲和非洲的发展中国家。近。

目前针对狂犬病病毒的预防和治疗，主要以灭活疫苗为主。由于灭活疫苗免疫原性较差，其需要多次接种，一般暴露前预防接种需要3次，暴露后防治兼顾则需接种4～5次；并且，根据暴露的严重程度，有时还需注射免疫球蛋白。这不仅增加了免疫接种的成本，也降低了患者的依从性。

狂犬病病毒糖蛋白(G)是唯一展示在病毒表面的蛋白，是诱导机体产生中和抗体(VNA)的唯一靶标，可提供针对RABV攻击的全面保护。以体外表达的RABV-G作为免疫原的疫苗称为亚单位狂犬病疫苗。目前采用传统的原核表达系统、昆虫表达系统、黑腹果蝇S2细胞表达系统等生产的RABV-G均显示一定的免疫原性，哺乳动物细胞HEK-293T表达的嵌合三聚体功能域的RABV-G胞外域融合蛋白免疫原性更好，可保护小鼠免受致死性攻击。然而，体外表达的重组蛋白因生产周期长、工艺复杂、产量较低等因素，目前国内还处于临床前研究阶段，国外也只有美国Novavax开发的狂犬病G蛋白候选疫苗处于I/II期临床试验阶段。

用于狂犬病病毒暴露后预防的被动免疫制剂主要是抗狂犬病血清和狂犬病人免疫球蛋白。2016年12月，印度血清研究所研发的重组抗狂犬病病毒单抗注射液Rabishield(SII RMab)被批准上市。印度Zydus Cadila开发的鼠源单抗混合制剂Twinrab(RabiMabs)也于2019年9月在印度获得批准I期临床研究，尚未披露临床试验结果。国内华北制药自主研发的首个抗狂犬病病毒单抗药物重组人源抗狂犬病病毒单抗注射液(rhRIG)，于2020年07月04日申报上市，与人用狂犬病疫苗联用以期发挥被动免疫作用。

目前，重组病毒载体类狂犬病疫苗主要为野生动物口服用狂犬病疫苗。基于复制型重组痘病毒载体疫苗(V-RG)已在北美洲使用多年，但其在部分野生动物中保护效果不是很理想；金丝雀痘病毒(canarypox)载体重组狂犬病疫苗(Feline Rabies和Rabies，Merial)在猫上可提供3年的免疫保护；基于人5型腺病毒(humanadenovirus 5，AdHu5)载体开发的/>也具有较好的免疫效果。近年来非人灵长类腺病毒载体疫苗发展迅速，如黑猩猩腺病毒载体狂犬病疫苗(ChAd68-Gp)能为比格犬提供致死剂量的RABV(CVS-11)攻击保护。然而，病毒载体类疫苗的开发需要考虑如何克服宿主的“预存免疫”，避免疫苗接种后激起机体对载体本身的应答而降低疫苗的免疫保护效果。因此，本领域中有必要开发新型狂犬病疫苗。

mRNA(信使核糖核酸)疫苗可在体外进行转录合成，避免了细胞培养、生产和复杂的工艺放大等问题，并且可在短时间内大量生产，安全有效，工艺简单，为新型高效狂犬病疫苗的研发带来曙光。国内外先后有不同厂家探索开发狂犬病核酸疫苗并进入临床试验阶段，其中，德国CureVac AG公司开发的以狂犬病病毒糖蛋白(G)为免疫原的狂犬病疫苗(CV7201)在2017年公布了其临床I期试验结果，但因接种剂量较高及接种方式的差异导致部分患者出现了肌肉疼痛等较多的不良反应。2021年，该公司公布了其新型的mRNA-LNP制剂CV7202的临床I期实验结果，但低剂量组需要接种2针才可诱导出符合WHO标准的狂犬病病毒抗体，而高剂量组则有较高的不良反应发生率。此外，珠海丽凡达生物技术有限公司于2020年1月份公布其开发的mRNA狂犬病疫苗，在该疫苗的动物模型评价中，小鼠模型评价时需肌肉接种5μg，体外评价其血清可产生保护性抗体；比格犬模型评价需肌肉接种20μg，可诱导出有效的中和抗体，目前该疫苗还处于临床前阶段。

在保证安全性的前提下，如何获得一种免疫原性更好、低剂量即可达到足够保护效果，临床规模生产时具有更低生产成本的狂犬病疫苗是目前本领域中狂犬病疫苗开发设计的重要目标。

发明内容

本文中提供了一种新型的狂犬病免疫原核酸表达载体、包含该表达载体的狂犬病疫苗及其制备方法和应用。本文的狂犬病免疫原核酸表达载体和疫苗能够在体内外高效表达狂犬病免疫原(例如RABV-G)，并产生优异的保护和中和效果，从而实现对狂犬病的有效预防和/或治疗。

在一些方面中，本文提供了一种狂犬病免疫原核酸表达载体，其从5'端至3'端依次包含：

(a)5'-UTR元件；

(b)编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的开放阅读框元件；

(c)3'-UTR元件；

(d)总长度为120nt以上的多聚腺苷酸尾元件，其包含：

多个腺苷酸串，每个腺苷酸串各自独立地包含n个连续的腺苷酸，n为10～80之间的整数，且所述多个腺苷酸串的腺苷酸总个数为100个以上；

位于所述多个腺苷酸串之间的连接子，所述连接子各自独立地不包含腺苷酸或仅包含1个或2个腺苷酸。

在一些方面中，本文提供了一种狂犬病mRNA疫苗，其包含本文的核酸表达载体，以及包装物和/或用于该核酸表达载体的递送系统和/或药学上或生理学上可接受的运载体。

在一些方面中，本文还提供了本文核酸表达载体和/或疫苗在制备狂犬病预防和/或治疗的产品中的应用。

在一些方面中，本文还提供了狂犬病预防和/或治疗狂犬病的方法，所述方法包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的本文核酸表达载体和/或疫苗。

在一些方面中，本文还提供了用于狂犬病预防和/或治疗的本文核酸表达载体和/或疫苗。

在一些方面中，本文还提供了制备如本文所述核酸表达载体或疫苗的方法，所述方法包括：提供独立或连接的各元件；将各元件组装成核酸表达载体。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本公开作进一步说明。这些附图仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。

图1：体外转录的RABV-G mRNA转染HEK293细胞的表达验证。

图2：用RABV-G mRNA疫苗免疫小鼠后的抗体滴度以及中和效果：

图2A：用不同剂量的RABV-G mRNA疫苗初免小鼠后，小鼠的体液免疫应答水平(纵坐标为log以10为底的对数)；

图2B：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗加强免疫小鼠后，小鼠的体液免疫应答水平(纵坐标为log以10为底的对数)；

图2C：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗初免后小鼠体内诱导的抗体针对狂犬病病毒的中和效果；

图2D：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗加强免疫后小鼠体内诱导的抗体针对狂犬病病毒的中和效果。

ns：表示无显著性差异(not significant)；*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；****表示p<0.0001。

图3：RABV-G mRNA疫苗诱导的抗原特异性T细胞应答：

图3A：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗诱导的抗原特异性的CD8⁺T细胞(IFNγ阳性CD8⁺T细胞)应答；

图3B：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗诱导抗原特异性的CD4⁺T细胞(IFNγ阳性CD4⁺T细胞)应答；

图3C：不同剂量的RABV-G mRNA疫苗诱导抗原特异性的CD4⁺T细胞(IL-4阳性CD8⁺T细胞)应答。

ns：表示无显著性差异(not significant)；*表示p<0.05；**表示p<0.01。

图4：单剂量1μg组的RABV-G mRNA疫苗攻毒保护效果：

图4A：攻毒保护后动物的体重变化结果；

图4B：攻毒保护后动物的存活率变化。

具体实施方式

针对现有技术中存在的问题，本文中提供一种可编码RABV-G蛋白的mRNA载体，该mRNA可高效的表达狂犬病病毒的糖蛋白，可用于狂犬病的预防和治疗。本文中提供的RABV-G mRNA狂犬病疫苗，采用较低剂量，单剂量肌肉注射，接种后14天即可诱导高滴度具有保护效果的抗体，并可保护动物能够完全抵抗致死性剂量狂犬病病毒的攻击，也可有效诱导针对RABV-G特异性T细胞应答。本文的RABV-G mRNA疫苗经2针免疫后可诱导高于WHO检测标准(0.5IU/mL)约2000倍的有效保护性抗体。本文的mRNA狂犬病疫苗具有良好的免疫原性，并在免疫机体后形成强效的免疫保护，且生产成本低、制备技术操作简便，适用于快速高效、规模化的疫苗制备，具有巨大的开发潜力。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“真核生物”可包括人、灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠)、驯养动物或畜牧哺乳动物。

本文所述的高度序列同一性，包括具有70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上，如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列同一性，这些高同一性序列也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列同一性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

狂犬病免疫原核酸表达载体及包含该载体的疫苗

本文中提供了一种狂犬病免疫原核酸表达载体，其从5'端至3'端依次包含：

(a)5'-UTR元件；

(b)编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的开放阅读框元件；

(c)3'-UTR元件；

(d)总长度为120nt以上的多聚腺苷酸尾元件，其包含：

在一些实施方式中，所用5'-UTR元件的长度为10～200nt，例如15～100nt。在一些实施方式中，所用5'-UTR元件为来自细胞内高翻译效率丰度高的蛋白质。

在一些实施方式中，所用5'-UTR元件源自下组中的一种或多种5'-UTR：人α-球蛋白、β-球蛋白、核糖体蛋白(RP)、微管蛋白β-2B、补体因子3(C3)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、载脂蛋白A-II(APOA2)、人类血红蛋白亚基β(hHBB)、血红蛋白A1(HBA1)、血红蛋白A2(HBA2)、登革热病毒(DENV)。

在一些实施方式中，所用5'-UTR元件具有如SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少80％的序列同一性。

在一些实施方式中，所用3'-UTR元件为来自细胞内高翻译效率丰度高的蛋白质。在一些实施方式中，所用3'-UTR元件为来源于哺乳动物或病毒的3'-UTR，例如来源选自下组的3'-UTR或其组合(如串联序列)：人α球蛋白、人β球蛋白、人白蛋白、人肌动蛋白、人血红蛋白亚基α1(HBA1)、细胞色素B-245α链(CYBA)、真核生物线粒体(Mit)的序列、SARAS-Cov-2、登革热病毒(DENV)、萝卜皱病毒(TCV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草蚀刻病毒(TEV)。

在一些实施方式中，所用3'-UTR元件包含选自下组一个或多个3'-UTR分子：α球蛋白3'-UTR、真核生物线粒体3'-UTR、白蛋白3'-UTR、β球蛋白3'-UTR或其任意串联序列，优选α球蛋白3'-UTR、真核生物线粒体3'-UTR、或它们串联形成的3'-UTR。

在一些实施方式中，所用3'-UTR具有如SEQ ID NO:3所示的序列，或与其具有至少80％的序列同一性的序列。

在一些实施方式中，所用多聚腺苷酸尾元件的总长度为120～400nt，例如120～350nt，120～320nt，或其中的任意整数，例如120、304nt。在一些实施方式中，各腺苷酸串各自独立地包含10～80个、20～70个、25～60个、30～50个或其中任意整数个连续的腺苷酸，如20个、30个、33个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个连续腺苷酸。

在一些实施方式中，多聚腺苷酸尾元件还进一步包含位于所述元件一个或两个端部的连接子。在一些实施方式中，连接子的长度各自独立地为3～15nt，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15nt。在一些实施方式中，连接子各自独立地不包含腺苷酸，或仅包含1个腺苷酸或2个腺苷酸。

在一些实施方式中，连接子的序列各自独立地选自：GCTATGACT、GTATGT、GCAAGT、GATTGC、GGCTGC、TACTGC、GGCTTC、GCATATGACT。

在一些实施方式中，多聚腺苷酸尾元件具有SEQ ID NO:4的序列，或与其中任何一者具有至少80％的序列同一性。

在一些实施方式中，所用开放阅读框元件为单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。在一些实施方式中，开放阅读框元件编码一个或多个来源相同或不同的RABV-G。

在一些实施方式中，RABV-G来源于选自下组的狂犬病病毒：巴斯德毒株中的Pitman-Moore(PM)株、Pasteur(PV)株、CTN株、aG株、Flury-LEP株、Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株、Street-Alabama-Duffering(SAD)株、KHUV(Khujand lyssavirus)、BBLV(Bokeloh bat lyssavirus)、ARAV(Aravan lyssavirus)、EBLV-1(European bat1lyssavirus)、EBLV-2(European bat 2lyssavirus)、IRKV(Irkutlyssavirus)、LBV(Lagosbat lyssavirus)、SHIBV(Shimoni bat lyssavirus)、MOKV(Mokola lyssavirus)、WCBV(West Caucasian bat lyssavirus)、IKOV(Ikomalyssavirus)、DUVV(Duvenhagelyssavirus)、ABLV(Australian bat lyssavirus)、GBLV(Gannoruwa batlyssavirus)或LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。

在一些实施方式中，RABV-G为产生狂犬病病毒中和抗体的主要免疫原，在多种狂犬病病毒间具有高度保守性。例如，RABV-G可来源于Pitman-Moore(PM)株。

在一些实施方式中，RABV-G包括选自下组的一种或多种分子：未经修饰或经真核修饰的RABV-G、其免疫原性片段或变体，所述分子能够诱导针对RABV的免疫中和和保护反应。

在一些实施方式中，编码RABV-G的元件经过或未经密码子优化、包含或不包含碱基修饰和/或核苷类似物。在一些实施方式中，编码序列根据真核生物密码子的偏好性进行优化。

在一些实施方式中，编码RABV-G的元件中的一个或多个尿嘧啶被选自下组中的一个或多个相同或不同的修饰碱基或核苷类似物置换：假尿苷、1-甲基尿嘧啶核苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选为N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的开放阅读框元件中50％～100％的尿嘧啶被置换。在一些实施方式中，表达载体序列中的50％～100％尿嘧啶被置换。通过置换能够提高mRNA在生物体内的稳定性。

在一些实施方式中，所述表达载体还包括5'-帽元件，其可选被修饰，例如所述5'-帽元件选自：m7GpppXpYp、m7GpppXmpYp、m7GpppXmpYmp、或其甲基化修饰序列、反向结合异构体、抗-反转帽类似物(ARCA)、N7-苄基二核苷四磷酸帽类似物。

在一些实施方式中，所述表达载体还包括启动子元件，例如T7启动子、sp6启动子或T3启动子。在一些实施方式中，所述表达载体还包括信号肽编码元件，例如指导目的蛋白亚细胞定位的信号肽(如跨膜信号肽、分泌信号肽、核定位信号肽)编码元件。在一些实施方式中，所述表达载体还包括酶切位点，例如XbaI、EcoRV、BamHI、XhoI。在一些实施方式中，所述表达载体还包括标签，例如用于目的分子鉴定、分离或纯化的分子标签，如Flag标签、HA标签。

在一些实施方式中，所述表达载体从5'端到3'端包含：包含SEQ ID NO:2所示序列的5'-UTR元件；编码RABV-G的开放阅读框元件；包含如SEQ ID NO:3所示序列的3'-UTR元件；包含如SEQ ID NO:4所示序列的多聚腺苷酸尾元件；或与所述各序列各自具有至少80％序列同一性的序列的元件。

在一些实施方式中，所述表达载体包含如SEQ ID NO:5或6所示的序列、或与其具有至少80％序列同一性的序列。

在一些实施方式中，所述核酸表达载体单独包含于包装物中，或与递送系统中的运载体组合，例如，所述递送系统选自：脂质递送系统、类脂递送系统、聚合物递送系统或其组合递送系统，例如加载于脂质纳米颗粒、阳离子脂质体、聚氨酯(PAA)、聚β氨基酯(PBAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、脂质包裹的聚合物胶束。

在一些实施方式中，所述核酸表达载体与脂质体纳米颗粒组合。在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒包括：阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和稳定脂质的组合。

在一些实施方式中，按摩尔百分比计算，所述脂质体纳米颗粒包括：20～50％阳离子脂质：20～50％结构脂质：5～20％辅助脂质：1～5％稳定脂质，更优选为50％阳离子脂质：38％结构脂质：10％辅助脂质：2％稳定脂质。

在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒中的阳离子脂质为选自下组中的一种或多种：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、己二酸二癸酯(DDA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、N,N-二甲基-4-吡啶胺(DMAP)，1,2-三乙醇胺-3-三甲基丙烷(DOTMA)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(Dlin-MC3-DMA)、KC2、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-1,3-二氧'戊环-4-乙'胺(Dlin-KC2-DMA)，优选为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(Dlin-MC3-DMA)。

在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒中的结构脂质包括胆固醇、胆固醇脂、固醇类激素、固醇类维生素或胆汁酸，优选为胆固醇。

在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒中的辅助脂质包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1,2二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，优选的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。

在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒中的稳定脂质包括聚乙二醇(PEG)-脂质，如PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二酰基甘油，优选为PEG修饰的二酰基甘油，更优选为长循环脂质体1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(PEG 2000-DMG)。

在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒中的阳离子脂质体与RABV-G mRNA质量比为10～30:1，优选为15～20:1。

在一些实施方式中，阳离子脂质纳米颗粒与优化后核苷修饰的RABV-GmRNA混合后，制备方法如下：将可电离阳离子脂质，结构脂质，辅助脂质和稳定脂质按配方比例溶解于乙醇中，制备得到有机相。将优化后核苷修饰的RABV-G mRNA溶于柠檬酸缓冲液(pH4.0)中，制备得到水相。使用推注混合器将有机相和水相以一定比例混合得到混合液，通过透析至PBS替换外部缓冲液，0.22μm无菌过滤器过滤混合液得到狂犬病毒核酸疫苗。所述的有机相和水相的比例1:2至1:5，优选为3:7。

在本文的一些方面中，提供了一种狂犬病mRNA疫苗，其包含：如本文所述的狂犬病免疫原核酸表达载体，以及包装物和/或用于该核酸表达载体的递送系统和/或药学上或生理学上可接受的运载体。

在一些实施方式中，疫苗中的核酸表达载体单独包含于包装物中，或与递送系统中的运载体组合，例如，所述递送系统选自：脂质递送系统、类脂递送系统、聚合物递送系统或其组合递送系统，例如加载于脂质纳米颗粒、阳离子脂质体、聚氨酯(PAA)、聚β氨基酯(PBAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、脂质包裹的聚合物胶束。

在一些实施方式中，疫苗中的核酸表达载体与脂质体纳米颗粒组合。在一些实施方式中，脂质体纳米颗粒包括：阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和稳定脂质的组合。

在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于选自下组的一种或多种给予或递送方式：呼吸道雾化吸入、滴鼻、口服、直接注射(例如静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射)、黏膜给药。

在一些实施方式中，所述疫苗还包含佐剂或与佐剂联合使用，例如所述佐剂选自：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21。

在一些实施方式中，疫苗的形式适于进行2种或以上药物或疫苗的组合给予，例如联合接种或序贯接种。

制备方法、相关产品及其应用

在本文的一些方面中，提供了制备本文所述的核酸表达载体或疫苗的方法，所述方法包括：提供独立或连接的各元件；将各元件组装成核酸表达载体。

在一些实施方式中，所述方法包括采用选自下组的一种或多种材料：DNA模板(例如PCR产物或已线性化的质粒DNA)、核酸酶、聚合酶、加帽酶、聚腺苷酸合酶、DNA酶、一个或多个元件分子、接头分子、天然或修饰的核酸分子、缓冲液、溶剂。

在一些实施方式中，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：对各元件进行设计、优化、改造和/或修饰；对中间产物和/或最终产物进行分离、纯化、鉴定、定量、包装和/或活性测试；将核酸表达载体与用于该核酸表达载体的递送系统和/或药学上或生理学上可接受的运载体组合。

在本公开的一些方面中，提供了本文的核酸表达载体和/或疫苗在制备用于预防和/或治疗狂犬病的产品中的应用。在一些实施方式中，所述狂犬病为由以下一种或多种狂犬病病毒引起的狂犬病：巴斯德毒株中的Pitman-Moore(PM)株、Pasteur(PV)株、CTN株、aG株、Flury-LEP株、Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株、Street-Alabama-Duffering(SAD)株、KHUV(Khujand lyssavirus)、BBLV(Bokeloh bat lyssavirus)、ARAV(Aravanlyssavirus)、EBLV-1(European bat 1lyssavirus)、EBLV-2(European bat2lyssavirus)、IRKV(Irkutlyssavirus)、LBV(Lagos bat lyssavirus)、SHIBV(Shimonibat lyssavirus)、MOKV(Mokola lyssavirus)、WCBV(West Caucasian bat lyssavirus)、IKOV(Ikomalyssavirus)、DUVV(Duvenhagelyssavirus)、ABLV(Australian batlyssavirus)、GBLV(Gannoruwa bat lyssavirus)或LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。

如本文所用，术语“药学上或生理上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的运载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了给药方便，将本文的活性物质制备成单次给药所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

应理解，所用活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本文的产品可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸核酸注射法；(2)将mRNA表达载体与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)使mRNA表达载体与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹mRNA表达载体后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)使mRNA表达载体与胆固醇结合使其保持时间增加；(6)用免疫脂质体转运mRNA以使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将mRNA表达载体体外转染给转载细胞；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将mRNA载体导入靶细胞。

本文还提供了一种用于预防和/或治疗狂犬病病毒感染和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开的一种或多种疫苗。可采用的接种方式包括但不限于：系统性免疫接种方式，如肌肉注射、皮下注射和皮内注射等，优选为肌肉注射和皮下注射，从给药程度的难易更优选为肌肉注射；呼吸道内免疫接种方式，如雾化、滴鼻等。在一些实施方式中，初次免疫采用系统性接种或呼吸道内接种，优选系统性接种。

在本公开的一些实施方式中，每两次接种之间的间隔至少为1周，例如2周、4周、2个月、3个月、6个月或更长间隔。

在一些实施方式中，采用mRNA疫苗进行初次免疫，并采用同种或其他类型的疫苗进行一次或多次加强免疫。本公开的免疫方法可采用“初免-加强”或“初免-加强-再加强”的方式，可采用单一的全身系统免疫或呼吸道局部免疫方式，或采用两种免疫方式的组合。

在一些实施方式中，以药物包或试剂盒的形式提供本文的组合产品，例如可将本文的一种或多种疫苗组合物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供疫苗组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料、方法与动物

实施例中的实验中所涉及到的RABV-G mRNA制备、阳离子脂质体纳米颗粒制备、动物免疫方案及检测方法如下：

I.RABV-G mRNA的制备

制备合适的DNA模板：以pCDNA3.1+为模板，进行改造，在T7启动子后从N端-C端依次包括：5'-UTR序列(SEQ ID NO:2)、编码序列(SEQ ID NO:1)、3'-UTR序列(SEQ ID NO:3)、含250个间插有连接子序列的连续腺苷酸的聚腺苷酸尾序列(SEQ ID NO:4)、线性化酶切位点XbaI，将修饰的狂犬病Pitman-Moore(PM)疫苗株糖蛋白(RABV-G)编码序列作为免疫原编码序列，插入到编码序列，并在编码序列C端插入酶切位点EcoRV和Flag标签，加入Flag标签以便后续的基因表达鉴定。其中，所构建的DNA模板序列(SEQ ID NO:6)根据真核生物密码子的偏好性进行优化，用于后续的体外转录实验。

体外转录、优化与修饰：转录试剂盒购自近岸蛋白质科技有限公司，以SEQ ID NO:6所述的质粒单酶切后为模板，按照合适的比例加入转录所需的NTP，并用1-甲基尿嘧啶核苷(ψ)替代尿嘧啶核苷(U)，使用T7聚合酶，转录得到相应的RABV-G mRNA(SEQ ID NO:5，5'UTR+RABV-GmRNA+(α-globin+Mit)3'UTR+250A，其中U被ψ取代，且含密码子优化)，然后通过酶加帽法同时使用牛痘病毒加帽酶和2'-O-甲基转移酶一步法进行加帽，将纯化后的RABV-G mRNA加上7-甲基鸟苷帽结构，用氯化锂纯化加帽后的mRNA，用于脂质纳米颗粒的制备。

修饰后的RABV-G mRNA序列

(转录后的产物序列，其中尿嘧啶核苷(U)替换为1-甲基尿嘧啶核苷(Ψ))

5'-GGGAAAΨAAGAGAGAAAAGAAGAGΨAAGAAGAAAΨAΨAAGAGCCACCGGAΨCCGCCACCAΨGGΨGCCCCAGGCCCΨCCΨGΨΨCGΨGCCACΨCCΨGGGCΨΨCΨCΨCΨGΨGCΨΨCGGCAAGΨΨCCCAAΨΨΨACACAAΨCCCCGACGAGCΨGGGCCCΨΨGGΨCCCCΨAΨΨGACAΨΨCACCACCΨGΨCΨΨGCCCAAACAACCΨGGΨGGΨGGAGGACGAGGGCΨGCACAAACCΨCAGCGAGΨΨCΨCΨΨACAΨGGAGCΨGAAGGΨGGGCΨACAΨΨAGCGCCAΨΨAAGGΨGAACGGCΨΨCACAΨGCACAGGCGΨGGΨGACAGAGGCCGAGACAΨACACCAACΨΨCGΨGGGCΨACGΨGACCACAACCΨΨCAAGAGAAAGCACΨΨCCGCCCΨACCCCCGACGCCΨGCCGCGCCGCCΨACAACΨGGAAGAΨGGCCGGCGACCCΨAGAΨACGAGGAGΨCCCΨGCACAACCCΨΨACCCCGACΨACCACΨGGCΨCAGAACAGΨGAGAACAACAAAGGAGΨCΨCΨCAΨΨAΨΨAΨCAGCCCAΨCΨGΨGACCGACCΨCGACCCΨΨACGACAAGAGCCΨCCACΨCΨAGGGΨGΨΨCCCAGGCGGCAAGΨGCΨCΨGGCAΨCACAGΨGΨCΨAGCACAΨACΨGCΨCΨACCAACCACGACΨACACAAΨΨΨGGAΨGCCAGAGAACCCACGCCCΨAGAACACCΨΨGCGACAΨΨΨΨCACCAACAGΨCGAGGCAAGCGCGCCΨCΨAAGGGCAACAAGACAΨGCGGCΨΨCGΨGGACGAGCGGGGCCΨGΨACAAGAGCCΨGAAGGGCGCCΨGΨAGACΨGAAGCΨGΨGCGGCGΨGCΨCGGCCΨGAGACΨGAΨGGACGGCACAΨGGGΨGGCCAΨGCAGACAΨCΨGACGAGACAAAGΨGGΨGCCCΨCCAGACCAGCΨCGΨGAACCΨGCACGACΨΨCCGCAGCGACGAGAΨΨGAGCACCΨGGΨGGΨGGAGGAAΨΨGGΨGAAGAAGCGCGAGGAGΨGCCΨCGACGCCΨΨAGAAΨCΨAΨΨAΨGACCACAAAGΨCCGΨGΨCΨΨΨCCGGAGACΨGΨCΨCACCΨGCGGAAGCΨGGΨGCCAGGCΨΨCGGCAAGGCCΨACACCAΨΨΨΨCAACAAGACACΨCAΨGGAGGCCGACGCCCACΨACAAGΨCCGΨGCGGACAΨGGAACGAGAΨCAΨΨCCAΨCΨAAGGGCΨGCCΨGAAGGΨGGGCGGCAGAΨGCCACCCΨCACGΨGAACGGCGΨGΨΨCΨΨCAACGGCAΨΨAΨΨCΨCGGCCCCGACGGCCACGΨGCΨGAΨCCCAGAGAΨGCAGΨCCΨCΨCΨGCΨCCAGCAGCACAΨGGAGCΨGCΨGAAGΨCCΨCΨGΨGAΨΨCCACΨCAΨGCACCCACΨCGCCGACCCAΨCΨACAGΨGΨΨCAAGGAGGGCGACGAGGCCGAGGACΨΨCGΨGGAGGΨGCACCΨCCCAGACGΨGΨACAAGCAGAΨΨΨCΨGGCGΨGGACCΨCGGCCΨCCCΨAACΨGGGGCAAGΨACGΨGCΨGAΨGACAGCCGGCGCCAΨGAΨΨGGCCΨCGΨGCΨCAΨΨΨΨCAGCCΨGAΨGACAΨGGΨGCCGCAGAGCCAACCGCCCCGAGΨCΨAAGCAGCGGΨCΨΨΨCGGCGGCACAGGCCGGAACGΨGΨCΨGΨGACAΨCΨCAGΨCΨGGCAAGGΨGAΨΨCCAΨCΨΨGGGAGΨCΨΨACAAGΨCCGGCGGCCAGACCAGGCΨGGAΨAΨCGACΨACAAAGACCAΨGACGGΨGAΨΨAΨAAAGAΨCAΨGACAΨCGAΨΨACAAGGAΨGACGAΨGACAAGΨAAΨAGACCGGΨΨGAΨAAΨAGGCΨGGAGCCΨCGGΨGGCCAΨGCΨΨCΨΨGCCCCΨΨGGGCCΨCCCCCCAGCCCCΨCCΨCCCCΨΨCCΨGCACCCGΨACCCCCGΨGGΨCΨΨΨGAAΨAAAGΨCΨGACAAGCACGCAGCAAΨGCAGCΨCAAAACGCΨΨAGCCΨAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGΨGAΨΨAACCΨΨΨAGCAAΨAAACGAAAGΨΨΨAACΨAAGCΨAΨACΨAACCCCAGGGΨΨGGΨCAAΨΨΨCAΨGCCAGCCACGAAΨΨCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCΨAΨGACΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGΨAΨGΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAAGΨAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAΨΨGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCΨGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAΨACΨGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCΨΨCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAΨCΨAGA-3'

II.包裹RABV-G mRNA的阳离子脂质纳米颗粒的制备

委托迈安纳(上海)仪器科技有限公司制备狂犬病mRNA脂质体纳米颗粒：将阳离子脂质Dlin-MC3-DMA、结构脂质胆固醇、辅助脂质DSPC和稳定脂质DMG-PEG2000，按50:38:10:2的摩尔比例溶解于乙醇中，乙醇浓度为30％(v/v)，得到油相混合液。然后，将该油相混合液于室温加入到50mM pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液中得到脂质混合物。将该脂质混合物加入脂质体挤出器，先用200nm滤膜挤出过滤，然后再用100nm滤膜过滤，使溶液从乳白变为澄清，得到阳离子脂质体纳米颗粒。

将优化后核苷修饰的RABV-G mRNA溶于柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)中，按照阳离子脂质纳米颗粒与mRNA质量比为20:1的比例，逐滴加入至阳离子脂质纳米颗粒中，使用振荡仪Vortex混匀得到混合液。彻底混匀后42℃金属浴加热孵育1小时，随后将混合液透析至无菌PBS，0.22μm无菌过滤器过滤后得到RABV-G mRNA阳离子脂质纳米颗粒，即狂犬病病毒核酸疫苗。

III.动物免疫方案

小鼠免疫实验分为2种方案，第一种方案将6～8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为4组，每组12只(其中6只用于体液应答检测，6只用于检测细胞免疫应答)，即阴性对照组、RABV-G高剂量组、RABV-G中剂量组、RABV-G低剂量组。各组均采用肌肉注射，试验第1天进行初次免疫，试验第21天进行加强免疫，每次免疫剂量相同，见表1。第二种免疫方案为一针免疫接种，选择RABV-G低剂量组，每组8只。单次免疫体积均为100μl。

表1

其中，RABV-G高剂量组、中剂量组、低剂量组的免疫剂量均指的是每次mRNA的免疫剂量。

IV.检测方法

A.采血：

小鼠在第1天进行初次免疫前采血，随后分别在第14天、第21天、第28天、第35天眼眶静脉丛采血，并于最后一次免疫后4周脱颈椎处死。将采集的小鼠全血收集于1.5mL无菌EP管，37℃静置使其自然凝血，将凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。随后将血清在56℃灭活30min，去除其补体活性。一针免疫接种组免疫4周后直接攻毒，不需要再采血。

B.酶联免疫吸附(ELISA)检测RABV-G结合抗体滴度：

用包被缓溶液(50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将RABV-G蛋白(武汉普建生物，ATAP10593)稀释到1ng/μL，100μl/孔，4℃孵育过夜。用PBST(含0.05％Tween-20)洗板1次，加入5％脱脂牛奶200μl/孔，37℃封闭2h。以5％脱脂牛奶为样品稀释液，将血清样品首孔稀释100倍，进行2倍倍比梯度稀释，加入至反应孔中，37℃反应1h。用PBST(含0.05％Tween-20)洗板5次后，拍干，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:5000)，100μl/孔，37℃下反应1h。用PBST(含0.05％Tween-20)洗涤6次，拍干后避光加入TMB底物缓冲液反应10min，加入2M硫酸终止液中止反应。在酶标仪450nm处读值(Biotek公司，酶标仪)。

分析数据，以阴性对照组读值的2.1倍为cut-off值，计算RABV-G特异性结合抗体稀释终点对应的滴度，以滴度的几何平均值(GMT)表示，利用Graphpad Prism8软件作图。

C.荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测血清真病毒中和抗体滴度：

参考英国犬源国际兽疫局(OIE)狂犬病实验室的标准操作程序。各孔内首先加入100μLDMEM完全培养基，首列孔加入50μL预先灭活后的血清样品，以多道移液器混匀，吸取50μL进入第2列，同法稀释至最后一列，混匀后吸弃50μL。取另一96孔板为对照板，按上述方式对标准阳性血清(军事医学科学院兽医研究所)(0.5IU/mL)、标准阴性血清(非免疫小鼠血清)进行稀释，同时设病毒重复滴定区，以及病毒对照、BHK-21细胞对照、培养基对照区。然后在每孔中加入50μL的100TCID50狂犬病病毒(病毒标准株CVS-11株)，细胞及培养基对照孔不加病毒，只加DMEM完全培养基。在37℃和5％CO₂条件下孵育1h。随后每孔中加入50μL的BHK-21细胞悬液，细胞密度为4E5个/mL，培养基对照孔不加细胞，在37℃和5％CO₂条件下孵育48h。孵育结束后弃细胞上清，进行固定和染色。先加80％丙酮溶液固定30min，弃固定液，晾干。加入抗狂犬病病毒核衣壳蛋白标记FITC的荧光抗体，每孔加入50μL1％的伊文思蓝染色液，37℃避光反应45～60min。荧光显微镜下观察是否存在一个或多个荧光细胞，将孔定性地分为“阳性”(有荧光为感染)或“阴性”(无荧光)。

血清滴度是50％孔中和100％病毒的稀释量(log D50)。0.5IU/ml为WHO推荐中和标准，在相同的实验条件下，具体计算待测血清和犬源国际兽疫局(OIE)参比血清的中和稀释液对定量病毒的半数中和稀释倍数，二者相比，再乘以标准血清效价(0.5IU/ml)即为待测血清狂犬病中和效价，以中和效价滴度的几何平均值(GMT)表示，用Graphpad Prism8软件作图。

D.胞内细胞因子染色法(ICS)分析RABV-G抗原特异性T细胞：

分离免疫后的小鼠脾脏细胞，制成单细胞悬液。每孔1E6个细胞铺于96孔中，加入终浓度为5μg/mL的狂犬病病毒糖蛋白肽库刺激，阴性对照组为DMSO组，阳性对照组为终浓度50ng/mL的PMA和5μg/mL的Ionomycin，37℃和5％CO₂条件下孵育1小时，加入BDGolgiStop^TMProtein Transport Inhibitor(1:1000)，37℃培养箱孵育5h，刺激结束。500g离心5min，PBS洗一次，然后进行荧光抗体染色(染色体系均为100μL，下同)。先用ZombieAqua^TM，小鼠CD8a-PB，小鼠CD4 PerCP-Cy5.5表染，室温下避光染色20min。PBS洗一次，500g离心5min。然后用Cytofix/Cytoperm(BD)固定，室温下避光固定20min，PBS洗一次，800g离心5min。通透细胞：将10x BD Perm/Wash^TM缓冲液用超纯水稀释为1×工作液使用，用1x BDPerm/Wash^TM缓冲液重悬细胞后，室温下避光孵育15min。800g离心5min，小心去除上清。用1xBD Perm/Wash^TM缓冲液稀释小鼠IFN-GMA FITC和小鼠IL-4APC，加入细胞悬液中染色。所有抗体均购自BD Biosciences。BD LSRFortessa流式细胞分析仪进行数据采集；每个样本至少收集30,000个细胞，随后使用FlowJo软件进行数据分析。

下面结合附图和具体实验进一步详细说明本申请的内容。除非特别说明，所用试剂、仪器、设备和方法均为本技术领域的常规市购试剂、仪器、设备和方法。

实施例1.RABV-G mRNA转染HEK293T细胞表达验证

用按上述实验方法I中制备的RABV-G mRNA转染HEK293T细胞进行表达验证。转染前24h将HEK293细胞以200000个细胞/孔的密度接种到12孔板，培养基为DMEM完全培养基(10％FBS和1％P.S.)，转染试剂为Lipofectamine 3000，每孔板转染2μg RABV-G mRNA，37℃孵箱培养40～48h。收集细胞到预冷的EP管，加入RIPA裂解缓冲液裂解细胞。进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜完毕后，置于5％的脱脂奶粉中室温封闭1小时。加入一抗(Rab-50，Santa Cruz，1:2000)，置于摇床4℃孵育过夜。PBST(含0.05％Tween-20)洗膜后加入羊抗鼠二抗(翊圣，33201ES60，1:5000)，室温摇床孵育1小时，PBST(含0.05％Tween-20)洗5次，每次洗3min。对膜进行显色，胶片采用定量分析仪曝光2分钟，记录并分析显色结果。

结果如图1所示，RABV-G mRNA转染HEK293T细胞后大量表达，可被抗狂犬病病毒抗体特异性识别，目的条带大小在60kDa位置，大小正确。

以上结果表明所构建的RABV-G mRNA可高效转染细胞，并有效表达目的蛋白。

实施例2.RABV-G mRNA疫苗诱导小鼠的体液免疫应答

本实施例中选用的mRNA为实施例一中验证表达正确的RABV-G mRNA，按上述实验方法II制备包裹RABV-G mRNA的阳离子脂质纳米颗粒。

用RABV-G mRNA脂质纳米颗粒疫苗免疫BALB/c小鼠评价其免疫原性，分别选取10μg(高，组4)、3μg(中，组3)和1μg(低，组2)三种不同的剂量，每组6只小鼠，肌肉注射，每只注射体积为100μl，阴性对照为等体积的未包裹核酸的阳离子脂质纳米颗粒。三种不同的剂量的疫苗及阴性对照组第1天1次给药后，在21天接受加强注射。分别在第14天、21天、28天、35天收集血液样品。通过酶联免疫吸附检测RABV-G特异性结合抗体滴度，荧光抗体病毒中和试验检(FAVN)检测血清真病毒中和抗体滴度。

酶联免疫吸附检测RABV-G特异性结合抗体滴度的结果如图2A和2B所示。如图2A所示，第1次给药后的第14天、第21天10μg组免疫小鼠血清RABV-G抗体滴度分别为12800、22807，3μg组免疫小鼠血清RABV-G IgG抗体滴度分别为3591.9、5701.5，1μg组免疫小鼠血清RABV-G抗体滴度分别为1600、2015.9。然后在第21天接受加强注射，结果如图2B所示，在加强注射后的第7天、第14天，10μg组免疫小鼠RABV-G抗体滴度分别为645080、705035，3μg组免疫小鼠RABV-G抗体滴度分别为256000、516064，1μg组免疫小鼠RABV-G抗体滴度分别为128000、409600。

真病毒中和实验检测该核酸疫苗对宿主的预防性保护作用的结果如图2C和图2D所示。如图2C所示，第1次给药后第14天、第21天10μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为5.5、13.7IU/ml，3μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为7.1、17.3IU/ml，1μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为4.2、8.6IU/ml。如图2D所示，在21天接受加强注射，加强免疫后的第7天、14天，10μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为1018.5、1166IU/ml，3μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为966.3、1255IU/ml，1μg组免疫小鼠血清中和抗体滴度分别为557.9、1001.7IU/ml。

该实验结果显示，无论是1次给药、还是接种加强针后，10μg、3μg、1μg的接种剂量诱导的血清抗体完全可以中和病毒感染的细胞，1针接种后中和抗体滴度为WHO标准(0.5IU/mL)的16～30倍，加强后为WHO标准(0.5IU/mL)的1000～2000倍，并且其结合抗体与中和抗体的趋势一致。

以上结果证明了本申请的狂犬病mRNA疫苗能够以低剂量(微克级别)、少次数(2次接种，或甚至单次接种)，实现极显著的中和保护效果。

实施例3.RABV-G mRNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫应答

T细胞虽不能阻止病毒感染宿主细胞，但T细胞对机体中狂犬病病毒的清除有重要作用。本实施例按上述实验方法III通过胞内细胞因子染色法(ICS)分析RABV-G抗原特异性T细胞。分别在加强注射后的第7天取3μg、1μg接种剂量组及未包裹核酸的脂质体纳米颗粒组(即阴性对照组的小鼠)，分离其脾脏细胞。

结果如图3A、3B和3C所示，3μg RABV-G mRNA疫苗组的RABV-G特异性IFN-γ阳性CD8⁺T细胞明显高于1μg接种剂量组，而1μg接种剂量组与阴性对照组的CD8⁺T细胞比例相当(3μg RABV-G mRNA疫苗组IFN-γ阳性CD8⁺T平均占比为0.33％，1μg接种剂量组平均占比为0.14％，阴性对照组IFN-γ阳性CD4⁺T细胞平均占比为0.12％)(图3A)。相比之下，RABV-G特异性IFN-γ阳性CD4⁺T细胞3μg接种剂量组和1μg接种剂量组均明显高于阴性对照组(3μg剂量组IFN-γ阳性CD4⁺T细胞平均占比0.60％，1μg剂量组IFN-γ阳性CD4⁺T细胞平均占比0.34％，阴性对照组IFN-γ阳性CD4⁺T细胞平均占比为0.2％)(图3B)。另外，RABV-G特异性IL-4阳性CD4⁺T细胞，3μg，1μg接种剂量组占比相当，且都显著高于阴性对照组(RABV-G特异性IL-4阳性CD4⁺T细胞接种3μg剂量组平均占比0.16％，1μg接种剂量组平均占比0.16％，阴性对照组平均占比0.05％)(图3C)。

该结果证明了RABV-G mRNA疫苗能够有效诱导RABV-G特异性CD4⁺和/或CD8⁺T细胞，并且该随着剂量增加，效果可有进一步的提高。

实施例4.单剂低剂量RABV-G mRNA疫苗的小鼠攻毒保护效果

为进一步评估本发明RABV-G mRNA核酸疫苗的体内保护效果，本实施例以BALB/c小鼠为模型，选取1μg低剂量组单次肌肉注射，阴性对照为等体积的未包裹核酸的脂质纳米颗粒。每组8只小鼠，每只注射体积为100μl。初次免疫后第4周通过肌肉注射，进行CVS-11固定毒攻毒，攻毒剂量为20LD50，50μl/只。将小鼠放入IVC笼中，连续14天每天称量小鼠体重，观察小鼠存活情况及生存状态。

结果如图4A和4B所示，1μg RABV-G mRNA疫苗接种组，小鼠在感染后的前2天体重下降了3～7％，从第3天开始体重逐渐恢复，第7天开始体重恢复到感染前水平，第10天开始体重逐渐增加(图4A)；并且，1μg的RABV-G mRNA疫苗可完全保护小鼠免受致死性剂量的CVS-11病毒的攻击，小鼠能可持续生存2周以上(图4B)。而与疫苗接种组相反，未包裹核酸的脂质纳米颗粒组小鼠在感染后第4天开始体重骤降(图4A)，感染后第7天开始死亡，第8天死亡率达到60％，第9天全部死亡(图4B)。

以上结果证明了本申请的狂犬病mRNA疫苗即便在低剂量下，也可实现优异的攻毒保护效果。

综合前述实施例可看出，本申请中所提供的RABV-G mRNA疫苗，在低剂量下接种就可形成强效的免疫保护，既可诱导出高滴度的中和抗体，也可激活T细胞免疫应答，在狂犬病病毒预防和治疗领域具有广阔的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附：序列表对应信息

SEQ ID NO	序列信息
		1	RABV-G免疫原的DNA序列
2	5'-UTR
		3	3'-UTR序列(来源于人α球蛋白和真核生物线粒体的串联3'UTR序列)
4	3'-多聚腺苷酸尾序列(250A)
		5	修饰后的RABV-G mRNA序列(密码子优化+尿嘧啶替换)
6	制备RABV-G mRNA的DNA模板序列

Claims

1.一种狂犬病免疫原核酸表达载体，其从5'端至3'端依次包含：

(a)5'-UTR元件；

(b)编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的开放阅读框元件；

(c)3'-UTR元件；

(d)总长度为120nt以上的多聚腺苷酸尾元件，其包含：

2.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，所述5'-UTR元件的长度为10～200nt，例如15～100nt；和/或

所述5'-UTR元件源自下组中的一种或多种5'-UTR：人α-球蛋白、β-球蛋白、核糖体蛋白(RP)、微管蛋白β-2B、补体因子3(C3)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、载脂蛋白A-II(APOA2)、人类血红蛋白亚基β(hHBB)、血红蛋白A1(HBA1)、血红蛋白A2(HBA2)、登革热病毒(DENV)；和/或

所述5'-UTR元件具有如SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少80％的序列同一性。

3.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，所述3'-UTR元件为来源于哺乳动物或病毒的3'-UTR，例如来源选自下组的3'-UTR或其组合(如串联序列)：人α球蛋白、人β球蛋白、人白蛋白、人肌动蛋白、人血红蛋白亚基α1(HBA1)、细胞色素B-245α链(CYBA)、真核生物线粒体(Mit)的序列、SARAS-Cov-2、登革热病毒(DENV)、萝卜皱病毒(TCV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草蚀刻病毒(TEV)；和/或

所述3'-UTR元件包含选自下组一个或多个3'-UTR分子：α球蛋白3'-UTR、真核生物线粒体3'-UTR、白蛋白3'-UTR、β球蛋白3'-UTR或其任意串联序列，优选α球蛋白3'-UTR、真核生物线粒体3'-UTR、或它们串联形成的3'-UTR；和/或

所述3'-UTR具有如SEQ ID NO:3所示的序列，或与其具有至少80％的序列同一性的序列。

4.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，所述多聚腺苷酸尾元件的总长度为120～400nt，例如120～350nt，120～320nt，或其中的任意整数，例如120、304nt；和/或

各腺苷酸串各自独立地包含10～80个、20～70个、25～60个、30～50个或其中任意整数个连续的腺苷酸，如20个、30个、33个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个连续腺苷酸；和/或

所述多聚腺苷酸尾元件还进一步包含位于所述元件一个或两个端部的连接子；和/或

所述连接子的长度各自独立地为3～15nt，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15nt；和/或

例如，所述连接子的序列各自独立地选自：GCTATGACT、GTATGT、GCAAGT、GATTGC、GGCTGC、TACTGC、GGCTTC；和/或

所述多聚腺苷酸尾元件具有SEQ ID NO:4的序列，或与其中任何一者具有至少80％的序列同一性。

5.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，

所述开放阅读框元件为单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA；和/或

所述开放阅读框元件编码一个或多个来源相同或不同的RABV-G；和/或

所述RABV-G来源于选自下组的狂犬病病毒：巴斯德毒株中的Pitman-Moore(PM)株、Pasteur(PV)株、CTN株、aG株、Flury-LEP株、Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株、Street-Alabama-Duffering(SAD)株、KHUV(Khujand lyssavirus)、BBLV(Bokeloh batlyssavirus)、ARAV(Aravan lyssavirus)、EBLV-1(European bat 1lyssavirus)、EBLV-2(European bat 2lyssavirus)、IRKV(Irkutlyssavirus)、LBV(Lagos bat lyssavirus)、SHIBV(Shimoni bat lyssavirus)、MOKV(Mokola lyssavirus)、WCBV(West Caucasian batlyssavirus)、IKOV(Ikomalyssavirus)、DUVV(Duvenhagelyssavirus)、ABLV(Australianbat lyssavirus)、GBLV(Gannoruwa bat lyssavirus)或LLEBV(Lleida bat lyssavirus)；和/或

所述RABV-G包括选自下组的一种或多种分子：未经修饰或经真核修饰的RABV-G、其免疫原性片段或变体，所述分子能够诱导针对RABV的免疫中和和保护反应。

6.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，编码RABV-G的元件经过或未经密码子优化、包含或不包含碱基修饰和/或核苷类似物；和/或

例如所述编码RABV-G的元件中的一个或多个尿嘧啶被选自下组中的一个或多个相同或不同的修饰碱基或核苷类似物置换：假尿苷、1-甲基尿嘧啶核苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷，优选假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷，进一步优选为N1-甲基假尿苷。

7.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，所述表达载体还包括选自下组的一种或多种元件：

5'-帽元件，其可选被修饰，例如所述5'-帽元件选自：m7GpppXpYp、m7GpppXmpYp、m7GpppXmpYmp、或其甲基化修饰序列、反向结合异构体、抗-反转帽类似物(ARCA)、N7-苄基二核苷四磷酸帽类似物；

启动子元件，例如T7启动子、sp6启动子或T3启动子；

信号肽编码元件，例如指导目的蛋白亚细胞定位的信号肽(如跨膜信号肽、分泌信号肽、核定位信号肽)编码元件；

酶切位点，例如XbaI、EcoRV、BamHI、XhoI；

标签，例如用于目的分子鉴定、分离或纯化的分子标签，如Flag标签、HA标签。

8.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，从5'端到3'端包含：

包含SEQ ID NO:2所示序列的5'-UTR元件；编码RABV-G的开放阅读框元件；包含如SEQID NO:3所示序列的3'-UTR元件；包含如SEQ ID NO:4所示序列的多聚腺苷酸尾元件；或与所述各序列各自具有至少80％序列同一性的序列的元件；和/或

所述核酸表达载体包含如SEQ ID NO:5或6所示的序列、或与其具有至少80％序列同一性的序列。

9.如权利要求1所述的核酸表达载体，其单独包含于包装物中，或与递送系统中的运载体组合，例如，所述递送系统选自：脂质递送系统、类脂递送系统、聚合物递送系统或其组合递送系统，例如加载于脂质纳米颗粒、聚氨酯(PAA)、聚β氨基酯(PBAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、脂质包裹的聚合物胶束。

10.如权利要求1所述的核酸表达载体，其中，核酸表达载体与脂质体纳米颗粒组合，例如：

所述脂质体纳米颗粒包括：阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和稳定脂质的组合；和/或

所述的阳离子脂质体与RABV-G mRNA质量比为10～30:1，优选为15～20:1。

11.一种狂犬病mRNA疫苗，其包含：如权利要求1～10中任一项所述的狂犬病免疫原核酸表达载体，以及包装物和/或用于该核酸表达载体的递送系统和/或药学上或生理学上可接受的运载体。

12.如权利要求11所述的mRNA疫苗，其中，所述疫苗的形式适于选自下组的一种或多种给予或递送方式：呼吸道雾化吸入、滴鼻、口服、直接注射(例如静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射)、黏膜给药；和/或

所述疫苗还包含佐剂或与佐剂联合使用，例如所述佐剂选自：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21；和/或

所述疫苗的形式适于进行2种或以上药物或疫苗的组合给予，例如联合接种或序贯接种。

13.如权利要求1～10中任一项所述的核酸表达载体和/或如权利要求11～12中任一项所述的疫苗在制备用于狂犬病预防和/或治疗的产品中的应用。

14.制备如权利要求1～10中任一项所述的核酸表达载体或如权利要求11～12中任一项所述的疫苗的方法，所述方法包括：提供独立或连接的各元件；将各元件组装成核酸表达载体。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述方法包括采用选自下组的一种或多种材料：DNA模板(例如PCR产物或已线性化的质粒DNA)、核酸酶、聚合酶、加帽酶、聚腺苷酸合酶、DNA酶、一个或多个元件分子、接头分子、天然或修饰的核酸分子、缓冲液、溶剂；和/或

所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：对各元件进行设计、优化、改造和/或修饰；对中间产物和/或最终产物进行分离、纯化、鉴定、定量、包装和/或活性测试；将核酸表达载体与用于该核酸表达载体的递送系统和/或药学上或生理学上可接受的运载体组合。