CN101208104B - Nipah病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组抗Nipah病毒疫苗以及此类疫苗给动物有利地猪的施用。有利地，抗Nipah病毒疫苗可以包含含有Nipah病毒糖蛋白基因的重组禽痘病毒。本发明包括通过施用抗Nipah病毒疫苗给动物有利地猪接种疫苗的方法，所述疫苗包含重组禽痘病毒，所述禽痘病毒可以含有Nipah病毒糖蛋白基因。
Description
与相关申请的交叉参照
本申请要求于2005年4月25日提交的美国临时申请序列号60/674,583的优先权。
引入的参考文献
本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，连同本文提及或引入本文作为参考的任何文件中任何产品的任何制造商说明书、描述、产品说明书和产品宣传单，在此引入本文作为参考，并且可以在本发明实践中采用。
发明领域
本发明涉及针对Nipah病毒的重组疫苗以及此类疫苗的施用。
发明背景
Nipah病毒是副粘病毒(Paramyxoviridae)科的成员并且与Hendra病毒(以前称为马麻疹病毒)有关。Nipah病毒最初在1999年从马来西亚和新加坡的成年男性中爆发的脑炎和呼吸系统疾病的检查样品中分离(参见，例如，Chua等人，Lancet.1999 Oct 9；354(9186)：1257-9和Paton等人，Lancet.1999 Oct 9；354(9186)：1253-6)。关于Nipah病毒的宿主仍未知，但怀疑狐蝠(狐蝠(Pteropus)属的蝙蝠)是天然宿主。
因为生态条件中的变化，狐蝠越来越多地与人和家养动物接触。因此，因此，可以想象狐蝠中的病毒可能感染家养动物和人，这可以导致更毒、可能致命的疾病。Nipah病毒在马来西亚和新加坡的猪中引起相对温和的疾病，并且病毒经由与受感染的猪的紧密接触传播给人、猫和狗。
人中的Nipah病毒感染已伴随特征为发热和嗜睡的脑炎和更严重 的中枢神经系统疾病例如昏迷、癫痫发作和不能维持呼吸(参见，例如Lee等人，Ann Neurol.1999 Sep；46(3)：428-32)。Nipah病毒病从3-14天的发热和头痛开始，随后为嗜睡和特征为精神错乱的定向障碍。这些特征和症状可以在24-48小时内发展为昏迷。某些患者在其感染的早期具有呼吸系统疾病。关于Nipah病毒性脑炎的严重神经病已由某些后遗症标记，例如持久性惊厥和人格改变。在1998-1999年Nipah病毒病爆发期间，入院的约40％具有严重神经病的患者死于该病(参见，例如，Lam和Chua，Clin Infect Dis.2002 May 1；34 Suppl 2：S48-51)。
因此，动物健康的目标是通过预防动物和/或人之间的疾病传播来改善人的健康。
Nipah病毒感染可以通过避免已知受感染的动物并当其必须与潜在受感染的动物接触时使用合适的个人防护设备装置来预防。药物利巴韦林已显示在体外有效对抗Nipah病毒，然而，受控制的药物调查仍未进行并且临床有效性仍不确定。
如果将开发预防或治疗Nipah病毒感染的有效程序，那么必须限定在诱导保护性应答中重要的病毒抗原，并且设计有效的免疫预防治疗。Nipah病毒的附着(G)和融合(F)糖蛋白已牵涉为病毒抗原(参见，例如，Bossart等人，J Virol.2002 Nov；76(22)：11186-98和Guillaume等人，J Virol.2004 Jan；78(2)：834-40)。Nipah病毒糖蛋白(G和F)当作为重组痘苗病毒表达时已在仓鼠中诱导保护不受Nipah病毒的致命性攻击的免疫应答(参见，例如，Guillaume等人，J Virol.2004 Jan；78(2)：834-40)。然而，观察到在主动和被动免疫接种中，针对Nipah病毒的抗体应答是强烈刺激的，提示免疫接种的功效与载体复制能力相关。
因此，本领域需要有效且可靠的Nipah病毒疫苗，其中异源蛋白具有有限或无生产性复制的表达。
本申请中任何文件的引用或鉴别并非承认此类文件可用作本发明的现有技术。
发明概述
本发明部分基于有效的重组疫苗的开发，所述重组疫苗使用编码Nipah病毒糖蛋白的减毒的金丝雀痘或减毒的鸡痘病毒(fowlpox)载体针对Nipah病毒免疫猪，因此可以具有有限或无生产性复制(productive replication)的异源蛋白表达。
本发明可以包含包括多核苷酸的禽痘病毒表达载体，所述多核苷酸编码Nipah病毒糖蛋白。在一个实施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是附着(G)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸碱基序列，或多核苷酸编码SEQ IDNO：8的肽。在另一实施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是融合(F)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸碱基序列，或多核苷酸编码SEQ ID NO：7的肽。在再一实施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是附着(G)蛋白和融合(F)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸碱基序列和核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸碱基序列，或多核苷酸编码SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的肽。
禽痘病毒表达载体可以是减毒的禽痘病毒表达载体。在一个实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是金丝雀痘病毒载体。有利地，金丝雀痘病毒载体可以是ALVAC。在另一实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是鸡痘病毒(fowlpox)载体。有利地，鸡痘病毒(fowlpox)载体可以是TROVAC。
本发明包括用于递送和表达Nipah病毒糖蛋白的制剂，其中所述制剂可以包含上文所述的任何一种载体和药学或兽医学可接受的运载体(carrier)、媒介物或赋形剂。在一个实施方案中，运载体、媒介物或赋形剂可以促进载体的转染和/或改善其保存。本发明还包括将Nipah病毒糖蛋白递送至动物的方法，其包含给动物施用上文段落的制剂。有利地，动物是猪。
本发明还包括在动物中诱发免疫应答的方法，其可以包含以有效诱发免疫应答的量施用可以包含上文所述的任何一种载体的组合物。 本发明还涉及在动物中诱发免疫应答的方法，其可以包含施用可以包含细胞的组合物，其中所述细胞可以包含有效诱发免疫应答的量的上文所述的任何一种载体。有利地，动物是猪。
本发明进一步包括在动物中诱导免疫或保护性应答的方法，其可以包含以有效诱发免疫应答的量施用可以包含上文所述的任何一种载体的组合物。本发明进一步涉及在动物中诱导免疫或保护性应答的方法，其可以包含以有效诱发免疫应答的量施用可以包含细胞的组合物，其中所述细胞可以包含上文所述的任何一种载体。有利地，动物是猪。
本发明还提供了用于执行上文所述的任何方法的试剂盒，其包含上文所述的任何组合物，以及任选地用于执行方法的说明书。
应当注意在本公开内容中以及特别在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”可以具有在美国专利法中对其认定的含义；例如它们可以意指“包括”；并且术语如“基本上由……组成”具有在美国专利法中归于其的含义，例如它们涵盖未明确叙述的元件，但排除在现有技术中发现或影响本发明的基本或新型特征的元件。
这些以及其他实施方案在下文详细描述中公开，或由于下文详细描述而变得显而易见并由下文详细描述所涵盖。
附图简述
作为例子给出，但不希望将本发明单独限制于描述的具体实施方案的下列详细描述，与附图结合可以最好地理解，其中：
图1举例说明了Nipah病毒核苷酸(图1A)和氨基酸(图1B)序列。参见，例如GenBank登记号NC_002728，Chua等人，Science.2000May 26；288(5470)：1432-5；Harcourt等人，Virology.2001 Aug15；287(1)：192-201；Chan等人，J Gen Virol.2001 Sep；82(Pt 9)：2151-5和Chua等人，Microbes Infect.2002 Feb；4(2)：145-51，其公开内容整体引入作为参考。
图2举例说明了质粒pSL-6802-1-4的构建。图2A是Nipah病毒编码区的图。图2B举例说明了用于扩增Nipah G基因的PCR寡核苷酸。图2C举例说明了pSL-6802-1-4的构建。图2D是左臂和右臂以及翻译 Nipah病毒G基因的表达盒的核苷酸序列。
图3举例说明了质粒pSL-6802-2-5的构建。图3A举例说明了用于扩增Nipah G基因的PCR寡核苷酸。图3B举例说明了pSL-6802-2-5的构建。图3C是左臂和右臂以及翻译Nipah病毒G基因的表达盒的核苷酸序列。
图4举例说明了质粒pSL-6839-1的构建。图4A是Nipah病毒和疫苗抗原的图。图4B举例说明了用于扩增尼帕F基因的PCR寡核苷酸(为明确起见，将11456.SL和11457.SL分别公开为SEQ ID NO：30和31)。图4C举例说明了pSL-6839-1的构建。图4D是左臂和右臂以及翻译Nipah病毒F基因的表达盒的核苷酸序列。
图5举例说明了质粒pSL-6851-29的构建。图5A举例说明了用于扩增Ni pah F基因的PCR寡核苷酸(为明确起见，将11456.SL和11457.SL分别公开为SEQ ID NO：30和31)。图5B是pSL-6851-29的质粒示意图。图5C是左臂和右臂以及翻译Nipah病毒F基因的表达盒的核苷酸序列。
图6举例说明了Nipah G蛋白质印迹。泳道1是ALVAC上清液，泳道2是vCP2199上清液(ALVAC Nipah G)，泳道3是vCP2199上清液(ALVAC Nipah G)，泳道4是鸡痘病毒(fowlpox)上清液，泳道5是vFP2200上清液(鸡痘病毒(fowlpox)Nipah G)，泳道6是vFP2200上清液(鸡痘病毒(fowlpox)Nipah G)，泳道7是标记(177.6、113.9、81.2、60.7、47.4、36.1、25.3、19.0、14.7、6.1kDa)，泳道8是ALVAC沉淀，泳道9是vCP2199沉淀，泳道10是vCP2199沉淀，泳道11是鸡痘病毒(fowlpox)沉淀，泳道12是vFP2200沉淀，并且泳道13是vFP2200沉淀。
图7举例说明了Nipah F免疫印迹。图7A使用豚鼠抗血清进行印迹。图7B使用猪抗血清进行印迹。凝胶#1是Nipah F重组体(只是沉淀)。泳道1是空白，泳道2是鸡痘病毒(fowlpox)，泳道3是vFP2207，泳道4是vFP2207，泳道5是空白，泳道6是ALVAC，泳道7是cvCP2208，泳道8是标记170、130、100、72、55、40、33、24kDa，并且泳道9和10是空白。凝胶#2是Nipah F重组体(只是上清液)。泳道1是空白，泳道2是鸡痘病毒(fowlpox)，泳道3是vFP2207， 泳道4是vFP2207，泳道5是标记170、130、100、72、55、40、33、24kDa，泳道6是空白，泳道7是ALVAC，泳道8是空白，泳道9是vCP2208，并且泳道10是空白。
发明详述
本发明部分基于针对Nipah病毒的有效的重组疫苗的开发。因此，本发明部分包括针对Nipah病毒的重组疫苗。
在本发明的一个实施方案中，Nipah病毒基因在表达载体内编码。在一个有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码糖蛋白。在一个特别有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码附着(G)糖蛋白。在另一特别有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码融合(F)糖蛋白。
在一个有利的实施方案中，表达载体是病毒载体。在一个特别有利的实施方案中，病毒载体是禽痘病毒载体。在一个更有利的实施方案中，禽痘病毒载体是金丝雀痘病毒载体或鸡痘病毒(fowlpox)载体。更有利地，禽痘病毒载体是减毒的禽痘病毒载体。在一个特别有利的实施方案中，减毒的禽痘病毒载体是减毒的金丝雀痘病毒或减毒的鸡痘病毒(fowlpox)载体。有利地，减毒的金丝雀痘病毒载体是ALVAC并且减毒的鸡痘病毒(fowlpox)载体是TROVAC。
在另一实施方案中，Nipah病毒蛋白质是具有已知蛋白质序列的任何Nipah病毒蛋白质或其片段。在一个有利的实施方案中，Nipah病毒蛋白质是糖蛋白。在一个特别有利的实施方案中，Nipah病毒蛋白质是附着(G)糖蛋白，有利地具有SEQ ID NO：8的序列。在另一特别有利的实施方案中，Nipah病毒蛋白质是融合(F)糖蛋白，有利地具有SEQ ID NO：7的序列。
在本发明的一个特别有利的实施方案中，重组构建体是命名为vCP2199的表达Nipah G的ALVAC构建体，命名为vCP2208的表达Nipah F的ALVAC构建体，命名为vFP2200的表达Nipah G的TROVAC构建体，和命名为vFP2207的表达Nipah F的TROVAC构建体。
在本发明的另一实施方案中，Nipah病毒蛋白质包括但不限于，核壳蛋白(有利地SEQ ID NO：2)，磷蛋白(有利地SEQ ID NO：3)， V蛋白(有利地SEQ ID NO：4)，C蛋白(有利地SEQ ID NO：5)，基质蛋白(有利地SEQ ID NO：6)，或聚合酶(有利地SEQ ID NO：9)。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸残基聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以由除氨基酸以外的化学部分间插。该术语还包括已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
在另一实施方案中，Nipah病毒基因是具有已知核苷酸序列的任何Nipah病毒基因。在一个有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码糖蛋白。在一个特别有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码附着(G)糖蛋白，有利地SEQ ID NO：1的核苷酸8943-10751。在另一特别有利的实施方案中，Nipah病毒基因编码融合(F)糖蛋白，有利地SEQ IDNO：1的核苷酸6654-8294。
在本发明的另一实施方案中，Nipah病毒基因可以编码核壳蛋白(有利地SEQ ID NO：1的核苷酸113-1711)，磷蛋白(有利地SEQ IDNO：1的核苷酸2406-4535)，V蛋白(有利地SEQ ID NO：1的核苷酸2406-3775)，C蛋白(有利地SEQ ID NO：1的核苷酸2428-2928)，基质蛋白(有利地SEQ ID NO：1的核苷酸5108-6166)，或聚合酶(有利地SEQ ID NO：1的核苷酸11259-18213)。
“多核苷酸”是任何长度的核苷酸聚合形式，其含有任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、以及类似物。多核苷酸可以具有三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括双链、单链和三螺旋分子。除非另有说明或要求，本文描述的本发明的多核苷酸的任何实施方案包括双链形式以及2个互补形式中的每一个，其已知或预期形成DNA、RNA或杂交分子的双链形式。
下列是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核 酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的多核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、uracyl、其他糖或连接基团例如氟代核糖和硫醇盐、以及核苷酸分支。核苷酸序列可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。这个定义中包括的其他修饰类型是帽、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入用于将多核苷酸附着至蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体载体的手段。
“分离的”多核苷酸或多肽是基本上不含在它的天然环境与其结合的材料的多核苷酸或多肽。基本上不含指至少50％、有利地至少70％、更有利地至少80％、并再更有利地至少90％不含这些材料。
本发明进一步包含Nipah病毒多核苷酸，有利地Nipah病毒糖蛋白多核苷酸的互补链。
互补链可以是聚合的且具有任何长度，并且可以含有任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、以及类似物。
杂交反应可以在不同“严谨性”条件下进行。增加杂交反应的严谨性的条件是众所周知的。参见例如“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，第二版(Sambrook等人，1989)。有关条件的例子包括(按照严谨性增加的顺序)：25℃、37℃、50℃和68℃的孵育温度；10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC的缓冲液浓度(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)以及使用其他缓冲系统的其等价物；0％、25％、50％和75％的甲酰胺浓度；5分钟-24小时的孵育时间；1、2或更多个洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤孵育时间；以及6xSSC、1xSSC、0.1xSSC的洗涤溶液，或去离子水。
本发明进一步包括编码Nipah病毒多肽的功能性等价变体和衍生物，以及可能增强、减少或不显著影响由此编码的多肽的特性的其功能性等价片段的多核苷酸。这些功能性等价变体、衍生物和片段显示保留Nipah病毒多肽，有利地Nipah病毒糖蛋白的活性的能力。例如，不改变编码的氨基酸序列的DNA序列中的变化，以及导致氨基酸残基的保守置换、一个或少数氨基酸删除或添加、以及由氨基酸类似物置 换氨基酸残基的那些改变是不显著影响编码的多肽的特性的那些改变。保守氨基酸置换是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。
为了本发明的目的，序列同一性或同源性通过在比对时比较序列来确定，所述比对能最大化重叠和同一性而最小化序列缺口。特别地，序列同一性可以使用许多数学算法中的任何一种来测定。用于比较2个序列的数学算法的一个非限制性例子是Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990；87：2264-2268的算法，由Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90：5873-5877进行修饰。
用于序列比较的数学算法的另一例子是Myers和Miller，CABIOS1988；4：11-17的算法。此类算法并入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)内。当使用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。用于鉴别局部序列相似性和比对区域的另一有用算法是如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85：2444-2448中描述的FASTA算法。
有利地用于根据本发明使用的是WU-BLAST(WashingtonUniversity BLAST)版本2.0软件。用于几种UNIX平台的WU-BLAST版本2.0执行程序可以从ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下载。这种程序基于WU-BLAST版本1.4，其基于公众域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul和Gish，1996，Localalignment statistics，Doolittleed.，Methods in Enzymology 266：460-480；Altschul等人，Journal of Molecular Biology 1990；215：403-410；Gish和States，1993；Nature Genetics 3：266-272；Karlin和Altschul，1993；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；所有这些引入本文作为参考)。
一般而言，氨基酸序列的比较通过比对已知结构的多肽的氨基酸 序列与未知结构的多肽的氨基酸序列来完成。随后比较序列中的氨基酸并归类同源的氨基酸组。这种方法检测多肽的保守区并考虑氨基酸插入和删除。氨基酸序列之间的同源性可以通过使用商购可得的算法来测定(同样参见上文同源性的描述)。除本文另外提及的那些以外，也可提及的是由美国国家生物技术信息中心提供的程序BLAST、缺口BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中广泛用于这个目的并且可以比对2个氨基酸序列的同源性区域。
在成套的所有搜索程序中，缺口比对例行程序是数据库搜索自身的部分。必要时可以关闭缺口。长度为1的缺口的缺省罚分(Q)对于蛋白质和BLASTP是Q＝9，并且对于BLASTN是Q＝10，但可以变为任何整数。用于延伸缺口的缺省每残基罚分(R)对于蛋白质和BLASTP是R＝2，并且对于BLASTN是R＝10，但可以变为任何整数。为了比对序列可以使用关于Q和R的值的任何组合，所述比对能最大化重叠和同一性而最小化序列缺口。默认的氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但可以使用其他氨基酸比较矩阵例如PAM。
可替代地或另外地，术语“同源性”或“同一性”，例如就核苷酸或氨基酸序列而言，可以指2个序列之间的同源性的定量度量。序列同源性百分比可以计算为(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif 是比对时2个序列中不相同的残基的总数目，并且其中Nref是其中一个序列的残基数目。因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Nref＝8；Ndif＝2)。
可替代地或另外地，“同源性”或“同一性”就序列而言可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以2个序列中较短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中2个序列的比对可以依据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：726，引入本文作为参考)测定，例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长、以及缺口罚分4，并且序列数据的计算机辅助分析和解释(包括比对)可以使用商购可得程序(例如IntelligeneticsTM Suite，Intelligenetics Inc.CA)方便地进行。当RNA序列被说成 与DNA序列相似，或具有序列同一性或同源性程度时，DNA序列中的胸苷(T)视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明范围内并且可以通过将DNA序列中的胸苷(T)视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)由DNA序列获得。
并且无需过度实验，技术人员可以参考许多其他程序或参考文献用于测定序列同源性。
本发明进一步包括在载体分子或表达载体中含有的Nipah病毒蛋白质，有利地为Nipah病毒糖蛋白，并在必要时与增强子和/或启动子元件可操作地连接。在一个有利的实施方案中，启动子是细胞巨化病毒(CMV)启动子。在另一实施方案中，增强子和/或启动子包括各种细胞或组织特异性启动子、各种病毒启动子和增强子以及对于每种动物种类同基因特异的各种Nipah病毒DAN序列。
“载体”指包含准备体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可以包含用于治疗用途的目的序列，并且可以任选地是表达盒的形式。如本文使用的，载体无需能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括用于翻译多核苷酸编码序列的克隆载体。还包括的是病毒载体。
术语“重组体”指基因组cDNA、半合成或合成起源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以在自然界中未发现的方式与另一种多核苷酸连接。
“异源”指来源于对于与之比较的其余实体遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可以由基因改造技术置于来源于不同来源的质粒或载体内，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出且可操作地连接至除该天然序列以外的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外编码序列，控制元件例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、转录终止子，在相同或不同启动子控制下的另外转录单位，允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，并且任何此类构建体可以是需要的以提供本发明的实施方案。
用于表达Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的元件有利地存在于本发明的载体中。以最低限度的方式，这包含下列元件、基本上由其组成、或由其组成：起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，和任选地还有用于某些载体例如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒以外的病毒载体的多腺苷酸化序列，以及用于痘病毒的转录终止子。当多核苷酸有利地在载体中编码多蛋白片段，例如Nipah病毒蛋白质时，ATG置于阅读框的5′并且终止子置于3′。可以存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列、稳定序列和允许蛋白质分泌的信号序列。
用于制备和/或施用用于在体内或体外表达本发明基因的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可以是任何所需方法，例如由下列文件中公开的，或下列文件引用的文件中公开的方法或类似于其的方法：美国专利号4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6；312,683；1986年10月16日提交的美国专利申请序列号920,197；WO 90/01543；WO91/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11313-11318；Ballay等人，EMBO J.1993；4：3861-65；Felgner等人，J.Biol.Chem.1994；269：2550-2561；Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11371-11377；Graham，Tibtech 1990； 8：85-87；Grunhaus等人，Sem.Virol.1992；3：237-52；Ju等人，Diabetologia 1998；41：736-739；Kitson等人，J.Virol.1991；65：3068-3075；McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11414-11420；Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11341-11348；Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11349-11353；Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984；4：399-406；Richardson(Ed)，Methods in Molecular Biology 1995；39，“Baculovirus Expression Protocols，”Humana Press Inc.；Smith等人，(1983)Mol.Cell.Biol.1983；3：2156-2165；Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11334-11340；Robinson等人，Sem.Immunol.1997；9：271；和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93：11307-11312。因此，本发明的载体可以是任何合适的重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒(fowlpox)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒、逆转录病毒等(如在引入本文作为参考的文件中)；或者载体可以是质粒。本文引用和引入本文作为参考的文件，除了提供在本发明实践中有用的载体的例子外，还可以提供通过本发明组合物中，或包括在其中的一种或多种载体表达的非Nipah病毒蛋白质或其片段的来源，例如非Nipah病毒蛋白质或其片段，细胞因子等。
一种或多种细胞因子可以是免疫原性或疫苗组合物中的蛋白质形式，或可以在宿主中与一种或多种免疫原或其表位共表达。优先考虑通过与表达一种或多种免疫原或其表位的同一载体，或通过分开的载体共表达一种或多种细胞因子。
细胞因子可以选自：白介素18(IL-18)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白1α；Marshall E.等人，Br.J.Cancer，1997，75(12)，1715-1720)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)。优选地，使用待接种疫苗物种的细胞因子；即，有利地，细胞因子匹配靶或宿主物种，并且例如提到，猪 GM-CSF(S.Inumaru等人，Immunol.Cell Biol.1995，73(5)，474-476)、犬GM-CSF(WO00/77043的实施例8)、猫GM-CSF(WO00/77043的实施例9)。
WO00/77210提供了对应马GM-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列，GM-CSF的体外生产以及允许马GM-CSF体内表达的载体(例如，质粒和病毒载体)的构建。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如治疗组合物。制剂可以在药学或兽医学可接受的运载体、赋形剂或媒介物中包含一种或多种载体、基本上由其组成、或由其组成，所述载体例如表达载体，例如体内表达载体，其包含一种或多种Nipah病毒多核苷酸、基本上由其组成、或由其组成(且有利地表达)，并且有利地，载体含有和表达多核苷酸，其包含编码Nipah病毒蛋白质(有利地Nipah病毒糖蛋白)的编码区、基本上由其组成、或由其组成。因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的一种或多种其他载体包含多核苷酸、基本上由其组成、或由其组成，所述多核苷酸编码、并且在合适的环境下载体表达Nipah病毒糖蛋白的一种或多种其他蛋白质，或其片段。
根据另一实施方案，制剂中的一种或多种载体包含多核苷酸、或基本上由其组成、或由其组成，所述多核苷酸编码Nipah病毒蛋白质、有利地Nipah病毒糖蛋白的一种或多种蛋白质或其片段。本发明的制剂有利地包含至少2种载体、基本上由其组成、或由其组成，所述载体包含来自不同Nipah病毒分离株的多核苷酸、基本上由其组成、或由其组成，并且有利地还表达所述多核苷酸、有利地在体内在适当的条件或合适的条件下或在合适的宿主细胞内，所述多核苷酸编码相同蛋白质和/或不同蛋白质、但有利地编码相同蛋白质。关于含有一种或多种载体的制剂(所述载体含有多核苷酸、基本上由其组成、或由其组成，所述多核苷酸编码，并且有利地表达、有利地在体内，Nipah病毒蛋白质、有利地Nipah病毒糖蛋白、或其表位)，有利的是表达产物来自2种、3种或更多种Nipah病毒分离株，有利地毒株。本发明还涉及载体混合物，其含有编码不同Nipah病毒糖蛋白的序列、基 本上由其组成、或由其组成，并表达其。
在一个有利的实施方案中，载体是含有Nipah病毒基因、有利地Nipah病毒糖蛋白基因的病毒载体，有利地禽痘病毒载体。在一个特别有利的实施方案中，禽痘病毒载体是金丝雀痘病毒载体，有利地，减毒的金丝雀痘病毒载体例如ALVAC。减毒的金丝雀痘病毒在美国专利号5,756,103(ALVAC)和WO 01/05934中描述。在另一特别有利的实施方案中，禽痘病毒载体是鸡痘病毒(fowlpox)载体，有利地减毒的鸡痘病毒(fowlpox)载体例如TROVAC。同样参考美国专利号5,766,599，其涉及减毒的鸡痘病毒(fowlpox)株TROVAC。
在一个具体实施方案中，病毒载体是痘病毒，例如痘苗病毒或减毒的痘苗病毒(例如，MVA，安卡拉疫苗株在鸡胚成纤维细胞上传代超过570代后获得的修改的安卡拉株；参见Stickl和Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.，1971，113，1149-1153；Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，10847-10851；可作为ATCC VR-1508获得；或NYVAC，参见美国专利号5,494,807，例如美国专利号5,494,807的实施例1-6以及下列等等，所述专利讨论NYVAC的构建，以及具有从哥本哈根株痘苗病毒基因组删除另外的ORF的NYVAC变异株，以及插入这种重组体的位点内的异源编码核酸分子，还有匹配启动子的使用；还参见WO96/40241)，禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘(fowlpox)、鸠痘(dovepox)、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC；还参见美国专利号5,505,941，5,494,807)，猪痘，浣熊痘，骆驼痘，或粘液瘤病病毒。
根据本发明的另一实施方案，痘病毒载体是金丝雀痘病毒或鸡痘病毒(fowlpox)载体，有利地减毒的金丝雀疸病毒或鸡痘病毒(fowlpox)。在这点上，金丝雀痘在登记号VR-111下可从ATCC获得。减毒的金丝雀痘病毒在美国专利号5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中描述。众多鸡痘病毒(fowlpox)疫苗接种株也是可获得的，例如由MERIAL销售的DIFTOSEC CT株，以及由INTERVET销售的NOBILIS VARIOLE疫苗；并且还参考美国专利号5,766,599，其涉及减毒的鸡痘病毒(fowlpox)株TROVAC。
关于生产其重组体以及如何施用其重组体的方法的信息，技术人员可以参考本文引用的文件以及WO90/12882，例如关于痘苗病毒可以提及的是美国专利号4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,494,807和5,762,938以及其他；关于鸡痘(fowlpox)，可以提及的是美国专利号5,174,993、5,505,941和US-5,766,599以及其他；关于金丝雀疸，可以提及的是美国专利号5,756,103以及其他；关于猪痘可以提及的是美国专利号5,382,425以及其他；并且关于浣熊痘，可以提及的是WO00/03030以及其他。
当表达载体是痘苗病毒时，关于待表达的一种或多种多核苷酸的一个或多个插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点，血凝素(HA)基因或插入位点，编码A型包涵体(ATI)的区域；还参见本文引用的文件，特别是涉及痘苗病毒的那些。在金丝雀痘的情况下，有利地一个或多个插入位点是ORF(s)C3、C5和/或C6；还参见本文引用的文件，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些。在鸡痘(fowlpox)的情况下，有利地一个或多个插入位点是ORFs F7和/或F8；还参见本文引用的文件，特别是涉及鸡痘病毒(fowlpox)的那些。关于MVA病毒的一个或多个插入位点有利地如各种出版物中的，包括Carroll M.W.等人，Vaccine，1997，15(4)，387-394；Stittelaar K.J.等人，J.Virol.，2000，74(9)，4236-4243；Sutter G.等人，1994，Vaccine，12(11)，1032-1040；并且在这点上还应当注意完整的MVA基因组在Antoine G.，Virology，1998，244，365-396中描述，这使得技术人员能够使用其他插入位点或其他启动子。
有利地，待表达的多核苷酸插入在特定痘病毒启动子的控制下，例如痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人，J.Virology，1985，54，30-35)，痘苗启动子I3L(Riviere等人，J.Virology，1992，66，3424-3434)，痘苗启动子HA(Shida，Virology，1986，150，451-457)，牛痘启动子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.，1988，69，35-47)， 痘苗启动子H6(Taylor J.等人，Vaccine，1988，6，504-508；Guo P.等人，J.Virol.，1989，63，4189-4198；Perkus M.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)，以及其他。
有利地，关于哺乳动物的疫苗接种，表达载体是金丝雀疸或鸡痘病毒(fowlpox)。以这种方式，可以表达具有有限或无生产性复制的异源蛋白质。
根据本发明的一个实施方案，表达载体是病毒载体，特别是体内表达载体。在一个有利的实施方案中，表达载体是腺病毒载体，例如人腺病毒(HAB)或犬腺病毒(CAV)。有利地，腺病毒是人Ad5载体、E1-删除和/或断裂的腺病毒、E3-删除和/或断裂的腺病毒、或E1-和E3-删除和/或断裂的腺病毒。任选地，E4可以从上文描述的任何一种腺病毒中删除和/或断裂。例如，Yarosh等人和Lutze-Wallace等人中描述的人Ad5载体可以用于根据本发明的方法表达Nipah病毒糖蛋白基因(参见，例如，Yarosh等人，Vaccine.1996 Sep；14(13)：1257-64和Lutze-Wallace等人，Biologicals.1995 Dec；23(4)：271-7)。
在一个实施方案中，病毒载体是人腺病毒，特别是通过病毒基因组E1区中的删除使得不能复制的血清型5腺病毒。删除的腺病毒在表达E1的293细胞或PER细胞，特别是PER.C6中繁殖(F.Falloux等人Human Gene Therapy 1998，9，1909-1917)。人腺病毒可以在E3区中删除，并且也在E1区中删除(参见，例如J.Shriver等人，Nature，2002，415，331-335，F.Graham等人Methods inMolecular Biology第7卷：Gene Transfer and ExpressionProtocols Edited by E.Murray，The Human Press Inc，1991，第109-128页；Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.Tapnell Adv.Drug Deliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人Gene Thrapy 2000，7，1707-1714；K.Berkner Bio Techniques 1988，6，616-629；K.Berkner等人Nucl. Acid Res.1983，11，6003-6020；C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。E1和/或E3区部分或完全删除后，插入位点最后可以是E1和/或E3基因座。有利地，当表达载体是腺病毒时，待表达的多核苷酸插入在真核细胞中起作用的启动子的控制下，例如强启动子，优选细胞巨化病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)。CMV-IE启动子有利地是鼠类或人来源。也可以使用延伸因子1α的启动子。在一个具体实施方案中，可以使用由缺氧调节的启动子，例如在K.Boast等人Human Gene Therapy 1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。还可以使用肌肉特异性启动子(X.Li等人Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。强启动子在本文中还在关于质粒载体时进行了讨论。多聚(A)序列和终止序列可以插入待表达的多核苷酸的下游，例如牛生长激素基因或兔β珠蛋白基因多腺苷酸化信号。
在另一实施方案中，病毒载体是犬腺病毒，特别是CAV-2(参见，例如L.Fischer等人，Vaccine，2002，20，3485-3497；美国专利号5,529,780；美国专利号5,688,920；PCT申请号WO95/14102)。对于CAV，插入位点可以在E3区中和/或位于E4区和右ITR区之间的区域中(参见美国专利号6,090,393；美国专利号6,156,567)。在一个实施方案中，插入片段在启动子的控制下，例如细胞巨化病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对于人腺病毒载体描述的启动子。多聚(A)序列和终止序列可以插入待表达的多核苷酸的下游，例如牛生长激素基因或兔β珠蛋白基因多腺苷酸化信号。
在另一具体实施方案中，病毒载体是疱疹病毒例如犬疱疹病毒(CHV)或猫疱疹病毒(FHV)。对于CHV，插入位点可以特别在胸苷激酶基因、ORF3、或UL43 ORF中(参见美国专利号6,159,477)。在一个实施方案中，待表达的多核苷酸插入在真核细胞中起作用的启动子的控制下，有利地为CMV-IE启动子(鼠类或人)。在一个具体实施方案中，可以使用由缺氧调节的启动子，例如在K.Boast等人HumanGene Therapy 1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。多聚(A)序列和终止序列可以插入待表达的多核苷酸的下游，例如牛生长激素 基因或兔β珠蛋白基因多腺苷酸化信号。
根据本发明的一个再进一步的实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体的非限制性例子中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke C.等人，Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97；Hartikka J.等人，Human Gene Therapy，1996，7，1205-1217)可以用作插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012且含有人tPA信号序列。
术语质粒涵盖任何DNA转录单位，其包含根据本发明的多核苷酸以及对于其在所需宿主或靶的一种或多种细胞中的体内表达所需的元件；并且，在这点上，应当注意超螺旋或非超螺旋的环状质粒，以及线性形式的质粒预期在本发明的范围内。
每种质粒包含或含有编码Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白、变体、类似物或片段的多核苷酸，或基本上由其组成，所述多核苷酸可操作地连接至启动子或在启动子的控制下或依赖于启动子。一般而言，采用在真核细胞中起作用的强启动子是有利的。优选的强启动子是人或鼠类来源的立即早期细胞巨化病毒启动子(CMV-IE)，或任选具有另一种来源例如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可以包含实际启动子部分，其可以与增强子部分结合或不结合。可以参考EP-A-260 148、EP-A-323 597、美国专利号5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT申请号WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart M.等人，Cell，1985，41，521-530)或鼠类CMV-IE。
更一般而言，启动子为病毒或细胞来源。可以在本发明实践中有效使用的除CMV-IE以外的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子，或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可以在本发明实践中有效使用的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如，结蛋白启动子(KwissaM.等人，Vaccine，2000，18，2337-2344)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人，Gene，1989，79，269-277)。
这些启动子的功能性亚片段，即维持足够启动活性的这些启动子 的部分包括在本发明内，例如根据PCT申请号WO98/00166或美国专利号6,156,567的截短的CMV-IE启动子可以在本发明实践中使用。因此在本发明实践中的启动子包括全长启动子的衍生物和亚片段，其维持足够的启动活性并因此起启动子的作用，优选启动活性基本上类似于衍生物或亚片段所来源的实际或全长启动子的那种，例如类似于美国专利号6,156,567截短的CMV-IE启动子的活性，或全长CMV-IE启动子的活性。因此，本发明实践中的CMV-IE启动子可以包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物和亚片段，或基本上由其组成，或由其组成。
有利地，质粒包含其他表达控制元件，或基本上由其组成。掺入一种或多种稳定序列是特别有利的，例如一种或多种内含子序列，优选hCMV-IE的第1个内含子(PCT申请号WO89/01036)、兔β珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，Science，1979，206，337-344)。
关于质粒和除痘病毒以外的病毒载体的多腺苷酸化信号(多聚A)，可以使用牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号(参见美国专利号5,122,458)，或兔β珠蛋白基因的多聚(A)信号，或SV40病毒的多聚(A)信号。
根据本发明的另一实施方案，表达载体是用于在合适的细胞系统中体外表达蛋白质的表达载体。蛋白质生产可以通过下列发生：经由质粒转染哺乳动物细胞，通过病毒载体在哺乳动物细胞或禽类细胞上复制或不含生产性复制的表达，或通过在昆虫细胞(例如，Sf9草地贪夜蛾细胞，ATCC CRL 1711；还参见美国专利号6,228,846，6,103,526)上的杆状病毒复制(参见，例如，美国专利号4,745,051；Vialard J.等人，J.Virol.，1990 64(1)，37-50；Verne A.，Virology，1988，167，56-71)，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒AcNPV。可以使用的哺乳动物细胞有利地是仓鼠细胞(例如CHO或BHK-21)或猴细胞(例如COS或VERO)。表达的蛋白质可以在分泌后或不在分泌后(如果没有分泌，那么一般发生或进行细胞裂解)在培养上清液中或从培养上清液中收获，任选通过浓缩方法 例如超滤进行浓缩和/或通过纯化方法例如亲和、离子交换或凝胶过滤型色谱方法进行纯化。
本领域技术人员应当理解用于培养宿主细胞的条件根据具体基因而变，并且有时候需要例行实验以测定取决于宿主细胞的用于培养Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的最佳条件。“宿主细胞”指已遗传改变、或能够通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体遗传改变的原核或真核细胞。当提及遗传改变的细胞时，该术语指最初改变的细胞及其后代。
包含所需序列的多核苷酸可以插入合适的克隆或表达载体内，并且载体随后可以引入合适的宿主细胞用于复制和扩增。多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法引入宿主细胞。含有目的多核苷酸的载体可以通过许多合适方法中的任何一种引入宿主细胞，包括直接摄取，内吞作用，转染，f交配，电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(其中载体是有传染性的，例如，逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
在一个有利的实施方案中，本发明提供了用于在靶细胞中递送和表达Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的治疗有效量的制剂的施用。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员是例行实验。在一个实施方案中，制剂包含表达载体和药学或兽医学可接受的运载体、媒介物或赋形剂，所述表达载体包含表达Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸。在一个有利的实施方案中，药学或兽医学可接受的运载体、媒介物或赋形剂促进载体或蛋白质的转染和/或改善其保存。
药学或兽医学可接受的运载体、或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，药学或兽医学可接受的运载体、或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可以用于本发明方法的其他药学或兽医学可接受的运载体、或媒介物或赋形剂包括，但不限于，多聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽 医学可接受的运载体、或媒介物或赋形剂可以是促进载体施用(或由本发明的载体体外表达的蛋白质)的任何化合物或化合物组合；有利地，运载体、或媒介物或赋形剂可以促进载体(或蛋白质)的转染和/或改善其保存。剂量和剂量体积在本文的一般描述中讨论并且还可以通过技术人员由本公开内容结合本领域的知识，无需任何过度实验而测定。
含有有利地但不是唯一适合于质粒的季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的那些：
其中R1是含有12-18个碳原子的饱和或未饱和的直链脂肪族基团，R2是含有2或3个碳原子的另一种脂肪族基团，并且X是氨基或羟基，例如DMRIE。在另一实施方案中，阳离子脂质可以与中性脂质例如DOPE结合。
在这些阳离子脂质中，优先考虑DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质，有利地为DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)结合，以形成DMRIE-DOPE。
有利地，质粒与佐剂的混合物临时且有利地与制剂施用同时或在制剂施用之前不久形成；例如，有利地在施用之前或以前不久，形成质粒-佐剂混合物，以便在施用以前给出足够的时间用于使混合物形成复合物，例如在施用以前约10-约60分钟，例如在施用以前约30分钟。
当存在DOPE时，DMRIE∶DOPE摩尔比有利地是约95∶约5-约5∶约95，更有利地约1∶约1，例如1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂：质粒重量比可以是约50∶约1-约1∶约10，例如约10∶约1-约1∶约5，并且有利地约1∶约1-约1∶ 约2，例如1∶1-1∶2。
在一个具体实施方案中，药物组合物在体内直接施用，并且编码产物通过载体在宿主中表达。编码Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的载体的体内递送方法(参见，例如美国专利号6,423,693；专利出版物EP 1052286，EP 1205551，美国专利出版物20040057941，WO 9905300和Draghia-Akli等人，Mol Ther.2002Dec；6(6)：830-6，其公开内容整体引入作为参考)可以修改以递送本发明的Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白。本发明所述编码Nipah病毒蛋白质，有利地Nipah病毒糖蛋白的载体的体内递送可以通过本领域普通技术人员根据上文提及的参考文献的教导来完成。
有利地，根据本发明的药物和/或治疗组合物和/或制剂包含有效量的如本文讨论的一种或多种表达载体和/或多肽、或基本上由其组成、或由其组成，以诱发治疗应答；并且，有效量可以根据本公开内容包括引入本文的文件，以及本领域的知识，无需过度实验而测定。
根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂，或基本上由其组成。用于在本发明实践中使用的特别合适的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如含有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman D.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1996，93，2879-2883；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版的“VaccineDesign，The Subunit and Adjuvant Approach”第147页上描述的SPT乳剂，以及相同作品第183页上描述的乳剂MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝或(7)本申请中引用并引入作为参考的任何文件中讨论的其他佐剂，或(8)其任何组合或混合物。
特别适合于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于：
-轻液体石蜡油(欧洲药典型)，
-类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯，
-由烯烃例如异丁烯或癸烯寡聚化产生的油，
-含有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或
-分支脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如：
-在一方面失水山梨醇、甘露醇(例如甘露醇酐油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇的酯，以及另一方面油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选是乙氧基化的，
-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如L121。
在(1)型佐剂聚合物中，优先考虑交联的丙烯酸或甲基丙烯酸，特别是由糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物已知为卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no.2，June 1996)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其提供了由含有至少3个羟基、优选不超过8个此类基团的多羟基化合物交联的此类丙烯酸聚合物，至少3个羟基的氢原子被含有至少2个碳原子的未饱和的脂肪族基团取代。优选的基团是含有2-4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他烯式未饱和的基团。未饱和的基团还可以含有其他取代基，例如甲基。在名称Carbopol(BF Goodrich，Ohio，USA)下出售的产品是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。在它们中，可以提及卡波姆974P、934P和971P。
关于马来酸酐-烯基衍生物共聚物，优先考虑EMA(Monsanto)，这是直链或交联的乙烯基-马来酸酐共聚物，并且它们例如通过二乙烯醚交联。还可以参考J.Fields等人，Nature 186：778-780，June4，1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选通过具有下式的基本单位形成：
其中：
-R1和R2，其可以是相同或不同的，表示H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，同时x+y＝2。
对于EMA，x＝0和y＝2并且对于卡波姆x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)，并且pH可以通过例如苏打(NaOH)调整至7.3-7.4，以提供其中表达载体可以掺入的佐剂溶液。最终疫苗组合物中的聚合物浓度可以是0.01-1.5％w/v，有利地0.05-1％w/v，并优选0.1-0.4％w/v。
本领域技术人员根据本公开内容和本领域的知识可以确定用于每次免疫接种或疫苗接种方案和物种的有效质粒剂量。
在一个有利的实施方案中，根据本发明的药物和/或治疗组合物和/或制剂通过注射施用，例如但不限于，肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射。
关于此类治疗组合物，根据本文的公开内容和本领域的知识，无需任何过度实验，技术人员就可以确定用于每个注射方案的施用次数、施用途径和剂量。
在一个有利的实施方案中，重组疫苗可以以每次剂量，例如每2ml剂量约至少103pfu的量施用于猪或感染或转染到细胞内；更优选约104pfu-约1010pfu，例如约105pfu-约109pfu，例如约106pfu-约108pfu。在一个特别有利的实施方案中，剂量为每次剂量约108 pfu。
方法包括给动物至少施用一次有效量的根据本发明的治疗组合物。动物可以是雄性、雌性、妊娠雌性和新生儿。这种施用可以特别通过肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或经由鼻内或口部施用完成。在一个有利的实施方案中，根据本发明的治疗组合物可以通 过注射器或无针器械(如，例如Pigjet、Biojector或Vitajet(Bioject，Oregon，USA))施用。施用质粒的另一种方法是使用电穿孔，参见，例如S.Tollefsen等人，Vaccine，2002，20，3370-3378；S.Tollefsen等人，Scand.J.Immunol.，2003，57，229-238；S.Babiuk等人，Vaccine，2002，20，3399-3408；PCT申请号WO99/01158。
本发明涉及用于在动物中针对Nipah病毒感染进行疫苗接种的药物组合物的用途。本发明涉及用于在动物中针对Hendra病毒感染进行疫苗接种的药物组合物的用途。在一个具体实施方案中，根据本发明包含Nipah F和Nipah G的药物组合物用于在动物中针对由Nipah或Hendra病毒引起的感染进行疫苗接种。在一个有利的实施方案中，动物是猪。在其他有利的实施方案中，动物是猫、狗、马或人。
本发明还提供了用于预防Nipah病毒在第一种动物和第二种动物之间传播的方法，其包含使用本文描述的任何方法在第一种动物中免疫或诱发免疫应答以预防疾病传播给第二种动物。本发明还提供了用于预防Hendra病毒从受感染的动物传播给另一种动物的方法，其包含使用本文描述的任何方法在第一种动物中免疫或诱发免疫应答以预防疾病传播给第二种动物。在一个具体实施方案中，根据本发明包含Nipah F和Nipah G的药物组合物用于针对由Nipah或Hendra病毒引起的感染疫苗接种所述第一种动物。在一个有利的实施方案中，其中第一种动物是猪。第二种动物是猫、狗、或马，有利地人。
本发明还提供了用于执行上文所述的任何方法的试剂盒，其包含上文所述的任何组合物，以及任选地用于执行方法的说明书。
本发明现在将经由下列非限制性实施例进一步描述。
实施例
实施例1：构建体
质粒pSL-6802-1-4的构建。pSL-6802-1-4包含C5基因座的侧翼序列、H6痘苗启动子和G Nipah病毒基因以产生VCP2199。Nipah病毒从人CSF中分离。Nipah G基因进行PCR扩增并插入质粒pTM1内， 产生pTM1 Nipah G。目的是构建pC5 H6p Nipah G供体质粒用于产生表达Nipah G的重组ALVAC金丝雀痘病毒。质粒名称是pC5 H6p NipahG，pSL-6802-1-4。质粒主链是pCXL-148-2，包含H6痘苗启动子的pC5H6p，对应插入片段的C5基因座的左和右臂。质粒pCXL-148-2通过在C5右臂中从T到C的单碱基突变由质粒pNVQH6C5LSP-18获得。质粒pNVQH6C5LSP-18在S.Loosmore等人US2005/0031641中描述。
Nipah G基因使用pTM1 Nipah G作为模板以及引物11470.SL和11471.SL进行PCR扩增(图2B)。将～1.8kb PCR片段克隆到pCR2.1内，产生克隆pSL-6771-1-1(pCR2.1 H6p Nipah G)，这通过序列分析进行确认(图2C)。将来自pSL-6771-1-1的～1.8kb Nru I-Xho IH6p Nipah G片段克隆到pCXL-148-2(pC5 H6p)内，产生pSL-6802-1-4(pC5 H6p Nipah G)，这通过序列分析进行确认(图2C和2D)。
质粒pSL-6802-2-5的构建。pSL-6802-2-5包含F8基因座的侧翼序列、H6痘苗启动子和G Nipah病毒基因以产生VFP2200。Nipah病毒从人CSF中分离。Nipah G基因进行PCR扩增并插入质粒pTM1内，产生pTM1 Nipah G。目的是构建pF8 H6p Nipah G供体质粒用于产生表达Nipah G的重组鸡痘病毒(fowlpox)。质粒名称是pF8 H6p NipahG，pSL-6802-2-5。质粒主链是pSL-6427-2-1，包含H6痘苗启动子的pF8 H6p，插入片段的F8基因座的左和右臂。质粒pSL-6427-2-1通过在F8左臂中从C到T的单碱基突变由质粒pSL-5440-5-1获得。质粒pSL-5440-5-1在S.Loosmore等人US2005/0031641中描述。
Nipah G基因使用pTM1 Nipah G作为模板以及引物11470.SL和11471.SL进行PCR扩增(图3A)。将～1.8kb PCR片段克隆到pCR2.1内，产生克隆pSL-6771-1-1(pCR2.1 H6p Nipah G)，这通过序列分析进行确认(图3B)。将来自pSL-6771-1-1的～1.8kb Nru I-Xho IH6p Nipah G片段克隆到pSL-6427-2-1(pF8 H6p)内，产生pSL-6802-2-5(pF8 H6p Nipah G)，这通过序列分析进行确认(图3B和3C)。
质粒pSL-6839-1的构建。pSL-6839-1包含F8基因座的侧翼序列、 H6痘苗启动子和F Nipah病毒基因以产生VFP2207。Nipah病毒从人CSF中分离。Nipah F基因进行PCR扩增并插入质粒pTM1内，产生pTM1Nipah F。目的是构建pF8 H6p Nipah F供体质粒用于产生表达NipahF的重组鸡痘病毒(fowlpox)。质粒名称：pF8 H6p Nipah F，pSL-6839-1。质粒主链是pSL-6427-2-1，包含H6痘苗启动子的pF8H6p，插入片段的F8基因座的左和右臂。
Nipah F中的内部T5NT序列通过定点诱变去除。编码H6启动子的3’末端和Nipah F基因的5’末端的片段使用引物11457.SL和11458.SL进行PCR扩增。在扩增的片段中，去除T5NT序列并引入ApaI位点用于克隆目的(图4B)。将片段克隆到pCR2.1内，产生pSL-6797-3-1(pCR2.1 H6p 5’-Nipah F，T5NT)，这通过序列分析进行确认(图4C)。3’-Nipah F片段使用引物11456.SL和11459.SL进行PCR扩增。在扩增的片段中，去除T5NT序列并引入ApaI位点用于克隆目的(图4B)。将片段克隆到pCR2.1内，产生pSL-6797-4-1(pCR2.1 3’-Nipah F，无T5NT)，这通过序列分析进行确认(图4C)。将来自pSL-6797-3-1的～0.7kb Nru I-BamH I H6p5’-Nipah F片段插入pSL-6427-2-1(pF8 H6p)内，产生pSL-6830-1(pF8 H6p 5’-Nipah F)。将来自pSL-6797-4-1的～1.0kb Apa I-BamHI 3’-Nipah F片段插入pSL-6830-1的Apa I和Bam H I之间，产生pSL-6839-1(pF8 H6p Nipah F)，这通过序列分析进行确认(图4C和4D)。
质粒pSL-6851-29的构建。pSL-6851-29包含C5基因座的侧翼序列、H6痘苗启动子和FNipah病毒基因以产生VCP2208。Nipah病毒从人CSF中分离。Nipah F基因进行PCR扩增并插入质粒pTM1内，产生pTM1 Nipah F。目的是构建pC5 H6p Nipah F供体质粒用于产生表达Nipah F的重组ALVAC金丝雀痘病毒。质粒名称是pSL-6851-29，pC5 H6pNipah F。质粒主链是pCXL-148-2，包含H6痘苗启动子的pC5 H6p，插入片段的C5基因座的左和右臂。
Nipah F中的内部T5NT序列通过定点诱变去除。编码H6启动子 的3’末端和Nipah F基因的5’末端的片段使用引物11457.SL和11458.SL进行PCR扩增。在扩增的片段中，去除T5NT序列并引入ApaI位点用于克隆目的(图5A)。将片段克隆到pCR2.1内，产生pSL-6797-3-1(pCR2.1 H6p 5’-Nipah F，无T5NT)，这通过序列分析进行确认(图5B)。3’-Nipah F片段使用引物11456.SL和11459.SL进行PCR扩增。在扩增的片段中，去除T5NT序列并引入ApaI位点用于克隆目的(图5A)。将片段克隆到pCR2.1内，产生pSL-6797-4-1(pCR2.1 3’-Nipah F，无T5NT)，这通过序列分析进行确认(图5B)。将来自pSL-6797-3-1的～0.7kb Nru I-BamH I H6p5’-Nipah F片段插入pSL-6427-2-1(pF8 H6p)内，产生pSL-6830-1(pF8 H6p 5’-Nipah F)。将来自pSL-6797-4-1的～1.0kb Apa I-BamHI 3’-Nipah F片段插入pSL-6830-1的Apa I和Bam H I之间，产生pSL-6839-1(pF8 H6p Nipah F)，这通过序列分析进行确认。将来自pSL-6839-1的1.7kb Nru I-Xma I H6p Nipah F片段插入pCXL-148-2(pC5 H6p)内，以产生pSL-6851-29(pC5 H6p Nipah F)，这通过序列分析进行确认(图5B和5C)。
表达Nipah F的重组鸡痘病毒(fowlpox)vFP2207的构建。基因是Nipah F。供体质粒是pSL-6839-1。插入位点是鸡痘病毒(fowlpox)的F8基因座。启动子是痘苗病毒H6启动子。用于体外重组的细胞是在10％FBS和DMEM中生长的原代鸡胚成纤维细胞(1°CEF)。
体外重组通过用Not I-线性化供体质粒pSL-6839-1(20ug)转染1°CEF细胞来进行。转染的细胞随后用鸡痘病毒(fowlpox)作为拯救病毒在MOI为10时感染。48小时后，收获转染-感染的细胞，超声处理并用于重组病毒筛选。重组空斑基于空斑转印杂交方法使用Nipah F特异性探针进行筛选，所述探针用辣根过氧化物酶标记。连续4轮空斑纯化后，产生命名为vCP2207的重组体并通过对于插入片段为100％阳性和对于F8 ORF为100％阴性的杂交来确认。
表达Nipah G的重组金丝雀痘病毒vCP2199的构建。基因是NipahG。供体质粒是pSL-6802-1-4。插入位点是C5。启动子是H6启动子。
用于体外重组的细胞是在10％FBS和DMEM中生长的原代鸡胚成纤维细胞(1°CEF)。
体外重组通过用Not I-线性化供体质粒pSL-6802-1-4(15ug)转染1°CEF细胞来进行。转染的细胞随后用ALVAC作为拯救病毒在MOI为10时感染。24小时后，收获转染-感染的细胞，超声处理并用于重组病毒筛选。重组空斑基于空斑转印杂交方法使用Nipah G特异性探针进行筛选，所述探针用辣根过氧化物酶标记。连续5轮空斑纯化后，产生命名为vCP2199的重组体并通过对于Nipah G插入片段为100％阳性和对于C5 ORF为100％阴性的杂交来确认。
表达Nipah G的重组鸡疸病毒(fowlpox)vCP2200的构建。基因是Nipah G。供体质粒是pSL-6802-2-5。插入位点是F8。启动子是H6启动子。用于体外重组的细胞是在10％FBS和DMEM中生长的原代鸡胚成纤维细胞(1°CEF)。
体外重组通过用Not I-线性化供体质粒pSL-6802-2-5(15ug)转染1°CEF细胞来进行。转染的细胞随后用鸡痘病毒(fowlpox)作为拯救病毒在MOI为8时感染。48小时后，收获转染-感染的细胞，超声处理并用于重组病毒筛选。重组空斑基于空斑转印杂交方法使用Nipah G特异性探针进行筛选，所述探针用辣根过氧化物酶标记。连续4轮空斑纯化后，产生命名为vFP2200的重组体。它们通过对于Nipah G插入片段为100％阳性和对于F8 ORF为100％阴性的杂交来确认。
表达Nipah F的重组金丝雀痘病毒vCP2208的构建。基因是NipahF。供体质粒是pSL6851.29(pC5 H6p Nipah F)。插入位点是C5。启动子是痘苗H6启动子。用于体外重组的细胞是在10％FBS和DMEM中生长的原代鸡胚成纤维细胞(1°CEF)。
体外重组通过用Not I-线性化供体质粒pSL6851.29(10ug)转染1°CEF细胞来进行。转染的细胞随后用ALVAC作为拯救病毒在MOI为10时感染。24小时后，收获转染-感染的细胞，超声处理并用于重组病毒筛选。重组空斑基于空斑转印杂交方法使用Nipah F特异性探 针进行筛选，所述探针用辣根过氧化物酶标记。连续4轮空斑纯化后，产生命名为vCP2208的重组体并通过对于Nipah F插入片段为100％阳性和对于C5 ORF为100％阴性的杂交来确认。
实施例2：表达
鸡痘病毒(fowlpox)Nipah G vFP2200的蛋白质印迹(图6)。原代CEF细胞用vCP2199(ALVAC C5 H6p Nipah G)和vFP2200(鸡痘病毒(fowlpox)F8 H6p Nipah G)在MOI为10时感染，并于37℃孵育24小时。随后收获细胞和培养物上清液。样品蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分离、转移至Immobilon尼龙膜。使用豚鼠抗血清和化学发光系统。Nipah G在vCP2199和vFP2200的细胞沉淀中表达。它不在上清液中出现。
ALVAC Nipah F vCP2208的蛋白质印迹(图7A和7B)。原代CEF细胞用vCP2208(ALVAC C5 H6p Nipah F)在MOI为10时感染，并孵育24小时。收获上清液并澄清。收获细胞并悬浮于水中以裂解。裂解物和上清液通过10％SDS-PAGE分离。将蛋白质转移至尼龙膜并用Western封闭缓冲液封闭。使用豚鼠抗血清和化学发光显色系统显示来自vCP2208(ALVAC C5 H6p Nipah F)的F蛋白质的表达。使用猪抗血清和辣根过氧化物酶系统同样显示来自vCP2208的F蛋白质的表达，但强度较低。
ALVAC Nipah G vCP2199的蛋白质印迹(图6)。原代CEF细胞用vCP2199(ALVAC C5 H6p Nipah G)和vFP2200(鸡痘病毒(fowlpox)F8 H6p Nipah G)在MOI为10时感染，并于37℃孵育24小时。随后收获细胞和培养物上清液。样品蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分离、转移至Immobilon尼龙膜。使用豚鼠抗血清和化学发光系统。Nipah G在vCP2199和vFP2200的细胞沉淀中表达。它不在上清液中出现。
鸡痘病毒(fowlpox)Nipah F vFP2207的蛋白质印迹(图7A和7B)。原代CEF细胞用vFP2207(鸡痘病毒(fowlpox)F8 H6p NipahF)在MOI为10时感染，并孵育24小时。收获上清液并澄清。收获细胞并悬浮于水中以裂解。裂解物和上清液通过10％SDS-PAGE分离。将 蛋白质转移至尼龙膜并用Western封闭缓冲液封闭。使用豚鼠抗血清和化学发光显色系统显示来自vFP2207(鸡痘病毒(fowlpox)F8 H6pNipah F)的F蛋白质的表达。使用猪抗血清和辣根过氧化物酶系统同样显示来自vFP2207的F蛋白质的表达，但强度较低。
实施例3：血清学和保护
16头猪随机分为4个组。F组的动物用表达Nipah病毒F蛋白质的108pfu/剂量的VCP2208免疫。G组的动物用表达Nipah病毒G蛋白质的108pfu/剂量的VCP2199免疫。G+F组的动物用含有分别表达Nipah病毒G和F蛋白质的108pfu/剂量的VCP2199和108pfu/剂量的VCP2208的混合物免疫。攻击组的动物是未接种疫苗的对照动物。
猪在第0天和第14天时通过肌内途径注射。猪在第28天时通过鼻内接种2.5×105pfu的Nipah病毒进行攻击。攻击后7天，通过RT-PCR或各种器官和鼻拭子中的病毒分离鉴别病毒的存在。在第一次注射后的第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第34天和第35天收集血液样品，并通过IgG间接ELISA或血清中和测定法测量抗体滴度。中和抗体在微量滴定空斑减少中和测定法(mPRNT)中如先前所述(H.Weingartl等人，Can.J.Vet.Rrs.2003，67，128-132)，使用Vero V-76细胞和1％羧甲基纤维素覆盖进行测定。空斑减少90％的孔视为对于Nipah病毒中和抗体存在阳性。ELISA和中和滴度(NT)的数据呈现于表1中。组合的Nipah F/G在攻击前诱导最高的中和滴度，其次是G疫苗。F疫苗诱导较低的中和抗体。
病毒空斑测定法：病毒空斑测定法在12孔板(Costar，Corning，NY)中使用汇合单层的Vero 76或PT-K75进行。病毒接种物(400μl/孔)在细胞上于33℃，5％CO2孵育1小时，随后替换为2ml 2％的羧甲基纤维素、钠盐、培养基粘度/DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)/2％FBS覆盖，并于33℃，5％CO2孵育。5天后细胞用4％甲醛固定并用0.5％结晶紫/80％甲醇/PBS染色。根据V.Guillaume等人J.Virol.Method.2004，120，229-237，使用SmartCycler(Cepheid)、 Quantitech试剂盒(Qiagen)、以及位于N基因内的引物和探针(Applied Biosystems International)只对血清/血浆和PMBC样品进行实时RT-PCR。正向引物GCA CTT GAT GTG ATT AGA(SEQ ID NO：29)和反向引物GGC AGT GTC GGG AGC TGT AA(SEQ ID NO：12)位于N基因内，产生395bp的扩增子。实时RT-PCR使用克隆到pSHAME2a质粒内的Nipah病毒N基因用在100μl样品中300个拷贝/反应的灵敏度进行标准化。在35个循环时变成阳性的样品视为阴性。
Nipah病毒在猪#33(1个空斑)、#35(1个空斑)和#36的三叉神经节中以非常低的滴度分离。在对照动物中，Nipah病毒可以从许多组织中以高达10e3pfu/ml分离：猪#39在鼻甲、气管、嗅球、三叉神经节、细支气管淋巴结和颌下淋巴结(LN)中阳性；猪#40在鼻甲、气管、嗅球、脑膜、三叉神经节、细支气管LN、颌下LN和脑中阳性。RT-PCR结果在表2和3中提供。数字是阈值循环数。在用F/G疫苗免疫的猪的免疫猪血浆、血清或PBMC中没有检测到RNA。
这些结果显示使用表达Nipah病毒F或G蛋白质的重组体的明确保护，以及使用Nipah病毒F+G蛋白质组合的完整保护。
实施例4：交叉中和
18头猪随机分为4个组。F组的4只动物用表达Nipah病毒F蛋白质的108pfu/剂量的vCP2208免疫。G组的4只动物用表达Nipah病毒G蛋白质的108pfu/剂量的vCP2199免疫。G+F组的4只动物用含有分别表达Nipah病毒G和F蛋白质的108pfu/剂量的vCP2199和108pfu/剂量的vCP2208的混合物免疫。作为未接种疫苗的对照组，6只动物用Nipah病毒天然感染并携带高达感染后28天(dpi)。这个组命名为“长期感染”。
F、G和G+F组的猪在第0天和第14天时通过肌内途径注射。在疫苗接种后第27天时(dpv或疫苗接种后天数)收集血液样品，并通过血清中和测定法测量抗体滴度。中和抗体在微量滴定空斑减少中和测定法(mPRNT)中如先前所述(H.Weingartl等人，Can.J.Vet.Rrs.2003，67，128-132)，使用Vero V-76细胞进行测定，所述Vero V-76细胞以1.2×105细胞/cm2(40,000细胞/孔)接种在96孔板中并用补充10％FBS的DMEM培养基在5％CO2 37℃下孵育。100μL系列2倍稀释血清(1/10-1/1280)与100μL Hendra或Nipah病毒一起在5％CO2 37℃下孵育1小时，所述病毒调整至含有1000PFU/100μL。所有稀释在DMEM中进行。
孵育后将100μL上述混合物转移到V76单层细胞上。含接种物的板在5％CO2 37℃下孵育1小时。
1小时后去除接种物并替换为100μL溶于补充2％FBS的DMEM的2％羧甲基纤维素溶液。板在5％CO2 37℃下孵育72小时。
对于Nipah病毒的反向滴定产生工作液稀释度为500PFU/孔的结果，并且对于Hendra病毒：625PFU/孔。
注意：来自用F蛋白质疫苗接种的猪的血清从1/50进行2倍稀释至1/2400。
空斑减少90％的孔视为对于Nipah病毒中和抗体存在或对于Hendra病毒中和抗体存在为阳性。
中和滴度的数据呈现于表4中。组合的Nipah F/G诱导了用于生产针对Nipah病毒的抗体的协同效应，这在天然感染Nipah病毒的过程中不会产生(参见长期感染组的结果)。G疫苗或F疫苗单独不诱导针对Nipah病毒的中和抗体，或比F+G疫苗诱导更低的中和抗体。在针对Nipah病毒的抗体滴度水平和针对Nipah病毒的那些之间没有关联。
[0174]
[0176]
[0180] 本发明由下列已编号的段落进一步描述：
1.一种禽痘病毒表达载体，其包含编码Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸。
2.段落1的禽痘病毒表达载体，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附着(G)蛋白。
3.段落1的禽痘病毒表达载体，其中所述Nipah病毒糖蛋白是融合(F)蛋白。
4.段落1的禽痘病毒表达载体，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附着(G)蛋白和融合(F)蛋白。
5.段落2的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸碱基序列。
6.段落3的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸碱基序列。
7.段落4的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸编码SEQ IDNO：8的肽。
8.段落2的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸编码SEQ IDNO：7的肽。
9.段落3的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸编码SEQ IDNO：7的肽和SEQ ID NO：8的肽。
10.段落5的禽痘病毒表达载体，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸6654-核苷酸10751的核苷酸碱基序列。
11.段落1-10的禽疸病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是减毒的禽痘病毒表达载体。
12.段落1-11的禽痘病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是金丝雀痘病毒载体。
13.段落12的金丝雀疸病毒载体，其中所述金丝雀痘病毒载体是ALVAC。
14.段落1-11的禽痘病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是鸡痘病毒(fowlpox)载体。
15.段落14的鸡痘病毒(fowlpox)载体，其中所述鸡痘病毒(fowlpox)载体是TROVAC。
16.一种表达载体，其中所述表达载体是vCP2199。
17.一种表达载体，其中所述表达载体是vCP2208。
18.一种表达载体，其中所述表达载体是vFP2200。
19.一种表达载体，其中所述表达载体是vVP2207。
20.一种用于递送和表达Nipah病毒糖蛋白的制剂，其中所述制剂包含段落1-19中任何一段的载体和药学或兽医学可接受的运载体、媒介物或赋形剂。
21.段落20的制剂，其中所述运载体、媒介物或赋形剂促进所述载体的转染和/或改善其保存。
22.一种将Nipah病毒糖蛋白递送至动物的方法，其包含给所述动物施用段落21或22的制剂。
23.段落22的方法，其中所述动物是猪。
24.一种在动物中诱发免疫应答的方法，其包含以有效量施用包含段落1-19中任何一段的载体的组合物用于诱发免疫应答。
25.一种在动物中诱发免疫应答的方法，其包含以有效量施用包含细胞的组合物用于诱发免疫应答，其中所述细胞包含段落1-19中任何一段的载体。
26.一种在动物中诱导免疫或保护性应答的方法，其包含以有效量施用包含段落1-19中任何一段的载体的组合物用于诱发免疫应答。
27.一种在动物中诱导免疫或保护性应答的方法，其包含以有效量施用包含细胞的组合物用于诱发免疫应答，其中所述细胞包含段落1-19中任何一段的载体。
28.段落24-27中任何一段的方法，其中所述动物是猪。
29.一种用于预防Nipah病毒在第一种动物和第二种动物之间传播的方法，其包含段落24-27中任何一段的方法，其中段落24-27中任何一段的动物是第一种动物。
30.段落29的方法，其中所述第一种动物是猪。
31.段落29或30的方法，其中所述第二种动物是人。
32.段落29或30的方法，其中所述第二种动物是猫或狗。
33.一种用于执行段落22-32中任何一段的方法的试剂盒，其包含段落1-19中任何一段的载体或段落20或21中任何一段的制剂，以及用于执行所述方法的说明书。
***
鉴于因此详细描述的本发明的有利实施方案，应当理解由上文段落限定的本发明不限于上文说明书中阐述的具体细节，因为无需背离本发明的精神或范围即可进行其许多显而易见的变化。
Claims (15)
1.禽痘病毒表达载体，其包含编码Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附着(G)蛋白，其中所述载体施用于选自猪、猫、狗和马的动物。
2.禽痘病毒表达载体，其包含编码Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸，其中所述Nipah病毒糖蛋白是融合(F)蛋白，其中所述载体施用于选自猪、猫、狗和马的动物。
3.权利要求1或2的禽痘病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是减毒的禽痘病毒表达载体。
4.权利要求1或2的禽痘病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是金丝雀痘病毒载体。
5.权利要求4的禽痘病毒表达载体，其中所述金丝雀痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：7所示的序列的F蛋白的多核苷酸。
6.权利要求4的禽痘病毒表达载体，其中所述金丝雀痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：8所示序列的G蛋白的多核苷酸。
7.权利要求1或2的禽痘病毒表达载体，其中所述禽痘病毒表达载体是鸡痘病毒载体。
8.权利要求7的禽痘病毒表达载体，其中所述鸡痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：7所示的序列的F蛋白的多核苷酸。
9.权利要求7的禽痘病毒表达载体，其中所述鸡痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：8所示的序列的G蛋白的多核苷酸。
10.权利要求6的禽痘病毒表达载体，其中所述金丝雀痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的序列的多核苷酸。
11.权利要求5的禽痘病毒表达载体，其中所述金丝雀痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列的多核苷酸。
12.权利要求9的禽痘病毒表达载体，其中所述鸡痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：18或SBQ ID NO：19所示的序列的多核苷酸。
13.权利要求8的禽痘病毒表达载体，其中所述鸡痘病毒载体包含编码具有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的序列的多核苷酸。
14.一种用于递送和表达Nipah病毒糖蛋白的制剂，其中所述制剂包含权利要求1或2的禽痘病毒表达载体和药学或兽医学可接受的运载体、媒介物或赋形剂。
15.权利要求14的制剂，其中所述运载体、媒介物或赋形剂促进所述载体的转染和/或改善其保存。
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