CN112888457A - 抗尼帕病毒的疫苗及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一个方面涉及能够表达至少一种在哺乳动物中引起抗NiV病毒的免疫响应的尼帕病毒(NiV)抗原的核酸构建体及其使用方法。

Description

抗尼帕病毒的疫苗及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2018年8月21日提交的美国临时申请号62/720,393的优先权，该临时申请的全部内容以其整体结合于本文中。

技术领域

本发明涉及编码尼帕(Nipah)病毒抗原的重组核苷酸序列及其功能片段。本发明还涉及用于产生针对尼帕病毒疾病的免疫力的编码尼帕病毒抗原的多个重组核苷酸序列的组合。本发明的组合物提供了用于诱导免疫响应以及用于预防和/或治疗性免疫个体抗尼帕病毒的改进方法。

背景技术

尼帕病毒(NiV)是副粘病毒(Paramyxoviridae)科的一个成员，于1998年首次报道。在这种情况下，猪是中间宿主。然而，在随后的NiV暴发中，却没有中间宿主。2004年在孟加拉国，由于食用被感染的果蝠污染的枣椰子汁(date palm sap)，人类感染了NiV。人与人的传播也有记录，包括在印度的一家医院中。

人类的NiV感染具有一系列临床表现。传播后5-14天，受感染的人会出现类似流感的症状，发烧和头痛，然后出现嗜睡，迷失方向和精神错乱，这可能在24-48小时内导致昏迷。感染NiV的患者通常在5-14天的潜伏期后会出现严重的肺部疾病和脑炎，然而，NiV感染可能会潜伏并在以后重新激活。这种病毒能够在急性感染幸存者中引起长期后遗症。

因此，仍然需要开发预防NiV的疫苗。本发明解决了这一需求。

发明内容

本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含编码至少一种共有(consensus)尼帕病毒(NiV)抗原的核酸分子。

在一个实施方式中，NiV抗原选自由融合抗原、糖蛋白抗原及其组合组成的组中。

在一个实施方式中，该核酸分子编码包含选自由以下氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的肽：a)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％具有至少约90％的一致性的免疫原性片段，c)选自由SEQID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方式中，该核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组中。

在一个实施方式中，所述核酸分子包含选自由以下的核苷酸序列组成的组的核苷酸序列：a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％的一致性的核苷酸序列，b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％的一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和d)选自由SEQ ID NO：1和SEQID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方式中，编码该肽的核苷酸序列与至少一种选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组中的调节序列可操作地连接。

在一个实施方式中，该核酸分子编码包含可操作地连接至SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的选自由以下氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的肽：a)相对于选自由SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％具有至少约90％的一致性的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方式中，所述核酸分子包含可操作地连接至编码SEQ ID NO：9的核苷酸序列的选自由以下的核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列：a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％的一致性的核苷酸序列，b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％的一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和d)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方式中，该核酸分子包含表达载体。

在一个实施方式中，该核酸分子被引入病毒颗粒中。

在一个实施方式中，该免疫原性组合物还包含药用赋形剂。

在一个实施方式中，该免疫原性组合物还包含佐剂。

本发明还提供了一种在需要其的受试者中诱导针对NiV抗原的免疫响应的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者给予包含编码至少一种共有(consensus)尼帕病毒(NiV)抗原的核酸分子的组合物。

在一个实施方式中，给予包括电穿孔和注射中的至少一种。

本发明还提供了一种在需要其的受试者中治疗或预防与NiV相关的病症的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者给予包含编码至少一种共有尼帕病毒(NiV)抗原的核酸分子的组合物。

在一个实施方式中，NiV相关的病症是NiV感染和脑炎中的至少一种。

附图说明

图1，包含图1A-图1C，描述了表达NiV-融合(F)免疫原的构建体的设计。图1A描绘了开发以表达NiV-F免疫原的表达构建体的图。图1B描绘了说明通过对多种NiV菌株进行分析而设计出共有NiV-F免疫原的图。图1C描绘了说明共有NiV抗原的表达的示例性数据。

图2，包括图2A-图2C，描述了表达NiV-糖蛋白(G)免疫原的构建体的设计。图2A描绘了开发以表达NiV-G免疫原的单个表达构建体的图。图2B描绘了说明通过对多个NiV菌株进行分析而设计出共有NiV-G免疫原的图。图2C描绘了说明共有NiV抗原的表达的示例性数据。

图3，包括图3A-图3B，描述了显示在NiV-F(图3A)和NiV-G(图3B)接种疫苗的动物中强效T-细胞响应的示例性NiV-F IFN-γELISpot分析测试的结果。该T细胞响应对所有肽库都有反应性。

图4，包括图4A-图4B，描绘了说明NiV-F和NiV-G蛋白的表达、纯化和表征的示例性实验结果。图4A描绘了说明NiV-F重组包膜蛋白的表达的示例性数据。图4B描绘了说明NiV-G重组包膜蛋白的表达的示例性数据。

图5，包括图5A-图5B，描绘了说明NiV疫苗诱导的体液免疫响应的示例性数据。图5A描绘了使用1×25μg疫苗接种时间表接种NiV-F的各个小鼠的血清滴度。图5B描绘了说明疫苗接种后F-特异性血清抗体的存在的示例性数据。

图6包括图6A图6B，是一组显示NiV-G疫苗引发免疫响应的图像。图6A是一组显示通过免疫荧光分析法对由NiV-G诱导的IgG抗体响应进行反应性分析的示例性图像。图6B是描绘与单独的pVaxl相比，在小鼠中递送的NiV-G疫苗表现出与重组NiV-G蛋白的免疫反应性的图像。

图7，包括图7A-图7E，是一组显示尼帕疫苗诱导抗原特异性细胞免疫响应的图像。尼帕特异的CD8⁺T淋巴细胞响应通过覆盖尼帕-融合(Nipah-Fusion)(图7A)和糖蛋白(图7B)的肽库的IFN-g ELISpot测试法进行评价。第二次免疫后一周各组的平均响应。误差棒表示标准差。

图7C和图7D图示说明了C57BL/6小鼠中尼帕(Nipah)特异性显性表位的表征。IFN-g响应是通过ELISpot分析法采用肽的矩阵库进行评价，表明尼帕特异性融合蛋白(图7C)和糖蛋白(图7D)的免疫显性表位组合物的存在。这些值代表每组(n＝4)的平均响应±SEM。

图7E显示了由尼帕F疫苗诱导的T-细胞响应的流式细胞术分析。当由尼帕-F肽刺激时，用尼帕-F的免疫会诱导更高数量的IFN-g、TNF-α和IL-2分泌细胞。在最后一次使用尼帕-F疫苗免疫后一周，在合并的尼帕-融合肽或仅R10的存在下培养脾细胞。通过流式细胞术测量尼帕-融合特异性IFN-g、NF-α和IL-2分泌细胞的频率。基于阴性对照(未刺激)样品设置单功能门，并在所有样品中一致放置。显示了总CD8+T细胞响应百分比。这些数据代表了两个独立的免疫实验。IFN，干扰素；TNF，肿瘤坏死因子。

具体实施方式

本发明涉及一种组合物，其包含编码一种或多种尼帕病毒(NiV)抗原的重组核酸序列及其功能片段。所述组合物能够给予有此需要的受试者，以在所述受试者中引发抗NiV病毒的免疫响应。

在一个实施方式中，该组合物包含一种或多种能够在受试者中表达一种或多种共有NiV抗原的核苷酸序列和药用赋形剂。在一个实施方式中，该核酸分子包含与编码一种或多种共有NiV抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一个实施方式中，一种或多种共有NiV抗原是一种或多种融合物和糖蛋白抗原。在一个实施方式中，本发明涉及用于表达融合物和糖蛋白共有NiV抗原的单个核酸构建体。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。下面描述优选的方法和材料，尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的方法和材料能够用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体结合于本文中。本文公开的材料、方法和实施例仅是举例说明性的，而非旨在进行限制。

本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“能够”、“含有”及其变体旨在是开放性的过渡性短语、术语或词语，其不排除其他行为或结构可能性。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。本公开还设想其他实施方式无论是否明确提出，都“包括”本文中陈述的实施方式或其要素、“由其组成和“基本上由其组成”。

正如本文所用，“佐剂”可以是指添加到核酸疫苗中以增强疫苗的抗原性的任何分子。

“抗原”是指具有在宿主中产生免疫响应的能力的蛋白。抗原可以被抗体识别并结合。抗原可能起源于体内或来自外部环境。

正如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”可以指包含编码如本文所述的抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以还包括可操作地连接至调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和能够指导该核酸给予的个体或哺乳动物的细胞中表达的聚腺苷酸化信号。该编码序列可以还包括对信号肽进行编码的序列。

正如本文所用，“互补”或“互补的”可以可以指核酸可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

正如本文所用，“共有”或“共有序列”可以是指基于对多个序列(例如，特定病毒抗原的多个序列)的比对进行分析而构建的合成核苷酸序列或相应多肽序列。

术语“恒定电流”在本文中用于定义在递送到相同组织的电脉冲的持续时间内由组织或限定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲从本文所述的电穿孔设备递送。因为本文中提供的电穿孔设备具有反馈元件，优选具有瞬时反馈，则该电流在电脉冲的整个生命期内以恒定安培数保持于所述组织中。反馈元件能够在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔设备改变其电能输出(例如，增加电压)，从而使同一组织中的电流在整个电脉冲内以及脉冲与脉冲之间保持恒定(以微秒的量级)。在一些实施方式中，反馈元件包括控制器。

正如本文所用的“电流反馈”或“反馈”可以互换使用，并可以是指所提供的电穿孔设备的主动响应，其包括测量电极之间的组织内电流并相应地改变由EP设备输送的能量输出，以便保持电流于恒定水平。该恒定水平由使用者在脉冲序列或电治疗开始之前预设。该反馈可以通过电穿孔设备的电穿孔组件，例如，控制器，而实现，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织内电流并将所监测的电流(或组织内电流)与预设电流进行比较，并不断进行能量输出调整，以将所监测的电流保持于预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。

正如本文所用，“分散电流(Decentralized current)”可以是指从如本文所述的电穿孔设备的各种针状电极阵列输送的电流的模式，其中所述模式最小化，或优选消除，正在电穿孔的组织的任何区域上与电穿孔相关的热应力的出现。

正如本文可以互换使用的“电穿孔”、“电渗”或“电动增强”(“EP”)可以是指跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔道)的使用；它们的存在使生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水能够从细胞膜的一侧穿过到另一侧。

正如本文所用，“内源性抗体”可以是指在受试者中产生的对诱导体液免疫响应有效的抗体。

本文所使用的“反馈机制”可以是指由软件或硬件(或固件)执行的过程，该过程接收并比较具有当前值(优选电流)的所需组织的阻抗(在能量脉冲的传递之前、期间和/或之后)，并调整所传递的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。

“片段”可以是指全长多肽序列或核苷酸序列的百分比。片段可以包含20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，45％或更多，50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，91％或更高，92％或更高，93％或更高，94％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，99％或更高百分比的全长亲本核苷酸序列或氨基酸序列或其变体。

正如本文所用，“基因构建体”是指包含编码蛋白如抗原的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接至调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和能够在核酸分子给予的个体的细胞中指导表达的聚腺苷酸化信号。正如本文所用，术语“可表达形式”是指含有必需的调控元件的基因构建体，所述调控元件可操作地连接至编码蛋白的编码序列，从而使得当存在于个体的细胞中时，就会表达该编码序列。

正如本文在两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中所使用的“一致的”或“一致性”可以是指该序列具有在指定区域内的相同残基的指定百分比。通过最佳比对所述两个序列，在指定区域内比较所述两个序列，确定出两个序列中出现相同残基的位置的数目而产生匹配位置的数目，并将所述匹配位置的数目除以所述指定区域内的位置总数，并将所述结果乘以100而得出序列一致性的百分比，就可以计算出该百分比。如果两个序列的长度不同，或比对产生一个或多个交错的末端(staggered end)，并且所指定的比对区域仅包含单个序列，则所述单个序列的残基包括于分母中，但不包括于所述计算的分子中。比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以当作是等效的。一致性可以手动执行，也可以使用计算机序列算法如BLAST或BLAST 2.0进行。

当讨论反馈机制时，可以使用本文中所用的“阻抗”，并且能够根据欧姆定律将其转换为电流值，从而可以与预设电流进行比较。

正如本文所用，“免疫响应”可以是指响应于一种或多种核酸和/或肽的引入而激活宿主的免疫系统，例如，哺乳动物的免疫系统。免疫响应能够是以细胞响应或体液响应或这两者的形式。

本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以是指至少两个共价连接至一起的核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸及其互补物。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可以包含双链和单链序列的部分。核酸可以是基因组和cDNA的DNA，RNA或杂合体，其中核酸可以包含脱氧核糖和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法而获得。

正如本文所用，“可操作地连接”可以是指基因的表达处于与其空间连接的启动子的控制之下。启动子可以位于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与该启动子与在其来源的基因中由其控制的基因之间的距离大致相同。正如本领域中已知，可以接受该距离的变化而不会丢失启动子功能。

本文所用的“肽”，“蛋白”或“多肽”能够是指氨基酸的连接序列，并能够是天然的、合成的，或天然或合成的修饰或组合。

正如本文所用，“启动子”可以是指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏子元件，其能够位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。启动子可以源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段或响应外部刺激如生理压力、病原体、金属离子或诱导剂而组成性地或差异性地调节基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可以互换使用，并且是指可以在本文所述的蛋白的氨基末端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选促进蛋白从产生它的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌后而从所述蛋白的其余部分(通常称为成熟蛋白)上切割下来。信号肽/前导序列在蛋白的N-末端连接。

正如本文所用，“受试者”和“患者”可以互换地是指任何脊椎动物，包括，但不限于，哺乳动物(例如，牛，猪，骆驼，美洲驼，马，山羊，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，猫，狗，大鼠和小鼠，非人类灵长类动物(例如，猴子，如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩，等)和人类)。在一些实施方式中，受试者可以是人类或非人类。

正如本文所用，“基本上互补”可以是指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二个序列的互补序列具有至少60％，65％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的一致性，或是指该两个序列在严格杂交条件下杂交。

正如本文所用，“基本上相同”可以是指第一序列和第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35，40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸或氨基酸的区域内，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补，具有至少60％，65％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的一致性。

术语“亚型”或“血清型”在本文中可以互换使用，并且对于病毒而言，是指该病毒抗原的遗传变体，从而使得除了不同的亚型之外，免疫系统还可以识别一种亚型。

正如本文所用，“治疗”或“治疗处理”可以是指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病而保护受试者免受疾病侵害。预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者给予本发明的疫苗。抑制疾病包括在诱导疾病之后但在其临床出现之前向受试者给予本发明的疫苗。压制疾病涉及在疾病的临床出现后向受试者给予本发明的疫苗。

本文所使用的关于核酸的“变体”可以是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补物；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。

关于通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物学活性的肽或多肽的“变体”。变体也可以是指具有与保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参照蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性，带电区域的程度和分布)的不同氨基酸取代氨基酸，在本领域内被当成通常涉及微小变化。这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)而确定，正如现有技术Kyte et al.，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)中的理解。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸能够被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面中，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也能够用于揭示将导致蛋白质保留生物学功能的取代。考虑肽环境中氨基酸的亲水性容许计算出该肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的度量，据报道能够与抗原性和免疫原性很好地关联。美国专利No.4,554,101，通过引用完全结合于本文中。正如本领域所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代能够导致肽保留生物学活性，例如，免疫原性。取代可以用亲水性值彼此在±2之内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸取代应该理解为取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，这由疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其他属性揭示。

变体可以是在完整基因序列或其片段的全长内基本相同的核酸序列。该核酸序列可以在基因序列或其片段的全长内具有80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长内基本相同的氨基酸序列。该氨基酸序列可以在氨基酸序列或其片段的全长内具有80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性。

正如本文所用，“载体”可以是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

为了列举本文的数值范围，明确考虑了它们之间具有相同精确度的每个居间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外，数字7和8也可以考虑；而对于6.0-7.0的范围，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

描述

本发明部分基于编码一种或多种尼帕病毒(NiV)抗原的优化共有序列的开发。在一个实施方式中，由优化的共有序列编码的一种或多种NiV抗原能够在哺乳动物中引发免疫响应。在一个实施方式中，由优化的共有序列编码的NiV抗原能够包含一个或多个表位，使其特别有效地作为针对其能够诱导免疫响应的免疫原。

优化的共有序列能够是衍生自两个或更多个NiV抗原的共有序列。所述优化的共有序列可以包含共有序列和/或用于改进表达的修饰。修饰能够包括密码子优化、RNA优化、增强翻译起始的kozak序列的添加和/或提高免疫原性的免疫球蛋白前导序列的添加。由优化的共有序列编码的NiV抗原能够包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如，但不限于，免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施方式中，由优化的共有序列编码的抗原能够包含血凝素(HA)标记。由优化的共有序列编码的抗原能够设计成引起比相应的非优化抗原更强的细胞和/或体液免疫响应。

本文提供了一种NiV抗原，其能够用于在患有NiV感染或有NiV感染风险的受试者中诱导针对NiV的免疫。在一个实施方式中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含一种或多种能够在哺乳动物中产生针对NiV抗原的免疫响应的核酸分子。本发明还提供了能够在哺乳动物中产生针对NiV抗原的免疫响应的分离核酸分子。在一个实施方式中，该核酸分子包含编码共有NiV抗原的优化核苷酸序列。

优化的共有NiV抗原

在一个实施方式中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含一种或多种能够在哺乳动物中产生针对NiV抗原的免疫响应的核酸分子。本发明还提供了能够在哺乳动物中产生针对NiV抗原的免疫响应的分离核酸分子。在一个实施方式中，该核酸分子包含编码至少1、2、3或大于3种共有NiV抗原的优化核苷酸序列。在一个实施方式中，一种或多种共有抗原是共有NiV融合或糖蛋白抗原。

NiV抗原的共有氨基酸序列包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8及其变体和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的片段及其变体。合成的共有NiV-F的示例性氨基酸序列作为SEQ ID NO：2提供。合成的共有NiV-G抗原的示例性氨基酸序列作为SEQ ID NO：6提供。

在一个实施方式中，本发明提供了包含核酸分子的组合物，该核酸分子包含编码合成的共有NiV抗原的核苷酸序列。在一个实施方式中，作为SEQ ID NO：1提供了编码合成的共有NiV-F抗原的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2。在一个实施方式中，作为SEQ ID NO：5提供了编码合成的共有NiV-G抗原的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：6。

包含编码多个共有NiV抗原的一个或多个核苷酸序列的组合物可以处于单个质粒上。在一个实施方式中，组合物包含在单个启动子之下编码共有NiV-F和NiV-G抗原的单个质粒。在这样的实施方式中，编码NiV-F抗原的序列和编码NiV-G抗原的序列可以被融合肽序列，例如，弗林蛋白酶(furin)切割序列连接。

在一个实施方式中，优化的共有编码的NiV抗原可操作地连接至一种或多种调节元件。在一个实施方式中，调节元件是前导序列。在一个实施方式中，前导序列是IgE前导序列。在一个实施方式中，IgE前导序列具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。因此，在一个实施方式中，本发明涉及可操作地连接至SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及核苷酸序列，其编码可操作地连接至如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。可操作地连接至IgE前导序列的合成共有NiV-F抗原的示例氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。可操作地连接至IgE前导序列的合成共有NiV-G抗原的示例性氨基酸序列如SEQID NO：8所示。在一个实施方式中，本发明提供了包含核酸分子的组合物，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8的核苷酸序列，或其变体或片段。在一个实施方式中，该核酸分子包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，或其变体或片段。

在一个实施方式中，调控元件是起始密码子。因此，在一个实施方式中，本发明涉及SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或其片段或变体，其可操作地连接至在5'端包含起始密码子的核苷酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列，或其片段或变体，其可操作地连接至在N端由起始密码子编码的氨基酸(例如，蛋氨酸)。

在一个实施方式中，调控元件是至少一个终止密码子。因此，在一个实施方式中，本发明涉及SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或其片段或变体，其可操作地连接至在3'端包含至少一个终止密码子的核苷酸序列。在一个实施方式中，该核苷酸序列可操作地连接于两个终止密码子以增加翻译终止的效率。

在一个实施方式中，该核酸分子能够编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的肽。在一个实施方式中，该核酸该分子包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，该序列能够是在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的全长内具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性的核苷酸序列。在其他实施方式中，序列能够是编码在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的整个长度内具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些实施方式中，该核酸分子包含RNA序列，该RNA序列是来自在SEQ ID ID：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的全长内具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％一致性的DNA序列的转录物。在一些实施方式中，该核酸分子包含编码在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的全长内具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％一致性的氨基酸序列的RNA序列。

该共有-NiV抗原能够是具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，该抗原能够具有在SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的全长内具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％一致性的氨基酸序列。

能够提供SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的免疫原性片段。免疫原性片段能够包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8全长的至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。在一些实施方式中，免疫原性片段包括前导序列，如例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方式中，免疫原性片段没有前导序列。

能够提供具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段能够包含与SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8具有95％同源性的至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％的蛋白质。一些实施方式涉及与本文的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方式涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方式中，免疫原性片段包括前导序列如，例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方式中，免疫原性片段没有前导序列。

一些实施方式涉及包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的全长的至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的免疫原性片段。免疫原性片段能够与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7的片段具有至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方式中，免疫原性片段包括编码前导序列的序列如，例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方式中，片段不含编码前导序列的编码序列。

在一个实施方式中，该核酸分子包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7具有至少90％同源性的序列。

在一个实施方式中，该核酸分子包含编码本文所述的共有NiV抗原序列的RNA序列。例如，核酸可以包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中一个或多个的RNA序列，其变体，其片段，或其任何组合。

核酸构建体

当被细胞摄取时，DNA质粒能够作为单独的遗传物质保留于细胞中。可替代地，可以将RNA给予细胞。还设想的是，提供一种遗传构建体，作为线性微型染色体，其包括着丝粒(centromere)、端粒(telomere)和复制起点。遗传构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。该元件包括：启动子，起始密码子，终止密码子和聚腺苷酸化信号。另外，编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。这些元件必须可操作地连接到编码所需蛋白质的序列上，并且调节元件必须可操作地处于其所给予的个体中。因此，此类遗传构建体可以是重组核酸分子。

重组核酸分子能够包括一种或多种重组核苷酸序列构建体。重组核苷酸序列构建体能够包含一种或多种组分，这将在下面更详细地描述。

该重组核苷酸序列构建体能够包括编码病毒抗原的异源核苷酸序列，其片段，其变体，或其组合。该重组核苷酸序列构建体还能够包括编码蛋白酶或肽酶切割位点的异源核苷酸序列。该重组核苷酸序列构建体还能够包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的异源核苷酸序列。IRES可以是病毒IRES或真核IRES。该重组核苷酸序列能够包括一个或多个前导序列，其中每个前导序列编码信号肽。该重组核苷酸序列能够包括一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终结或终止密码子和/或一个或多个聚腺苷酸化信号。该重组核苷酸序列构建体还能够包括一个或多个连接子或标记序列。该标记序列能够编码血凝素(HA)标记。

a)蛋白酶切割位点

该重组核苷酸序列构建体能够包括编码蛋白酶切割位点的异源核苷酸序列。该蛋白酶切割位点能够被蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内切蛋白酶，例如，但不限于，弗林蛋白酶(furin)，弹性蛋白酶，HtrA，钙蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和胃蛋白酶。该蛋白酶能够是弗林蛋白酶。在其他实施方式中，该蛋白酶能够是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或任何裂解内部肽键(即，不裂解N-端或C-端肽键)的蛋白酶。

该蛋白酶切割位点能够包括一个或多个促进或提高切割效率的氨基酸序列。所述一个或多个氨基酸序列能够促进或提高形成或产生离散多肽的效率。所述一个或多个氨基酸序列能够包括弗林蛋白酶切割位点。

b)连接子序列

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个连接子序列。该连接子序列能够在空间上分隔或连接本文所述的一种或多种组分。在其他实施方式中，该连接子序列能够编码在空间上分隔或连接两个或更多个多肽的氨基酸序列。

c)启动子

该重组核苷酸序列构建体能够包含一个或多个启动子。所述一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达并调节基因表达的任何启动子。这样的启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件。用于指导基因表达的启动子的选择取决于具体应用。启动子在重组核苷酸序列构建体中可以位于距离转录起始与在其天然环境中距离转录起始位点距离相同的位置处。然而，该距离的变化可以适应而不会丢失启动子功能。

该启动子可以可操作地连接至编码一种或多种病毒抗原的异源核苷酸序列。该启动子可以是在真核细胞中表现出有效表达的启动子。可操作地连接至编码序列的启动子可以是CMV启动子、来自猿病毒40(SV40)的启动子如SV40早期启动子和SV40晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦巴尔(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)启动子。该启动子也可以是来自人类基因，例如，人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸、人类多角体蛋白或人类金属硫蛋白的启动子。

该启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，其仅当宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激下才启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子也能够对特定的组织或器官或发育阶段具有特异性。该启动子也可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开号No.US 20040175727中，其内容合以其整体结合于本文中。

该启动子可以与增强子结合。该增强子可以位于编码序列的上游。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸蛋白或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV中的增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和WO 94/016737中，其各自的内容通过引用以其整体结合于本文中。

d)转录终止区

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个转录终止区。所述转录终止区可以位于编码序列的下游，以提供有效的终止。所述转录终止区能够从与上述启动子相同的基因获得，或能够从一种或多种不同的基因获得。

e)起始密码子

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个起始密码子。所述起始密码子可以位于编码序列的上游。所述起始密码子可以位于具有编码序列的读框内。所述起始密码子能够与有效翻译起始所需的一个或多个信号，例如，但不限于，核糖体结合位点，进行结合。

f)终止密码子

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个终结或终止密码子。所述终止密码子可以位于编码序列的下游。所述终止密码子可以位于具有编码序列的读框中。所述终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号结合。通常认为起始密码子和终止密码子是编码所需蛋白的核苷酸序列的部分。然而，这些元件在给予核酸构建体的哺乳动物中必须是功能性的。起始密码子和终止密码子必须位于具有编码序列的读框内。

g)聚腺苷酸化信号

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个聚腺苷酸化信号。所述聚腺苷酸化信号能够包括转录物有效聚腺苷酸化所需的一个或多个信号。所述聚腺苷酸化信号可以位于编码序列的下游。所述聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。所述SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego，CA)的聚腺苷酸化信号。所用的启动子和聚腺苷酸化信号在所述个体的细胞内必须是功能性的。

h)前导序列

该重组核苷酸序列构建体能够包括一个或多个前导序列。所述前导序列可以编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(Ig)信号肽，例如，但不限于，IgG信号肽和IgE信号肽。

除了DNA表达所需的调控元件外，正如上所述，该重组核酸分子中还可以包括其他元件。这种附加元件包括增强子。所述增强子可以选自由包括，但不限于，以下增强子的组中：人肌动蛋白，人肌球蛋白，人血红蛋白，人肌肉肌酸蛋白和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV的那些。

对遗传构建体能够提供哺乳动物的复制起点，以便在染色体外维持该构建体并在细胞中产生该构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(San Diego，CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4包含爱泼斯坦巴尔病毒的复制起点和产生高拷贝游离型(episomal)复制而无需整合的核抗原EBNA-1编码区。

为了最大化蛋白生产，可以选择非常适合在给予构建体的细胞中进行基因表达的调节序列。而且，可以选择在宿主细胞中最有效转录的编码所述蛋白质的密码子。本领域普通技术人员能够生产在细胞中具有功能性的DNA构建体。

在一些实施方式中，可以提供核酸构建体，其中本文所述蛋白的编码序列与IgE前导肽进行连接，或去除了这种IgE前导序列。在一些实施方式中，本文所述的蛋白与IgE信号肽进行连接，或除去了这种IgE前导序列。

在使用蛋白的一些实施方式中，例如，本领域普通技术人员能够使用众所周知的技术进行生产并使用众所周知的技术分离本发明的蛋白。在使用蛋白的一些实施方式中，例如，本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术将编码本发明的蛋白的DNA分子插入适用于众所周知的表达系统的可商购获得的表达载体中。例如，所述可商购获得的质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。所述可商购获得的质粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)可以，例如，用于在酿酒酵母菌株中生产。例如，所述可商购获得的MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)可以用于在昆虫细胞中生产。所述商购获得的质粒pcDNA或pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，CA)可以，例如，用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产。本领域普通技术人员能够使用这些商业表达载体和系统等通过常规技术和容易获得的起始原料进行蛋白生产。(参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning a Laboratory Manual,Second Ed.Cold Spring Harbor Press(1989))。因此，在原核和真核系统中能够制备所需的蛋白质，从而产生一系列加工形式的蛋白。

载体

上述重组核苷酸序列构建体能够置于一种或多种载体中。所述一种或多种载体能够包含复制起点。所述一种或多种载体能够是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述一种或多种载体能够是自我复制的额外染色体载体，或整合至宿主基因组中的载体。

所述一种或多种载体可以是异源表达构建体，其通常是用于将特异性基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体进入细胞中，由重组核苷酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽就通过细胞转录和翻译机制核糖体复合物进行生产。所述一种或多种载体能够表达大量稳定的信使RNA，并因此表达蛋白。

i)表达载体

所述一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的受试者细胞中的表达。包含所述重组核苷酸序列构建体的所述一种或多种载体可以是嵌合的，这意味着其至少一个组件相对于其至少一个其他组件是异源的。

j)质粒

所述一种或多种载体能够是质粒。该质粒可以用于采用重组核苷酸序列构建体转染细胞。该质粒可以用于将所述重组核苷酸序列构建体引入受试者中。该质粒还可以包含调控序列，其可以非常适合于其中给予该质粒的细胞中进行基因表达。

该质粒还可以包含哺乳动物的复制起点，以便在染色体外维持该质粒并在细胞中产生该质粒的多个拷贝。该质粒可以是来自Invitrogen(圣地亚哥，CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可以包含爱泼斯坦巴尔病毒的复制起点和可以产生高拷贝的游离型复制而无需整合的核抗原EBNA-1编码区。该质粒的主链可以是pAV0242。该质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。

该质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白质。该质粒也可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)，其可以用于在酿酒酵母酵母菌株中生产蛋白。该质粒也可以是MAXBAC^TM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，其可以用于昆虫细胞中进行蛋白生产。该质粒也可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，其可以用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。

k)RNA

在一个实施方式中，核酸是RNA分子。在一个实施方式中，该RNA分子从本文描述的DNA序列转录。例如，在一些实施方式中，该RNA分子由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7具有至少90％同源性的DNA序列进行编码。在另一个实施方式中，该核苷酸序列包含由编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽序列的DNA序列转录的RNA序列，或其变体，或其片段。因此，在一个实施方式中，本发明提供了编码一种或多种共有NiV抗原的RNA分子。该RNA可以是正链的。因此，在一些实施方式中，该RNA分子能够由细胞进行翻译，而不需要任何中间复制步骤，如反转录。可用于本发明的RNA分子可以具有5'帽(例如，7-甲基鸟苷)。该帽能够增强RNA的体内翻译。可用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，这可以通过5'至5'桥与7-甲基鸟苷进行连接。RNA分子可以具有3'聚-A尾巴。它还可以在其3'末端附近包括聚-A聚合酶识别序列(例如，AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。可用于本发明的RNA分子可以包含合成RNA。在一些实施方式中，RNA分子是裸RNA分子。在一个实施方式中，该RNA分子包含于载体内。

在一个实施方式中，该RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，所述5'UTR的长度为0-3000个核苷酸。5'和3'UTR序列添加至编码区内的长度能够通过不同的方法进行改变，包括，但不限于，设计退火至UTR不同区域的PCR引物。使用这种方法，本领域的普通技术人员能够在转录的RNA转染后修改达到最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。

所述5'和3'UTR能够是所关注的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可替代地，通过将UTR序列引入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰，能够添加所关注的基因的非内源的UTR序列。使用所关注的基因的非内源性UTR序列能够用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件能够降低RNA的稳定性。因此，基于本领域众所周知的UTR的特性，能够选择或设计出3'UTR，以提高所转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，所述5'UTR能够包含内源基因的Kozak序列。可替代地，当如上所述通过PCR添加对于所关注的基因不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列能够提高某些RNA转录物的翻译效率，但对于所有RNA而言似乎并不要求都能有效翻译。许多RNA对Kozak序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施方式中，5'UTR能够衍生自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物能够用于3'或5'UTR以阻止RNA的核酸外切酶降解。

在一个实施方式中，该RNA在5'端具有帽和3'聚(A)尾，其确定核糖体结合、翻译的起始和RNA在细胞中的稳定性。

在一个实施方式中，该RNA是核苷修饰的RNA。核苷修饰的RNA与未修饰的RNA相比具有特殊的优势，包括，例如，稳定性更高，固有免疫原性低或不存在，以及翻译增强。

1)环状和线性载体

该一种或多种载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中而转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。该载体能够是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核苷酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送至受试者并表达由重组核苷酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是没有任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可能不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可能不包含与所需基因表达无关的其他核苷酸序列。

该LEC可以源自能够线性化的任何质粒。该质粒可以能够表达由重组核苷酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。该质粒能够是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。该质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核苷酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。

LEC能够是pcrM2。该LEC能够是pcrNP。pcrNP和pcrMR能够分别来自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

m)病毒载体

在一个实施方式中，本文提供了能够将本发明的核酸递送至细胞的病毒载体。该表达载体可以是以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于，例如，Sambrook et al.，(2001)和Ausubel et al.，(1997)以及其他病毒学和分子生物学手册。适用作载体的病毒包括，但不限于，逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒。通常而言，合适的载体包含在至少一种生物中具有功能性的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。(参见，例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利No.6,326,193)。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物，例如，人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体能够衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利No.5,350,674和5,585,362。

n)制备载体的方法

本文提供了一种用于制备其中已置入重组核苷酸序列构建体的一种或多种载体的方法。在最后的亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法将载体用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

在其他实施方式中，在最后的亚克隆步骤之后，可以将载体与一个或多个电穿孔(EP)设备一起使用。以下更详细地描述这种EP设备。

使用已知设备和技术的组合，能够配制或生产所述一种或多种载体，但优选的是，使用2007年5月23日提交的许可的共同未决美国临时申请美国序列号No.60/939,792中描述的质粒生产技术进行制备。在一些实施例中，本文所述的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度进行配制。除了在美国序列号No.60/939792中描述的那些，包括在2007年7月3日公开的许可专利美国专利No.7,238,522中描述的那些，制造方法还包括或结合本领域技术人员通常已知的各种设备和方案。上述申请和专利，美国序列号No.60/939,792和美国专利号No.7,238,522分别以其整体结合于本文中。

疫苗和免疫原性组合物

本文提供了包括优化的共有序列、优化的共有编码的抗原、其片段、其变体或其组合的免疫原性组合物，如疫苗。该免疫原性组合物能够显著诱导给予该免疫原性组合物的受试者针对NiV抗原的免疫响应。疫苗可以包含多个核酸分子或其组合。可以提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫响应。

该免疫原性组合物可以是DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或组合疫苗。该疫苗能够包含编码抗原的优化共有核苷酸序列。该核苷酸序列能够是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。该核苷酸序列还能够包括编码通过肽键与抗原连接的连接子、前导序列或标记序列的其他序列。该肽疫苗能够包括抗原、其变体、其片段或其组合。该组合DNA和肽疫苗能够包括上述优化的共有核苷酸序列和编码的抗原。

该疫苗能够是DNA疫苗。DNA疫苗公开于美国专利No.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594中，这些专利以其全部内容通过引用结合于本文中。DNA疫苗能够还包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。

该疫苗能够是一种或多种NiV抗原的RNA。该RNA疫苗能够引入该细胞中。

该疫苗能够是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚基(subunit)疫苗和糖蛋白疫苗，例如，但不限于，美国专利No.：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529中公开的疫苗，这些专利各自通过引用结合于本文中。

本发明的疫苗能够具有有效疫苗所需的特征，如是安全的，以使该疫苗本身不会引起疾病或死亡；预防疾病；诱导保护性T细胞反应；和提供易于给予，几乎没有副作用，生物学稳定性和每剂量低成本。

本文提供了能够在哺乳动物中产生针对NiV的免疫响应的免疫原性组合物。该免疫原性组合物可以包含如上所述的每种质粒。该免疫原性组合物可以包含多种质粒，或其组合。可以提供该免疫原性组合物以诱导治疗性或预防性免疫响应。

免疫原性组合物可以用于递送编码一种或多种共有NiV抗原的核酸分子。该免疫原性组合物优选是包含质粒的组合物。

本发明的另一方面提供了能够在哺乳动物中产生针对一种或多种NiV病毒的免疫响应的免疫原性组合物。该免疫原性组合物由一种或多种能够在哺乳动物中表达共有病毒抗原的核酸分子组成。

在一个实施方式中，该免疫原性组合物包含编码至少一种共有NiV抗原的核苷酸序列。所述共有病毒抗原可以是共有融合物、共有糖蛋白或一种或多种前述抗原的组合。

每种抗原都可以与病毒感染关联。在一个实施方式中，每种抗原能够与NiV病毒感染相关联。

该抗原能够是核酸序列、氨基酸序列、多糖或其组合。该核酸序列能够是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。该氨基酸序列能够是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。该多糖能够是核酸编码的多糖。

在一些实施方式中，该免疫原性组合物包含多个独特的核酸分子，其中所述多个独特的核酸分子的每一个编码共有融合蛋白或共有糖蛋白蛋白。

本发明的免疫原性组合物中能够包括的示例性核酸分子可以选自：

在一个实施方式中，该核酸分子包含优化的核酸序列。优化的序列能够包含共有序列和/或用于改进表达的修饰。修饰能够包括密码子优化、RNA优化、用于增强翻译起始的kozak序列的添加，和/或用于提高免疫原性的免疫球蛋白前导序列的添加。由优化序列编码的NiV抗原能够包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如，但不限于，免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施方式中，由优化的共有序列编码的抗原能够包含血凝素(HA)标记。由优化的序列编码的NiV抗原能够设计成引起比相应天然抗原更强的细胞和/或体液免疫响应。

所述免疫原性组合物能够在给予所述组合物的受试者中诱导免疫响应。诱导的免疫响应可以对至少一种NiV抗原具有特异性。所诱导的免疫响应能够与至少一种与给予的优化的共有编码抗原相关的NiV抗原具有反应活性。在各个实施方式中，相关抗原包括具有与优化的共有编码抗原的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同源性的氨基酸序列的抗原。在各种实施方式中，相关抗原包括由与本文公开的优化的共有核苷酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同源性的核苷酸序列编码的抗原。

该免疫原性组合物能够在给予所述免疫原性组合物的受试者中诱导体液免疫响应。所诱导的体液免疫响应可以对至少一种NiV抗原具有特异性。所诱导的体液免疫响应能够与至少一种与给予的优化的共有编码抗原相关的NiV抗原具有反应活性。在给予免疫原性组合物的受试者中能够诱导约1.5倍-约16倍，约2倍-约12倍，或约3倍-约10倍的体液免疫响应。在给予免疫原性组合物的受试者中与未给予本发明的免疫原性组合物的受试者相比诱导了至少约1.5倍，至少约2.0倍，至少约2.5倍，至少约3.0倍，至少约3.5倍，至少约4.0倍，至少约4.5倍，至少约5.0倍，至少约5.5倍，至少约6.0倍，至少约6.5倍，至少约7.0倍，至少约7.5倍，至少约8.0倍，至少约8.5倍，至少约9.0倍，至少约9.5倍，至少约10.0倍，至少约10.5倍，至少约11.0倍，至少约11.5倍，至少约12.0倍，至少约12.5倍，至少约13.0倍，至少约13.5倍，至少约14.0倍，至少约14.5倍，至少约15.0倍，至少约15.5倍或至少约16.0倍的体液免疫响应。

与未给予免疫原性组合物的受试者相比，由免疫原性组合物诱导的体液免疫响应能够包括与给予免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体水平的增加。这些IgG抗体能够对至少一种与给予的优化的共有编码的抗原遗传上相关的NiV抗原具有特异性。这些IgG抗体能够与至少一种与给予的优化的共有编码的抗原遗传上相关的NiV抗原具有反应活性。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，给予该免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体的水平能够提高约1.5倍-约16倍，约2倍-约l2倍，或约3倍-约10倍。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予该免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体的水平能够提高至少约1.5倍，至少约2.0倍，至少约2.5倍，至少约3.0倍，至少约3.5倍，至少约4.0倍，至少约4.5倍，至少约5.0倍，至少约5.5倍，至少约6.0倍，至少约6.5倍，至少约7.0倍，至少约7.5倍，至少约8.0倍，至少约8.5倍，至少约9.0倍，至少约9.5倍，至少约10.0倍，至少约10.5倍，至少约11.0倍，至少约11.5倍，至少约12.0倍，至少约12.5倍，至少约13.0倍，至少约13.5倍，至少约14.0倍，至少约14.5倍，至少约15.0倍，至少约15.5倍，或至少约16.0倍。

该免疫原性组合物能够在给予免疫原性组合物的受试者中诱导细胞免疫响应。所诱导的细胞免疫响应能够对至少一种与给予的优化共有编码抗原遗传上相关的NiV抗原具有特异性。所诱导的细胞免疫响应能够与给予的优化共有编码的抗原遗传上相关的至少一种NiV抗原具有反应活性。所诱导的细胞免疫响应能够包括引发CD8+T细胞响应。所引发的CD8+T细胞响应能够与至少一种与给予的优化共有编码的抗原遗传上相关的NiV抗原具有反应活性。所引发的CD8+T细胞响应能够是多功能性的。所诱导的细胞免疫响应能够包括引发CD8+T细胞响应，其中所述CD8+T细胞会产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。

与未给予该免疫原性组合物的受试者相比，所诱导的细胞免疫响应能够包括与给予免疫原性组合物的受试者相关的增加的CD8+T细胞响应。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予该免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞响应能够增加约2倍-约30倍，约3倍-约25倍，或约4倍-约20倍。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞响应能够增加至少约1.5倍，至少约2.0倍，至少约3.0倍，至少约4.0倍，至少约5.0倍。至少约6.0倍，至少约6.5倍，至少约7.0倍，至少约7.5倍，至少约8.0倍，至少约8.5倍，至少约9.0倍，至少约9.5倍，至少约10倍，至少约10.5倍，至少约11.0倍，至少约11.5倍，至少约12.0倍，至少约12.5倍，至少约13.0倍，至少约13.5倍，至少约14.0倍，至少约14.5倍，至少约15.0倍，至少约16.0倍，至少约17.0倍，至少约18.0倍，至少约19.0倍，至少约20.0倍，至少约21.0倍，至少约22.0倍，至少约23.0倍，至少约24.0倍，至少约25.0倍，至少约26.0倍，至少约27.0倍，至少约28.0倍，至少约29.0倍或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫响应能够包括对天然抗原具有反应活性的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8T细胞的频率增加。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的频率能够增加至少约2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫响应能够包括对天然抗原具有反应活性的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的频率增加。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD107a/IFNγ双阳性CD8 T细胞的频率能够增加至少约2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍或14倍。

由免疫原性组合物诱导的细胞免疫响应能够包括引发CD4+T细胞响应。所引发的CD4+T细胞响应可以与优化的共有抗原遗传上相关的天然抗原具有反应活性。所引发的CD4+T细胞响应可以是多功能性的。所诱导的细胞免疫响应能够包括引发CD4+T细胞响应，其中CD4+T细胞会产生IFN-γ，TNF-α，IL-2，或IFN-γ和TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫响应能够包括产生IFN-γ的CD4+T细胞的频率增加。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD4+IFN-γ+T细胞的频率能够增加至少约2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫响应能够包括产生TNF-α的CD4+T细胞的频率增加。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD4+TNF-α+T细胞的频率能够增加至少约2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍，20倍或22倍。

所诱导的细胞免疫响应能够包括产生IFN-γ和TNF-α的CD4+T细胞的频率增加。与未给予免疫原性组合物的受试者相比，与给予免疫原性组合物的受试者相关的CD4+IFN-γ+TNF-α+的频率能够增加至少约2倍，2.5倍，3.0倍，3.5倍，4.0倍，4.5倍，5.0倍，5.5倍，6.0倍，6.5倍，7.0倍，7.5倍，8.0倍，8.5倍，9.0倍，9.5倍，10倍，10倍，10.5倍，11.0倍，11.5倍，12.0倍，12.5倍，13.0倍，13.5倍，14.0倍，14.5倍，15.0倍，15.5倍，16.0倍，16.5倍，17.0倍，17.5倍，18.0倍，18.5倍，19.0倍，19.5倍，20.0倍，21倍，22倍，23倍，24倍，25倍，26倍，27倍，28倍，29倍，30倍，3l倍，32倍，33倍，34倍或35倍。

组合物的其他组分

在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包括药用赋形剂。药用赋形剂能够包括已知的且公众易于获得的这类功能性分子，如运载体(vehicle)、佐剂、载体或稀释剂。优选所述药用赋形剂是佐剂或转染促进剂。在一些实施方式中，核酸分子或DNA质粒与多核苷酸功能增强子或遗传疫苗促进剂(或转染促进剂)的给予一起递送至细胞。多核苷酸功能增强子描述于1994年1月26日提交的美国序列号5,593,972、5,962,428和国际申请序列号PCT/US94/00899中，其各自通过引用结合于本文中。遗传疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国序列号021,579中，其通过引用结合于本文中。转染促进剂能够与核酸分子一起作为与核酸分子的混合物进行给予，或在给予核酸分子的同时、之前或之后单独给予。转染促进剂的实例包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)，弗氏(Freunds)不完全佐剂，包括单磷酰基脂质A的LPS类似物，鼠李肽，醌类似物和囊泡(vesicle)，如角鲨烷和角鲨烯，也可以使用透明质酸与基因构建体一起给予。在一些实施方式中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见，例如，WO9324640)，钙离子，病毒蛋白，聚阴离子，聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。优选该转染促进剂是聚阴离子，聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。

在本发明的一些实施方式中，该免疫原性组合物能够还包括佐剂。在一些实施方式中，该佐剂选自由以下这些组成的组中：α-干扰素，γ-干扰素，血小板衍生生长因子(PDGF)，TNFα，TNRβ，GM-CSF，表皮生长因子(EGF)，皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)，上皮胸腺表达趋化因子(TECK)，粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)，IL-12，IL-15，MHC，CD80，CD86(包括IL-15，其信号序列已删除且可选包含来自IgE的信号肽)。其他可能是有用佐剂的基因包括编码以下的那些：MCP-1，MIP-1-α，MIP-1p，IL-8，RANTES，1-选择素，P-选择素，E-选择素，CD34，GlyCAM-1，MadCAM-1，LFA-1，VLA-1，Mac-1，pl50.95，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3，CD2，LFA-3，M-CSF，G-CSF，IL-4，IL-18突变形式，CD40，CD40L，血管生长因子，成纤维细胞生长因子，IL-7，神经生长因子，血管内皮生长因子，Fas，TNF受体，Flt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2，DR6，Caspase ICE，Fos，c-jun，Sp-1，Ap-1，Ap-2，p38，p65Rel，MyD88，IRAK，TRAF6，IkB，非活性NIK，SAP K，SAP-1，JNK，干扰素响应基因，NFkB，Bax，TRAIL，TRAILrec，TRAILrecDRC5，TRAIL-R3，TRAIL-R4，RANK，RANK LIGAND，Ox40，Ox40LIGAND，NKG2D，MICA，MICB，NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2E，NKG2F，TAP1，TAP2及其功能性片段。在一些优选的实施方式中，该佐剂选自IL-12、IL-15、CTACK、TECK或MEC。

根据要使用的给予方式配制根据本发明的免疫原性组合物。在DNA质粒疫苗是可注射组合物的情况下，它们是无菌的和/或无热原的和/或无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常而言，等渗性用添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在某些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方式中，将血管收缩剂添加到该制剂中。在一些实施方式中，允许制剂在室温或环境温度下长时间稳定的稳定剂，如LGS或其他聚阳离子或聚阴离子，可以添加到该制剂中。

该组合物可以还包含药用赋形剂。药用赋形剂能够是功能性分子，例如运载体、载体或稀释剂。药用赋形剂能够是转染促进剂，其能够包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、鼠李肽、醌类似物、囊泡如角鲨烷和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其他已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子，聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以以小于6mg/mL的浓度存在于该组合物中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)，弗氏不完全佐剂，包括单磷酰脂质A的LPS类似物，鼠李肽，醌类似物和囊泡，如角鲨烷和角鲨烯，而透明质酸也可以用于与该组合物一起给予。该组合物还可以包含转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见，例如，WO 9324640)，钙离子，病毒蛋白，聚阴离子，聚阳离子，或纳米颗粒或其他已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子，聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/mL，小于2mg/mL，小于1mg/mL，小于0.750mg/mL，小于0.500mg/mL，小于0.250mg/mL，小于0.100mg/mL，小于0.050mg/mL或小于0.010mg/mL。

该组合物可以还包含遗传促进剂，正如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述，该文献通过引用完整结合于本文中。

该组合物可以包含约1ng-100mg；或约1μg-约10mg；或优选约0.1μg-约10mg；或更优选约1mg-约2mg的量的核酸。在一些优选的实施方式中，根据本发明的组合物包含约5ng-约1000μg的核酸。在一些优选的实施方式中，该组合物可以包含约10ng-约800μg的核酸。在一些优选的实施方式中，该组合物可以包含约0.1-约500μg的核酸。在一些优选的实施方式中，该组合物可以包含约1-约350μg的核酸。在一些优选的实施方式中，该组合物可以包含约25-约250μg，约100-约200μg，约1ng-100mg；约1μg-约10mg；约0.1μg-约10mg；约1mg-约2mg，约5ng-约1000μg，约10ng-约800μg，约0.1-约500μg，约1-约350μg，约25-约250μg，约100-约200μg的核酸。

该组合物能够根据要使用的给予方式进行配制。注射用药物组合物能够是无菌的、无热原的和无颗粒的。能够使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。该组合物能够包含血管收缩剂。等渗溶液能够包括磷酸盐缓冲盐水。该组合物能够还包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以使制剂在室温或环境温度下长时间稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

组合物的递送方法

本发明的另一方面提供了在哺乳动物中引发针对一种或多种NiV病毒的免疫响应的方法，包括将免疫原性组合物递送至哺乳动物的组织，该免疫原性组合物包含至少一种能够在哺乳动物细胞中表达所述一种或多种NiV病毒的共有抗原而引起哺乳动物免疫响应的核酸分子。

本发明还涉及将组合物递送至需要其的受试者中的方法。该递送方法能够包括将该组合物给予受试者。给予能够包括，但不限于，使用体内电穿孔和不使用体内电穿孔的DNA注射，脂质体介导递送，和纳米颗粒促进的递送。

接受递送组合物的哺乳动物可以是人、灵长类、非人灵长类、奶牛、肉牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛类、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和小鸡。

该组合物可以通过不同途径给予，包括口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经口腔给予、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，根据常规兽医实践，该组合物可以作为适当可接受的制剂进行给予。兽医们能够轻松确定最适合具体动物的给药方案和给予途径。该组合物可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其他物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体力学方法”或超声进行给予。

电穿孔

使用电穿孔设备可以完成通过电穿孔的组合物给予，所述电穿孔设备能够设置成递送至哺乳动物的所需组织，能量脉冲有效地引起细胞膜中形成可逆孔道，并且优选该能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔设备可以包括电穿孔组件和电极组件或手柄组件。电穿孔组件可以包括并引入电穿孔设备的各元件中的一个或多个，包括：控制器，电流波形发生器，阻抗测试仪，波形记录器，输入元件，状态报告元件，通信端口，存储组件，电源和电源开关。使用体内电穿孔设备，例如CELLECTRA EP系统(InovioPharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)或Elgen电穿孔器(Inovio Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)可以完成该电穿孔操作，从而促进质粒对细胞的转染。

电穿孔组件可以充当电穿孔设备的一个元件，而其他元件是与电穿孔组件通信的单独元件(或多个组件)。电穿孔组件可以充当电穿孔设备的不止一个元件，其可以与电穿孔设备中与电穿孔组件分开的其他元件通信。作为一种机电或机械设备的一部分而存在的电穿孔设备的元件可以不受限制，因为这些元件可以充当一个设备或充当彼此通信的独立元件。电穿孔组件可以能够传递能量脉冲，该能量脉冲在所需的组织中产生恒定电流，并且包括反馈机构。电极组件可以包括在空间排布中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件接收来自电穿孔组件的能量脉冲，并通过电极将其传送至所需的组织。所述多个电极中至少一个在能量脉冲的传递期间是中性的，并且测量所需的组织中的阻抗，并将阻抗通信至电穿孔组件。反馈机构可以接收所测量的阻抗，并能够调节由电穿孔组件传递的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散模式传送能量脉冲。所述多个电极可以在编程的序列之下通过控制电极以分散的模式传递能量脉冲，并且用户将所编程的序列输入到电穿孔组件中。所述编程的序列可以包括按序传送的多个脉冲，其中所述多个脉冲中的每个脉冲由至少两个有源电极与一个测量阻抗的中性电极传送，并且其中所述多个脉冲中的后续脉冲由至少两个有源电极中不同的一个电极与测量阻抗的中性电极进行递送。

反馈机制可以通过硬件或软件执行。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。反馈每50μs，20μs，10μs或1μs发生，但优选实时反馈或瞬时反馈(即，由用于确定响应时间的可用技术确定，基本上是瞬时的)。所述中性电极可以测量所需的组织中的阻抗并将阻抗通信至反馈机构，而反馈机构响应于该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持于类似于预设电流的值。反馈机构可以在能量脉冲的传递期间连续且瞬时地保持恒定电流。

可以促进本发明组合物递送的电穿孔设备和电穿孔方法的实例包括描述于德拉吉亚-阿克利(Draghia-Akli)等人的美国专利No.7,245,963、由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中描述的那些，其内容通过引用以其整体结合于本文中。可用于促进组合物递送的其他电穿孔设备和电穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中的那些，该申请要求享有2006年10月17日提交的美国专利申请序列号Nos.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982的35USC119(e)之下的权益，所有这些均以其整体结合于本文中。

Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963描述了模块化电极系统及其在促进将生物分子引入体内或植物中所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针状电极；皮下针头；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针状电极的导电连接；和电源。操作员能够握住安装于支撑结构上的多个针状电极，并将其牢固地插入身体或植物中所选定的组织中。然后通过皮下针头将生物分子输送到所选定的组织中。可编程恒流脉冲控制器被激活，并且恒流电脉冲被施加到多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲有助于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的全部内容通过引用结合于本文中。

Smith等人的美国专利公开2005/0052630描述了一种可以用于有效促进将生物分子引入身体或植物中所选定组织的细胞中的电穿孔设备。电穿孔设备包括电动器件(“EKD器件”)，其操作由软件或固件指定。EKD器件根据用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲模式，并允许存储和采集电流波形数据。该电穿孔设备还包括具有针状电极阵列的可更换电极盘，用于注射针的中央注射通道，以及可拆卸导向盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用结合于本文中。

美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可以适于不仅深入渗透到诸如肌肉的组织中，而且适于深入渗透到其他组织或器官中。由于电极阵列的这种构造，注射针头(用于输送所选择的生物分子)也被完全插入靶器官中，并且在电极预先划定的区域内垂直于靶组织给予注射。美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选长20mm，规格为21。

另外，在结合电穿孔设备及其用途的一些实施方式中设想了以下专利中描述的那些的电穿孔设备：1993年12月28日授权的美国专利5,273,525、2000年8月29日授权的美国专利6,110,161、2001年7月17日授权的6,261,281和2005年10月25日授权的美国专利6,958,060以及2005年9月6日授权的美国专利6,939,862。此外，本文中考虑了涵盖该主题的专利：2004年2月24日授权的美国专利6,697,669，其涉及使用各种设备中的任何一种递送DNA，以及2008年2月5日授权的美国专利7,328,064，其涉及注射DNA的方法。上述专利通过引用以其整体结合于本文中。

在一个实施方式中，与本文所述的肌肉或皮肤EP设备一起使用的核酸制剂具有高的核酸浓度，优选在小体积中包括微克至几十毫克用量的浓度，并且优选毫克用量的的核酸，该小体积最佳地用于递送至皮肤，优选小注射体积，理想的是25-200微升(μL)。在一些实施方式中，该核酸制剂具有高核酸浓度，如1mg/mL或更高(mg核酸/制剂体积)。更优选的是，该核酸制剂具有的核酸浓度在200μL制剂中提供克量级的核酸，并且更优选100μL制剂中提供克量级的核酸。

适用于本发明的EP设备的核酸质粒能够使用已知设备和技术的组合进行配制或生产，但优选使用作为2009年1月1日公开的美国专利公开号20090004716的美国专利申请No.12/126611中描述的优化质粒生产技术对其进行生产。在一些实施例中，这些研究中使用的核酸质粒能够配制成大于或等于10mg/mL的浓度。除了描述于美国公开号20090004716和2007年7月3日发布的美国专利No.7,238,522中公开的那些之外，生产技术还包括或引入了本领域普通技术人员通常已知的各种设备和方案。与本文所述的皮肤EP设备和递送技术一起使用的高浓度质粒允许以相当低的体积将质粒给予至ID/SC空间中，并有助于增强表达和免疫效果。出版物，美国公开No.20090004716和美国专利No.7,238,522以其整体结合于本文中。

治疗方法

本文还提供了通过在受试者中诱导针对病毒抗原的免疫响应而治疗、防护和/或预防有此需要的受试者中的疾病的方法。在某些实施方式中，本发明提供了一种治疗、防护和/或预防受试者中的NiV病毒感染或NiV相关病症中的至少之一的方法。在一个实施方式中，NiV相关病症是脑炎。

该方法能够包括向受试者给予本发明的免疫原性组合物。使用上述递送方法能够将该组合物给予所述受试者。

该组合物剂量能够为1μg-10mg活性成分/kg体重/次，并且能够为20μg-10mg组分/kg体重/次。该组合物能够每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天进行给予。有效治疗的组合物剂量的数目能够为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

组合疫苗

本发明还提供了通过给予两种或更多种核酸分子或免疫原性组合物的组合而治疗、防护和/或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，其中两种或更多种核酸分子或免疫原性组合物的每种都编码优化的共有病毒抗原。

使用任何合适的方法都可以给予所述两种或更多种核酸分子或免疫原性组合物，从而使所述两种或更多种核酸分子或免疫原性组合物的组合都存在于受试者中。在一个实施方式中，该方法可以包括通过以上详细描述的任何方法给予本发明的第一核酸分子或免疫原性组合物，以及在给予本发明的第一核酸分子或免疫原性组合物后少于1天，少于2天，少于3天，少于4天，少于5天，少于6天，少于7天，少于8天，少于9天或少于10天给予第二核酸分子或免疫原性组合物。在一个实施方式中，该方法可以包括在同一受试者的不同部位同时给予至少2，至少3，至少4，至少5，至少6或超过6种核酸分子或免疫原性组合物。在一个实施方式中，该方法可以包括在给予第一核酸分子或免疫原性组合物后超过1天，超过2天，超过3天，超过4天，超过5天，超过6天，超过7天，超过8天，超过9天，超过10天给予至少2，至少3，至少4，至少5，至少6个或超过6种核酸分子或免疫原性组合物。在一个实施方式中，该方法可以包括在给予第一核酸分子或免疫原性组合物后少于1天，少于2天，少于3天，少于4天，少于5天，少于6天，少于7天，少于8天，少于9天或少于10天给予至少2，至少3，至少4，至少5，至少6或超过6种核酸分子或免疫原性组合物。

实施例

在以下实施例中进一步说明本发明。应当理解的是，这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅以举例说明的方式给出。根据以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以明确本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文中显示和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

实施例1：针对尼帕(Nipah)病毒的新型合成DNA疫苗的免疫响应的构建和表征

DNA疫苗已开发出来，以引发针对各种出现的传染病的共有病毒蛋白的免疫响应。本发明表明尼帕疫苗在疫苗接种的受试者中诱导免疫响应的开发和用途。

现在描述所使用的材料和方法

质粒疫苗构建

开发质粒以表达共有NiV融合(F)或NiV糖蛋白(G)抗原(图1和图2)。

动物和疫苗接种

用NiV-F、NiV-G或pVaxl免疫Balb/C小鼠，每2周2次电穿孔(EP)。第二次免疫后1周，从各个小鼠(n＝4)中分离出血清和脾细胞。

现在描述实验的结果

小鼠中的NiV DNA疫苗的免疫原性

NiV DNA疫苗的免疫原性和保护功效在小鼠中进行了评价。小鼠通过IM-EP递送25μg NiV接受三次免疫。最后免疫后一周，通过脾细胞IFNγELISpot测量细胞响应。如图3所示，NiV疫苗诱导针对NiV的强烈IFN-γ响应。抗原结合IgG ELISA进行实施，以评价小鼠的体液免疫响应。NiV疫苗诱导了强结合抗体(图5和图6)。这些数据表明，NiV DNA疫苗在小鼠中是免疫原性的，为在更大动物物种中进行进一步测试提供了支持。

实施例2：序列

SEQ ID NO：1-共有NiV融合(F)免疫原的核苷酸序列

SEQ ID NO:2-共有NiV-融合(F)免疫原的氨基酸序列

SEQ ID NO:3-可操作地连接至编码IgE前导序列和两个终止密码子的序列的共有NiV-融合免疫原的核苷酸序列

SEQ ID NO:4-可操作地连接至IgE前导序列的共有NiV-融合免疫原的氨基酸序列

SEQ ID NO:5-共有NiV-糖蛋白(G)免疫原的核苷酸序列

SEQ ID NO:6-共有NiV-G免疫原的氨基酸序列

SEQ ID NO:7-可操作地连接至编码IgE前导序列和两个终止密码子的序列的共有NiV-G免疫原的核苷酸序列

SEP ID NO：8-可操作地连接至IgE前导序列的共有NiV-G免疫原的氨基酸序列

SEP ID NO：9-IgE前导序列

MDWTWILFLVAAATRVHS

应当理解的是，前述详细描述和所附实施例仅是举例说明性的，并且不应该视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物进行限定。

对所公开的实施方式的各种改变和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行这样的改变和修改，包括但不限于，与本发明使用的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或方法有关的那些。

序列表

<110> 威斯塔解剖学和生物学研究所（THE WISTAR INSTITUTE OF ANATOMY ANDBIOLOGY）

卡尔·穆图马尼（ Muthumani, Kar）

大卫·韦纳（Weiner, David B）

<120> 抗尼帕病毒的疫苗及其使用方法（VACCINES AGAINST NIPAH VIRUS, ANDMETHODS OF USING SAME）

<130> 206193-0007-00WO

<150> US 62/720,393

<151> 2018-08-21

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有 NiV-融合 (F)免疫原的核苷酸序列

<400> 1

gtggtcatcc tggataagag atgctactgt aacctgctga tcctgatcct gatgatcagc 60

gagtgctccg tgggcatcct gcactacgag aagctgtcca agatcggcct ggtgaagggc 120

gtgacccgga agtataagat caagtctaat cccctgacaa aggacatcgt gatcaagatg 180

atccctaacg tgtctaatat gagccagtgt accggcagcg tgatggagaa ctacaagacc 240

cgcctgaatg gcatcctgac acccatcaag ggcgccctgg agatctataa gaacaataca 300

cacgacctgg tgggcgatgt gaggctggca ggcgtgatca tggcaggagt ggcaatcgga 360

atcgcaaccg cagcacagat cacagcagga gtggccctgt atgaggccat gaagaacgcc 420

gacaacatca ataagctgaa gagctccatc gagtccacca atgaggccgt ggtgaagctg 480

caggagacag ccgagaagac agtgtacgtg ctgacagccc tgcaggacta tatcaacacc 540

aatctggtgc ctacaatcga taagatctct tgcaagcaga ccgagctgag cctggacctg 600

gccctgagca agtacctgtc cgatctgctg ttcgtgtttg gcccaaacct gcaggacccc 660

gtgagcaatt ccatgacaat ccaggccatc agccaggcct tcggcggcaa ctacgagaca 720

ctgctgagaa cactgggcta tgccaccgag gactttgacg atctgctgga gtctgatagc 780

atcacaggcc agatcatcta tgtggacctg tctagctact atatcatcgt gcgggtgtac 840

ttcccaatcc tgaccgagat ccagcaggcc tatatccagg agctgctgcc cgtgagcttc 900

aacaatgata actctgagtg gatcagcatc gtgcctaact tcatcctggt gaggaacacc 960

ctgatctcta atatcgagat cggcttttgc ctgatcacaa agagaagcgt gatctgtaac 1020

caggactacg ccacccctat gacaaacaat atgcgggagt gcctgaccgg ctccacagag 1080

aagtgtcctc gggagctggt ggtgtcctct cacgtgccac gcttcgccct gtccaacggc 1140

gtgctgtttg ccaattgcat ctctgtgacc tgccagtgtc agaccacagg cagggccatc 1200

tcccagtctg gcgagcagac cctgctgatg atcgataaca ccacatgtcc aacagccgtg 1260

ctgggcaatg tgatcatctc cctgggcaag tacctgggca gcgtgaacta taattccgag 1320

ggaatcgcaa tcggccctcc cgtgttcacc gacaaggtgg atatcagctc ccagatctct 1380

agcatgaacc agtccctgca gcagtctaag gactacatca aggaggccca gcgcctgctg 1440

gataccgtga atccatccct gatctctatg ctgagcatga tcatcctgta tgtgctgtcc 1500

atcgcctctc tgtgcatcgg cctgatcacc ttcatcagct ttatcatcgt ggagaagaag 1560

cggaacacat actcccgcct ggaggacagg agagtgaggc ccacctcctc tggcgatctg 1620

tactatatcg gcaca 1635

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有 NiV-融合 (F) 免疫原的氨基酸序列

<400> 2

Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu Ile

1 5 10 15

Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu

20 25 30

Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys

35 40 45

Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn Val

50 55 60

Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr

65 70 75 80

Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr

85 90 95

Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly Val

100 105 110

Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr

115 120 125

Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn

130 135 140

Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys Leu

145 150 155 160

Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp

165 170 175

Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys Lys

180 185 190

Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp

195 200 205

Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser

210 215 220

Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr

225 230 235 240

Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu

245 250 255

Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser Ser

260 265 270

Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln

275 280 285

Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn

290 295 300

Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr

305 310 315 320

Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser

325 330 335

Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met Arg

340 345 350

Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val Val

355 360 365

Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala

370 375 380

Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala Ile

385 390 395 400

Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys

405 410 415

Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu

420 425 430

Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val

435 440 445

Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln

450 455 460

Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu Leu

465 470 475 480

Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile Leu

485 490 495

Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr Ser Arg Leu Glu

515 520 525

Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile Gly

530 535 540

Thr

545

<210> 3

<211> 1695

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接到编码IgE前导序列和两个终止密码子的序列的共有 NiV-融合免疫原的核苷酸序列

<400> 3

atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa caagggtgca ctctgtggtc 60

atcctggata agagatgcta ctgtaacctg ctgatcctga tcctgatgat cagcgagtgc 120

tccgtgggca tcctgcacta cgagaagctg tccaagatcg gcctggtgaa gggcgtgacc 180

cggaagtata agatcaagtc taatcccctg acaaaggaca tcgtgatcaa gatgatccct 240

aacgtgtcta atatgagcca gtgtaccggc agcgtgatgg agaactacaa gacccgcctg 300

aatggcatcc tgacacccat caagggcgcc ctggagatct ataagaacaa tacacacgac 360

ctggtgggcg atgtgaggct ggcaggcgtg atcatggcag gagtggcaat cggaatcgca 420

accgcagcac agatcacagc aggagtggcc ctgtatgagg ccatgaagaa cgccgacaac 480

atcaataagc tgaagagctc catcgagtcc accaatgagg ccgtggtgaa gctgcaggag 540

acagccgaga agacagtgta cgtgctgaca gccctgcagg actatatcaa caccaatctg 600

gtgcctacaa tcgataagat ctcttgcaag cagaccgagc tgagcctgga cctggccctg 660

agcaagtacc tgtccgatct gctgttcgtg tttggcccaa acctgcagga ccccgtgagc 720

aattccatga caatccaggc catcagccag gccttcggcg gcaactacga gacactgctg 780

agaacactgg gctatgccac cgaggacttt gacgatctgc tggagtctga tagcatcaca 840

ggccagatca tctatgtgga cctgtctagc tactatatca tcgtgcgggt gtacttccca 900

atcctgaccg agatccagca ggcctatatc caggagctgc tgcccgtgag cttcaacaat 960

gataactctg agtggatcag catcgtgcct aacttcatcc tggtgaggaa caccctgatc 1020

tctaatatcg agatcggctt ttgcctgatc acaaagagaa gcgtgatctg taaccaggac 1080

tacgccaccc ctatgacaaa caatatgcgg gagtgcctga ccggctccac agagaagtgt 1140

cctcgggagc tggtggtgtc ctctcacgtg ccacgcttcg ccctgtccaa cggcgtgctg 1200

tttgccaatt gcatctctgt gacctgccag tgtcagacca caggcagggc catctcccag 1260

tctggcgagc agaccctgct gatgatcgat aacaccacat gtccaacagc cgtgctgggc 1320

aatgtgatca tctccctggg caagtacctg ggcagcgtga actataattc cgagggaatc 1380

gcaatcggcc ctcccgtgtt caccgacaag gtggatatca gctcccagat ctctagcatg 1440

aaccagtccc tgcagcagtc taaggactac atcaaggagg cccagcgcct gctggatacc 1500

gtgaatccat ccctgatctc tatgctgagc atgatcatcc tgtatgtgct gtccatcgcc 1560

tctctgtgca tcggcctgat caccttcatc agctttatca tcgtggagaa gaagcggaac 1620

acatactccc gcctggagga caggagagtg aggcccacct cctctggcga tctgtactat 1680

atcggcacat gataa 1695

<210> 4

<211> 563

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接到IgE前导序列的共有NiV-融合免疫原的氨基酸序列

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile

20 25 30

Leu Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu

35 40 45

Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys

50 55 60

Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro

65 70 75 80

Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr

85 90 95

Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu

100 105 110

Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala

115 120 125

Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln

130 135 140

Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn

145 150 155 160

Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val

165 170 175

Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu

180 185 190

Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser

195 200 205

Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu

210 215 220

Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser

225 230 235 240

Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr

245 250 255

Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu

275 280 285

Ser Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu

290 295 300

Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn

305 310 315 320

Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg

325 330 335

Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys

340 345 350

Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn

355 360 365

Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu

370 375 380

Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu

385 390 395 400

Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg

405 410 415

Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr

420 425 430

Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys

435 440 445

Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro

450 455 460

Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met

465 470 475 480

Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg

485 490 495

Leu Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile

500 505 510

Ile Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr

515 520 525

Phe Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr Ser Arg

530 535 540

Leu Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu Tyr Tyr

545 550 555 560

Ile Gly Thr

<210> 5

<211> 1803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有 NiV-糖蛋白 (G) 免疫原的核苷酸序列

<400> 5

ccagccgaga ataagaaggt gaggtttgag aacaccacat ctgacaaggg caagatcccc 60

tctaaagtga tcaagagcta ctatggcacc atggacatca agaagatcaa tgagggcctg 120

ctggatagca agatcctgtc cgccttcaac acagtgatcg ccctgctggg ctccatcgtg 180

atcatcgtga tgaatatcat gatcatccag aactacacca ggtctacaga caatcaggcc 240

gtgatcaagg acgctctgca gggcatccag cagcagatca agggcctggc cgataagatc 300

ggcacagaga tcggccccaa ggtgagcctg atcgacacca gctccaccat cacaatccct 360

gccaacatcg gcctgctggg cagcaagatc tctcagagca ccgcctccat caacgagaat 420

gtgaacgaga agtgcaagtt cacactgccc cctctgaaga tccacgagtg caatatctcc 480

tgtcctaacc cactgccctt tagggagtac agaccacaga ccgagggcgt gtctaatctg 540

gtgggcctgc ccaacaatat ctgtctgcag aagaccagca accagatcct gaagcccaag 600

ctgatctcct atacactgcc tgtggtgggc cagtctggca cctgcatcac agaccctctg 660

ctggccatgg atgagggcta cttcgcctat tctcacctgg agcggatcgg ctcctgttct 720

cgcggcgtga gcaagcagag gatcatcgga gtgggagagg tgctggacag aggcgatgag 780

gtgcctagcc tgttcatgac caacgtgtgg acaccaccca atccaaacac cgtgtaccac 840

tgctccgccg tgtataacaa tgagttttac tacgtgctgt gcgccgtgag caccgtgggc 900

gatcctatcc tgaactccac atactggagc ggctccctga tgatgaccag gctggcagtg 960

aagccaaaga gcaatggcgg cggatataac cagcaccagc tggccctgag atccatcgag 1020

aagggccggt acgataaagt gatgccttat ggcccatccg gcatcaagca gggcgacaca 1080

ctgtacttcc ccgccgtggg ctttctggtg aggaccgagt tcaagtacaa tgactctaac 1140

tgccctatca caaagtgtca gtattctaag ccagagaatt gccgcctgag catgggcatc 1200

aggcccaact ctcactacat cctgcgcagc ggcctgctga agtataatct gagcgacggc 1260

gagaacccta aggtggtgtt tatcgagatc tccgatcaga ggctgtctat cggctctccc 1320

agcaagatct acgactccct gggccagccc gtgttctacc aggcctcctt ttcttgggac 1380

acaatgatca agttcggcga tgtgctgacc gtgaatccac tggtggtgaa ctggagaaac 1440

aataccgtga tcagccggcc cggacagtcc cagtgtccta ggttcaacac atgcccagag 1500

atctgttggg agggcgtgta caatgacgcc ttcctgatcg atcggatcaa ctggatctcc 1560

gccggcgtgt ttctggactc taatcagacc gccgagaacc ccgtgttcac agtgtttaag 1620

gataatgaga tcctgtacag agcccagctg gcctctgagg acaccaacgc ccagaagacc 1680

atcacaaatt gcttcctgct gaagaacaag atctggtgta tcagcctggt ggagatctat 1740

gacaccggcg ataacgtgat ccggccaaag ctgtttgccg tgaagatccc cgagcagtgc 1800

aca 1803

<210> 6

<211> 601

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有 NiV-G 免疫原的氨基酸序列

<400> 6

Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp Lys

1 5 10 15

Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met Asp

20 25 30

Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala

35 40 45

Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met

50 55 60

Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala

65 70 75 80

Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu

85 90 95

Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp

100 105 110

Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys

130 135 140

Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser

145 150 155 160

Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly

165 170 175

Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr

180 185 190

Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val

195 200 205

Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp

210 215 220

Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp

245 250 255

Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro

260 265 270

Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu

275 280 285

Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val

305 310 315 320

Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu

325 330 335

Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro

340 345 350

Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe

355 360 365

Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr

370 375 380

Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile

385 390 395 400

Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn

405 410 415

Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp

420 425 430

Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly

435 440 445

Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys

450 455 460

Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn

465 470 475 480

Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn

485 490 495

Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu

500 505 510

Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn

515 520 525

Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile

530 535 540

Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr

545 550 555 560

Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu

565 570 575

Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe

580 585 590

Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr

595 600

<210> 7

<211> 1863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接到编码IgE前导序列和两个终止密码子的序列的共有NiV-G免疫原的核苷酸序列

<400> 7

atggattgga catggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ctccccagcc 60

gagaataaga aggtgaggtt tgagaacacc acatctgaca agggcaagat cccctctaaa 120

gtgatcaaga gctactatgg caccatggac atcaagaaga tcaatgaggg cctgctggat 180

agcaagatcc tgtccgcctt caacacagtg atcgccctgc tgggctccat cgtgatcatc 240

gtgatgaata tcatgatcat ccagaactac accaggtcta cagacaatca ggccgtgatc 300

aaggacgctc tgcagggcat ccagcagcag atcaagggcc tggccgataa gatcggcaca 360

gagatcggcc ccaaggtgag cctgatcgac accagctcca ccatcacaat ccctgccaac 420

atcggcctgc tgggcagcaa gatctctcag agcaccgcct ccatcaacga gaatgtgaac 480

gagaagtgca agttcacact gccccctctg aagatccacg agtgcaatat ctcctgtcct 540

aacccactgc cctttaggga gtacagacca cagaccgagg gcgtgtctaa tctggtgggc 600

ctgcccaaca atatctgtct gcagaagacc agcaaccaga tcctgaagcc caagctgatc 660

tcctatacac tgcctgtggt gggccagtct ggcacctgca tcacagaccc tctgctggcc 720

atggatgagg gctacttcgc ctattctcac ctggagcgga tcggctcctg ttctcgcggc 780

gtgagcaagc agaggatcat cggagtggga gaggtgctgg acagaggcga tgaggtgcct 840

agcctgttca tgaccaacgt gtggacacca cccaatccaa acaccgtgta ccactgctcc 900

gccgtgtata acaatgagtt ttactacgtg ctgtgcgccg tgagcaccgt gggcgatcct 960

atcctgaact ccacatactg gagcggctcc ctgatgatga ccaggctggc agtgaagcca 1020

aagagcaatg gcggcggata taaccagcac cagctggccc tgagatccat cgagaagggc 1080

cggtacgata aagtgatgcc ttatggccca tccggcatca agcagggcga cacactgtac 1140

ttccccgccg tgggctttct ggtgaggacc gagttcaagt acaatgactc taactgccct 1200

atcacaaagt gtcagtattc taagccagag aattgccgcc tgagcatggg catcaggccc 1260

aactctcact acatcctgcg cagcggcctg ctgaagtata atctgagcga cggcgagaac 1320

cctaaggtgg tgtttatcga gatctccgat cagaggctgt ctatcggctc tcccagcaag 1380

atctacgact ccctgggcca gcccgtgttc taccaggcct ccttttcttg ggacacaatg 1440

atcaagttcg gcgatgtgct gaccgtgaat ccactggtgg tgaactggag aaacaatacc 1500

gtgatcagcc ggcccggaca gtcccagtgt cctaggttca acacatgccc agagatctgt 1560

tgggagggcg tgtacaatga cgccttcctg atcgatcgga tcaactggat ctccgccggc 1620

gtgtttctgg actctaatca gaccgccgag aaccccgtgt tcacagtgtt taaggataat 1680

gagatcctgt acagagccca gctggcctct gaggacacca acgcccagaa gaccatcaca 1740

aattgcttcc tgctgaagaa caagatctgg tgtatcagcc tggtggagat ctatgacacc 1800

ggcgataacg tgatccggcc aaagctgttt gccgtgaaga tccccgagca gtgcacatga 1860

taa 1863

<210> 8

<211> 619

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可操作地连接到IgE前导序列的共有NiV-G免疫原的氨基酸序列

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser

20 25 30

Asp Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr

35 40 45

Met Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu

50 55 60

Ser Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile

65 70 75 80

Val Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn

85 90 95

Gln Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys

100 105 110

Gly Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu

115 120 125

Ile Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu

130 135 140

Gly Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn

145 150 155 160

Glu Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn

165 170 175

Ile Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr

180 185 190

Glu Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln

195 200 205

Lys Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu

210 215 220

Pro Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala

225 230 235 240

Met Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser

245 250 255

Cys Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val

260 265 270

Leu Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp

275 280 285

Thr Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn

290 295 300

Asn Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro

305 310 315 320

Ile Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu

325 330 335

Ala Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu

340 345 350

Ala Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr

355 360 365

Gly Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val

370 375 380

Gly Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro

385 390 395 400

Ile Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met

405 410 415

Gly Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys

420 425 430

Tyr Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile

435 440 445

Ser Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser

450 455 460

Leu Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met

465 470 475 480

Ile Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp

485 490 495

Arg Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg

500 505 510

Phe Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala

515 520 525

Phe Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp

530 535 540

Ser Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn

545 550 555 560

Glu Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln

565 570 575

Lys Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile

580 585 590

Ser Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys

595 600 605

Leu Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr

610 615

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgE前导序列

<400> 9

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser

Claims (27)

1.一种免疫原性组合物，包含编码至少一种共有尼帕病毒(NiV)抗原的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述NiV抗原选自由融合抗原、糖蛋白抗原及其组合组成的组中。

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列的肽：

a)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％包含至少约90％一致性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和

d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组中。

5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含选自由以下各项组成的组中的核苷酸序列：

a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％一致性的核苷酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和

d)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码肽的核苷酸序列与选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组中的至少一种调节序列可操作地连接。

7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含可操作地连接至SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列的肽：

a)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％包含至少约90％一致性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和

d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含可操作地连接至编码SEQ ID NO：9的核苷酸序列的选自由以下各项组成的组中的核苷酸序列：

a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％一致性的核苷酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和

d)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含表达载体。

10.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中将所述核酸分子引入病毒颗粒中。

11.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含药用赋形剂。

12.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。

13.一种核酸分子，编码包含选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列的肽：

a)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％包含至少约90％的一致性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和

d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组中。

15.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下各项组成的组中的核苷酸序列：

a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％一致性的核苷酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和

d)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

16.根据权利要求13所述的核酸分子，其中编码的肽与选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组中的至少一种调节序列可操作地连接。

17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码包含可操作地连接至SEQID NO：9所示的氨基酸序列的选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列的肽：

a)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％的一致性的氨基酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的至少60％包含至少约90％的一致性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列，和

d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含可操作地连接至编码SEQID NO：9的核苷酸序列的选自由以下各项组成的组中的核苷酸序列：

a)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的全长具有至少约90％一致性的核苷酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％一致性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列，和

d)选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5组成的组中的核苷酸序列的免疫原性片段。

19.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含表达载体。

20.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括病毒颗粒。

21.一种包含选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列的肽：

a)相对于选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的组中的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列，

b)相对于选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的组中的氨基酸序列的至少60％包含至少约90％一致性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的组中的氨基酸序列，和

d)包含至少60％选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8组成的组中的氨基酸序列的免疫原性片段。

22.一种免疫原性组合物，包含权利要求21所述的肽。

23.一种在需要其的受试者中诱导针对NiV抗原的免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者给予权利要求1所述的免疫原性组合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中给予包括电穿孔和注射中的至少一种。

25.一种在需要其的受试者中治疗或预防NiV相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者给予权利要求1所述的免疫原性组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中给予包括电穿孔和注射中的至少一种。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述NiV相关病症是NiV感染和脑炎中的至少一种。

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