MXPA06015263A - Vacunacion de zorrillos y/o mangostas contra rabia. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona a vacunas anti-rabia recombinantes y la administracion oral de tales vacunas a zorrillos y/o mangostas. Ventajosamente, la vacuna anti-rabia puede comprender un virus de vaccinia recombinante que contiene un gen de glicoproteina de rabia. La invencion abarca metodos para vacunar zorrillos y/o mangostas mediante la administracion de una vacuna anti-rabia que puede comprender un virus de vaccinia recombinante que contiene un gen de glicoproteina de rabia.

Description

VACUNACIÓN DE ZORRILLOS Y/O MANGOSTAS CONTRA RABIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a vacunas antirabia recombinantes y la administración de tales vacunas a zorrillos y/o mangostas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La rabia es una enfermedad que puede ocurrir en todas las especies de sangre caliente y es causada por el virus de rabia. La infección con el virus de rabia seguida por el brote de las características clínicas en casi todos los casos da por resultado la muerte de la especie infectada. En Europa, los Estados Unidos y Canadá la rabia de vida silvestre todavía existe y es un factor importante en la Causa de la mayoría de casos de rabia humana que ocurren. Por otra parte, la rabia urbana constituye la causa mayor de rabia humana en países en desarrollo. El virus de rabia es un virus de RNA de hebra negativa no segmentada de la familia R abdoviridae. Los viriones de virus de rabia están compuestos de dos componentes estructurales principales: una nucleocápsida o ribonucleoproteína (RNP) , y una envoltura en la forma de una membrana bicapa que circunda el núcleo de RNP. El componente infeccioso de todos los Rhabdovirus es el núcleo de RNP que consiste del genoma de RNA encapsidado por la proteína de nucleocápsida (N) en combinación con dos proteínas menores, es decir RNA-polimerasa (L) dependiente de RNA y fosfoproteína (P) . La membrana que circunda el núcleo de RNP consiste de dos proteínas: una glicoproteína de transmembrana (G) y una proteína de matriz (M) localizadas en el sitio interno de la membrana. La proteína G, también referida como proteína de punta, es responsable para la unión de la célula y la fusión de la membrana en el virus de rabia y adicionalmente es el objetivo principal para el sistema inmune del hospedero. La región de aminoácidos en la posición 330 a la 340 (referida como sitio antigénico III) de la proteína G ha sido identificada que es responsable para la virulencia del virus, en particular el residuo Arg en la posición 333. Todas las cepas de virus de rabia tienen esta virulencia que determina el sitio antigénico III en común. Raboral V-RG se desarrolló como una vacuna de rabia alternativa por Merial, Ltd. Como una vacuna de rabia alternativa esa probó que tiene el atributo único y novedoso de ser efectiva por la ruta oral (revisado por Mac owia y colaboradores, Adv Vet Med. 1999; 41:571-83). La vacuna consiste de un virus de vaccinia vivo modificado que contiene el gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en su genoma. El primer uso experimental de la vacuna recombinante en la vida silvestre se inició en Europa. La vacuna fue contenida dentro de un saco de plástico circundado por un cebo de harina de pescado comestible y se desplegó en áreas conocidas que contienen poblaciones de zorro rojo infectado con rabia. Estas campañas dieron por resultado una reducción notable en casos de rabia en los zorros rojos y el uso del Raboral V-RG se consideró un éxito. El Raboral V-RG también se encontró que es efectivo en causar una reducción en la rabia en mapaches, coyotes y zorros rojos (revisado por Mackowiak y colaboradores, Adv Vet Med. 1999; 41:571-83). ? pesar del éxito de la vacunación oral de la vida silvestre, tales corao zorros y mapaches, la vacunación oral de zorrillos ha sido menos exitosa. Rupprecht y colaboradores reportaron que la administración oral de las vacunas SAD-B19 y ERA/BHK-21 no indujeron seroconversión ni protección significante contra la estimulación de rabia (ver, por ejemplo, Rupprecht y colaboradores, J ildl Dis. 1990 Jan;26 (1) : 99-102) . Rupprecht y colaboradores concluyeron que sus resultados experimentales definitivamente confirmaron las sugerencias previas de la insuficiencia general de varias vacunas de rabia atenuadas convencionales dadas oralmente a zorrillos, aun en dosificaciones de 1,000-veces arriba de aquellas encontradas mínimamente protectoras para zorros (ver, por ejemplo, Rupprecht y colaboradores, J Wildl Dis. 1990 Jan;2ß(l) :99-102).. En un estudio similar, Vos y colaboradores estudiaron la administración oral directa de la vacuna de virus de rabia vivo modificado, SAD B19, a zorrillos rayados (Mephitis mephitis) (ver, por ejemplo, Vos y colaboradores, J Wildl Dis. 2002 Apr; 38 (2) : 428-31) . En este estudio, tres de siete . zorrillos vacunados seroconvertidos y ninguno de los animales de control tuvieron niveles detectables de anticuerpos que neutralizan el virus de rabia (ver, por ejemplo, Vos y colaboradores, J Wildl Dis. 2002 Apr; 38 (2) : 428-31) . En otro estudio, Hanlon y colaboradores evaluaron una vacuna de virus de rabia altamente atenuado, SAG-2, mediante una ruta oral en zorrillos y mapaches (ver, por ejemplo, Hanlon y colaboradores, J Wildl Dis. 2002 Apr; 38 (2) : 420-7) . Dos de cinco zorrillos y tres de cinco mapaches desarrollaron anticuerpos que neutralizan el virus (VNA) por el día 14 después de la administración oral de la vacuna SAG-2. Todos los animales permanecieron sanos. En la estimulación, los controles naturales sucumbieron a la rabia. Entre los animales vacunados, cuatro de cinco zorrillos y todos los cinco mapaches tuvieron VNA en el día 7 de la post-estimulación y todos sobrevivieron. Hanlon y colaboradores sugieren que SAG-2 es una vacuna candidato prometedora que puede satisfacer tanto los problemas de seguridad y eficacia para la inmunización de rabia oral de los depósitos de rabia de Norteamérica principales (ver, por ejemplo, Hanlon y colaboradores, J Wildl Dis. 2002 Apr; 38(2) :420). Sin embargo, SAG-2, un mutante de virus de rabia atenuado tiene el potencial para revertir la cepa parental patogénica (ver, por ejemplo, solicitud de patente Europea 583998). Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica por una vacuna de rabia oral confiable, eficaz, para la administración a zorrillos y/o mangostas, especialmente puesto que los zorrillos y mangostas permanecen como una especie de depósito de rabia principal en Norteamérica. La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que tal documento esté disponible como técnica previa para la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención está basada, en parte, sobre el resultado inesperado y sorprendente de que el Raboral V-RG es efectivo para la vacunación oral de zorrillos. La invención se relaciona a un método para inducir una respuesta inmune en un zorrillo o mangosta, que puede comprender la administración de una composición que puede comprender un vector viral que puede comprender un gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en el genoma del vector viral en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en el zorrillo o mangosta. En una modalidad, el vector puede comprender un virus de vaccinia vivo modificado. En otra modalidad, el gen de glicoproteína de superficie de rabia puede ser glicoproteína G de rabia, que es derivado de una cepa ERA en una modalidad. En otra modalidad, el virus de vaccinia o el vector de virus de vaccinia pueden ser una cepa Copenhagen o un derivado de la misma. En otra modalidad, el virus de vaccinia o el vector de virus de vaccinia pueden tener un fenotipo tk". En una modalidad ventajosa, el virus de vaccinia o el vector del virus de vaccinia puede ser una cepa Copenhagen (o un derivado de la misma) y tiene un fenotipo tk~. En una modalidad ventajosa, el virus de vaccinia vivo modificado puede ser Raboral V-RG. En una . modalidad particularmente ventajosa, la administración de las composiciones descritas en lo anterior puede ser oral. Ventajosamente, la administración oral puede ser mediante un cebo. En una modalidad, el cebo puede comprender un paquete de plástico hueco. En otra modalidad, la composición se puede insertar en el cubo de polímero hueco. En todavía otra modalidad ventajosa, la administración de las composiciones descritas en lo anterior puede ser nasal o a través del contacto con la mucosa nasal. La invención también abarca un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora en un zorrillo o mangosta que puede comprender la administración de una composición que puede comprender un vector viral que puede comprender un gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en el genoma del vector viral en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en el zorrillo o mangosta . En una modalidad, el vector puede comprender un virus de vaccinia vivo modificado. En otra modalidad, el gen de glicoproteína de superficie de rabia puede ser glicoproteína G de rabia, que se deriva de una cepa ERA en una modalidad. En otra modalidad el virus de vaccinia o el vector de virus de vaccinia pueden ser una cepa Copenhagen o un derivado de la misma. En otra modalidad, el virus de vaccinia o el vector de virus de vaccinia pueden tener un fenotipo tk~. En una modalidad ventajosa, el virus de vaccinia o el vector de virus de vaccinia puede ser una cepa Copenhagen (o un derivado de la misma) que tiene un fenotipo tk~J En una modalidad ventajosa, el virus de vaccinia vivo modificado puede ser Raboral V-RG. En una modalidad particularmente ventajosa, la administración de las composiciones descritas en lo anterior puede ser oral. Ventajosamente, la administración oral puede ser mediante un cebo. En una modalidad, el cebo puede comprender un paquete de plástico hueco. En otra modalidad, la composición se puede insertar en el cubo de polímero hueco.

En todavía otra modalidad ventajosa, la administración de las composiciones descritas en lo anterior puede ser nasal o a través del contacto con la mucosa nasal. La invención también proporciona un equipo para realizar cualquiera de los métodos descritos en lo anterior, que comprende cualquiera de las composiciones descritas en lo anterior y opcionalmente, instrucciones para realizar el método . Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y los similares pueden tener el significado atribuido a éste en la ley de Patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y los similares; y aquellos términos tales como, "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen el significado adscrito a estos en la ley de Patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, ellos tienen en cuenta elementos no explícitamente citados, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica previa o que afectan una característica básica o novedosa de la invención. Estas y otras modalidades son divulgadas o son obvias de y abarcadas por, la siguiente Descripción Detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La siguiente descripción detallada, dada a manera de ejemplo, pero no propuesta para limitar la invención únicamente a las modalidades específicas descritas, puede ser mejor entendida en conjunción con los dibujos acompañantes, en los que : la FIG. 1 muestra un cebo basado en polímero de harina de pescado que contiene la vacuna y un saco recubierto que contiene la vacuna. DESCRIPCIÓN DETALLADA La invención está basada, en parte, sobre el resultado inesperado y sorprendente de que el Raboral V-RG es eficaz para la vacunación oral de zorrillos. Por lo tanto, la invención abarca, en parte, la administración oral de un vector de virus de vaccinia que contiene un gen de glicoproteína de rabia a zorrillos. Los métodos y composiciones divulgados en la presente ventajosamente se relacionan a la vacunación de zorrillos y/o mangostas contra rabia, sin embargo, los métodos y composiciones también pueden aplicar a animales de las familias Mustilidae, Mephi tidae o Viverridae tales como, pero no limitados a, civetos, hurones, hienas, lémures, meerkats, visones y comadrejas. En una modalidad de la invención, un gen de glicoproteína de rabia es codificado en un vector de expresión. En una modalidad ventajosa, el gen de glicoproteína de rabia es glicoproteína G del virus de rabia. En otra modalidad ventajosa, el gen de glicoproteína de rabia se aisla a partir de una cepa ERA. En otra modalidad, la glicoproteína de rabia es cualquier glicoproteína de rabia con una secuencia de proteína conocida, tal como glicoproteína G de virus de rabia. Tales como las secuencias de proteína en o derivadas de las secuencias de nucleótidos en Marissen y colaboradores J Virol. Abril del 2005; 7 (8 ): 4672-8; Dietzschold y colaboradores, Vaccine. 9 de Diciembre del' 2004 ; 23 (4) : 518-24; Mansfield y colaboradores, J Gen Virol. Noviembre del 2004;85(Pt ll):3279-83; Sato y colaboradores, J Vet Med Sci. Julio del 2004; 66 (7 ): 747-53; Takaya a-Ito y colaboradores, J Neurovirol. Abril del 2004 ; 10 (2) : 131-5; Li y colaboradores, Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. Diciembre del 2003; 25 (6) : 650-4; Hemachudha y colaboradores, J Infect Dis. 1 de Octubre del 2003;_188 (7) : 960-6; Kankanamge y colaboradores, Microbiol Immunol . 2003; 47 (7 ): 507-19; Maillard y colaboradores, Virus Res. Junio del 2003; 93 (2) : 151-8; Irie y colaboradores, Microbiol Immunol . 2002; 46 (7) : 449-61; Langevin y colaboradores, J Biol Chem. 4 de Octubre del 2002;277 (40) :37655-62; Maillard y Gaudin, J Gen Virol. Junio del 2002;83(Pt 6):1465-76; Holmes y colaboradores, Virology. 20 de Enero del 2002; 292 (2) : 247-57 ; Mebatsion, J Virol.

Diciembre del 2001;75(23): 11496-502; Zhang y colaboradores, Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. Septiembre del 2000; 14 (3) : 281-4; Ray y colaboradores, Clin Exp Immunol . Julio del 2001;125 (1) :94-101; Morimoto y colaboradores, Vaccine. 14 de Mayo del 2001; 19 (25-26) : 3543-51; Morimoto y colaboradores, J Neurovirol. Octubre del 2000; 6 (5): 373-81; Bourhy y colaboradores, J Gen Virol. Octubre de 1999; 80 (Pt 10):2545-57; Kissi y colaboradores, J Gen Virol. Agosto de 1999;80 (Pt 8):2041-50; Nakahara y colaboradores, Microbiol Immunol. 1999; 43 (3) : 259-70; Matthews y colaboradores, J Gen Virol. Febrero de 1999;80 (Pt 2):345-53; Tuffereau y colaboradores, EMBO J. 15 de Diciembre de 1998 ; 17 (24) : 7250-9; Jallet y colaboradores, J Virol. Enero de 1999; 73 (1) : 225-33; Wloch y colaboradores, Hum Gene Ther. 1 de Julio de 1998;9(10): 1439-47; Mellquist y colaboradores, Biochemistry. Mayo de 1998; 37 (19) : 6833-7; Morimoto y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S . 17 de Marzo de 1998 ; 95 (6) : 3152-6; Coll, Arch Virol. 1997 ; 142 (10) : 2089-97 ; Bracci y colaboradores, Blood. 1 de Noviembre de 1997 ; 90 (9) : 3623-8; Gaudin y colaboradores, J Virol. Noviembre de 1996;70(1 l):7371-8; Morimoto y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S . 28 de Mayo de 1996; 93 (11) : 5653-8 ; Mebatsion y colaboradores, Cell. 22 de Marzo de 1996; 84 ( 6) : 941-51; Shakin-Eshleman y colaboradores, J Biol Chem. 15 de Marzo de 1996; 271 (11) : 6363-6; Nadin-Davis y colaboradores, J Virol Methods. Marzo de 1996;57(1): 1-14. Erratum in: J Virol Methods 26 de Abril de 1996; 58 (1-2) : 209; Wojczyk y colaboradores, Protein Expr Purif. Marzo de 1996;7(2): 183-93; Suzuki y colaboradores, J Gen Virol. Diciembre de 1995;76 (Pt 12):3021-9; Raux y colaboradores, Virology. 10 de Julio de 1995; 210 (2) : 00-8; Kasturi, J Biol Chem. 16 de Junio de 1995; 270 (24) : 14756-61; Otvos y colaboradores y colaboradores, Biochim Biophys Acta. 29 -de Mayo de 1995; 1267 (1) : 55-64 ; Mebatsion y colaboradores, J Virol. Marzo de 1995; 69 (3) : 1444-51; Wojczyk B, Shakin-Eshle an SH, Doms RW, Xiang ZQ, - Ertl HC, Wunner WH, Spitalnik, Biochemistry. 28 de Febrero de 1995; 34 (8) : 2599-609; Ravkov y colaboradores, Virology. 10 de Enero de 1995;206 (1) : 718-23; Ni y colaboradores, Microbiol Immunol. 1995;39 (9) : 693-702; Coll, Arch Virol. 1995; 140 (5) : 827-51; Grabko y colaboradores, Dokl AkadNauk. Julio de 1994;337(1): 117-21; Sakamoto y colaboradores, Virus Genes. Enero de 1994; 8 (1) : 35-46; Fodor y colaboradores, Arch Virol. 1994; 135 (3-4) : 451-9; Ito y colaboradores, Microbiol Immunol . 1994;38 (6) :479-82; Shakin-Eshleman' y colaboradores, Biochemistry. , 14 de Septiembre de 1993; 32 (36) : 9465-72; Morimoto y colaboradores, Virology. Agosto de 1993; 195 (2) : 541-9; van der Heijden y colaboradores, J Gen Virol. Agosto de 1993;74 (Pt 8):1539-45; Nishihara y colaboradores, Gene. 30 de Julio de 1993; 129 (2) : 207-14; Rustici y colaboradores, Biopolymers. Junio de 1993;33 (6) :961-9; McColl y colaboradores, Aust Vet J. Marzo de 1993; 70 (3) : 84-9; Bai y colaboradores, Virus Res. Febrero de' 1993; 27 (2) : 101-12; Nishihara y colaboradores, Nippon Rinsho. Febrero de 1993; 51 (2) : 323- 8; -Bracci y colaboradores, FEBS Lett. 19 de Octubre de 1992;311 (2): 115-8; Tuchiya y colaboradores, Virus Res. 1 de Septiembre de 1992; 25 (1-2) : 1-13; Shakih-Eshle an y colaboradores, J Biol Chem. 25 de Mayo de 1992;267 (15) :10690-8; Whitt y colaboradores, Virology. Diciembre de 1991; 185 (2) : 681-8 ; Benmansour y colaboradores, J Virol. Agosto de 1991; 65 (8 ): 4198- 203; Burger y colaboradores, J Gen Virol. Febrero de 1991;72 (Pt 2):359-67; Dietzschold y colaboradores, J Virol. Agosto de 1990; 64 (8) : 3804-9; Becker, Virus Genes. Febrero de 1990; 3 (3) : 277-84; Prehaud y colaboradores, Virology. Diciembre de 1989; 173 (2) : 390-9 y Wang y colaboradores, Chin Med J (Engl) . Noviembre de 1989;102(1 l):885-9, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades, y se pueden utilizar en la . presente invención. Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede ser interrumpido por porciones químicas diferentes a los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo la formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un "componente de marcación o bioactivo. En otra modalidad, el gen de glicoproteína de rabia es cualquier gen de glicoproteína de rabia, con una secuencia de nucleótidos conocida, tal como glicoproteína G de virus de rabia, tal como las secuencias de nucleótidos en o derivadas de las secuencias de proteína en Marissen y colaboradores, J Virol. Abril del 2005; 79 (8 ): 4672-8; Dietzschold y colaboradores, Vaccine. 9 Diciembre del 2004 ; 23 (4) : 518-24; Mansfield y colaboradores, J Gen Virol. Noviembre del 2004 Nov;85(Pt ll):3279-83; Sato y colaboradores, J Vet Med Sci. Julio de 2004 Jul; 66 (7 ): 747- 53; Takayama-Ito y colaboradores, J Neurovirol. Abril del 2004 ; 10 (2) : 131-5; Li y colaboradores, Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. Diciembre del 2003;25 (6) : 650-4; Hemachudha y colaboradores, J Infect Dis. 1 de Octubre del 2003; 188 (7 ): 960-6; Kankanamge y colaboradores, Microbiol Immunol. 2003; 47 (7) : 507-19; Maillard y colaboradores, Virus Res. Junio del 2003 ; 93 (2) : 151-8 ; Irie y colaboradores, Microbiol Immunol. 2002; 46 (7) : 449-61; Langevin y colaboradores, J Biol Chem. 4 de Octubre del 2002;277 (40) :37655-62; Maillard y Gaudin, J Gen Virol. Junio del 2002;83(Pt 6): 1465-76; Holmes y colaboradores, Virology. 20 de Enero del 2002; 292 (2) : 247-57 ; Mebatsion, J Virol. Diciembre del 2001; 75 (23) : 1 1496-502; Zhang y colaboradores, Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. Septiembre del 2000;14 (3) :281-4; Ray y colaboradores, Clin Exp Immunol. Julio del 2001;125 (1) :94-101; Morimoto y colaboradores, Vaccine. 14 de Mayo del 2001; 19 (25-26) : 3543-51; Morimoto y colaboradores, J Neurovirol. Octubre del 2000; 6 (5) : 373-81; Bourhy y colaboradores, J Gen Virol. Octubre de 1999; 80 (Pt 10):2545-57; Kissi y colaboradores, J Gen Virol. Agosto de 1999;80 (Pt 8) -.2041-50; Nakahara y colaboradores, Microbiol Immunol. 1999; 3 (3) : 259-70; Matthews y colaboradores, J Gen Virol. Febrero de 1999;80 ( Pt 2):345-53; Tuffereau y colaboradores, EMBO J. 15 de Diciembre de 1998; 17 (24) : 7250-9; Jallet y colaboradores, J Virol. Enero de 1999; 73 (1) : 225-33; Wloch y colaboradores, Hum Gene Ther. 1 de Julio de 1998;9(10): 1439-47; Mellquist y colaboradores, Biochemistry. 12 de Mayo de 1998 ; 37 (19) : 6833-7 ; Morimoto y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S . 17 de marzo de 1998; 95 ( 6) : 3152-6; Coll, Arch Virol. 1997 ; 142 (10) : 2089-97; Bracci y colaboradores, Blood. 1 de Novimebre de 1997 ; 90 (9) : 3623-8; Gaudin y colaboradores, J Virol. Noviembre de 1996;70 (11) :7371-8; Morimoto y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S . 28 de mayo de 1996; 93 (11) : 5653-8; Mebatsion y colaboradores, Cell. 22 de Marzo de 1996; 84 (6) : 941-51; Shakin-Eshleman y colaboradores, J Biol Chem. 15 de Marzo de 1996 15;271(11) : 6363-6; Nadin- Davis y colaboradores, J Virol Methods. Marzo de 1996; 57 (1) : 1-14. ' Erratum in: J Virol Methods 26 de Abril de 1996; 58 (1-2) : 209; Wojczyk y colaboradores, Protein Expr Purif. Marzo de 1996;7(2): 183-93; Suzuki y colaboradores, J Gen Virol. Diciembre de 1995; 76 (Pt 12): 3021-9; Raux y colaboradores, Virology. 10 de Julio de 1995;210 (2) :400-8; Kasturi y colaboradores, J Biol Chem. 16 de Junio de 1995; 270 (24) : 14756-61; Otvos y colaboradores, Biochim Biophys Acta. 29 de Mayo de 1995; 1267 (1) : 55-64; Mebatsion y colaboradores, J Virol. Marzo de 1995;69(3): 1444-51; Wojczyk B, Shakin-Eshleman SH, Doms RW, Xiang ZQ, Ertl HC, Wunner WH, Spitalnik, Biochemistry. 28 de Febrero de 1995;34 (8) -.2599-609; Ravkov y colaboradores, Virology. 10 de Enero de 1995; 206 (1) : 718-23; Ni y colaboradores, Microbiol Immunol. 1995; 39 (9) : 693-702; Coll, Arch Virol. 1995;140 (5) : 827-51; Grabko y colaboradores, Dokl Akad Nauk. Julio de 1994; 337 (1) : 1 17-21; Sakamoto y colaboradores, Virus Genes. Enero de 1994; 8 (1) : 35-46; Fodor y colaboradores, Arch Virol. 1994; 135 (3-4) : 451-9; Ito y colaboradores, Microbiol Immunol . 199 ; 38 ( 6) : 479-82 ; Shakin-Eshleman y colaboradores, Biochemistry. 14 de Septiembre de 1993; 32 (36) : 9465-72; Morimoto y colaboradores, Virology. Agosto de 1993; 195 (2) : 541-9; van der Heijden y colaboradores, J Gen Virol. Agosto de 1993;74 (Pt 8): 1539-45; Nishihara y colaboradores, Gene. 30 de Julio de 1993; 129 (2) : 207-14 ; Rustici y colaboradores, Biopolymers. Junio de 1993;33 (6) : 961-9; McCoIl y colaboradores, Aust Vet J. Marzo de 1993; 70 (3) : 84-9; Bai y colaboradores, Virus Res. Febrero de 1993;27 (2) : 101-12; Nishihara y colaboradores, Nippon Rinsho. Febrero de 1993; 51 (2) : 323-8 ; Bracci y colaboradores, FEBS Lett. 19 de Octubre de 1992; 311 (2) : 115-8 ; Tuchiya y colaboradores, Virus Res. 1 de Septiembre de 1992; 25 (1-2) : 1-13; Shakin-Eshleman y colaboradores, J Biol Chem. 25 de Mayo de 1992;267 (15) : 10690-8; hitt y colaboradores, Virology. Diciembre de 1991; 185 (2) : 681-8; Benmansour y colaboradores, J Virol. Agosto de 1991; 65 (8) : 198-203; Burger y colaboradores, J Gen Virol. Febrero de 1991;72 (Pt 2):359- 67; Dietzschold y colaboradores, J Virol. Agosto de 1990; 64 (8) : 3804-9; Becker, Virus Genes. Febrero de 1990; 3 (3) : 277-8 ; Prehaud y colaboradores, Virology. Diciembre de 1989; 173 (2) : 390-9 y Wang y colaboradores, Chin Med J (Engl) . Noviembre de 1989; 102 (11) : 885-9, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades, y se pueden utilizar en la presente invención. Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contienen deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener estructura tridimensional, y pueden desempeñar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido incluye moléculas de dos hebras, una hebra, y triple hélice. A menos que de otra manera se especifique o requiera, cualquier modalidad descrita en la presente que es un polinucleótido abarca tanto la forma de dos hebras como cada una de las dos formas complementarias conocidas o predecidas para constituir la forma de dos hebras de ya sea el DNA, RNA o la molécula híbrida. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, mRNA, tRNA, rRNA, ribosomas, cDNA, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de cualquiera secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácido nucleico. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos . de enlace tal como fluororibosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser modificada adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcación. Otros tipos de modificaciones incluidos en esta definición son terminaciones, sustitución de uno o más de . los nucleótidos que ocurren naturalmente con un análogo, e introducción del medio para unir el polinucleótido a proteínas, iones de metal, componentes de marcación, otros polinucleótidos o soporte sólido. Un polinucleótido o polipéptido "aislado" es uno que está sustancialmente libre de materiales con el que se asocia en su medio ambiente nativo. Por sustancialmente libre, se propone por lo menos 50%, ventajosamente por lo menos 70%, más ventajosamente por lo menos 80% y aun más venta osamente por lo menos 90% libre de estos materiales. La invención además comprende una hebra complementaria a un polinucleótido de glicoproteína de rabia. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación. Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente "severidad". Las condiciones que incrementan la severidad de una reacción de hibridación son bien conocidas. Ver por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y colaboradores, 1989). Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (a fin de incrementar la severidad) : temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 500 °C, y 6. °C; concentraciones de solución reguladora de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (donde SSC es NaCl 0.15 M y solución reguladora de citrato 15 mM) y su equivalente utilizando otros sistemas de solución reguladora; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50%, y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, o agua desionizada. La invención además abarca polinucleótidos que codifican variantes y derivados funcionalmente equivalentes de polipéptidos de glicoproteína de rabia y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden aumentar, disminuir o no afectar significantemente las propiedades de los polipéptidos codificados de esta manera. Estas variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes exhiben la habilidad de retener la actividad de la glicoproteína de rabia. Por ejemplo, los cambios en la secuencia de DNA que no cambia la secuencia de aminoácidos codificada, así como aquellos que dan por resultado sustituciones conservadas de residuos de aminoácidos, una o unas pocas supresiones o adiciones de aminoácidos, y sustitución de residuos de aminoácido mediante análogos de aminoácidos son aquellos que no afectarán significantemente las propiedades del polipéptido codificado. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina, asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptofano. Para los propósitos de la presente invención, la identidad u homología de secuencia se determina al comparar las secuencias cuando se alinean a fin de maximizar la sobreposición e identidad mientras que se minimizan los espacios de secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar utilizando cualquiera de un número de algoritmos matemáticos. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de las secuencias es el algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, modificado como en Karlin & Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos ponderados PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de la similitud y alineación de secuencia local es el algoritmo FASTA como se describe en Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1988;85: 2444-2448. Ventajoso para el uso de acuerdo con la presente invención es el software de versión 2.0 WU-BLAST (Washington University BLAST). Los programas ejecutables de versión 2.0 WU-BLAST para varias plataformas UNIX se pueden descargar de ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa está basado sobre la versión 1.4 WU-BLAST, que a su vez está basado sobre la versión 1.4 NCBI-BLAST de dominio público (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul y colaboradores, Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993,-Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; todas las cuales se incorporan por referencia en la presente) . En general, la comparación de secuencias de aminoácidos se logra al alinear una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de estructura desconocida. Los aminoácidos en la secuencia luego se comparan y los grupos de aminoácidos que son homólogos se agrupan conjuntamente. Este método detecta las regiones conservadas de los polipéptidos y tiene en cuenta las inserciones y supresiones de aminoácidos. La homología entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar al utilizar algoritmos comercialmente disponibles (ver también la descripción de homología en lo anterior) .

Además de aquellos de otra manera mencionados en la presente, la mención también se hace de los programas BLAST, BLAST espaciado, BLASTN, BLASTP, y PSI-BLAST, proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología. Estos programas se utilizan ampliamente en la técnica para este propósito y pueden alinear regiones homologas de dos secuencias de aminoácidos. En todos los programas de búsqueda en el conjunto, las rutinas de alineación espaciadas son integrales a la investigación de la base de datos por si misma. El espaciado puede ser inactivado si se desea. La sanción de error (Q) para un espacio de longitud uno es Q=9 para proteínas y BLASTP, y Q=10' para BLASTN, pero se puede cambiar a cualquier número entero. La sanción por residuo de error para extender un espacio (R) es R=2 paira proteínas y BLASTP, y R=10 para BLASTN, pero se puede cambiar a cualquier número entero. Cualquier combinación de valores para Q y R se puede utilizar a fin de alinear las secuencias a fin de maximizar la sobreposición e identidad mientras que se minimizan los espacios de secuencia. La matriz de comparación de aminoácidos de error es BLOSUM62, pero otras matrices de comparación de aminoácidos tal como PAM se pueden utilizar. Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre las dos secuencias. El por ciento de homología de secuencia se puede calcular como (Nxef - Nd±f) *100/Nxef, en donde N^if es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nrer es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de DNA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2) . Alternativamente o adicionalmente, "homología o "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divididos entre el número de nucleótidos y aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde la alineación de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman-, (Wilbur & Lipman, Proc Nati Acad Sci USA 1983; 80: 726, incorporada en la presente por referencia), por ejemplo, utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una sanción de espacio de 4, y el análisis e interpretación asistido por computadora de los datos de secuencia que incluyen la alineación se pueden realizar convenientemente utilizando los programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando las secuencias de RNA se dicen que son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de DNA, la timidina (T) en la secuencia de DNA es considerada igual al uracilo (U) en las secuencias de RNA. Así, las secuencias de RNA están dentro del alcance de la invención y se pueden derivar de la secuencia de DNA, mediante la timidina (T) en la secuencia de DNA que es considerada igual a uracilo (U) en la secuencia de RNA. Y, sin experimentación indebida, la persona experta puede consultar con muchos otros programas o referencias para determinar el por ciento de homología. La invención además abarca una glicoproteína de rabia contenida en una molécula de vector o un vector de expresión y enlazada operablemente a un mejorador y/o un elemento promotor si es necesario. En una modalidad ventajosa, el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV). En otra modalidad, los mejoradores y/o promotores incluyen varios promotores específicos de célula o tejido, varios promotores virales y mejoradores y varias secuencias de DNA de glicoproteína de rabia isogénicamente específicas para cada especie de animal. Un "vector" se refiere a un plásmido o virus de DNA o RNA recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que se suministra a una célula objetivo, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para propósitos de terapia y puede opcionalmente estar en la forma de un cásete de expresión. Como se utiliza en la presente, un vector no necesita ser capaz de replicación en la célula o sujeto objetivo final. El término incluye vectores de clonación para la traducción de una secuencia de codificación de polinucleótido. También se incluyen vectores virales. El término "recombinante" significa un polinucleótido de cDNA genómico, semisintético, o de origen sintético que ya sea que no ocurre en la naturaleza o sé enlaza a otro polinucleótido en un arreglo no encontrado en la naturaleza. "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la cual está siendo comparado. Por ejemplo, un polinucleótido, se puede colocar mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor removido de su secuencia de codificación nativa y enlazado operativamente a una secuencia de codificación diferente a la secuencia nativa es un promotor heterólogo. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de enlace de ribosoma, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo control del mismo o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homologa, y transformación de una célula hospedera, y cualquier construcción tal como puede ser deseable para proporcionar modalidades de esta invención. Elementos para la expresión de la glicoproteína de rabia están ventajosamente presentes es un vector inventivo. En la manera mínima, este comprende, consiste esencialmente, o consiste de un codon de iniciación (ATG) , un codon de detención y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores tal como plásmido y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales diferentes a los poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, glicoproteína de rabia, ventajosamente, en el vector, un ATG es colocado en el 5' de la estructura de lectura y un codon de detención es colocado en . 3' . Otros elementos para controlar la expresión pueden estar presentes, tales como secuencias mejoradoras, secuencias de estabilización y secuencias de señal que permiten la secreción de la proteína. Métodos para hacer y/o administrar un vector o recombinantes o plásmido para la expresión de los productos de gen de genes de la invención ya sea in vivo o in vitro puede ser cualquiera método deseado, por ejemplo, un método que es mediante o análogo a los métodos divulgados en, o divulgados en los documentos citados en: patentes norteamericanas Nos. 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; ,514,375; 5,744,140 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091 5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439 5,552,143; 5,580,859 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066 6,497,883; 6,464,984 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376 6,376,473; 6,368,603 6,348,196; 6,306,400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199; 6,090,393; 6,074,649; 6,045,803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450 y 6; 312,683; solicitud de patente norteamericana No. de Serie 920,197, presentada el 16 de Octubre de 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky y colaboradores, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 1996;93:11313-11318; Ballay y colaboradores, EMBO J. 1993;4:3861-65; Felgner y colaboradores, J. Bíol . Chem. 1994;269:2550-2561; Frolov y colaboradores, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 1996;93:11371-11377; Graham, Tibtech 1990;8:85-87; Grunhaus y colaboradores, Sem. Virol. 1992;3:237-52; Ju y colaboradores, Diabetologia 1998;41:736-739; Kitson y colaboradores, J. Virol. 1991;65:3068-3075; McClements y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93: 11414- 11420; Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11341-11348; Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11349-11353; Pennock y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 1984;4:399-406; Richardson (Ed) , Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols", Humana Press Inc.; Smith y colaboradores (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165; Robertson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93 : 11334- 11340; Robinson y colaboradores, Sem. Immunol . 1997; 9: 271; y Roizman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11307-11312. Así, el vector en la invención puede ser cualquier virus o vector de virus recombinante adecuado, tal como un poxvirus (por ejemplo, virus de vaccinia, virus avipox, virus canaripox, virus fowlpox, virus raccoonpox, virus swinepox, etc.), adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino) , herpesvirus, baculovirus, retrovirus, etc. (como en los documentos incorporados en la presente por referencia) ; o el vector puede ser un plásmido. Los documentos citados en la presente e incorporados en la presenté por referencia, además de proporcionar ejemplos de vectores útiles en la práctica de la invención, también pueden proporcionar fuentes para proteínas de glicoproteína no de rabia o fragmentos de las mismas, por ejemplo, proteínas de glicoproteína no de rabia o fragmentos de las mismas, citoquinas, etc. a ser expresadas por el vector o vectores, en, o incluidos en, las composiciones de la invención. La presente invención también se relaciona a preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender, consisten esencialmente de, o consisten de uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden, que consisten esencialmente o que consisten de (y ventajosamente que expresan) uno o más de unos polinucleótidos de glicoproteína de rabia y, ventajosamente, el vector contiene y expresa un polinucleótido que incluye, consiste esencialmente de, o consiste de una glicoproteína de rabia que codifica la región de codificación, en un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Así, de acuerdo a una modalidad de la invención, el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente de o consiste de un polinucleótido que codifica, y bajo circunstancias apropiadas el vector que expresa uno o más de otras proteínas de glicoproteína de rabia o un fragmento de las mismas. De acuerdo a otra modalidad, el vector o vectores en la preparación comprenden, o consisten esencialmente de, o consisten de polinucleótido (s) que codifican una o más proteínas o fragmento (s) de las mismas de glicoproteína de rabia, el vector o vectores han expresado el polinucleótido (s) . La preparación inventiva ventajosamente comprende, consiste esencialmente de o consiste de, por lo menos dos vectores que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten de, y ventajosamente también que expresan, ventajosamente in vivo bajo condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula hospedera adecuada, polinucleótidos de diferentes aislados de glicoproteína de rabia que codifican las mismas proteínas y/o para diferentes proteínas, pero ventajosamente para las mismas proteínas. Como en las preparaciones que contienen uno o más vectores que contienen uno o más vectores que contienen, que consisten esencialmente de o que consisten de polinucleótidos que codifican, y ventajosamente que expresan, ventajosamente in vivo, glicoproteína de rabia, o un epítope de la misma, es ventajoso que los productos de expresión sean de dos o tres o más aislados de glicoproteína de rabia diferente, venta osamente cepas. La invención también se dirige a mezclas de vectores que contienen, consisten esencialmente de, o consisten de codificación para, y expresan, diferentes proteínas de rabia. En una modalidad ventajosa, el vector es un vector viral, ventajosamente un vector de virus de vaccinia que contiene el gen de glicoproteína de rabia. Ventajosamente, la glicoproteína de rabia es glicoproteína G de rabia, ventajosamente, derivada de la cepa ERA. En una modalidad ventajosa, el virus de vaccinia puede ser una cepa Copenhagen y/o un fenotipo tkJ En una modalidad particularmente ventajosa, el vector es un vector de virus de vaccinia (cepa Copenhagen y fenotipo tk~) con la glicoproteína G de virus de rabia codificada en el mismo, ventajosamente Raboral V-RG.

En una modalidad particular el vector viral es un poxvirus, por ejemplo un virus de vaccinia un virus de vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida después de más de 570 pasos de la cepa de vacuna Ankara sobre fibroblastos de embrión de pollo, ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wsclir., 1971, 113, 1149-1153; Sutter y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, ver la patente norteamericana No. 5,494,807, por ejemplo, Ejemplos 1 al 6 y et seq de la patente norteamericana No. 5,494,807 que discute la construcción de NYVAC, así como variaciones de NYVAC con ORFs adicionales suprimidos del genoma del virus de vaccinia de cepa Copenhagen, así como la inserción de las moléculas de ácido nucleico de codificación heterólogas en los sitios de este recombinante, y también, el uso de promotores igualados; ver también WO96/40241) , un virus avipox o un virus avipox atenuado (por ejemplo, canaripox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC o TROVAC; ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,505,941, 5,494,807), swinepox, raccoonpox, camelpox, o virus de mixomatosis. De acuerdo a otra modalidad de la invención, el vector de poxvirus es un virus de canaripox o un vector de virus de fowlpox, ventajosamente un virus canaripox o virus fowlpox atenuado. En este respecto, se hace al canaripox disponible del ATCC bajo el número de acceso VR-111. Los virus de canaripox atenuados se describen en la patente norteamericana No. 5,756,103 (ALVAC) y WOO 1/05934. Las cepas de vacunación de virus fowlpox numerosas también son disponibles, por ejemplo la cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS VARIÓLE comercializada por INTERVET; y, la referencia también se hace a la patente norteamericana No. 5,766,599 que pertenece a la cepa fowlpox atenuada TROVAC. Para información sobre el método para generar recombinantes del mismo y como administrar los recombinantes del mismo, la persona experta puede referirse a documentos citados en la presente y al WO90/12882, por ejemplo, en cuanto al virus de vaccinia la mención se hace de las patentes norteamericanas Nos. 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112, 5,110,587, 5,494,807, y 5,762,938 inter alia; en cuanto al fowlpox, la mención se hace de las patentes norteamericanas Nos. 5,174,993, 5,505,941 y US-5,766,599 inter alia; en cuanto al canaripox la mención se hace de la patente norteamericana No. 5,756,103 inter alia; en cuanto al swinepox la mención se hace de la patente norteamericana No. 5,382,425 inter alia; y, en cuanto al raccoonpox, la mención se hace de WO00/03030 inter alia. Cuando el vector de expresión es un virus de vaccinia, el sitio o sitios de inserción para el polinucleótido o polinucleótidos a ser expresados son ventajosamente en el gen o sitio de inserción de quinasa timidina (TK) , el gen o sitio de inserción de hemaglutinina (HA) , la región que codifica el cuerpo de inclusión del tipo A (ATI) ; ver también los documentos citados en la presente, especialmente aquellos que pertenecen al virus de vaccinia. En el caso del canaripox, ventajosamente, el sitio o sitios de inserción son ORF(s) C3, C5 y/o C6; ver también los documentos citados en la presente, especialmente aquellos pertenecientes al virus de canaripox. En el caso del fowlpox, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son ORFs F7 y/o F8; ver también los documentos citados en la presente, especialmente aquellos pertenecientes al virus de fowlpox. El sitio o sitios de inserción para el área del virus de MVA ventajosamente como en varias publicaciones incluyendo Carroll M. W. y colaboradores, Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. y colaboradores, J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. y colaboradores, 1994, Vaccine, 12 (11) , 1032-1040; y, en este respecto también es notado que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, el cual permite a la persona experta usar otros sitios de inserción u otros promotores. Ventajosamente, el polinucleótido a ser expresado se inserta bajo el control de un promotor de poxvirus específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia 7.5 kDa (Cochran y colaboradores, J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor de vaccinia I3L (Ri iere y colaboradores, J. Virology, 1992, 66, 3424- 3434), el promotor de vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451 -457), el promotor de cowpox ATI' (Funahashi y colaboradores, J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), el promotor de vaccinia H6 (Taylor J. y colaboradores, Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y colaboradores, J. Virol., 1989, 63, 3829-3836), inter alia . Ventajosamente, para la vacunación de mamíferos el vector de expresión es un canaripox o un fowlpox. De esta manera, puede haber la expresión de las proteínas heterólogas con replicación limitada o no productiva. De acuerdo a una modalidad de la invención, el vector de expresión es un vector viral, en particular un vector de expresión in vivo. En una modalidad ventajosa, el vector de expresión es un vector de adenovirus, tal como un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV) . Ventajosamente, el adenovirus es un vector Ad5 humano, un adenovirus suprimido de El y/o interrumpido, un adenovirus suprimido de E3 y/o interrumpido o un adenovirus suprimido de El y E3 y/o interrumpido. Opcionalmente, el E4 puede ser suprimido y/o interrumpido de cualquiera de los adenovirus descritos en lo anterior. Por ejemplo, los vectores Ad5 humanos que expresan un gen de glicoproteína de rabia descritos en Yarosh y colaboradores y Lutze-Wallace y colaboradores se pude utilizar en métodos de la invención (ver, por ejemplo, Yarosh y colaboradores, Vaccine. 1996 Sep; 14(13): 1257-64 y Lutze-Wallace y colaboradores, Biologicals. 1995 Dec;23(4) -. 211-1 ) . En una modalidad el vector viral es un adenovirus humano, en particular un adenovirus de serotipo 5, vuelto incompetente para la replicación mediante una supresión en la región El del genoma viral. El adenovirus suprimido se propaga en las células' 293 que expresan El o células PER, en particular PER.C6 (F. Falloux y colaboradores Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917) . El adenovirus humano se puede suprimir en la región E3 eventualmente en combinación con una supresión en la región El. (ver por ejemplo, J. Shriver y colaboradores Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham y colaboradores Methods in Molecular Biology Vol. 7 : Gene Transfer y Expression Protocols Edited por E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128; Y. lian y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592; S. Tripathy y coalbroadores Proc. Nati. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199;X. Danthinne y colaboradores Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K. Berkner y colaboradores Nucí. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier y colaboradores J. Virol. 1996, 70, 4805-4810) . Los sitios de inserción pueden ser los sitios El y/o E3 eventualmente después de una supresión parcial o completa de las regiones El y/o E3. Ventajosamente, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido a ser expresado se inserta bajo , el control de un promotor funcional en células eucarióticas, tal como un promotor fuerte, preferiblemente un promotor de . gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor VMV-IE) . El promotor CMV-IE es ventajosamente de origen murino o humano. El promotor del factor de alargamiento la también se puede utilizar. En una modalidad particular un promotor regulado por hipoxia, por ejemplo el promotor HRE descrito en K. Boast y colaboradores Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208), se puede utilizar. Un promotor específico del músculo también se puede utilizar (X. Li y colaboradores Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245) . Los promotores fuertes también se discuten en la presente en relación a los vectores de plásmido. Una secuencia poly (A) y la secuencia terminadora se pueden insertar corriente abajo del polinucleótido a ser expresado, por ejemplo un gen de hormona de crecimiento bovino o una señal de poliadenilación de gen de ß-globina de conejo. En otra modalidad el vector viral es un adenovirus canino, en particular un CAV-2 (ver, por ejemplo, L. Fischer y colaboradores Vaccine, 2002, 20, 3485-3497; patente norteamericana No. 5,529,780; patente norteamericana No. ,688,920; solicitud de PCT No. WO95/14102) . Para CAV, los sitios de inserción pueden estar en la región E3 yo en la región localizada entre la región E4 y la región ITR derecha (ver la patente norteamericana No. 6,090,393; patente norteamericana No. 6,156,567). En una modalidad la inserción está bajo el control de un promotor, tal como un promotor de gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor CMV-IE) o un promotor ya descrito para un vector de adenovirus humano. Una secuencia poly (A) y la secuencia terminadora se pueden insertar corriente abajo del polinucleótido a ser expresado, por ejemplo un gen de hormona de crecimiento bovino o una señal de poliadenilación del gen de ß-globina de conejo. En otra modalidad particular el vector viral es un herpes virus tal como un herpesvirus canino (CHV) o un herpesvirus canino (FHV) . Para el CHV, los sitios de inserción pueden estar en particular en el gen de timidina quinasa, en la ORF3, o en la ORF de UL43 (ver la patente norteamericana No. 6,159,477). En una modalidad el polinucleótido a ser expresado se inserta bajo el control de un promotor funcional en las células eucarióticas, ventajosamente un promotor CMV-IE (murino o humano) . En una modalidad particular un promotor regulado por hipoxia, por ejemplo el promotor HRE descrito en K. Boast y colaboradores Human Gene Therapy 1999, 13,2197-2208), se puede utilizar. Una secuencia poly (A) y la secuencia terminadora se pueden insertar corriente abajo del polinucleótido a ser expresado, por ejemplo hormona de crecimiento bovino o una señal de poliadenilación del gen de ß-globína de conejo. De acuerdo a todavía una modalidad adicional de la invención, el vector de expresión es un vector de plásmido o un vector de plásmido de DNA, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo específico, no limitativo, el plásmido pVR1020 o el plásmido 1012 (VICAL Inc.; Luke C. y colaboradores, Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. y colaboradores, Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217) se puede utilizar como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 se deriva del pVR1012 y contiene la secuencia de señal tPA humana . El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de DNA que comprende un polinucleótido de acuerdo a la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del hospedero u objetivo deseado; y, en este respecto, se menciona que un plásmido circular, superenrrollado o no superenrrollado, así como una forma lineal, se proponen estar dentro del alcance de la invención. Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente de, además del polinucleótido que codifica una variante, análogo o fragmento de glicoproteína de rabia, operablemente enlazado a un promotor o bajo un el control de un promotor o dependiente en un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en las células eucarióticas. El promotor fuerte preferido es el promotor de citomegalovirus temprano intermedio (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente que tiene otro origen tal como la rata o cobayo. El promotor de VMV-IE puede comprender la parte de promotor actual, que puede o no puede ser asociada con la parte mej oradora. La referencia se puede hacer a EP-A-260 148, EP-A-323 597, patentes' norteamericanas Nos. 5,168,062, 5,385,839, y 4,968,615, así como la solicitud de PCT No WO87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart M. y colaboradores, Cell., 1985, 41, 521-530) o CMV-IE murino. En términos más generales, el promotor tiene ya sea un origen viral o celular. Un promotor viral fuerte diferente al CMV-IE que puede ser empleado útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus de sarcoma Rous. Un promotor celular fuerte que se puede emplear útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa M. y colaboradores, Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), o el promotor de actina (Miyazaki J. y colaboradores, Gene, 1989, 79, 269-277) .

Los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad de promoción adecuada, se incluyen dentro de la presente invención, por ejemplo los promotores CMV-IE truncados de acuerdo a la solicitud de PCT No. WO98/00166 o patente norteamericana No: 6,156,567 se pueden utilizar en la práctica de la invención. Un promotor en la práctica de la invención consecuentemente incluye derivados y sus fragmentos de un promotor de longitud completa que mantiene una actividad de promoción adecuada y por consiguiente funciona como un promotor, preferiblemente que promueve la actividad sustancialmente similar a aquella del promotor actual o de longitud completa del cual el derivado o su fragmento se deriva, por ejemplo, semejante a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la patente norteamericana No. 6,156,567 a la actividad de los promotores CMV-IE de longitud completa. Así, un promotor CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente de consistir de la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción mej oradora del promotor de longitud completa, así como derivados y subfragmentos. Ventajosamente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente de otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar secuencia (s) de estabilización, por ejemplo, secuencia (s) de intrones, preferiblemente el primer intrón de hCMV-IE (solicitud del PCT No. WO89/01036) , el intrón II del gen de ß-globina de conejo (van Ooyen y colaboradores, Science, 1979, 206, 337-344) . En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y los vectores virales diferentes a los poxviruses, el uso puede ser más hecho de la señal de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) {ver la patente norteamericana No. 5,122,458), o la señal de poli (A) del gen de ß-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40. De acuerdo a otra modalidad de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión utilizados para la expresión in vitro de proteínas en un sistema de células apropiado. Las proteínas expresadas se pueden cosechar en o del sobrenadante de cultivo después, o no después de la secreción (si no hay secreción una lisis de célula típicamente ocurre o se realiza) , opcionalmente concentrada por los métodos de concentración tales como ultrafiltración y/o purificadas por medio de purificación, tal como afinidad, intercambio iónico o métodos de cromatografía de tipo de filtración de gel. Es entendido para uno de habilidad en la técnica que las condiciones para cultivar una célula hospedera varían de acuerdo al gen particular y que la experimentación de rutina es necesaria a veces para determinar las condiciones óptimas para cultivar glicoproteína de rabia dependiendo de la célula hospedera. Una "célula hospedera" denota una célula procariótica o eucariótica que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se refiere a células genéticamente alteradas, el término se refiere a tanto la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada se pueden insertar en un vector de clonación o expresión adecuado, y el vector a su vez se puede introducir en una célula hospedera adecuada para la replicación y amplificación. Los polinucleótidos se pueden introducir en las células hospederas mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contiene los polinucleótidos de interés se pueden introducir en la célula hospedera mediante cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo captación directa, endocitosis, transfección, f-acoplamiento, electroporación, transfección que emplea cloruro de calcio, cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral). La elección para introducir los vectores o polinucleótidos frecuentemente dependerá en las características de la célula hospedera . En una modalidad ventajosa, la invención proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación para suministro y expresión de glicoproteína de rabia en una célula objetivo. La determinación de la cantidad terapéuticamente efectiva es rutina de experimentación para uno de habilidad ordinaria en la técnica. En una modalidad, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa la glicoproteína de rabia y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En una modalidad ventajosa, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína . Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0.9% (por ejemplo, solución salina) o una solución reguladora de fosfato. Otro portador o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden utilizar para los métodos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli- (L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada de un vector inventivo in vitro) ; ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína) . La dosis o volúmenes de dosis se discuten en la presente en la descripción general y también se pueden determinar por la persona experta de esta lectura de descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin cualquier experimentación indebida. Los lípidos catiónicos que contiene una sal de amonio cuaternaria que son ventajosamente pero no exclusivamente adecuados para los plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula: en la cual Ri es un radical alifático de cadena recta saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene de 2 a 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo el DMRIE. En otra modalidad el lípido catiónico se puede asociar con un lípido neutro, por ejemplo el DOPE. Entre estos lípidos catiónicos, la preferencia se da a DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N, N-dimetil-2, 3-bis (tetradeciloxi) -1-propano-amonio; WO96/34109) , ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amine; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5,382-389), para formar DMRIE-DOPE. Ventajosamente, la mezcla de plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea y de manera ventajosa contemporáneamente con la administración de la preparación o brevemente antes de la administración de la preparación; por ejemplo, brevemente antes o antes de la administración, la mezcla de plásmido-adyuvante se forma, ventajosamente a fin de dar insuficiente tiempo antes de la administración para la mezcla para formar un complejo, por ejemplo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración. . . Cuando el DOPE está presente, la relación molar de DMRIE:DOPE es de manera ventajosa aproximadamente 95 : aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, más de manera ventajosa aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1. La relación en peso de DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante: plásmido puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5 y de manera ventajosa de aproximadamente 1 : aproximadamente 1 y aproximadamente 1 : aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2. En una modalidad específica, la composición farmacéutica se administra directamente in vivo, y el producto codificado se expresa por el vector en el hospedero. Los métodos de suministro in vivo de un vector que codifica la glicoproteína de rabia (ver, por ejemplos, patente norteamericana No. 6,423,693; publicaciones de patente EP 1052286, EP 1205551, publicación de patente norteamericana 20040057941, WO 9905300 y Draghia-Akli y colaboradores, Mol Ther. 2002 Dec; 6 ( 6) : 830-6; las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades) se puede modificar para suministrar una glicoproteína de rabia de la presente invención a un perro. El suministro in vivo de un vector que codifica la glicoproteína de rabia descrito en la presente se puede lograr mediante uno de habilidad ordinaria en la técnica dadas las enseñanzas de las referencias mencionadas en lo anterior. Ventajosamente, las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas de acuerdo a la invención comprenden o consisten esencialmente de o consisten de una cantidad efectiva para inducir una respuesta terapéutica de uno o más vectores y/o polipéptidos de expresión como se discute en la presente: y, una cantidad efectiva se puede determinar de esta descripción, incluyendo los documentos incorporados en la presente, y el conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida. Un experto en la técnica puede determinar la dosis de plásmido efectiva a ser utilizada para cada protocolo de inmunización y vacunación y especie de esta descripción y el conocimiento en la técnica. En una modalidad ventajosa, las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas de acuerdo a la invención se administran oralmente. En una modalidad particularmente ventajosa, las composiciones orales se administran como un cebo. Por ejemplo, el cebo puede comprender un cubo de polímero de harina de pescado (1.25 pulgadas por 0.75 pulgadas) que es hueco. Un saco, o un paquete de plástico, que contiene la vacuna de rabia se puede insertar en el área hueca del cebo y sellar con cera. La harina de pescado es atractiva para los zorrillos y/o mangostas y es suficientemente fuerte para soportar la distribución del vuelo de aeroplanos a baja altitud (por ejemplo aproximadamente 500 pies) . Cuando un zorrillo o magosta encuentra el cebo y lo muerde, el saco se rompe, permitiendo a la vacuna entrar a la boca del zorrillo. Los zorrillos o mangostas luego se pueden vacunar contra la rabia mediante esta ruta oral. También en relación con tal composición terapéutica, a partir de la descripción en la presente y el conocimiento en la técnica, la persona experta puede determinar el número de administraciones, la ruta de administración y las dosis a ser utilizadas para cada protocolo de inyección, sin cualquier experimentación indebida. En otra modalidad ventajosa, las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas de acuerdo a la invención se administran nasalmente. Los métodos para la administración intranasal de vacunas en los zorrillos son bien conocidos por uno de habilidad en la técnica y pueden ser extrapolados a las mangostas (ver, por ejemplo Rupprecht y colaboradores, J Wildl Dis. 1990 Jan; 26 (1) : 99-102) y Toisón y colaboradores, Can J Vet Res. -1988 Jan; 52 (1) : 58-62, las descripciones las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades) . El método incluye por lo menos una administración a un animal de una cantidad eficiente de la composición terapéutica de acuerdo a la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra preñada y recién nacido. Esta administración se puede hacer notablemente mediante la inyección intramuscular (IM) , intradérmica '(ID) o subcutánea (SC) o por la vía de administración intrasanal u oral. En una modalidad ventajosa, la administración es oral, ventajosamente como una formulación de cebo. En una modalidad alterna, la composición terapéutica de acuerdo a la invención se puede administrar mediante una jeringa o un aparato sin aguja (similar a, por ejemplo Pigjet, Biojector o Vitaje (Bioject, Oregon, USA)). Otro procedimiento para administrar el plásmido es' usar la electroporación, ver, por ejemplo S. Tollefsen y colaboradores Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen y colaboradores Scand. J. Immunol . , 2003, 57, 229-238; S. Babiuk y colaboradores, Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; solicitud del PCT No. WO99/01158. La invención se relaciona al uso de las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de rabia y de animales silvestres, ventajosamente zorrillos y/o mangostas. La seguridad de una vacuna oral para la rabia, por ejemplo, Raboral V-RG, ya ha sido probada en zorrillos de rayas necesariamente para satisfacer las regulaciones de la USDA (ver, por ejemplo, Mackowiak y colaboradores, Adv Vet Med. 1999;41:571-83, la descripción de la cual se incorpora por referencia en su totalidad) . Mientras que la invención ha sido descrita por referencia a métodos. y modalidades .específicas, tal descripción es para propósitos ilustrativos únicamente. Las palabras utilizadas son palabras de descripción antes de limitación. Va a ser entendido que los cambios y variaciones pueden ser hechos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención, que se expone en las siguientes reivindicaciones. La invención ahora será descrita por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1: Resultados de la estimulación de zorrillo 16.6 semanas (116 días) de post estimulación Zorrillos se inmunizaron con una dosificación de 108-°TCID50/1.5 ml de Raboral V-RG mediante la ruta oral o en un saco recubierto utilizando una dosificación comparable aquella utilizada exitosamente para inmunizar mapaches. Los zorrillos se estimularon con el virus de rabia mediante la inyección de 0.5 ml en cada músculo masetero. El virus de estimulación de rabia R98-0100 AB (log 106'3 MICLD50/ml) se diluyó 1:25 con 2% de suero de caballo en PBS después de la inmunización. Los resultados del estudio de estimulación son como sigue: siete (7) de siete (7) controles no inmunizados murieron tres semanas después de la estimulación que indica una proporción de mortalidad de 100%. Cuatro (4) de cinco (5) zorrillos que comen un (1) saco recubierto que contiene el virus VRG (108'° por dosis) murieron por la semana seis (6) de post-estimulación, como lo hicieron 100% de los cinco (5) de cinco (5) zorrillos que comen tres (3) sacos recubiertos que contiene VRG (108'° por dosis) . Sin embargo, cuatro (4) de seis (6) zorrillos que reciben 108' de Raboral V-RG por dosis dada mediante la instilación directa por la vía de la ruta oral sobrevivieron a esta estimulación severa (33% de mortalidad) . Estos resultados indican que el Raboral V-RG induce una respuesta inmune protectora contra la rabia en zorrillos cuando se administra por la vía de una ruta oral. Ejemplo 2: Eficacia de Una Vacuna de Rabia Oral de Vector de Vaccinia en Zorrillos de Rayas (Mephitis mephitis) La rabia es una infección encefalítica viral fatal que afecta tanto los mamíferos silvestres y domésticos y es transmisible a humanos. Las poblaciones de zorrillos de rayas (Mephi tis mephitis) y - el mapache ( Procyon lotor) son los depósitos de rabia de la vida silvestre principales en el este de los Estado unidos (U.S.), posiblemente compartiendo sitios epizoóticos por la vía del rebosamiento de variantes de especies-específicas (Guerra y colaboradores, 2003, Emerging Infectous Diseases 9: 1143-1150). En California y los Estados Unidos central, tres variantes de rabia son responsables para esta enfermedad en zorrillos (Krebs, y colaboradores, 2004, Journal of the American Veterinary Medical Associa tion 225:1837-1849). En Europa, un postvirus recombinante oralmente administrado, V-RG, se ha mostrado que es una vacuna efectiva en el control de la rabia del zorro rojo ( Vulpes vulpes) (Brochier y colaboradores, 2001, Ann Med Vet 145:293- 305) . Esta misma vacuna oral basada en vaccinia, contenida dentro de los cebos de polímero de harina de pescado, muestra la promesa en controlar la rabia en las poblaciones de tejones de los Estados Unidos (Hanlon y colaboradores, 1998, Journal of Wildlife Diseases 34:228-239) . También ha contribuido a la eliminación de la rabia del coyote en el sur de Texas (Fearneyhough, y colaboradores, 1998, Journal of the American Veterinary Medical Associa tion 212:498-502). El control de la rabia en las poblaciones de zorrillos, sin embargo, continúa siendo un objetivo elusivo. Las vacunas de rabia vivas modificadas, históricamente utilizadas en Europa y Canadá para controlar la rabia de zorro, son inefectivas y potencialmente patogénicas en zorrillos (Rupprecht y colaboradores, 1990, Journal of Wildlife Diseases 26:99-102; Toisón y colaboradores, 1990, Canadian Journal of Veterinary Research 54: 178-183) . La vacuna de rabia de vector de vaccinia es segura en estas especies pero ha sido sugerida que es inefectiva (Charlton y colaboradores, 1992, Archives of Virology 123:169-179). Esta declaración está en contraste a un estudio en el que la eficacia se demostró en zorrillos que se les dieron títulos relativamente altos (109"° pfu/dosis) de virus mediante rutas múltiples (Toisón y colaboradores, 1987, Canadian Journal of Veterinary Research 51:363-366). El presente estudio se condujo para determinar si una serie comercial del virus de vaccinia recombinante, cuando se dio mediante la ruta oral, podría proteger a los zorrillos enjaulados contra una estimulación de rabia virulenta. La dosis de campo del mapache de 107'7 TCID50/ml se eligió, contenida en un volumen de 1.5 a 2.0 ml, dada por la instilación directa y dentro de un saco recubierto. Los zorrillos enjaulados se utilizaron para permitir la observación directa del consumo del cebo. La eficacia de la instilación oral directa de la vacuna se comparó a la eficacia de la vacuna suministrada dentro de un cebo. Veintitrés (23) zorrillos rayados adultos (Mephitis mephi tis) entre las edades de 1 y 5 años, obtenidos de una fuente comercial (Ruby's Fur Farm, New Sharon, Iowa, USA) se alojaron individualmente en jaulas de acero inoxidable, se les ofreció una ración felina comercial y se les proporcionó agua ad libitum . Después de un período de aclimatación de aproximadamente 2 meses, durante el cual se acostumbraron a varios formatos de cebo, los animales se asignaron aleatoriamente a uno de los cuatro grupos de tratamiento. Un grupo de siete zorrillos permaneció no vacunado. Los zorrillos vacunados recibieron 1.5 a 2.0 ml de una serie de producción de (Rabies Vaccine, Live Vaccinia Vector; trade ñame: Raboral V-RG®, Merial Limited, Athens, GA) conteniendo 107'7 TCID5o/ml. Dos grupos de cinco zorrillos cada uno se les ofreció ya sea un saco recubierto solo o un total de tres sacos, se les dio como dosis individual, sobre tres días consecutivos. Otro grupo de seis zorrillos recibió 1.5 ml de dosis de vacuna, equivalente a los contenidos de un saco solo, mediante la instilación oral por la vía de una jeringa libre de agua de 3.0 ml bajo cesación ligera mediante la administración intramuscular de clorhidrato de medetomidina (0.02 mg/kg), clorhidrato de cetamina (5 mg/kg). Los reflejos de tragamiento se observaron en los zorrillos que reciben la vacuna mediante la instilación directa. Los zorrillos que consumen sacos se observaron y se registraron para la aceptación del cebo. El título de la vacuna se confirmó post administración mediante la titulación en el cultivo de célula. Las muestras de sangre se recolectaron por la vía de la vena yugular de los zorrillos sedados tres días antes de la vacunación, 32 días post-vacunación y sobre el día de la estimulación (116 días post-vacunación). Los sueros se evaluaron para los anticuerpos que utilizan el virus de rabia (VNA) utilizando la Prueba de Inhibición de Foco Fluorescente Rápido (RFFIT) (Smith y colaboradores, 1996, A rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for determining rabies virus-neutralízíng antíbody. In Laboratory techniques in rabies, 4th Edition, F.-X. Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (eds.). World Health Organization, Geneva, Suiza, pp.l 81-92) . Para la estimulación de rabia, cada zorrillo se le administró el material del virus de rabia mediante la inyección intramuscular de 0.5 ml de extracto de virus de rabia (aislado de zorrillo, cepa R98-0100, log 106'3 MICLD5o/ml) bilateralmente, en cada músculo masetero. Los zorrillos se observaron diariamente durante 56 días post-estimulación para signos clínicos de rabia. Los animales se 1 eutanizaron mediante la inyección intracardíaca de pentobarbital de sodio ( (300 mg/kg) después de la administración intramuscular de clorhidrato de cetamina (2.2 mg/kg) y maleato de acepromazina (0.02 mg/kg). El diagnóstico de rabia se confirmó post-mortem al someter el tejido del cerebro al manchado inmunofluorescente directo con el anticuerpo monoclonal de antivirus de rabia (Velleca y Forrester, 1981, Detection and identification. In Laboratory methods for detection rabies. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for disease control, Atlanta, Georgia, pp. 69-107) . La recolección de las muestras de sangre y la administración del virus de estimulación se realizó bajo sedado profundo después de la administración intramuscular de 0.04-mg/kg de clorhidrato de medetomidina (Pfizer Animal Health, Inc., Westchester, PA, USA) y 10 mg/kg clorhidrato de quetamina (Fort Dodge Laboratories, Inc., Fort Dodge, Iowa, USA) . Todo el cuidado y procedimientos experimentales de los animales se realizaron en conformidad con las Guías de Cuidado y Uso Institucional de Animales establecido.

Los datos RFFIT y la proyección contra los resultados de la estimulación de rabia se resumen en la Tabla 1. Seis de seis (100%) de zorrillos naturales sucumbieron a la estimulación (tiempo de supervivencia medio = 17 días post-estimulación) . Cuatro de seis (67%) zorrillos que recibieron la vacuna mediante la instilación oral sobrevivieron a la estimulación. En este grupo, el VNA de rabia estuvo presente en los cuatro zorrillos que sobrevivieron a 32 días post-vacunación (GMT=1.2), y se declinaron a los niveles de la línea de base o residual (GMT=0.40) por el día de la estimulación (116 días postvacunación) . Los dos zorrillos en este grupo que no sobrevivieron a la estimulación (tiempo de supervivencia medio = 16 días), no lograron la seroconversión después de la vacunación. Uno de estos zorrillos (S 19) se notó que había recibido menos que la dosis completa de la vacuna debido a la sedación insuficiente. Todos los diez zorrillos que se les ofreció los sacos recubiertos rápidamente aceptaron el cebo. La aceptación se registró como el consumo del saco completo (es decir ninguna parte restante en la jaula) o la perforación del material de plástico y la ausencia de los contenidos de vacuna. Los VNAs de rabia no se detectaron en los sueros de los cinco zorrillos que ingieren dosis múltiples de vacuna ofrecidas en un saco recubierto tampoco cualquiera de este grupo sobrevivió a la estimulación (0 de , o 0% de supervivencia con un tiempo de supervivencia medio de 21 días, intervalos = 17 a 26 días) . Del mismo modo, ninguno de los cinco zorrillos que ingiere un saco solo desarrolló el VNA contra la rabia. Sin embargo, en este grupo un zorrillo (1 de 5, o 20%) sobrevivió a la estimulación de rabia; sugiriendo que la vacuna suficiente se consumió para inducir la inmunidad. Los tejidos del cerebro de 18 zorrillos sospechosos de rabia fueron positivos para la reactividad con el anticuerpo monoclonal de virus de rabia mediante la fluorescencia directa. Dos muestras de tejido cerebro recolectadas de los 'cinco zorrillos sobrevivientes a 56 días post-estimulación fueron negativas para la detección de antígenos de virus de rabia. Este estudio mostró que la instilación oral directa del Raboral V-RG® a 107"7 TDCID50/1.5 ml de dosis protegió 67% de zorrillos contra una estimulación de virus de rabia virulento. La vacuna fue inmunogénica y eficaz en un grupo pequeño de zorrillos domésticamente criados en un título utilizado para la aplicación de campo en los tejones. Aunque diez zorrillos fácilmente consumieron los sacos recubiertos de harina de pescado, la estimulación subsecuente de estos animales reveló pobre eficiencia de suministro de vacuna si uno o tres sacos se comieron (es decir, 90% y 100% mortalidad, respectivamente) . En este estudio, así como durante los experimentos de campo de vacuna del zorro rojo en Europa (Brochier y colaboradores 1990, Veterinary Record 127: 165.-167), se mostró que el suministro- de vacuna directamente impacta la evaluación de la eficacia de la vacuna oral. Estos resultados demuestran el valor de utilizar la instilación directa para evaluar las vacunas orales en una especie objetivo. La evaluación de una vacuna oral en un cebo elegido es crítica para la eficacia en el campo pero la serología post-cebado y los datos de frecuencia de rabia permanecen en las medidas indirectas de la eficacia de la vacuna. La vacuna de rabia oral de vector de vaccinia, RABORAL V-RG® como se formula para el uso en tejones, es capaz de proteger un porcentaje de zorrillos contra la rabia. El V-RG puede probar que es una vacuna de rabia oral efectiva para los zorrillos de rayas. La ventaja logística para distribuir una vacuna en el medio ambiente para inmunizar tanto tejones como zorrillos es un ahorro de costo obvio para este procedimiento. Los estudios de campo en las poblaciones silvestres de zorrillos que utilizan los sacos recubiertos rellenos de vacuna proporcionarán datos adicionales en cuanto a la conveniencia de este formato de cebo para estas especies . Tabla 1. Anticuerpos que neutralizan el virus de rabia y protección de la estimulación de rabia en zorrillos después de la captación de la vacuna V-RG mediante instilación oral directa y aceptación del cebo.

* Los resultados se expresan en IU/ml. S = sobreviviente, R = •muerto o eutanizado después de los signos de rabia (día de muerte/eutanasia después de la estimulación) . *** La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes párrafos numerados : 1. Un método para inducir una respuesta inmune en un zorrillo o mangosta que comprende administrar una composición que comprende un vector viral que comprende un gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en el genoma de vector viral en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en el zorrillo o mangosta. 2. El método del párrafo 1 en donde el vector comprende un virus de vaccinia vivo modificado. 3. El método del párrafo 1 en donde el gen de glicoproteína de superficie de rabia es glicoproteína G de rabia. 4. El método del párrafo 3 en donde ' la glicoproteína G de rabia se deriva de una cepa ERA. 5. El método del párrafo 2 en donde el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen. 6. El método del párrafo 2 en donde el virus de vaccinia tiene un fenotipo tk-. 7. El método del párrafo 2 en donde el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen y tiene un fenotipo tk". 8. El método del párrafo 2 en donde el virus de vaccinia vivo modificado es Raboral V-RG. 9. El método de los párrafos 1 al 8 en donde la administración es oral. 10. El método del párrafo 9 en donde la administración oral es mediante un cebo. 11. El método del párrafo 10 en donde el cebo comprende un cubo de polímero hueco. 12. El método del párrafo 11 en donde la composición se inserta en el cubo de polímero hueco. 13. Un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora en un zorrillo "o en una mangosta que comprende administrar una composición que comprende un vector viral que comprende un gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en el genoma del vector viral en una cantidad efectiva para inducir la respuesta en el zorrillo o mangosta. 14. El método del párrafo 13 en donde el vector comprende un virus de vaccinia vivo modificado. 15. El método del párrafo 13 en donde el gen de glicoproteína de superficie de rabia es glicoproteína G de rabia. 16. El método del párrafo 15 en donde la glicoproteína G de rabia se deriva de una cepa ERA. , 17. El método del párrafo 14 en donde el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen. 18. El método del párrafo 14 en donde el virus de vaccinia tiene un fenotipo tk-. 19. El método del párrafo 14 en donde el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen y tiene un fenotipo tk-. 20. El método del párrafo 14 en donde el virus de vaccinia vivo modificado es Raboral V-RG. 21. El método de los párrafos 13 al 20 en donde la administración es oral. 22. El método del párrafo 21 en donde la administración oral es mediante un cebo. 23. El método del párrafo 22 en donde el cebo comprende un cubo de polímero hueco. 24. El método del párrafo 23 en donde la composición se inserta en el cubo de polímero hueco. 25. El método de cualquiera de los párrafos 1 al 24 en donde la respuesta inmune, inmunológica o protectora es en un zorrillo. 26. El método de cualquiera de los párrafos 1 al 24 en donde la respuesta inmune, inmunológica o protectora es en una mangosta. 27. Un equipo para realizar el método de cualquiera de los párrafos 1 al 26 que comprende la composición de los párrafos 1 al 26 e instrucciones para realizar el método. *** Habiéndose descrito de esta manera en detalle las modalidades ventajosas de la presente invención, va a ser entendido que la invención definida por los párrafos anteriores no va a ser limitada a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya que muchas variaciones evidentes de la misma son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir una respuesta inmune en un zorrillo o mangosta, caracterizado porque comprende administrar una composición que comprende un vector viral que comprende un gen de glicoproteína de superficie de rabia insertado en el genoma del vector viral en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en el zorrillo o mangosta.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector comprende un virus de vaccinia vivo modificado.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de glicoproteína de superficie de rabia es glicoproteína G de rabia.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la glicoproteína G de rabia se deriva de una cepa ERA.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen.
6. 6. El método • de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el virus de vaccinia tiene un fenotipo tk-.
7. 7. El 'método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el virus de vaccinia es una cepa Copenhagen y tiene un fenotipo tk-.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el virus de vaccinia vivo modificado es Raboral V-RG.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque la administración es oral.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la administración oral es mediante un cebo.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el cebo comprende un cubo de polímero hueco.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la composición se inserta en el cubo de polímero hueco.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la respuesta inmune se induce en un zorrillo.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la respuesta inmune se induce en una mangosta.