JP6260972B2 - 狂犬病タンパク質及びｏｘ４０タンパク質の両方を発現する組換えポックスウイルスベクター並びに前記ベクターから製造されるワクチン - Google Patents

Description

本出願は、米国仮特許出願61/598,610（2012年2月14日出願）の優先権を主張する（前記仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
本発明は、概してウイルスワクチン及び前記ワクチンの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、1つ以上の遺伝子アジュバントを含むことができる、ウイルスベクターに関し、ベクター（有利にはウイルスベクター）中の遺伝子によって発現される抗原に対する免疫応答の強化をもたらすベクターに関する。

狂犬病は、全ての温血種で発生し得る疾患であり、狂犬病ウイルスによって引き起こされる。狂犬病ウイルスの感染はほぼ全例で特徴的症状の出現がその後に続き、感染種を死に至らしめる。狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス科の非分割マイナス鎖をもつRNAウイルスである。狂犬病ウイルスビリオンは、2つの主要な構造成分、すなわちヌクレオキャプシド又はリボ核タンパク質（RNP）、及びRNPを取り囲む二層膜の形状のエンベロープで構成される。全てのラブドウイルスの感染性成分はRNPコアであり、前記コアは、2つのマイナーなタンパク質（すなわちRNA依存RNAポリメラーゼ（L）及びリンタンパク質（P））と結合したヌクレオキャプシド（N）タンパク質によってキャプシド内に包まれたRNAゲノムから成る。RNPコアを取り囲む膜は、2つのタンパク質、すなわち膜貫通糖タンパク質（G）及び膜の内部側に位置するマトリックス（M）タンパク質から成る。
Gタンパク質（スパイクタンパク質とも称される）は、狂犬病ウイルスの細胞接着及び膜融合に必要であり、さらにまた宿主免疫系の主要標的である。Gタンパク質の330から340位のアミノ酸領域（抗原性部位IIIと称される）、特に333位のArg残基は、当該ウイルスのビルレンスに必要であると認定されている。全ての狂犬病ウイルス株は共通してこのビルレンス決定抗原性部位IIIを有する。

コンパニオン動物のための通常的狂犬病ワクチンは、不活化狂犬病ウイルス及びアジュバントを含み、それらアジュバントは当業界で周知であり多様な性質を有する。例えば、アジュバントは水に不溶性の無機塩、ミセル又はエマルジョン（すなわちフロイントのアジュバント）から成る。他のアジュバントは、上述の文献（Vogel and Powell, 1995）で見出すことができる。アジュバントの作用メカニズムは単一ではないが、主要な特徴は、ワクチン抗原単独で誘発される応答と比較してワクチン抗原に対する免疫応答を顕著に高めるそれらの能力である（Nossal, 1999（上掲書）；Vogel and Powell, 1995（上掲書））。これに関して、いくつかのアジュバントは液性免疫応答の増強により有効であり、他のアジュバントは細胞媒介免疫応答の増加により有効であり（Vogel and Powell, 1995（上掲書））、さらに別のアジュバントグループは、ワクチン抗原に対する液性及び細胞媒介免疫応答の両方を増加させる（Vogel and Powell, 1995（上掲書））。総合すれば、アジュバントは概して以下の5つの態様の少なくとも1つでそれらの作用を示すようである：（1）抗原の取り込み、輸送及びリンパ節での提示を促進する；（2）抗原提示を長引かせる；（3）固有の免疫細胞で発現される病原体認識レセプター（PRR）に信号を送る；（4）細胞に損傷又はストレスを引き起こす（前記損傷又はストレスは免疫応答への信号である）；及び（5）優先的Th1又はTh2応答を誘発する（Schijns VE et al. 2007）。抗原の免疫原性はまた、遺伝子アジュバント（例えば免疫細胞膜に存在するレセプターのためのリガンド）の使用によって強化され得る。DNAワクチンのための遺伝子アジュバントは既に概説されている（例えば以下を参照されたい：Calarota & Weiner, Expert Rev Vaccines. 2004 Aug;3(4 Suppl): S 135-49；Calarota & Weiner, Immunol Rev. 2004 Jun;199:84-99；及びKutzler & Weiner, J Clin Invest. 2004 Nov; l 14(9):1241-4）。しかしながら、ウイルスワクチン、特にポックスウイルス系ワクチンのための遺伝子アジュバントはまだ十分に研究されていない。

腫瘍壊死因子スーパーファミリー（TNFSF）のいくつかのメンバー及びそれらの対応するレセプター（TNFRSF）は、免疫応答のための重要な共同刺激シグナルを提供することが示された（Watts TH. Annu Rev Immunol 2005;23:23-68）。OX40リガンド（OX40L）（gp34、CD252、CD134L又はTNFSF4としても知られている）は、TNFスーパーファミリーのメンバーである。ヒトOX40Lは、そのマウス対応物と46％のアミノ酸配列同一性を共有する。他のTNFスーパーファミリーメンバーと同様に、膜結合OX40リガンドはホモトリマーとして存在する。OX40LはOX40（CD134）（TNFレセプタースーパーファミリーのメンバーである）と結合する。OX40は活性化T細胞で発現され、一方、そのリガンド（OX40L）は、活性化抗原提示細胞（APC）（例えばB細胞）及び樹状突起細胞（DC）で誘発される（Watts TH. 2005（上掲書）；Sugamura K, et al., Nat Rev Immunol 2004;4(6):420-31）。OX40−OX40L相互作用はCD4+ T細胞の増殖、分化及び特に生存を促進することができる（Rogers PR, et al., Immunity 2001;15(3):445-55；Song J, et al., Nat Immunol 2004;5(2):150-8）。OX40の結合は、ウイルス（HIV-1、エプスタイン-バーウイルス（EBV）及びインフルエンザウイルスを含む）に対するヒトCD8+ T細胞リコール応答をex vivoで強化することが示された（Serghides L, et al., J Immunol. 2005;175(10):6368-77）。OX40L-発現カナリアポックス及びHIV-1カナリアポックスワクチン（vCP1452）によるマウスの同時免疫は、HIV-1特異的CD8+ T細胞応答を、頻度及びサイトカイン発現に関して増強させた（Liu J. et al., Vaccine. 2009;275077-5084）。しかしながら、OX40Lは、HIV-1カナリアポックスワクチンによって誘引される抗体応答を強化せず、前記は、HIV-1カナリアポックスワクチンの細胞免疫原性を強化するが液性免疫原性は強化できないことを示唆した（Liu J. et al., 2009、上掲書）。

本開示では、以前のSerghidesらの研究（Serghides L, et al., 2005、上掲書）又はLiuらの研究（Liu J. et al., 2009）とは反対に、OX40Lは同一組換え体によって狂犬病Gと一緒に同時発現される。Serghidesらの研究では、アデノウイルス発現OX40Lはインフルエンザペプチドと一緒にin vitro実験で用いられ、Liuらの研究では、OX40L発現カナリアポックス及びHIV-1発現カナリアポックスが同時投与された。驚くべきことに、このOX40Lの同時発現は、Liuら（Liu J. et al., 2009、上掲書）が報告した液性免疫原性が存在しないという研究とは反対に、ピーク時の抗狂犬病中和抗体力価の2から3倍の増加をもたらした。
コンパニオン動物のための遺伝子アジュバント付加狂犬病ワクチンは、通常の化学的にアジュバントが付加されたワクチンに従来付随する負の結果（例えば注射部位の反応、不快感、痛み、非特異的免疫応答、発がんリスクの増加など）を回避又は軽減することができるので、大いに希求されるであろう。例えば、ネコでは、ワクチン関連肉腫がいくつかのアジュバント付加ワクチンの投与に伴って生じることが報告されている。したがって、特に、防御免疫を誘引するために十分な量で問題の標的抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させるために、有効で安全なウイルスワクチンが希求される。

本発明の目的は、組換えベクター又はウイルス及びそのようなウイルスを作製する方法を提供すること、並びに組成物及び／又はワクチンと同様に感染を治療及び予防する方法を提供することのいずれか1つ又は全てであり得る。
本発明は、少なくとも1つの外因性核酸分子を含みこれを発現する組換えベクター、例えば組換えウイルス、例えば組換えポックスウイルスを提供し、前記少なくとも1つの外因性核酸分子は、狂犬病に由来する問題の免疫原又はエピトープ、例えば狂犬病Gをコードする核酸分子を含むことができる。
本発明はまた、ポックスウイルス又は他の適切なウイルス性発現ベクター（アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、パラミクソウイルス、マレック病ウイルス（MDV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBD）などを含む）を用いて、動物宿主においてin vivoで首尾よく発現されて免疫学的応答及び／又は防御性免疫学的応答を誘引する多数の抗原を包含する。前記例にはイヌジステンパーウイルス、口蹄疫ウイルス（FMDV、US7527960（Merial））、インフルエンザ（US7384642、US7910112、US6713068及びUS7507416（各々Merial））、ブルータングウイルス（BTV、US7862821（Merial））、ブタシルコウイルスII型（PCV2、US6497883（Merial））、ニパー（nipah）ウイルス（US7803612（Merial））、ヘンドラ（hendra）ウイルス、西ナイルウイルス（WNV、US7740863（Merial））、ネコ白血病ウイルス（FeLV、US7582302（Merial））、イヌリーシュマニア（US7794736（Merial））、ネコカルシウイルス（FCV、US6914134（Merial））、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV、US6096535（Merial））、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、アフリカウマ病（African horse sickness）ウイルス（AHSV、US2010/0119546A1（Merial））及び水疱性口内炎ウイルス（US8008268（Merial））が含まれるが、ただしこれらに限定されない（前記文献の各々の開示内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。

特に、本発明は、少なくとも1つの外因性核酸分子を含みこれを発現する組換えベクター、例えば組換えウイルス、例えば組換えポックスウイルスを提供し、前記少なくとも1つの外因性核酸分子は、任意の適切な抗原（狂犬病Gポリペプチド及び／又はその変種又はフラグメントを含む）を含むことができる。
本発明は、狂犬病Gポリペプチド及び／又はその変種又はフラグメントをコードする第一のポリヌクレオチド及びTNFαレセプター−結合ポリペプチド及び／又はその変種又はフラグメントをコードする第二のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、例えば組換えポックスウイルスを提供する。
本発明はさらに、そのような発現ベクター又はそのような発現ベクターの発現生成物を含む組成物又はワクチンを提供する。
本発明はさらに、狂犬病に対する免疫学的（免疫原性）又は防御性応答を誘発する方法、および、狂犬病又は狂犬病によって引き起こされる症状を予防又は治療する方法を提供し、前記方法は、該発現ベクター若しくは該発現ベクターの発現生成物、又は該発現ベクターを含む組成物、又は該発現ベクターの発現生成物を含む組成物を投与する工程を含む。
本発明はまた、該ウイルスの発現生成物と同様に、該発現生成物から生じるか又はin vivoでのその発現から生じる抗体、並びにそのような生成物及び抗体のための使用（例えば診断的応用における使用）に関する。
少なくとも1つの狂犬病ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び使用のための指示書を含むキットもまた提供される。
本発明はまた、病源体（狂犬病を含むがただし前記に限定されない）由来の抗原及びTNFαRリガンド遺伝子アジュバント（OX40Lを含むがただし前記に限定されない）をコードする遺伝子を、動物宿主においてin vivoで同時発現するポックスウイルスベクターは、狂犬病に対する長期存続性防御免疫を該動物で誘引できるという予期せぬ驚くべき結果に部分的に基づいている。特に、該OX40Lは、ワクチン免疫される種と同種であることができ、例えばイヌOX40L（cOX40L）は、狂犬病に対するイヌワクチンの狂犬病Gと効率的に結合することができる。
これら及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によって開示されそれらから明白であり、かつそれらに包含されている。
当業者への本発明の完全かつその実行を可能にする開示（その最良の態様を含む）は、本明細書の残りの部分でより詳細に示され、前記は以下のとおりの添付図面の説明を含む。

ドナープラスミドp397-Syn Rabies G構築の模式図を提供する。フランキングC3アームとともに合成狂犬病Gの配列を立証するために用いられた配列決定プライマーの位置が示されている； vCP3006（C3部位に合成狂犬病G及びC5部位にクラシック狂犬病Gを保持する）のゲノム編成を示す模式図を提供する； 野生型ALVAC及びvCP3006から単離したゲノムDNAの画像である。前記DNAはHindIII、BamHI又はXbaIで消化され、アガロースゲル電気泳動を用いて分離された； 合成狂犬病G特異的プローブを用いてハイブリダイズさせた、図3（wtALVAC及びvCP3006由来のゲノムDNA）に示すゲルのサザンブロットを示す； vCP3600の発現のウェスタンブロット分析を示す。狂犬病ウイルスGと一致するバンドはvCP3600感染細胞ペレットでのみ検出できた（左）。同様なMOIのvCP3600又はvCP65aを感染させた細胞から得た種々の量の感染細胞サンプルをGタンパク質発現の比較のためにロードした（右）； プライマーの位置を示す、vCP3600のC3領域の模式図を提供する； フランキングC3アーム、I3Lプロモーターとともに合成狂犬病GをカバーするvCP3006の配列を提供する（完全な配列は配列番号：2に示される）； 図７−１続き 図７−２続き 合成コドン最適化狂犬病ウイルス糖タンパク質の予想されるアミノ酸配列を示す； ドナープラスミドp397-cOX40Lのクローニング模式図である； vCP3015（C5部位にクラシック狂犬病G及びC6部位にcOX40Lを保持する）のゲノム編成を示す模式図である； ゲル電気泳動でのNruI消化ゲノムDNAの分離（右）及びcOX40Lプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションを示すアガロースゲル画像である； NruI消化ゲノムDNAの分離（左）及びクラシック狂犬病ウイルスGプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（右）を示すアガロースゲル画像である。このプローブはクラシック狂犬病Gタンパク質及びC5右アームの389bpの両方に及び、389bpプローブ結合のために、親ALVACゲノムとの弱いハイブリダイゼーションシグナルが存在するが（レーン3）、vCP3015のそれとは異なるバンドサイズとのハイブリダイゼーションシグナルである； vCP3015のウェスタンブロット分析である。狂犬病ウイルスGに対応するバンドはvCP3015に感染した細胞のペレットでのみ検出できた； プライマーの位置を示すvCP3015 C6領域の模式図である； フランキングC6アーム、42Kプロモーターとともに合成cOX40LをカバーするvCP3015の配列である（ひとまとめにして配列番号：7に示される）； 図１５−１の続き。 合成cOX40Lの予想されるアミノ酸配列である（配列番号：12、63、64、65、66又は67）； プライマーの位置を示すvCP3015 C5領域の模式図である； フランキングC5アーム、H6プロモーターとともにクラシック狂犬病ウイルスGをカバーするvCP3015の配列である（ひとまとめにして配列番号：13に示される）； 図１８−１の続き。 クラシック狂犬病Gの予想されるアミノ酸配列である（配列番号：1）。クラシックG及びコドン最適化Gの予想アミノ酸配列は100％同一である； vCP3012（C5部位にクラシック狂犬病ウイルスG、C3部位にコドン最適化合成狂犬病ウイルスG及びC6部位にcOX40Lを保持する）のゲノム編成を示す模式図である； ゲル電気泳動でのPmeI消化ゲノムDNAの分離及びクラシック狂犬病ウイルスGプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションを示す； ゲル電気泳動でのBamHI消化ゲノムDNAの分離及び合成狂犬病ウイルスGプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションを示す； ゲル電気泳動でのNruI消化ゲノムDNAの分離及びクラシック狂犬病ウイルスGプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションを示す； vCP3012のウェスタンブロット分析である。狂犬病ウイルスGに対応するバンドは感染細胞ペレットで検出された； プライマーの位置を示すvCP3012 C6領域の模式図である； フランキングC6アーム、42Kプロモーターとともに合成cOX40LをカバーするvCP3012の配列を示す（ひとまとめにして配列番号：17に示される）； プライマーの位置を示すvCP3012 C3領域の模式図である； フランキングC3アーム、I3Lプロモーターとともに合成狂犬病GをカバーするvCP3012の配列を示す（ひとまとめにして配列番号：20に示される）； 図２８−１の続き。 vCP3012のC5RからC5Lまでのフラグメント（すなわち狂犬病ウイルスG及びフランキング領域）の模式図を示す： 狂犬病G遺伝子を含むC5RからC5LまでのvCP3012の配列を示す（ひとまとめにして配列番号：23に示される）。クラシック狂犬病ウイルスG（配列番号：1）及び合成狂犬病ウイルスG（配列番号：1）の予想されるアミノ酸は100％同一であり、vCP3006又はvCP3015について記載したものと同じである； 図３０−１の続き。 14日目のGMT及び95％信頼区間（CI）のグラフである； 21日目のGMT及び95％信頼区間（CI）のグラフである； 28日目のGMT及び95％信頼区間（CI）のグラフである； 48日目のGMT及び95％信頼区間（CI）のグラフである； グループの力価を示すグラフである； 配列番号：1−24、63−67の説明である； 配列番号：25−62の説明である； 配列番号：12、63−67（すなわち選択したOX40Lペプチド）のアミノ酸配列アラインメントを示す。添付の表は配列間の％同一性を示す。

本発明の詳細な説明
動物で免疫原性応答を誘引する、狂犬病ポリペプチド並びにそのフラグメント及び変種をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物が提供される。狂犬病ポリペプチド又はフラグメント若しくは変種をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターはワクチン又は組成物に処方され、動物で防御応答を誘引又は刺激するために用いることができる。ある実施態様では、狂犬病ポリペプチドは狂犬病Gポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種である。
狂犬病Gポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種をコードするポリヌクレオチド、及びOX40Lポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物が提供される。特に、該OX40LはイヌOX40L（cOX40L）である。
本発明のポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種でもよいことは理解されよう。“活性なフラグメント”又は“活性な変種”とは、該フラグメント又は変種が該ポリペプチドの抗原性性質を維持することを意図する。したがって、本発明は、動物で免疫原性応答を誘引する任意の狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。該狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、任意の狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、例えば動物、例えばトリで応答を誘引、誘発又は刺激する、タンパク質、ペプチド又はフラグメント（ただしこれらに限定されない）であり得る。

特に、問題の狂犬病ポリペプチドは、狂犬病糖タンパク質（G）である。狂犬病Gは、狂犬病ウイルスの表面で見出される糖タンパク質のあるタイプを指す。前記は抗原性糖タンパク質であり、ウイルスとウイルスが感染しようとしている細胞との結合に必要である。これらの抗原のいずれかの前駆体を用いることができることは理解されよう。
本発明の抗原性ポリペプチドは狂犬病を防御できる。すなわち、それらは動物で免疫応答を刺激することができる。“抗原”又は“免疫原”とは、宿主動物で特異的な免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、全生物（死滅、弱毒又は生）；ある生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物への提示に際して免疫応答を誘導できるDNA片又はフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン又は前記の任意の組合せを含むことができる。また別に、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。

“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”という用語は本明細書では互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。該ポリマーは線状でも分枝状でもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、アミノ酸以外の化学的部分によって中断されてあってもよい。前記用語はまた、天然に又は介入によって、（例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識又は生物活性成分との複合物形成）改変されてあるアミノ酸ポリマーを含む。
“狂犬病Gポリペプチド又はポリヌクレオチド”という用語は、自然のまま又は最適化された任意の狂犬病Gポリペプチド又はポリヌクレオチド並びにそれらの誘導体及び変種を指す。
“OX40Lポリペプチド又はポリヌクレオチド”という用語は、自然のまま又は最適化された任意のOX40Lポリペプチド又はポリヌクレオチド並びにそれらの誘導体及び変種を指す。

本明細書で用いられる“免疫原性又は抗原性ポリペプチド”という用語は、宿主に投与されると、当該タンパク質に対抗する液性及び／又は細胞性タイプの免疫応答を惹起させることができるという意味で、免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。好ましくは、該タンパク質フラグメントは、前記が完全なタンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するというものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも１つのエピトープ又は抗原性決定基を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドは、該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ又はその免疫原性フラグメントを含む。“免疫原性フラグメント”とは、１つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を誘引するタンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて同定できる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66（Glenn E. Morris, Ed., 1996）。例えば、線状エピトープは、例えば固相上で多数のペプチド（該タンパク質分子の部分に対応する）を同時に合成し、当該ペプチドが該固相になお結合している間に抗体と該ペプチドを反応させることによって決定することができる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている：米国特許第4,708,871号；Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1986。同様に立体的エピトープは、アミノ酸の立体配座を例えばX線結晶学及び二次元核磁気共鳴によって決定することによって容易に同定される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。T.パルバ（T. parva）のタンパク質に特に応用可能な方法は、PCT/US2004/022605に完全に記載されている（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。

本明細書で考察するように、本発明は、抗原性ポリペプチドの活性なフラグメント及びその変種を包含する。したがって、“免疫原性又は抗原性ポリペプチド”にはさらに、当該ポリペプチドが機能して本明細書に規定の免疫学的応答を生じる限り、当該配列に対する欠失、付加及び置換が想定される。“保存的変種”は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入れ替え、又はコードアミノ酸残基が変化しないか若しくは別の生物学的に類似の残基であるような当該核酸配列内のヌクレオチドの入れ替えを指す。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には性質が保存的である、すなわち、あるファミリーのアミノ酸内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般的には以下の4つのファミリーに分割される：（1）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時には芳香族アミノ酸として分類される。保存的変異の例には以下が含まれる：ある疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）による別の疎水性残基の置換、又はある極性残基による別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換など）；又は、生物学的活性に大きな影響をもたない構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の同様な保存的入れ替え。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、該タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内に入る。これらの改変によって生じるポリペプチドはいずれもここに含められる。“保存的変異”という用語はまた、未置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含むが、ただし該置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた該未置換ポリペプチドと免疫反応することを条件とする。

“エピトープ”という用語は、特異的B細胞及び／又はT細胞が応答する、抗原又はハプテン上の部位を指す。前記用語はまた、“抗原決定基”又は“抗原性決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原への結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイで同定できる。
ある組成物又はワクチンとの“免疫学的応答”は、問題の組成物又はワクチンに対する宿主の細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答の発生である。通常は、“免疫学的応答”には以下の１つ以上の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物又はワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞及び／又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療的又は防御的な免疫学的応答を示し、したがって、新規な感染に対する耐性が強化されるか、及び／又は疾患の臨床的重篤性が軽減されるであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される症候群及び／又は臨床的徴候の軽減又は欠如、より短い回復期間、及び／又は感染宿主のウイルス力価の低下によって提示されるであろう。

“動物”とは哺乳動物、鳥類などを意図する。本明細書で用いられる動物又は宿主には哺乳動物及び人間が含まれる。動物は、ウマ科の動物（例えばウマ）、イヌ科の動物（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ科の動物（例えばライオン、トラ、家ネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、及びネコ科動物（チーター、オオヤマネコを含む））、ヒツジ科の動物（例えばヒツジ）、ウシ科の動物（例えばウシ）、ブタ科の動物（例えばブタ）、トリ（例えばニワトリ、アヒル、カモ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュ及びヒクイドリ）、霊長類（例えばキツネザル、メガネザル、サル、テナガザル、ヒヒ）、フェレット、アザラシ及び魚類から成る群から選択できる。“動物”という用語はまた、全発育段階（新生児期、胚性期及び胎生期を含む）の個々の動物を含む。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語、“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示さないかぎり複数の同一語を含む。同様に“or”という単語は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“and”を含む。
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又は文章では、例えば“comprises”、“comprised”、“comprising”（含む）などの用語は、米国特許法で前記に帰せられる意味を有することができる。例えば、それらは“includes”、“included”、“including”（含む）などの意味を有することができ、さらに例えば“consisting essentially of”及び“consists essentially of”(本質的に〜から成る)という用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有する。例えば、それら用語は明確に列挙されなかった成分を許容するが、従来技術で見出される成分又は発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える成分は排除する。

組成物
本発明は狂犬病ワクチン又は組成物に関し、前記は、狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む組換え体又は発現ベクター、及び医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる狂犬病ワクチン又は組成物に関する。該狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、任意の狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、例えば動物で応答を誘引し、誘発し又は刺激するタンパク質、ペプチド又はそのフラグメントであり得るが、ただしこれらに限定されない。
本発明は狂犬病ワクチン又は組成物に関し、前記は、狂犬病Gポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え体又は発現ベクター、及び医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる狂犬病ワクチン又は組成物に関する。ある実施態様では、該発現ベクターはさらに、OX40Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
別の実施態様では、該医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルは油中水エマルジョンであり得る。さらにまた別の実施態様では、該油中水エマルジョンは水/油/水（W/O/W）三重エマルジョンであり得る。さらにまた別の実施態様では、該医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルは水中油エマルジョンであり得る。

ある実施態様では、該狂犬病ポリペプチド、抗原又はそのフラグメント若しくは変種は、狂犬病Gポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種を含む。この実施態様のある特徴では、該狂犬病Gポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、狂犬病G遺伝子によって生成される組換えポリペプチドである。この実施態様の別の特徴では、該狂犬病G遺伝子は、配列番号：5又は16に示す配列と少なくとも70％の同一性を有する。この実施態様の別の特徴では、該狂犬病Gポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、配列番号：1に示す配列と少なくとも80％の同一性を有する。
別の実施態様では、該OX40Lポリペプチド、抗原又はそのフラグメント若しくは変種は、OX40L遺伝子によって生成される組換えポリペプチドである。この実施態様の別の特徴では、該OX40L遺伝子は、配列番号：10に示す配列と少なくとも70％の同一性を有する。この実施態様の別の特徴では、該OX40Lポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、配列番号：12，63、64、65、66又は67に示す配列と少なくとも80％の同一性を有する。
別の実施態様では、本発明は、コンパニオン動物（例えばネコ、イヌ及びフェレット）で非限定使用される新規な遺伝子アジュバント付加狂犬病ワクチンを提供し、前記ワクチンは、狂犬病G及びOX40Lを含みそれらを発現する組換えポックスウイルスベクターを含む。別の実施態様では、該ベクターは組換えカナリアポックスを含むことができる。別の実施態様では、該狂犬病表面糖タンパク質遺伝子は狂犬病糖タンパク質G（配列番号：1に示す配列を有する）をコードし、さらにOX40Lは配列番号：12，63、64、65、66又は67に示す配列を有する。

合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ及び他の組換え体又は合成誘導抗原もまた本定義に含まれる。例えば以下を参照されたい：Bergmann et al., 1993；Bergmann et al., 1996；Suhrbier, 1997；Gardner et al., 1998。本発明の目的のための免疫原性フラグメントは、通常は該分子の約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10−15アミノ酸、又は約15−25アミノ酸、又はそれより大きいアミノ酸を含むであろう。該フラグメントの長さに決定的な上限は存在せず、該タンパク質配列のほぼ完全長又は該タンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質すら含むことができよう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、狂犬病ポリペプチドのエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成るものである。狂犬病ポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードする配列の連続する又は切れ目のない、最小限15ヌクレオチド、約30−45ヌクレオチド、約45−75又は少なくとも57，87又は150を含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。エピトープ決定手順、例えばオーバーラップペプチドライブラリーの作製（Hemmer et al., 1998）、ペプスキャン（Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1985；Van der Zee R. et al., 1989；Geysen, 1990；Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot et al., 1999；PCT/US2004/022605）を本発明の実施で用いることができる。

“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語はRNA又はDNAを指し、前記は直鎖状若しくは分枝状であるか、単鎖若しくは二本鎖であるか、又はそのハイブリッドである。前記用語はまたRNA/DNAハイブリッドを包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ）、ウラシル、他の糖及び連結基（例えばフルオロリボース及びチオレート）、並びにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列はポリマー形成後に、標識成分により（例えば複合物形成によって）さらに改変され得る。この定義に含まれる他の改変タイプは、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグによる置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固相と結合させる手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手するか、又は微生物から誘導することができる。
“遺伝子”という用語は、生物学的機能と密接に関係するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。したがって、遺伝子は、ゲノム配列におけるイントロン及びエクソン、又はcDNAにおける単なるコード配列、及び／又はそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNA又は機能的RNAを発現するか、又は特異的タンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記は調節配列を含む。

OX40Lの多様性に関して、“OX40Lの機能的フラグメント又は変種”は、本開示のOX40Lと比較したとき、免疫原性ペプチドによって誘引される免疫応答を、同じメカニズムでかつ匹敵し得る程度に補助する／増大させるペプチドと本明細書では定義される。例えば、ネコOX40Lが、イヌ宿主で狂犬病Gと同時発現させたとき、狂犬病G発現ベクターだけで誘引される免疫応答よりも狂犬病に対する強い免疫応答を生じ、さらに該ネコOX40Lが同じメカニズム（例えばTNFレセプターに結合する）を介して作用を発揮するならば、該ネコOX40Lは本明細書に示すイヌOX40Lの“機能的フラグメント又は変種”であると考えられよう。同様に、免疫応答を増大させることができるイヌOX40Lの多形性バージョンもまたcOX40Lの“機能的フラグメント又は変種”である。最後に、OX40Lの切端バージョンが、対応する完全長OX40Lに匹敵し得る程度に免疫応答を補助する／増大させるならば、該切端バージョンは“OX40Lの機能的フラグメント又は変種”であると考えられる。
本発明はさらに、狂犬病抗原、エピトープ若しくは免疫原をコードするポリヌクレオチド又はOX40L抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドに対する相補鎖を含む。該相補鎖はポリマーであり任意の長さを有することができ、さらにデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び任意の組合せのアナローグを含むことができる。

“単離された”生物学的成分（例えば核酸又はタンパク質又は細胞内小器官）は、当該成分が天然に存在する当該生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質並びに細胞内小器官）から実質的に分離されてあるか、又は精製されてある成分を指す。“単離” されてある核酸及びタンパク質には標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。前記用語はまた、化学合成と同様に組み換え技術によって調製された核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は完璧な純度を必要とせず、前記は相対的用語である。したがって、例えば部分的に精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境にあるよりも当該ポリペプチドがより濃縮されている調製物である。それは、当該ポリペプチドが細胞成分から分離されているということである。“実質的に精製される”とは、細胞成分又は細胞物質の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％又は前記以上が除去されてあることが意図される。同様に、ポリペプチドも部分的に精製され得る。“部分的に精製される”とは、細胞成分又は細胞物質の60％未満が除去されることが意図される。同じことがポリヌクレオチドに適用される。本明細書に開示のポリペプチドは当業界で公知の任意の手段によって精製できる。

さらにまた、狂犬病Gのホモローグ及びOX40Lポリペプチドのホモローグが本発明の範囲内に入ることが意図される。本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語には、オルトローグ、アナローグ及びパラローグが含まれる。“アナローグ”という用語は、同じ又は類似の機能を有するが無関係の生物で別個に進化してきた2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。“オルトローグ”という用語は、異なる種に由来する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指すが、ただしそれらは共通の先祖遺伝子から種形成によって進化してきた。通常は、オルトローグは同じ又は類似の機能を有するポリペプチドをコードする。“パラローグ”という用語は、ゲノム内の複製によって関係を有する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。パラローグは、通常は異なる機能を有するが、これらに機能は関連する。例えば、野生型狂犬病ポリペプチドのアナローグ、オルトローグ及びパラローグは、翻訳後修飾によって、アミノ酸の配列相違によって、又はその両方によって野生型狂犬病ポリペプチドと相違し得る。特に、本発明のホモローグは、概して野生型狂犬病ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の全部又は部分と少なくとも80−85％、85−90％、90−95％又は95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示し、さらに類似の機能を示すであろう。

別の特徴では、本発明は、配列番号：1に示す配列を有するポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、上記同定の狂犬病ポリペプチド又はOX40Lポリペプチド（配列番号：1又は12、63−67）のフラグメント及び変種を提供する（前記を当業者は周知の分子生物学的技術を用いて容易に調製できる）。
変種は、配列番号：1又は12、63−67に示すアミノ酸配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％同一性のアミノ酸配列を有する同種ポリペプチドである。
変種は対立遺伝子変種を含む。“対立遺伝子変種”という用語は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし、かつ天然の集団（例えばウイルスの種又は系統）内に存在する多形性を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。そのような天然の対立遺伝子変種は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに典型的には1−5％の多様性をもたらすことができる。対立遺伝子変種は、多数の異なる種で問題の核酸配列を配列決定することによって同定できる（前記は、それらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を同定するハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に実施することができる）。そのような核酸変異体及びその結果のアミノ酸多形性、又は天然の対立遺伝子変異の結果であり問題の遺伝子の機能的活性を変化させない変異体のいずれか及びいずれも、本発明の範囲内に入ることが意図される。

本明細書で用いられるように、“誘導体”又は“変種”という用語はポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を指し、前記は、（1）野生型ポリペプチドと比較したとき対応するポリペプチドが実質的に等価の機能を有するか、又は（2）当該ポリペプチドに対して作製した抗体が該野生型ポリペプチドと免疫反応するように、1つ以上の保存的アミノ酸変異又は他のマイナーな改変を有する。これらの変種又は誘導体には、狂犬病ポリペプチド又はOX40Lの一次アミノ酸配列のマイナーな改変を有するポリペプチドが含まれる（前記マイナーな改変は、未改変の対応ポリペプチドと比較したとき実質的に等価の活性を有するペプチドを生じ得る）。そのような改変は、部位特異的変異導入によってもたらされるように意図的であるか、又は偶発的に生じ得る。“変種”という用語はさらに、当該配列への欠失、付加及び置換を意図するが、ただし前記ポリペプチドが機能して本明細書に規定の免疫学的応答を生じることを条件とする。
“保存的変種”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入れ替え、又はコードアミノ酸残基が変化しないか若しくは別の生物学的に類似する残基であるような核酸配列内のヌクレオチドの入れ替えを指す。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には上記に記載のように性質が保存的であろう。

狂犬病ポリペプチド又はOX40Lポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号：1に示す配列を有する狂犬病Gポリペプチド又はその変種、配列番号：12、63、64、65、66又は67に示す配列を有するOX40Lポリペプチドの少なくとも8、10、13、14、15又は20の連続するアミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。
別の特徴では、本発明は、狂犬病Gポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号：5又は16に示す配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号：1に示す配列を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ若しくは免疫原性フラグメント（これらポリペプチドの1つの少なくとも8又は少なくとも10の連続するアミノ酸を含む）、又はこれらポリペプチドの組合せと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
さらにまた別の特徴では、本発明は、OX40Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号：12、63、64、65、66又は67に示す配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号：12、63、64、65、66又は67に示す配列を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ若しくは免疫原性フラグメント（これらポリペプチドの1つの少なくとも8又は少なくとも10の連続するアミノ酸を含む）、又はこれらポリペプチドの組合せと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴では、配列番号：5、10又は16に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号：5、10又は16に示す配列を有するポリヌクレオチドの1つ、又はその変種と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。

本開示のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の結果としての、例えばある特定の宿主のための最適化コドン使用としての縮退である配列を含む。本明細書で用いられるように、“最適化”は、与えられた種におけるその発現を高めるように遺伝的に操作されたポリペプチドを指す。狂犬病Gポリペプチド又はOX40Lポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、狂犬病G遺伝子又はOX40L遺伝子のDNA配列は以下のように改変できる：（1）特定の種で高度に発現される遺伝子によって優先されるコドンを含む；（2）前記種で実質的に見出されるヌクレオチド塩基組成のA＋T又はG+C含量を含む；（3）前記種の開始配列を形成する；又は（4）RNAの脱安定化、不適切なポリアデニル化、分解及び停止を引き起こすか、又は二次構造ヘアピン若しくはRNAスプライス部位を形成する配列を排除する。前記種での狂犬病Gタンパク質又はOX40Lタンパク質の発現増加は、真核細胞及び原核細胞又は具体的な種のコドン使用頻度分布を利用することによって達成できる。“好ましいコドン使用頻度”という用語は、あるアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される優先性を指す。したがって、全ての縮退ヌクレオチドが本開示に含まれるが、ただし当該ヌクレオチド配列によってコードされる狂犬病Gポリペプチド又はOX40Lポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない場合に限られる。

2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）ペアワイズブラスト及びblosum6マトリックスで標準的パラメーターを用いて決定できる（例えばNCBI（“National Center for Biotechnology Information”(NCBI, Bethesda, Md., USA)サーバー及びAltschuらの著書（したがってこの著書はBLAST又は BLASTX及びBLOSUM62マトリックスの“blasts”という用語による使用について記述する）で利用できるBLAST又はBLASTXアルゴリズムを参照されたい）。
配列に関する“同一性”は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を2つの配列の短い方のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割ったものを指し、ここで前記2つの配列のアラインメントは、ウィルバーとリップマンのアルゴリズム（Wilbur and Lipman）にしたがい、例えばウィンドウサイズ20ヌクレオチド、ワード長4ヌクレオチド及びギャップペナルティー4並びにコンピューター支援分析を用いて決定できる。アラインメントを含む配列データの解釈は、市場で利用可能なプログラム（例えばIntelligenetics^TM Suite, Intelligenetics Inc. CA）を都合よく用いて実施できる。RNA配列が、DNA配列と類似する、又はある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等しいとみなされる。したがって、RNA配列は本発明の範囲内にあり、DNA配列中のチミジン（T）をRNA配列中のウラシル（U）と等しいと考えることによってDNA配列から誘導することができる。

2つのアミノ酸配列の配列同一性又は配列類似性、又は2つのヌクレオチド配列間の配列同一性はベクターNTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA）を用いて決定できる。
以下の著書は配列の相対的同一性又は相同性を比較するアルゴリズムを提供し、さらに上記に加えて又は上記の代替として、これら文献の教示を用いパーセント相同性又は同一性を決定できる：Needleman SB and Wunsch CD；Smith TF and Waterman MS；Smith TF, Waterman MS and Sadler JR；Feng DF and Dolittle RF；Higgins DG and Sharp PM；Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ；及びDevereux J, Haeberlie P and Smithies O。さらに、煩雑な実験を行うことなく、パーセント相同性を決定するために当業者は多くの他のプログラム又は参考文献を利用することができる。
ハイブリダイゼーション反応は種々の“ストリンジェンシー”条件下で実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は周知である。例えば以下を参照されたい：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”（第二版）(Sambrook et al., 1989)。

本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター成分及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結された狂犬病ポリヌクレオチド又はOX40Lポリヌクレオチド、又はその両方を包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA又はRNAプラスミド又はウイルスを指す。該異種ポリヌクレオチドは、予防又は治療の目的のために問題の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態でもよい。本明細書で用いられるように、ベクターは最終標的細胞又は対象動物で複製能力を有することを必要としない。前記用語はクローニングベクター及びウイルスベクターを含む。
“組換え体”という用語は、天然には存在しないか、又は天然には見出されないアレンジメントで別のポリヌクレオチドと連結される半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、比較されている存在物の残りの部分と遺伝的に別個の存在物に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドは、異なる供給源から誘導されたプラスミド又はベクター中に遺伝子操作技術によって配置されることが可能であり、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その本来のコード配列から取り出され、本来の配列以外のコード配列に作動的に連結されたプロモーターは異種プロモーターである。

本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、制御エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモーター制御下の追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施態様を提供するために所望され得る任意の構築物を含むことができる。
狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、又はOX40ポリペプチドの発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最小限の態様として、前記は開始コドン（ATG）、停止コドン及びプロモーター、並びに場合によってある種のベクター（例えばプラスミド）及びある種のウイルスベクター（例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター）のためのポリアデニル化配列を含む。該ポリヌクレオチドがポリペプチドフラグメント（例えば狂犬病Gポリペプチド）をコードするとき、有利には該ベクターでは、ATGはリーディングフレームの5’に配置され、停止コドンは3’に配置される。発現制御のための他のエレメント、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン）及び該タンパク質の分泌を可能にするシグナル配列も存在し得る。

本発明はまたベクター（例えば発現ベクター）を含む調製物、例えば治療用組成物に関する。該調製物は、1つ以上のベクター、例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクターを含み、該ベクターは、1つ以上の狂犬病Gポリペプチド又はOX40Lポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含み、それらを発現する。ある実施態様では、該ベクターは、狂犬病G抗原、エピトープ又は免疫原をコードし及び／又は発現するポリヌクレオチドを、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクル中に含むポリヌクレオチドを含み、これを発現する。したがって、本発明の実施態様にしたがえば、該調製物中の他のベクターは、狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の1つ以上の他のタンパク質（例えばヘマグルチニン、ニューラミニダーゼ、核タンパク質）又はそのフラグメントをコードし、適切な環境下で発現するポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。

別の実施態様にしたがえば、該調製物中の該1つのベクター又は複数のベクターは、狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、又はOX40Lポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の1つ以上のタンパク質若しくはフラグメント又は前記の組合せをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。別の実施態様では、該調製物は1つ、2つ又は3つ以上のベクターを含み、該ベクターは、狂犬病Gポリペプチド、抗原、融合タンパク質又はそのエピトープをコードし発現する（有利にはin vivoで）ポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、種々の狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ、融合タンパク質又は免疫原、例えば異なる種（例えばヒト、ブタ、乳牛又はウシ、イヌ、ネコ及びトリであるがただしこれらに限定されない）の狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原をコードし発現するポリヌクレオチドを含むベクターの混合物を目的とする。
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、該発現ベクターは、プラスミドベクター、特にin vivo発現ベクターである。ある具体的な非限定的な例では、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.；Luke et al., 1997；Hartikka et al., 1996、例えば米国特許第5,846,946号及び6,451,769号を参照されたい）をポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用することができる。pVR1020プラスミドはpVR1012から誘導され、ヒトtPAシグナル配列を含む。ある実施態様では、ヒトtPAシグナルは、Genbankのアミノ酸M(1)からアミノ酸S(23)（アクセッション番号HUMTPA14）を含む。別の具体的な非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入のためのベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankuのアミノ酸M(24)からアミノ酸A(48)（アクセッション番号U28070）のウマIGF1のシグナルペプチド配列を含む。本実施に参考とするか又は利用できるDNAプラスミドの追加の情報は、例えば米国特許第6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770号、6,376,473号及び6,221,362号で見出される。

プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチド及び所望の宿主又は標的の細胞（1つ又は複数の細胞）におけるそのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットをカバーする。さらにこれに関して、スーパーコイル又は非スーパーコイル環状プラスミドは、線形プラスミドと同様に本発明の範囲内に含まれるものであることに留意されたい。
各プラスミドは、狂犬病Gポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（場合によって異種ペプチド配列と融合される）に加えて、変種、アナローグ又はフラグメントを含むか、収納するか又は本質的に前記から成り、それらは、プロモーターに作動できるように連結されるか、又はプロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存する。一般的には、真核細胞で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。強力なプロモーターは、ヒト又はネズミ起源の（場合によっては別の起源（例えばラット又はモルモット）を有する）極初期サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-IE）であり得る。
より一般的な関係では、プロモーターはウイルス起源又は細胞起源を有する。本発明の実施で有用に利用できる、CMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施で有用に利用できる強力な細胞性プロモーターは、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000）又はアクチンプロモーター（Miyazaki et al., 1989）である。
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（米国特許第5,122,458号を参照されたい）、又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル、又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルが有用であり得る。
“宿主細胞”は、遺伝的に改変されてあるか、又は外因性ポリヌクレオチド（例えば組換えプラスミド又はベクター）の投与によって遺伝的に改変させることができる原核又は真核細胞を指す。遺伝的に改変された細胞というとき、該用語は、最初に改変された細胞及びその子孫の両方を指す。

使用方法及び製造物品
本発明は以下の態様の方法を含む。ある実施態様では、動物をワクチン免疫する方法が開示され、前記方法はベクターを含む組成物を動物に投与する工程を含み、前記ベクターは、狂犬病Gポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む。この実施態様のある特徴では、動物はトリ、ウマ、イヌ、ネコ、フェレット、アザラシ又はブタである。
本発明のある実施態様では、プライム-ブースト投薬スケジュールを利用することができる。前記投薬スケジュールは、少なくとも1回の基礎投与及び少なくとも1回のブースター投与で構成され、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原が用いられる。典型的には、基礎投与で用いられる免疫学的組成物又はワクチンは、ブースターとして用いられるものとは性質が異なる。しかしながら、基礎投与及びブースター投与と同じ組成物を用いることができることは理解されよう。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。

本発明では、狂犬病ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種をコードする狂犬病コード配列又はそのフラグメントを発現させるために、組換えウイルスベクターが用いられる。具体的には、該ウイルスベクターは、狂犬病配列、より具体的には狂犬病G遺伝子又は抗原性ポリペプチドをコードするそのフラグメントを発現することができる。本明細書で意図されるウイルスベクターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス又は弱毒ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス又は弱毒アビポックスウイルス（例えばカナリアポックス、鶏痘、ドーブポックス、ハトポックス、ウズラポックス、ALVAC、TROVAC；例えばUS 5,505,941、US 5,494,8070を参照されたい）、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど）、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えばイヌヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなど。別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター、例えばALVACであり得る。さらにまた別の実施態様では、アビポックス発現ベクターは鶏痘ベクター、例えばTROVACであり得る。狂犬病ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は狂犬病Gであり得る。例えば、狂犬病Gを含むポックスウイルスベクターは、US5,756,102に記載のベクターであり得る。発現されるべき本発明の狂犬病Gポリペプチド又は抗原は、固有のポックスウイルスプロモーター、とりわけ、例えばワクシニアプロモーター7.5kDa（Cochran et al., 1985）、ワクシニアプロモーターI3L（Riviere et al., 1992）、ワクシニアプロモーターG （Shida, 1986）、牛痘プロモーターATI（Funahashi et al., 1988）、ワクシニアプロモーターH6（Taylor et al., 1988b；Guo et al., 1989；Perkus et al., 1989）の制御下に挿入される。

プライム-ブースト投薬スケジュールは、少なくとも1つの共通ポリペプチド及び／又はその変種又はフラグメントを用いる、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含む。プライム投与で用いられるワクチンは、後のブースターワクチンとして用いられるものと性質が異なることがある。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1回以上の投与を含むことができる。
本発明のプライム-ブーストプロトコル又は投薬スケジュールのある特徴では、プライム-ブーストプロトコルは、狂犬病Gポリペプチド、抗原及び／又はその変種若しくはフラグメントを含みin vivoでそれらを発現することができる組換えウイルスベクターを含む組成物の投与とその後に続く本発明の組換え狂犬病Gポリペプチド又は抗原の投与を含むことができる。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、本発明の狂犬病G抗原を含む組成物の投与とその後に続く狂犬病Gポリペプチド又は抗原及び／又はその変種若しくはフラグメントを含みin vivoでそれらを発現することができる組換えウイルスベクターの投与を含むことができる。一次投与及び二次投与の両方が、本発明の狂犬病Gポリペプチドを含みさらに発現する組換えウイルスベクターを含むことができることはさらに特記される。したがって、本発明の組換え狂犬病ウイルスベクターは、任意の順序で組換え狂犬病抗原とともに投与するか、また別には一次組成物及び二次組成物の両方として単独で用いてもよい。

本発明のプライム-ブーストプロトコルの別の特徴では、本発明の狂犬病Gポリペプチド、抗原及び／又はその変種又はフラグメントを含みin vivoでそれらを発現する組換えウイルスベクターを含む組成物が投与され、続いて狂犬病ポリペプチド又は抗原を含む不活化ウイルス組成物又はワクチンが投与される。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、不活化ウイルス組成物又はワクチンの投与と、その後に続く本発明の狂犬病Gポリペプチド、抗原及び／又はその変種又はフラグメントを含みin vivoでそれらを発現する組換えウイルスベクターの投与を含むことができる。
本発明のプライム-ブーストプロトコルのさらにまた別の特徴では、プライム-ブーストプロトコルは、本発明の組換えウイルスベクター基剤組成物の少なくとも1回の基礎投与及び本発明のプラスミド基剤組成物の少なくとも1回のブースト投与を含む。同様に、該プライム-ブーストは、本発明のプラスミド基剤組成物の少なくとも1回の基礎投与及び本発明の組換えウイルスベクター基剤組成物の少なくとも1回のブースト投与を含むことができる。

哺乳動物である標的種のための組成物の一用量体積、例えばイヌ組成物の一用量体積は、ウイルスベクター、例えば非ポックスウイルス-ウイルスベクター基剤組成物を基準にすれば、一般的には約0.1から約2.0mL、約0.1から約1.0mL、及び約0.5mLから約1.0mLである。
ワクチンの有効性は、最後の免疫の後で動物（例えばイヌ）を狂犬病ビルレント株でチャレンジすることによって試験することができる。一般的には、動物を麻酔し、1.0mLのチャレンジ物質をIM注射により投与する（各前頭筋及び／又は咀嚼筋に0.5mL）。目標用量は約3.8log₁₀LD₅₀/mLであり、マウスのチャレンジバック滴定を実施して、実際の接種用量を実証する。チャレンジ7日前に、イヌを個々のケージに慣れさせ、実験終了まで個々のケージで維持する。動物に市場で入手できる飼料を与え、水は随意に提供する。SAS(商標)ソフトウェアV9.1エンタープライズガイドを用いてケージ収容のためのランダム表を作成できる。0日目に、最初のチャレンジ懸濁液ストックをPBS＋2％ウシ胎児血清で1：100に稀釈することによってチャレンジ株を調製することができる。前記稀釈チャレンジ物質を無菌的で密閉されたキャップ付きバイアルに入れ、相応に標識し、使用まで氷上で維持することができる。チャレンジ前の朝に、動物がイヌの場合、鎮痛剤/抗炎症剤、例えばフィロコキシブ5mg/kg（半錠ずつ増やして計算した用量）を投与することが推奨される。チャレンジ後少なくとも30日間毎日、死亡率又は狂犬病感染の指標である進行性の神経学的徴候について動物を観察するべきである。

進行性神経学的徴候を示す動物を認可手順にしたがって人道的に安楽死させる。死亡又は安楽死直後に、中心部脳サンプルを全動物から採集する。チャレンジ後の血液収集は、麻酔下での安楽死の時点で心臓穿刺によりで実施できる。血清を得るために血液を処理し、2つのアリコット（各2−3mL）に分け、この血清を試験まで凍結保存できる（〜-20℃）。チャレンジ後の期間に死亡した又は安楽死させた全動物及び実験終了時に安楽死させた一切の生存動物から、延髄の中心部サンプルを収集することができる。サンプルは氷上で生のまま又はドライアイス上で凍結させて試験施設まで輸送できる。血清の狂犬病抗体力価は、迅速蛍光焦点阻害試験（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test（RFFIT））又は蛍光抗体ウイルス中和（FAVN）アッセイを用いて定量し、実験動物の脳組織は抗狂犬病モノクローナル抗体による直接免疫蛍光染色に付すことができる。
本明細書での開示は例示として提供され、本発明はこれらに限定されないことは当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当業界における知識から、当業者は、煩雑な実験をまったく行うことなく投与回数、投与ルート及び各注射プロトコルについて用いられるべき用量を決定することができる。

本発明は、本発明にしたがって製造した有効量の治療用組成物の動物への少なくとも1回の投与を意図する。動物は雄、雌、妊娠雌及び新生仔であり得る。本投与は、多様なルート（筋肉内（IM）、皮内（ID）若しくは皮下（SC）注射、又は鼻内若しくは経口投与を含むがただしこれらに限定されない）によることができる。本発明の治療用組成物はまた無針装置（例えば以下による：ピッグジェット（Pigjet）、デルモジェット（Dermojet）、バイオジェクター（Biojector）、アビジェット（Avijet）（Merial, GA, USA）、ベトジェット（Vetjet）又はビタジェット装置（Vitajet apparatus）（Bioject, Oregon, USA））によって投与できる。プラスミド組成物を投与する別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である（例えば以下を参照されたい：Tollefsen et al., 2002；Tollefsen et al., 2003；Babiuk et al., 2002；PCT出願WO99/01158）。別の実施態様では、治療用組成物は遺伝子銃又は金粒子ボンバードメントによって動物にデリバーされる。有利な実施態様では、動物はイヌ、フェレット又はアザラシである。

ある実施態様では、本発明は、狂犬病抗原又はエピトープのデリバリー及び標的細胞内での発現のための治療的有効量の処方物の投与を提供する。治療的に有効な量の決定は当業者には日常的実験である。ある実施態様では、該処方物は、狂犬病抗原又はエピトープを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び医薬的に又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤を含む。別の実施態様では、該医薬的に又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤はトランスフェクション又は感染を促進し、及び／又は該ベクター又は宿主内のタンパク質の保存を改善する。
本発明の別の実施態様は、動物で狂犬病に対する免疫学的又は防御応答を誘引又は誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、組換え狂犬病G免疫学的組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を誘引するために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
ある実施態様では、本明細書に開示する主要事案は免疫応答を誘引又は誘発する方法を実施するためのキットを目的とし、前記キットは、組換え狂犬病組成物若しくはワクチン、不活化狂犬病組成物若しくはワクチン、組換えウイルス組成物若しくはワクチン、又はプラスミド基剤狂犬病組成物若しくはワクチンのいずれか1つ、及び当該方法を実施するための指示書を含むことができる。

本発明の別の実施態様は、動物で狂犬病に対する免疫学的又は防御応答を誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明の狂犬病ポリペプチド又は抗原を含む組成物又はワクチン及び組換え狂犬病ウイルス組成物又はワクチン、並びに動物で免疫応答を誘引するために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明の別の実施態様は、動物で狂犬病に対する免疫学的又は防御応答を誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明の組換え狂犬病ウイルスベクターを含む組成物又はワクチン及び不活化狂犬病免疫学的組成物又はワクチン、並びに動物で免疫応答を誘引するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明の別の実施態様は、動物で狂犬病に対する免疫学的又は防御応答を誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明の組換え狂犬病ウイルスベクターを含む組成物又はワクチン及びプラスミド基剤狂犬病組成物又はワクチン、並びに動物で免疫応答を誘引するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明のさらに別の特徴は、上記に記載の本発明のプライム-ブーストワクチン免疫用キットに関する。該キットは、少なくとも2つのバイアルを含むことができる。第一のバイアルは本発明のプライムワクチン免疫用ワクチン又は組成物を含み、第二のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫用ワクチン又は組成物を含む。該キットは、有利には追加プライムワクチン免疫用又は追加ブーストワクチン免疫用の追加第一又は第二バイアルを含むことができる。

ある実施態様では、本発明は、狂犬病Gポリペプチドまたは抗原又はエピトープのデリバリー及び標的細胞内での発現のための治療的有効量の処方物の投与を提供する。治療的に有効な量の決定は当業者には日常的実験である。ある実施態様では、該処方物は、狂犬病Gポリペプチド又は抗原又はエピトープを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び医薬的に又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤を含む。別の実施態様では、該医薬的に又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、ベクター又はタンパク質のトランスフェクション又は感染を促進及び／又は保存を改善する。
医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は、0.9％NaCl（例えば食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法に用いることができる他の医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤にはポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただし前記に限定されない。医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからin vitroで発現されたタンパク質）の投与を容易にする任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。有利には、前記担体、ビヒクル又は賦形剤は、トランスフェクションを容易にするか、及び／又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善することができる。用量及び用量体積は一般的記述としてここで考察されるが、前記はまた、煩雑な実験を実施することなく当業界の情報と併せて本開示から当業者によって決定され得る。

プラスミドのために極めて適切な（ただし唯一無比に適切というわけではない）第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質は、有利には下記式を有するものである：

式中、R1は、12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族基であり、R2は、2又は3炭素原子を含む別の脂肪族基であり、さらにXはアミン又はヒドロキシル基（例えばDMRIE）である。別の実施態様では、陽イオン脂質は中性脂質、例えばDOPEと結びつき得る。
これら陽イオン脂質の中で、DMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム；WO96/34109）が好ましく、前記は有利には中性脂質、有利にはDOPE（ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン；Behr, 1994）と結びついてDMRIE-DOPEを形成する。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPE分子比は有利には約95：約5から約5：約95、より有利には約1：約1、例えば1：1である。
タイプ（1）のアジュバントポリマーの中で、架橋されたアクリル又はメタクリル酸のポリマー（特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたもの）が好ましい。これらの化合物はカルボマーの名称で知られている（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）。当業者はまたUS2,909,462を参照できる。前記文献は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8つを超えないヒドロキシル基で、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和、脂肪族基によって置き換えられてある）を有するポリヒドロキシル化合物によって架橋されたアクリルポリマーを提供する。好ましい基は2から4炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。該不飽和基はまた他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポル（Carbopol, BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売される製品が特に適切である。それらは、アリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋される。それらの中で、Carbopol 974P、934P及び971Pが挙げられる。

無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMA（Monsanto）が好ましい。前記は、直鎖又は架橋エチレン-無水マレイン酸コポリマーであり、それらは、例えばジビニルエーテルによって架橋される。以下の文献もまた参照されたい：J. Fields et al., 1960。
構造に関しては、アクリル又はメタクリル酸ポリマー及びEMAは、好ましくは以下の式を有する基本単位によって形成される：

式中、R1及びR2（これらは同じでも異なっていてもよい）はH又はCH₃を表し、ｘは0又は 1で、好ましくはｘは1であり、ｙは1又は2であってｘ＋ｙは2である。
EMAについては、ｘは0でｙは2であり、カルボマーについては、ｘ＝ｙ＝1である。
これらのポリマーは、水又は生理学的塩溶液（20g/L NaCl）に可溶性であり、pHは7.3から7.4に例えばソーダー（NaOH）で調整されて、発現ベクターを取り入れることができるアジュバント溶液が生成される。最終的な免疫学的組成物又はワクチン組成物のポリマー濃度は、約0.01から約1.5％w/v、約0.05から約1％w/v、及び約0.1から約0.4％w/vの範囲であり得る。
本発明で用いることができる他のサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNγ）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、形質転換成長因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫学的組成物又はワクチン組成物と一緒に同時投与されるか、及び／又は連続的に投与され得る。したがって、例えば、本発明のワクチンはまた、適切なサイトカイン（例えばワクチン接種されるべき又は免疫学的応答が誘引されるべき宿主と適合するサイトカイン（例えばイヌに投与される調製物のためにはイヌサイトカイン））をin vivoで発現する外因性核酸分子を含むことができる。
本発明をこれから以下の非限定的な実施例の手段によってさらに詳しく説明する。

組換え体vCP3006（狂犬病ウイルス糖タンパク質の4コピーを発現する）の構築
C5遺伝子座にクラシック狂犬病ウイルスG（2コピー）を保持するvCP65aを骨格として、合成狂犬病G遺伝子（2コピー）がC3遺伝子座に挿入されたALVAC組換えウイルスを作製した。
概要：合成コドン最適化狂犬病ウイルスG（配列番号：1）を親のカナリアポックスウイルス（ALVAC CP65a（US 5843456（Virogenetics）に詳しく記載）、6.1ｘ10E7 pfu/mLの力価を有し、1mLトリス緩衝液（pH9）に懸濁）のC3遺伝子座に挿入した。CP65aの作製に用いた親ALVACは、ブダペスト条約の下にATCCアクセッション番号VR-2547で1996年11月14日に寄託された。したがって、当業者は、US5843456のCP56a又はその合理的/機能的代替物を作製及び利用できると十分に期待できる。コドン最適化狂犬病ウイルスGのタンパク質配列はGenBank ACR15154.1（配列番号：1）と100％同一であった。ドナープラスミドは合成狂犬病G遺伝子（配列番号：5）及びISLプロモーター（配列番号：4）をC3遺伝子座プラスミド（p397-Syn Rabies G；図1）に含んでいた。該ドナープラスミドは、I3L-合成狂犬病G PCRフラグメントを含む〜1.6kbのXhoI-XmaIを採取し、前記をpHN606.1（pC3）でクローニングしてp397-Syn Rabies G（pC3 I3Lp Syn Rabies G；図1）を生成することによって作製した。In vitro組換えは初代ニワトリ胚線維芽細胞（1°CEF）で実施した。

組換え体vCP3006の生成：in vitro組換え（IVR）を開始するために、第一の1°CEF細胞に20μgのNotI消化プラスミドp397-Syn Rabies GをFuGENE-6(商標)（Roche）を用いてトランスフェクトした。このトランスフェクト細胞に続いてALVAC CP65aストックをMOI10で感染させた。24時間後に、このトランスフェクト感染させた細胞を採集し、超音波処理して組換えウイルススクリーニングに用いた。組換え体プラークはプラークリフトハイブリダイゼーション方法によりスクリーニングした。前記スクリーニングには、North2Southビオチンランダムプライム標識キット（Thermo Scientific#17075）で標識した140塩基対(bp)の固有I3Lプローブを用い、North2Southケミルミネセンスハイブリダイゼーション検出キット（Thermo Scientific#17097）により検出した。連続5回プラーク精製の後で、vCP3066.4.1.3.1.1.3と称される組換え体を得た。単一プラークを6回目のプラーク精製から選別し、P1（1ｘT25）、P2（6ウェルプレートの1ウェル）、P3（6ウェルプレートの1ウェル）、P4（1ｘT75フラスコ）及びP5へと増殖させた。P5のローラーボトルの感染細胞を採集し、濃縮してvCP3006ストックを作製した。vCP3006作製の模式図は図2に示されている。

vCP3006の分析：遺伝的純度の立証は、ハイブリダイゼーション用に合成狂犬病G及びC3部位プローブを用いP5ストックで実施した。サザンブロットハイブリダイゼーションのためには、ゲノムDNAをvCP3006 P5から抽出し、XbaI、HindIII及びBamHIで消化し、アガロース電気泳動により分離した。前記消化ゲノムDNAをナイロン膜に移し、合成狂犬病G特異的プローブで調べることによりサザンブロット分析に付した。プライマーRabG1.F（配列番号：52）及びRabG1.R（配列番号：53）を用いて合成狂犬病G特異的プローブを増幅した。
ウェスタンブロット：初代CEF細胞にP5ストックを4.5のMOIで感染させ、37℃で24時間インキュベートした。G発現レベルの比較のために、同じ感染多重度を用いて細胞をさらに親vCP65aに感染させた。続いてこれらの細胞及び培養上清を採集した。サンプルのタンパク質を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移した。この膜を1：500稀釈のマウス抗狂犬病G MAb（Chemicon #MAB8727）とともにインキュベートし、続いてアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体とインキュベートした。
配列分析：P5ストックのゲノムDNAのより詳細な分析を、C3遺伝子座のフランキングアーム及び合成狂犬病G挿入物のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマーC3R.3F（配列番号：44）及びC3L.1R（配列番号：47）（ALVACゲノムのC3遺伝子座のアームに位置を占める）を用いて全C3L-Syn Rabies G-C3Rフラグメント（配列番号：2）を増幅し、さらに図37に示すプライマーを用いて該フラグメントの配列を決定した。
結果：vCP3006のP5ストックの均質性は、ハイブリダイゼーションによって合成狂犬病Gについて100％陽性及びC3部位について100％陰性と確認された。P5ストックvCP3006ウイルスの力価は1.88ｘ10⁹ pfu/mlであった。組換え体vCP3006のゲノムの完全性は、制限酵素消化ゲノムDNAのゲル電気泳動による分離後にサザンブロット分析によって立証された（図3）。合成狂犬病G特異的プローブを用いたサザンブロット分析は予想サイズのバンド（14322bp及び5248bp BamHI、17367bp HindIII及び6293 bp Xba；図4）を示し、合成狂犬病GのC3遺伝子座への正確な挿入を明示した。レーン5の2つのバンド（図4）もまたC3の両部位への合成狂犬病Gの挿入を立証している（左C3部位については14322bp及び右C3部位については5248bp）。
狂犬病ウイルスGの発現分析のために、初代CEF細胞にvCP3006又はvCP65aのP5ストックを4.5のMOIで感染させた。上清も感染細胞サンプルと同様に処理し、ウェスタンブロット分析に付した。図5に示すように、狂犬病ウイルスGは感染細胞ペレットで検出できるが上清サンプルでは検出できず、当該GはALVACビリオンに検出可能なレベルでは取り込まれないことが示唆される（図5左）。抗狂犬病モノクローナル抗体はクラシックG及びvCP3006の追加コドン最適化Gの両方を認識するので、G発現vCP65aの量とvCP3006のそれとを比較する試みを実施した。この目的のために、細胞を同様なMOIで感染させ、種々の量の全細胞溶解物をウェスタンブロット分析に付した（図5右）。2μLの細胞溶解物をロードした対応するレーンを比較したとき、vCP3006のGバンドはvCP65aの対応するレーンよりも濃度が高いように見える。このことは、vCP3006はvCP65aよりも多くのGを発現することを示唆している。C3遺伝子座のフランキングアーム及び合成狂犬病G挿入物をカバーするPCR生成物の配列を、図6に示すプライマーを用いて決定した（その完全な開示は図37に提示される）。この配列分析は、合成狂犬病G並びにC3L及びC3R領域の配列は予想のとおりであり（図7）、さらにC3LからC3Rまでの完全なフラグメントが配列番号：2に示される配列を有することを提示した。予想される合成狂犬病Gペプチド配列は図8に提供され（配列番号：1）、前記は野生型狂犬病Gペプチド配列と同一である。

組換え体vCP3015（狂犬病ウイルス糖タンパク質及びOX40Lを同時発現する）の構築
概要：C5遺伝子座にクラシック狂犬病ウイルスG（2コピー）を保持するvCP65aを骨格として、OX40Lリガンド（cOX40L）（1コピー）がC6遺伝子座に挿入されたALVAC組換え体の作製及び特徴決定。コドン最適化合成イヌOX40Lリガンド（cOX40L、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー4に類似）を、親ウイルスALVAC CP65a（力価6.1ｘ10e7 pfu/mL、1mLトリス緩衝液（pH9）に再懸濁）のC6遺伝子座に挿入した。ドナープラスミドはp397-cOX40L（pC6 42 Kp cOX40L）（C6遺伝子座内で42Kプロモーターをもつ合成cOX40L）であり、前記は、〜0.6kbのEcoRI-XmaI合成イヌOX40Lフラグメント（42Kプロモーターを有する）を採取し、pC6Lにクローニングすることによって作製した（図9）。in vitro組換えは、初代1°CEF細胞で実施例1に開示した手順にしたがって実施した。組換え体プラークのスクリーニングは、551bpのcOX40L特異的プローブを用い本質的には実施例1に記載したように実施した。連続4回のプラーク精製の後で、vCP3015.9.2.1.2と称される組換え体を得た。単一プラークを4回目のプラーク精製から選別し、増殖させてvCP3015.9.2.1.2のP1（T-25フラスコ）、P2（T-75フラスコ）及びP3（4ローラーボトル）を得た。P3を採集し、感染CEFをペレットにし上清を除去した。前記感染CEFを1mMのトリス（pH9.0）に再懸濁して超音波処理し、さらに濃縮してvCP3015のウイルスストックを生成した。vCP3015作製の模式図は図10に示されている。
vCP3015の分析：vCP3015のP3からゲノムDNAを抽出し、NruIで消化して0.8％アガロースゲルでデュープリケートとして泳動させた。NruI消化ゲノムDNAをナイロン膜に移し、cOX40L又はクラシック狂犬病Gプローブで精査することによって、本質的に実施例1の記載にしたがってサザンブロット分析を実施した。PCRプライマーOX40L.1F（配列番号：61）及びOX40L.1R（配列番号：62）を用いてcOX40Lを増幅し、さらにプライマーCP65.2R（配列番号：39）及びC5R.3F（配列番号：30）を用いてクラシック狂犬病ウイルスGプローブを増幅した。
ウェスタンブロット：初代CEF細胞にvCP3015のP3ストックを10のMOIで感染させ、37℃で26時間インキュベートした。続いて細胞及び培養上清を採集した。サンプルのタンパク質を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移した。この膜を1：500稀釈のモノクローナル抗狂犬病G抗体（Chemicon #MAB8727）とその後に続くアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体をプローブとして用いて精査した。
配列分析：C5部位のクラシック狂犬病Gに関しては、P3ストックゲノムDNAの詳細な分析を、クラシック狂犬病G挿入物を含むC5遺伝子座のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマー7635CXL.R（配列番号：35）及び7635CXL.F（配列番号：36）（C5遺伝子座のアームの末端に位置を占める）を用いてC5R-クラシック狂犬病G-C5Lフラグメントの全体を増幅した。続いてこのフラグメントを図37に列挙したプライマーを用いて配列を決定した。C6のcOX40Lに関しては、P3ストックゲノムDNAの詳細な分析を、cOX40L挿入物を含むC6遺伝子座のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマーC6R.1F（配列番号：57）及びC6L.1R（配列番号：60）（C6遺伝子座のアーム末端に位置を占める）を用いてC6R-cOX40L-C6Lフラグメントの全体を増幅した。このフラグメントの配列を図37に列挙したプライマーを用いて決定した
結果：vCP3015のP3ストックの均質性は、ハイブリダイゼーションによってcOX40Lについて100％陽性及びエンプティーC6部位について100％陰性と確認された。P3ストックvCP3015ウイルスの力価は8.5ｘ10⁹ pfu/mlであった。組換え体vCP3015のゲノムの完全性もまたサザンブロット分析によって立証された。cOX40Lに関して、プローブは151,858bpフラグメントを検出し（図11）、クラシック狂犬病Gに関しては、プローブは、左C5部位について72,175bpフラグメントを、右C5部位について23,014bpフラグメントを、さらに両C5部位について806bpフラグメントを検出した（図12）。
クラシック狂犬病ウイルスGの発現分析のために、初代CEF細胞にvCP3015のP3ストックを10のMOIで感染させた。上清も感染細胞サンプルと同様に処理し、ウェスタンブロット分析に付した。図13に示すように、狂犬病ウイルスGは感染細胞ペレットで予想されたサイズで検出できるが上清サンプルでは検出できなかった。C6遺伝子座のフランキングアーム及びcOX40LをカバーするPCR生成物の配列を図14に示すプライマーを用いて決定した。この配列分析は、cOX40L並びにC6L及びC6R領域の配列は予想のとおりであることを示した（図15）。C5遺伝子座のフランキングアーム及びクラシック狂犬病ウイルスG挿入物をカバーするPCR生成物の配列を図17に示すプライマーを用いて決定した。結果から得られた配列は図18に示されている（配列番号：13）。

組換え体vCP3012（クラシック狂犬病ウイルスG、コドン最適化狂犬病ウイルスG及びOX40Lを同時発現する）の構築
概要：C5遺伝子座にクラシック狂犬病ウイルスG（2コピー）及びC3遺伝子座にコドン最適化狂犬病ウイルスG（2コピー）を保持するvCP3006を骨格として、イヌOX40Lリガンド（cOX40L）（1コピー）がC6遺伝子座に挿入されたALVAC組換え体の作製及び特徴決定。コドン最適化合成イヌOX40Lリガンド（42Kプロ―モーターによって先導される）を、親ウイルスALVAC vCP3006P5（ストック力価1.88ｘ10⁹ pfu/mL）のC6遺伝子座に挿入した。ドナープラスミドはp397-cOX40L（pC6 42 Kp cOX40L）は実施例2で用いたものと同一であった（図2）。
組換え体プラークのスクリーニングは、551bpのcOX40L特異的プローブを用い本質的には実施例1に記載したように実施した。連続4回のプラーク精製の後で、vCP3012.9.2.1.3と称される組換え体を得た。単一プラークを最後の回のプラーク精製から選別し、増殖させてP1（6ウェルプレート）、P2（T-75フラスコ）及びP3（ローラーボトル）を得てvCP3012.9.2.1.3を増幅させた。前記ローラーボトルから培養上清と同様に感染細胞を採集しペレットにした。上清を除去した後、ペレットを超音波処理し、さらに濃縮してvCP3012ストックウイルスを得た。
vCP3012の分析：vCP3012（P3）からゲノムDNAを抽出し、PmeI、NruI及びBamHIで消化してアガロース電気泳動によって分離した。消化ゲノムDNAをナイロン膜に移し、cOX40L、合成狂犬病G及びクラシック狂犬病Gプローブで精査することによって、本質的に実施例1の記載にしたがってサザンブロット分析を実施した。PCRプライマーOX40L.1F（配列番号：61）及びOX40L.1R（配列番号：62）を用いてcOX40Lプローブを増幅し、プライマーCP65.2R（配列番号：39）及びC5R.3F（配列番号：30）を用いてクラシック狂犬病ウイルスGプローブを増幅し、さらにRabG.1R（配列番号：53）及びRabG.1F（配列番号：52）を用いて合成狂犬病ウイルスを増幅した。
ウェスタンブロット：初代CEF細胞にvCP3012のP3ストックを10のMOIで感染させ、37℃で24時間インキュベートした。続いて細胞及び培養上清を採集した。サンプルのタンパク質を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移した。この膜を1：500稀釈のモノクローナル抗狂犬病G抗体（Chemicon #MAB8727）、続いてアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体とともにインキュベートした。
配列分析：C6部位のcOX40Lに関しては、P3ストックゲノムDNAの分析は、cOX40L挿入物を含むC6遺伝子座のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマーC6R.1F（配列番号：57）及びC6L.1R（配列番号：60）（C6遺伝子座のアームの末端に位置を占める）を用いてC6R-cOX40L-C6Lフラグメントの全体を増幅した。このフラグメントを図37に列挙したプライマーを用いて配列を決定した。C3の合成狂犬病Gに関しては、P3ストックゲノムDNAの分析は、C3遺伝子座のフランキングアーム及び合成狂犬病G挿入物のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマーC3R.2F（配列番号：43）及びC3L.1R（配列番号：47）（C3遺伝子座のアームに位置を占める）を用いてC3R-Syn Rabies G挿入物-C3Lフラグメントの全体を増幅した。C5のクラシック狂犬病Gに関しては、P3ストックゲノムDNAの分析は、クラシック狂犬病G挿入物を含むC5遺伝子座のPCR増幅及び配列分析によって実施した。プライマー7635CXL.R（配列番号：35）及び7635CXL.F（配列番号：36）（C5遺伝子座のアームの末端に位置を占める）を用いてC5R-クラシック狂犬病G-C5Lフラグメントの全体を増幅した。このフラグメントを図37に列挙したプライマーを用いて配列を決定した。
結果：vCP3012のP3ストックの均質性は、ハイブリダイゼーションによってcOX40L挿入物について100％陽性及びエンプティーC6部位について100％陰性と確認された。P3ストックvCP3012ウイルスの力価は4ｘ10⁹ pfu/mlであった。組換え体vCP3012のゲノムの完全性もまたサザンブロット分析によって立証された。cOX40Lに関して、プローブは200,362bpフラグメントを検出し（図21）、合成狂犬病Gに関しては、左C3部位について14322bpフラグメントを、右C3部位について5248bpフラグメントを（図22）、さらにクラシック狂犬病Gに関しては両C5部位について806bp、左C5部位について72,436bp及び右C5部位について23,275bpフラグメントを検出した（図23）。これらの予想されたサイズは、C6遺伝子座におけるcOX40Lの、C3遺伝子座における合成狂犬病Gの、さらにC5遺伝子座におけるクラシック狂犬病Gの正確な挿入を示した。
合成狂犬病ウイルスGと同様にクラシック狂犬病ウイルスGの発現分析のために、初代CEF細胞にvCP3012のP3ストックを10のMOIで感染させた。上清も感染細胞サンプルと同様に処理し、ウェスタンブロット分析に付した。図24に示すように、狂犬病ウイルスGは感染細胞ペレットで予想されたサイズで検出された。
C6遺伝子座のフランキングアーム及びcOX40L挿入物をカバーするPCR生成物の配列を図25に示すプライマーを用いて決定した。この配列分析は、cOX40L並びにC6L及びC6R領域の配列は予想のとおりであることを示した（図26）。C3遺伝子座のフランキングアーム及び合成狂犬病ウイルスG挿入物をカバーするPCR生成物の配列を図27に示すプライマーを用いて決定した。結果から得られた配列は図28に示されている（配列番号：20）。これらの結果は、vCP3012中の合成狂犬病G挿入物並びに該合成狂犬病G挿入物周囲のC3左及び右アームの配列は予想のとおりであることを示した。C5遺伝子座のフランキングアーム及びクラシック狂犬病ウイルスG挿入物をカバーするPCR生成物の配列を図29に示すプライマーを用いて決定した。結果から得られた配列は図30に示されている（配列番号：23）。これらの結果は、vCP3012中のクラシック狂犬病G挿入物並びに該クラシック狂犬病G挿入物周囲のC5左及び右アームの配列は予想のとおりであることを示した。

イヌのワクチン免疫及び血清学による、vCP65Aと比較した3つの新規な組換えカナリアポックスワクチンの有効性の評価
この実験のために、同腹仔IDを因子とし、全てのイヌを5つの異なる処置グループにランダムに割り当てた（各グループに6匹のイヌ）。異なるワクチングループのイヌをランダムに囲いに割り当て、同じ囲い内でワクチングループを混ぜ合わせた。性別で分けた囲いにイヌを割り当てた。コントロールグループのイヌは、チャレンジ前の期間はワクチン接種動物とは異なる囲いに収容される。SAS(商標)ソフトウェアV9.1エンタープライズガイドを用いてランダム表を作成した。0日目に候補ワクチン（表1）を用いてイヌにワクチンを接種した。血液サンプルを0、7、14、21、28，48、70及び90日目に採取し、狂犬病抗体力価をRFFITによって決定した。

表1：処置グループ
幾何平均RFFIT力価及び95％信頼区間を各グループ（A、B、C及びD）及び日について計算した。抗体のピークは21日目のようである。結果は表2に示されている。14日目に、vCP3012ワクチン接種動物は、他の全てのグループよりもはるかに高い力価を示す。21日目にcOX40L含有カナリアポックスベクターをワクチン接種された両グループが、他のワクチン接種グループよりもはるかに強い中和応答を示す。したがって、より早期の免疫開始及びより高いピーク力価が、cOX40Lを発現するベクターを接種されたグループで明瞭に観察される。21日目から実験の終了まで、vCP3012ワクチン接種動物は、他の全てのグループよりもはるかに高い力価を維持した。90日目に、vCP3012を接種された全てのイヌが0.5 IU/mL（狂犬病ビルレントチャレンジ実験で一般的に防御性であるとみなされる力価）より高い力価を有した。したがって、cOX40L発現は、カナリアポックスベクター狂犬病ワクチンによる免疫持続期間を改善する。
結論：親vCP65aと比較して、vCP65a又はvCP3006の骨格へのcOV40Lの追加は、抗狂犬病中和抗体によって測定したとき明瞭に抗狂犬病免疫の開始を強化し、抗狂犬病中和抗体ピーク力価を増加させるとともに抗狂犬病免疫の持続期間を少なくとも90日間（血液サンプル採取の最後の日付）延長する。

表2；幾何平均力価及び95％信頼区間

イヌのビルレントチャレンジによる3つの新規な組換えカナリアポックスワクチンの免疫原性の評価
32から3カ月齢の計画交配ビーグルを、同腹仔IDを一次ランダム化因子として用い、5つの処置グループ（n＝6）の1つにランダムに割り当てた。0日目に下記表3にしたがって全てのイヌにワクチンを接種した。

表3：ワクチン接種計画
*ワクチン目標力価10^5.9 TCID₅₀/mL
ワクチン接種後1時間、動物を急性全身性反応についてモニターした。注射部位を調べ、その後直腸温度を3日間毎日記録した。ワクチン接種前及びその後定期的間隔の迅速蛍光焦点阻害試験（RFFIT）によって測定される狂犬病抗体力価のために血液を収集した。好ましい血清学的応答を基にして、ワクチン接種後約1年（397日目）でグループCのイヌ（vCP3015）をビルレント狂犬病チャレンジに付した。チャレンジ物質（1：100稀釈のニューヨーク株1 42.90）は、麻酔下で左右の前頭筋に筋肉内ルートにより投与された（各筋に0.5mL）。チャレンジ物質の逆滴定はQCD-CM-030にしたがって実施した。チャレンジ後30日間、死亡率及び進行性神経学的徴候の証拠について動物を観察した。安楽死直後にRFFIT試験のために全てのイヌから血清を入手した。両脳半球を剖検時に収集し、右半球を直接免疫蛍光による狂犬病ウイルス検出に付した。
すべての統計分析はSAS、Cary、NC（SAS Version 9.1, Enterprise Guide）を用いて実施した。全試験で二方支援を実施し（two-sided）、統計的有意はP値が0.05未満で決定した。一次変数は、迅速蛍光焦点阻害試験（RFFIT）によって測定される狂犬病抗体血清力価であった。血清変換は、陰性抗体力価（検出閾値以下、すなわち0.2 IU/mL以下）から陽性狂犬病抗体（0.2 IU/mLを超える）への変化と定義した。グループA（vCP3006）の1匹のイヌ（0.3 IU/mLの低い狂犬病力価を示し、再検査で0.5 IU/mLの値を提示した）を除いて、全てのイヌがワクチン接種前に狂犬病について血清陰性であった。Eグループ（陰性コントロールグループ）の3匹のイヌが実験開始から30日以内に低い抗体力価を示した。48日目までに、グループEの全てのイヌが血清陰性で、本実験を通して陰性を維持した。前記の低狂犬病力価は、ほぼ確実に残留母体抗体によるものであった。ワクチン接種後のグループA、B、C及びDの幾何平均RFFIE抗体力価は表4に示されている。

表4：ワクチン接種後の各グループの狂犬病血清抗体幾何平均力価（IU/mL）
*GMTは参照ワクチン（グループD；vCP65a）とは有意に相違する（p＜0.05）。
血清変換は、ワクチン接種後7日で、グループB（vCP3012）の全てのイヌ、並びにグループA（vCP3006）、C（vCP3015）及びD（vCP65A）の5/6のイヌで観察された。vCP3012を接種されたイヌは、グループA（vCP3006）及び参照ワクチングループD（vCP65A）と比較して、14日目から90日目まで有意で予想不能に高い狂犬病力価を示した。グループC（vCP3015）の狂犬病GMTは、21，48、70及び90日目に参照ワクチングループD（vCP65A）よりも有意に高かった。vCP3006を接種されたイヌは、90日目を除いて参照ワクチングループD（vCP65A）と比較して狂犬病力価に有意な相違を示さなかった。
ワクチン接種後約1年で、グループC（vCP3015）のイヌをビルレント狂犬病チャレンジに付した。グループB及びEの残りのイヌは、本実験を後日終了するまでこの実験下に維持した。投与した本チャレンジウイルスの50％マウス致死算出用量は0.03 mL中に2.2 log₁₀（158.5 MLD₅₀）であった。各イヌに1mLを投与したので、イヌの用量は3.96 log₁₀ MLD₅₀であった。チャレンジ前及びチャレンジ後RFFIT力価、及びチャレンジ後狂犬病蛍光抗体の結果、及び有病率/致死率データは下記の表5に示されている。

表5：結果のまとめ
*チャレンジ後30日目前に安楽死させた全てのイヌが狂犬病感染の臨床徴候を示した。
**CBCCTX、CBDCCE及びCBDCCYのチャレンジ前の日は752日目であった。

グループCのイヌはいずれもチャレンジ後30日まで臨床的な異常を全く示さなかった。陰性コントロールグループの全てのイヌが、12日目から17日目の間にイヌ狂犬病感染に適合する臨床徴候（例えば行動の変化、嗜眠、流ぜん、顔面痙攣、嚥下困難、及び四肢麻痺）を発した。チャレンジ後17日までに安楽死させた全てのイヌは狂犬病蛍光抗体試験について陽性であり、実験終了時に安楽死させた残りのイヌは脳組織の狂犬病蛍光抗体試験について陰性であった。さらにまた、ワクチン接種後に、局所注射部位反応も（びまん性腫脹、明瞭な腫脹、触診時の痛み、又は痒み）、直腸温度の臨床的に重大な上昇も観察されなかった。
考察：ワクチン接種前力価の結果から、約10^5.9 TCID₅₀/mLの目標力価に達するように各試験ワクチンの最終体積を調整した。結果的に、他の試験ワクチンよりも高いワクチン接種前力価を有していたvCP3012（グループB）のワクチン接種ではより小さい体積が投与された。ワクチン接種から1又は2年後の狂犬病チャレンジのための動物の選別は、参照ワクチン（グループD、vCP65A）と比較して、3か月の期間の間の狂犬病幾何平均血清学力価を基準にした。グループAはこのチャレンジ基準に適合せず、したがってこのグループに属するイヌは151日目に本実験から外した。グループB及びCはこの基準に明瞭に適合した。1年及び2年の免疫持続評価をそれぞれvCP3015及びvCP3012のために選択した。どの試験ワクチンを評価するかの選択は、第一に血清学の結果及び最小数の狂犬病G遺伝子コピーを有する構築物を基準にした。vCP3015構築物は2コピーを含み、vCP3012は4コピーを含むので、したがってvCP3015を最初の評価のために選択した。2年免疫持続評価はvCP3012でワクチン接種したイヌで実施され、参照グループ（vCP65A）と比較されるであろう。
これらの結果は、vCP構築物は皮下ルートでイヌに1回投与されるとき安全であることを示した。2コピーの狂犬病G遺伝子及び免疫調節物質OX40Lを含む構築物（vCP3015）の一用量（10^5.87 TCID₅₀/mL）を皮下ルートでワクチン接種されたイヌは、ワクチン接種から1年後のビルレント狂犬病チャレンジに対して防御された。vCP3012（4コピーの狂犬病G遺伝子及びOX40Lを含む）は、他の全てのvCP構築物と比較してより早期かつより強力な狂犬病抗体応答を誘発し、ワクチン接種から2年後の狂犬病チャレンジによって評価されるであろう。

他の有効な抗原/OX40L組合せ
本発明者らは、抗原とOX40Lの他の多くの組合せが、同じ抗原を単独で発現するポックスウイルスよりも有効性が改善されたポックスウイルスベクター系ワクチンをもたらすであろうと考える。テーブル3は、抗原とOX40Lの組合せの非限定的リストを提供する。前記組合せでは、OX40Lは、標的動物で有効な遺伝子アジュバントとして機能するその高い能力の故に選択される。図38は、多様な種々の種に由来する既知/推定OX40Lのアラインメントを提供する。当業者は、OX40Lタンパク質はまた動物の1つの属又は種（例えばカニス・ファミリアリス（Canis familiaris））の中でいくらか変動し得ることを理解しているであろう。したがって、配列番号：12と十分な相同性を有するOX40Lタンパク質もまたイヌで有効な遺伝子アジュバントとして機能するはずであり、本発明に包含される。さらにまた、本発明者らは、同様な結果が、抗原及びアジュバント能力を有するOX40Lをコードする遺伝子を動物宿主においてin vivoで発現する他のベクター（ウイルスベクターを含む）を用いておそらく達成され得ると考える。例えば、ウイルスベクターには、DNAウイルス、RNAウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ様ウイルス、白血病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV）、マレック病ウイルス（MDV）、SB1及びHVTなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。

テーブル３

以下の番号を付与した項目は非限定的実施態様を提供する。
1．以下を含む組成物：
a）以下の（i）及び（ii）の両方をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター：
（i）狂犬病G、インフルエンザ、FMDV、BTV、PCV2、PRRSV、WNV、ニパーウイルス、白血病ウイルス、リーシュマニアウイルス、FIV、FIPV、FCV、AHSV、VSV及び免疫学的に有効な前記の変種又はフラグメント、及び
（ii）OX40Lポリペプチド又は匹敵し得るアジュバント能力を有するその変種又はフラグメント；並びに
b）医薬的に又は獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤又は賦形剤。
2．該ベクターが標的動物（すなわち該組成物が投与される動物のタイプ）由来のOX40Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、項目1の組成物。
3．該OX40Lポリペプチドが、配列番号：12（イヌ標的用）、配列番号：63（ネコ標的用）、配列番号：64（ウマ標的用）、配列番号：65（ウシ標的用）、配列番号：66（ブタ標的用）、配列番号：70（トリ標的用）、配列番号：71（ヒツジ標的用）、又は配列番号：67（霊長類標的用）に示す配列と少なくとも90％同一である、項目2の組成物。
4．該1つ以上のポリペプチドが狂犬病Gポリペプチドであり、かつ該標的動物がイヌ又はネコである、項目3の組成物。
5．該1つ以上のポリペプチドがBTVポリペプチドであり、かつ該標的動物がウシ又はヒツジである、項目3の組成物。
6．該1つ以上のポリペプチドがFMDVポリペプチドであり、かつ該標的動物がウシ又はブタである、項目3の組成物。
7．該1つ以上のポリペプチドがPRRSVポリペプチドであり、かつ該標的動物がブタである、パラ3の組成物。
8．該1つ以上のポリペプチドがPCV2ポリペプチドであり、かつ該標的動物がブタである、項目3の組成物。
9．該1つ以上のポリペプチドが白血病ウイルスポリペプチドであり、かつ該標的動物がネコである、項目3の組成物。
10．該1つ以上のポリペプチドがインフルエンザポリペプチドであり、かつ該標的動物がウマ、イヌ又はネコである、項目3の組成物。
11．該1つ以上のポリペプチドがWNVポリペプチドであり、かつ該標的動物がイヌ又はウマである、項目3の組成物。
12．該1つ以上のポリペプチドがトリ動物で免疫応答を誘引できる、項目3の組成物。
13．該ポリペプチドがNDV、MDV、IBD又はIBDVに由来する、項目12の組成物。
14．該発現ベクターがMDV、NDV、IBD、IBDV、アデノウイルス、アデノ様ウイルス又はヘルペスウイルスである、項目1−4のいずれか1つの組成物。
15．該狂犬病Gポリペプチドが配列番号：5に示す配列によってコードされる、項目4の組成物。
16．該OX40Lポリペプチドが配列番号：12に示す配列と少なくとも90％同一である、項目4の組成物。
17．該OX40Lポリペプチドが配列番号：12に示す配列を有する、項目13の組成物。
18．該発現ベクターが組換えポックスウイルスベクターである、項目1−4のいずれか1つの組成物。
19．該ベクターがカナリアポックスである、項目15の組成物。
20．該ベクターが配列番号：23に示す配列を含む、パラ16の組成物。
21．以下の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクター：
a）狂犬病G、インフルエンザ、FMDV、BTV、PCV2、PRRSV、WNV、ニパーウイルス、白血病ウイルス、リーシュマニアウイルス、FIV、FIPV、FCV、AHSV、VSV及び免疫学的に有効な前記の変種又はフラグメント、及び
b）OX40Lポリペプチド又は匹敵し得るアジュバント能力を有するその変種又はフラグメント。
22．該OX40Lポリペプチドが、配列番号：12（イヌ標的用）、配列番号：63（ネコ標的用）、配列番号：64（ウマ標的用）、配列番号：65（ウシ標的用）、配列番号：66（ブタ標的用）、又は配列番号：71（ヒツジ標的用）に示す配列と少なくとも90％同一である、項目21のベクター。
23．該1つ以上のポリペプチドが狂犬病Gポリペプチドであり、かつ該標的動物がイヌ又はネコである、項目22のベクター。
24．該1つ以上のポリペプチドがBTVポリペプチドであり、かつ該標的動物がウシ又はヒツジである、項目22のベクター。
25．該1つ以上のポリペプチドがFMDVポリペプチドであり、かつ該標的動物がウシ又はブタである、項目22のベクター。
26．該1つ以上のポリペプチドがPRRSVポリペプチドであり、かつ該標的動物がブタである、項目22のベクター。
27．該1つ以上のポリペプチドがPCV2ポリペプチドであり、かつ該標的動物がブタである、項目22のベクター。
28．該1つ以上のポリペプチドが白血病ウイルスポリペプチドであり、かつ該標的動物がネコである、項目22のベクター。
29．該1つ以上のポリペプチドがインフルエンザポリペプチドであり、かつ該標的動物がウマ、イヌ又はネコである、項目22のベクター。
30．該1つ以上のポリペプチドがWNVポリペプチドであり、かつ該標的動物がイヌ又はウマである、項目22のベクター。
31．該狂犬病Gポリペプチドが配列番号：5に示す配列によってコードされる、項目23のベクター。
32．該ポリヌクレオチドが配列番号：1に示す配列を有する狂犬病Gポリペプチドをコードし、さらにOX40Lポリペプチドが配列番号：12に示す配列と少なくとも90％の同一性を有する、項目22のベクター。
33．該ベクターがポックスウイルスである、項目21のベクター。
34．項目 1−14のいずれか1つの組成物の少なくとも1用量を投与する工程を含む、動物をワクチン免疫する方法。
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本発明の好ましい実施態様をこれまで詳細に述べてきたが、上記項目に規定する本発明は、上記に示す特定の説明に限定されないことは理解されよう。なぜならば、それらの多くの明白な改変が本発明の意図及び範囲から外れることなく可能だからである。

Claims (15)

1. ２または４コピーの狂犬病G遺伝子および１コピーのイヌOX40L遺伝子を含む組換えカナリアポックスベクターを含むワクチン組成物であって、それぞれが動物宿主においてin vivoで発現する、前記ワクチン組成物。
2. カナリアポックスベクターが４コピーの狂犬病G遺伝子を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. 狂犬病G遺伝子の少なくとも1つが配列番号：5に示す配列を有する、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
4. 狂犬病G遺伝子の２コピーが配列番号：5に示す配列を有する、請求項３に記載のワクチン組成物。
5. OX40L遺伝子が配列番号：12に示す配列を有するOX40Lポリペプチドをコードする、請求項１、２または４に記載のワクチン組成物。
6. カナリアポックスベクターがALVACである、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
7. ベクターが配列番号：23に示す配列を含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
8. 以下のポリヌクレオチドの両方を含み、各遺伝子を動物宿主においてin vivoで発現させ得る、組換えカナリアポックスベクター：
   a）２または４コピーの狂犬病G遺伝子、及び
   b）１コピーのイヌOX40L遺伝子。
9. 配列番号：20に示す配列を含む、請求項８に記載のベクター。
10. 配列番号：7に示す配列を含む、請求項８に記載のベクター。
11. 狂犬病G遺伝子の２コピーが配列番号：5に示す配列を有する、請求項８に記載のベクター。
12. ポリヌクレオチドが配列番号：5に示す配列有する狂犬病G遺伝子を２コピー、および配列番号：16に示す配列を有する狂犬病G遺伝子を２コピー含む、請求項８または１１に記載のベクター。
13. 動物に１回のみ投与するための、請求項１記載のワクチン組成物。
14. 動物がイヌ科動物またはネコ科動物である、請求項１記載のワクチン組成物。
15. 動物がイヌである、請求項１記載のワクチン組成物。