BR112015018989B1

BR112015018989B1 - Combinação de vacina/inibidor da via de pd-1, inibidor da via de pd-1 e vacina de rna

Info

Publication number: BR112015018989B1
Application number: BR112015018989-0A
Authority: BR
Inventors: Mariola Fotin-Mleczek; Karl-Josef Kallen; Jochen Probst
Original assignee: Curevac Ag
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2023-11-14
Also published as: US20180169202A1; MX2015010880A; RU2718988C2; HK1250910A1; US10434158B2; US9974845B2; SG10201710472PA; US20180169201A1; JP2016514097A; AU2018241156B2; US11458195B2; SG11201506052PA; CN105073135A; ES2739913T3; ES2649180T3; DK2958588T3; AU2018241156A1; JP2019014746A; SG10201710473VA; JP6768045B2

Abstract

COMBINAÇÃO DE VACINAÇÃO E INIBIÇÃO DA VIA DE PD-1. A presente invenção refere-se a uma combinação de vacina/inibidor que compreende uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno e uma composição que compreende pelo menos um inibidor da via de PD-1, de preferência dirigido contra o receptor PD-1, ou os seus ligantes PD-L1 e PD-L2. A presente invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica e partes do kit que compreende os componentes de uma tal combinação de vacina/inibidor. Além disso, a presente invenção refere-se a utilização médica de tal combinação da vacina/inibidor, a composição farmacêutica e as partes do kit que compreende uma tal combinação de vacina/inibidor, em particular para a prevenção ou tratamento de doenças tumorais ou de câncer ou doenças infecciosas. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de uma vacina de RNA em terapia em combinação com um inibidor da via de PD-1 e à utilização de um inibidor da via de PD-1 na terapia em combinação com uma vacina de RNA.

Description

[001] A presente invenção refere-se a combinação de vacina/inibidor que compreende uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno e uma composição que compreende pelo menos um inibidor da via de PD-1, de preferência dirigido contra o receptor de PD-1 ou seus ligantes PD- L1 e/ou PD-L2. A presente invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica e a partes do kit que compreende uma tal combinação de vacina/inibidor. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização médica de tal combinação da vacina/inibidor, a composição farmacêutica e as partes do kit que compreende uma tal combinação de vacina/inibidor, em particular para a prevenção ou tratamento de doenças tumorais ou de câncer ou doenças infecciosas. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de uma vacina de RNA em terapia em combinação com um inibidor da via de PD-1 e à utilização de um inibidor da via de PD-1 na terapia em combinação com uma vacina de RNA.

[002] De uma forma tradicional, a imunoterapia do câncer foi focada na estimulação do sistema imune através da vacinação ou imunoterapia celular adotiva para induzir uma resposta anti-tumoral. Esta abordagem baseou-se no pressuposto de que as células tumorais expressam alvos antigênicos, mas que as células T anti-tumor não foram suficientemente ativadas. Portanto, para contornar este problema, buscou principalmente aumentar o reconhecimento dessas metas antigênicas, estimulando as vias imunes inatas e co- estimuladores positivos chave (tais como os receptores CD28, CD154 e TLR).

[003] Mais recentemente, tornou-se claro que o sistema immune reconhece os antígenos tumorais, mas permanece quiescente, embora os antígenos tumorais estejam presentes. Esta observação levou à hipótese de que exihaste mecanismos de inibição específicos que limitam ou mesmo desligam a resposta anti-tumoral. Esta hipótese foi confirmada quando as moléculas da superfície das células T reguladoras negativas foram descobertas as quais são reguladas de forma positiva em células T ativadas para atenuar a sua atividade, resultando em morte menos eficaz das células tumorais. Estas moléculas inibitórias foram denominadas moléculas negativas co- estimuladoras devido à sua homologia com a molécula co-estimulatória das células T CD28. Estas proteínas, também referidas como proteínas de ponto de verificação imunes, em função de várias vias, incluindo a atenuação dos sinais de ativação precoce, competição por co- estimulação positiva e a inibição direta de células apresentadoras de antígenos (Bour-Jordan et al., 2011. Immunol Rev. 241 (1): 180 a 205; PMID: 21488898). Um membro desta família de proteínas é a morte programada-1 (PD-1) e os seus ligantes B7-H1/PD-L1 (CD274) e B7- DC/PD-L2 (CD273).

[004] PD-1 é expresso em células T e B ativadas bem como em monócitos envolvidos na regulação do equilíbrio entre a ativação imune e a tolerância. O principal papel da PD-1 é o de limitar a atividade das células T na periferia durante uma resposta inflamatória a infecção e para limitar a auto-imunidade. A base para esta regulação é que os ligantes de PD-1 de B7-H1/PD-L1 e B7-DC/PD-L2 são regulados de forma positiva em resposta a diversas citocinas pró-inflamatórias e pode ligar-se a PD-1 em células T ativadas em tecidos inflamados, limitando dessa maneira a resposta imune. A deleção do gene PD-1 leva a complicações auto-imunes, por exemplo, sintomas semelhantes ao lúpus (Nishimura et al, 1999, Immunity 11 (2): 141 a 51; PMID: 10.485.649).

[005] Além disso, verificou-se que B7-H1/PD-L1 é frequentemente sobre-regulado em muitos tipos de tumores diferentes, onde o mesmo inibe as respostas de células T anti-tumorais locais por meio da ligação a PD-1 em linfócitos infiltrantes de tumor. Por exemplo, foi demonstrado que PD-L1 desempenha um papel na evasão imune do tumor em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (Dong et al, 2002. Nat Med 8 (8): 793 a 800). Os autores demonstraram que a expressão forçada de B7-H1/PD-L1 em tumores que são normalmente B7-H1/PD-L1 negativos inibe a sua eliminação imune e que tal bloqueio de anticorpo restaura as respostas anti-tumorais. Além disso, mostrou- se que muitos tumores humanos, tais como carcinomas do pulmão, ovário e cólon, regulam de forma positiva B7-H1/PD-L1 em proporção às suas contrapartes dos tecidos normais. Em resumo, estas observações sugeriram usar o bloqueio da via de PD-1 para a imunoterapia do câncer (Zitvogel e Kroemer, 2012. Oncoimmunology 1, 1223 a 1125).

[006] Neste contexto US2010/0055102 descreve a utilização de antagonistas de PD-1 para aumentar uma resposta imune da célula T em um mamífero.

[007] Recentemente, foram relatados os primeiros ensaios clínicos com inibidores de ponto de verificação imunes (ICIs) contra o receptor de PD-1 e o seu ligante PD-L1. O primeiro ensaio de fase I com o anticorpo monoclonal anti-PD-1 BMS-936558 foi conduzido em pacientes com tumores sólidos metastáticos refratários de tratamento. Foi observada atividade clínica em pacientes com melanoma, carcinoma renal, câncer colo-retal e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Pode ser demonstrado que PD-L1 é sobre- expresso em muitos cânceres e é frequentemente associado com mau prognóstico. Além disso, a expressão na superfície celular do tumor de PD-L1 em biópsias de pré-tratamento emergiu como um biomarcador potencial de resposta, de acordo com a via de biologia (Brahmer et al, 2010. J Clin Oncol 28 (19): 3167-75; PMID: 20516446).

[008] Outro estudo clínico com BMS-936558 produziu respostas objetivas em aproximadamente um em cada quatro para um em cinco pacientes com câncer do pulmão de células não pequenas, melanoma ou câncer de célula renal; o perfil de eventos adversos não parece excluir a sua utilização. Os dados preliminares sugerem uma proporção entre a expressão de PD-L1 no encaminhamento de células tumorais e de resposta objetiva (Topalian et al, 2012. N Engl J Med 366 (26): 2443 a 54; PMID: 22658127).

[009] Além disso, um estudo de fase I com a regressão do tumor durável BMS-936559 induziu regressão do tumor durável (taxa de resposta objetiva de 6 a 17 %) e prolongada estabilização da doença (taxas de 12 para 41 % às 24 semanas) em pacientes com cânceres avançados, incluindo o câncer do pulmão de células não pequenas, melanoma e câncer de células renais. Específicamente, uma resposta objetiva (uma resposta completa ou parcial) foi observada em 9 de 52 pacientes com melanoma, 2 dos 17 com câncer de célula renal, 5 dos 49 com câncer de pulmão de células não pequenas, e um de 17 com câncer de ovário (Brahmer et al 2012. N Engl J Med 366 (26): 2455 a 65; PMID: 22658128).

[0010] Contudo, apenas relativamente baixas respostas de alguns tipos de câncer poderiam ser demonstradas nestes estudos (por exemplo, câncer de pulmão e de próstata) parai nibidores da via de ponto de verificação PD-1. Em estudos mais recentes, as combinações com inibidores da via de ponto de verificação PD-1 foram avaliadas em modelos pré-clínicos.

[0011] Um estudo relatou, por exemplo, a geração de uma vacina de células dendríticas (DC) com uma combinação de um ligante de PD-1 siRNA e mRNA de antígeno alvo. Estes PD-L1-silenciados de DC carregados com antígeno mRNA aumentaram as respostas de células T CD8 + específicas de antígeno ex vivo a partir de pacientes de câncer transplantados (Hobo et al 2013. Cancer Immunol Immunother 62 (2): 285 a 97; PMID: 22903385)

[0012] Da mesma forma, Dai et al. mostraram que um sistema de vetor lentiviral dirigido a partir de células dendríticas (VEDC) que codifica para o vírus da imunodeficiência humana da proteína Gag (HIV) -1 combinado com o bloqueio do sinal inibitório (PD-L) do ligante PD- 1/PD-1 através de um anticorpo anti-PD -L1 gerou uma resposta imune CD8 + específica de HIV-1 Gag melhorada seguindo a imunização VEDC (Dai et al 2012. Mol Ther 20 (9): 1800-9; PMID: 22588271).

[0013] Outro estudo avaliou a combinação da vacinação de lentivetor recombinante (RLV) com anticorpos bloqueadores PD-L1 e PD-1. A combinação dos anticorpos bloqueadores com a vacinação RLV atrasou o crescimento do tumor, mas não foi suficiente para induzir a rejeição completa de tumores estabelecidos (Sierro et al 2011. Eur J Immunol; 41 (8): 2217 a 28; PMID: 21538347).

[0014] Além disso, WO2008/11344 descreve a modulação de uma resposta imune por meio de combinação de um constructo adenoviral recombinante baseado em DNA (rAAV) codificando um antígeno ou proteína terapêutica e um ácido nucleico que codifica para um modulador de sinalização de PD-1, especialmente siRNA, RNA anti- sentido ou uma ribozima específica para o gene PD-L1.

[0015] Neste contexto também a fusão de proteína PD-1 solúvel e fragmentos de proteínas antigênicas foi estudada (WO2012/062218).

[0016] Um outro estudo pré-clínico relatou que a combinação do bloqueio dos receptores co-estimuladores de CTLA-4 e PD-1 negativos leva a níveis sinérgicos de rejeição de tumores, no contexto de uma vacina adequada (Curran et al., 2010. Proc Natl Acad Sci EUA 107 (9): 4275 a 80; PMID: 20160101). Camundongos pré-implantados com células de melanoma B16 foram vacinados com células de melanoma B16 irradiadas que expressam tanto o ligante GM-CSF (GVAX) quanto o ligante de flt3 (Fvax) combinado com o bloqueio do anticorpo do antígeno 4 T-linfócito citotóxico do receptor co-estimulatório de células T negativas (CTLA- 4), a morte programada-1 (PD-1) e o seu ligante PD-L1. No contexto de GVAX, nem o bloqueio de qualquer receptor único co-inibitório, nem de qualquer combinação resultou em mais do que 20 % de sobrevivência. Usando Fvax, o bloqueio de qualquer PD- L1 (8 % de sobrevivência), CTLA-4 (10 % de sobrevivência), ou PD-1 (25 % de sobrevivência) mostrou benefício terapêutico modesto. No entanto, o bloqueio unicamente combinado de CTLA-4 e PD-1 levou a rejeição do tumor em 50 % dos camundongos e a posterior adição de anticorpo anti-PD-L1 aumentou a taxa de 65 %. Em resumo, apenas o bloqueio de CTLA-4 combinado com bloqueio o PD-1 teve um efeito significativo na promoção da rejeição de melanoma B16 em conjunto com a vacina de células de melanoma B16. O bloqueio de um único receptor inibitório (PD-1 ou CTLA-4) conduz a sobre-regulação da via de desbloqueamento. Portanto, este estudo sugere que o bloqueio simultâneo de múltiplos receptores co-estimulatórios negativos pode ser necessário para permitir que as células-T se infiltrem no tumor para ser eficaz. Além disso, com base em seus dados pré-clínicos no modelo de melanoma B16, os autores sugerem que a combinação destes agentes pode ter efeitos sinérgicos na condução de rejeição de tumor, mas eles observam que a combinação de vários anticorpos bloqueadores co- inibitórios na clínica deve proceder com grande cautela.

[0017] Mkrtichia et al. além disso, apresentam respostas imunes específicas para o antígeno sinérgico usando um anticorpo anti-PD-1 murino (CT-011) com a depleção de células Treg por uma dose baixa de ciclofosfamida (CPM), combinada com uma vacina tumoral (vacina de peptídeos de HPV16-E7). Mas apenas a combinação destes três tratamentos resultou em uma regressão completa de tumores (Mkrtichia et al 2011. Eur J Immunol 41 (10): 2977-86; PMID: 21710477)

[0018] Um outro relatório examina que o efeito de inibição de PD- L1 no crescimento do tumor mostrou que a administração sistêmica de anticorpo anti-PD-L1 mais células dendríticas pulsadas de peptídeo de melanoma\ (DCs), resultou em um aumento do número de células específicas do peptídeo de melanoma T CD8 +, mas que esta combinação era insuficiente para retardar o crescimento do melanoma B16 estabelecido. Embora a irradiação do corpo adicional retardou o crescimento do tumor, foi necessária a transferência adotiva de células ainda mais específicos para o antígeno T CD8 + para atingir a regressão do tumor e a sobrevivência a longo prazo dos camundongos tratados (Pilon-Thomas et al 2010. J. Immunol 1; 184 (7): 3442-9; PMID:20194714).

[0019] Em um estudo pré-clínico Fotin-Mleczek et al. mostraram a combinação benéfica de uma vacina de tumor com base em mRNA e um anticorpo dirigido contra o receptor de CTLA4, que atenua a sinalização de células T (Fotin-Mleczek et al, 2012. J Gene Med 14 (6): 428 a 39; PMID: 22.262.664).

[0020] Em suma, a utilização de inibidores de ponto de verificação imunes parece representar uma abordagem promissora para a melhoria da imunoterapia do câncer. No entanto, a combinação de vacinas com um único ICI frequentemente não conduz a uma melhoria da imunoterapia esperada e o uso clínico combinado de ICIs alvo de múltiplos receptores co-estimulantes negativos ou a combinação de ICIs com outros tratamentos podem induzir as complicações clínicas, como por exemplo, a indução de uma doença auto-imune.

[0021] Por conseguinte, objetivo da presente invenção consiste em proporcionar meios seguros e eficazes para uma terapia baseada em ICIs, particularmente com base em inibidores das vias de PD-1, em especial para uma terapia de tumor, câncer e/ou doenças infecciosas.

[0022] O objetivo subjacente à presente invenção é resolvido por meio da matéria reivindicada. Em particular, o objetivo da presente invenção é resolvido através da disponibilização de uma combinação da vacina/inibidor que compreende a vacina, como uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno e como um inibidor o Inibidor da via de PD-1, de preferência dirigido contra o receptor de PD-1 ou os seus ligantes PD-L1 e/ou PD-L2. Além disso, o objetivo é resolvido por meio de uma composição farmacêutica ou partes do kit que compreende a combinação de vacina/inibidor ou os respectivos componentes. Além disso, o objetivo é resolvido por meio de uma combinação de uma vacina de RNA com ICIs, particularmente Inibidores da via de PD-1 para utilização em um método de tratamento de doenças tumorais ou de câncer ou doenças infecciosas.

[0023] Por uma questão de clareza e legibilidade as seguintes definições são fornecidas. Qualquer característica técnica mencionada para estas definições pode ser lida em cada modalidade da presente invenção. Definições e explicações adicionais podem ser específicamente fornecidas no escopo destas modalidades.

[0024] A resposta imune: Uma resposta imune pode geralmente ser uma reação específica do sistema imune adaptativo para um antígeno particular (assim chamada resposta imune específica ou adaptativa) ou uma reação inespecífica do sistema imune inato (assim chamada resposta imune inata ou inespecífica). Em essência, a presente invenção está associada com as reações específicas (respostas imunes adaptativas) do sistema imune adaptativo. No entanto, esta resposta específica pode ser suportada por meio de uma reação inespecífica adicional (resposta imune inata). Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um composto, composição ou combinação para a estimulação simultânea do sistema imune inato e adaptativo para evocar uma resposta imune adaptativa eficiente.

[0025] Sistema imune: O sistema imune pode proteger os organismos de infecção. Se um agente patogênico consegue transmitir uma barreira física de um organismo e entra nesse organismo, o sistema imune inato fornece uma resposta imediata, mas não específica. Se os patógenos contornam esta resposta inata, os vertebrados possuem uma segunda camada de proteção, o sistema imune adaptativo. Na presente invenção, o sistema adapta-se a sua resposta imune durante uma infecção para melhorar o seu reconhecimento do agente patogênico. Esta resposta melhorada é então retida após o agente patogênico ter sido eliminado, sob a forma de uma memória imunológica, e permite que o sistema imune adaptativo venha a montar ataques mais rápidos e mais fortes cada vez que este agente patogênico é encontrado. De acordo com isto, o sistema imune inato compreende o sistema imune adaptativo. Cada uma destas duas partes, tipicamente, contém os assim chamados componentes humorais e celulares.

[0026] Resposta imune adaptativa: A resposta imune adaptativa é normalmente entendida como sendo uma resposta específica de antígeno do sistema imunológico. A especificidade do antígeno permite a geração de respostas que são adaptadas para agentes patogênicos específicos ou células infectadas com agentes patogênicos. A capacidade de montar estas respostas adaptadas é normalmente mantida no corpo por meio das "células de memória". Se um patógeno infectar o corpo mais do que uma vez, estas células de memória específicas são usadas para eliminá-lo rapidamente. Neste contexto, a primeira etapa de uma resposta imune adaptativa é a ativação de células T ingênuas específicas de antígeno ou células imunes diferentes capazes de induzir uma resposta imune específica para o antígeno por meio das células apresentadoras de antígeno. Isso ocorre nos tecidos linfóides e órgãos através dos quais as células T ingênuas estão constantemente passando. Os três tipos de células que podem servir como células apresentadoras de antígeno são células dendríticas, macrófagos, e células B. Cada uma destas células tem uma função distinta na indução de respostas imunes. As células dendríticas podem levar até antígenos por meio da fagocitose e macropinocitose e podem tornar-se estimuladas por meio do contato com, por exemplo, um antígeno estranho para migrar para o tecido linfóide local, onde se diferenciam em células dendriticas maduras. Os macrófagos ingerem os antígenos particulados tais como bactérias e são induzidos por meio dos agentes infecciosos ou outros estímulos apropriados para expressar as moléculas de MHC. A capacidade única de células B para se ligar e interiorizar os antígenos proteicos solúveis, através dos seus receptores também pode ser importante para induzir as células T. As moléculas MHC são, tipicamente, responsáveis pela apresentação de um antígeno a células T. Aí, apresentando o antígeno em moléculas de MHC conduz à ativação de células T que induz a sua proliferação e diferenciação em células T efetoras armadas. A função mais importante das células T efetoras representa a morte de células infectadas por meio das células T citotóxicas CD8 + e a ativação de macrófagos de células Th1 que juntas formam a imunidade mediada por células, e a ativação de células B por ambas as células Th2 e Th1 para produzir diferentes classes de anticorpos, conduzindo assim a resposta imune humoral. As células T reconhecem um antígeno por meio dos seus receptores de células T, que não reconhecem e ligam o antígeno diretamente, mas em vez disso reconhecem os fragmentos peptídicos curtos, por exemplo, de antígenos de proteínas derivadas de organismos patogênicos, por exemplo, chamado epitopos, os quais são ligados a moléculas de MHC na superfície de outras células.

[0027] Sistema imune adaptativo: O sistema imune adaptativo é essencialmente dedicadao para eliminar ou evitar o crescimento patogênico. Ele normalmente regula a resposta imune adaptativa, fornecendo o sistema imunológico dos vertebrados com a capacidade de reconhecer e memorizar agentes patogênicos específicos (para gerar imunidade), e para montar ataques mais fortes cada vez que o agente patogênico é encontrado. O sistema é altamente adaptável por causa da hipermutação somática (um processo de mutações somáticas aceleradas), e V (D) de recombinação (a recombinação genética irreversível de segmentos do gene do receptor de antígeno). Este mecanismo permite que um pequeno número de genes venha a gerar um grande número de diferentes receptores de antígenos, que são então expressos exclusivamente sobre cada linfócitos individuais. Uma vez que o rearranjo de genes conduz a uma alteração irreversível no DNA de cada célula, toda a progénie (descendentes) de uma tal célula irá então herdar os genes que codificam a mesma especificidade de receptor, incluindo as células B de memória e células T de memória, que são as peças chaves para a longa vida da imunidade específica.

[0028] Imunidade Celular/resposta imune celular: A imunidade celular refere-se tipicamente à ativação de macrófagos, células assassinas naturais (NK), os T linfócitos citotóxicos específicos para o antígeno, e a libertação de diferentes citoquinas em resposta a um antígeno. Em termos mais gerais, a imunidade celular não se baseia em anticorpos, mas sobre a ativação de células do sistema imune. Normalmente, uma resposta imune celular pode ser caracterizada por exemplo por meio da ativação de linfócitos T citotóxicos específicos para o antígeno que são capazes de induzir a apoptose em células, por exemplo, as células imunes específicas tais como células dendríticas, ou de outras células que apresentam os epítopos de antígenos estranhos na sua superfície. Tais células podem ser infectadas por vírus ou infectadas com bactérias intracelulares, ou células cancerosas que apresentem os antígenos tumorais. Outras características podem ser a ativação de macrófagos e células assassinas naturais, permitindo-lhes destruir os agentes patogênicos e a estimulação de células de secretar uma variedade de citocinas que influenciam a função de outras células envolvidas na resposta imune adaptativa e respostas imunes inatas.

[0029] Imunidade humoral/resposta imune humoral: A imunidade humoral refere-se tipicamente à produção de anticorpo e, opcionalmente, para os processos de acessórios que acompanham a produção de anticorpos. Uma resposta imune humoral pode ser tipicamente caracterizada, por exemplo, por meio da ativação de Th2 e a produção de citoquinas, a formação de centros germinais e mudança de isotipo, afinidade de maturação e geração de células de memória. A imunidade humoral também pode tipicamente referir-se às funções efetoras de anticorpos, que incluem neutralização de toxina e patógeno, a ativação do complemento clássico e a promoção de opsonina de fagocitose e eliminação de agentes patogênicos.

[0030] Sistema imune inato: O sistema imune inato, também conhecido como não específico (ou inespecífico) do sistema imune, compreende, tipicamente, as células e os mecanismos de defesa do hospedeiro contra a infecção por meio de outros organismos, de forma não específica. Isto significa que as células do sistema inato podem reconhecer e responder aos patógenos de uma forma geral, mas ao contrário do sistema imune adaptativo, que não confere imunidade de longa duração ou de proteção para o hospedeiro. O sistema imune inato pode ser, por exemplo, ativado por meio dos ligantes de receptores semelhantes a Toll (TLRs) ou de outras substâncias auxiliares, tais como lipopolissacarídeos, TNF-alfa, ligante CD40, ou citocinas, monocinas, linfocinas, interleucinas ou quimioquinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14, IL-15, IL- 16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL- 27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M- CSF, LT-beta, TNF-alfa, fatores de crescimento, e a hGH, um ligante de receptor do tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, um ligante de murino Toll- como receptor TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ou TLR13, um ligante de um receptor do tipo NOD, um ligante de um receptor do tipo RIG-I, um ácido nucleico imunoestimulante, um RNA imunoestimulante (isRNA), um CpG-DNA, um agente antibacteriano ou um agente anti-viral. A combinação da vacina/inibidor, a composição farmacêutica ou as partes do kit de acordo com a presente invenção podem compreender um ou mais de tais substâncias. Normalmente, uma resposta do sistema imune inato inclui o recrutamento das células imunes para os locais de infecção, através da produção de fatores químicos, incluindo mediadores químicos especializados, chamados citoquinas; a ativação da cascata do complemento; identificação e eliminação de substâncias estranhas presentes nos órgãos, tecidos, sangue e linfa, por glóbulos brancos especializados; a ativação do sistema imune adaptativo; e/ou que atua como uma barreira físico-química para agentes infecciosos.

[0031] Adjuvante/componente adjuvante: um adjuvante ou um componente adjuvante, no sentido mais amplo, é tipicamente um farmacológico e/ou agente imunológico que pode modificar, por exemplo, melhorar, o efeito de outros agentes, tais como uma vacina ou medicamento. É para ser interpretado em um sentido lato e refere-se a um largo espectro de substâncias. Tipicamente, estas substâncias são capazes de aumentar a imunogenicidade de antígenos. Por exemplo, os adjuvantes podem ser reconhecidos por meio dos sistemas imunes inatos e, por exemplo, pode provocar uma resposta imune inata."Adjuvantes" normalmente não provocam uma resposta imune adaptativa. Na mesma medida, os "adjuvantes" não se qualificam como antígenos. O seu modo de ação é diferente dos efeitos provocados por antígenos resultando em uma resposta imune adaptativa.

[0032] Antígeno: No contexto da presente invenção "antígeno" refere-se tipicamente a uma substância que pode ser reconhecida por meio do sistema imune, de um modo preferido por meio do sistema imune adaptativo, e é capaz de desencadear uma resposta imune específica do antígeno, por exemplo, por formação de anticorpos e/ou células T específicas de antígeno como parte de uma resposta imune adaptativa. Tipicamente, um antígeno pode ser ou pode compreender um peptídeo ou uma proteína que compreende pelo menos um epitopo e que pode ser apresentado por meio de MHC às células T. No sentido da presente invenção um antígeno pode ser o produto de tradução de um RNA fornecido, de um modo preferido um mRNA, tal como definido na presente invenção. Neste contexto, também fragmentos, variantes e derivados de peptídeos e proteínas que compreendem pelo menos um epitopo são entendidos como antígenos. No contexto da presente invenção, os antígenos tumorais e os antígenos patogênicos tal como definido na presente invenção, são particularmente preferidos.

[0033] Epitopo: Epitopos (também chamado de "determinante antigênico") podem ser distinguidos em epítopos de células T e epítopos de células B. Os epitopos de células T ou de partes das proteínas no contexto da presente invenção podem compreender os fragmentos de preferência com um comprimento de cerca de 6 a cerca de 20 ou mesmo mais aminoácidos, por exemplo, como fragmentos processados e apresentados por meio das moléculas de MHC de classe I, tendo de preferência um comprimento de cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos, por exemplo, 8, 9, ou 10, (ou mesmo 11 ou 12 aminoácidos), ou como fragmentos processados e apresentados por meio das moléculas MHC de classe II, de preferência tendo um comprimento de cerca de 13 ou mais aminoácidos, por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mesmo mais aminoácidos, em que esses fragmentos podem ser selecionados a partir de qualquer parte da sequência de aminoácidos. Estes fragmentos são tipicamente reconhecidos por meio das células T na forma de um complexo constituído pelo fragmento de peptídeo e uma molécula de MHC, isto é, os fragmentos não são normalmente reconhecidos na sua forma nativa. Os epítopos de célula B são tipicamente fragmentos localizados sobre a superfície exterior das proteínas (nativo) ou antígenos peptídicos, tal como definido na presente invenção, de um modo preferido ter de 5 a 15 aminoácidos, mais de preferência possuindo de 5 a 12 aminoácidos, ainda mais de preferência com 6 a 9 aminoácidos, que pode ser reconhecidos por meio dos anticorpos, ou seja, na sua forma nativa.

[0034] Tais epítopos de proteínas ou peptídeos podem, também, ser selecionados de entre qualquer uma das variantes de tais proteínas ou peptídeos mencionados na presente invenção. Neste contexto, os determinantes antigênicos podem ser epítopos conformacionais ou descontínuos que são compostos por meio dos segmentos das proteínas ou peptídeos tal como é definido na presente invenção que são descontínuos na sequência de aminoácidos das proteínas ou peptídeos, como definido na presente invenção, mas estão reunidos na estrutura tridimensional ou epítopos contínuos ou lineares que são compostos por meio de uma única cadeia polipeptídica.

[0035] Vacina: A vacina é geralmente entendida como sendo um material terapêutico ou profilático proporcionando pelo menos um antígeno, de preferência, um imunogênio. "Proporcionar pelo menos no antígeno" significa, por exemplo, que a vacina compreende o antígeno ou que a vacina compreende uma molécula que, por exemplo, codifica para o antígeno ou uma molécula que compreende o antígeno. Por exemplo, a vacina pode compreender um ácido nucleico, tal como um RNA (por exemplo, vacina de RNA), que codifica para um peptídeo ou proteína que compreende o antígeno. O antígeno ou imunogênio pode ser derivado a partir de qualquer material que é adequado para vacinação. Por exemplo, o antígeno ou imunogênio pode ser derivado de um agente patogênico, tal como a partir de bactérias ou partículas de vírus, etc, ou a partir de um tumor ou tecido canceroso. O antígeno ou imunogênio estimula o sistema imune adaptativo do corpo para proporcionar uma resposta imune adaptativa. No escopo, da presente invenção, a vacina de um modo preferido não compreende células, tais como células dendríticas ou células cancerosas, por exemplo, células de melanoma B16. Além disso, no contexto da presente invenção, a vacina de um modo preferido não consiste em antígenos peptídicos, tais como os antígenos tumorais do peptídeo. No contexto da presente invenção, a vacina é de preferência uma vacina de RNA.

[0036] Vacina de RNA: Uma vacina de RNA é definida na presente invenção como uma vacina que compreende pelo menos uma molécula de RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno. No contexto da presente invenção, pelo menos uma molécula de RNA composta pela vacina é de preferência uma molécula de RNA isolada. Este pelo menos um RNA é RNA viral de um modo preferido, RNA de auto-replicação (replicon) ou mais de preferência MRNA. Também estão incluídos nesta presente invenção os híbridos de RNA/DNA, o que significa que, pelo menos, uma molécula de RNA da vacina de RNA consiste parcialmente em ribonucleotídeos e parcialmente de desoxirribonucleotídeos. Neste contexto, pelo menos um RNA da vacina de RNA consiste em, pelo menos, 50 % de ribonucleotídeos, mais de preferência a pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e mais de preferência de 100 %. Neste contexto, pelo menos um RNA da vacina de RNA também pode ser fornecido como RNA complexado ou MRNA, como partícula de vírus e de partículas como replicon, tal como definido na presente invenção. No contexto da presente invenção, pelo menos um RNA composto pela vacina de RNA de preferência não está presente em células, tais como em células cancerosas ou células dendriticas, por exemplo, Células de melanoma B16. Além disso, é particularmente preferido que a vacina de RNA da presente invenção não compreenda ou não consista em um vetor lentiviral, em particular, não uma célula dendrítica - vetor lentiviral dirigido, ou um vetor adenoviral/adeno-associado (recombinante) (vetor (R) de AAV). De preferência, a vacina de RNA da presente invenção não é uma vacina contra o HIV. Em particular, prefere-se que a vacina de RNA da presente invenção não compreenda um AAV ou um vetor lentiviral que codifica um ou mais antígenos. Além disso, a vacina de RNA da presente invenção de preferência não pode codificar os antígenos específicos para o HIV, por exemplo, Proteína Gag, em particular, não um vetor lentivírus que codifica os antígenos específicos do HIV, como Gag. De preferência, a vacina de RNA da presente invenção não compreende uma proteína de fusão de uma proteína de PD1 e uma proteína antigênica, ou uma proteína de fusão de uma proteína de PD1 e uma imunoglobulina ou uma porção da mesma e não codifica uma tal proteína de fusão PD1.

[0037] Vacinação genética: a vacinação genética pode, tipicamente, ser entendida como sendo a vacinação através da administração de uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno ou imunogênio ou os fragmentos dos mesmos. A molécula de ácido nucleico pode ser administrada ao corpo de um paciente ou a células isoladas de um paciente. Após a transfecção de determinadas células do corpo ou por meio da transfecção das células isoladas, o antígeno ou imunogênio pode ser expresso por estas células e, subsequentemente, apresentado ao sistema imunológico, estimular um adaptativo, isto é, a resposta imune específica para o antígeno. Dessa maneira, a vacinação genética compreende, tipicamente, pelo menos uma das etapas de a) a administração de um ácido nucleico, de preferência um (isolado) de RNA, tal como definido na presente invenção, a um paciente, de preferência um paciente, ou para células isoladas de um indivíduo, de preferência um paciente , o que geralmente resulta na transfecção de células do indivíduo quer in vivo ou in vitro; b) a transcrição e/ou tradução da molécula de ácido nucleico introduzida; e opcionalmente c) Re-administração de células isoladas, transfectadas para o indivíduo, de preferência do paciente, se o ácido nucleico não tiver sido administrado diretamente ao paciente.

[0038] O ácido nucleico: O termo ácido nucleico entende-se qualquer molécula de DNA ou RNA e que é usada de forma sinônima de polinucleotídeo. Além disso, as modificações ou derivados de ácido nucleico como definido na presente invenção estão explicitamente incluídas no termo geral "ácido nucleico". Por exemplo, o PNA também está incluído no termo "ácido nucleico".

[0039] RNA monocistrônico: Um RNA monocistrônico pode, tipicamente, ser um RNA, de um modo preferido um mRNA, que compreende apenas uma estrutura de leitura aberta. Uma estrutura de leitura aberta neste contexto é uma sequência de vários trios de nucleotídeos (códons) que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína.

[0040] RNA Bi/multicistrônico: RNA, de preferência mRNA, que normalmente pode ter duas (bicistrônico) ou mais (multicistrônico) estruturas de leitura abertas (ORF). Uma estrutura de leitura aberta neste contexto é uma sequência de vários trios de nucleotídeos (códons) que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína.

[0041] Estrutura tampão 5’: O tampão 5' é tipicamente um nucleotídeo modificado, particularmente um nucleotídeo guanina, adicionado a extremidade 5' de uma molécula de RNA. De preferência, o tampão 5’ é adicionado utilizando uma ligação 5'-5'-trifosfato.

[0042] Sequência Poli (C): Um poli (C) é tipicamente uma sequência longa sequência de nucleotídeos de citosina, tipicamente cerca de 10 a cerca de 200 nucleotídeos de citidina, de preferência cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de citidina, mais de preferência cerca de 10 a cerca de 70 nucleotídeos de citidina nem mais de preferência cerca de 20 a cerca de 50 ou mesmo cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos de citidina. Um poli (C) sequência pode de preferência ser localizado a 3’da região codificante composta por um ácido nucleico.

[0043] Cauda Poli (A): A cauda poli (A) também chamada de "cauda poli (A) 3' " é normalmente uma longa sequência de nucleotídeos de adenina de até cerca de 400 nucleotídeos de adenosina, por exemplo, desde cerca de 25 a cerca de 400, de preferência de cerca de 50 a cerca de 400, mais de preferência de cerca de 50 a cerca de 300, ainda mais de preferência desde cerca de 50 a cerca de 250, mais de preferência de cerca de 60 a cerca de 250 nucleotídeos de adenosina, adicionados a extremidade 3’ de uma sequência de ácido nucleico, de um modo preferido um mRNA. Uma cauda poli (A) pode de preferência ser localizada a 3’ da região codificante composta por meio de um ácido nucleico, por exemplo, um mRNA.

[0044] Ácido nucleico estabilizado: Um ácido nucleico estabilizado, tipicamente, pode ser essencialmente resistente à degradação in vivo (por exemplo, a degradação por um exo- ou endo-nuclease) e/ou ex vivo de degradação (por exemplo, o processo de fabricação, antes da administração da vacina, por exemplo, no decurso da preparação da solução de RNA da vacina a ser administrada). A estabilização de RNA, particularmente mRNA pode, por exemplo, ser conseguida proporcionando uma estrutura de tampão 5’, uma cauda poli (A), uma cauda poli (C), e/ou qualquer outra modificação UTR. Ela também pode ser conseguida por meio da modificação da estrutura, modificação de açúcar, modificação de base, e/ou a alteração do teor G/C do ácido nucleico. Vários outros métodos são possíveis no contexto da presente invenção.

[0045] A modificação de um ácido nucleico (ácido nucleico modificado): A modificação de uma molécula de ácido nucleico, particularmente de RNA ou de mRNA, pode conter modificações da estrutura principal, modificações de açúcar ou modificações de bases. Uma modificação da estrutura em ligação com a presente invenção é uma modificação em que a estrutura principal de fosfatos dos nucleotídeos contidos na molécula de ácido nucleico são modificados quimicamente. Uma modificação de açúcar em ligação com a presente invenção é uma modificação química do açúcar dos nucleotídeos do ácido nucleico. Além disso, uma modificação de base em ligação com a presente invenção é uma modificação química da porção de base dos nucleotídeos da molécula de ácido nucleico. Por conseguinte, um ácido nucleico modificado também é definido na presente invenção como uma molécula de ácido nucleico que pode incluir os análogos de nucleotídeos. Além disso, uma modificação de uma molécula de ácido nucleico pode incluir uma modificação lipídica. Um tal ácido nucleico modificadas com lipídios compreende, tipicamente, um ácido nucleico, tal como definido na presente invenção. Uma tal molécula de ácido nucleico modificada por meio de lipídio tipicamente compreende ainda pelo menos um ligante ligado covalentemente com a molécula de ácido nucleico, e pelo menos um lipídio ligado de forma covalente com o respectivo ligante. De uma maneira alternativa, a molécula de ácido nucleico modificada por lipídio compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico tal como definido na presente invenção e, pelo menos, um lipídio (bifuncional) ligado de forma covalente (sem um ligante) com essa molécula de ácido nucleico. De acordo com uma terceira alternativa, a molécula de ácido nucleico modificada por lipídio compreende uma molécula de ácido nucleico tal como definido na presente invenção, pelo menos um ligante ligado de forma covalente com a molécula de ácido nucleico, e pelo menos um lipídio ligado de forma covalente com o respectivo ligante, e também pelo menos, um lipídio (bifuncional) covalentemente ligado (sem um ligante) com essa molécula de ácido nucleico.

[0046] Uma modificação de um ácido nucleico pode também compreender a modificação do teor de G/C da região de codificação de uma molécula de ácido nucleico, especialmente de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação da vacina/inibidor da presente invenção. Neste contexto, é particularmente preferido que o teor de G/C da região de codificação da molécula de ácido nucleico seja aumentado, em comparação com o teor de G/C da região de codificação da sua sequência de tipo selvagem de codificação particular, isto é, a RNA não modificado. A sequência de aminoácidos codificada da sequência de ácido nucleico de um modo preferido não é modificada em comparação com a sequência de aminoácidos codificada do mRNA do tipo selvagem em particular. A modificação do teor de G/C da molécula de ácido nucleico, especialmente, se a molécula de ácido nucleico estiver sob a forma de um mRNA ou os códigos para um mRNA, baseia-se no fato de que a sequência de qualquer região do mRNA a ser traduzida é importante para a tradução eficiente do que o mRNA. Dessa maneira, a composição e a sequência de vários nucleotídeos são importantes. Em particular, as sequências possuindo um aumento do teor de G (guanosina)/C (citosina) são mais estáveis do que as sequências que têm um maior teor de A (adenosina) L/(uracila). Portanto, os códons da sequência codificante do mRNA ou são, por conseguinte, variados em comparação com a sua sequência de codificação do tipo selvagem ou mRNA, mantendo a sequência de aminoácidos traduzida, de tal modo que eles incluem um aumento da quantidade de nucleotídeos G/C. No que diz respeito ao fato de que vários códons podem codificar um e o mesmo aminoácido (a chamada degeneração do código genético), os códons mais favoráveis para a estabilidade podem ser determinados (denominada utilização de códons alternativa) .De maneira preferida, o teor G/C da região de codificação da molécula de ácido nucleico, especialmente de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, é aumentado de pelo menos 7 %, mais de preferência em pelo menos 15 %, de modo particularmente preferido pelo menos 20 %, em comparação com o teor de G/C da região codificada do mRNA do tipo selvagem. De acordo com uma modalidade específica, pelo menos, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, mais de preferência pelo menos 70 %, ainda mais de preferência pelo menos 80 % e mais de preferência pelo menos 90 %, 95 % ou mesmo 100 % dos códons de substituição na região que codifica para uma proteína ou um peptídeo como definido na presente invenção, ou o fragmento, variante e/ou derivado do mesmo, ou toda a sequência da sequência de mRNA do tipo selvagem ou sequência de codificação são substituídos, aumentando assim o teor de G/C da referida sequência. Neste contexto, é particularmente preferido aumentar o teor de G/C da molécula de ácido nucleico, especialmente de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, para o valor máximo (isto é, 100 % dos códons substituíveis), em particular na região que codifica para uma proteína, em comparação com a sequência de tipo selvagem. Além disso, uma modificação do ácido nucleico, especialmente de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, baseia-se na descoberta de que a eficiência da tradução, também é determinada por meio de uma frequência diferente na ocorrência de tRNA em células. A frequência da ocorrência de tRNA de uma célula, e assim a utilização de códons na referida célula, é dependente da espécie da célula ao qual a célula é derivada. Deste modo, uma célula de levedura geralmente exibe uma utilização de códons diferente de uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Dessa maneira, se os chamados "códons raros" estão presentes na molécula de ácido nucleico (em proporção ao respectivo sistema de expressão), especialmente se o ácido nucleico está sob a forma de um mRNA ou os códigos para um mRNA, a um aumento da extensão , a molécula de ácido nucleico modificada correspondente é traduzida para um grau significativamente pior do que no caso em que os códons que codificam para tRNAs "relativamente frequentes" estão presentes. Por conseguinte, a região de codificação do ácido nucleico modificado, particularmente, pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação da vacina/inibidor da presente invenção é de preferência modificada em comparação com a região correspondente do mRNA do tipo selvagem ou da sequência de codificação, tais que pelo menos um códon da sequência de tipo selvagem que codifica um tRNA que é relativamente raro na célula é trocado por um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e transporta o mesmo aminoácido que o tRNA relativamente raro . Por esta modificação, as sequências da molécula de ácido nucleico, em particular pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, são modificadas de tal modo que os códons para os quais tRNA ocorrem frequentemente disponíveis são inseridas . Em outras palavras, por meio desta modificação todos os códons da sequência do tipo selvagem que codificam para um TRNA que é relativamente raro na célula podem em cada caso ser trocados por meio de um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e que, em cada caso, transporta o mesmo aminoácido que o tRNA relativamente raro. Um tal ácido nucleico modificado, de um modo preferido é denominado na presente invenção como "ácido nucleico com códons optimizados ou RNA". tRNA que ocorre com relativa frequência na célula e que, em contraste, relativamente ocorre raramente é conhecido por meio de uma pessoa que é versada na técnica; cf. por exemplo. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11 (6): 660 a 666. É particularmente preferido que uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína, particularmente, pelo menos, um RNA que codifica para pelo menos um antígeno constituído pela vacina de RNA, utilizado na presente invenção tenha códons optimizados para a utilização de códons humanos. Os códons que utilizam para o aminoácido particular o tRNA que ocorre com maior frequência, por exemplo, o códon de Gli, que utiliza o tRNA que ocorre mais frequentemente na célula (humana), são particularmente preferidos. Neste contexto, é particularmente preferido ligar o teor sequencial de G/C, que é aumentada, em particular maximizado, na molécula de ácido nucleico modificada, particularmente de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação da vacina/ inibidor da presente invenção, com os códons "frequentes" sem modificar a sequência de aminoácidos da proteína codificada por meio da região de codificação da molécula de ácido nucleico. Esta modalidade preferida permite uma disposição de ácido nucleico particular e eficazmente traduzida e estabilizada (modificada), particularmente de pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção.

[0047] Derivado de uma molécula de ácido nucleico: Um derivado de uma molécula de ácido nucleico é definido na presente invenção, do mesmo modo como um ácido nucleico modificado, como definido acima.

[0048] Análogos de nucleotídeos: os análogos de nucleotídeos são nucleotídeos estruturalmente semelhantes (análogos) para os nucleotídeos, que incluem as modificações de fosfato da estrutura principal, modificações de açúcar, ou modificações da nucleobase que ocorrem de forma natural.

[0049] Modificação UTR: Uma molécula de ácido nucleico, especialmente se o ácido nucleico está sob a forma de uma molécula de ácido nucleico de codificação, em particular pelo menos um RNA da vacina de RNA que compreende, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno de acordo com a presente invenção, de preferência, tem, pelo menos, uma sequência de modificação UTR 5’ e/ou 3' (modificação UTR). Estas nas regiões 5’ e/ou 3' não traduzidas (UTR) incluíram as sequências que podem ter o efeito de aumentar a semi-vida do ácido nucleico no citosol ou pode aumentar a tradução da proteína codificada ou do peptídeo. Estas sequências UTR podem ter 100 % de identidade de sequência com as sequências que ocorrem no vírus, bactérias e eucariotas que ocorre de forma natural, mas pode também ser parcialmente ou totalmente sintéticas. As sequências não traduzidas (UTR) do gene (alfa) da globina, por exemplo, de Homo sapiens ou Xenopus laevis podem ser mencionadas como um exemplo de sequências de estabilização que podem ser utilizadas para um ácido nucleico estabilizado. Outro exemplo de uma sequência de estabilização tem a fórmula geral (C/L) CCANxCCC (L/A) PyxUC (C/L) CC, que está contido na 3'UTR do RNA muito estável, que codifica para a (alfa) globina, colágeno do tipo (I), 15-lipoxigenase ou para a tirosina hidroxilase (cf. Holcik et al, Proc Natl Acad Sci EUA 1997, 94: 2410 a 2414). Particularmente preferidos no escopo da presente invenção é a UTR mutada de (alfa) globina que compreende a seguinte sequência GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG (SEQ ID NO. 1) (o nucleotídeo sublinhado mostra a mutação em comparação com a sequência de tipo selvagem), que também é na presente invenção designada como muag. Tais sequências UTR introduzidas podem, de forma natural, ser usadas individualmente ou em combinação umas com as outras e também em combinação com outras modificações de sequências conhecidas por meio de uma pessoa que é versada na técnica.

[0050] Histona de haste-laçada: No contexto da presente invenção, uma sequência de histona de haste-laçada é de preferência selecionada a partir de, pelo menos, uma das seguintes fórmulas (I) ou (II):

[0051] fórmula (I) (sequência de haste-laçada sem elementos de bordas da haste):

[0052] fórmula (II) (sequência de haste-laçada com elementos de bordas da haste):

[0053] em que:

[0054] elementos de borda da haste 1 ou haste 2 N1-6 é uma sequência consecutiva de 1 a 6, de preferência de 2 a 6, mais de preferência de 2 a 5, ainda mais de preferência de 3 a 5, mais de preferência de 4 a 5 ou 5 N, em que cada N é independentemente selecionado a partir de outro de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G e C, ou um análogo de nucleotídeo do mesmo;

[0055] haste 1 [N0-2GN3-5] reverso é complementar ou parcialmente complementar reverso com o elemento haste 2, e é uma sequência consecutiva de entre 5 a 7 nucleotídeos;

[0056] em que N0-2 é uma sequência consecutiva de 0 a 2, de preferência de 0 a 1, mais de preferência de 1 N, em que cada n é independentemente do outro selecionado a partir de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G e C ou um análogo de nucleotídeo do mesmo;

[0057] em que N3-5 é uma sequência consecutiva de 3 a 5, de preferência de 4 a 5, mais de preferência de 4 N, em que cada n é independentemente do outro selecionado a partir de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G e C ou um análogo de nucleotídeo do mesmo, e

[0058] em que G é guanosina ou um análogo da mesma, e pode ser opcionalmente substituído por meio de uma citidina ou um análogo do mesmo, desde que a sua citidina no nucleotídeo complementar da haste 2 seja substituída por guanosina;

[0059] sequência de laçada [N0-4 (U/T) N0-4] situa-se entre os elementos de haste 1 e haste 2, e é uma sequência consecutiva de 3 a 5 nucleotídeos, mais de preferência de 4 nucleotídeos;

[0060] em que cada N0-4 é independente do outro uma sequência consecutiva de 0 a 4, de preferência de 1 a 3, mais de preferência de 1 a 2 N, em que cada n é independentemente do outro selecionado a partir de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G e C ou um análogo de nucleotídeo do mesmo; e

[0061] em que U/T representa uridina, ou opcionalmente timidina;

[0062] haste 2 [N3-5CN0-2] é complementar reversa ou parcialmente complementar reversa com o elemento de haste 1, e é uma sequência consecutiva de entre 5 a 7 nucleotídeos;

[0063] em que N3-5 é uma sequência consecutiva de 3 a 5, de preferência de 4 a 5, mais de preferência de 4 N, em que cada n é independentemente do outro selecionado a partir de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G e C ou um análogo de nucleotídeo do mesmo;

[0064] em que N0-2 é uma sequência consecutiva de 0 a 2, de preferência de 0 a 1, mais de preferência de 1 N, em que cada n é independentemente do outro selecionado a partir de um nucleotídeo selecionado de A, U, T, G ou C ou um análogo de nucleotídeo do mesmo; e

[0065] em que C é a citidina ou um análogo da mesma, e pode ser opcionalmente substituído por um guanosina ou um análogo da mesma, desde que o seu nucleosídeo de guanosina complementar em haste 1 seja substituído por meio de citidina;

[0066] em que

[0067] haste 1 e haste 2 são capazes de emparelhamento de bases umas com as outras formando uma sequência complementar reversa, em que o emparelhamento de bases pode ocorrer entre a haste 1 e haste 2, por exemplo, por Watson-Crick emparelhamento de bases de nucleotídeos A e U/T ou G e C, ou por base de emparelhamento não Watson-Crick por exemplo, o emparelhamento de bases de oscilação, emparelhamento de base Watson-Crick reverso , o emparelhamento de bases de Hoogsteen, o emparelhamento de bases de Hoogsteen reverso ou são capazes de emparelhamento de bases uns com os outros formando uma sequência complementar parcialmente reversa, em que um emparelhamento de bases incompleto pode ocorrer entre a haste 1 e haste 2, com base que uma ou mais bases de uma haste não têm uma base complementar na sequência complementar reversa da outra haste.

[0068] Síntese de ácido nucleico: As moléculas de ácido nucleico utilizadas de acordo com a presente invenção, tal como definido na presente invenção, podem ser preparadas utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo métodos sintéticos, tais como por exemplo, a síntese em fase sólida, na propagação in vivo (por exemplo, a propagação in vivo do vírus), assim como métodos in vitro, tais como as reações de transcrição in vitro.

[0069] Para a preparação de uma molécula de ácido nucleico, especialmente se o ácido nucleico está sob a forma de um RNA ou de mRNA, uma molécula de DNA correspondente pode, por exemplo ser transcrita in vitro. Esta matriz de DNA compreende de preferência um promotor adequado, por exemplo, um promotor de T7 ou SP6, para a transcrição in vitro, a qual é seguida pela sequência de nucleotídeos desejada que codifica para a molécula de ácido nucleico, por exemplo, mRNA, para ser preparada e um sinal de terminação para a transcrição in vitro. A molécula de DNA, que forma a matriz de pelo menos um RNA de interesse, pode ser preparada por meio da proliferação de fermentação e isolamento subsequente como parte de um plasmídeo que pode ser replicado em bactérias. Os plasmídeos que podem ser mencionados como adequados para a presente invenção são, por exemplo, os plasmídeos pT7Ts (número de acesso GenBank U26404; Lai et al, Development 1995, 121: 2349 a 2360), série pGEM®, por exemplo, pGEM®-1 (número de acesso GenBank X65300; da Promega) e pSP64 (GenBank número de acesso X65327); cf. também Mezei e Storts, Purification of PCR Products, em: Griffin e Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, de 2001.

[0070] RNA: RNA é a abreviatura usual para ácido ribonucleico. É uma molécula de ácido nucleico, isto é, um polímero que consiste em nucleotídeos. Estes nucleotídeos são geralmente de adenosina- monofosfato, uridina-monofosfato, guanosina-monofosfato de citidina e os monômeros-monofosfato que são ligados uns aos outros ao longo de uma chamada estrutura principal. A estrutura principal é formada por meio das ligações fosfodiéster entre o açúcar, ou seja, de ribose, de uma primeira e uma parte de fosfato de um segundo monômero, adjacente. A sucessão específica dos monômeros é chamada de sequência de RNA.

[0071] RNA mensageiro (mRNA): Em células eucarióticas, a transcrição é realizada tipicamente no interior do núcleo ou da mitocôndria. In vivo, a transcrição de DNA geralmente resulta no chamado RNA prematuro, que tem de ser processado em um chamado RNA mensageiro, normalmente abreviado como mRNA. O processamento do RNA prematuro, por exemplo, em organismos eucarióticos, compreende uma variedade de diferentes modificações de fatiamento pós-transcricional, tais como, 5'-capeamento, poliadenilação, exportação do núcleo ou a mitocôndria e semelhantes. A soma destes processos é também chamada de maturação de RNA. O RNA mensageiro maduro geralmente proporciona a sequência de nucleotídeos que pode ser traduzida para uma sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína particular. Tipicamente, um mRNA maduro compreende um tampão 5’, um UTR 5’, uma estrutura de leitura aberta, um UTR 3' e uma sequência poli (A). No contexto da presente invenção, um mRNA também pode ser uma molécula artificial, isto é, uma molécula que não ocorre na natureza. Isto significa que o mRNA no contexto da presente invenção pode, por exemplo, compreender uma combinação de um UTR 5’, estrutura de leitura aberta, UTR 3' e sequência poli (A), o que não ocorre nesta combinação na natureza.

[0072] Retrovírus: Um retrovírus é um vírus de RNA que é duplicado em uma célula hospedeira, utilizando a enzima transcriptase reversa para produzir o DNA a partir do seu genoma de RNA. O DNA é então incorporado no genoma do hospedeiro por meio de uma enzima integrase. O vírus se replica em seguida, como parte do DNA da célula hospedeira e, em seguida, sofre os processos de transcrição e de tradução habituais para expressar os genes transportados por meio do vírus. Muitas vezes, os lentivírus foram usados para fins de terapia gênica. Por razões de segurança, os vetores lentivirais normalmente não possuem os genes necessários para a sua replicação. Para produzir um lentivírus, vários plasmídeos são transfectados para uma linhagem de célula de empacotamento assim chamada, geralmente HEK 293. Um ou mais plasmídeos, designados geralmente como plasmídeos de empacotamento, codificam as proteínas de virion, tais como o capsídeo e a transcriptase reversa. Outro plasmídeo contém o material genético a ser entregue por meio do vetor. Ele é transcrito para produzir o genoma viral de RNA de filamento simples que é empacotado no virion, o qual é utilizado para a infecção de células para fins de terapia genética ou vacinação genética.

[0073] Virion: As partículas de vírus (conhecidos como virions) consistem em duas ou três partes: i) o material genético (que compreende genes virais e genes heterólogos substituídos opcionais) feitos a partir de DNA ou RNA; ii) uma camada de proteína que protege esses genes; e, em alguns casos, iii) um envelope de lipídios que envolve o revestimento da proteína quando estão fora de uma célula.

[0074] RNA Auto-replicante (replicons): RNA auto-replicantes são vetores de entrega baseado em alfavírus que foram desenvolvidos a partir de vírus Semliki Forest (SFV), vírus Sindbis (SIN) e vírus da encefalite equina venezuelana (VEE). Os alfavírus são vírus RNA de filamento simples em que os genes heterólogos de interesse podem substituir os genes estruturais dos alfavírus. Ao proporcionar os genes estruturais em trans, o RNA replicon é empacotado em partículas de replicon (RP) que podem ser usados para fins de terapia genética ou vacinação genética (vide, por exemplo, Vander Veen et al., 2012. Alphavirus replicon vacines. Avaliações de Pesquisa de Saúde Animal 13 (1): 1 a 9). Após a entrada na célula hospedeira, o RNA viral genômico serve inicialmente como um mRNA para tradução das proteínas não estruturais virais (NSPS) necessários para a iniciação da amplificação do RNA viral. A replicação de RNA ocorre através da síntese de um intermediário de filamento menor de comprimento total que é usado como molde para a síntese de RNA de genoma de comprimento adicional e para a transcrição de um RNA subgenômico de filamento maior a partir de um promotor interno. Tal RNA pode então ser considerada como RNA auto-replicante, uma vez que as proteínas não estruturais responsáveis pela replicação (e transcrição dos genes heterólogos) ainda estão presentes em tais replicon. Tais vetores de alfavírus são referidos como "replicons".

[0075] Partícula de Replicon: Uma partícula replicon consiste em duas ou três partes: i) o material genético (= o replicon) (que compreende genes virais e genes heterólogos substituídos opcionais) feitos a partir de DNA ou RNA; ii) uma camada de proteína que protege esses genes; e, em alguns casos, iii) um envelope de lipídios que envolve o revestimento da proteína quando estão fora de uma célula.

[0076] RNA isolado: Isolado RNA é definido na presente invenção como RNA que não é parte de uma célula, uma célula irradiada ou um lisado celular. Um RNA isolado pode ser produzido por meio do isolamento e/ou purificação a partir de células ou de lisatos de células, ou a partir de sistemas de transcrição in vitro.

[0077] O termo RNA isolado, no contexto da presente invenção é definido na presente invenção como RNA que não faz parte das células, as células ou lisados de células, incluindo o RNA da vacina de RNA irradiado ou que não faça parte das células transfectadas com o RNA da vacina de RNA. Em outras palavras, o termo "exclui os RNA isolados" (ex vivo) ou as células transfectadas moduladas usadas como vacina de RNA, em particular exclui ex vivo as células imunes transfectadas ou moduladas, tais como as células dendríticas (DC), por exemplo, DC transfectadas/transduzidas com um RNA utilizadao como vacina de RNA. Além disso, o termo RNA isolado exclui o RNA composto em células irradiadas, as células ou lisado de células que compreendem de forma natural pelo menos um RNA que codifica para um antígeno utilizado como vacina de RNA. Por conseguinte, a vacina de RNA da combinação da presente invenção de preferência não compreende as células moduladas ou transfectadas, em particular de células imunes não transfectadas ou moduladas (por exemplo, células apresentadoras de antígeno), mais particularmente DC não transfectadas ou moduladas, as células irradiadas ou lisados celulares que compreendem de forma natural pelo menos um RNA da vacina de RNA. Por essa modalidade, torna-se claro que a vacina de RNA usada na presente invenção de preferência não corresponde a uma vacina baseada em célula ou uma vacina baseada em DC, ou, mais geralmente, que de preferência não corresponde a uma vacina à base de células ou, mais geralmente, a vacina de RNA usada na presente invenção é de preferência livre de células e a combinação da presente invenção a ser administrada a vacina proporciona RNA como de RNA, mais de preferência como mRNA, opcionalmente em associação com um veículo e/ou adjuvante componente. O termo RNA isolado também inclui RNA que é complexado com outros componentes, por exemplo peptídeos, proteínas, veículos, etc, RNA empacotado em partículas como por exemplo, partículas de replicon ou em partículas de vírus (virions) e RNA contido na solução que pode adicionas para o RNA ainda compreender os componentes, por exemplo tampão, reagentes de estabilização, inibidores de RNAse, etc..

[0078] Sequência de uma molécula de ácido nucleico: A sequência de uma molécula de ácido nucleico está normalmente entendida como sendo a ordem particular e individual, isto é, a sucessão de seus nucleotídeos.

[0079] Sequência de uma proteína ou peptídeo: A sequência de um peptídeo ou proteína é normalmente entendida como sendo da ordem, isto é, a sucessão dos seus aminoácidos.

[0080] A identidade de sequência: duas ou mais sequências são idênticas se eles apresentam o mesmo comprimento e a fim de nucleotídeos ou aminoácidos. A porcentagem de identidade tipicamente descreve a extensão em que duas sequências são idênticas, isto é, tipicamente, descreve a porcentagem de nucleotídeos que correspondem na sua posição com a sequência de nucleotídeos idênticas de uma sequência de referência. Para a determinação do grau de identidade, as sequências a serem comparadas são considerados para apresentar o mesmo comprimento, ou seja, o comprimento da sequência mais longa das sequências a ser comparada. Isto significa que uma primeira sequência de nucleotídeos que consiste em 8 é 80 % idêntica a uma segunda sequência de nucleotídeos que consiste em 10, que compreende a primeira sequência. Em outras palavras, no contexto da presente invenção, a identidade de sequências, de um modo preferido, refere-se a porcentagem de nucleotídeos de uma sequência que tem a mesma posição em duas ou mais sequências que tenham o mesmo comprimento. As lacunas são geralmente consideradas como posições não idênticas, independentemente da sua posição real em um alinhamento.

[0081] O fragmento de uma sequência: um fragmento de uma sequência é tipicamente uma porção menor de uma sequência de comprimento total de, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos. Dessa maneira, um fragmento de uma sequência de, tipicamente, é constituído por meio de uma sequência que é idêntica para os correspondentes estiramentos ou correspondentes alongamentos dentro da sequência de comprimento completa. Um fragmento de uma sequência preferida no contexto da presente invenção, é constituído por meio de uma extensão contínua de entidades, tais como nucleotídeos ou aminoácidos, correspondendo a uma extensão contínua de entidades na molécula ao qual o fragmento é derivado, que representa pelo menos 5%, de preferência pelo menos 20%, de preferência pelo menos 30%, mais de preferência pelo menos 40%, mais de preferência pelo menos 50%, ainda mais de preferência pelo menos 60%, ainda mais de preferência pelo menos 70%, e mais de preferência pelo menos 80% do total (isto é, de comprimento completo) da molécula a partir da qual o fragmento foi derivado. Dessa maneira, por exemplo, um fragmento de um antígeno de proteína ou peptídeo de preferência corresponde a uma extensão contínua de entidades do antígeno de proteína ou peptídeo ao qual o fragmento é derivado, que representa pelo menos 5%, de preferência pelo menos 20%, de preferência pelo menos 30%, mais de preferência pelo menos 40%, mais de preferência pelo menos 50%, ainda mais de preferência pelo menos 60%, ainda mais de preferência pelo menos 70%, e mais de preferência pelo menos 80% do total (isto é, de comprimento total) ou proteína do antígeno peptídico. É particularmente preferido que o fragmento de uma sequência seja um fragmento funcional, ou seja, que o fragmento venha a preencher uma ou mais das funções desempenhadas por meio da sequência ao qual o fragmento é derivado. Por exemplo, um fragmento de um antígeno de proteína ou peptídeo de preferência apresenta pelo menos uma função antigênica (por exemplo, é capaz de causar uma reação imunológica específica contra pelo menos um determinante antigênico em que a referida proteína ou peptídeo de antígeno) da proteína ou do peptídeo antígeno ao qual o fragmento é derivado.

[0082] Fragmentos de proteínas: "Fragmentos" de proteínas ou peptídeos, isto é, fragmentos de sequências de aminoácidos, no contexto da presente invenção podem, tipicamente, compreender uma sequência de uma proteína ou peptídeo como definido na presente invenção, que é, no que diz respeito à sua sequência de aminoácidos (ou a sua molécula de ácido nucleicocodificada), N-terminais, C- terminais e/ou intra-sequencialmente truncados em comparação com a sequência de aminoácidos da proteína original (nativo) (ou a sua molécula de ácido nucleico codificada). Tal truncamento pode, dessa maneira, ocorrer tanto no nível de amino ácido ou correspondentemente ao nível do ácido nucleico. A identidade de sequência em proporção a um tal fragmento, tal como definido na presente invenção, pode, por conseguinte, de preferência, referir-se a toda a proteína ou peptídeo como descrito na presente invenção ou a toda a molécula de ácido nucleico (codificada) de tal proteína ou peptídeo.

[0083] Da mesma forma, os "fragmentos" de sequências de ácidos nucleicos no contexto da presente invenção podem compreender uma sequência de um ácido nucleico, tal como definido na presente invenção, que é, no que diz respeito à sua molécula de ácido nucleico 5'-, 3'- e/ou intra-sequencialmente truncada em comparação com a molécula de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico inicial (nativo). A identidade de sequência em proporção a um tal fragmento, tal como definido na presente invenção, pode, por conseguinte, de preferência, referir-se a todo o ácido nucleico, tal como definido na presente invenção.

[0084] Transfecção: O termo "transfecção" refere-se à introdução de moléculas de ácido nucleico, tal como DNA ou RNA (por exemplo, moléculas de mRNA), em células, de preferência em células eucarióticas. No contexto da presente invenção, o termo "transfecção" inclui qualquer método conhecido por meio de uma pessoa que é versada na técnica para a introdução de moléculas de ácido nucleico, de preferência moléculas de RNA em células, de preferência em células eucarióticas, tais como em células de mamífero. Tais métodos compreendem, por exemplo, eletroporação, lipofecção, por exemplo, baseada em lipídios catiônicos e/ou lipossomas, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção à base de nanopartículas, transfecção à base de vírus, ou de transfecção à base de polímeros catiônicos, tais como DEAE-dextrano ou polietilenimina etc..

[0085] Veículo: Um veículo no contexto da presente invenção pode, tipicamente, ser um composto que facilita o transporte e/ou complexação de um outro composto (carga). Um veículo pode ser associado com a sua carga por meio da interação covalente ou não covalente. Um veículo pode transportar ácidos nucleicos, por exemplo, RNA ou DNA , para as células alvo. O veículo pode - em algumas modalidades - ser um composto catiônico ou policatiônico ou um veículo polimérico tal como definido na presente invenção. Um veículo, no contexto da presente invenção, é de preferência adequado como veículo para moléculas de ácido nucleico, por exemplo, para mediar a dissolução em líquidos fisiológicos aceitáveis, transporte e absorção celular de moléculas de ácido nucleico ou um vetor. Deste modo, um veículo, no contexto da presente invenção, pode ser um componente que pode ser adequado para depósito e fornecimento de uma molécula de ácido nucleico ou vetor. Tais veículos podem ser, por exemplo, veículos catiônicos ou policatiônicos ou compostos que possam servir como agente de transfecção ou complexação. Os veículos particularmente preferidos ou veículos poliméricos neste contexto são compostos catiônicos ou policatiônicos.

COMPOSTO/COMPONENTE CATIÔNICO OU POLICATIÔNICO:

[0086] O termo "composto/componente catiônico ou policatiônico" refere-se tipicamente a uma molécula carregada, a qual é carregada de forma positiva (cátions), a um valor de pH tipicamente de 1 a 9, de preferência a um valor de pH 9 ou inferior (por exemplo, de 5 a 9) , de ou abaixo de 8 (por exemplo, de 5 a 8), de ou abaixo de 7 (por exemplo, 5 a 7), mais de preferência a um pH fisiológico, por exemplo, 7,3-7,4. Por conseguinte, um composto/componente catiônico ou policatiônico pode ser qualquer composto ou polímero carregado de forma positiva, de um modo preferido um peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico que é carregada de forma positiva, sob condições fisiológicas, particularmente sob condições fisiológicas in vivo. Um "peptídeo ou proteína catiônico" pode conter pelo menos um aminoácido carregado de forma positiva, ou mais do que um aminoácido carregado de forma positiva, por exemplo, selecionado entre Arg, His, Lys ou Orn. Por conseguinte, os compostos ‘policatiônicos’ também estão dentro do escopo exibindo mais do que uma carga positiva nas condições dadas. Neste contexto, um peptídeo ou proteína catiônico contém um maior número de aminoácidos catiônicos, por exemplo, um maior número de Arg, His, Lys ou Orn, de aminoácidos carregados de forma negativa. Em uma modalidade preferida, um peptídeo ou proteína catiônico no contexto da presente invenção contém um maior número de aminoácidos catiônicos, por exemplo, um maior número de Arg, His, Lys ou Orn, de outros resíduos.

[0087] O termo "composto catiônico ou policatiônico" no contexto da presente invenção refere-se de preferência a compostos que podem ser utilizados como agente de transfecção ou complexação, em particular de ácidos nucleicos, utilizados de acordo com a presente invenção.

[0088] Os compostos catiônicos ou policatiônicos de acordo com a presente invenção, sendo os agentes particularmente preferidos, neste contexto, incluem protamina, nucleolina, espermina ou espermidina, ou outros peptídeos ou proteínas catiônicos, tais como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, polipeptídeos básicos, peptídeos celulares de penetraçãos (CPPs), incluindo peptídeos de ligação HIV, peptídeos HIV-1 Tat (HIV), derivados de Tat, penetratina, VP22 ou peptídeos derivados analógicos, HSV VP22 (Herpes simplex), MAPA, KALA ou domínios de transdução de proteína (PTDs ), PpT620, peptídeos ricos em prolina, peptídeos ricos em arginina, peptídeos ricos em lisina, peptídeo(s) MPG, Pep-1, L- oligômeros, peptídeo(s) de calcitonina, peptídeos derivados de Antennapedia (em particular a partir de Drosophila) antennapedia , pAntp, Pisl, FGF, lactoferrina, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB (1), PVEC, peptídeos derivados de hCT, SAP, ou histonas. A protamina é particularmente preferida.

[0089] Além disso, as proteínas ou peptídeos catiônicos ou policatiônicos preferidos utilizados como agente de transfecção ou complexação podem ser selecionados a partir das seguintes proteínas ou peptídeos que têm a seguinte fórmula (III) total: (Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)O; (Xaa)x, (fórmula (III))

[0090] em que l + m + n + o + x = 8-15, e l, m, n ou o, independentemente do outro, podem ser qualquer número selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, desde que o teor global de Arg, Lys, His e Orn represente pelo menos 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de entre aminoácidos nativos (= ocorrem de forma natural) ou os aminoácidos não nativos com exceção de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado a partir de 0, 1, 2, 3 ou 4, desde que o teor global de Xaa não exceda 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo. Os peptídeos catiônicos particularmente preferidos neste contexto são, por exemplo, Arg7, Arg8, Arg9, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y (RKH)2R, etc..

[0091] Além disso, os compostos catiônico ou policatiônicos preferidos, que podem ser utilizados como agente de transfecção ou complexação podem incluir polissacarídeos catiônicos, por exemplo, quitosano, polibreno, polímeros catiônicos, por exemplo, polietilenoimina (PEI), lipídios catiônicos, por exemplo DOTMA: [1- (2,3- sioleilóxi) propil)]-N,N,N-trimetilamônio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilspermina, DIMRI: brometo de dimiristo-oxipropil dimetil hidroxietil de amônio, DOTAP: dioleoilóxi-3- (trimetilamônio)propano, DC-6-14: cloreto de O,O-ditetradecanoil-N-(α- trimetilamonioacetil) dietanolamina, CLIP1: rac-[(2,3- dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamônio, CLIP6: rac-[2(2,3- dihexadeciloxipropil-oximetilóxi)etil]trimetilamônio, CLIP9: rac- [2 (2,3- dihexadeciloxipropil-oxisuccinilóxi)etil] trimetilamônio, oligofectamina, Lipofectamina® ou polímeros catiônicos ou policatiônicos, por exemplo, poliaminoácidos modificados, tais como e-aminoácido-polímeros ou poliamidas invertidas, etc., polietilenos modificados, tais como PVP (poli (brometo de N-etil-4-vinilpiridínio)), etc, acrilatos modificados, tais como pDMAEMA (poli (acrilato de metil dimetilaminoetila)), etc., amidoaminas modificadas tais como (poli (amidoamina)) PAMAM, etc, polibetaaminoéster modificado (PBAE), tais como polímeros de diacrilato-co-5-amino-1-pentanol de 1,4-butanodiol de extremidade diamina modificada, etc, dendrímeros, tais como dendrímeros de polipropilamina ou dendrímeros à base de PAMAM etc., poliimina(s), tais como PEI: poli (etilenoimina), poli (propilenoimina), etc., polialilamina, polímeros à base da estrutura principal de açúcar, tais como polímeros à base de ciclodextrina, polímeros à base de dextrano, quitosana, etc, polímeros à base da estrutura principal de Silan, tais como copolímeros PMOXA-PDMS, etc, polímeros em bloco constituídos por meio de uma combinação de um ou mais blocos catiônicos (por exemplo, selecionados a partir de um polímero catiônico tal como mencionado acima) e de um ou mais blocos hidrofílicos ou hidrofóbicos (por exemplo polietilenoglicol); etc..

[0092] Veículo polimérico: Um veículo polimérico é tipicamente um veículo que é formado por meio de um polímero. Um veículo polimérico no contexto da presente invenção utilizado como agente de transfecção ou complexação pode ser um veículo polimérico formado por meio dos componentes catiônicos reticulados de dissulfureto. Os componentes catiônicos reticulados por meio das ligações dissulfureto podem ser iguais ou diferentes uns dos outros. O veículo polimérico pode também conter outros componentes. É também particularmente preferido que o veículo polimérico compreenda as misturas de peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos e eventualmente outros componentes, como definido na presente invenção, que são reticulados por meio das ligações de dissulfureto, como descrito na presente invenção.

[0093] Neste contexto, os componentes catiônicos que formam a base para o veículo polimérico por meio da reticulação de dissulfureto, são tipicamente selecionados a partir de qualquer peptídeo, proteína ou polímero catiônico ou policatiônico adequado para esta finalidade, nomeadamente, qualquer peptídeo, proteína ou polímero catiônico ou policatiônico capaz de complexo de um ácido nucleico, tal como definido de acordo com a presente invenção, e dessa maneira, de preferência, condensar o ácido nucleico. O peptídeo, proteína ou polímero catiônico ou policatiônico, é de preferência uma molécula linear, no entanto, peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos ramificados, podem também ser utilizados.

[0094] Cada peptídeo, proteína ou polímero catiônico ou policatiônico do veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, de reticulação com dissulfureto pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção contenha, pelo menos, uma porção -SH, mais de preferência, pelo menos, um resíduo de cisteína ou de qualquer grupo químico que exibe mais uma porção -SH, capaz de formar uma ligação dissulfureto mediante a condensação com pelo menos uma outra peptídeo, proteína ou polímero catiônico ou policatiônico como componente catiônico do veículo polimérico tal como mencionado na presente invenção.

[0095] Como definido acima, o veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação da vacina/inibidor da presente invenção pode ser formado por meio dos componentes dissulfureto reticulados catiônicos (ou policatiônicos).

[0096] De acordo com uma primeira alternativa, pelo menos um componente catiônico (ou policatiônico) do veículo polimérico, que pode ser utilizado neste contexto pode ser selecionado a partir de peptídeos ou proteínas catiônicos ou policatiônicos. Tais peptídeos ou proteínas catiônicos ou policatiônicos exibem de preferência um comprimento de cerca de 3 a 100 aminoácidos, de preferência, um comprimento de cerca de 3 a 50 aminoácidos, mais de preferência um comprimento de cerca de 3 a 25 aminoácidos, por exemplo, um comprimento de cerca de 3 a 10, 5 a 15, 10 a 20 ou 15 a 25 aminoácidos. De uma maneira alternativa ou adicional, esses peptídeos ou proteínas catiônicos ou policatiônicos podem apresentar um peso molecular de cerca de 0,01 kDa a cerca de 100 kDa, incluindo um peso molecular de cerca de 0,5 kDa a cerca de 100 kDa, de preferência de cerca de 10 kDa a cerca de 50 kDa, ainda mais de preferência de cerca de 10 kDa a cerca de 30 kDa.

[0097] No caso específico que o componente catiônico do veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção compreende um peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico, as propriedades catiônicas do peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico ou de todo o veículo polimérico, se o veículo polimérico for inteiramente composto por peptídeos ou proteínas catiônicos ou policatiônicos, podem ser determinados sobre o seu teor de aminoácidos catiônicos. De preferência, o teor de aminoácidos catiônicos no peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico e/ou o veículo polimérico é pelo menos 10%, 20%, ou 30%, de preferência pelo menos 40%, mais de preferência pelo menos 50%, 60% ou 70%, mas também, de preferência, pelo menos, 80%, 90%, ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, mais de preferência pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, ou pode estar na proporção de cerca de 10% a 90%, mais de preferência na proporção de cerca de 15% a 75%, ainda mais de preferência na proporção de cerca de 20% a 50%, por exemplo, 20, 30, 40 ou 50%, ou em uma proporção formada por quaisquer dois dos valores acima mencionados, desde que o teor de todos os aminoácidos, por exemplo, catiônico, aminoácidos, hidrofílicos, aromáticos e outros lipófilos, no peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico, ou em todo o veículo polimérico, se o veículo polimérico é inteiramente composto de catiônico ou policatiônicos peptídeos ou proteínas, seja de 100%.

[0098] De um modo preferido, esses peptídeos ou proteínas catiônicos ou policatiônicos do veículo polimérico, que contêm ou são adicionalmente modificados para compreender, pelo menos, uma porção -SH, são selecionados a partir de, sem serem restringidos a isso, peptídeos ou proteínas catiônicos, tais como a protamina, nucleolina, espermina ou espermidina, oligo- ou poli-L-lisina (PLL), polipeptídeos básicos, oligo ou poli-arginina, peptídeos de células de penetração (CPPs), CPPs quimérico, tais como Transportan, ou peptídeos MPG, peptídeos de ligação a HIV, Tat, HIV- 1 TAT (HIV), derivados de Tat, os membros da família penetratina, por exemplo, Penetratina, peptídeos derivados de Antennapedia (em particular a partir de Drosophila antennapedia), pAntp, Pisl, etc, antimicrobiana derivada de CPP ex Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB (1), os peptídeos pVec, derivados de HCT, SAP, MAP, PpTG20, Loligomere, FGF, lactoferrina, histonas, peptídeos analógicos ou derivados de VP22, pestivirus Erns, HSV, VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA ou proteínas de transdução de domínios (PTDs, PpT620, peptídeos ricos em prolina, peptídeos ricos em arginina, peptídeos ricos em lisina, Pep-1, L-oligômeros, peptídeo (s) de calcitonina, etc..

[0099] De uma maneira alternativa ou adicional, esses peptídeos catiônicos ou policatiônicos ou proteínas do veículo polimérico, que contêm ou são adicionalmente modificados para compreender, pelo menos, uma porção -SH, são selecionados de entre, sem se limitar aos mesmos, seguintes peptídeos catiônicos possuindo a seguinte soma de fórmula (IV): {(Arg) l; (Lys) m; (His) n, (Orn) o; (Xaa) x}; fórmula (IV)

[00100] em que l + m + n + o + x = 3-100, e l, m, n ou o independentemente um do outro é um número selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90 e 91 a 100, desde que o teor global de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) e Orn (Ornitina) represente pelo menos 10% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e Xaa é qualquer aminoácido selecionado de entre os aminoácidos nativos (= ocorrem de forma natural) ou os aminoácidos não nativos, com exceção de Arg, Lys, His ou Orn; e x é um número selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90, desde que o teor geral do Xaa não exceda 90 % de todos os aminoácidos da oligopeptídeo. Qualquer um dos aminoácidos Arg, Lys, His, Orn e Xaa podem ser posicionados em qualquer lugar do peptídeo. Neste contexto os peptídeos ou proteínas catiônicos na proporção de 7 a 30 aminoácidos são em particular preferidos. Mesmo os peptídeos mais preferidos desta fórmula são oligoargininas, tais como, por exemplo, Arg7, Arg8, Arg9, Arg12, His3Arg9, Arg9His3, His3Arg9His3, His6Arg9His6, His3Arg4His3, His6Arg4His6, TyrSer2Arg9Ser2Tyr, (ArgLysHis)4, Tyr (ArgLysHis)2Arg, etc..

[00101] De acordo com uma outra modalidade particularmente preferida, o peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico do veículo polimérico, quando definido de acordo com a fórmula {(Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x} (fórmula (IV)), como mostrado acima, e que compreende, ou é adicionalmente modificado para compreender, pelo menos, uma porção -SH, podem ser, sem estar restritos a isso, selecionados a partir da sub-fórmula (IVa): {(Arg)l; (Lys)m; (His)n; (ORN)o; (Xaa’)x (Cys)y} fórmula (IVa)

[00102] em que (Arg) l; (Lys) m; (His) n, (Orn) o; e x são como definido na presente invenção, Xaa’ é qualquer aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nativaos (= ocorre de forma natural), ou não nativos, com exceção de Arg, Lys, His, Orn ou Cys e y é um número selecionado a partir de 0, 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80 e 81 a 90, desde que o teor global de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) e Orn (Ornitina) representa pelo menos 10% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo.

[00103] Esta modalidade pode ser aplicada a situações, em que o peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônicos do veículo polimérico, por exemplo, quando definido de acordo com a fórmula empírica (Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x (fórmula (IV)), como mostrado acima, compreende ou que tenha sido modificado com pelo menos uma cisteína como grupo -SH no sentido de cima de tal modo que o peptídeo policatiônico catiônico ou como componente catiônico transporte pelo menos uma cisteína, que é capaz de formar uma ligação dissulfureto com outros componentes do veículo polimérico.

[00104] De acordo com uma outra modalidade particularmente preferida, o peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico do veículo polimérico, quando definido de acordo com a fórmula {(Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x} (fórmula (IV)), como mostrado acima, podem ser, sem estar restrito a isso, selecionados a partir da sub-fórmula (IVb): Cys1 {(Arg)l; (Lys)m; (His)n, (Orn)o; (Xaa)x} Cys2 fórmula (IVb)

[00105] em que a fórmula empírica {(Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x} (fórmula (IV)) é como definida na presente invenção e que forma um núcleo de uma sequência de aminoácidos de acordo com a fórmula (IV) (semiempírica) e em que a Cys1 e Cys2 são cisteínas proximais, ou terminais para (Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x. Esta modalidade podem ser aplicadas a situações, em que o peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico do veículo polimérico, o qual pode ser usado para complexar pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação da vacina/inibidor da presente invenção, por exemplo, quando definido de acordo com a fórmula empírica (Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x (fórmula (IV)), como mostrado acima, foi modificado com pelo menos duas cisteínas como porções -SH no sentido de cima de tal modo que o peptídeo policatiônico catiônico ou do veículo polimérico da presente invenção possui pelo menos duas cisteínas (terminais), que são capazes de formar uma ligação dissulfureto com outros componentes do veículo polimérico.

[00106] De acordo com uma segunda alternativa, pelo menos um componente catiônico (ou policatiônico) do veículo polimérico pode ser selecionado a partir de, por exemplo, qualquer polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) adequado, neste contexto, desde que este polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) exponha ou seja modificado para expor, pelo menos, uma porção SH, que prevê uma ligação dissulfureto ligante ao polímero catiônico ou policatiônico com um outro componente do suporte polimérico, tal como definido na presente invenção. Dessa maneira, do mesmo modo, tal como definido na presente invenção, o veículo polimérico pode compreender os mesmos ou diferentes polímeros catiônicos ou policatiônicos.

[00107] No caso específico que o componente catiônico do veículo polimérico compreende um polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) as propriedades catiônicas do polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) podem ser determinadas no momento do seu teor de cargas catiônicas quando comparado com as cargas totais dos componentes do polímero catiônico. De preferência, o teor de cargas catiônicas do polímero catiônico a um pH (fisiológico) , tal como definido na presente invenção é, pelo menos, 10%, 20%, ou 30%, de preferência pelo menos 40 %, mais de preferência pelo menos 50%, 60% ou 70%, mas também, de preferência, pelo menos, 80 %, 90 %, ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, mais de preferência pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, ou pode estar na proporção de cerca de 10% a 90%, mais de preferência na proporção de cerca de 30% a 100%, ainda de preferência, na proporção de cerca de 50% a 100%, por exemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, ou em uma proporção formada por quaisquer dois dos valores acima mencionados, desde que o teor de todas as cargas, por exemplo, cargas positivas e negativas no pH (fisiológico) tal como definido na presente invenção, em todo o polímero catiônico seja de 100%.

[00108] De um modo preferido, o componente catiônico (não peptídico) do veículo polimérico representa um polímero catiônico ou policatiônico, normalmente exibindo um peso molecular de cerca de 0,1 ou 0,5 kDa a cerca de 100 kDa, de preferência de cerca de 1 kDa e cerca de 75 kDa, mais de preferência de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, ainda mais de preferência de cerca de 5 kDa a cerca de 30 kDa, ou um peso molecular de cerca de 10 kDa a cerca de 50 kDa, ainda mais de preferência de cerca de 10 kDa a cerca de 30 kDa. Além disso, o polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) exibe tipicamente, pelo menos, uma porção -SH, que é capaz de formar uma ligação dissulfureto mediante a condensação, quer com outros componentes catiônicos ou outros componentes do veículo polimérico, tal como definido na presente invenção.

[00109] No contexto acima, o componente catiônico (não peptídico) do veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser selecionado a partir de acrilatos, acrilatos modificados, tais como pDMAEMA (poli (metacrilato de dimetilaminoetila)), quitosanas, ou aziridinas 2-etil-2-oxazolina (formando etileniminas oligo ou oligoettileniminas modificadas), polímeros obtidos por meio da reação de aminas com bisacrilatos formando aminoésteres beta oligo ou poliaminas de amido ou outros polímeros tais como poliésteres, policarbonatos, etc., cada molécula destes polímeros catiônicos ou policatiônicos (não peptídicos) exibe tipicamente, pelo menos, uma Porção SH, em que pelo menos uma destas porções SH podem ser introduzidas no polímero catiônico ou policatiônico (não peptídico) por meio das modificações químicas, por exemplo, usando imonotiolan, ácido 3-tio propiônico ou introdução de porções SH contendo aminoácidos, tal como a cisteína ou qualquer outro aminoácido adicional (modificado). Tais porções SH são de preferência como já foi definido acima.

[00110] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o componente adicional, o qual pode estar contido no suporte polimérico, o qual pode ser usado para modificar os diferentes (curtos) polímeros ou peptídeos catiônicos ou policatiônicos (não peptídicos) que formam a base para o veículo polimérico ou as propriedades bioquímicas/biofísicas do veículo polimérico, tal como definido na presente invenção, é um componente de aminoácidos (AA). De acordo com a presente invenção, o componente de aminoácidos (AA) compreende um número de aminoácidos de um modo preferido em uma proporção de cerca de 1 a 100, de preferência, em uma proporção de cerca de 1 a 50, mais de preferência selecionado a partir de uma série que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 a 20, ou podem ser selecionados de entre uma proporção formada por meio de quaisquer dois dos valores acima mencionados. Neste contexto, os aminoácidos de componente aminoácido (AA) podem ser escolhidos independentemente um do outro. Por exemplo, se o veículo polimérico em dois ou mais componentes (AA) estão presentes eles podem ser iguais ou podem ser diferentes uns dos outros.

[00111] O componente aminoácido (AA) pode conter ou pode ser flanqueado (por exemplo, terminal) por meio de uma porção contendo - SH, que permite a introdução deste componente (AA) por meio de uma ligação dissulfureto no suporte polimérico, tal como definido na presente invenção. No caso específico de que a porção contendo -SH representa uma cisteína, o componente de aminoácidos (AA) também pode ser lido como -Cys- (AA) em que -Cys- Cys representa a cisteína e fornece o necessário para a porção SH de uma ligação dissulfeto. A porção contendo -SH podem também ser introduzida no componente de aminoácidos (AA), utilizando qualquer uma das modificações ou reações como mostrado acima para o componente catiônico ou qualquer um dos seus componentes.

[00112] Além disso, o componente de aminoácidos (AA) pode ser fornecido com duas porções SH (ou mesmo mais), por exemplo, em uma forma representada pela fórmula HS- (AA) -SH para permitir a ligação de duas funcionalidades através de ligações dissulfureto, por exemplo, se o componente de aminoácidos (AA) é usado como um agente de ligação entre dois componentes adicionais (por exemplo, como um agente de ligação entre dois polímeros catiônicos).

[00113] Em alternativa, o componente de aminoácido (AA) pode ser proporcionado com outras funcionalidades, como acima descrito para os outros componentes do veículo polimérico, que permitem a ligação do componente de aminoácidos (AA) para qualquer um dos componentes do veículo polimérico.

[00114] Dessa maneira, de acordo com a presente invenção, o componente de aminoácidos (AA) do veículo polimérico pode ser ligado a outros componentes do veículo polimérico, que podem ser utilizadas para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação da vacina/inibidor da presente invenção com ou sem a utilização de uma ligação dissulfureto.

[00115] De acordo com uma alternativa adicional e, particularmente preferida, o componente de aminoácidos (AA), pode ser usado para modificar o veículo polimérico, em particular o teor de componentes catiônicos no veículo polimérico tal como definido acima.

[00116] No contexto da presente invenção, o componente de aminoácidos (AA) pode ser selecionado a partir das seguintes alternativas: um componente aromático de aminoácidos, um componente aminoácido hidrófilo (de preferência não polar e carregado), um componente aminoácido lipofílico, ou um componente básico fraco dos aminoácidos.

[00117] De acordo com uma outra alternativa, o componente de aminoácidos (AA) pode ser um peptídeo de sinal ou sequência de sinal, um sinal de localização ou a sequência, um sinal de localização nuclear ou de sequência (NLS), um anticorpo, um peptídeo de penetração celular (por exemplo, TAT), etc Além disso, de acordo com uma outra alternativa, o componente de aminoácidos (AA) pode ser um peptídeo ou uma proteína funcional, o que pode modular a funcionalidade do veículo polimérico em conformidade. Tais peptídeos ou proteínas funcionais como o componente de aminoácidos (AA) compreendem, de preferência quaisquer peptídeos ou proteínas como definido na presente invenção, por exemplo, tal como é definido na presente invenção como antígenos. De acordo com uma alternativa, esses outros peptídeos ou proteínas funcionais podem compreender os chamados peptídeos de células de penetração (CPPs) ou peptídeos catiônicos para transporte.

[00118] De acordo com uma última alternativa, o componente de aminoácidos (AA) pode ser constituído por, ou pode compreender qualquer peptídeo ou proteína que pode executar qualquer função favorável na célula. São particularmente preferidos os peptídeos ou proteínas selecionadas a partir de proteínas ou peptídeos terapeuticamente ativos, a partir de, por exemplo, antígenos tumorais, antígenos de patogênicos (por exemplo, antígenos de origem animal, antígenos virais, antígenos de protozoários, antígenos bacterianos), de anticorpos, a partir de proteínas imunoestimulantes ou peptídeos, a partir de receptores de células T específicas do antígeno, ou de qualquer outra proteína ou peptídeo apropriado para uma aplicação específica (terapêutica). Particularmente preferidos são aqueles epítopos peptídicos de antígeno (s) codificado (s) por meio de, pelo menos, um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção.

[00119] O veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode compreender, pelo menos, um dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), em que qualquer uma das alternativas acima mencionadas podem ser combinadas umas com as outras, e pode ser formado por meio da polimerização mesmo em uma reação de condensação de polimerização através das suas porções SH.

[00120] Além disso, o veículo polimérico pode ser selecionado a partir de uma molécula de veículo polimérico de acordo com a fórmula geral (V): L-P1-S- [S-P2-S]n-S-G-P3 fórmula (V)

[00121] em que,

[00122] P1 e P3 são diferentes ou idênticos uns aos outros e representam uma cadeia linear ou ramificada de polímero hidrofílico, cada P1 e P3 exibe pelo menos uma Porção SH, capaz de formar uma ligação dissulfureto mediante a condensação com o componente P2, ou de uma maneira alternativa com (AA), (AA)x ou [(AA)x]z se tais componentes são usados como um agente de ligação entre P1 e P2 ou P3 e P2) e/ou com outros componentes (por exemplo, (AA), (AA)x, [ (AA)x]z ou L), polímero hidrófilo de cadeia linear ou ramificada selecionado independentemente um do outro a partir de polietileno- glicol (PEG), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, poli-2-(metacriloilóxi) etil fosforilcolinas, poli (hidroxialquil L-asparagina), poli (2- (metacriloilóxi) etil fosforilcolina), hidroxietilamido ou poli (hidroxialquil L- glutamina), em que as cadeias de polímero hidrófilo apresentam um peso molecular de cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa, de preferência de cerca de 2 kDa a cerca de 25 kDa; ou mais de preferência de cerca de 2 kDa a cerca de 10 kDa, por exemplo, cerca de 5 kDa a cerca de 25 kDa ou de 5 kDa a cerca de 10 kDa;

[00123] P2 é um peptídeo ou proteína catiônico ou policatiônico, por exemplo, como definido acima para o veículo polimérico formado por meio dos componentes catiônicos reticulados por meio das ligações dissulfureto, e de preferência tendo um comprimento de cerca de 3 a cerca de 100 aminoácidos, mais de preferência possuindo um comprimento de cerca de 3 a cerca de 50 aminoácidos, ainda mais de preferência com um comprimento de cerca de 3 a cerca de 25 aminoácidos, por exemplo, um comprimento de cerca de 3 a 10, 5 a 15, 10 a 20 ou 15 a 25 aminoácidos, mais de preferência um comprimento de cerca de 5 a cerca de 20 e ainda mais de preferência, um comprimento de cerca de 10 a cerca de 20; ou

[00124] é um polímero catiônico ou policatiônico, por exemplo como definido acima para o veículo polimérico formado por meio dos componentes catiônicos dissulfureto reticulados, possuindo tipicamente um peso molecular de cerca de 0,5 kDa a cerca de 30 kDa, incluindo um peso molecular de cerca de 1 kDa e cerca de 20 kDa, ainda mais de preferência de cerca de 1,5 kDa a cerca de 10 kDa, ou tendo um peso molecular de cerca de 0,5 kDa a cerca de 100 kDa, incluindo um peso molecular de cerca de 10 kDa a cerca de 50 kDa, ainda mais de preferência de cerca de 10 kDa a cerca de 30 kDa;

[00125] cada P2 exibindo, pelo menos, duas porções SH, capazes de formar uma ligação dissulfureto mediante a condensação com outros componentes P2 ou componente(s) de P1 e/ou P3 ou, de uma maneira alternativa, com outros componentes (por exemplo, (AA), (AA)x, ou [(AA)x]z);

[00126] -SS- É uma ligação de dissulfeto (reversível) (os suportes são omitidos para melhor legibilidade), em que s representa de preferência enxofre ou uma porção transportando SH, que formou uma ligação de dissulfeto (reversível). O dissulfeto (reversível) é de preferência formado por meio da condensação de porções SH de ambos os componentes P1 e P2, P2 e P2, ou P2 e P3, ou, opcionalmente, de outros componentes, como definido na presente invenção (por exemplo, G, (AA), (AA)x, [(AA)x]z, etc); a Porção SH pode ser parte da estrutura de um destes componentes ou adicionada por meio de uma modificação, tal como definido abaixo;

[00127] L é um ligante opcional, o qual pode ou não estar presente, e pode ser selecionado independentemente do outro a partir de RGD, transferrina, folato, uma sequência de sinal ou peptídeo de sinal, um sinal ou a sequência de localização, um sinal ou sequência de localização nuclear (NLS), um anticorpo, um peptídeo de penetração dacélula (por exemplo, a TAT ou KALA), um ligante de um receptor (por exemplo, citoquinas, hormônios, fatores de crescimento, etc.), moléculas pequenas (por exemplo, hidratos de carbono de manose ou galactose como ligantes ou sintéticos), pequenas moléculas agonistas, inibidores ou antagonistas de receptores (por exemplo, análogos peptidomiméticos RGD), ou qualquer outra proteína, tal como definido na presente invenção, etc.;

[00128] n é um número inteiro, tipicamente selecionado de entre uma proporção de cerca de 1 a 50, de preferência a partir de uma proporção de cerca de 1, 2 ou 3 a 30, mais de preferência a partir de uma proporção de cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 a 25, ou de uma proporção de cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 a 20, ou uma proporção de cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 a 15, ou uma proporção de cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 a 10, incluindo, por exemplo, uma proporção de cerca de 4 a 9, 4 a 10, 3 a 20, 4 a 20, 5 a 20, ou 10 a 20, ou uma proporção de cerca de 3 a 15, 4 a 15, 5 a 15, ou 10 a 15 , ou uma proporção de cerca de 6 a 11 ou 7 a 10. Mais de preferência, n é em uma proporção de cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 a 10, mais de preferência em uma proporção de cerca de 1, 2, 3, ou 4 a 9, em uma proporção de cerca de 1, 2, 3, ou 4 a 8, ou em uma proporção de cerca de 1, 2, ou 3 a 7.

[00129] Cada um dos polímeros hidrófilos P1 e P3 exibem tipicamente, pelo menos, uma Porção SH, em que pelo menos uma porção SH é capaz de formar uma ligação dissulfureto na reação com o componente P2 ou com o componente (AA) ou (AA)x, se for usado como ligante entre P1 e P2 ou P3 e P2, tal como definido abaixo e, opcionalmente, com um componente adicional, por exemplo, L e/ou (AA) ou (AA)x, por exemplo, se duas ou mais porções SH estão contidas. As seguintes sub-fórmulas "P1-P2-SS" e "P2-P3-SS" dentro da fórmula geral (V) acima (os suportes são omitidas para uma melhor legibilidade), em que qualquer de S, P1 e P3 são tal como definidos na presente invenção, representam tipicamente uma situação, em que uma Porção SH hidrofílica de polímeros P1 e P3 foi condensada com uma porção SH- P2 do componente de fórmula geral (V) acima, em que ambos os enxofres destas porções SH formam uma ligação dissulfureto -SS- como definido na presente invenção para a fórmula (V). Estas porções SH são tipicamente fornecidas por meio de cada um dos polímeros hidrófilos P1 e P3, por exemplo, através de uma cisteína interna ou qualquer outro aminoácido ou composto (modificado) que transporta uma Porção SH. Por conseguinte, as sub-fórmulas "P1-P2-SS" e "P2-P3- SS" também podem ser escritas como "P1-Cys-Cys-P2" e "P2-Cys-Cys- P3", se a porção -SH for fornecida por meio de uma cisteína, em que o termo Cys-Cys representa duas cisteínas acopladas através de uma ligação dissulfureto, e não através de uma ligação peptídica. Neste caso, o termo "-SS-" nestas fórmulas pode também ser escrito como "S- Cys", como "Cys-S" ou como "Cys-Cys". Neste contexto, o termo "Cys- Cys" não representa uma ligação peptídica, mas uma ligação de duas cisteínas através das suas porções SH para formar uma ligação dissulfureto. Por conseguinte, o termo "Cys-Cys" também pode ser compreendido geralmente como "(Cys-S) - (S-Cys) -", em que, neste caso específico S indica o enxofre da porção SH de cisteína. Da mesma forma, os termos "-S-Cis" e "-Cys-S" indicam uma ligação de dissulfureto entre uma porção contendo -SH e uma cisteína, que também pode ser escrito como "S- (S-Cys)" e "- (Cys-S) -S". Em alternativa, os polímeros hidrófilos P1 e P3 podem ser modificados com uma Porção SH, de preferência através de uma reação química com um composto que leva uma porção -SH, de tal modo que cada um dos polímeros hidrófilos P1 e P3 transportam pelo menos uma tal porção de SH. Tal composto transportando uma porção SH pode ser, por exemplo, uma cisteína (adicional) ou qualquer outro aminoácido(modificado), que transporta uma Porção SH. Um tal composto pode também ser qualquer composto ou porção não amino, que contenha ou que permite a introdução de uma porção SH hidrofílica nos polímeros P1 e P3, tal como definido na presente invenção. Tais compostos não aminoácidos podem ser ligados aos polímeros hidrofílicos P1 e P3 de fórmula (VI) do veículo polimérico de acordo com a presente invenção por meio de reações químicas ou por meio da ligação de compostos, por exemplo, através da ligação de um ácido 3-tio propiônico ou tioimolane, por meio da formação de amida (por exemplo, ácidos carboxílicos, ácidos sulfônicos, aminas, etc), por meio da adição de Michael (por exemplo, porções de maleinimida, α, β carbonilas insaturadas, etc.), por meio de clique químico (por exemplo, azidas ou Alquinas), por meio da metátese de alqueno/alquina (por exemplo, alquenos ou Alquinas), formação de imina ou zona hídrica (aldeídos ou cetonas, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas), as reações de complexação (avidina, biotina, proteína G) ou componentes que permitem Reações de substituição do tipo Sn (por exemplo, halogenalcanos, tióis, álcoois, aminas, hidrazinas, hidrazidas, ésteres de ácidos sulfônicos, sais oxifosfônio) ou outras porções químicas que podem ser utilizadas na fixação de componentes adicionais. Um derivado de PEG particularmente preferido neste contexto é o poli (etileno-glicol) alfa-metóxi-omega-mercapto. Em cada caso, a porção SH, por exemplo, de uma cisteína ou de qualquer outro aminoácidos ou compostos (modificados), podem estar presentes nas extremidades terminais ou internamente, em qualquer posição de polímeros hidrófilos P1 e P3. Tal como definido na presente invenção, cada um dos polímeros hidrófilos P1 e P3 exibem tipicamente, pelo menos, uma porção SH de um modo preferido em uma extremidade terminal, mas podem também conter duas ou as mesmas porções SH, que podem ser utilizados para fixar, adicionalmente, outros componentes, tal como definidos na presente invenção, de preferência peptídeos ou proteínas ainda mais funcionais, por exemplo, um ligante, um componente de aminoácidos (AA) ou (AA)x, anticorpos, peptídeos de penetração celular ou peptídeos estimuladores (por exemplo, TAT, KALA), etc..

[00130] No contexto da fórmula inteira (V) do veículo polimérico da presente invenção pode ser de preferência definido como se segue: L-P1-S- [Cys-P2-Cys]n-S-G-P3 fórmula (VI)

[00131] em que L, P1, P2, P3 e n são como definidos na presente invenção, S é enxofre e cada Cys prevê a porção SH para a ligação de dissulfureto.

[00132] O componente aminoácido (AA) ou (AA)x no suporte polimérico de fórmula (V ou VI), por exemplo, como definido acima para o veículo polimérico formado por meio dos componentes catiônicos dissulfureto reticulados também podem ocorrer como um componente de aminoácidos repetitivo misto [(AA)x]z, em que o número de componentes de aminoácidos (AA) ou (AA)x é ainda definido por z inteiro. Neste contexto, Z pode ser selecionado de entre uma proporção de cerca de 1 a 30, de preferência a partir de uma proporção de cerca de 1 a 15, mais de preferência 1 a 10 ou de 1 a 5 e ainda mais de preferência selecionado de entre um número selecionado entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, ou pode ser selecionado de entre uma proporção formada por meio de quaisquer dois dos valores acima mencionados.

[00133] De acordo com uma alternativa específica e particularmente preferida, o componente de aminoácidos (AA) ou (AA)x, de preferência escrito como S-(AA)x-S ou [S-(AA)xS] pode ser usado para modificar o componente P2, particularmente do teor do componente de S-P2-S no componente repetitivo [S-P2-S] n do veículo polimérico de fórmula (V) acima. Isto pode ser representado no contexto de todo o veículo polimérico de acordo com a fórmula (VI), por exemplo, por meio da seguinte fórmula (VI): L-P1-S - {[S-P2-S]a[S-(AA)xS]b}-S-G-P3-L, fórmula (VI)

[00134] em que X, S, L, AA, P1, P2 e P3 são, de preferência, tal como definidos na presente invenção. Na fórmula (VI) acima, qualquer um dos componentes individuais [S-P2-S] e [S-(AA)x-S] podem ocorrer em qualquer ordem na sub-fórmula {[S-P2-S] de [S-(AA)x-S] b}. O número de componentes individuais [S-P2-S] e [S-(AA)x-S] na sub-fórmula {[S- P2-S]a[S-(AA)x-S]b} são determinadas por meio dos números inteiros a e b , em que a + b = n. n é um número inteiro e é definido como anteriormente para a fórmula (V).

[00135] De acordo com uma outra modalidade, o veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação da vacina/inibidor da presente invenção ou componentes individuais dos mesmos, por exemplo, dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), pode ser ainda modificada com um ligante, de preferência um hidrato de carbono, mais de preferência um açúcar, ainda mais de preferência de manose.

[00136] De acordo com uma modalidade específica, a totalidade do veículo polimérico pode ser formada por meio de uma condensação de polimerização (de pelo menos um) dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), através das suas porções SH em uma primeira etapa e o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção com um veículo polimérico, em uma segunda etapa. O veículo polimérico pode assim conter um número de, pelo menos, um ou mesmo mais dos mesmos ou diferentes dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), o número de preferência determinado por meio da proporção acima.

[00137] De acordo com uma modalidade específica alternativa, o veículo polimérico, o qual pode ser usado para o complexo, por exemplo, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou um ácido nucleico adjuvante na combinação de vacina/inibidor da presente invenção é formado através da realização da condensação de polimerização de pelo menos um dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), através das suas porções SH simultaneamente para complexar por exemplo pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno ou um adjuvante de ácido nucleico na combinação de vacina/inibidor da presente invenção para um veículo polimérico(preparado in situ). Da mesma forma, o veículo polimérico pode, dessa maneira, também, na presente invenção, conter um número de, pelo menos, um ou mesmo mais dos mesmos ou diferentes dos peptídeos, proteínas ou polímeros catiônicos ou policatiônicos mencionados acima ou outros componentes, por exemplo, (AA), o número de preferência determinado por meio da proporção acima.

[00138] Proporção N/P: A proporção N/P é uma medida da carga iônica do componente catiônico (cadeia lateral) do composto catiônico ou policatiônico ou do veículo polimérico utilizado como agente veículo ou de complexação, tal como definido na presente invenção. Em particular, se as propriedades catiônicas do componente catiônico são geradas por meio dos átomos de nitrogênio (por exemplo, as cadeias laterais de aminoácido), a proporção N/P expressa a proporçãode átomos de nitrogênio básicos de resíduos de fosfato na estrutura principal de nucleotídeos, considerando que os átomos de nitrogênio (cadeia lateral) no componente catiônico do composto catiônico ou policatiônico ou do veículo polimérico contribuirá no que diz respeito as cargas positivas e fosfato da estrutura principal de fosfato da carga por exemplo, ácido nucleico pelo menos um RNA que codifica para pelo menos um antígeno constituído na vacina de RNA ou de um ácido nucleico adjuvante contribuindo para a carga negativa. Geralmente, um fosfato fornece uma carga negativa, por exemplo, um nucleotídeo na molécula de ácido nucleico de carga fornece uma carga negativa. Ela pode ser calculada na base de que, por exemplo, 1 μg de RNA contém tipicamente cerca de 3 nmols de fosfato de resíduos, desde que o RNA apresente uma distribuição estatística de bases. Além disso, 1 nmol de peptídeo contém tipicamente cerca de resíduos x nmol de nitrogênio, dependentes do peso molecular e o número dos seus aminoácidos (catiônico).

[00139] Zetapotential: O termo "zetapotential" é um parâmetro amplamente utilizado para a carga eléctrica na superfície de uma partícula. É tipicamente determinado movendo a partícula carregada através de um campo elétrico. No contexto da presente invenção, o zetapotential preferido é o parâmetro para caracterizar a carga de uma partícula, por exemplo, de um complexo que compreende, como veículo ou agente de complexação catiônico ou um composto policatiônico e/ou o um veículo polimérico e como carga de ácido nucleico de pelo menos um RNA que codifica para pelo menos um antígeno da vacina de RNA ou de um ácido nucleico adjuvante. Dessa maneira, no contexto da presente invenção, a carga de uma partícula é de preferência determinada através da determinação da zetapotential por meio do método de eletroforese de Doppler a laser usando um instrumento Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 25 °C e um ângulo de dispersão de 173 °. A carga da superfície de uma dada partícula também depende da força iônica da matriz utilizada (por exemplo, sal contendo tampão) e o pH da solução. Portanto, o zetapotential real de um dado complexo a uma proporçãode carga (N/P) pode diferir ligeiramente entre diferentes tampões utilizados para injeção. Para a medição, as partículas, tais como complexos que compreende como agente veículo ou complexação catiônico ou um composto policatiônico e/ou um veículo polimérico e como carga de ácido nucleico de pelo menos um RNA que codifica para pelo menos um antígeno da vacina de RNA ou um adjuvante ácido nucleico de acordo com a presente invenção são de preferência suspensos em uma solução de Lactato de Ringer. Em uma modalidade específica da presente invenção refere-se à utilização de um complexo carregado de forma negativa sob as condições de um determinado tampão de injeção, de preferência sob as condições de uma solução de lactato de Ringer, avaliada por meio de seu Zetapotential. Uma solução de lactato de Ringer de acordo com a presente invenção contém de preferência íons de 130 mmols/L de cloreto de sódio, íons de 109 mmols/L, 28 mmols/L de lactato, os íons de potássio de 4 mmols/L e 1,5 mmol/L de íon de cálcio. O sódio, cloreto de potássio e lactato normalmente vêm de NaCl (cloreto de sódio), NaC3H5O3 (lactato de sódio), CaCl2 (cloreto de cálcio), e KCl (cloreto de potássio). A osmolaridade da solução de lactato de Ringer é 273 mOsm/L e o pH é ajustado para 6,5.

[00140] Composição imunoestimulante: No contexto da presente invenção, uma composição imunoestimulante pode ser normalmente entendida como sendo uma composição que contém pelo menos um componente que é capaz de induzir uma resposta imune ou a partir do qual um componente que é capaz de induzir uma resposta imune é derivável. Esta resposta imune pode ser, de preferência uma resposta imune inata ou uma combinação de um adaptativo e uma resposta imune inata. De preferência, uma composição imunoestimulante no escopo da presente invenção contém pelo menos uma molécula de ácido nucleico imunoestimulante/adjuvante, mais de preferência, um RNA, por exemplo, uma molécula de mRNA. O componente imunoestimulante, tal como o mRNA pode ser complexado com um veículo adequado. Dessa maneira, a composição imunoestimulante pode compreender um complexo mRNA/veículo. Além disso, a composição imunoestimulante pode compreender um adjuvante e/ou um veículo adequado para o componente imunoestimulante, tal como o mRNA.

[00141] Ácido nucleico Adjuvante: Um ácido nucleico adjuvante, tal como utilizado na presente invenção, é de preferência selecionado a partir de ácidos nucleicos que são conhecidos por se ligarem a receptores TLR. Um tal ácido nucleico adjuvante pode ser na forma de um ácido nucleico (imunoestimulante) CpG, em particular CpG-RNA ou CpG-DNA, o que induz de preferência uma resposta imune inata. Um CpG-RNA ou CpG-DNA utilizado de acordo com a presente invenção pode ser uma filamento simples de DNA CpG (ss CpG-DNA), uma filamento duplo de CpG-DNA (dsDNA), um filamento simples de RNA- CpG (ss CpG-RNA) ou um filamento duplo de RNA-CpG (ds CpG-RNA). O ácido nucleico de CpG utilizado de acordo com a presente invenção é, de preferência, sob a forma de CpG-RNA, mais de preferência sob a forma de CpG-RNA de filamento simples (ss CpG-RNA). Também de preferência, tais ácidos nucleicos de CpG tem um comprimento tal como descrito acima. De preferência, os motivos CpG não são metilados. Além disso, um ácido nucleico adjuvante, tal como utilizado na presente invenção, pode ser um RNA imunoestimulante (isRNA), que de preferência provoca uma resposta imune inata.

[00142] De preferência, um ácido nucleico adjuvante, de preferência um RNA imunoestimulante (isRNA), tal como utilizado na presente invenção, pode compreender qualquer sequência de ácido nucleico conhecida para ser imunoestimulante, incluindo, por exemplo, as sequências de ácido nucleico que representam e/ou que codificas os ligantes de TLR, de um modo preferido selecionado a partir de membros da família TLR1 - TLR10 humano ou membros da família de TLR1 - TLR13murino, mais de preferência selecionado a partir de membros da família TLR1 - TLR10 (humanos), ainda mais de preferência de TLR7, TLR8 e ligantes para receptores intracelulares de RNA (tais como RIG- I ou MDA-5 , etc.) (vide por exemplo, Meylan, E., Tschopp, J. (2006) Do tipo Toll receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses. Mol Cell 22, 561 a 569), ou qualquer outra sequência de RNA imunoestimulante. Tal ácido nucleico adjuvante pode compreender um comprimento de 1000 a 5000, de 500 a 5000, de 5 a 5000, ou de 5 a 1000, de 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos.

[00143] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, uma sequência de ácido nucleico adjuvante, particularmente um isRNA, tal como utilizado na presente invenção, pode consistir em ou compreender um ácido nucleico de fórmula (VII) ou (VIII): GlXmGn, (fórmula geral (VII))

[00144] em que:

[00145] G é guanosina, uracila ou um análogo de guanosina ou uracila;

[00146] X é guanosina, uracila, a adenosina, timidina, citosina ou um análogo de nucleotídeos mencionado acima;

[00147] I é um número inteiro de 1 a 40,

[00148] em que

[00149] Quando L = 1 G é guanosina ou um análogo do mesmo,

[00150] Quando L > 1, pelo menos 50% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo do mesmo;

[00151] m é um número inteiro e é pelo menos 3;

[00152] em que

[00153] quando m = 3, X é uracila ou um análogo do mesmo,

[00154] quando m > 3, pelo menos, três sucessivas uracilas ou análogos de uracila ocorrem;

[00155] n é um número inteiro de 1 a 40,

[00156] em que

[00157] quando n = 1 G é guanosina ou um análogo do mesmo,

[00158] quando n > 1, pelo menos 50 % dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo do mesmo. ClXmCn, (fórmula (VIII))

[00159] em que:

[00160] C é citosina, uracila ou um análogo da citosina ou uracila;

[00161] X é guanosina, uracila, a adenosina, timidina, citosina ou um análogo de nucleotídeos mencionado acima;

[00162] I é um inteiro de 1 a 40,

[00163] em que

[00164] Quando L = 1 C é citosina ou um análogo da mesma,

[00165] Quando L > 1, pelo menos 50 % dos nucleotídeos são citosina ou um análogo do mesmo;

[00166] m é um número inteiro e é pelo menos 3;

[00167] em que

[00168] quando m = 3, X é uracila ou um análogo do mesmo,

[00169] quando m > 3, pelo menos, três sucessivas uracilas ou análogos de uracila ocorrem;

[00170] n é um número inteiro de 1 a 40,

[00171] em que

[00172] quando n = 1 C é citosina ou um análogo da mesma,

[00173] quando n > 1, pelo menos 50 % dos nucleotídeos são citosina ou um análogo dos mesmos.

[00174] Os ácidos nucleicos de fórmula (VII) ou (VIII), que podem ser utilizados como uma sequência de ácido nucleico adjuvante, particularmente um isRNA, podem ser moléculas de ácidos nucleicos relativamente curtas, com um comprimento típico de cerca de 5 a 100 (mas pode também ser mais do que 100 nucleotídeos de modalidades específicas, por exemplo até 200 nucleotídeos), de 5 a 90 ou de 5 a 80 nucleotídeos, de preferência um comprimento de cerca de 5 a 70, mais de preferência, um comprimento de cerca de 8 a 60 e, mais de preferência um comprimento de cerca de 15 a 60 nucleotídeos, mais de preferência de 20 a 60, mais de preferência de 30 a 60 nucleotídeos. Se o ácido nucleico de fórmula (VII) ou (VIII) tem um comprimento máximo de, por exemplo, 100 nucleotídeos, m será tipicamente < = 98. O número de nucleotídeos G no ácido nucleico de fórmula (I) é determinado por l ou n. l e n, independentemente um do outro, são cada um número inteiro de 1 a 40, em que, quando n = l ou 1 G é guanosina ou um análogo do mesmo, e quando L ou n > 1, pelo menos 50 % dos nucleotídeos são ou guanosina um análogo do mesmo. Por exemplo, sem que isso implique qualquer limitação, quando L ou n = 4 Gl ou Gn pode ser, por exemplo, um GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, Gugg, Uggg ou GGGG, etc.; Quando L ou n = 5 Gl ou Gn pode ser, por exemplo, um GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, ou GGGGG, etc .; etc Um adjacente nucleotídico ao Xm no ácido nucleico de fórmula (VII) de acordo com a presente invenção não é de preferência uma uracila. Da mesma forma, o número de nucleotídeos C no ácido nucleico de fórmula (VIII) de acordo com a presente invenção é determinado por l ou n. l e n, independentemente um do outro, são cada um número inteiro de 1 a 40, em que, quando l ou n = 1 , C é citosina ou um análogo da mesma, e quando L ou n > 1, pelo menos 50 % dos nucleotídeos são ou citosina um análogo do mesmo. Por exemplo, sem que isso implique qualquer limitação, quando L ou n = 4, Cl ou CN podem ser, por exemplo, um CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, Cuuc, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC ou CCCC, etc.; Quando L ou n = 5 Cl ou CN podem ser, por exemplo, um CCCUU, CCUCU, Cuccu, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC, ou CCCCC, etc.; etc. Um adjacente nucleotídico ao Xm no ácido nucleico de fórmula (VIII) de acordo com a presente invenção não é de preferência uma uracila. De preferência, na fórmula geral (VII), em que l ou n > 1, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo do mesmo, tal como definido acima. Os restantes nucleotídeos a 100% (quando guanosina constitui menos do que 100% dos nucleotídeos) nas sequências flanqueadoras G1 e/ou Gn são uracila ou um análogo do mesmo, tal como definido anteriormente. Também de preferência, L e n, independentemente um do outro, são cada um número inteiro de 2 a 30, mais de preferência um número inteiro de 2 a 20 e ainda mais de preferência um número inteiro de 2 a 15. O limite inferior de l ou n pode ser variado se necessário, e é pelo menos 1, de preferência pelo menos 2, mais de preferência pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Esta definição aplica-se correspondentemente com a fórmula (VIII).

[00175] De acordo com uma outra modalidade particularmente preferida, uma sequência de ácido nucleico adjuvante, particularmente um isRNA, tal como utilizado na presente invenção, pode consistir em ou compreender um ácido nucleico de fórmula (IX) ou (X):(NuGlXmGnNv)a, (fórmula geral (IX))

[00176] em que:

[00177] G é guanosina (guanina), uridina (uracila) ou um análogo de guanosina (guanina) ou uridina (uracila), de preferência de guanosina (guanina) ou um análogo do mesmo;

[00178] X é guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos), de preferência de uridina (uracila) ou um análogo do mesmo;

[00179] N é uma sequência de ácido nucleico com um comprimento de cerca de 4 a 50, de preferência de cerca de 4 a 40, mais de preferência de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 ácidos nucleicos, cada um, independentemente, N sendo selecionado a partir de guanosina (guanina), uridina (uracila ), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos);

[00180] a é um número inteiro de 1 a 20, de preferência de 1 a 15, mais de preferência de 1 a 10;

[00181] I é um inteiro de 1 a 40,

[00182] em que

[00183] Quando L = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo do mesmo,

[00184] Quando L > 1, pelo menos 50 % destes nucleotídeos (nucleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo do mesmo;

[00185] m é um número inteiro e é pelo menos 3;

[00186] em que

[00187] quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo do mesmo, e

[00188] quando m > 3, pelo menos, 3 uridinas sucessivas (uracilas) ou análogos de uridina (uracila) ocorrer;

[00189] n é um número inteiro de 1 a 40,

[00190] em que

[00191] quando n = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo do mesmo,

[00192] quando n > 1, pelo menos 50 % destes nucleotídeos (nucleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo do mesmo;

[00193] u, v pode ser independentemente um do outro um número inteiro de 0 a 50,

[00194] de preferência em que, quando u = 0, v > 1, ou

[00195] quando v = 0, u > 1;

[00196] em que a molécula de ácido nucleico de fórmula (IX) tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência de pelo menos 100 nucleotídeos, mais de preferência de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais de preferência de pelo menos 200 nucleotídeos e mais de preferência de pelo menos 250 nucleotídeos .(NuClXmCnNv)a (fórmula (X))

[00197] em que:

[00198] C é a citidina (citosina), uridina (uracila) ou um análogo de citidina (citosina) ou uridina (uracila), de preferência citidina (citosina), ou um análogo do mesmo;

[00199] X é guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo de nucleotídeos mencionado acima (nucleosídeos), de preferência de uridina (uracila) ou um análogo do mesmo;

[00200] N é cada um uma sequência de ácido nucleico possuindo independente um do outro um comprimento de cerca de 4 a 50, de preferência de cerca de 4 a 40, mais de preferência de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 ácidos nucleicos, cada um, independentemente, N sendo selecionado a partir de guanosina (guanina ), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos);

[00201] a é um número inteiro de 1 a 20, de preferência de 1 a 15, mais de preferência de 1 a 10;

[00202] I é um inteiro de 1 a 40,

[00203] em que

[00204] Quando L = 1, C é a citidina (citosina), ou um análogo do mesmo,

[00205] Quando L > 1, pelo menos 50 % destas (nucleotídeos) são nucleosídeos de citidina (citosina), ou um análogo do mesmo;

[00206] m é um número inteiro e é pelo menos 3;

[00207] em que

[00208] quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo do mesmo,

[00209] quando m > 3, pelo menos, 3 uridinas sucessivas (uracilas) ou análogos de uridina (uracila) ocorrem;

[00210] n é um número inteiro de 1 a 40,

[00211] em que

[00212] quando n = 1, C é a citidina (citosina), ou um análogo do mesmo,

[00213] quando n > 1, pelo menos 50 % destas (nucleotídeos) são nucleosídeos de citidina (citosina), ou um análogo do mesmo.

[00214] u, v pode ser independentemente um do outro um número inteiro de 0 a 50,

[00215] de preferência em que, quando u = 0, v > 1, ou

[00216] quando v = 0, u > 1;

[00217] em que a molécula de ácido nucleico de fórmula (X) de acordo com a presente invenção tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência de pelo menos 100 nucleotídeos, mais de preferência de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais de preferência de pelo menos 200 nucleotídeos e mais de preferência de pelo menos 250 nucleotídeos.

[00218] Qualquer uma das definições dadas acima nas fórmulas (VII) e (VIII), por exemplo, para N elementos (ou seja, Nu e NV) e X (Xm), particularmente a estrutura do núcleo, tal como definido acima, bem como para os números inteiros, l, m, n, u e v, aplicam-se de forma semelhante aos elementos de fórmula (IX) e (X) correspondente. A definição de elementos Nu e NV na fórmula (X) é idêntica à fronteira com as definições dadas acima para Nu e Nv na fórmula (IX).

[00219] RNA imunoestimulante: um RNA imunoestimulante (isRNA) no contexto da presente invenção pode, tipicamente, ser um RNA que é capaz de induzir uma resposta imune inata. Geralmente, não tem uma estrutura de leitura aberta e, portanto, não fornece um peptídeo de antígeno ou imunogênio, mas por exemplo, induz uma resposta imune inata a um tipo específico de receptor Do tipo Toll (TLR) ou outros receptores adequados. No entanto, é claro, também mRNAs com uma estrutura de leitura aberta e de codificação para um peptídeo/proteína pode induzir a uma resposta imune inata e, dessa maneira, podem ser RNAs imunoestimulantes. De um modo preferido, o RNA imunoestimulante pode ser um de filamento simples, um RNA de filamento duplo ou parcialmente de um filamento duplo, mais de preferência, um RNA de filamento simples, e/ou um RNA circular ou linear, mais de preferência um RNA linear. Mais de preferência, o RNA pode ser um imunoestimulante (linear) de RNA de filamento simples. Ainda mais de preferência, o RNA pode ser um imunoestimulante (longo) (linear) de RNA não codificante (de filamento simples). Neste contexto, é em particular preferido que o isRNA transporte um trifosfato, na sua extremidade 5’ que é o caso para o RNA transcrito in vitro. Um imunoestimulante RNA também pode ocorrer como um oligonucleotídeo de RNA curto, tal como definido na presente invenção. Um RNA imunoestimulante, tal como utilizado na presente invenção, além disso, pode ser selecionado a partir de qualquer classe de moléculas de RNA, encontrado na natureza ou pode ser preparado sinteticamente, e que pode induzir uma resposta imune inata e pode suportar uma resposta imune adaptativa, induzida por meio de um antígeno. Além disso, (classes de) moléculas de RNA imunoestimulantes utilizadas como em um outro composto da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, podem incluir qualquer outro RNA capaz de induzir uma resposta imune inata. Por exemplo, um tal RNA imunoestimulante pode incluir RNA ribossomal (ARNr), RNA de transferência (TRNA), RNA mensageiro (MRNA), e RNA viral (ARNv). Tal RNA imunoestimulante pode compreender um comprimento de 1000 a 5000, de 500 a 5000, de 5 a 5000, ou de 5 a 1000, de 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos.

[00220] siRNA: Um pequeno RNA interferente (siRNA), é de interesse particular em ligação com o fenômeno de interferência de RNA. A técnica in vitro de interferência de RNA (RNAi) baseia-se moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA), que provoca a supressão específica da sequência de expressão de gene (Zamore (2001) Nat Struct Biol 9: 746 a 750; Sharp (2001) Genes Dev. 5: 485 a 490: Hannon (2002) Nature 41: 244 a 251). Na transfecção de células de mamífero com cdRNA longo, a ativação da proteína cinase R e RNaseL traz efeitos não específicos, tais como, por exemplo, uma resposta de interferão (Stark et al (1998) Annu Rev. Biochem 67: 227 a 264; He e Katze (2002) Immunol Viral 15: 95 a 119). Estes efeitos não específicos são evitados quando mais curto, por exemplo 21- e 23-mero, chamado siRNA (pequeno RNA interferente), é utilizado, porque os efeitos não específicos não são acionados por siRNA que é mais curto do que 30 pb (Elbashir et al. ( 2001) Nature 411: 494 a 498).

[00221] No contexto da presente invenção, os siRNAs dirigidos contra PD-1, PD-PD-L1 ou L2 podem, dessa maneira, ser RNA de filamento duplo (cdRNA) que tem um comprimento de 17 a 29, de um modo preferido de 19 a 25, e de preferência é pelo menos 90 %, mais de preferência 95 % e especialmente de 100 % (dos nucleotídeos de um cdRNA) complementares para uma parte da sequência de MRNA de ocorrência natural que codifica para o TP-1, TP-L1 ou PD-L2 ou a uma codificação ou uma sessão, de preferência, uma sessão de codificação não codificante. Tal sessão da sequência de MRNA que ocorre de forma natural pode ser denominada na presente invenção uma "sequência alvo" e pode ser qualquer sessão do mRNA de ocorrência natural que codifica para a PD-1, PD-PD-L1 ou L2. 90 % complementar significa que, com um comprimento de um dsRNA descrito na presente invenção de, por exemplo, de 20 nucleotídeos, dsRNA contém não mais do que dois nucleotídeos que não apresentam complementaridade com a correspondente sessão da sequência alvo. A sequência do siRNA de filamento duplo utilizada de acordo com a presente invenção é, no entanto, de um modo preferido inteiramente complementar, na sua estrutura geral, com uma sessão da sequência alvo. Neste contexto, a molécula de ácido nucleico do complexo pode ser um dsRNA com a estrutura geral 5’- (N17-29) -3', de preferência com a estrutura geral 5’- (N19-25) -3', mais de preferência possuindo a estrutura geral 5’- (N19-24) -3', ou ainda mais de preferência possuindo a estrutura geral 5’- (N21 23) -3', em que para cada estrutura geral cada N é um nucleotídeo (de preferência diferente) de uma sessão da sequência alvo, sendo de preferência selecionado a partir de um número contínuo de 17 a 29 nucleotídeos de uma sessão da sequência alvo, e estando presente na estrutura geral 5’- (N17-29) -3' na sua ordem natural. Em princípio, todas as sessões com um comprimento de 17-29, de um modo preferido de 19 a 25, os pares de bases que ocorrem na sequência alvo pode servir para a preparação de um dsRNA, como definido na presente invenção. Igualmente, dsRNAs usados como siRNAs também podem ser dirigidos contra as sequências de mRNA que não se encontram na região de codificação, em particular, na região não codificante 5’ da sequência alvo, por exemplo, por conseguinte, para as regiões não codificantes da sequência alvo tendo uma função de regulação. A sequência alvo do dsRNA utilizado como siRNA pode, por conseguinte, encontrar-se na região não traduzida da tradução e da sequência alvo e/ou na região dos elementos da sequência de mRNA de controle. A sequência alvo para um dsRNA utilizado como siRNA dirigido contra PD-1, PD-PD-L1 ou L2 também pode estar na região de sobreposição de sequência não traduzida e traduzida; em particular, a sequência alvo pode compreender pelo menos um nucleotídeo a montante do tripleto do início da região de codificação da sequência de MRNA.

[00222] Estrutura de leitura aberta: uma estrutura de leitura aberta (ORF), no contexto da presente invenção pode ser tipicamente uma sequência de vários tripletos de nucleotídeos que pode ser traduzida em um peptídeo ou proteína. Uma estrutura de leitura aberta de preferência contém um códon de iniciação, ou seja, uma combinação de três nucleotídeos subsequentes que codificam geralmente para o aminoácido metionina (ATG ou AUG), na sua extremidade 5’ e uma região posterior, que geralmente apresenta um comprimento que é um múltiplo de 3 nucleotídeos. Uma ORF é de preferência denunciada por um códon de parada (por exemplo, TAA, TAG, TGA). Tipicamente, este é o único códon de parada da estrutura de leitura aberta. Deste modo, uma estrutura de leitura aberta no contexto da presente invenção é de preferência uma sequência de nucleotídeos, que consiste em um número de nucleotídeos que pode ser dividido por três, que começa com um códon de início (por exemplo, ATG ou AUG) e que termina de preferência com um códon de terminação (por exemplo, TAA, TGA, ou TAG ou UAA, UAG, UGA, respectivamente). A estrutura de leitura aberta pode ser isolada ou pode ser incorporada em uma sequência de ácido nucleico mais longa, por exemplo, em um vetor ou um mRNA. Uma estrutura de leitura aberta pode também ser denominado "região de codificação de proteína" ou "região de codificação".

[00223] Sequência IRES (local de entrada do ribossoma interno): Um IRES pode funcionar como um local de ligação ao ribossoma único, mas também pode servir para proporcionar um RNA bi- ou mesmo multicistrônico como definido na presente invenção o qual codifica para diversas proteínas ou peptídeos, que são para ser traduzido por meio dos ribossomas independentemente um do outro. Exemplos de sequências IRES que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção são aqueles de picornavírus (por exemplo, de FMDV), pestivírus (CFFv), poliovírus (PV), os vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus da doença de pé e boca (FMDV), vírus da hepatite C ( HCV), vírus da peste suína clássica (CSFV), vírus de camundongo leucoma (MLV), vírus de imunodeficiência de símios (SIV) ou vírus de paralisia cricket (CrPV).

[00224] Fragmento ou parte de um antígeno (proteína/peptídeo): Os fragmentos ou partes de um antígeno (proteína/peptídeo) no contexto da presente invenção são normalmente entendidos como sendo peptídeos correspondentes a uma parte da sequência contínua de aminoácidos de um antígeno (proteína/peptídeo), de preferência tendo um comprimento de cerca de 6 a cerca de 20 ou mesmo mais aminoácidos, por exemplo, partes como processadas e apresentadas por meio das moléculas de MHC de classe I, tendo de preferência um comprimento de cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos, por exemplo, 8, 9, ou 10, (ou mesmo 11 ou 12 aminoácidos), ou como fragmentos processados e apresentados por meio das moléculas MHC de classe II, de preferência tendo um comprimento de cerca de 13 ou mais aminoácidos, por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mesmo mais aminoácidos, em que esses fragmentos podem ser selecionados a partir de qualquer parte da sequência de aminoácidos. Estes fragmentos são tipicamente reconhecidos por meio das células T na forma de um complexo constituído por meio do fragmento de peptídeo e uma molécula de MHC, isto é, os fragmentos não são normalmente reconhecidos na sua forma nativa. Os fragmentos ou partes dos antígenos (proteína/peptídeo) tal como definido na presente invenção podem também compreender os epítopos ou locais funcionais desses antígenos (proteína/peptídeo). De preferência, os fragmentos ou partes de um antígeno (proteína/peptídeo) no contexto da presente invenção são ou compreendem epítopos, ou têm características antigênicas, desencadeando uma resposta imune adaptativa. Por conseguinte, os fragmentos de antígenos (proteína/peptídeo), podem compreender pelo menos um epitopo de antígenos (proteína/peptídeo). Além disso, também os domínios de um antígeno (proteína/peptídeo), como o domínio extracelular, o domínio intracelular ou o domínio transmembranar e as versões encurtadas ou truncadas de um antígeno (proteína/peptídeo) pode ser entendido como que compreende um fragmento de um antígeno (proteína/peptídeo).

[00225] As variantes de proteínas: "variantes" de proteínas ou peptídeos como definidos no contexto da presente invenção podem ser gerados, tendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência original de uma ou mais mutações(s), tais como um ou mais aminoácido(s) substituído(s) , inserido(s) e/ou apagado(s). De preferência, estas variantes têm a mesma função biológica ou atividade específica em comparação com o comprimento total da proteína nativa, por exemplo, sua propriedade antigênica específica. "Variantes" de proteínas ou peptídeos como definidos no contexto da presente invenção podem compreender a substituição de aminoácido(s) conservativo(s) em proporção a sua sequência fisiológica nativa, ou seja, não mutada. Aquelas sequências de aminoácidos, bem como as suas sequências de nucleotídeos de codificação, em particular a queda sob as variantes do termo, tal como definido na presente invenção. As substituições as quais os aminoácidos, que se originam a partir da mesma classe, são trocados um pelo outro são chamadas substituições conservativas. Em particular, estes são aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas, cadeias laterais carregadas de forma positiva ou de forma negativa, grupos aromáticos nas cadeias laterais de aminoácidos ou cadeias laterais, os quais podem entrar em pontes de hidrogênio, por exemplo, cadeias laterais que têm uma função hidroxila. Isto significa que, por exemplo, um aminoácido com uma cadeia lateral polar é substituído por outro aminoácido possuindo uma cadeia lateral polar da mesma forma, ou, por exemplo, um aminoácido caracterizado por uma cadeia lateral hidrofóbica é substituído por outro aminoácido possuindo uma cadeia lateral hidrofóbica do mesmo modo (por exemplo, serina (treonina) por treonina (serina) ou leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). As inserções e substituições são possíveis, em particular, nas posições de sequência que causam nenhuma modificação para a estrutura tridimensional ou não afetam a região de ligação. Modificações de uma estrutura tridimensional por inserção(ões) ou deleção(ões) podem ser facilmente determinadas, por exemplo, utilizando espectros de CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, em: Modern Physcial Methods in Biochemistry, Neuberger et al (ed), Elsevier, Amsterdam.).

[00226] Além disso, as variantes de proteínas ou peptídeos, como definido na presente invenção, que podem ser codificadas por meio de uma molécula de ácido nucleico, também podem compreender as sequências de nucleotídeos, em que as sequências de ácido nucleico são trocadas de acordo com a degeneração do código genético, sem conduzir a uma alteração da respectiva sequência de aminoácidos da proteína ou do peptídeo, isto é, a sequência de aminoácidos ou pelo menos uma parte, não pode diferir da sequência original de uma ou mais mutações dentro do significado de cima.

[00227] A fim de determinar a porcentagem de que duas sequências são idênticas, por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos ou de sequências de aminoácidos, como definido na presente invenção, de um modo preferido as sequências de aminoácidos codificadas por meio de uma sequência de ácido nucleico do veículo polimérico, tal como definido na presente invenção ou as próprias sequências de aminoácido, as sequências podem ser alinhadas, de modo a ser posteriormente comparadas com uma outra . Portanto, por exemplo, uma posição de uma primeira sequência pode ser comparada com a posição correspondente da segunda sequência. Se uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo componente (resíduo) como é o caso em uma posição na segunda sequência, as duas sequências são idênticas nessa posição. Se este não for o caso, as sequências diferem em esta posição. Se ocorrer inserções na segunda sequência, em comparação com a primeira sequência, as lacunas podem ser inseridas na primeira sequência para permitir uma continuação do alinhamento. Se ocorrer deleções na segunda sequência, em comparação com a primeira sequência, as lacunas podem ser inseridas na segunda sequência para permitir uma continuação do alinhamento. A porcentagem de que duas sequências são idênticas em seguida, é uma função do número de posições idênticas, dividida pelo número total de posições, incluindo as posições que só estão ocupadas em uma sequência. A porcentagem de que duas sequências são idênticas pode ser determinada utilizando um algoritmo matemático. Um preferido, mas não limitativo, exemplo de um algoritmo matemático que pode ser utilizado é o algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS EUA, 90: 5873-5877 ou Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25: 3389 a 3402. Um tal algoritmo está incorporado no programa BLAST. As sequências que são idênticas às sequências da presente invenção a um certo ponto, podem ser identificadas por este programa. Uma "variante" de uma proteína ou peptídeo pode ter, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, de identidade de aminoácidos de 98% ou 99% ao longo de um trecho de 10, 20, 30, 50, 75 ou 100 aminoácidos de tal proteína ou peptídeo, de preferência a sequência de comprimento de tamanho completo que variante é derivada. De forma análoga, uma "variante" de uma sequência de ácido nucleico pode ter, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de nucleotídeos ao longo de um trecho de 10, 20, 30, 50, 75 ou 100 nucleotídeos de tal sequência de ácido nucleico, de preferência q sequência de comprimento de tamanho completo da variante é derivada.

[00228] Derivado de uma proteína ou peptídeo: Um derivado de um peptídeo ou proteína é normalmente entendido como sendo uma molécula que é derivada a partir de outra molécula, tal como o referido peptídeo ou proteína. Um "derivado" de um peptídeo ou proteína de fusão que compreende engloba também um peptídeo ou proteína utilizada na presente invenção. Por exemplo, a fusão compreende um marcador, tal como, por exemplo, um epitopo, por exemplo, um epitopo FLAG ou um epitopo V5. Por exemplo, o epitopo é um epitopo de FLAG. Essa marcação é útil para, por exemplo, purificar a proteína de fusão.

[00229] A quantidade farmaceuticamente eficaz: uma quantidade farmaceuticamente eficaz no contexto da presente invenção é normalmente entendida como sendo uma quantidade que é suficiente para induzir um efeito farmacêutico, tal como uma resposta imune, altterando um nível patológico de um peptídeo ou proteína expresso, ou substituindo um produto do gene em falta, por exemplo, no caso de uma situação patológica.

[00230] Veículo: Um veículo é geralmente entendido como sendo um material que é adequado para o armazenamento, transporte, e/ou administração de um composto, tal como um composto farmaceuticamente ativo. Por exemplo, pode ser um líquido fisiologicamente aceitável, que é adequado para armazenar,transportar, e/ou administrar um composto farmaceuticamente ativo.

[00231] Via de PD-1: Os membros da via de PD-1 são todas as proteínas que estão associadas com A sinalização de PD-1. Por um lado, estes podem ser proteínas que induzem a sinalização de PD-1 a montante de PD-1, como por exemplo, os ligantes de PD-1 e PD-L1e PD-L2 PD-1 do receptor de transdução de sinal. Por outro lado, estes podem ser proteínas de transdução de sinal a jusante do receptor PD- 1. Particularmente preferidos como membros da via de PD-1 no contexto da presente invenção são PD-1, PD-PD-L1 e L2.

[00232] Inibidor da via de PD-1: No contexto da presente invenção, um inibidor da via de PD-1 é de preferência definido na presente invenção como um composto capaz de afetar a Via de sinalização de PD-1, de preferência sinalização mediada pelo receptor de PD-1. Por conseguinte, o inibidor da via de PD-1 pode ser qualquer inibidor dirigido contra qualquer membro da via de PD-1 capaz de antagonizar a Via de sinalização de PD-1. Neste contexto, o inibidor pode ser um anticorpo antagonista, tal como definido na presente invenção, tendo como alvo qualquer membro da Via de PD-1, de preferência dirigido contra o receptor de PD-1, PD-PD-L1 ou L2. Este anticorpo antagonista pode também ser codificado por meio de um ácido nucleico. Tais anticorpos codificados são também chamados "intracorpos", tal como definido na presente invenção. Além disso, o inibidor da via de PD-1 pode ser um fragmento do receptor de PD-1 ou pode bloquear a atividade de receptor de ligantes PD1-PD1. B7-1 ou fragmentos dos mesmos, assim como podem atuar como inibidores dos ligantes de PD1. Além disso, o inibidor da via de PD-1 pode ser siRNA (pequeno RNA interferente) ou RNA anti-sentido dirigido contra um membro da Via de PD-1, de preferência, PD-1, PD-PD-L1 ou L2. Além disso, um inibidor da via de PD-1 pode ser uma proteína que compreende (ou um ácido nucleico que codifica para) uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar a PD-1, mas impedindo a sinalização de PD-1, por exemplo, através da inibição da PD-1 e B7-H1 ou interação de B7-DL. Além disso, um inibidor da via de PD-1 pode ser um inibidor de molécula pequena capaz de inibir a Via de sinalização de PD-1, por exemplo, um peptídeo de ligação de PD-1 ou uma pequena molécula orgânica.

[00233] Anticorpo: Um anticorpo pode ser selecionado a partir de qualquer anticorpo, por exemplo, quaisquer anticorpos produzidos de forma recombinante ou que ocorrem de forma natural, conhecidos na técnica, em particular os anticorpos adequados para fins terapêuticos, de diagnósticos ou científicos, particularmente dirigidos contra PD-1, PD-PD-L1 ou L2. Na presente invenção, o termo "anticorpo" é utilizado no seu sentido mais lato e abrange específicamente os anticorpos monoclonais e policlonais (incluindo, antagonistas e de bloqueio ou neutralizantes) e anticorpos de espécies de anticorpos com especificidade poliepitópica. De acordo com a presente invenção, o termo "anticorpo" compreende, tipicamente, qualquer anticorpo conhecido na técnica (por exemplo, anticorpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tais como anticorpos que ocorrem de forma natural, os anticorpos gerados por meio da imunização de um organismo hospedeiro, os anticorpos que foram isolados e identificados a partir de anticorpos ou anticorpos gerados por meio da imunização de um organismo hospedeiro e produzidos de forma recombinante por meio dos métodos biomoleculares conhecidos na técnica, bem como anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos, intracorpos, ou seja, anticorpos expressos em células e, opcionalmente, localizados que ocorrem de forma natural em compartimentos celulares específicos, e fragmentos e variantes dos anticorpos acima mencionados. Em geral, um anticorpo consiste em uma cadeia leve e uma cadeia pesada possuindo tanto os domínios variáveis e constantes. A cadeia leve é constituída por um domínio do terminal N variável, VL, e um domínio constante de do terminal C, CL. Em contraste, a cadeia pesada do anticorpo IgG, por exemplo, é constituída por um domínio do terminal N variável, VH, e três domínios constantes, CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos de filamento simples podem ser utilizados de acordo com a presente invenção também.

[00234] Os anticorpos podem compreender de um modo preferido os anticorpos de comprimento completo, ou seja, os anticorpos completos os compostos de cadeias leves e pesadas completas, tal como descrito acima. No entanto, os derivados de anticorpos, tais como fragmentos de anticorpo, variantes ou adutos também podem ser usados como inibidor da via de PD-1 de acordo com a presente invenção. Os fragmentos de anticorpo podem ser selecionados a partir de fragmentos Fab, Fab’, F (ab') 2, Fc, FACB, pFc’, Fd e Fv dos anticorpos (comprimento total) acima mencionados. Em geral, os fragmentos de anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um fragmento Fab ("fragmento, de ligação ao antígeno") é composto por meio do fragmento de uma constante e um domínio variável de cada cadeia pesada e de cadeia leve. Os dois domínios variáveis ligam o epitopo de antígenos específicos. As duas cadeias são ligadas através de uma ligação dissulfureto. Um fragmento scFv ("fragmento variável de cadeia única"), por exemplo, consiste tipicamente nos domínios variáveis das cadeias leve e pesada. Os domínios estão ligados por meio de uma ligação artificial, em geral, um polipeptídeo de ligação tal como um peptídeo composto por 15-25 glicina, prolina e/ou resíduos de serina.

[00235] Anticorpo policlonal: o anticorpo policlonal tipicamente significa as misturas de anticorpos dirigidos a antígenos específicos ou imunogênios epitopos ou de uma proteína que foram gerados por meio da imunização de um organismo hospedeiro, tal como um mamífero, por exemplo, incluindo cabra, gado, suínos, cão, gato, burro, macaco, um roedor tal como um rato, hamster e coelho. Os anticorpos policlonais são geralmente não idênticos e, portanto, geralmente reconhecem diferentes epitopos ou regiões do mesmo antígeno. Dessa maneira, em um tal caso, tipicamente, uma mistura (composição) de anticorpos diferentes será utilizada, sendo cada anticorpo dirigido a antígenos específicos ou imunogênios epitopos ou de uma proteína, particularmente dirigida a PD-1, PD-PD-L1 ou L2 .

[00236] Anticorpo monoclonal: O termo "anticorpo monoclonal" refere-se na presente invenção geralmente a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único local antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um único determinante no antígeno. Por exemplo, os anticorpos monoclonais como definidos acima, podem ser produzidos por meio do método do hibridoma primeiro descrito por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos por meio dos métodos de DNA recombinante, por exemplo, tal como descrito na Patente US 4.816.567. "Anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348: 552 a 554 (1990), por exemplo. De acordo com Kohler e Milstein, um imunogênio (antígeno) de interesse é injetado em um hospedeiro tal como um camundongo e as células B-linfócitas produzidas em resposta ao imunogênio são colhidas após um período de tempo. As células B são combinadas com células de mieloma de camundongo obtidas e introduzidas em uma forma que permite que as células B venham a se fundir com as células de mieloma, produzindo hibridomas. Estas células fundidas (hibridomas), em seguida, são colocados em cavidades separados de placas de microtitulação e cultivadas para produzir os anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são testados para determinar quais deles são adequados para a detecção do antígeno de interesse. Depois de serem selecionados, os anticorpos monoclonais podem ser cultivados em culturas de células ou por meio da injeção dos hibridomas em camundongos. No contexto da presente invenção particularmente preferidos são os anticorpos monoclonais dirigidos contra o PD-1, PD-PD-L1 e L2.

[00237] Os anticorpos quiméricos: os anticorpos quiméricos, os quais podem ser utilizados como o inibidor da Via de PD-1 de acordo com a presente invenção são de preferência anticorpos em que os domínios constantes de um anticorpo descritos acima são substituídos por meio das sequências de anticorpos a partir de outros organismos, de preferência sequências humanas.

[00238] Os anticorpos humanizados: Os anticorpos humanizados (não humanos), os quais podem ser utilizados como Inibidor da via de PD de acordo com a presente invenção são os anticorpos em que os domínios constante e variável (exceto para os domínios hipervariáveis) de um anticorpo são substituídos por meio das sequências humanas.

[00239] Os anticorpos humanos: Os anticorpos humanos podem ser isolados a partir de tecidos humanos ou a partir de organismos hospedeiros não humanos que são imunizados para transgene do local do gene de IgG humana. Além disso, os anticorpos humanos podem ser proporcionados pela utilização de uma apresentação de fagos.

[00240] Os anticorpos biespecíficos: Os anticorpos biespecíficos em contexto da presente invenção são de preferência os anticorpos que atuam como um adaptador entre um efetor e um respectivo alvo por meio de dois domínios diferentes Fa/b, por exemplo, Fa para efeitos de moléculas efetoras de recrutamento, tal como toxinas, fármacos, citoquinas, etc., tendo como alvo as células efetoras, tais como CTL, células NK, macrófagos, granulócitos, etc. (vide, por avaliação: Kontermann RE, Acta Pharmacol Sin, 2005, 26 (1): 1 a 9). Os anticorpos biespecíficos são como descrito na presente invenção, de um modo geral, configurados para reconhecer por meio de dois domínios diferentes Fa/b, por exemplo, Fa dois antígenos diferentes, imunogênios, epitopos, fármacos, células (ou receptores nas células), ou outras moléculas (ou estruturas) como descrito acima. Biespecificidade com isto significa que as regiões de ligação ao antígeno dos anticorpos são específicas para dois epítopos diferentes. Dessa maneira, diferentes antígenos ou epítopos imunogênicos, etc., podem ser levados para perto em conjunto, o que, opcionalmente, permitem uma interação direta dos dois componentes. Por exemplo, as células diferentes, tais como células efetoras e células-alvo podem ser ligadas através de um anticorpo biespecífico. Englobado, mas não se limitando, pela presente invenção estão os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que se ligam, por um lado, um antígeno solúvel e, por outro lado, um antígeno ou receptor, por exemplo PD-1 ou os seus ligantes PD-L1 e PD-L2 na superfície de uma célula, por exemplo, uma célula tumoral.

[00241] Os intracorpos: Os intracorpos podem ser anticorpos, tal como definido acima. Estes anticorpos são anticorpos intracelulares expressos, e, por conseguinte, estes anticorpos podem ser codificados por meio dos ácidos nucleicos a serem utilizados para a expressão dos anticorpos codificados. Por conseguinte, os ácidos nucleicos que codificam para um anticorpo, de preferência, tal como definido acima, em particular um anticorpo dirigido contra um membro da Via de PD-1, por exemplo, PD-1, PD-PD-L1 ou L2 podem ser utilizados como Inibidor da via de PD de acordo com a presente invenção.

[00242] De acordo com um primeiro aspecto, o objetivo subjacente à presente invenção é resolvido por meio de uma combinação de vacina/inibidor que compreende:

[00243] (I) como vacina uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno, e

[00244] (Ii) como um inibidor de uma composição que compreende pelo menos um inibidor da via de PD-1.

[00245] No contexto da presente invenção, o termo "combinação de vacina/inibidor" significa, de preferência, uma ocorrência combinada de uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno e de uma composição de que compreende pelo menos um inibidor da via de PD-1. Dessa maneira, esta combinação de vacina/inibidor pode ocorrer tanto como uma composição, que compreende os seguintes componentes em uma e a mesma mistura (por exemplo, em uma composição farmacêutica), ou podem ocorrer como partes do kit, em que os diferentes componentes formam diferentes partes de tais partes do kit. Esta combinação da vacina/inibidor da presente invenção de preferência permite induzir uma resposta imune adaptativa (e opcional de uma resposta imune inata) em um paciente a ser tratado, de preferência um mamífero, através da utilização, como um primeiro componente de uma vacina de RNA, que compreende, pelo menos, um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno, de um modo preferido que codifica para um antígeno de tumor ou um antígeno patogênico. O inibidor da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, de preferência um inibidor da via de PD-1 pode antagonizar a via de sinalização PD-1 de um modo preferido inibindo ou suprimindo a transdução de sinal mediada pelo receptor de PD-1. Dessa maneira, a administração da vacina e do inibidor pode ocorrer simultaneamente ou em tempo útil escalonado, ou ao mesmo local de administração ou em locais diferentes de administração, como adicionalmente descrito abaixo. Uma tal combinação de vacina/inibidor pode induzir uma resposta imune ativa e, dessa maneira, por exemplo, impede induz o crescimento do tumor ou regressão do tumor. A combinação da vacina/inibidor da presente invenção é, portanto, adequado para estimular eficazmente respostas imunes específicas para o antígeno contra o câncer e células infectadas agentes patogênicos. Mais precisamente, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção é particularmente adequada no tratamento de doenças tumorais e doenças infecciosas que podem ser associados com uma sobre-expressão de PD-1, PD-L1 ou PD-L2 e para melhorar ainda mais a resposta imune contra tais tumores de células e as células infectadas.

[00246] A presente invenção é, por conseguinte, baseada na descoberta surpreendente de que a combinação de uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1 mostra uma inibição extremamente vantajosa do crescimento do tumor, resultando em aumento de sobrevivência, que não podia ser esperado a partir da técnica anterior. Dessa maneira, o tratamento combinado com uma vacina de RNA, por exemplo, que codifica para um antígeno específico (vacinação ativa), tal como um antígeno de tumor, e com um inibidor dirigido a um membro da Via de PD-1, particularmente do receptor de PD-1 ou os seus ligantes PD-L1e PD-L2, poderia diminuir fortemente o impacto prejudicial de uma doença a ser tratada, por exemplo, a taxa de crescimento de um tumor. Neste contexto, os presentes inventores verificaram surpreendentemente que o tratamento com uma vacina de RNA que compreende um RNA que codifica para um antígeno de tumor em combinação com um inibidor da via de PD-1 inibiu o crescimento do tumor de forma inesperada, resultando em uma melhoria da sobrevivência de camundongos desafiados tumorais de uma forma sinérgica como evidenciado pela ocorrência de 50% de respostas completas.

[00247] Como um primeiro componente, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção inclui, como uma vacina uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno, de preferência, um antígeno de tumor ou um antígeno patogênico.

[00248] De acordo com a presente invenção, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção compreende de preferência pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno, tal como definido na presente invenção.

[00249] Pelo menos um RNA da vacina de RNA pode ser selecionado a partir de qualquer RNA adequado para codificar uma sequência de aminoácidos, de preferência a partir de um RNA mensageiro (mRNA).

[00250] No entanto outras formas de RNA podem também encontrar a sua aplicação na realização do ensinamento da presente invenção. Por exemplo, o RNA pode ser derivado de um vírus de RNA tal como um retrovírus de RNA ou um replicon de RNA, tal como definido na presente invenção, por exemplo, derivado de um alfavírus.

[00251] Em modalidades específicas pelo menos um RNA da vacina de RNA não compreende ou não consiste em um vetor lentiviral ou um vetor adeno/associado a adenoviral.

[00252] Em uma modalidade específica, a vacina de RNA compreende ou consiste em RNA isolado, tal como definido na presente invenção.

[00253] Além disso, pelo menos um RNA da vacina de RNA de combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser um RNA de filamento simples ou de filamento duplo (que também pode ser considerado como um RNA (molécula) devido à associação não covalente de RNA de filamento duplo (moléculas)) ou um RNA de filamento parcialmente simples ou de filamento parcialmente duplo, que são pelo menos parcialmente auto-complementares (ambas estas moléculas de RNA de filamento parcialmente duplo ou parcialmente simples são tipicamente formados por meio de uma molécula de RNA de filamento simples mais curto ou mais longo ou por meio de duas moléculas de RNA de filamento duplo, que são aproximadamente iguais em comprimento, em que uma única molécula de RNA de filamento simples é em parte complementar da outra molécula de RNA de filamento simples e, dessa maneira, ambos formam uma molécula de RNA de filamento duplo nesta região, ou seja, um RNA de filamento parcialmente duplo ou parcialmente simples). De um modo preferido, pelo menos um RNA da vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção pode ser um RNA de filamento simples. Além disso, pelo menos um RNA da vacina de RNA de combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser um RNA circular ou linear, de preferência, um RNA linear. Mais de preferência, pelo menos um RNA da vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção pode ser um RNA de filamento simples (linear).

[00254] De um modo preferido, pelo menos um RNA da vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção compreende um comprimento de cerca de 5 a cerca de 20.000, ou cerca de 100 a 20000 nucleotídeos, de preferência de cerca de 250 a cerca de 20.000 nucleotídeos, mais de preferência de cerca de 500 a cerca de 10.000, ainda mais de preferência de cerca de 500 a cerca de 5000.

[00255] Em uma modalidade particularmente preferida do primeiro aspecto da presente invenção, pelo menos um RNA da vacina de RNA que compreende, pelo menos, um código de estrutura de leitura aberta para, pelo menos, um antígeno do tumor. Neste contexto, os antígenos de tumor são de preferência localizados na superfície da célula (de tumor). Os antígenos tumorais também podem ser selecionados a partir de proteínas, que são sobre-expressos em células tumorais, em comparação com uma célula normal (por exemplo, células não tumorais). Além disso, os antígenos tumorais incluem os antígenos expressos em células que são/eram não em si (ou originalmente não elas mesmas) degeneradas, mas estão associadas com o suposto tumor. Os antígenos que estão relacionados com os vasos de abastecimento de tumor ou (re)formação do mesmo, em particular, os antígenos que estão associados com a neovascularização, por exemplo, fatores de crescimento, tais como VEGF, bFGF, etc., também são incluídos na presente invenção. Os antígenos associados com um tumor incluem, além disso, os antígenos de células ou tecidos, tipicamente a incorporação do tumor. Além disso, algumas substâncias (geralmente proteínas ou peptídeos) são expressas em pacientes que sofrem (intencionalmente ou não intencionalmente) a partir de uma doença cancerosa e que ocorrem em concentrações aumentadas nos fluidos do corpo do referido paciente. Estas substâncias são também referidas como "antígenos tumorais", no entanto elas não são antígenos no sentido estrito de uma resposta imune indutora substância. A classe de antígenos tumorais pode ser dividida adicionalmente em antígenos específicos de tumores (CST) e associada a tumores (antígenos TAAs). CPSTs só podem ser apresentados por células de tumor e não por células normais "saudáveis". Eles resultam tipicamente de uma mutação específica do tumor. Os TAAs, que são mais comuns, são geralmente apresentados por tanto o tumor quanto as células saudáveis. Estes antígenos são reconhecidos e a célula apresentadora de antígeno pode ser destruída por meio das células T citotóxicas. Além disso, os antígenos tumorais podem também ocorrer na superfície do tumor sob a forma de, por exemplo, um receptor mutado. Neste caso, eles podem ser reconhecidos por meio dos anticorpos.

[00256] Além disso, os antígenos associados a tumores podem ser classificados como antígenos específicos de tecidos, também chamados antígenos específicos de melanócitos, antígenos de câncer dos testículos e antígenos específicos de tumores. Antígenos do câncer do testículo são tipicamente entendidos como peptídeos ou proteínas da linha germinal de genes associados que podem ser ativados em uma grande variedade de tumores. Os antígenos do câncer do testículo- humanos podem ser ainda subdivididos em antígenos que são codificados no cromossoma X, os chamados antígenos CT-X, e os antígenos que não estão codificados no cromossoma X, os chamados (antígenos não CT-X). Antígenos do câncer do testículo, os quais são codificados no cromossoma X compreendem, por exemplo, a família de genes de antígeno de melanoma, a chamada família MAGE. Os genes da família MAGE podem ser caracterizados por meio de um domínio de homologia partilhada MAGE (MHD). Cada um destes antígenos, isto é, antígenos específicos de melanócitos, antígenos de câncer dos testículos e antígenos específicos de tumores, podem provocar respostas imunes celulares e humorais autólogas. Deste modo, o antígeno de tumor codificado pelo RNA compreendido na vacina de RNA utilizado na presente invenção é de preferência um antígeno específico de melanócito, um antígeno do câncer do testículo, ou um antígeno específico de tumor, de preferência, pode ser um antígeno de CT-X, um antígeno não CT-X, um parceiro de ligação para um antígeno de CT-X ou um parceiro de ligação para um antígeno não CT-X ou um antígeno específico de tumor, mais de preferência, um antígeno de CT-X, um parceiro de ligação para um antígeno não CT-X ou um antígeno específico de tumor.

[00257] Antígenos tumorais particulares preferidos de acordo com a presente invenção são selecionados a partir da lista que consiste em 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrina, alfa-5- beta-6-integrina, alfa actinina-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemase, ARTE-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenina/m, Bing-4, BRCA1/m , BRCA2/m, CA 15-3/27-29 CA, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, camelo, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, proteína do tipo coactosina, colagem XXIII, COX- 2, CT- 9/BRD6, Cten, a ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE- 1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE- 8, GDEP, a GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, TENS-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A * 0201-R17I, HLA-A11/m, HLA- A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, E7 HPV-, HSP70-2M, HST-2, hTERT, gelo, IGF-1R , IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina imaturo, calicreína-2, calicreína-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR -FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, B4 MAGE- , MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE -E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART- 1/Melan-A, MART-2, MART-2/m, de proteína de matriz 22, MC1R, M- CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antígeno, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, classe miosina I/m, NA88 -A, N-acetilglucosaminiltransferase V, neo-PAP, neo- PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NFM/LFA, N-Ras/M, NSE, NY-ESO- B, NY-ESO-1 , OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 menor BCR-ABL, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI -2, PAP, PARTE-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinase, Pin-1, PML/PARalpha, POTE, PRAME, PRDX5/m, prostein, proteinase- 3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA , PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, SP17, SSX-1 , SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, SELO-1, STEAP-1, survivin, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG- 72, TARP , TEL-AML1, TGFbeta, TGFbetaRII, TGM-4, a TPI/m, TRAG- 3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-P8, tirosinase, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, e de WT1. Tais antígenos tumorais de um modo preferido podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em p53, CA125, EGFR, HER2/neu, hTERT, PAP, MAGE-A1, MAGE- A3, mesotelina, MUC-1, GP100, MART-1, tirosinase, PSA, PSCA, PSMA, a STEAP-1, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Ras, CEA ou WT1, e mais de preferência de PAP, MAGE-A3, WT1, e MUC-1. Tais antígenos tumorais de um modo preferido podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em MAGE-A1 (por exemplo MAGE-A1 de acordo com o número de acesso M77481), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6 (por exemplo MAGE-A6 de acordo com o número de acesso NM_005363), MAGE-C1, MAGE-C2, melan-A (por exemplo, melan-A de acordo com o número de acesso NM_005511), GP100 (por exemplo GP100 de acordo com o número de acesso M77348), tirosinase (por exemplo, tirosinase de acordo com o número de acesso NM_000372), sobrevivendo (por exemplo, de acordo com survivina para o número de acesso AF077350), CEA (por exemplo, CEA de acordo com o número de acesso NM_004363), Her-2/neu (por exemplo, Her-2/neu de acordo com o número de acesso M11730), WT1 (por exemplo, WT1 de acordo com o número de acesso NM_000378), PRAME (p.ex. PRAME de acordo com o número de acesso NM_006115), EGFRI (receptor do fator de crescimento epidérmico 1) (por exemplo EGFRI (receptor do fator de crescimento epidérmico 1) de acordo com o número de acesso AF288738), MUC1, mucina-1 (por exemplo, mucina-1 de acordo com o número de acesso NM_002456), SEC61G (por exemplo SEC61G de acordo com o número de acesso NM_014302), hTERT (p.ex. adesão hTERT número NM_198253), 5T4 (por exemplo 5T4 de acordo com o número de acesso NM_006670), TRP-2 (por exemplo, TRP-2 de acordo com o número de acesso NM_001922), STEAP1 (antígeno epitelial seis- transmembranar de próstata 1), PSCA, PSA, PSMA, etc..

[00258] Neste contexto, é particularmente preferido que pelo menos um RNA da vacina de RNA de combinação de vacina/inibidor da presente invenção codifica os antígenos de tumores selecionados a partir de APC, PSA, PSMA, STEAP opcional e MUC-1, ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos.

[00259] Em uma outra modalidade particularmente preferida, a vacina de RNA de combinação da vacina/inibidor da presente invenção compreende, pelo menos, um RNA que codifica para os antígenos de tumores selecionados a partir de NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, Survivina, 5T4 opcional e MUC- 1 opcional, ou os fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos.

[00260] Além disso, os antígenos tumorais podem também englobar os antígenos idiotípicos relacionados com um câncer ou doença de tumor, particularmente linfoma ou uma doença associada ao linfoma, em que o referido antígeno idiotípico é um idiotipo de imunoglobulina de uma célula linfóide de sangue ou um idiotipo receptor de células T de uma célula de sangue linfóide.

[00261] Em uma outra modalidade particularmente preferida do primeiro aspecto da presente invenção, pelo menos um RNA da vacina de RNA compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno patogênico. Os antígenos patogênicos são peptídicas ou proteicas antígenos derivados de um patogênio associado com doenças infecciosas que são de preferência selecionados a partir de antígenos derivados de agentes patogênicos Acinetobacter baumannii, gênero Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, gênero Aspergillus, Astroviridae , gênero Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, vírus BK, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, gênero Borrelia, Borrelia spp, gênero Brucella, Brugia malayi, família Bunyaviridae, Burkholderia cepacia e outras espécies de Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Caliciviridae família, gênero Campylobacter, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD príon, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani , Coccidioides spp, coronavírus, Corynebacterium diphteriae, Coxiella burnetii, vírus da febre hemorrágica Crimeia-Congo, Cryptococcus neoformans, gênero Cryptosporidium, citomegalovírus (CMV), vírus da dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4), fragilis dientamoeba, Ebolavirus (EBOV), gênero Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, gênero Ehrlichia, Entamoeba histolytica, gênero Enterococcus, gênero Enterovírus, enterovírus, principalmente Coxsackie Um vírus e Enterovírus 71 (EV71), Epidermophiton spp,Epstein-Barr ( EBV), Escherichia coli O157: H7, O111 e O104: H4, Fasciola hepatica e Fasciola gigantica, FFI prion, superfamília Filarioidea, flavivírus, Francisella tularensis, gênero Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS prion, vírus Guanarito, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, henipavirus (vírus Hendra vírus Nipah), Vírus da Hepatite A, Vírus da Hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite D, vírus da Hepatite E, vírus Herpes simplex 1 e 2 ( HSV-1 e HSV-2), Hide paradalasma capsulatum, HIV (vírus da imunodeficiência humana), Hortaea werneckii, bocavírus Humanos (bocavírus humano), vírus do herpes humano 6 (HHV-6) e herpes vírus humano 7 (HHV-7), metapneumovírus humano (hMPV ), papilomavírus humano (HPV), parainfluenza (HPIV), vírus da encefalite japonesa, vírus JC, vírus Junin, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Kuru príons, vírus de Lassa, Legionella pneumophila, gênero Leishmania, gênero Leptospira, Listeria monocytogenes, vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), vírus Machupo, Malassezia spp, vírus de Marburg, o vírus do sarampo, Metagonimus yokagawai, Microsporidia filo, vírus do molusco contagioso (MCV), vírus da caxumba, Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, família Orthomyxoviridae (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, parvovírus B19, gênero Pasteurella, gênero Plasmodium, Pneumocystis carinii, poliovírus, vírus da raiva, vírus sincicial respiratório (RSV), rinovírus, rinovírus, Rickettsia akari, gênero Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, vírus da febre do Vale do Rift, rotavírus, vírus da rubéola, vírus Sabiá, gênero Salmonella, Sarcoptes scabiei, SARS coronavírus, gênero Schistosoma, gênero Shigella, vírus Sin Nombre, Hantavirus, Sporothrix schenckii, gênero Staptilococcus, gênero Staptilococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, gênero Taenia, Taenia solium, vírus da encefalite transmitida por carrapatos (TBEV) , Toxocara canis ou Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophiton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, vírus varicela zoster (VZV), vírus varicela zoster (VZV), Varíola maior ou varíola minor, vCJD prion, vírus da encefalite equina venezuelana, Vibrio cholerae, vírus do Nilo Ocidental, encefalite equina ocidental, Wuchereria bancrofti, vírus da febre amarela, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, e Yersinia pseudotuberculosis.

[00262] Neste contexto, são particularmente preferidos os antígenos de agentes patogênicos selecionados a partir de vírus influenza, o vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da herpes simplex (HSV), vírus do papiloma humano (HPV), o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o Plasmodium, Staptilococcus aureus, Dengue vírus, Chlamydia trachomatis, Citomegalovírus (CMV), vírus da hepatite B (VHB), Mycobacterium tuberculosis, vírus da raiva, e vírus da febre amarela.

[00263] Pelo menos um RNA da vacina de RNA que compreende, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção podem ocorrer como um RNA mono-, di-, ou mesmo multicistrônico, ou seja, um RNA que contém a estrutura de leitura aberta de uma, duas ou mais proteínas ou peptídeos. Tais estruturas de leitura aberta em RNAs di-, ou mesmo multicistrônico podem ser separadas por, pelo menos, um local de entrada de ribossoma interno (IRES) de sequência, por exemplo, tal como descrito na presente invenção ou por meio dos peptídeos de sinal que induzam a clivagem do polipeptídeo resultante, que compreende várias proteínas ou peptídeos.

[00264] Pelo menos um RNA da vacina de RNA de combinação da vacina/inibidor da presente invenção pode ser estabilizado de modo a impedir a instabilidade e a degradação (rápida) do RNA por meio de várias abordagens. Esta instabilidade de RNA é normalmente devido a enzimas degradantes de RNA de "RNases" (ribonucleases), em que a contaminação com ribonucleases tais podem, por vezes, se degradam completamente em solução de RNA. Por conseguinte, a degradação natural de RNA no citoplasma das células é muito finamente regulada e contaminações de RNase podem ser geralmente removidas por meio do tratamento especial, antes da utilização das referidas composições, em particular com pirocarbonato de dietila (DEPC). Um número de mecanismos de degradação natural é conhecido neste contexto na técnica anterior, que podem também ser utilizados. Por exemplo, a estrutura do terminal é tipicamente de importância crítica em particular para um mRNA. Como um exemplo, na extremidade 5’ de mRNAs que ocorrem de forma natural normalmente há uma assim chamada estrutura de cobertura, que é um nucleotídeo guanosina modificado também chamada estrutura de tampão 5', e na extremidade 3' é tipicamente uma sequência de até 200 nucleotídeos de adenosina (a assim chamada cauda poli-A). Em uma outra modalidade, pelo menos um RNA da vacina de RNA da combinação da vacina/inibidor da presente invenção compreende, pelo menos, um dos seguintes elementos estruturais: a sequência 5’e/ou a 3'-UTR, de preferência, uma modificação 5' e/ou 3'-UTR, uma estrutura de tampão 5', uma sequência de poli (C), uma cauda poli-A e/ou um sinal de poliadenilação, de preferência, tal como definido na presente invenção.

[00265] Em uma outra modalidade, pelo menos um RNA da vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção compreende de preferência pelo menos dois dos seguintes elementos estruturais: a sequência 5’e/ou a 3'-UTR, de preferência, uma modificação 5' e/ou 3'-UTR (por exemplo, a sequência mutada de 3'- UTR do gene (alfa) globina (muag)); uma estrutura de haste-laçada de histona, de preferência uma histona de haste-laçada na sua região 3’ não traduzida; uma estrutura do tampão 5’ ; uma sequência poli (C); uma cauda poli-A; ou um sinal de poliadenilação, por exemplo dada uma estrutura do tampão 5' e uma haste-laçada de histona e, potencialmente, uma cauda poli-A.

[00266] Neste contexto, é particularmente preferido que pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno contido na combinação de vacina/inibidor da presente invenção tem a seguinte estrutura na direção 5’3':

[00267] a) uma sequência de 5'-UTR opcional que compreende uma modificação UTR

[00268] b) uma estrutura de leitura aberta que codifica um antígeno, tal como definido acima;

[00269] c) uma sequência de 3'-UTR que compreende uma modificação UTR

[00270] d) pelo menos uma haste-laçada de histona, opcionalmente, sem um elemento a jusante da histona 3’ para a haste-laçada de histona

[00271] e) uma sequência poli (A) ou um sinal de poliadenilação opcional; e

[00272] f) uma sequência poli (C).

[00273] Em uma outra modalidade preferida particular, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção tem a seguinte estrutura na direção 5’3':

[00274] a) uma sequência de 5'-UTR opcional que compreende uma modificação UTR

[00275] b) uma estrutura de leitura aberta que codifica um antígeno, tal como definido acima;

[00276] c) uma sequência de 3'-UTR que compreende uma modificação UTR

[00277] d) uma sequência poli (A)

[00278] e) uma Sequência poli (C); e

[00279] f) pelo menos uma haste-laçada de histona.

[00280] Para melhorar ainda mais a resistência a por exemplo degradação in vivo (por exemplo, uma exo- ou endo-nuclease), pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser fornecida como um ácido nucleico estabilizado, por exemplo, sob a forma de um ácido nucleico modificado, tal como definido na presente invenção. De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é portanto preferido que pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção é estabilizado, de um modo preferido, por meio da modificação da estrutura principal das modificações de açúcar e/ou modificações de bases , mais de preferência estabilizados por meio da modificação do teor G/C tal como definido na presente invenção. Todas estas modificações podem ser introduzidas em pelo menos um RNA sem prejudicar a função do RNA a ser traduzida para o antígeno, para ser transcrito de modo reverso ou de ser replicado.

[00281] De acordo com outra modalidade, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser modificado e, dessa maneira, estabilizada por meio da modificação do teor de G (guanosina)/C (citosina) do MRNA, de preferência da estrutura de leitura aberta da mesma.

[00282] Aí, o teor de G/C do pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno na combinação da vacina/inibidor da presente invenção é particularmente aumentada em comparação com o teor de G/C da estrutura de leitura aberta da estrutura de leitura aberta do tipo selvagem específica, ou seja, o RNA não modificado, tal como definido na presente invenção. No entanto, a sequência de aminoácidos codificada da estrutura de leitura aberta de pelo menos um RNA de codificação da vacina de RNA pelo menos um antígeno na combinação da vacina/inibidor da presente invenção de RNA é de preferência não modificado, quando comparado com a sequência de aminoácidos codificada da estrutura de leitura aberta do tipo selvagem.

[00283] De acordo com uma outra modalidade preferida da presente invenção, pelo menos um RNA a vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção é optimizada para tradução (códon optimizados), tal como definido na presente invenção, de um modo preferido optimizado para tradução por meio da substituição de códons para tRNAs menos frequente de um determinado aminoácido por códons de maior frequência de ocorrência de tRNA do respectivo aminoácido.

[00284] Neste contexto, é particularmente preferido ligar o teor de G/C sequencial que é aumentado, em particular maximizado, em que pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, com os " códons frequentes " sem modificar a sequência de aminoácidos da proteína codificada por meio da estrutura de leitura aberta composta em pelo menos um RNA da vacina de RNA.

[00285] No contexto da presente invenção, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, pode ser preparado utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo os métodos sintéticos, tais como por exemplo, a síntese em fase sólida, bem como a propagação in vivo, como por exemplo, produção de partículas semelhantes a vírus ou partículas de replicon nas células ou em métodos in vitro, tais como as reações de transcrição in vitro. Replicons de RNA, tais como auto-amplificação com base em um genoma de alfavírus podem ser produzidos por meio da construção de plasmídeos de DNA que codificam o RNA de auto-amplificação utilizando as técnicas de biologia molecular padrão. O DNA linearizado é transcrito in vitro por, por exemplo, RNA-polimerase de T7 e o RNA resultante introduzido em células, por exemplo, por meio da eletroporação. A produção de partículas replicon pode ser avaliada em ensaios de embalagem em que o replicon transcrito in vitro e o RNA auxiliar defeituoso são co-transfectados em células (Perri et al, 2003. J. Virol 77 (19): 10394 a 403; 12.970.424).

[00286] Em uma outra modalidade da vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção compreende uma pluralidade ou mais do que um, de preferência 2 a 10, mais de preferência 2 a 5, mais de preferência de 2 a 4 de moléculas de RNA, tal como definido na presente invenção. Estas vacinas de RNA compreendem mais do que uma moléculas de RNA, de um modo preferido que codifica diferentes proteínas ou peptídeos que compreendem de preferência diferentes antígenos tumorais ou antígenos patogênicos.

[00287] Neste contexto, é particularmente preferido que a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção que compreende uma pluralidade (o que significa, tipicamente mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais de 10 ácidos nucleicos, por exemplo, 2 a 10, de preferência 2 a 5 ácidos nucleicos) de moléculas de RNA, em particular para utilização no tratamento do câncer da próstata (CaP) compreende pelo menos:

[00288] a) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral PSA, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e

[00289] b) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o PSMA antígeno de tumor, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e

[00290] c) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral de PSCA ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos;

[00291] d) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral de STEAP-1, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e opcional

[00292] e) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno de tumor MUC-1, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos.

[00293] Em uma outra modalidade preferida, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção que compreende uma pluralidade (o que significa, tipicamente mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais de 10 ácidos nucleicos, por exemplo, 2 a 10, de preferência 2 a 5 ácidos nucleicos) de moléculas de RNA, em particular para utilização no tratamento de câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC) compreende pelo menos:

[00294] a) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral NY-ESO-1, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e

[00295] d) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno do tumor MAGE-C1, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e

[00296] e) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno do tumor MAGE-C2, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos;

[00297] f) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral Survivina, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e opcional

[00298] g) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno tumoral 5T4, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos; e opcional

[00299] h) uma molécula de RNA que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína, em que o referido peptídeo ou proteína codificada compreende o antígeno de tumor MUC-1, ou um fragmento, variante ou derivado dos mesmos.

[00300] De acordo com uma modalidade da presente invenção, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser administrado nu sem estar associado com qualquer veículo adicional, transfecção ou complexação de agente para aumentar a transfecção da eficiência e/ou as propriedades imunoestimulantes de pelo menos um RNA.

[00301] Em uma modalidade preferida, pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode ser formulado em conjunto com um composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico tal como definido na presente invenção. Por conseguinte, em uma modalidade específica da presente invenção, é preferido que pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção seja associado com ou complexado com um composto catiônico ou policatiônico ou um veículo polimérico como definido na presente invenção, opcionalmente, em uma proporção em peso selecionada de uma proporção de cerca de 6: 1 (p/p) a cerca de 0,25: 1 (p/p), mais de preferência entre cerca de 5: 1 (p/p) a cerca de 0,5: 1 (p/p), ainda mais de preferência de cerca de 4: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (p/p) ou de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (p/p) , e mais de preferência em uma proporção de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 2: 1 (p/p) de RNA de composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico; ou opcionalmente em uma proporção N/P de pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1, 1,5 ou 2. De preferência, uma proporção N/P situa-se no intervalo de cerca de 0,1, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 ou 2 a 20, de preferência em uma proporção de cerca de 0,2 (0,5 ou 0,75 ou 1,0) a 12, mais de preferência em uma uma proporção N/P de cerca de 0,4 (0,75 ou 1,0) a 10, e ainda mais de preferência em uma proporção N/P de cerca de 0,4 (0,75 ou 1,0) a 5. Mais de preferência, uma proporção N/P encontra-se em uma proporção entre 0,1 e 0,9.

[00302] Neste contexto, é preferível que o composto catiônico ou policatiônico ou o veículo polimérico usado como veículo ou agente de complexação e pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção tal como definido na presente invenção são fornecidos em uma proporção N/P de, pelo menos, cerca de 1 ou, de preferência, de uma proporção de cerca de 1 a 20, para aplicações in vitro (por exemplo, no caso das células extraídas do paciente seria tratada in vitro com a composição farmacêutica da presente invenção e subsequentemente administrado para o paciente).

[00303] Para aplicações in vivo, uma proporção N/P de pelo menos 0,1 (0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6), de preferência de uma proporção de cerca de 0,1 (0,2, 0,3, 0,4., 0,5, ou 0,6) a 1,5 é preferida . Ainda mais preferida é uma proporção N/P de 0,1 ou 0,2 a 0,9 ou uma proporção N/ P de 0,5 a 0,9.

[00304] A proporção N/P influencia significativamente a carga de superfície do complexo resultante que consiste em compostos catiônicos ou policatiônicos ou de um veículo polimérico e uma carga de ácido nucleico, por exemplpelo menos um RNA que codifica para pelo menos um antígeno constituído na vacina de RNA ou de um ácido nucleico adjuvante. Dessa maneira, é preferível que o complexo de carga veículo polimérico resultante seja carregado de forma positiva para aplicações in vitro e de forma negativa ou com carga neutra para aplicações in vivo. A carga de superfície do complexo de carga do veículo polimérico resultante pode ser indicada como Zetapotential que pode ser medida por meio do método de eletroforese de Doppler utilizando um Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido).

[00305] Pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica pelo menos um antígeno na combinação de vacina/inibidor da presente invenção pode também ser associado com um veículo, transfecção ou agente de complexação para aumentar a eficiência de transfecção e/ou as propriedades imunoestimulantes de pelo menos um RNA.

[00306] Neste contexto, é particularmente preferido que pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno em combinação a vacina/inibidor da presente invenção seja pelo menos parcialmente complexado com um composto catiônico ou policatiônico e/ou um veículo polimérico, de preferência proteínas ou peptídeos catiônicos. Parcialmente significa que apenas uma parte do pelo menos um RNA é complexado com um composto catiônico e que o resto do pelo menos um RNA da vacina de RNA é composto na combinação da vacina/inibidor da presente invenção na forma não complexada ("livre" ou " nu "). De preferência, a proporção de RNA complexado com: RNA não complexado na vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção é selecionado a partir de uma proporção de cerca de 5: 1 (p/p) a cerca de 1:10 (p/p), mais de preferência a partir de uma proporção de cerca de 4: 1 (p/p) a cerca de 1: 8 (p/p), ainda mais de preferência a partir de uma proporção de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 1: 5 (p/p) ou 1: 3 (p/p), e mais de preferência a proporçãode RNA complexado com RNA livre na vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção é selecionado a partir de uma proporção de cerca de 1: 1 (p/p).

[00307] Pelo menos um RNA complexado na vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, é de preferência preparado de acordo com uma primeira etapa por meio da complexação de pelo menos um RNA com um composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico, de um modo preferido, tal como definido na presente invenção, em uma proporção específica de modo a formar um complexo estável. Neste contexto, é altamente preferível, que o veículo ou o composto polimérico não catiônico ou policatiônico livre ou apenas insignificantemente uma pequena quantidade da mesma permanece no componente de RNA complexado após a complexação do RNA. Por conseguinte, a proporçãoentre o RNA e o composto catiônico ou policatiônico e/ou do veículo polimérico no componente do RNA complexado é tipicamente selecionada de uma proporção que o RNA é totalmente complexado e nenhum composto ou veículo polimérico policatiônico ou catiônico livre, ou apenas uma quantidade insignificantemente pequena do mesmo permaneça na composição.

[00308] De preferência, a proporçãoentre, pelo menos, um RNA (por exemplo, MRNA), que compreende, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno para o composto catiônico ou policatiônico e/ou do veículo polimérico, de um modo preferido, como definido na presente invenção, é selecionado a partir de uma proporção de cerca de 6: 1 (p/p) a cerca de 0,25: 1 (p/p), mais de preferência entre cerca de 5: 1 (p/p) a cerca de 0,5: 1 (p/p), ainda mais de preferência de cerca de 4: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (p/p) ou de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (p/p), e mais de preferência em uma proporção de cerca 3: 1 (p/p) a cerca de 2: 1 (p/p). Em alternativa, a proporçãodo RNA para o composto catiônico ou policatiônico e/ou do veículo polimérico, de um modo preferido, como definido na presente invenção, no componente do RNA complexado, também pode ser calculada com base na proporção nitrogênio/fosfato (Proporção N/P) de todo o complexo. No contexto da presente invenção, uma Proporção N/P é de preferência na proporção de cerca de 0,1-10, de preferência em uma proporção de cerca de 0,3-4 e mais de preferência em uma proporção de cerca de 0,5-2 ou 0,7-2 sobre a proporção de composto e/ou veículo polimérico catiônico ou policatiônico: RNA, de um modo preferido, como definido na presente invenção, no complexo, e mais de preferência em uma proporção de cerca de 0.7-1,5, 0,5-1 ou 0,7-1, e ainda mais de preferência em uma proporção de cerca de 0,3-0,9 ou 0,5-0,9 de preferência, desde que o composto catiônico ou policatiônico no complexo é uma proteína catiônica ou catiônico ou policatiônico policatiônico ou peptídeo e/ou o veículo polimérico tal como definido acima. Nesta modalidade específica, o RNA complexado também é abrangido no termo "componente adjuvante".

[00309] Em uma outra modalidade, pelo menos um RNA fornecendo o antígeno na vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, tal como definido acima pode ser formulado em conjunto com um adjuvante. Um tal adjuvante pode ser de preferência um outro ácido nucleico que não é mais que codifica um antígeno, mas é capaz de estimular uma resposta imune não específico, isto é, a resposta imune inata, ao interagir com qualquer parte do sistema imune inato. Um tal ácido nucleico estimulação de uma resposta imune não específica é denominado na presente invenção como "ácido nucleico adjuvante".

[00310] Neste contexto, um ácido nucleico adjuvante de preferência compreende ou consiste em um oligo- ou um polinucleotídeo; mais de preferência um ácido nucleico adjuvante que compreende ou consiste em um RNA ou um DNA; ainda mais de preferência um ácido nucleico tal adjuvante que compreende ou que consiste em um RNA ou em um DNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico tal como definido na presente invenção; opcionalmente em uma proporção em peso selecionada de uma proporção de cerca de 6: 1 (p/p) a cerca de 0,25: 1 (p/p), mais de preferência entre cerca de 5: 1 (p/p) a cerca de 0,5: 1 (p/p), ainda mais de preferência de cerca de 4: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (w: w) ou de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 1: 1 (p/p), e mais de preferência em uma proporção de cerca de 3: 1 (p/p) a cerca de 2: 1 (p/p) de ácido nucleico adjuvante para composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico; ou, opcionalmente, em uma proporção nitrogênio/fosfatos do composto catiônico ou policatiônico e/ou veículo polimérico para adjuvante ácido nucleico na proporção de cerca de 0,1 a 10, de preferência em uma proporção de cerca de 0,3 a 4, mais de preferência em uma proporção de cerca de 0,7 a 1 ou 0,5 a 1, e ainda mais de preferência em uma proporção de cerca de 0,3 a 0,9 ou 0,5 a 0,9. Um tal ácido nucleico complexado adjuvante está também englobado no termo "componente adjuvante":

[00311] No caso específico de que a indução de IFN-α se destina, uma proporção N/P de pelo menos 0,1 (0,2, 0,3, 0,4, 0,5, ou 0,6) ou uma proporção N/P em N de 0,1 a 1 ou mais é preferida uma proporção de N/P de 0,1 ou 0,2 a 0,9 é preferida ou uma proporção N/P de N de 0,5 a 0,9. Caso contrário, se a indução de TNF seria destinada, uma proporção N/P de 1 a 20 é particularmente preferida.

[00312] Em outras palavras, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um RNA codificador de pelo menos um antígeno, e um outro ácido nucleico que está a actuar como um adjuvante, que é chamado o ácido nucleico adjuvante. Claro que a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção não está limitada a compreender apenas um adjuvante de ácido nucleico, mas pode compreender vários destes ácidos nucleicos diferentes. Ambos os tipos de ácidos nucleicos, o RNA que codifica o antígeno e o adjuvante ácido nucleico, podem ser, independentemente um do outro, complexado com um veículo, tal como definido na presente invenção. Por conseguinte, um composto catiônico ou policatiônico e/ou um veículo polimérico utilizado para complexar pelo menos um RNA da vacina de RNA que codifica, pelo menos, um antígeno ou o ácido nucleico adjuvante, pode ser selecionado a partir de qualquer composto policatiônico ou catiônico e/ou veículo polimérico como definido na presente invenção.

[00313] No caso, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção (ou da combinação da vacina/inibidor da presente invenção) compreende um RNA fornecendo o antígeno e, adicionalmente, um ácido nucleico adjuvante, a resposta imunológica que é evocada por meio da administração de uma tal vacina compreende a ativação de ambos partes do sistema imunológico, o sistema imune adaptativo, bem como o sistema imune inato.

[00314] Um fator importante para uma resposta imune adaptativa adequada é a estimulação de diferentes sub-populações de células T. Os T linfócitos são tipicamente divididos em duas sub-populações, as células T1 auxiliares, nas seguintes células Th1, e as células T2 auxiliares, nas seguintes células Th2, com o qual o sistema imune é capaz de destruir agentes patogênicos intracelulares e extracelulares (por exemplo, antígenos). Deste modo, células Th1 são responsáveis pela destruição de agentes patogênicos intracelulares, auxiliando a resposta imune celular através da ativação de macrófagos e células T citotóxicas. As células Th2, por outro lado, são principalmente para eliminação extracelular de patógeno e promovem a resposta imune humoral por meio da estimulação de células B para a conversão em células do plasma e pela formação de anticorpos (por exemplo, contra antígenos). As duas populações de células T auxiliares diferem no padrão das proteínas efetoras (citocinas) produzidas por eles.

[00315] A proporção célula Th1 célula/Th2 é de grande importância na indução e manutenção de uma resposta imune adaptativa. Em ligação com a presente invenção, a proporção de células Th1/ células Th2 da resposta imune (adaptativa) é de preferência deslocada na direção da resposta celular (Th1) e uma resposta imune celular é induzida deste modo. A estimulação desta resposta do sistema imune adaptativo é provocada principalmente por meio da tradução do RNA proporcionando o antígeno e a presença resultante dos antígenos peptidicos ou protéicos dentro do organismo.

[00316] O sistema imune inato que pode apoiar uma tal resposta imune adaptativa e que podem induzir ou apoiar uma mudança no sentido de uma resposta Th1 pode ser ativado por meio de ligantes de receptores do tipo Toll (TLRs). TLRs são uma família altamente conservada do receptor de reconhecimento de polipeptídeos padrões (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados aos agentes patogênicos (PAMPs) e desempenham um papel crítico na imunidade inata em mamíferos. Pelo menos treze membros da família, designado TLR1- TLR13 (receptores do tipo Toll: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ou TLR13), foram identificados. Além disso, foram identificadas uma série de ligantes TLR específicos. Foi por exemplo descoberto que o DNA bacteriano não metilado e seus análogos sintéticos de DNA (CPG) são ligantes para TLR9 (Hemmi H et al (2000) Nature 408: 740-5; Bauer S et al (2001) Proc Natl Acad Sci EUA 98 , 9237-42). Além disso, tem sido relatado que os ligantes para certos TLRs incluem certas moléculas de ácido nucleico e que certos tipos de RNA são imunoestimulantes de uma maneira independente da sequência ou dependente da sequência, em que estes vários RNAs imunoestimulantes podem, por exemplo, estimular o TLR3, TLR7, TLR8 ou, ou receptores intracelulares, tais como RIG-I, MDA-5, etc..

[00317] No contexto da presente invenção, a ativação do sistema imune inato pode ser fornecida por meio de um ácido nucleico adjuvante, de preferência um RNA imunoestimulante (isRNA) tal como definido na presente invenção, contido na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, de preferência compreendido na vacina de RNA.

[00318] De acordo com o exposto, em uma modalidade adicional preferida da presente invenção, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção é formulada para compreender

[00319] a) o referido pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno; de preferência na forma de um grupo de RNA mono-, bi- ou multicistrônico, opcionalmente estabilizado, sendo opcionalmente, optimizado para a tradução e/ou, opcionalmente, complexado com um composto catiônico ou policatiônico ou um veículo polimérico;

[00320] b) opcionalmente, um componente adjuvante, que compreende ou que consiste em pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno e/ou pelo menos um ácido nucleico adjuvante, complexado com um composto catiônico ou policatiônico e/ou com um veículo polimérico, e

[00321] c) opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável, como definido na presente invenção.

[00322] Neste contexto, é particularmente preferido que o componente adjuvante opcionalmente composto compreenda o mesmo RNA como compreendido na vacina de RNA da combinação da vacina/inibidor da presente invenção como RNA fornecendo o antígeno por exemplo, mRNA que codifica para pelo menos um antígeno.

[00323] Além disso, a vacina de RNA da combinação da vacina/inibidor da presente invenção pode compreender outros componentes para facilitar a administração e a absorção dos componentes da vacina de RNA. Tais componentes adicionais podem ser um veículo ou veículo adequado, por exemplo, ou adjuvantes adicionais para apoiar qualquer resposta imune, tal como definido na presente invenção.

[00324] De acordo com uma outra modalidade, os componentes da vacina, por exemplo RNA pelo menos um RNA que codifica para pelo menos um antígeno e um componente adjuvante, a combinação de vacina/inibidor da presente invenção, podem ser formulados em conjunto ou separadamente, na mesma ou em diferentes composições.

[00325] Como um segundo componente, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção inclui, como inibidor de uma composição que compreende um inibidor da via de PD-1 tendo como alvo qualquer membro da Via de sinalização de PD-1, de preferência alvo de PD-1, PD-L1 ou PD-L2.

[00326] A morte programada-1 (PD-1, PDCD1) é uma proteína transmembranar do tipo I pertencente à família alargada de CD28 de células T reguladoras. PD-1 não tem o resíduo de cisteína proximal à membrana requerida para a homodimerização de outros membros da família CD28. As análises estruturais e bioquímicas demonstraram que a PD-1 é monomérica em solução, bem como na superfície celular (Okazaki e Honjo, 2007. Int Immunol 19 (7): 813 a 24). PD-1 é expressa em células T ativadas, células B e monócitos. A expressão mais ampla de PD-1 contrasta com a expressão restrita dos outros membros da família de CD28 às células T, sugerindo que a PD-1 regula um espectro mais largo de respostas imunes em comparação com outros membros da família CD28.

[00327] PD-1 regula de forma negativa a sinalização do receptor de antígeno através do recrutamento da proteína tirosina fosfatase SHP-2 sobre a interação com qualquer um dos dois ligantes, PD-L1 ou PD-L2.

[00328] PD-L1 (B7-H1, CD274) e PD-L2 (B7-DC, CD273) são glicoproteínas transmembranares de tipo I compostas por domínios extracelulares do tipo IGC e IgV. PD-L1 e PD-L2 dividem identidade de aminoácidos de 40 %, enquantoos ortólogos humano e do camundongo de PD-L1 e PD-L2 dividem as identidades de aminoácidos de 70 %. Ambos PD-L1 e PD-L2 têm caudas citoplasmáticas curtas sem motivo conhecido para a transdução do sinal, sugerindo que estes ligantes não transduzem qualquer sinal por interação com PD-1.

[00329] A interação de PD-L1 e PD-1 fornece um sinal co- estimulador negativo crucial para células T e as funções como indutor de morte celular. A interação entre a baixa concentração de PD-1 e PD- L1 conduz à transmissão de um sinal inibidor que inibe a proliferação de células CD8 + específicas para o antígeno. As concentrações mais elevadas esta interação não inibe a proliferação de células T, mas reduz a produção de citocinas múltiplas. Dessa maneira, a ligação a PD-L1 pode antagonizar o sinal B7 - CD28 quando a estimulação antigênica é fraca e desempenha um papel chave na regulação negativa de respostas de células T.

[00330] O papel dos ligantes PD-1 e PD-1 na inibição da ativação e proliferação de células T sugeriu que estas proteínas podem servir como alvos terapêuticos para o tratamento de inflamação, câncer ou doenças infecciosas. Dependendo do resultado terapêutico desejado, é necessária uma modulação para baixo ou para cima da Via de PD-1. A modulação para cima do sistema imune é particularmente necessário no tratamento de cânceres e infecções crônicas. Isto pode ser conseguido, por exemplo por bloqueio de PD-1 ou da inibição da Via de PD-1. A inibição das vias de PD-1 pode ser conseguida, por exemplo, por meio de um anticorpo dirigido para PD-1 ou um PD-1 do ligante. Neste contexto, o inibidor da via de PD-1 pode remover disfunção de células T, resultante da sinalização de PD-1 e, dessa maneira, restaurar ou melhorar a função das células T (por exemplo, proliferação, produção de citoquinas, alvo de morte celular). Além disso, as células T anérgicas que não respondem ao antígeno de estimulação podem ser reativadas.

[00331] No contexto da presente invenção, o inibidor da via de PD-1 pode ser em modalidades específicas de um anticorpo, em particular um anticorpo antagonista ou um anticorpo codificado por meio do ácido nucleico (intracorpo), um siRNA, um RNA anti-sentido, que compreende uma proteína (ou um ácido nucleico que codifica para) uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar a PD-1, mas a prevenção da sinalização de PD-1 (por exemplo uma proteína de fusão de um fragmento de PD-L1 ou PD-L2 e a parte Fc de uma imunoglobulina), uma proteína solúvel (ou um ácido nucleico que codifica para uma proteína solúvel) competindo com PD-1 para a ligação dos seus ligantes PD-L1 e PD -L2 ligados à membrana; ou um inibidor de molécula pequena capaz de inibir a Via de sinalização de PD-1.

[00332] Portanto, em uma modalidade preferida da presente invenção, o inibidor da via do PD-1 é um anticorpo (ou um ácido nucleico que codifica para um anticorpo) dirigido contra o PD-1, de um modo preferido um anticorpo que se liga específicamente ao domínio extracelular de PD-1 e inibindo assim a A sinalização de PD-1. De um modo preferido, um tal anticorpo antagonista liga-se perto do local de ligação PD-L1 em PD-1, inibindo assim a ligação de PD-L1 para PD-1.

[00333] Particularmente preferidos são os anticorpos anti-PD1 Nivolumab (MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538), (Brahmer et al, 2010. J Clin Oncol 28 (19): 3167-75; PMID: 20.516.446); Pidilizumab (CT-011), (Berger et al, 2008, Clin Cancer Res 14 (10): 3044-51; PMID:18.483.370); e MK-3475 (SCH 900.475).

[00334] Em uma outra modalidade preferida, o inibidor da via de PD- 1 é um anticorpo (ou um ácido nucleico que codifica para um anticorpo) dirigido contra um ligante de PD-1, de um modo preferido um anticorpo que se liga específicamente ao domínio extracelular do ligante PD-1 ou PD- 2. De preferência, tal anticorpo se liga proximal e perturbador ao local de ligação PD-1 ou PD-2 com o ligante.

[00335] Particularmente preferidos são os anticorpos anti-PD-L1 MDX-1105/BMS-936559 (Brahmer et al 2012. N Engl J Med 366 (26): 2455-65; PMID: 22658128); MPDL3280A/RG7446, ou MEDI4736.

[00336] Em uma outra modalidade preferida, o inibidor da via de PD- 1 é uma proteína que compreende (ou um ácido nucleico que codifica para) uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar a PD-1, mas impedindo a sinalização via de PD-1, particularmente preferido, neste contexto, é um proteína de fusão de um fragmento do ligante de PD-L1 ou PD-L2.

[00337] Neste contexto, uma modalidade particularmente preferida é uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de PD- L1 ou PD-L2 ou um fragmento do mesmo capaz de se ligar a PD-1 e uma porção Fe de uma imunoglobulina. Um exemplo de uma tal proteína de fusão é representada por AMP-224 (domínio extracelular de murino PD-L2/B7-DC fundido com a parte não modificada da proteína Fc de IgG2a de murino; Mkrtichian et al, 2012. J Immunol 189 (5): 2338 a 47; PMID: 22837483).

[00338] No contexto da presente invenção, a administração da vacina e do inibidor pode ocorrer simultaneamente ou em tempo útil escalonado, ou ao mesmo local de administração ou em locais diferentes de administração, como adicionalmente descrito abaixo.

[00339] Para assegurar que os mecanismos separados induzidos pela vacina de RNA e o inibidor da via de PD-1 não sejam influenciados de forma negativa por outro, o inibidor da via do PD-1 e a vacina de RNA são de preferência administrados separados no tempo (de um modo escalonado de tempo), ou seja, sequencialmente, e/ou são administrados em diferentes locais de administração. Isto significa que a vacina de RNA pode ser administrada por exemplo, antes, concomitante ou subsequente ao inibidor da via de PD-1, ou vice-versa. De uma maneira alternativa ou adicionalmente, a vacina de RNA e o inibidor da via de PD-1 podem ser administradas em diferentes locais de administração, ou ao mesmo local de administração, de um modo preferido, quando administrada em uma forma escalonada de tempo. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a vacina de RNA é para ser administrada em primeiro lugar e o inibidor da via do PD-1 é para ser administrado após a vacina de RNA. Este procedimento garante que as células imunes tais como células apresentadoras de antígenos e as células T já tenham encontrado o antígeno antes do sistema imune ter sido estimulado por meio da inibição do percurso de PD-1, mesmo que uma administração simultânea ou administração , em que o Inibidor da via de PD-1 é para ser administrado antes de a vacina de RNA, pode conduzir aos mesmos ou pelo menos resultados comparáveis.

[00340] Por conseguinte, em uma outra modalidade, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção compreende, além disso, um veículo e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[00341] Um tal veículo farmaceuticamente aceitável inclui, tipicamente, a base líquida ou não líquida de uma composição que compreende os componentes da combinação da vacina/inibidor da presente invenção. Se a composição é fornecida na forma líquida, o veículo será de preferência água isenta de pirogênios; soluções aquosas (solução salina tamponada isotônica) ou, por exemplo, fosfato, citrato, etc. soluções tamponadas. O tampão de injeção pode ser hipertônico, hipotônico ou isotônico com referência ao meio de referência específico, ou seja, o tampão pode ter um teor de sal mais elevado, idêntico ou inferior, com referência ao meio de referência, em que de um modo preferido tais concentrações dos sais acima mencionados podem ser utilizadas, que não dão origem a danos de células devido à osmose ou outros efeitos de concentração. Meios de referência são, por exemplo líquidos que ocorrem em métodos "in vivo", tais como sangue, linfa, líquido citosólicas, ou outros líquidos corporais, ou por exemplo, líquidos, que podem ser utilizados como meios de referência em "in vitro" de métodos, tais como tampões ou líquidos comuns. Tais tampões ou líquidos comuns são conhecidos por meio de uma pessoa que é versada na técnica. Solução de Lactato de Ringer é particularmente preferida como uma base líquida.

[00342] No entanto, um ou mais agentes de enchimentos compatíveis ou diluentes sólidos ou líquidos ou compostos de encapsulamento, que são adequados para administração a um paciente a ser tratado, podem ser utilizados, assim como para a combinação de vacinas/inibidor de acordo com a presente invenção. O termo "compatível", como usado na presente invenção significa que estes constituintes da combinação de vacinas/inibidor são capazes de serem misturados com a vacina de RNA e/ou o inibidor na via de PD-1 de uma tal forma que não ocorre a interação que reduziria substancialmente a farmacêutica eficácia da combinação de vacinas/inibidor em condições típicas de utilização.

[00343] Além disso, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção pode compreender um ou mais adjuvantes adicionais que são adequados para iniciar ou aumentar uma resposta imune do sistema imune inato, ou seja, uma resposta imune não específico, em particular através da ligação a padrões moleculares associados a agentes patogênicos (MMAPs). Com outras palavras, quando administrada, de preferência, a vacina de RNA provoca uma resposta imune inata devido ao adjuvante, opcionalmente contido nela. No entanto, o adjuvante pode também ser parte de um outro componente da combinação da vacina/inibidor da presente invenção do que a vacina de RNA. De preferência, um tal adjuvante pode ser selecionado a partir de um adjuvante conhecido por meio de uma pessoa que é versada na técnica e adequado para o presente processo, ou seja, a apoiar a indução de uma resposta imune inata em um mamífero, por exemplo, um adjuvante de ácido nucleico ou um componente adjuvante, tal como definido acima ou um adjuvante, tal como definido a seguir.

[00344] Portanto, um tal adjuvante pode também ser selecionado a partir de qualquer adjuvante conhecido por meio de uma pessoa que é versada na técnica e adequado para o presente processo, ou seja, a apoiar a indução de uma resposta imune inata em um mamífero e/ou adequada para depósito e distribuição dos componentes da combinação de vacina/inibidor da presente invenção. Preferidos como adjuvantes adequados para depósito e distribuição são os compostos catiônicos ou policatiônicos, tal como definido acima. Da mesma forma, o adjuvante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em, por exemplo, compostos catiônicos ou policatiônicos tal como definido acima, a partir de quitosano, TDM, MDP, dipeptídeo de muramila, Plurônicos, solução de alúmen, hidróxido de alumínio, ADJUMERTM (polifosfazeno); gel de fosfato de alumínio; glucanos lineares a partir de algas; algammulina; gel de hidróxido de alumínio (alúmen); gel de hidróxido de alumínio de alta adsorção de proteínas; gel de hidróxido de alumínio de baixa viscosidade; AF ou SPT (emulsão de esqualano (5 %), Tween 80 (0,2 %), Pluronic L121 (1,25 %), solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4); AVRIDINETM (propanodiamina); BAY R1005TM ((N- (hidroacetato de 2-desóxi-2-L-leucilaminob-D- glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoil-amida); CALCITRIOLTM (1-alfa, 25-di-hidróxi-vitamina D3); gel de fosfato de cálcio; CAPTM (nanopartículas de fosfato de cálcio); holotoxina da cólera, toxina da cólera-A1-proteína-fragmento de AD proteína de fusão, sub-unidade B da toxina da cólera; CRL 1005 (copolímero de bloco P1205); lipossomas contendo citoquinas; DDA (brometo de dimetildioctadecilamônio); DHEA (desidroepiandrosterona), DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complexo DOC/alúmen (sal de sódio do ácido deoxicólico); adjuvante completo de Freund; adjuvante incompleto de Freund; proporção de inulina; adjuvante de Gerbu (mistura de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil- glutamina D35 (GMDP), ii) cloreto de dimetildioctadecilamônio (DDA), iii) complexo de sal de zinco de L-prolina (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetilglucosaminila-(B1-4)-N-acetilmuramil-L47alanil-D- isoglutamina); imiquimod (1-(2-methipropil)-1H-imidazo [4,5-c] quinolina-4-amina); ImmTherTM (dipalmitato de N-acetilglucosaminil-N- acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol); DRVs imunolipossomas (preparados a partir de vesículas de desidratação-re-hidratação); interferongamma; interleucina-1 beta; interleucina-2; interleucina-7; interleucina-12; ISCOMSTM; ISCOPREP 7.0.3. TM; lipossomas; LOXORIBINETM (7-alil-8-oxoguanosina); adjuvante por via oral LT 5 (E. coli lábil enterotoxina-protoxina); microesferas e micropartículas de qualquer composição; MF59TM; (Emulsão de água esqualeno); Montanide ISA 51TM (adjuvante incompleto de Freund purificado); Montanide ISA 720TM (adjuvante de óleo metabolizável); MPLTM (3-Q- desacil-4'-monofosforil-lipídio A); Lipossomas MTP-PE e MTP-PE ((N- acetil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-3- (hidroxifosforilóxi))-ettilamide, sal monossódico); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM e DMURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn- gliceroldipalmitoil); NAGO (neuraminidase- galactose-oxidase); nanoesferas ou nanopartículas de qualquer composição; NISVs (vesículas de agentes tensioativos não iônicos); PLEURANTM (□- glucano); PLGA, PGA e PLA (homo- e co-polímeros de ácido láctico e ácido glicólico; microesferas/nanoesferas); PLURONIC L121TM; PMMA (polimetilmetacrilato); PODDSTM (microesferas proteinóides); derivados de carbamato de polietileno; poli-RA: poli-ru (complexo de ácido poliuridílico - ácido poliadenílico); polissorbato 80 (Tween 80); proteína de cocleatos (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULONTM (QS-21); Quil-A (Quil-A saponina); S-28463 (4-amino- otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo [4,5- c] quinolina-1-etanol); SAF- 1TM ("formulação de adjuvante Syntex"); Proteolipossomas Sendai e Sendai contendo matrizes lipídicas; Span-85 (trioleato de sorbitano); Specol (emulsão de Marcol 52, Span 85 e Tween 85); esqualeno ou Robane® (2,6,10,15,19,23-hexamettiltetracosan e 2,6,10,15,19,23- hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano); esteariltirosina (cloridrato de octadeciltirosina); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil- L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxipropilamida); Theronyl-MDP (TermurtideTM ou [thr 1] -MDP; N-acetilmuramil-Ltreonyl-D- isoglutamina); Partículas Ty (Ty-VLPs ou partículas semelhantes a vírus); lipossomas Walter Reed (lipossomas contendo lipídio A adsorvido em hidróxido de alumínio), e lipopeptídeos Pam3Cys, incluindo, em particular, sais de alumínio, tais como Adju-fos, Alhidrogel, Rehidragel; emulsões, incluindo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; copolímeros, incluindo Optivax (CRL1005), L121, Poloaxmer4010), etc .; lipossomas, incluindo discrição, cocleados, incluindo BIORAL; derivados de plantas, adjuvantes, incluindo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adjuvantes adequados para a co-estimulação, incluindo tomatina, biopolímeros, incluindo PLG, PMM, inulina, adjuvantes derivados de micróbio, incluindo romurtida, DESINTOXICAÇÃO, MPL, CWS, manose, sequências de ácido nucleico CpG, CpG7909, ligantes de TLR 1-10 humanos , ligantes de TLR 1-13 murino, ISS-1018, 35 IC31,imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIV, VLP, a toxina da cólera, a toxina termo-lábil, Pam3Cys, Flagelina, âncora GPI, LNFPIII/Lewis X, peptídeos antimicrobianos, UC-1V150, proteína de fusão RSV, cdiGMP; e adjuvantes adequados como antagonistas incluindo neuropeptídeo CGRP.

[00345] Um adjuvante é de preferência selecionado a partir de adjuvantes, que suportam a indução de uma resposta imune Th1 ou a maturação de células T ingênua, tais como GM-CSF, IL-12, IFNg, qualquer ácido nucleico adjuvante, tal como definido acima, de preferência um RNA imunoestimulante, CpG DNA , etc..

[00346] Em uma outra modalidade preferida, é também possível que a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção contenha, além do fornecimento do RNA para o antígeno e o inibidor da via de PD-1 outros componentes que são selecionados a partir do grupo que compreende: mais antígenos ou mais ácidos nucleicos fornecendo o antígeno ; um outro agente imunoterapêutico; uma ou mais substâncias auxiliares; ou qualquer outro composto, o qual é conhecido por ser imunoestimulantes devido à sua afinidade de ligação (como ligantes) a receptores semelhantes a Toll humanos; e/ou um ácido nucleico adjuvante, de preferência um RNA imunoestimulante (isRNA).

[00347] Consequentemente, em uma outra modalidade preferida, a combinação da vacina/inibidor da presente invenção compreende além disso pelo menos um adjuvante, uma substância auxiliar selecionado a partir de lipopolissacarídeos, TNF-alfa, ligante CD40, ou citocinas, monocinas, linfocinas, interleucinas ou quimioquinas, IL-1, IL -2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 , IL-16, IL- 17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL - 28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM- CSF, G-CSF, M-CSF, a LT-beta , o TNF-alfa, fatores de crescimento, e a hGH, um ligante de receptor de tipo Toll humana TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, um ligante de receptor de tipo Toll TLR1 murino, TLR2 , TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 TLR13 ou, um ligante de um receptor do tipo NOD, um ligante de um receptor do tipo RIG-I , um ácido nucleico adjuvante, um RNA imunoestimulante (isRNA), um CpG-DNA, um agente antibacteriano ou um agente anti-viral.

[00348] A combinação da vacina/inibidor, tal como definido de acordo com a presente invenção pode compreender, além disso, outros aditivos ou compostos adicionais. Outros aditivos que podem ser incluídos na combinação de vacina/inibidor da presente invenção, como na vacina de RNA e/ou a composição que compreende um inibidor da via de PD- 1, são emulsionantes, tais como, por exemplo, Tween®; agentes molhantes, tais como, por exemplo, sulfato de lauril e sódio; agentes corantes; agentes que conferem sabor, veículos farmacêuticos; agentes de formação de comprimidos; estabilizadores; antioxidantes; conservantes, inibidores de RNase e/ou um agente anti-bacteriano ou um agente anti-viral.

[00349] A combinação da vacina/inibidor da presente invenção compreende, tipicamente, uma "quantidade segura e eficaz" dos componentes da combinação da vacina/inibidor da presente invenção tal como definido na presente invenção. Tal como utilizado na presente invenção, uma "quantidade segura e eficaz" significa uma quantidade de um modo preferido um dos componentes, de um modo preferido de, pelo menos, um RNA que codifica, pelo menos, um antígeno e o inibidor da via de PD-1, que é suficiente para induzir significativamente uma modificação positiva ou prevenção de uma doença ou distúrbio, como na presente invenção definida. Ao mesmo tempo, no entanto, uma "quantidade segura e eficaz" é suficientemente pequena para evitar efeitos secundários graves, e para permitir uma proporção razoável entre benefício e risco. A determinação dos limites normalmente encontra-se dentro do escopo do julgamento médico razoável.

[00350] A combinação da vacina/inibidor da presente invenção pode ser administrada oralmente, parentericamente, por pulverização de inalação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por via de um reservatório implantado. O termo parentérico, tal como utilizado na presente invenção inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-nodal, intra- sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional, intracraniana, transdérmica, intradérmica, intrapulmonal,intraperitoneal, intracardíaca, intra-arterial, injeção e sublingual ou técnicas de infusão. De preferência, a vacina de RNA é administrada por meio da aplicação intradérmica ou intramuscular e o inibidor da via do PD-1 é de preferência administrado por meio da injeção intramuscular ou intraperitoneal, mais de preferência por infusão intravenosa, no caso de ser na forma de um anticorpo.

[00351] De acordo com um outro aspecto, o objetivo subjacente à presente invenção é resolvido por meio de uma composição farmacêutica que compreende uma vacina e um inibidor, em particular, como vacina uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno e como um inibidor de uma composição que compreende um inibidor da via de PD-1, ambos de preferência como definida acima. Da mesma forma, a composição farmacêutica é, de preferência formulada e administrada como anteriormente definido para os componentes da combinação da vacina/inibidor da presente invenção. Uma tal composição farmacêutica pode compreender adicionalmente qualquer outro componente como definido acima para a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção.

[00352] Por conseguinte, a combinação da vacina e o RNA inibidor da via de PD-1, tal como definido de acordo com a presente invenção pode ocorrer tanto como uma composição, por exemplo, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, ou pode ocorrer em mais do que uma composição, por exemplo, como partes do kit, em que os diferentes componentes formam diferentes partes das partes do kit tais. Estes componentes diferentes, tais como a vacina e o inibidor, podem ser formulados como cada composição farmacêutica ou como uma composição tal como definida acima. De preferência, cada uma das diferentes partes do kit compreende um componente diferente, por exemplo, uma parte compreende a vacina de RNA, tal como definido na presente invenção, uma parte adicional compreende o inibidor da via de PD-1 tal como definido na presente invenção, etc..

[00353] Portanto, de acordo com um outro aspecto, a presente invenção também proporciona kits, particularmente kits de partes. Tais kits, particularmente kits de partes, tipicamente compreendem como componentes isolados ou em combinação com outros componentes, como definido na presente invenção uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno e, de preferência, em uma parte diferente do kit, um inibidor da via de PD- 1, tal como definido na presente invenção. A combinação da vacina/inibidor da presente invenção tal como definida na presente invenção, opcionalmente em combinação com outros componentes, como definido na presente invenção, tal como um adjuvante adicional, pode ocorrer em uma ou diferentes partes do kit. Como um exemplo, por exemplo pelo menos, uma parte do kit pode compreender a vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA codificador de pelo menos um antígeno, tal como definido na presente invenção, pelo menos, uma parte adicional do kit pode compreender o inibidor da via de PD-1 tal como definido na presente invenção, e opcionalmente pelo menos uma parte adicional do kit pode compreender um adjuvante adicional como descrito na presente invenção. O kit ou partes do kit podem, além disso, conter instruções técnicas com informações sobre a administração e a dosagem da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção ou de qualquer dos seus componentes ou partes.

[00354] A combinação da vacina/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção ou as partes do kit da presente invenção que compreendem uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1 podem ser utilizados para consumo humano e também para fins de medicina veterinária, de preferência para fins médicos humanos.

[00355] Portanto, de acordo com um outro aspecto, a presente invenção é dirigida para a primeira utilização médica da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção e as partes do kit da presente invenção que compreendem uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1 tal como definido na presente invenção . Por conseguinte, a combinação da vacina/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção e as partes do kit da presente invenção que compreendem uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1 como definido na presente invenção, podem ser utilizados como um medicamento.

[00356] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção está dirigida para a segunda utilização médica da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção e as partes do kit da presente invenção que compreendem uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1, tal como definido na presente invenção. Dessa maneira, a combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, a composição farmacêutica da presente invenção e as partes do kit da presente invenção que compreendem uma vacina de RNA e um inibidor da via de PD-1 como definido na presente invenção, podem ser utilizados para o tratamento e/ou melhoria de várias doenças, particularmente de câncer e doenças tumorais e doenças infecciosas, tal como definido na presente invenção.

[00357] Doenças cancerosas ou tumorais neste contexto incluem de preferência por exemplo, melanomas, melanomas malignos, carcinomas do cólon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas renais, tumores gastrointestinais, gliomas, tumores de próstata, câncer de bexiga, tumores do reto, câncer de estômago, câncer do esôfago, câncer pancreático, câncer de fígado, carcinomas mamários (= câncer da mama) , câncer uterino, câncer do colo do útero, da leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (CLL), hepatomas, vários tumores induzidos por vírus, tais como, por exemplo, vírus do papiloma carcinomas induzidas (por exemplo, carcinoma do colo do útero = câncer cervical), adenocarcinomas, tumores induzidos por vírus do herpes (por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma de células B induzida pelo EBV), tumores induzidos por heptatite B (carcinomas hepatocell), linfomas induzidos por HTLV-1 e HTLV- 2, neuroma acústico, carcinomas do pulmão (câncer do pulmão = carcinoma bronquial), os carcinomas do pulmão de células pequenas, câncer da faringe, o carcinoma anal, o glioblastoma, o carcinoma retal, astrocitoma, tumores cerebrais, o retinoblastoma, basalioma, metástases cerebrais, meduloblastomas, câncer vaginal, câncer pancreático, câncer testicular, síndrome de Hodgkin, meningiomas, doença Schneeberger, tumor de hipófise, MF, carcinóides, neurinoma, spinalioma, linfoma de Burkitt, câncer de laringe, câncer renal, timoma, o carcinoma corporal, câncer ósseo, linfomas de não Hodgkin, o câncer da uretra, a síndrome CUP, tumores da cabeça/pescoço, oligodendroglioma, câncer vulvar, câncer intestinal, carcinoma do cólon, carcinoma esofágico (= câncer do esôfago), envolvimento de verrugas, tumores do intestino delgado, craniopharyngeomas, carcinoma de ovário, tumores genitais, câncer de ovário (= carcinoma do ovário), carcinoma do pâncreas (= câncer de pâncreas), carcinoma endometrial, as metástases hepáticas, câncer de pênis, câncer de língua, o câncer de vesícula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor da tampa, o câncer de próstata (= tumores da próstata), etc..

[00358] Em modalidades específicas o tratamento de câncer do pulmão (por exemplo, câncer do pulmão de células não pequenas ou o câncer do pulmão de pequenas células), ou câncer da próstata é particularmente preferido.

[00359] As doenças infecciosas, neste contexto, de preferência inclui as doenças infecciosas virais, bacterianas ou proto-zoologia. Tais doenças infecciosas, de preferência doenças infecciosas (virais, bacterianas ou proto-), são tipicamente selecionadas a partir da lista que consiste em infecções de Acinetobacter, a doença do sono Africano (tripanossomíase Africana), a AIDS (síndrome de imunodeficiência adquirida), amebíase, Anaplasmose, antraz, apendicite, Arcanobacterium infecções haemolyticum, febre hemorrágica argentina, ascaridíase, aspergilose, infecções Astrovirus, pé de atleta, Babesiose, infecções Bacillus cereus, meningite bacteriana, pneumonia bacteriana, vaginose bacteriana (BV), infecções Bacteroides, balantidíase, infecções Baylisascaris, bilharziosis, infecções por vírus BK, Preto piedra, Blastocystis hominis infecções, blastomicose, febre hemorrágica boliviana, Borrelia infectionss (Borreliose), botulismo (e botulismo infantil), Bovine tênia, febre hemorrágica brasileira, Brucelose, infecções de Burkholderia, úlcera de Buruli, infecções Calicivirus (Norovirus e sapovírus), campilobacteriose, Candidíase (Candidose), infecções tênia canina, doença da arranhadura do gato, Doença de Chagas (tripanossomíase americana), câncer mole, varicela, infecção por clamídia, infecções por Chlamydia trachomatis, infecções por Chlamydophila pneumoniae, cólera, cromoblastomicose, bubão Climático, Clonorchiasis, infecções por Clostridium difficile, coccidioidomicose, resfriado, febre da carraça Colorado (CTF), resfriado (rinofaringite viral aguda comum; Coriza aguda), condiloma acuminado, conjuntivite, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), febre hemorrágica da Crimeia-Congo (CCHF), criptococose, criptosporidiose, Larva migrans cutânea (CLM), Leishmaniose Cutânea, Ciclosporíase, cisticercose, infecções por citomegalovírus, dengue, dermatofitose, Dientamoebíase, Difteria, difilobotríase, Donavanosis, Dracunculiasis, meningoencefalite do início do verão (FSME), febre hemorrágica Ebola, Equinococose, Ehrlichiosis, Enterobíase (infecções Pinworm), infecções Enterococcus, infecções por enterovírus, tifo Epidemia, epiglotite, Epstein-Barr Mononucleose Infecciosa , eritema infeccioso (Quinta doença), Exanthem subitum, Fasciolopsiasis, Fasciolosis, insônia familiar fatal (FFI), Quinta doença, filariose, o envenenamento dos peixes (Ciguatera), tênia do peixe, gripe, intoxicação alimentar por Clostridium perfringens, Fox tênia, infecções amebianas de vida livre, infecções Fusobacterium, gangrena gasosa, Geotricose, síndrome de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS), Giardíase, mormo, gnatostomíase, gonorréia, granuloma inguinal (Donovanosis), Grupo A infecções estreptocócicas, infecções por estreptococos do grupo B, infecções por Haemophilus influenzae, febre aftosa (HFMD), Síndrome Pulmonar por Hantavírus (HPS), infecções Helicobacter pylori, síndrome hemolítico- urêmica (SHU), febre hemorrágica com síndrome renal (HFRS), infecções henipavirus, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D , hepatite E, Herpes simplex, Herpes simplex tipo I, Herpes simplex tipo II, Herpes zoster, hide paradalasmose, verrugas ocas, as infecções por parasitas, infecções Bocavírus Humano, erliquiose ewingii Humana, anaplasmose granulocítica humana (HGA), infecções metapneumovírus humano, erliquiose monocítica humana , infecções por vírus do papiloma humano (HPV), infecções por vírus parainfluenza humana, himenolepíase, gripe, isosporíase, encefalite japonesa, doença de Kawasaki, queratite, infecções Kingella kingae, Kuru, Lambliasis (giardíase), febre de Lassa, legionelose (doença do legionário, febre de Pontiac) , leishmaniose, hanseníase, leptospirose, Lice, listeriose, borreliose de Lyme, doença de Lyme, filaríase linfática (elefantíase), coriomeningite linfocitária, malária, febre hemorrágica de Marburg (MHF), vírus de Marburg, Sarampo, Melioidose (doença de Whitmore), meningite, doença meningocócica , Metagonimiasis, Microsporidiose, tênia diminuto, aborto (inflamação da próstata), molusco contagioso (MC), Mononucleose, Caxumba, tifo murino (tifo endêmico), Micetoma, Mycoplasma hominis, pneumonia Mycoplasma, Myiasis, dermatite da fralda/fralda, conjuntivite neonatal (oftalmia neonatal), sepse neonatal (Corioamnionite), Nocardiosis, Noma, infecções por vírus Norwalk, oncocercose (cegueira dos rios), osteomielite, otite média, paracoccidioidomicose (blastomicose sul-americana), paragonimíase, paratifo, Pasteurelose, Pediculose capitis (piolhos), corporis Pediculose (piolho do corpo), pubis pediculose (piolhos pubianos, caranguejo piolhos), doença inflamatória pélvica (DIP), coqueluche (tosse convulsa), a febre de Pfeiffer glandular, Peste, infecções pneumocócicas, pneumonia Pneumocystis (PCP), Pneumonia, Poliomielite (claudicação infância) , Poliomielite, tênia Porcina, infecções Prevotella, meningoencefalite amebiana primária (PAM), leucoencefalopatia multifocal progressiva, Pseudo-garupa, psitacose, febre Q, febre do coelho, raiva, febre de mordida de rato, síndrome de Reiter, respiratórias infecções pelo vírus sincicial (RSV), Rinosporidiose, infecções por rinovírus, Rickettsioses, rickettsia, febre do vale do Rift (FVR), Febre maculosa (RMSF), infecções por rotavírus, rubéola, Salmonella paratifo, Salmonella tifo, salmonelose, SARS (Síndrome Respiratória Aguda Grave), escabiose, escarlatina , esquistossomose (bilharziosis), Scrub tifo, septicemia, shigelose (disenteria bacilar), telhas, a varíola (Variola), câncer mole, esporotricose, intoxicação alimentar estafilocócica, infecções estafilocócicas, estrongiloidíase, Sífilis, teníase, tétano, febre dos três dias, encefalite de pulga Tinea , Tinea do barbeiro (coceira do barbeiro), Tinea capitis (tinha do couro cabeludo), Tinea corporis (Micose do corpo), Tinea cruris (Jock coceira), Tinea manuum (Micose da Mão), Tinea nigra, Tinea pedis (pé de atleta), Tinea unguium (onicomicose), Tinea versicolor (Pitiríase versicolor), toxocaríase (oculares Larva migrans (OLM) e Visceral Larva migrans (VLM)), toxoplasmose, triquinose, tricomoníase, tricuríase (infecções Trichuris), Tripper, tripanossomíase (doença do sono), doença de Tsutsugamushi, Tuberculose, tularemia, tifo, febre tifo, infecções Ureaplasma urealyticum, vaginite (colpitis), doença variante Creutzfeldt- Jakob (vCJD, nvCJD), encefalite equina venezuelana, febre hemorrágica venezuelana, pneumonia viral, Leishmaniose Visceral , verrugas, Febre do Nilo Ocidental, encefalite equina ocidental, Branco piedra (Tinea blanca), tosse convulsa, manchas de fungo de levedura, febre amarela, infecções Yersinia pseudotuberculose, Iersiniose, e Zigomicose.

[00360] Particularmente preferidas são as doenças, em particular doenças cancerosas ou de tumores, que estão associadas com uma sobre-expressão de pelo menos um membro da Via de PD-1, de preferência, receptor de PD-1 e/ou os seus ligantes PD-L1e PD-L2.

[00361] Particularmente preferida neste contexto é o tratamento do melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pâncreas, pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, cânceres uroteliais, carcinomas de células escamosas da cabeça e do pescoço e carcinoma hepatocelular, que estão associados com um a sobre-expressão de PD-L1. Mais particularmente preferido é o tratamento do câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC) ou câncer do pulmão de células pequenas associada com a sobre-expressão de um membro qualquer da Via de PD-1, particularmente de PD-1 ou PD-L1.

[00362] Em uma outra modalidade o tratamento de doenças cancerosas ou de tumores associados com pouca ou nenhuma expressão de pelo menos um membro da Via de PD-1, de preferência PD-1 do receptor e/ou os seus ligantes PD-L1 e PD-L2 é particularmente preferida. Neste contexto, a vacina de RNA da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção é capaz de induzir a expressão de pelo menos um membro da Via de PD-1, por exemplo, PD-L1 no paciente a ser tratado e, portanto, permite que a atividade terapêutica do inibidor de PD-1.

[00363] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona um inibidor da Via de PD-1 tal como definido acima, para utilização em terapia, em combinação com uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno, tal como definido acima , por exemplo, para utilização em um método de tratamento ou prevenção de doenças tumorais e/ou câncer ou doenças infecciosas, tal como definido na presente invenção.

[00364] De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno, tal como definido acima, para utilização em terapia, em combinação com um inibidor da via de PD-1 tal como definida acima, por exemplo, para utilização em um método de tratamento ou prevenção de doenças tumorais e/ou câncer ou doenças infecciosas, tal como definido na presente invenção.

[00365] Além disso, a presente invenção proporciona em um outro aspecto um método para a transfecção e/ou o tratamento de uma célula, um tecido ou um organismo, desse modo aplicando ou administrando a combinação da vacina/inibidor da presente invenção particularmente para fins terapêuticos. Neste contexto, tipicamente, após a preparação da combinação de vacinas/inibidor da presente invenção, a combinação de vacina/inibidor da presente invenção é de preferência administrada a uma célula, um tecido ou de um organismo, de preferência, utilizando qualquer um dos modos de administração como descrito na presente invenção. O método de transfecção e/ou o tratamento de uma célula podem ser realizados in vitro, in vivo ou ex vivo.

[00366] Por conseguinte, a presente invenção também fornece um método de tratamento que compreende a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno, tal como definido acima em combinação com uma composição que compreende um Inibidor da via de PD-1 como definido acima.

[00367] Em uma modalidade preferida, o método compreende a transfecção in vitro de células isoladas. As células utilizadas são, por conseguinte, de um modo preferido células humanas ou animais, em particular células de uma cultura de células primárias, que são então retransferidas a um ser humano ou animal. Antes da transfecção, as células são tipicamente isoladas a partir do paciente a ser tratado e cultivado.

[00368] Em uma outra modalidade preferida, o método de tratamento não inclui a transfecção in vitro de células isoladas. Neste caso, a vacina de RNA, tal como definido acima administrada ao indivíduo em necessidade do mesmo não inclui células isoladas transfectadas com o, pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica para pelo menos um antígeno constituído na vacina de RNA.

[00369] Na presente invenção, a menos que seja indicado de uma outra forma, as diferentes características de alternativas e modalidades podem ser combinadas umas com as outras. No contexto da presente invenção, o termo "que compreende" pode ser substituído pelo termo "que consiste em", se for caso disso.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00370] Os números apresentados a seguir são meramente ilustrativos e devem descrever a presente invenção em uma outra maneira. Estes números não devem ser interpretados para limitar a presente invenção aos mesmos.

[00371] Figura 1: A vacina de RNA (OVA-RNAtive R1710) atua em sinergia com anticorpo anti-PD-1. Os camundongos C57 BL/6 foram desafiados subcutaneamente com 3x105 células tumorais singênicas E.G7-OVA no dia 0 e em seguida tratados com vacina OVA RNAtivo (32 ng), isoladamente ou em combinação com anticorpos anti-PD-1 ou IgG de controle (100 μg ip), de acordo com o calendário indicado.

[00372] Figura 2: proporções de sobrevivência de camundongos com tumores E.G7-OVA tratados com terapias diferentes. De acordo com o Exemplo 2, os camundongos foram tratados com qualquer uma das vacinas de OVA-RNAtiva ou anticorpo anti-PD-1 por si só ou em combinação.

[00373] Figura 3: sequência de mRNA G/C optimizada de R1710 que codifica para a ovalbumina como Gallus gallus compreendido na vacina OVA-RNAtiva.

EXEMPLOS

[00374] Os exemplos apresentados a seguir são apenas ilustrativos e devem descrever a presente invenção em uma outra forma. Estes exemplos não devem ser interpretados para limitar a presente invenção aos mesmos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DA VACINA DE MRNA 1. Preparação de Constructos de DNA e mRNA

[00375] Para os presentes exemplos de uma sequência de DNA, mRNA que codifica Gallus gallus de ovalbumina (R1710) foi preparado e utilizado para reações de transcrição in vitro seguintes.

[00376] De acordo com uma primeira preparação, a sequência de DNA que codifica para o mRNA acima referido foi preparada. O constructo foi preparado por meio da modificação da sequência de codificação do tipo selvagem por meio da introdução de uma sequência optimizada por GC para a estabilização, seguido de uma sequência estabilizadora derivada da alfa-globina-3'-UTR (muag (alfa-globina-3'- UTR mutado) ), um estiramento de 64 adenosinas (sequência poli-A), um estiramento de 30 citosinas (sequência poli-C), e uma haste em laçada de histona. Na SEQ ID NO: 2 (vide a Figura 3) a sequência de MRNA correspondente é mostrada.

2. Transcrição in vitro

[00377] O respectivo plasmídeo de DNA preparado de acordo com o Exemplo 1 foi transcrito in vitro utilizando polimerase de T7. Subsequentemente, o mRNA foi purificado utilizando PureMessengem (Curevac, Tuebingen, Alemanha).

3. Reagentes

[00378] Complexação do reagente: protamina

4. Preparação da vacina

[00379] O mRNA R1710 foi complexado com protamina por meio da adição de protamina para o MRNA na proporção (1: 2) (p/p) (componente adjuvante). Após incubação durante 10 minutos, a mesma quantidade de mRNA livre R1710 utilizado como RNA proporcionando o antígeno foi adicionada.

[00380] Vacina OVA-RNAtiva (R1710): que compreende um componente adjuvante que consiste em mRNA que codifica para a ovalbumina Gallus gallus (R1710) de acordo com a SEQ ID NO. 2 complexado com protamina na proporção de 2: 1 (p/p) e o mRNA de codificação livre fornecendo o antígeno para Gallus gallus ovalbumina (R1710) de acordo com a SEQ ID NO. (Proporção 1: 1; RNA complexado: RNA livre).

Exemplo 2: Combinação de um anticorpo anti-PD1 e uma vacina de RNA

[00381] No dia zero, os camundongos C57BL/6 foram implantados subcutaneamente (flanco direito) com 3x105 células E.G7-OVA por camundongo (volume de 100 ul em PBS). E.G7-OVA é uma linhagem de célula de linfoma de células T de camundongo que expressam esG tavelmente allus gallus ovalbumina (OVA). A vacinação intradérmica com a vacina de RNA que compreende o mRNA de OVA R1720 (32 μg/camundongo/dia de vacinação) (de acordo com o Exemplo 1) ou de lactato de Ringer (Rila) como tampão de controle e de tratamento com o anti-PD-1/CD279 anticorpo monoclonal (100 μg ip) ou com um controle do isotipo de acordo com a Tabela 1 começou no dia 4, e foi repetido nos dias 7, 11, 14, 18 e 21. Os animais receberam a injeção de anticorpo na parte da manhã e foram vacinados na parte da tarde com um mínimo de quatro horas entre os tratamentos. TABELA 1: Grupos de Animais

[00382] O anticorpo anti-PD-1/CD279 (clone RMP1-14, IgG2a de rato) e o anticorpo de controle de isotipo (clone 2A3, IgG2a de rato) foram adquiridos a BioXCell (West Lebanon, NH, EUA).

[00383] O crescimento Comprimento Izado através da medição do tamanho do tumor em duas dimensões (comprimento e largura) utilizando um calibrador (começando no dia 4). O volume do tumor foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:

[00384] Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2.

[00385] Como pode ser visto na Figura 1, o MRNA de vacinas de OVA (OVA-RNAtive R1710) sozinho ou em combinação com o controle de IgG retardou o crescimento do tumor em cerca de 5 dias, em comparação com o grupo de controle tratado com tampão. O tratamento com o anticorpo anti-PD-1 sozinho foi comparável à vacinação só, que a aplicação simultânea de uma combinação de vacina de RNA/anti-PD- 1 conduziu a uma inibição significativa do crescimento do tumor, indicando um efeito sinérgico. As linhas representam a evolução do volume de tumor e as barras de erro significam o SEM. A análise estatística foi baseada na 2way Anova com pós-teste de Bonferroni.

[00386] Como pode ser visto na Figura 2, a administração da vacina de mRNA de OVA (OVA-RNAtive R1710) ou anticorpo anti-PD-1 por si só já teve um efeito significativo sobre a sobrevivência, enquanto que a aplicação simultânea da combinação da vacina de RNA/anti-PD-1 conduziu a 50 % de sobrevivência (3 de 6 animais), indicando um efeito sinergético

Claims

1. Combinação de vacina/inibidor, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) como vacina, uma vacina de RNA que compreende pelo menos um RNA que compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para pelo menos um antígeno e (ii) como inibidor, uma composição que compreende um inibidor da via de PD-1, em que o inibidor da via PD-1 é um anticorpo antagonista dirigido contra PD-1 ou PD-L1.

2. Combinação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo dirigido contra o PD-1 é Nivolumab (BMS-936558/MDX1106), CT-011 ou MK-3475 (SCH 900475).

3. Combinação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo dirigido contra o PD-L1 é MDX-1105/BMS-936559, MPDL3280A/RG7446 (atezolizumab), ou MEDI4736 (durvalumab).

4. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que pelo menos um RNA da vacina de RNA é um RNA isolado.

5. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um RNA do RNA é uma vacina de RNA estabilizado.

6. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um RNA da vacina de RNA é, pelo menos parcialmente G/C modificado.

7. Combinação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o teor de G/C da pelo menos uma estrutura de leitura aberta do pelo menos um RNA da vacina de RNA é aumentado em comparação com a estrutura de leitura aberta do tipo selvagem.

8. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um RNA da vacina de RNA compreende uma região com códons optimizados.

9. Combinação de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma estrutura de leitura aberta do pelo menos um RNA da vacina de RNA tem códons optimizados.

10. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos um RNA da vacina de RNA é um mRNA.

11. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos um RNA da vacina de RNA é complexado com um veículo.

12. Combinação de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o veículo é um composto catiônico ou policatiônico ou um veículo polimérico.

13. Combinação de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o veículo é protamina.

14. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser para uso médico.

15. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de prevenção ou tratamento de um tumor ou câncer ou uma doença infecciosa.

16. Combinação de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que o inibidor da via do PD-1 e a vacina de RNA são para ser administrados a um paciente em necessidade do mesmo sequencialmente ou simultaneamente.

17. Combinação de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o inibidor e a vacina de RNA são para ser administrados a um paciente em necessidade do mesmo por meio de diferentes vias de administração.

18. Inibidor da via de PD-1 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia, em combinação com uma vacina de RNA como definida em qualquer uma das reivindicações1 a 17.

19. Vacina de RNA como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia de combinação com um inibidor da via de PD-1 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.