KR20110050529A - Ｐｄ-１ 길항제의 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물을 강력한 T 세포 매개된 반응을 생성시키기 위해 증강제, 예를 들어 시클로포스파미드와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 치료 요법을 이용하는 암 및 감염성 질환의 치료 방법을 설명한다. 본 발명의 방법에서 유용한 PD-1 길항제 및 증강제를 포함하는 조성물을 또한 개시한다.

Description

ＰＤ-１ 길항제의 조성물 및 사용 방법{COMPOSITIONS OF PD-1 ANTAGONISTS AND METHODS OF USE}

본원은 2009년 4월 2일 출원된 미국 특허 가출원 61/211,697, 2008년 8월 25일 출원된 61/091,694, 2008년 8월 25일 출원된 61/091,709, 및 2008년 8월 25일 출원된 61/091,705를 기초로 한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 T 세포에 대한 억제 신호 전달을 방지하는 화합물을 증강제와 조합하여 함유하는 치료 조성물, 및 질환 치료에 유용한 T 세포 반응의 유도를 위한, 상기 성분의 조합물 또는 개별적인 성분의 용도에 관한 것이다.

질환 상태, 예를 들어 감염 및 암과 같은 만성 질환에 대한 T 림프구의 반응은 복잡하고, 세포간 상호작용 및 가용형 매개물질 (시토카인 또는 림포카인으로 불림)의 생산을 수반한다. T 세포의 활성화는 보통 T 세포 수용체 (TCR)와 주요 조직적합 복합체 (MHC)를 통해 제시된 항원성 펩티드와의 접촉 후의 항원-특이적 신호에 따라 결정되는 한편, 상기 반응의 정도는 다양한 보조-자극성 분자로부터 나오는 양성 및 음성 항원-비의존 신호에 의해 제어된다. 후자는 일반적으로 CD28/B7 패밀리의 구성원이다. 이와 반대로, 프로그래밍된 사멸 (Programmed Death)-1 (PD-1)은 T 세포 상에서 유도될 때 음성 면역 반응을 전달하는 CD28 패밀리의 수용체의 구성원이다. PD-1 및 그의 리간드 (B7-H1 또는 B7-DC) 중 하나 사이의 접촉은 T 세포 증식 및/또는 T 세포 반응의 강도 및/또는 지속기간을 감소시키는 억제성 반응을 유도한다.

따라서, T 림프구 반응은 수용체로서 역할을 하는 세포 표면 분자를 포함한 다양한 인자에 의해 조절되고, 여기서 후자는 TCR 복합체 및 다른 표면 분자를 모두 포함한다.

요약하면, 항원 특이적 T 세포 반응은 2개의 신호에 의해 매개된다: 1) TCR과 HC의 상황에서 제시되는 항원성 펩티드와의 결합 (신호 1), 및 2) 상이한 수용체/리간드 쌍 사이의 접촉에 의해 전달되는 제2 항원-비의존 신호 (신호 2). 상기 "제2 신호"는 T 세포 반응의 종류 (활성화 vs 내성) 및 그 반응의 강도 및 지속기간을 결정하는데 중요하고, B7 패밀리의 단백질과 같은 보조자극 분자로부터의 양성 및 음성 신호 모두에 의해 조절된다.

가장 광범위하게 특성이 결정된 T 세포 보조자극 경로는 B7-CD28이고, 여기서 B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86)은 각각 자극성 CD28 수용체 및 억제성 CTLA-4 (CD152) 수용체에 결합할 수 있다. T 세포 수용체를 통한 신호 전달과 함께, CD28 라이게이션 (ligation)은 T 세포의 항원-특이적 증식을 증가시키고, 시토카인 생산을 향상시키고, 분화 및 효과기 기능을 활성화시키고, T 세포의 생존을 촉진한다 ([Lenshow, et al., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996)]; [Chambers and Allison, Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 (1997)]; 및 [Rathmell and Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999)]). 이와 달리, CTLA-4를 통한 신호 전달은 T 세포 증식, IL-2 생산, 및 세포 주기 진행을 억제하는 음성 신호를 전달하는 것으로 생각된다 ([Krummel and Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996)]; 및 [Walunas, et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996)]). B7 패밀리의 보조자극 분자의 다른 구성원은 B7-H1 ([Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)]; 및 [Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1-9 (2000)]), B7-DC ([Tseng, et al., J. Exp. Med., 193:839-846 (2001)]; 및 [Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001)]), B7-H2 ([Wang, et al., Blood, 96:2808-2813 (2000)]; [Swallow, et al., Immunity, 11:423-432 (1999)]; 및 [Yoshinaga, et al., Nature, 402:827-832 (1999)]), B7-H3 ([Chapoval, et al., Nature Immunol., 2:269-274 (2001)]) 및 B7-H4 ([Choi, et al., J. Immunol., 171:4650-4654 (2003)]; [Sica, et al., Immunity, 18:849-861 (2003)]; [Prasad, et al., Immunity, 18:863-873 (2003)]; 및 [Zang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003)])을 포함한다. B7-H5 (WO 2006/012232에 기재됨)는 B7 패밀리의 새로 발견된 구성원이다.

B7 패밀리 분자는 막 근위 IgC (불변) 도메인 및 막 원위 IgV (가변) 도메인을 갖는다. 이들 리간드에 대한 CD28-유사 패밀리의 수용체는 공통의 세포외 IgV-유사 도메인을 공유한다. 수용체-리간드 쌍의 상호작용은 주로 리간드의 IgV 도메인 및 수용체 내의 잔기들을 통해 매개된다 (Schwartz, et al., Nature Immunol., 3:427-434 (2002)). 일반적으로, IgV 도메인은 각각 β-가닥의 층을 포함하는 2개의 시트 (sheet)를 갖는 것으로서 설명된다 (Williams and Barclay, Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988)). CTLA-4의 전면 및 후면 시트는 각각 가닥 A'GFC'C 및 ABEDC를 포함하는 반면 (Ostrov, et al., Science, 290:816-819 (2000)), B7 IgV 도메인의 전면 및 후면 시트는 각각 가닥 AGFCC'C" 및 BED로 구성된다 ([Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)]; [Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001)]; 및 [Ikemizu, et al., Immunity, 12:51-60 (2000)]). 결정학 분석으로 CTLA-4/B7 결합 계면이 MYPPPY 모티프로 구성된, CTLA-4로부터의 CDR3-유사 루프와 주로 G, F, C, C' 및 C" 가닥에 의해 형성된 B7 상의 표면과의 상호작용에 의해 지배됨이 밝혀졌다 ([Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)]; 및 [Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001)]). 아미노산 상동성, 돌연변이, 및 컴퓨터 모델링으로부터의 데이타는 상기 모티프가 또한 CD28에 대한 주요 B7-결합 부위라는 개념을 지지한다 (Bajorath, et al., J. Mol. Graph. Model., 15:135-139 (1997)). MYPPPY 모티프는 B7-H2에 대한 수용체인 ICOS에서 보존되지 않지만, 연구에서는 서열 FDPPPF를 갖고 유사한 위치에 위치하는 관련 모티프가 B7-H2에 대한 ICOS의 결합에 대한 주요 결정인자임을 나타내었다 (Wand, et al., J. Exp. Med., 195:1033-1041 (2002)).

B7-DC (PD-L2 또는 CD273으로도 불림)는 B7 패밀리의 비교적 새로운 구성원이고, B7-H1 (PD-L1로도 불림)에 약 34% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 인간 및 마우스 B7-DC 오르토로그 (orthologue)는 약 70% 아미노산 동일성을 공유한다. B7-H1 및 B7-DC 전사체는 다양한 조직에서 발견되지만 ([Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)]; [Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001)]; 및 [Tamura, Blood, 97:1809-1816 (2001)]), 단백질의 발현 프로필은 매우 구별된다. B7-H1은 매우 다양한 조직 및 세포 종류 상에서 널리 발현되는 한편, B7-DC 발현은 주로 활성화된 수지상 세포 (DC) 및 대식세포에 제한된다.

B7-H1 및 B7-DC는 둘 모두 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM)를 갖는 CD28 패밀리의 먼 구성원 (Ishida, et al., EMBO J., 11:3887-3895 (1992))인 PD-1에 결합하는 것으로 나타났다 (Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000)). CD28 패밀리의 수용체의 구성원인 PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, DC, 및 대식세포 상에서 유도되어 발현된다 (Keir, et al. Curr. Opin. Immunol. 19:309-314 (2007)).

그의 리간드에 의한 PD-1 라이게이션의 주요 결과는 T 세포 수용체 (TCR)의 하류에서 신호 전달을 억제하는 것이다. 따라서, PD-1을 통한 신호 전달은 대체로 T 세포에 억압 또는 억제 신호를 제공하여, 감소된 T 세포 증식 또는 T 세포 활성의 다른 감소를 일으킨다. B7-H1은 T 세포에서 억제 신호 전달을 일으키는 주요 PD-1 리간드이다. 본 발명에서는 PD-1에 결합하고 따라서 억제 신호 전달을 방지하거나, 또는 달리 PD-1의 리간드, 예를 들어 B7-H1에 결합하여, 리간드가 억제 신호를 전달하기 위해 PD-1에 결합하는 것을 방지하는 물질을 제공함으로써, 바람직하지 않은 T 세포 억제의 문제를 해결한다. 두 경우에, T 세포 반응, 예를 들어 T 세포 증식 또는 활성화가 자극된다.

B7-H1은 아마도 그의 보다 넓은 분포 및 보다 높은 발현 수준으로 인해 주요한 PD-1 리간드이다. PD-1 억제는 면역 시냅스의 환경에서 PD-1 및 TCR이 서로 매우 근접하게 라이게이팅될 때에만 일어난다. PD-1 및 그의 리간드는 몇몇 검토 문헌의 주제이었다.

B7-H1은 또한 많은 암 (예를 들어 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 신경아교종, 백혈병, 폐암, 흑색종, 다발 골수종, 난소암, 췌장암, 신세포 암종, 및 요로상피암)에서 과다 발현되고, 불량한 예후에 연관되었다. B7-H1은 특히 인터페론 감마 (IFN-γ)로의 자극 후에 많은 종양 세포주에 의해 발현되고, 또한 종양 침윤성 골수 유래 억제자 세포 (MDSC) 상에서 상향조절된다. 예를 들어, PD-1은 종양 특이적 CD8 T 세포 상에서 상향-조절되고, 기능성 장애, 무응답 (anergy), 결핍, 및 세포자멸 (apoptosis)과 연관된다. PD-1 상향조절은 또한 추가의 세포 종류, 예를 들어 조절성 T 세포 (Treg) 및 천연 킬러 T (NKT) 세포에 대한 기능이상 및/또는 억압 표현형과 연관되었다.

본 발명에서는 증가된 T 세포 활성을 통해 질환, 특히 암 및 감염성 질환을 치료하기 위한 치료 요법을 제공함으로써 상기한 분자 기능을 이용한다.

발명의 개요

한 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 면역 세포, 특히 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물 및 증강제를 투여하는 것을 포함하는, 그러한 증가를 필요로 하는 포유동물에서, 예를 들어 항원에 대한 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다.

본 발명의 치료 요법에서 유용한 화합물은 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 T 세포 상의 PD-1 수용체에 결합하고 차단하는 화합물, PD-1 리간드에 결합하여 PD-1에 대한 그들의 결합을 방지하는 화합물, 상기 2가지 역할을 모두 하는 화합물, 및 PD-1 또는 PD-1의 천연 리간드를 코딩하는 유전자의 발현을 방지하는 화합물을 포함한다. 상기 화합물을 본원에서 "PD-1 길항제"로서 칭한다. PD-1의 천연 리간드에 결합하는 화합물은 PD-1 자신 및 PD-1의 활성 단편, 및 B7-H1 리간드의 경우에 B7.1 단백질 및 단편을 포함한다. 상기 길항제는 단백질, 항체, 안티센스 분자 및 작은 유기물질을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 T 세포 반응은 다른 것 없이 하나만 투여될 때 상기 PD-1 길항제 또는 상기 증강제 중 하나에 의해 생산된 반응보다 더 크다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 유용한 화합물은 T 세포 표면 분자, 예를 들어 CTLA4에 결합하여 그의 천연 리간드의 결합에 의해 촉발된 억제 신호를 방지하는 것 또는 상기 천연 리간드에 결합하는 것이다. 상기 길항제는 단백질, 항체, 안티센스 분자 및 작은 유기물질을 포함한다.

일반적 실시양태에서, 본 발명의 치료 요법 및 조성물에서 유용한 화합물은 PD-1과 TCR의 동시-라이게이션을 촉발 및/또는 유도 및/또는 증가 및/또는 촉진 및/또는 허용하지 않으면서 PD-1에 결합하는 것을 포함한다.

PD-1을 통한 억제 신호 전달을 방지하고 따라서 PD-1 길항제로서 작용하는 바람직한 화합물은 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1에 결합하는, B7-DC 폴리펩티드, 특히 이들의 가용형 부분, 예를 들어 이들의 활성 단편, 이들의 변이체 및 상동체, 및 상기한 것 중 임의의 것을 포함한 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, B7-DC는 서열 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 상기 화합물은 B7-DC의 가용형 도메인을 포함하는 것이다 (즉, 막횡단 서열이 없는). B7-DC 폴리펩티드의 적합한 단편은 IgV 및/또는 IgC 도메인을 함유하는 단편 또는 IgV 도메인만을 함유하는 단편을 포함하고, 여기서 후자가 바람직한 실시양태이고, 서열 1의 아미노산 20-121이 IgV 도메인의 바람직한 예이다.

또한, 바람직한 PD-1 길항제는 또한 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1에 결합하는, B7-H1 폴리펩티드 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,803,192에 개시됨)와 같은 PD-1의 천연 리간드의 활성 단편, 특히 이들의 가용형 부분, 예를 들어 이들의 변이체 및 상동체, 및 상기한 것 중 임의의 것을 포함한 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 화합물은 또한 PD-1의 천연 리간드에 결합하는 화합물, 예를 들어 활성 단편, 변이체 및 상동체, 예를 들어 B7-H1에 결합하는 B7-1의 단편, 및 리간드가 억제 신호 전달을 촉발하기 위해 PD-1에 결합하는 것을 방지하기 위해 PD-1의 리간드에 결합하는, 상기한 것 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

다른 실시양태에서, 조성물 및 그의 사용 방법은 PD-1 수용체에 결합하고 차단하는 PD-1 수용체 길항제, 및 PD-1 수용체 리간드에 결합하고 차단하는 별개의 PD-1 수용체 길항제의 조합물을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서는 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 결합하고 또한 PD-1 수용체 리간드, 예를 들어 B7-H1 (이는 그렇지 않으면 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 촉발할 것이다)에 결합하고 그를 길항하는 능력을 갖는 PD-1 수용체 길항제를 제공한다. 다른 고려되는 PD-1 수용체 길항제는 PD-1 수용체 및 PD-1 수용체 리간드에 모두 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함한다.

본 발명에서 유용한 화합물의 바람직한 실시양태는 또한 PD-1 또는 CTLA4에 결합하여, 이들 공급원에 의해 매개되는 억제 신호 전달을 감소 또는 폐지시키는 항체를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 바람직한 화합물은 또한 CTLA4에 결합하여 후속적인 억제 신호를 감소시키지만 CD28에 결합하거나 CD28에 의한 양성 신호 형질도입을 달리 억제하지 않는 CTLA4의 리간드 (예를 들어 B7-1 및 B7-2)의 활성 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

PD-1을 통한 억제 신호 전달을 방지하고 따라서 PD-1 길항제로서 작용하는 바람직한 화합물은 B7-DC에 결합하는, B7-DC 길항제, 특히 이들의 가용형 부분, 예를 들어 이들의 활성 단편, 이들의 변이체 및 상동체, 및 상기한 것 중 임의의 것을 포함한 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, B7-DC 폴리펩티드, 그의 단편 또는 변이체는 다른 폴리펩티드에 결합되어, PD-1을 통한 억제 신호 전달을 야기하지 않으면서 PD-1 수용체에 결합하여, PD-1에 대한 리간드 결합, 특히 B7-H1 결합을 감소 또는 저해함으로써 및 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 저해함으로써 PD-1 수용체에 길항하는 융합 단백질을 형성한다. 상기 융합 단백질의 예는 서열 9, 10, 12 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 그의 상동체이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, B7-DC의 세포외 도메인 (ECD)의 전부 또는 일부는 융합 단백질의 일부이고, 여기서 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 그의 바람직한 예는 B7-DC-Ig, 특히 이 구조가 2개의 B7-DC-Ig 분자가 예를 들어 디술피드 연결에 의해 서로 연결되어 있는 동종이량체의 일부인 경우이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물에서 유용한 단편은 목적하는 길항제 활성을 갖는 폴리펩티드의 적어도 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200개 또는 그 초과의 인접하는 아미노산으로 이루어진다. 상기 단편은 또한 일반적으로 본 발명에 사용하기 위한 융합 단백질의 일부이다.

다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 항-PD-1 항체 및 증강제를 포함하는 효과적인 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다.

다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 면역조정물질 및 증강제를 포함하는 효과적인 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다. 상기 면역조정물질은 T 세포 반응을 억제하는 다른 CD28 패밀리 수용체 (예를 들어 CTLA4)를 길항하는 분자를 포함한다. 바람직한 실시양태는 항-CTLA4 항체 및 증강제를 이용한다. 추가의 면역조정물질은 T 세포 반응을 활성화시키는 CD28 패밀리 수용체 (예를 들어 CD28 및 ICOS)를 효능화시키는 분자; T 세포 반응을 억제하는 B7 패밀리 리간드 (예를 들어 B7-H1, B7-DC, B7-H4)를 길항하는 분자; 및 T 세포 반응을 활성화시키는 B7 패밀리 리간드 (예를 들어 B7.1 및 B7.2)를 효능화시키는 분자를 포함한다.

본 발명의 임의의 방법의 추가의 실시양태에서, PD-1 길항제 화합물 및 증강제의 치료 요법은 적어도 하나의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 고려되는 추가의 치료제는 면역조정제를 포함한다. 상기 방법을 위한 예시적인 면역조정제는 항-PD-1 및 항-CTLA4 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 증강제는 시클로포스파미드 및 시클로포스파미드의 유사체, 수니티닙 (수텐트 (Sutent)), 항-TGFβ 및 이마티닙 (글리백 (Gleevac)), 유사분열 억제제, 예를 들어 파클리탁셀, 아로마타제 억제제, 예를 들어 레트로졸, A2a 아데노신 수용체 (A2AR) 길항제, 혈관신생 억제제, 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제로부터 선택된다. 이들 물질의 일부는 종양 미세환경 내에서 Treg (즉, 조절성 T 림프구 또는 T-reg)의 수를 감소시킨다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물은 상기 방법 및/또는 조성물의 일부로서 임의의 적합한 아주반트의 사용을 구체적으로 고려한다.

본 발명에 따라서, T 세포는 시험관 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서 PD-1 수용체 길항제 및/또는 증강제를 함유하는 그의 조성물과 접촉될 수 있다. PD-1 수용체 길항제 및/또는 증강제를 함유하는 그의 조성물을 사용하여 T 세포를 접촉시키는 것은 T 세포의 활성화 전에, 활성화 동안 또는 활성화 후에 일어날 수 있다.

특정 실시양태에서, PD-1을 통한 억제 신호 전달을 방지 또는 감소시키는 분자 및 증강제는 증강제가 PD-1 길항제를 투여하기 전에 투여되는 경우와 같이 상이한 시간에 투여된다. 그러한 투여는 추가의 치료제와 함께 수행될 수 있다.

본 발명의 임의의 방법의 구체적 실시양태에서, 치료 요법은 임의의 또는 모든 PD-1 길항제, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 및/또는 추가의 치료제를 투여하기 적어도 1시간, 또는 적어도 2시간, 또는 적어도 3시간, 또는 적어도 5시간, 또는 적어도 10시간, 또는 적어도 15시간, 또는 적어도 20시간, 또는 적어도 24시간, 또는 적어도 30시간 전에 또는 심지어 이보다 전에 증강제의 투여를 포함한다. 증강제의 투여는 또한 임의의 또는 모든 PD-1 길항제, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체 및/또는 추가의 치료제를 투여한 후에, 예를 들어 PD-1 길항제를 투여한 후 1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 24시간 이내에 또는 심지어 30시간까지 일어날 수 있거나, PD-1 길항제를 투여하는 것과 함께 일어날 수 있다.

본 발명의 방법의 결과로서 달성된 증가된 T 세포 반응은 암, 바이러스 감염, 세균 감염 및 기생충 감염 중 하나 이상을 포함한 질환을 치료하기 위해 충분하다. 질환이 암인 경우에, 상기 암은 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환, 또는 혈액암 중 임의의 하나 이상이다.

다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 내의 본 발명의 방법에서 사용되는 길항제의 조성물을 포함하고, 여기서 상기 PD-1 결합 분자 및 상기 증강제는 각각 증가된 T 세포 자극을 생성시키기 위해 효과적인 양으로 존재한다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에서 사용하기 위한 하나 이상의 물질을 그의 희석을 위한 제약상 담체와 함께 보유하는 용기 및 투여를 위한 지시서를 포함하는 의료 키트를 포함한다. 또한, 상기 PD-1 수용체 길항제 및 증강제는 상기 성분들이 동시에 투여되어야 할 때 둘 모두 단일 용기 내의 성분으로서 제약상 허용되는 담체 내에 존재할 수 있다.

도 1은 B7-DC-Ig가 PD-1에 결합함을 보여준다. 표지된 B7-DC-Ig를 다양한 농도에서 PD-1을 구성적으로 발현하는 CHO 세포주 또는 PD-1을 발현하지 않는 모 CHO 세포와 함께 인큐베이팅하였다. 결합을 유동 세포 측정에 의해 분석하였다. B7-DC-Ig의 중간 형광 강도 (MFI) (y-축)를 프로브의 농도 (x-축)의 함수로서 도시한다. B7-DC-Ig는 CHO.PD-1 세포에 결합하지만 (속이 찬 원), 형질감염되지 않은 CHO 세포에 결합하지 않는다 (회색 삼각형).
도 2는 B7-DC-Ig가 PD-1에 대한 결합을 위해 B7-H1과 경쟁함을 보여준다. 표지되지 않은 B7-DC-Ig를 다양한 농도에서 먼저 PD-1을 구성적으로 발현하는 CHO 세포주와 함께 인큐베이팅한 후, 표지된 B7-H1-Ig를 세포 혼합물에 첨가하였다. B7-H1-Ig의 중간 형광 강도 (MFI) (y-축)을 첨가된 표지되지 않은 B7-DC-Ig 경쟁자의 농도 (x-축)의 함수로서 도시한다. 표지되지 않은 B7-DC-Ig의 농도가 증가함에 따라 CHO 세포에 결합된 표지된 B7-H1-Ig의 양은 감소하고, 이것은 B7-DC-Ig가 PD-1에 대한 결합을 위해 B7-H1과 경쟁함을 입증한다.
도 3은 시클로포스파미드 (CTX 또는 시톡산(Cytoxan)®) 및 이량체성 뮤린 B7-DC-Ig의 조합물이 마우스에서 확립된 CT26 종양 (결장 암종)의 근절을 일으켰다는 실험의 결과를 보여준다. 그래프 A는 제10일에 100 mg/kg의 CTX로 처리한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 도시한 한편, 그래프 B는 제10일에 CTX로 처리한 후, 1일 후에 제1 B7-DC-Ig를 투여한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 도시한 것이다. 각각의 그래프 내의 각각의 선은 1마리의 마우스를 나타낸다. 흑색 화살표는 B7-DC-Ig 투여를 나타낸다. 그래프 C는 평균 종양 부피를 보여준다.
도 4는 CTX 및 이량체성 뮤린 B7-DC-Ig의 조합물이 마우스에서 확립된 CT26 종양 (결장 암종)을 근절하고, CT26을 사용한 재접종에 대해 보호하였다는 실험 결과를 보여준다. CTX 및 B7-DC-Ig로 처리하고 종양 접종 후 제44일에 종양 성장이 없는 것으로 밝혀진 마우스에게 종양을 재접종하였다. 마우스를 나중에 제70일에 다시 재접종하였다. 마우스는 어느 것도 제100일에 종양 성장을 보이지 않았다.
도 5는 CTX 및 B7-DC-Ig 치료가 종양 특이적 기억 CTL을 생성시켰음을 보여준다. CTX 및 B7-DC-Ig 치료 후 확립된 CT26 피하 종양을 근절시킨 마우스에게 CT26 세포를 재접종하였다. 7일 후에, 비장세포를 단리하고, 난알부민 (비관련 펩티드) 또는 AH1 (CT26 특이적 펩티드)로 펄싱하였다. 세포를 먼저 항-CD8 항체로 염색한 후, 항-IFNγ 항체를 사용하여 세포내 염색한 후 FACS 분석하였다.
도 6은 마우스에서 확립된 CT26 종양의 근절에 대한 CTX와 조합한 상이한 용량의 B7-DC-Ig의 효과를 보여준다. 9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1E05개의 CT26 세포를 피하 이식하였다. 제9일에, 마우스에게 100 mg/kg의 CTX를 IP 주사하였다. 24시간 후인 제10일에, 마우스에게 30, 100, 또는 300 ㎍의 B7-DC-Ig로 처리한 후, 매주 2회 주사로 총 8회까지 처리하였다. 종양 성장을 매주 2회 측정하였다.
도 7은 CTX 및 항-PD-1 항체의 조합물이 마우스에서 확립된 CT26 종양 (결장 암종)의 근절을 일으켰다는 실험 결과를 보여준다. 그래프 A는 처리하지 않은 마우스 (즉, 비히클 단독으로 처리한 마우스)에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 보여주고, 그래프 B는 제11일에 주사 당 300 ㎍으로 시작하여 매주 3회 12회 주사하여 항-PD-1 단독으로 처리한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 보여주고, 그래프 C는 제11일에 CTX로 처리하고 제1 항-PD-1 투여를 제12일에 주사 당 300 ㎍으로 매주 3회 12회 주사한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 보여준다. 각각의 그래프 내의 각각의 선은 1마리의 마우스를 나타낸다. 흑색 화살표는 항-PD-1 투여를 나타낸다.
도 8은 CTX 및 항-CTLA4 항체의 조합물이 마우스에서 확립된 CT26 종양 (결장 암종)의 근절을 일으켰다는 실험 결과를 보여준다. 여기서, 그래프 A는 제11일에 100 mg/kg의 CTX를 처리한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 보여주는 한편, 그래프 B는 제11일에 CTX로 처리하고, 제12일에 항-CTLA4를 주사 당 100 ㎍로 매주 2회 8회 주사한 마우스에서 종양 부피 (mm³) 대 종양 접종 후 일수를 보여준다. 각각의 그래프 내의 각각의 선은 1마리의 마우스를 나타낸다. 흑색 화살표는 항-CTLA-4 투여를 나타낸다.
도 9는 9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1 X 10⁵개의 CT26 세포를 피하 이식한 실험 결과를 보여준다. 제9일에, 마우스에게 100 mg/kg의 CTX를 IP로 주사하였다. 24시간 후인 제10일에, 마우스를 100 ㎍의 B7-DC-Ig로 처리하였다. 5개의 군이 존재하였다: 임의의 종양 세포를 투여하지 않은 나이브 (naive) 마우스, 비히클 주사, CTX 단독, CTX + B7-DC-Ig, 또는 B7-DC-Ig 단독. 2마리의 나이브 마우스 및 다른 군으로부터의 4마리의 마우스를 T 세포 분석을 위해 제11일 (CTX의 2일 후) 및 제16일 (CTX의 7일 후)에 연구로부터 제거하였다. 좌측 패널은 제11일 (CTX 주사의 2일 후)에 CTX 치료한 마우스의 비장 내의 Treg가 종양을 이식하고 비히클을 주사한 마우스에서보다 유의하게 더 낮았음을 보여준다. 우측 패널은 제16일 (CTX의 7일 후 및 B7-DC-Ig 치료의 6일 후)에, B7-DC-Ig가 높은 PD-1을 발현하는 CD4+ T 세포를 유의하게 저하시켰음을 보여준다. 이것은 B7-DC-Ig 처리된 마우스 및 CTX + B7-DC-Ig 처리된 마우스 모두에서 관찰되었다. 종양 세포를 이식한 마우스는 나이브 마우스에 비해 배수 (draining) LN 내에 보다 많은 PD-1+/CD4+ T 세포를 갖도록 의도되었다.
도 10은 마우스 전립선 종양 세포주를 꼬리 정맥에 주사한 마우스에서 CTX 및 B7-DC-Ig의 조합물이 증가된 생존을 일으켰다는 실험 결과를 보여준다. SP-1 세포를 TRAMP 전립선 종양 세포 주사로부터 전이된 마우스 폐로부터 단리하였다. B10.D2 마우스에게 먼저 3 x 10⁵개의 SP-1 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 주사하였다. 제5, 12 및 19일에, 마우스에게 지시되는 곳에 50 mg/kg의 CTX를 주사하였다. 제6, 13 및 20일에, 마우스에게 지시되는 곳에 5 mg/kg의 B7-DC-Ig를 주사하였다. 여기서, "NT"는 "처리하지 않음"을 나타낸다.
도 11. 11-13주령의 Balb/C 마우스에게 단리된 간 전이물을 반비장 (hemispleen) 주사 기술을 이용하여 제공하였다. 마취시킨 마우스의 비장을 2개의 반비장으로 나누고, 반비장들을 클리핑 (clipping)하였다. CT26 세포 (1E05)를 1개의 반비장 내로 주사하고, 30초 후에 그 반비장을 절제하고 비장 배수 정맥을 클리핑하였다. 제10일에, 마우스에게 CTX를 50 mg/kg로 IP로 1회 주사하였다. 24시간 후인 제11일에, 마우스를 AH1 펩티드 (CT26의 면역우성 에피토프)를 보유하는 재조합 리스테리아 (Listeria)로 0.1 x LD₅₀ (1x10⁷ CFU)로, 이어서 제14일 및 제17일에 처리하였다. 마우스를 또한 B7-DC-Ig로 제11일, 이어서 제18일에 처리하였다. 마우스 총 생존을 모니터링하였다.

정의

달리 규정하지 않으면, 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 특히, 다음 용어 및 어구는 다음 의미를 갖는다.

용어 "억제 신호 전달"은 T 세포 증식의 감소 또는 임의의 다른 억제 메카니즘에 의해 항원에 대한 T 세포 반응을 폐지하거나 감소시켜, 면역원성 T 세포 반응의 정도 또는 지속 기간을 감소시키는 효과를 갖는 임의의 신호 전달을 의미하고자 의도된다. 상기 억제 신호 전달은 천연 리간드에 대한 PD-1 결합, 예를 들어 B7-H1 또는 상기 클래스의 리간드의 몇몇 다른 구성원인 B7-DC에 의한 PD-1의 결합에 의한 것일 수 있거나, 또는 CTLA4의 리간드, 예를 들어 B7-1 또는 B7-2에 대한 결합에 의한 것일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 상기 억제 신호 전달을 감소시키고, PD-1 길항제 및 CTLA4 길항제를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "PD-1 길항제"는 T 세포, B 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, DC, 및 대식세포의 표면에서 발견되는 PD-1에 의해 매개되는 억제 신호 전달을 약화시키는 임의의 분자를 의미한다. 상기 길항제는 T 세포 상의 PD-1 분자에 의해 생성된 임의의 억제 신호를 붕괴시키는 분자를 포함한다. 본 발명의 구체적인 예에서, PD-1 길항제는 PD-1 수용체 신호 전달 경로를 통한 억제 신호 전달을 억제하거나, 감소시키거나 폐지하거나 다른 방식으로 감소시키는 분자이다. 그러한 감소는 (i) 본 발명의 PD-1 길항제가 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 결합하여 억제 신호 전달을 감소시키거나 차단하거나; (ii) PD-1 길항제가 PD-1 수용체의 리간드 (예를 들어 효능제)에 결합하여 그에 대한 리간드의 결합을 억제하거나 (예를 들어, 상기 효능제가 B7-H1인 경우에); (iii) PD-1 길항제가, 억제되지 않을 때 PD-1 억제 신호 전달을 자극하거나 달리 용이하게 하는 조절 사슬의 일부인 분자에 결합하거나 분자의 활성을 억제하거나; 또는 (iv) 특히 PD-1 또는 하나 이상의 그의 천연 리간드를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키거나 폐지함으로써 PD-1 길항제가 PD-1 수용체 또는 그의 발현 리간드의 발현을 억제하는 경우에 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명의 PD-1 길항제는 PD-1 억제 신호 전달의 감소를 유도하여 하나 이상의 항원에 대한 T 세포 반응을 증가시키는 분자이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CTLA4 길항제"는 T 세포 반응의 CTLA4-매개된 억제를 감소시키는 화합물을 의미한다. 예를 들어, T 세포에서, CTLA4는 B7 리간드, 예를 들어 B7-1 및 B7-2의 결합시에 억제 자극을 전달한다. CTLA4 길항제는 활성화된 T 세포 상의 CTLA4에 대한 상기 리간드의 결합을 붕괴시키는 것이다. 한 실시양태에서, 길항제는 CTLA4에 결합하여 리간드 결합을 억제하는 항-CTLA4 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 단편"은 예를 들어 PD-1에 결합하거나 또는 PD-1의 리간드에 결합함으로써 PD-1 길항제 활성을 보이는, 천연 폴리펩티드, 또는 천연 폴리펩티드에 대해 높은 서열 상동성 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단편은 PD-1에 결합하는 B7-DC 단백질의 세포외 도메인 (ECD), 예를 들어 서열 3, 바람직하게는 그의 아미노산 20 내지 221로 구성된다. PD-1 폴리펩티드의 경우에, 활성 단편은 PD-1의 천연 리간드에 결합하여 상기 리간드에 의한 PD-1 매개된 억제 신호 전달의 자극을 억제하는 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드의 일부이다. 활성 단편은 천연 결합 부위에 대한 결합을 위해 그가 유도되는 분자와 경쟁하는 그들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 활성 단편은 PD-1에 대한 결합을 위해 야생형 B7-DC와 경쟁할 것이다.

항체에 관하여, 용어 "활성 단편"은 전체 면역글로불린보다 더 작은 항체의 항원 결합 부분을 의미한다. 상기 단편은 수용체 또는 리간드로서 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드와 반응하고 그에 결합할 수 있는 Fab 및 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 이들 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 무손상 항체의 Fc 부분이 결여되고, 혈류로부터 보다 신속하게 제거되고, 무손상 항체보다 더 작은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다 (Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983)). Fv 단편도 또한 포함된다 ([Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135]; [Sharon, J. et al. (1976) Biochemistry 15:1591-1594]). 이들 다양한 단편은 통상적인 기술, 예를 들어 프로테아제 절단 또는 화학적 절단을 이용하여 생산된다 (예를 들어, 문헌 [Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 PD-1 길항제의 "가용형 부분"은 막횡단 부분 또는 세그먼트의 어떠한 부분도 포함하지 않는 전장 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 예를 들어, B7-DC에 대해, 가용형 부분은 세포외 부분 (N-말단 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않는)을 포함하지만, 막횡단 부분의 어떠한 부분 (또는, 적어도 용해도를 감소시키기에 충분하지 않은)도 포함하지 않을 것이다. 따라서, 인간 B7-DC의 ECD는 서열 3으로서 제시되고, 전장 분자의 IgV-유사 및 IgC-유사 도메인 (즉, 전장 서열 (서열 1)의 아미노산 20-221)으로 구성된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "보조-자극성 폴리펩티드"는 T 세포 상의 세포-표면 분자와 상호작용시에 T 세포의 활성을 조정하는 폴리펩티드이다. 따라서, T 세포의 반응은 효과기 (예를 들어, CTL 또는 항체-생산 B 세포) 반응, 하나 이상의 효과기 (예를 들어, CTL 또는 항체-생산 B 세포) 반응에 대한 도움을 제공하는 헬퍼 반응, 또는 억압 반응일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 요법"은 질환의 치료 또는 요구되는 병리학적 변화, 예를 들어 면역계의 항원 또는 면역원에 대한 증가 또는 감소된 반응, 예를 들어 상기 반응에 관련되는 하나 이상의 세포, 또는 세포 종류의 수 또는 활성의 증가 또는 감소를 달성하는 방법을 의미하고, 여기서 상기 치료 또는 방법은 동물, 예를 들어 포유동물, 특히 인간에게 질환을 효과적으로 치료하거나 상기 병리학적 변화를 생성시키기에 충분한 양의 상기 요법의 2가지 이상의 화학적 작용제 또는 성분을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 화학적 작용제 또는 성분은 동일한 조성물의 일부로서 함께 투여되거나 또는 별개로 독립적으로 동시에 또는 상이한 시점에 투여되고 (즉, 각각의 작용제 또는 성분의 투여는 하나 이상의 작용제 또는 성분과 한정된 시간차를 두고 시행된다), 상기 하나 이상의 작용제 또는 성분의 투여는 단독으로 또는 별개로 투여되는 임의의 상기 작용제 또는 성분보다 더 큰 결과를 달성한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 예를 들어, 펩티드를 자연에서 발견되지 않는 농도로 농축함으로써 그의 자연 환경으로부터 분리된, 화합물이 자연적으로 발생하는 것과 상이한 환경 내에 있는 관심있는 화합물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)을 설명하기 위한 의미를 갖는다. "단리된"은 관심있는 화합물에 대해 실질적으로 농축시킨 및/또는 관심있는 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 화합물을 포함하는 의미이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 변형 (예를 들어, 인산화 또는 당화)에 상관없이 임의의 길이의 아미노산의 사슬을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 서열 변경을 함유한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 서열 변경"은 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "일부", "세그먼트", 및 "단편"은 폴리펩티드에 대해 사용될 때, 잔기, 예를 들어 아미노산 잔기의 연속적인 서열을 의미하고, 이 서열은 보다 큰 서열의 하위세트를 형성한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 임의의 통상적인 엔도펩티다제, 예를 들어 트립신 또는 키모트립신으로 처리될 경우, 상기 처리에 의해 생성되는 올리고펩티드는 출발 폴리펩티드의 일부, 세그먼트 또는 단편을 나타낼 것이다. 따라서, 폴리펩티드의 "단편"은 전장 단백질의 보다 짧은 폴리펩티드인 폴리펩티드의 임의의 하위세트를 나타낸다. 일반적으로, 단편은 5개 이상의 아미노산 길이일 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 (또는 그의 단편)의 유도체, 유사체 또는 상동체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드가 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙 폴리펩티드, 예를 들어 리더 또는 분비 서열 또는 성숙 폴리펩티드 또는 전단백질 서열의 정제에 사용되는 서열에 융합되는 것일 수 있다. 상기 유도체 및 유사체는 본원의 개시내용으로부터 당업자가 인식할 수 있는 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "결합가 (valency)"는 분자당 이용가능한 결합 부위의 수를 나타낸다.

본 발명에 따라서, 용어 "동일성 비율" 또는 "동일한 비율"은 서열에 대해 사용될 때, 비교할 서열 ("비교되는 서열")을 설명되거나 청구되는 서열 ("참조 서열")과 정렬한 후에 서열이 청구되거나 설명되는 서열에 비교됨을 의미한다. 이어서, 동일성 비율은 다음 식에 따라 결정된다:

동일성 비율 = 100 [1-(C/R)]

여기서, C는 참조 서열과 비교되는 서열 사이의 정렬 길이에 걸친 참조 서열과 비교되는 서열 사이의 차이의 수이고, 여기서 (i) 비교되는 서열 내의 대응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖지 않는 참조 서열 내의 각각의 염기 또는 아미노산 및 (ii) 참조 서열 내의 각각의 갭 및 (iii) 비교되는 서열 내의 대응하는 정렬된 염기 또는 아미노산과 상이한 참조 서열 내의 각각의 정렬된 염기 또는 아미노산이 상기 차이를 구성하고; R은 비교되는 서열과의 정렬 길이에 걸친 참조 서열 내의 염기 또는 아미노산의 수이고, 참조 서열 내에 생성된 임의의 갭도 염기 또는 아미노산으로 계수된다. 그에 대해 상기와 같이 계산된 동일성 비율이 특정 최소 동일성 비율과 거의 같거나 더 큰 정렬이 비교되는 서열과 참조 서열 사이에 존재할 경우, 비교되는 서열은 참조 서열에 대해 특정 최소 동일성 비율을 갖지만, 상기 계산된 동일성 비율이 특정 동일성 비율보다 작은 정렬이 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적" 아미노산 치환은 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 치환이고, "비-보존적" 아미노산 치환은 치환된 아미노산의 전하, 소수도, 또는 부피가 유의하게 변경된 치환이다. 비-보존적 치환은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서 치환 영역 내의 펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 그들의 효과에서 보다 유의하게 상이할 것이다. 보존적 아미노산 치환의 예는 치환이 다음 5개의 군 중의 하나 내에서 이루어지는 것을 포함한다: 1) 작은 지방족, 비극성 또는 경미한 극성 잔기 (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 2) 극성, 음대전 잔기 및 그들의 아미드 (Asp, Asn, Glu, Gln); 극성, 양대전 잔기 (His, Arg, Lys); 큰 지방족, 비극성 잔기 (Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 큰 방향족 잔기 (Phe, Tyr, Trp). 비-보존적 아미노산 치환의 예는 1) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴, 또는 알라닐을 치환하거나 (또는 이에 의해 치환되거나); 2) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 치환하거나 (또는 이에 의해 치환되거나); 3) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전성 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파르틸을 치환하거나 (또는 이에 의해 치환되거나); 또는 4) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어, 글라이신을 치환하는 (또는 이에 의해 치환되는) 것이다.

용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 포유동물, 예를 들어 비제한적으로 영장류, 예를 들어, 인간 및 설치류, 예를 들어 마우스 및 래트, 및 다른 실험 동물을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료되는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 억제하거나 완화하기 위해 또는 달리 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 제공하기 위해, 특히 선택된 항원에 대한 T 세포 반응을 향상시키기 위해 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 대상체-의존 변수 (예를 들어, 연령, 면역계 건강 등), 질환, 및 투여되는 치료와 같은 다양한 인자에 따라 변할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 "제약상 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물과 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 치료 조성물에서 그의 용도가 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물도 조성물 내에 혼입될 수 있다.

용어 "항체"는 무손상 분자, 및 항원-결합 부위를 포함하는 그의 단편을 모두 포함하는 의미이다. 전체 항체 구조는 종종 H₂L₂로서 제시되고, 항체가 통상적으로 2개의 경쇄 (L) 아미노산 및 2개의 중쇄 (H) 아미노산을 포함함을 의미한다. 두 사슬은 구조적으로 상보성인 항원성 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로 언급되고, 상이한 항원 특이성의 항체와 아미노산 서열이 상이하다는 특징을 갖는다. H 또는 L 사슬의 가변 영역은 항원성 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다. 이들 서열 내에, 상이한 특이성의 항체 사이의 극도의 가변성 때문에 "초가변"으로 불리는 보다 작은 서열이 존재한다. 상기 초가변 영역은 또한 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로 칭해진다. 이들 CDR 영역에 의해 특정 항원 결정 구조에 대한 항체의 기본적인 특이성이 나타난다. CDR은 가변 영역 내의 아미노산의 비-인접 스트레치 (stretch)를 나타내지만, 종과 무관하게, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 이들 중요한 아미노산 서열의 위치는 가변 사슬의 아미노산 서열 내의 유사한 위치에 대응하는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각의 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)에 대해 각각 서로 인접하지 않는 3개의 CDR 영역 (L1, L2, L3, H1, H2, H3으로 칭함)을 각각 갖는다. 허용되는 CDR 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]에 기재되어 있다. 또한, 본 발명에 따라 개시된 항체는 완전히 합성된 것일 수 있고, 여기서 항체의 폴리펩티드 사슬은 합성되고, 가능하게는 수용체로서 본원에 개시된 폴리펩티드에 대한 결합을 위해 최적화된다. 상기 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있고, 완전한 사량체 구조일 수 있거나, 또는 이량체로서 단일 중쇄 및 단일 경쇄만을 포함할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 면역 반응을 증가시키기 위해 증강제와 함께 투여될 때 T 세포, 바람직하게는 인간 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소 또는 폐지시키는 화합물을 포함하는, 포유동물에서 질환을 치료하기 위한 치료 요법 또는 조합 요법을 제공한다.

본 발명의 방법은 또한 광범위 면역조정물질 및 이들의 조성물의 용도에 관련된다. 일반적으로, 이들 방법에서 생성하는 증가된 T 세포 반응은 동일한 용량의 상기 PD-1 길항제 또는 상기 증강제 단독을 투여한 것으로부터 생성하는 임의의 증가된 T 세포 반응보다 더 크다.

개시된 조성물 및 요법은 T 세포를 수반하는 면역 반응을 자극 또는 향상시키기 위해 유용하다. 따라서, 본 발명의 방법은 질환이 감소된 T 세포 반응에 의해 특이적으로 유발되거나 악화되지 않더라도, T 세포 활성의 증가가 유익하고 증가된 T 세포 반응이 질환을 치료하기 위해 필요하거나 충분한 질환 상태를 치료하는데 가장 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 치료 또는 예방할 질환의 종류는 즉, 세포독성 T 림프구가 공격하는 악성 종양, 또는 세균, 바이러스, 원생동물, 기생충, 또는 다른 세포내 미생물 병원체에 의해 유발된 만성 감염성 질환이다. 개시된 조성물을 사용한 T 세포의 활성화는 면역억제를 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 또한 유리하다.

본 발명에 따라서, T 세포 반응은 T 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 분자 및 상기 수용체의 리간드에 결합하는 분자에 의해 조절될 수 있다. PD-1의 경우에, 그의 억제 효과를 감소시키도록 PD-1에 결합하는 분자 및/또는 PD-1에 결합하는 그들의 능력을 감소시키도록 하나 이상의 PD-1 리간드에 결합하는 분자는 T 세포 반응을 억제하는 PD-1의 능력을 감소시켜, 상기 반응 및 그의 면역학적 효과를 증가시키는 효과를 갖는다.

A. PD -1 수용체 길항제

PD-1 수용체의 길항제를 함유하는 조성물을 제공하고, 이는 PD-1의 리간드에 결합하고 차단하거나, PD-1 수용체에 대한 리간드의 결합을 저해 또는 억제하거나, PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 유도하지 않으면서 PD-1 수용체에 직접 결합하고 차단하는 화합물 또는 작용제를 포함한다. 다른 실시양태에서, PD-1 수용체 길항제는 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 직접 결합하고, 또한 PD-1 수용체의 리간드에 결합하여 리간드가 PD-1 수용체를 통한 신호 전달을 촉발하는 것을 감소 또는 억제한다. PD-1 수용체에 결합하고 억제 신호의 전달을 촉발하는 리간드의 수 및/또는 양을 감소시킴으로써, PD-1 신호 전달에 의해 전달된 음성 신호에 의해 몇몇 세포는 약화되고, 보다 강건한 면역 반응을 성취할 수 있다.

본 발명에 따라서, PD-1 신호 전달은 주요 조직적합 복합체 (MHC)에 의해 제시된 펩티드 항원에 매우 근접하게 PD-1 리간드 (예를 들어 B7-H1 또는 B7-DC)에 대한 결합을 요구한다 (예를 들어, 문헌 [Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)] 참조). 따라서, PD-1 및 T 세포막 상의 TCR의 동시-라이게이션을 방지하는 단백질, 항체 또는 소분자가 본 발명에서 고려되는 유용한 PD-1 길항제이다.

예시적인 PD-1 수용체 길항제는 그의 상동체 및 변이체를 포함한 B7-DC 폴리펩티드, 및 이들의 임의의 활성 단편, 및 이들 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 항체, 예를 들어 인간 IgG의 Fc 부분에 결합된 B7-DC의 가용형 부분을 포함하고, 인간 B7-DC의 막횡단 부분의 전부 또는 일부를 포함하지 않는다. PD-1 수용체 길항제는 또한 PD-1의 리간드 또는 PD-1 자체에 결합함으로써 PD-1 수용체 신호 전달을 감소 또는 저해하는 소분자 길항제 또는 항체일 수 있고, 특히 여기서 PD-1과 TCR의 동시-라이게이션이 그러한 결합에 이어지지 않아서, PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 촉발하지 않는다.

본원에서 제공되는 PD-1 수용체 길항제는 면역 반응-자극 치료제로서 생체 내에서 및 생체 외에서 일반적으로 유용하다. 일반적으로, 개시된 길항제 조성물은 대상체의 면역계가 면역 반응에 착수하는 임의의 질환 또는 장애가 있거나 상기 질환 또는 장애에 소인이 있는 대상체를 치료하기 위해 유용하다.

1. B7- DC 폴리펩티드

특정 실시양태에서, B7-DC 단백질은 PD-1 수용체 길항제로서 사용될 수 있다. B7-DC는 PD-1의 천연 리간드이고, B7-H1보다 더 큰 친화도로 PD-1에 결합하고, 따라서 B7-H1:PD-1 상호작용을 억제할 수 있다. 그의 변이체, 상동체 및 단편을 포함한 적합한 B7-DC 폴리펩티드는 내인성 신호 펩티드를 갖거나 (서열 1) 갖지 않는 (서열 2) 다음 전장 인간 B7-DC 폴리펩티드로부터 얻을 수 있다.

막 근위 불변 IgC 도메인 및 막 원위 IgV 도메인을 갖는 B7 패밀리의 분자, 예를 들어 B7-DC는 세포 표면에서 발현된다. 이들 리간드에 대한 수용체는 공통의 세포외 IgV-유사 도메인을 공유한다. 수용체-리간드 쌍의 상호작용은 주로 리간드의 IgV 도메인 및 수용체 내의 잔기들을 통해 매개된다. 일반적으로, IgV 도메인은 각각 β-가닥의 층을 포함하는 2개의 시트를 갖는 것으로서 설명된다. 이들 β-가닥은 A', B, C, C', C", D, E, F 및 G로서 칭해진다. 상기 폴리펩티드의 구조는 문헌에 설명되었다 ([Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008)] 참조).

막횡단 단백질인 B7-DC은 그의 단량체 형태에서, 분자의 세포외 부분 (세포외 도메인, 또는 ECD)를 구성하는 IgV 및 IgC 도메인을 포함하고, 여기서 IgV-유사 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로, 본 발명의 방법에서 언급된 PD-1 결합 및 다른 기능을 담당한다. 인간 단백질에 대해, IgV 도메인은 B 및 F 가닥 (상기 언급된)을 연결하는 디술피드 결합을 갖는 것을 특징으로 하고, 이것은 많은 IgV 도메인의 특징인 것으로 보이고 B7-1 및 B7-2 둘 모두의 IgV 도메인과 유사한 3차원 구조를 갖는다 ([Molnar et al.(2008), 상기 문헌] 참조).

한 실시양태에서, B7-DC 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 이들 β-가닥 내에 아미노산 변경 (즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 임의의 가능한 조합으로 함유한다. 다른 실시양태에서, B7-DC 변이체는 A', C, C', C", D, E, F 또는 G β-가닥 내에 하나 이상의 아미노산 변경 (즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 함유한다. 바람직한 실시양태에서, B7-DC 변이체는 G β-가닥 내에 하나 이상의 아미노산 변경을 함유한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgC 및 IgV 도메인을 함유한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgV 도메인을 포함한다.

인간 및 마우스 B7-DC 단백질은 짧은 세포질내 도메인, 단일 막횡단 도메인 및 세포외 도메인을 함유한다. 세포외 도메인은 2개의 Ig 도메인; 막 근위 IgC 도메인 및 막 원위 IgV 도메인을 함유한다. 변이체 B7-DC 폴리펩티드의 유용한 단편은 가용형 단편을 포함한다. 가용형 B7-DC 단편은 생산 세포로부터 흘러나오거나 분비되거나 달리 추출될 수 있는 B7-DC의 단편이다. 한 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 전체 세포외 도메인을 포함한다. B7-DC의 세포외 도메인은 뮤린 또는 인간 B7-DC 또는 그의 활성 단편의 약 20 내지 약 아미노산 221로부터의 아미노산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgC 및 IgV 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgV 도메인을 포함한다.

PD-1 신호 전달은 주요 조직적합 복합체 (MHC)에 의해 제시된 펩티드 항원에 매우 근접하게 PD-1 리간드 (대개 B7-H1)에의 결합을 요구하는 것으로 생각된다 (Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)). 따라서, PD-1 및 T 세포막 상의 TCR의 동시-라이게이션을 방지하는 단백질, 항체 또는 소분자는 본 발명에서 고려되는 유용한 PD-1 길항제이다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 PD-1 길항제는 ECD를 포함하는 B7-DC 단백질의 단편을 포함한다. 별법으로, B7-DC의 단편은 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 저해하거나 방지하거나 달리 감소시키도록 PD-1 수용체에 결합하기에 충분한, IgV 또는 IgV-유사 도메인의 세포외 도메인의 일부, 바람직하게는 아미노산 20-221, 보다 바람직하게는 20-121을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, B7-DC 단편은 PD-1 수용체에 대한 결합을 위해 B7-H1과 경쟁한다.

한 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 PD-1에 대한 결합을 위해 중요한 폴리펩티드의 영역을 함유할 수 있다. 이들 폴리펩티드 단편은 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고, 천연 B7-DC가 PD-1에 결합하는 것을 방지하기 위해 유용할 수 있다. B7-H1 및 B7-DC와 PD-1과의 상호작용을 억제하면 그렇지 않으면 일어날 면역 반응의 억압을 억제하므로, PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁함으로써 이들 단편은 면역 반응을 향상시키기 위해 유용할 수 있다. PD-1에 경쟁적으로 결합할 수 있는 마우스 또는 인간 B7-DC의 폴리펩티드 단편은 예를 들어, 아미노산 101-108 또는 110-114를 함유할 수 있다. PD-1에 대한 야생형 B7-DC의 결합은, 상기 야생형 B7-DC의 단편의 부재 하의 PD-1에 대한 야생형 B7-DC의 결합 수준에 비해 일반적으로 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 또는 95% 초과로 억제된다. 본 발명의 방법 및/또는 조성물에서 유용한 예시적인 B7-DC 단편은 다음 B7-DC 세포외 도메인들을 포함하고 어떠한 방식으로도 이로 제한되지 않는다:

인간 B7-DC 세포외 도메인 (ECD):

및 뮤린 B7-DC ECD:

시노몰구스 원숭이 B7-DC ECD:

본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 많은 다른 영장류 서열은 문헌 [Onlamoon et al., Immunology, Vol. 124, pp. 277-293 (2008)]에 제공되어 있다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 PD-1 길항제는 또한 제1 및 제2 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질 (아래 설명됨)을 포함하고, 여기서 상기 융합 단백질 또는 그의 적어도 제1 폴리펩티드 부분은 PD-1 길항제 활성을 보유하고, 특히 여기서 상기 융합 단백질은 PD-1에 결합하고 차단하거나 PD-1의 리간드에 결합하고 차단한다. 상기 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 임의의 PD-1 길항제 폴리펩티드, 또는 본 발명의 방법에서 PD-1 길항제로서 사용하기 위해 본원에서 달리 언급되는 그의 PD-1 결합 단편을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 상기 융합 단백질의 바람직한 실시양태에서, 언급된 제1 폴리펩티드 부분은 언급된 제2 폴리펩티드 부분에 대해 N-말단이다. 별개의 실시양태에서, 언급된 제1 폴리펩티드 부분은 언급된 제1 및 제2 폴리펩티드 부분을 포함하는 아미노산에 추가로 올리고펩티드에 의해 언급된 제2 폴리펩티드 부분에 연결되고, 여기서 상기 연결 아미노산은 상기 융합 단백질의 PD-1 길항제 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다.

바람직한 이량체성 융합 단백질에서, 이량체는 이량체화된 정상 Ig 중쇄 내에서 디술피드 연결되는 동일한 Cys 잔기들인, 2개의 Ig 중쇄의 CH 영역 내의 Cys 잔기들의 공유 결합으로부터 생성한다.

융합 단백질 결합 파트너 (partner)로서 통상적으로 사용되는 매우 많은 폴리펩티드 서열이 당업계에 공지되어 있다. 유용한 폴리펩티드 결합 파트너의 예는 초록 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 폴리히스티딘, myc, 헤마글루티닌, Flag™ 태그 (코닥 (Kodak), 미국 코네티컷주 뉴 헤이븐), 말토스 E 결합 단백질 및 단백질 A를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

또 다른 실시양태는 변이체 B7-DC 폴리펩티드의 세포외 도메인에 융합된 BirA 기질을 갖는 사량체 구성체를 제공한다. 사량체 구성체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 ([Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006)] 참조).

예시적인 뮤린 B7-DC 융합 단백질은 뮤린 IgG2a (CAA49868)의 아미노산 237-469에 융합된 뮤린 B7-DC의 아미노산 20-221을 함유한다. 하나의 비-제한적인 예에서, 인간 B7-DC 융합 단백질은 인간 IgG1 (AAA02914)의 아미노산 245-476에 융합된 인간 B7-DC의 아미노산 20-221을 함유한다. B7-DC 융합 단백질에 대한 신호 펩티드는 숙주로부터 융합 단백질의 분비를 용이하게 하는 내인성 신호 펩티드 또는 임의의 다른 신호 펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 IgV 도메인만을 포함할 것이다. 다른 실시양태는 IgG 항체, 예를 들어 IgG1의 힌지 및 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 가변 영역은 존재하지 않는다. 다른 실시양태는 특히 효과기 기능을 감소시키는 N297Q 또는 다른 돌연변이를 갖는, IgG2 또는 IgG4의 힌지 및 Fc 영역의 사용을 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물에 따라, PD-1 길항제로서 유용한 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제로서 유용한 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 서열 1의 아미노산 1-221, 바람직하게는 서열 1의 아미노산 20-221, 또는 서열 1의 아미노산 26-221, 또는 서열 3 또는 4의 아미노산 1-202, 보다 바람직하게는 서열 1의 아미노산 20-121 또는 서열 3 또는 4의 아미노산 1-102에 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, PD-1 길항제로서 유용한 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제로서 유용한 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 서열 1의 아미노산 1-221로 이루어지거나, 서열 1의 아미노산 20-221로 이루어지거나, 서열 1의 아미노산 26-221로 이루어지거나, 서열 3 또는 4의 아미노산 1-202로 이루어진다. 한 실시양태에서 (서열 2), 이는 서열 1의 아미노산 1-19를 포함하지 않는다.

다른 특정 예에서, PD-1 길항제 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 서열 1의 아미노산 서열 20-121을 포함하고, 바람직하게는 여기서 그의 잔기 110-114에서 아미노산 서열 WDYKY를 포함하거나, 서열 3의 아미노산 1-102를 포함하고, 바람직하게는 그의 잔기 91-95에서 아미노산 서열 WDYKY를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 그러한 동일성%는 본원에서 규정된 바와 같은 보존적 아미노산 치환에 의지하여 달성된다.

상기 한 실시양태에서, PD-1 길항제 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 서열 1의 아미노산 1-19를 포함하지 않거나, PD-1 리간드 또는 다른 PD-1 길항제 단백질의 막횡단 도메인의 어떠한 부분도 포함하지 않고, 특히 전체 상기 도메인을 포함하지 않거나, 세포내 (또는 가용형) 도메인의 어떠한 부분도 포함하지 않고, 특히 전체 상기 도메인을 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 상기 길항제, 또는 제1 폴리펩티드 부분은 서열 1의 세포외 도메인 (ECD)만을 포함하고, 따라서 상기 서열의 폴리펩티드의 가용형 부분, 또는 상기 가용형 부분의 단편만으로 이루어진다.

다른 실시양태에서, PD-1 길항제 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분은 PD-1 리간드의 IgV 도메인 또는 IgV-유사 도메인, 또는 그의 PD-1 결합 단편을 포함하거나, PD-1 리간드의 IgV 도메인 또는 IgV-유사 도메인, 또는 그의 PD-1 결합 단편으로 이루어진다. 특정 예에서, 상기 PD-1 리간드는 야생형 B7-DC 또는 B7-H1 분자, 바람직하게는 마우스 또는 영장류, 바람직하게는 인간, 야생형 B7-DC 또는 B7-H1 분자이다.

다른 실시양태에서, PD-1 길항제 폴리펩티드, 또는 PD-1 길항제 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분, PD-1 리간드의 IgV 도메인 또는 IgV-유사 도메인의 PD-1 결합 단편, 특히 IgV 도메인 또는 IgV-유사 도메인은 서열 1의 아미노산 20-121 또는 서열 3의 아미노산 1-102로 이루어진다.

본 발명의 PD-1 길항제는 또한 서열 1 (인간 전장)의 아미노산 20-121 또는 서열 3 (세포외 도메인 또는 ECD)의 아미노산 1-102의 PD-1 결합 단편을 포함한다.

그의 구체적 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 PD-1 결합 단편은 또한 서열 1의 잔기 110-114에서 아미노산 WDYKY, 또는 서열 3의 잔기 91-95에서 WDYKY를 포함한다. 비-제한적인 예로서, 상기 PD-1 결합 단편은 서열 1의 아미노산 20-121의 서열의 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 75, 또는 적어도 80, 또는 적어도 85, 또는 적어도 90, 또는 적어도 95, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하고, 여기서 각각의 상기 PD-1 결합 단편의 바람직한 실시양태는 하위 단편으로서, 서열 1의 잔기 110-114에서 발견되는 아미노산 WDYKY 또는 서열 3의 잔기 91-95에서 WDYKY를 포함할 것이다.

본 발명에서 구체적으로 고려되는 다른 바람직한 폴리펩티드 및 PD-1 결합 단편은 서열 1 (인간 전장)의 아미노산 20-121의 폴리펩티드 서열 및 그의 PD-1 결합 단편을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 PD-1 결합 단편 내에서 시스테인은 잔기 42 및/또는 102에 존재하고, 여기서, 두 위치 모두에서 시스테인이 존재하는 것이 바람직하고/하거나, 페닐알라닌은 잔기 21에 존재하고/하거나 글루탐산은 잔기 28에 존재하고/하거나, 트레오닌, 및/또는 글루타민은 잔기 60에 존재하고/하거나, 글루탐산은 잔기 101에 존재하고/하거나, 이소류신은 잔기 103에 존재하고/하거나, 이소류신은 잔기 105에 존재하고/하거나, 글라이신은 잔기 107에 존재하고/하거나, 발린은 잔기 108에 존재하고/하거나, 트립토판은 잔기 110에 존재하고/하거나, 아스파르트산은 잔기 111에 존재하고/하거나, 티로신은 잔기 112에 존재하고/하거나, 라이신은 잔기 113에 존재하고/하거나, 티로신은 잔기 114에 존재하고, 단, PD-1 결합 단편의 경우에, 상기 단편은 그러한 아미노산 위치를 포함하도록 충분히 크다.

본 발명에서 구체적으로 고려되는 추가의 바람직한 폴리펩티드 및 PD-1 결합 단편은 서열 3 (인간 ECD) 또는 서열 4 (뮤린 ECD)의 아미노산 1-102의 폴리펩티드 서열 및 그의 PD-1 결합 단편을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 PD-1 결합 단편 내에서, 시스테인은 잔기 23 및/또는 83에 존재하고, 여기서 두 위치 모두에 시스테인이 존재하는 것이 바람직하고/하거나 페닐알라닌은 잔기 2에 존재하고/하거나, 글루탐산은 잔기 9에 존재하고/하거나, 트레오닌 또는 아르기닌은 잔기 37에 존재하고, 여기서 트레오닌이 바람직하고/하거나 글루타민은 잔기 41에 존재하고/하거나, 아르기닌은 잔기 82에 존재하고/하거나, 류신은 잔기 84에 존재하고/하거나, 이소류신은 잔기 86에 존재하고/하거나, 글라이신은 잔기 88에 존재하고/하거나, 알라닌은 잔기 89에 존재하고/하거나, 트립토판은 잔기 91에 존재하고/하거나, 아스파르트산은 잔기 92에 존재하고/하거나, 티로신은 잔기 93에 존재하고/하거나, 라이신은 잔기 94에 존재하고/하거나, 티로신은 잔기 95에 존재하고, 단, PD-1 결합 단편의 경우에, 상기 단편은 그러한 아미노산 위치를 포함하도록 충분히 크다.

추가의 실시양태에서, 임의의 상기 폴리펩티드는 마우스 또는 영장류, 바람직하게는 인간의 것과 같은 B7-DC 또는 B7-H1 폴리펩티드의 신호, 막횡단 또는 C-말단 도메인으로부터의 부분 또는 단편, 예를 들어, 1 내지 10개의 인접하는 아미노산을 또한 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드 및/또는 PD-1 결합 단편은 또한 본 발명의 임의의 융합 단백질 내에 존재할 수 있고, 예를 들어, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 PD-1 결합 단편은 상기 융합 단백질의 "제1 폴리펩티드"를 나타낸다.

구체적인 예에서, 증강제와 조합하여 본 발명의 치료 요법에 사용하기 위한 분자는 서열 1의 아미노산 20-221의 PD-1 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 서열 1의 아미노산 20-121을 포함하고, 바람직하게는 여기서 단편은 서열 1의 아미노산 110-114를 함유한다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 상기 단편이 존재하고 (본원에서 설명한 바와 같이), 분자는 B7-DC 단백질의 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 단편을 포함하고, 특히 여기서 단편은 서열 1의 아미노산 20-221의 일부이거나 그의 일부를 함유한다. 그의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 단편은 서열 1의 아미노산 20-121로부터의 것이고, 보다 바람직하게는 여기서 적어도 하나의 상기 단편은 서열 1의 아미노산 110-114 (즉, 서열 WDYKY (서열 14))을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 결합 단편은 적어도 10, 또는 적어도 25, 또는 적어도 50, 또는 적어도 75, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산 길이를 포함한다.

내인성 인간 신호 펩티드는 서열 MIFLLLMLSL ELQLHQIAA (서열 5)을 갖고, 서열 1의 처음 19개의 아미노산을 나타낸다. 특정 실시양태에서, B7-DC의 폴리펩티드 단편은 내인성 또는 이종성 신호 펩티드 (형질전환된 세포에서의 발현 및 분비에 의해 재조합 B7-DC 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 인접하는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, B7-DC 단편이 PD-1 수용체를 길항하는 능력을 보유하는 한, 유용한 B7-DC 폴리펩티드는 B7-DC의 막횡단 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 인접하는 아미노산, 및/또는 세포질 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 인접하는 아미노산, 또는 그의 조합을 포함할 수 있음이 또한 이해될 것이다.

PD-1-/- 마우스의 표현형은 PD-1이 생체 내에서 면역 반응의 음성 조절자라는 직접적인 증거를 제공한다. PD-1의 부재 하에, C57BL/6 배경 상의 마우스는 루푸스-유사 사구체신염 및 진행성 관절염을 서서히 발병한다 (Nishimura, et al., Immunity, 11:141-151 (1999)). BALB/c 배경 상의 PD-1-/- 마우스는 치명적인 자가면역 확장성 심근병증을 급속하게 발병한다 (Nishimura, et al., Science. 291:319-322 (2001)). 그러나, 실질적인 증거는 B7-DC가 T 세포 반응을 활성화하는 것을 보조자극하는 기능을 할 수 있음을 나타낸다. 최적 미만의 TCR 신호의 존재 하에, B7-DC는 시험관 내에서 시토카인의 증가된 증식 및 생산을 일으킨다 (Tseng, et al., J. Exp. Med. 193:839-846 (2001)). 다른 한편으로, 시험관내 연구는 T 세포 반응에서 B7-DC에 대한 음성 조절 역할을 나타낸다. 이들 겉보기에 모순되는 데이타는 PD-1 이외의 T 세포 상에서 B7-DC에 대한 추가의 수용체의 발현에 의해 최상으로 해석된다.

따라서, B7-DC 단백질, 그의 변이체, 단편 및 융합체는 PD-1 매개된 억제 신호 전달을 방지함으로써 T 세포 반응을 향상시키는 것에 추가로, T 세포를 활성화시키는 미지의 수용체에 결합함으로써 T 세포 반응을 직접 향상시키는 잇점을 가질 수 있다.

2. B7- H1 폴리펩티드

다른 실시양태에서, 본 발명의 치료 요법에서 증강제와 조합으로 사용하기 위한 화합물은 바람직하게는 마우스 또는 영장류, 바람직하게는 인간으로부터의 포유동물 B7-H1의 단편이거나 그를 포함하고, 여기서 상기 단편은 PD-1에 결합하고 차단하지만 PD-1을 통한 억제 신호 전달을 일으키지 않고, 상기 단편은 적어도 10, 또는 적어도 20, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 50, 또는 적어도 60, 또는 적어도 70, 또는 적어도 80, 또는 적어도 90, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산 길이이다. 다른 실시양태에서, 단편은 PD-1에 결합하는 기능을 갖지만 감소된 T 세포 증식을 일으키는 억제 신호 전달을 생성하지 않는 한 가변적인 길이의 것일 수 있다. 상기 B7-H1 단편은 또한 본 발명의 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분의 일부로서 사용된다. B7-H1 서열은 다음과 같다:

인간 B7-H1 폴리펩티드 (서열 16):

뮤린 B7-H1 (서열 17)

붉은털 원숭이 (Macaca mulatta) PD-L1 (서열 18)

B7-H1-Ig 단백질은 WO/2001/014557 (2001년 3월 1일 공개) 및 WO/2002/079499 (2002년 10월 10일 공개)에 기재되어 있다.

3. PD -1 및 다른 폴리펩티드

본 발명의 다른 유용한 폴리펩티드는 PD-1 수용체의 리간드에 결합하는 것을 포함한다. 이들은 PD-1 수용체 단백질 또는 그의 가용형 단편을 포함하고, 이는 PD-1 리간드, 예를 들어 B7-H1 또는 B7-DC에 결합하고, 내인성 PD-1 수용체에 대한 결합을 방지하여, 억제 신호 전달을 방지할 수 있다. B7-H1은 또한 단백질 B7.1에 결합하는 것으로 나타났다 (Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). 또한, 상기 단편은 천연 리간드에 대한 결합을 증가시키는 돌연변이, 예를 들어 A99L 돌연변이를 포함하는 PD-1 단백질의 가용형 ECD 부분을 포함한다 (Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1)) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008)). B7-H1 리간드에 결합하고 내인성 PD-1 수용체에 대한 결합을 방지하여, 억제 신호 전달을 방지할 수 있는 B7-1 또는 그의 가용형 단편이 또한 유용하다.

본 발명의 방법에 유용한 PD-1 폴리펩티드는 다음과 같다:

인간 PD-1 (서열 19)

시노몰구스 원숭이 PD-1 (서열 20)

본 발명에 따라서, B7-1 및 그의 단편은 또한 B7-H1에 결합하고 B7-H1을 통해 억제성 신호를 T 세포에 전달할 수 있으므로, 상기 상호작용의 차단은 또한 B7-H1을 통해 일어나는 억제 신호 전달을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 화합물은 상기 종류의 상호작용을 차단하는 분자이다. 상기 분자는 문헌 [Butte et al. (2007) 상기 문헌]에 개시되어 있고, B7-H1:B7-1 및 B7-H1:PD-1 상호작용을 차단하는 이중-특이성을 갖는 항-B7-H1 항체, 및 PD-L1:B7-1 상호작용을 차단하는 단일-특이성을 보이는 항체를 포함한다. B7-1을 차단함으로써 상기 상호작용을 차단하는 화합물은 또한 유용하고 항-B7-1 항체를 포함한다.

4. 변이체 폴리펩티드

설명된 바와 같은 본 발명에서 유용한 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 함유하도록 돌연변이된 것을 포함한다. 돌연변이유발 방법은 당업계에 공지되어 있다. 돌연변이된 또는 변이체 폴리펩티드는 PD-1의 리간드에 결합함으로써 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 억제 또는 감소시킨다. 별법으로, 변이체 (예를 들어, B7-DC 폴리펩티드)는 PD-1 수용체에 결합하고, PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 억제하거나 감소시키거나 차단할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 임의의 종에서 기원된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 포유동물 종에서 유래한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 뮤린 또는 영장류, 바람직하게는 인간 기원의 것이다.

한 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 야생형 또는 비-변이체 B7-DC와 동일한 PD-1에 대한 결합 친화도를 갖지만 비-돌연변이된 B7-DC 폴리펩티드에 비해 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 촉발하는 능력을 갖지 않거나 10% 미만으로 갖는 B7-DC 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드는 PD-1 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 야생형 B7-DC보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 초과의 PD-1에 대한 결합 친화도를 갖는다.

변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 B7-DC 폴리펩티드)는 PD-1 길항 활성이 야생형에 비해 실질적으로 감소되지 않는 한, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합을 갖는 것을 포함한다. 그러나, 그러한 감소가 있으면, 상기 변이체가 야생형 단백질의 PD-1 길항제 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%를 갖도록 (여기서 적어도 100%가 특히 바람직하다) 감소는 야생형의 1/2 이하이어야 한다. 상기 변이체로부터 생성되는 그러한 활성의 증가가 훨씬 더 바람직하다. 한 실시양태에서, 단리된 B7-DC 변이체 폴리펩티드는 그들의 아미노산 서열이 특히 포유동물, 바람직하게는 야생형 뮤린 또는 야생형 영장류, 바람직하게는 인간, B7-DC 폴리펩티드로부터 야생형 B7-DC 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 공유하도록 아미노산 변경을 가진다.

폴리펩티드 서열 동일성은 상기 제공되는 % 동일성의 정의를 이용하여 계산할 수 있다.

폴리펩티드 내의 아미노산 치환은 "보존적" 또는 "비-보존적"일 수 있다.

막 근위 불변 IgC 도메인 및 막 원위 IgV 도메인을 갖는 B7 패밀리의 분자, 예를 들어 B7-DC은 세포 표면에서 발현된다. 이들 리간드에 대한 수용체는 공통의 세포외 IgV-유사 도메인을 공유한다. 수용체-리간드 쌍의 상호작용은 주로 리간드의 IgV 도메인 및 수용체 내의 잔기들을 통해 매개된다. 일반적으로, IgV 도메인은 각각 β-가닥의 층을 포함하는 2개의 시트를 갖는 것으로서 설명된다. 이들 β-가닥은 A', B, C, C', C", D, E, F 및 G로서 칭해진다. 한 실시양태에서, B7-DC 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 이들 β-가닥 내에 아미노산 변경 (즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 임의의 가능한 조합으로 함유한다. 다른 실시양태에서, B7-DC 변이체는 A', C, C', C", D, E, F 또는 G β-가닥 내에 하나 이상의 아미노산 변경 (즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 함유한다. 한 실시양태에서, B7-DC 변이체는 G β-가닥 내에 하나 이상의 아미노산 변경을 함유한다.

뮤린 또는 영장류, 바람직하게는 인간에 관하여, B7-DC (변이체 B7-DC 폴리펩티드)는 비제한적으로, 비-돌연변이된 B7-DC에 비해 PD-1에 대한 결합을 실질적으로 감소시키지 않는 위치에서 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다.

그러나, 언급된 아미노산 위치에서 치환은 임의의 아미노산 또는 아미노산 유사체를 사용하여 이루어질 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 언급된 위치에서 치환은 임의의 천연-발생 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 아르기닌, 시스테인, 글라이신, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 류신, 발린, 이소류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 트레오닌, 세린, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신)을 사용하여 이루어질 수 있다.

본원에 기재된 치환은 마우스 및 영장류, 특히 인간, B7-DC에 관한 것이지만, 당업자는 다른 종 (예를 들어, 래트, 햄스터, 기니 돼지, 게르빌루스쥐, 토끼, 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 소 또는 비-인간 영장류)으로부터 대응하는 폴리펩티드에서 동등한 변경을 쉽게 이룰 수 있음에 주목한다.

바람직한 단편은 PD-1에 결합하기에 효과적인 B7-DC의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.

한 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 PD-1 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1에 결합하는 능력을 보유하는 것이다. 하나의 실시양태는 전장 B7-DC의 단편이고 일반적으로 전장 변이체 B7-DC 폴리펩티드의 PD-1 길항제 활성을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, 또는 심지어 100% 초과로 갖는 변이체 B7-DC 폴리펩티드를 제공한다.

변이체 B7-DC 폴리펩티드의 유용한 단편은 가용형 단편을 포함한다. 가용형 B7-DC 단편은 생산 세포로부터 흘러나오거나 분비되거나 달리 추출될 수 있는 B7-DC의 단편이다. 한 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 전체 세포외 도메인을 포함한다. B7-DC의 세포외 도메인은 뮤린 또는 영장류, 바람직하게는 인간 B7-DC의 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 221을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgC 및 IgV 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 B7-DC의 IgV 도메인을 포함한다.

한 실시양태에서, 변이체 B7-DC 폴리펩티드 단편은 PD-1에 대한 결합 친화도에 중요한 폴리펩티드의 영역을 함유한다. 이들 폴리펩티드 단편은 천연 리간드가 PD-1 수용체에 결합하는 것을 방지하여, 면역 반응을 향상시키기 위해 PD-1 수용체에 결합하고 차단하기 위해 유용하다. 천연 B7-H1 또는 B7-DC와 PD-1의 상호작용을 억제하면 그렇지 않으면 일어날 면역 반응의 억압을 억제한다. PD-1에 결합하는 마우스 또는 영장류, 바람직하게는 인간 B7-DC의 폴리펩티드 단편은 비-제한적인 예로써, 아미노산 101-105, 또는 111-113을 함유한다. B7-H1의 PD-1 수용체에 대한 결합은 일반적으로 단편의 부재 하의 B7-H1의 PD-1에 대한 결합 수준에 비해 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 그 초과로 억제된다.

인간 PD-1 돌연변이체 A99L은 돌연변이되지 않은 인간 PD-1보다 더 큰 친화도로 B7-DC 및 B7-H1에 결합한다 (Lazar Molnar et al. PNAS 105 p. 10483-10488 (2008)). 본 발명의 한 실시양태에서, 억제 신호 전달을 감소시키는 작용을 하는 화합물은 상기 돌연변이를 포함하는 PD-1의 ECD와 같은 가용형 단백질이다.

5. 변형된 폴리펩티드

설명되는 바와 같이, 그의 변이체, 상동체 및 단편을 포함한 본 발명에서 유용한 폴리펩티드는 정상 세포 환경에서 폴리펩티드와 연관된 것으로 발견되는 화학적 모이어티 (moiety)에 의해, 예를 들어, 폴리펩티드의 인산화, 메틸화, 아미드화, 황산화, 아실화, 당화, 수모일화 (sumoylation) 및 유비퀴틸화 (ubiquitylation)에 의해 변형될 수 있다.

상기 폴리펩티드는 또한 정상적으로 세포 환경 내에서 폴리펩티드의 일부가 아닌 화학적 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 그러한 변형은 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다. 다른 유용한 변형은 단백질의 고리화이다. 그러한 변형은 또한 방사성 동위원소 및 형광 화합물을 포함하고 이로 제한되지 않는, 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 표지의 도입을 포함한다.

폴리펩티드의 화학적 유도체의 예는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물로 유도체화한 라이시닐 및 아미노 말단 잔기를 포함한다. 환식 카르복실산 무수물을 사용한 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과가 있다. 아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로히드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4 펜탄디온; 및 글리옥실레이트를 사용한 트랜스아미나제-촉매 반응을 포함한다. 카르복실 측쇄기, 아스파르틸 또는 글루타밀은 카르보디이미드 (R-N=C=N-R'), 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형될 수 있다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모니아와의 반응에 의해 아스파르기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 L-아미노산을 대체하는 하나 이상의 D-아미노산을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 증강제, 예를 들어 CTX는 증강제가 본 발명의 PD-1 길항제에 화학적으로 연결되는 경우에서와 같이, 자체가 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물의 일부일 수 있다.

6. 융합 단백질

(i) 제2 폴리펩티드에 직접 융합된, 또는 (ii) 임의로 제2 폴리펩티드에 융합된 링커 (linker) 펩티드 서열에 융합된, 제1 융합 파트너 또는 PD-1 길항제 단백질, 예를 들어, B7-DC 폴리펩티드 (변이체, 상동체 및 그의 단편 포함)의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드 부분을 갖는 융합 폴리펩티드를 또한 제공한다. 융합 파트너의 존재는 예를 들어, PD-1 길항제 폴리펩티드의 용해도, 친화도 및/또는 결합가 (valency)를 변경할 수 있다. 개시된 융합 단백질은 상기한 바와 같이 PD-1 길항제 폴리펩티드의 아미노산 변경 (즉, 치환, 결실 또는 삽입), 단편, 및/또는 변형의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, B7-DC 융합 단백질은 제1 결합 파트너로서 B7-DC 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 그러한 B7-DC 융합 단백질은 제1 결합 파트너로서 B7-DC 단백질의 IgV 및 IgC 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변이체 B7-DC 융합 단백질은 제1 결합 파트너로서 B7-DC 단백질의 IgV 도메인을 포함한다.

대표적인 제1 융합 파트너는 영장류, 바람직하게는 인간 또는 뮤린 B7-DC 폴리펩티드, 그의 단편, 및 상기 개시된 그의 변이체를 포함한다. 바람직한 단편은 B7-DC의 세포외 도메인을 포함한다. 언급된 바와 같이, 세포외 도메인은 신호 펩티드의 1-10개의 인접하는 아미노산, B7-DC 막횡단 도메인, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 생성물 및/또는 방법에서는 다른 폴리펩티드에 결합되어, PD-1 리간드, 예를 들어 B7-H1에 결합하여 리간드가 PD-1과 상호작용하는 것을 억제함으로써 PD-1 수용체에 길항하는 융합 단백질을 형성하는 PD-1 수용체 길항제, 특히 폴리펩티드 (그의 변이체, 상동체 및 단편 포함)을 이용한다. 다른 실시양태에서, PD-1 수용체 길항제 폴리펩티드, 또는 그의 변이체는 다른 폴리펩티드에 결합되어, PD-1 수용체에 결합하고 차단함으로써 PD-1 수용체에 길항하고 PD-1을 통한 억제 신호 전달을 억제 또는 감소시키는 융합 단백질을 형성한다.

제2 폴리펩티드 결합 파트너, 또는 제2 폴리펩티드 부분은 PD-1 길항제 폴리펩티드에 비해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 PD-1 길항제 폴리펩티드에 C-말단이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물 및/또는 생성물에서 사용하기 위해 고려되는 융합 단백질은 적어도 항체의 일부를 포함한다. 분자 생물학 및 재조합 기술의 방법의 발전으로, 재조합 수단에 의해 항체 분자를 생산하고 그에 의해 항체의 폴리펩티드 구조 내에서 발견되는 특이적 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열을 생성하는 것이 이제 가능하다. 상기 항체는 상기 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 유전자 서열을 클로닝함으로써 또는 상기 폴리펩티드 사슬의 직접 합성 및 합성된 사슬의 시험관내 조립에 의해 특이적 에피토프 및 항원 결정인자에 대한 친화도를 갖는 활성 사량체 (H₂L₂) 구조를 형성함으로써 생산할 수 있다. 이것은 상이한 종 및 공급원으로부터 중화 항체의 특징적인 서열을 갖는 항체의 신속한 생산을 허용하였다.

항체의 공급원, 또는 재조합 방식으로 구성된 방식, 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서, 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어 소, 염소 및 양을 사용하여, 실험실 또는 공업 규모의 큰 세포 배양액을 사용하여, 생물반응기 내에서, 또는 임의의 공정 단계에서 살아있는 유기체를 사용하지 않는 직접 화학 합성에 의하여 합성된 방식에 무관하게, 모든 항체는 유사한 전체 3차원 구조를 갖는다. 상기 구조는 종종 H₂L₂로서 제공되고, 항체는 일반적으로 2개의 경쇄 (L) 아미노산 및 2개의 중쇄 (H) 아미노산을 포함한다는 사실을 나타낸다. 두 사슬은 구조적으로 상보성인 항원성 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로 칭하고, 상이한 항원 특이성의 항체들로부터 아미노산 서열 차이를 특징으로 한다.

바람직한 실시양태에서, PD-1 수용체 길항제 폴리펩티드 (단편, 돌연변이체 및 다른 변이체 포함)는 (i) 제2 폴리펩티드에 직접 융합된, 또는 (ii) 임의로 제2 폴리펩티드에 융합된 링커 펩티드 서열에 융합된, B7-DC 단백질 또는 그의 변이체의 전부 또는 일부를 갖는 제1 융합 파트너를 갖는다. 융합 파트너의 존재는 B7-DC 폴리펩티드의 용해도, 친화도 및/또는 결합가를 변경할 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, B7-DC 폴리펩티드는 Ig 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 도메인에, 보다 바람직하게는 인간 면역글로불린 Cγ1 사슬의 힌지, C_H2 및 C_H3 영역에 또는 뮤린 면역글로불린 Cγ2a 사슬의 힌지, C_H2 및 C_H3 영역에 상응하는 아미노산 서열에 융합된다. 바람직한 실시양태에서, 불변 영역은 바람직하게는 Fc 수용체 결합을 제거 또는 감소시키는 돌연변이 (예를 들어 N297Q)를 포함한다.

인간 면역글로불린 Cγ1 사슬의 힌지, C_H2 및 C_H3 영역은 다음 아미노산 서열을 갖는다:

뮤린 면역글로불린 Cγ2a 사슬의 힌지, C_H2 및 C_H3 영역은 다음 아미노산 서열을 갖는다:

예시적인 뮤린 B7-DC 융합 단백질은 뮤린 IgG2a (CAA49868)의 아미노산 237-469에 융합된 뮤린 B7-DC의 아미노산 20-221을 포함한다. 인간 B7-DC 융합 단백질은 인간 IgG1 (AAA02914)의 아미노산 245-476에 융합된 인간 B7-DC의 아미노산 20-221을 포함할 수 있다. B7-DC 융합 단백질에 대한 신호 펩티드는 숙주로부터 융합 단백질의 분비를 용이하게 하는 내인성 신호 펩티드 또는 임의의 다른 신호 펩티드일 수 있다.

대표적인 뮤린 B7-DC-Ig 융합 단백질은 서열 8의 핵산 서열에 의해 코딩된다.

개시된 핵산 서열은 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 융합 단백질을 합성하기 위해 발현 수준을 증가시키기 위해서 코돈이 최적화될 수 있음이 이해될 것이다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

서열 8에 의해 코딩되는 뮤린 B7-DC-Ig 융합 단백질은 다음 아미노산 서열을 갖는다:

서열 10은 신호 서열이 없는 뮤린 B7-DC-Ig 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 제공한다.

한 실시양태에서, 인간 B7-DC-Ig는 인간 B7-DC-Ig의 아미노산 서열을 코딩하는, 서열 11의 핵산 서열에 의해 코딩된다:

본 발명은 구체적으로 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 성숙한 융합 단백질에서 신호 서열이 제거되는 실시양태를 구체적으로 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 신호 서열은 완전히 제거된다.

서열 13은 신호 서열이 없는 인간 B7-DC-Ig에 대한 아미노산 서열을 제공한다.

본 발명은 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용된 개시된 B7-DC-Ig 융합 단백질이 서열 9, 10, 12, 또는 13에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 실시양태를 구체적으로 고려한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 이중특이적 기능을 가질 수 있어서, 제1 융합 파트너는 PD-1의 리간드, 예를 들어 B7-H1에 결합하고, 제2 융합 파트너은 PD-1 수용체를 통한 억제 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 결합한다.

본 발명에서 유용한 폴리펩티드는 단량체성 또는 이량체성일 수 있지만, 융합 단백질 자체는 단량체 또는 올리고머 형태로, 바람직하게는 이량체로서 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서 PD-1 길항제로서 유용한 융합 단백질은 올리고성, 특히 이량체성 형태로 자발적으로 조립할 수 있거나, 당업계에 잘 공지된 수단에 의해 그러한 올리고머를 형성하기 위해 화학적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명을 실시하는데 유용한 융합 단백질은 자체가 항체의 일부에 융합된 B7-DC 폴리펩티드의 일부를 포함할 수 있고, 이들은 이량체로 더욱 조립될 수 있다. 하나의 그러한 예에서, 본 발명에서 유용한 폴리펩티드는 단일 아미노산 사슬로서 항체의 Fc 영역에 융합되고 (상기 구성체가 단일 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 경우와 같이), 그 후 2개의 그러한 융합 생성물은 각각의 Fc 영역 사이의 디술피드 연결에 의해서와 같이 서로 연결되어 동종이량체를 형성한다.

상기 이량체성 생성물은 동종이량체일 수 있거나 (여기서 두 단량체성 융합 단백질은 동일하다), 이종이량체일 수 있다 (여기서 2개의 상이한 융합 단백질이 서로 연결된다). 상기 이량체의 개별 단량체들은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어 공유 연결 (예를 들어, 디술피드 결합) 또는 비-공유 연결 (예를 들어 이온성 상호작용)에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용된 B7-DC-Ig는 디술피드 연결에 의해 함께 연결된 2개 카피의 서열 10을 갖는 동종이량체의 형태로 존재하였다. 또한, 본 발명의 이종이량체는 이중특이적 단백질 및 융합 단백질을 포함하고, 여기서 하나의 단량체성 부분은 PD-1에 결합하고 다른 것은 PD-1의 천연 리간드에 결합한다. 상기 이종이량체는 본원에 충분히 설명되는 폴리펩티드 및 융합 단백질의 결합에 의해 형성된다.

본 발명의 다른 유용한 실시양태에서, PD-1 길항제는 이종이량체이고, 예를 들어 여기서 2개의 융합 단백질이 함께 연결되지만 동일한 아미노산 서열의 것이 아니다. 특정 예에서, 각각의 단량체는 B7-DC 폴리펩티드의 활성 단편에 연결된 항체의 Fc 부분을 포함할 수 있고, 여기서 이들 활성 단편은 B7-DC 폴리펩티드의 상이한 부분으로부터의 것이거나, 전장 천연 B7-DC 폴리펩티드에 융합된 항체의 Fc 부분을 포함하는 융합 단백질은 항체의 Fc 부분 및 전장 천연 BY-DC 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 융합 단백질에 연결된다 (예를 들어, 가교결합된다). 각각의 그러한 경우에, 각각의 단량체성 융합 단백질을 형성하는데 사용되는 항체의 부분은 2개의 단량체성 단위 사이에서 상이할 수 있다. 임의의 그러한 이량체 조합은 본 발명의 방법 및 조성물에서 구체적으로 고려된다.

바람직한 이량체성 융합 단백질에서, 이량체는 이량체화된 정상 Ig 중쇄 내에서 디술피드 연결되는 동일한 Cys 잔기들인, 2개의 Ig 중쇄의 CH 영역 내의 Cys 잔기들의 공유 결합으로부터 생성한다.

또 다른 실시양태는 변이체 B7-DC 폴리펩티드의 세포외 도메인에 융합된 BirA 기질을 갖는 사량체 구성체를 제공한다. 사량체 구성체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 ([Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006)] 참조).

7. 항- PD -1 및 다른 항체

본 발명의 방법에서 고려되는 다른 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-1의 리간드에 결합하는 항체, 및 다른 항체를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 항-PD-1 항체 및 증강제를 포함하는 효과적인 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 항원에 대한 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다.

본 발명의 치료 요법(들)에 유용한 항-PD-1 항체는 다음 공개문에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다:

본 발명의 방법에 유용한 항-PD-1 항체의 구체적인 예는 바람직하게는 3 mg/kg의 용량으로 투여되는 인간 항-PD-1 항체인 MDX-1106이다 (US 20070166281 (Kosak, 2007년 7월 19일 공개) at par. 42 참조).

다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 항-PD-1 리간드 항체, 예를 들어, 항-B7-H1 항체 및 증강제를 포함하는 효과적인 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 항원에 대한 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다.

본 발명의 치료 요법(들)에 유용한 항-B7-H1 항체는 다음 공개문에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다:

PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, 2006년 12월 14일 공개),

PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, 2008년 7월 10일 공개),

US 2006/0110383 (2006년 5월 25일 공개)

본 발명의 방법에 유용한 항-B7-H1 항체의 구체적인 예는 인간 항-B7-H1 항체인 MDX-1105 (WO/2007/005874, 2007년 1월 11일 공개))이다.

항-B7-DC 항체에 대해서는 7,411,051, 7,052,694, 7,390,888, 20060099203을 참조한다.

본 발명의 다른 실시양태는 PD-1의 리간드, 예를 들어 B7-H1에 결합하는 항체에 연결된, PD-1 수용체에 결합하는 항체를 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 결합 부분은 PD-1 수용체를 통한 신호 전달을 감소 또는 억제한다.

본 발명에 사용하기 위한 항체는 항-PD-1 또는 항-PD-1 리간드 항체일 필요가 없고, 대신에 면역 반응에서 T 세포의 효과를 매개하는데 유용한 다른 항체일 수 있다. 본 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 항-CTLA4 항체 및 증강제를 포함하는 효과적인 치료 요법을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 포유동물에서 항원에 대한 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 치료 요법은 상기 항원에 대한 상기 포유동물의 T 세포 반응을 증가시키기 위해 효과적이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 고려되는 항-CTLA4 항체의 예는 PCT/US2006/043690 (WO/2007/056539, Fischkoff et al.)에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 항-CTLA4 항체의 특정 예는 바람직하게는 10 mg/kg의 용량으로 투여되는 인간 항-CTLA4 항체인 이필리무맙 (Ipilimumab) (MDX-010 또는 MDX-101로도 알려짐), 및 바람직하게는 15 mg/kg의 용량으로 투여되는 인간 항-CTLA4 항체인 트레멜리무맙 (Tremelimumab)이다.

8. 소분자 PD -1 길항제

PD-1 수용체 길항제는 또한 소분자 길항제일 수 있다. 용어 "소분자"는 분자량이 100 달톤 초과 내지 약 2,500 달톤 미만, 바람직하게는 100 내지 2000 달톤, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 1250 달톤, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 1000 달톤, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 750 달톤, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 500 달톤인 작은 유기 화합물을 나타낸다. 소분자는 종종 하나 이상의 관능기로 치환된 환식 탄소 또는 헤테로환 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 소분자 길항제는 PD-1의 리간드, 예를 들어 B7-H1 및 B7-DC에 결합하고 리간드가 PD-1과 상호작용하는 것을 방지함으로써 또는 PD-1 수용체를 통한 신호 전달을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 직접 결합하고 차단함으로써, PD-1 수용체 신호 전달을 감소 또는 저해한다.

한 실시양태에서, 그러한 소분자는 다른 PD-1 길항제 또는 CTLA4 길항제, 예를 들어 PD-1 또는 그의 리간드 중 하나에 특이적인 항체 또는 CTLA4 또는 그의 리간드 중 하나에 특이적인 항체와 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 그러한 소분자는 하나 이상의 본 발명의 방법에서 화합물로서 투여될 수 있거나, 본 발명의 방법에서 유용한 다른 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 일련의 작은 유기 화합물은 B7-1 리간드에 결합하여 CTLA4에 대한 결합을 방지하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Erbe et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, pp. 7363-7368 (2002)] 참조). 상기 작은 유기 물질은 T 세포의 억제 신호 전달을 감소시키기 위해서, 단독으로 또는 항-CTLA4 항체와 함께 CTX 투여와 조합하여 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려되는 PD-1 길항제 또는 CTLA4 길항제는 안티센스 핵산, DNA 및 RNA 모두, 및 siRNA 분자를 포함한다. 그러한 안티-센스 분자는 T 세포 상의 PD-1의 발현 및 T 세포 리간드, 예를 들어 B7-H1, PD-L1 및 PD-L2의 생산을 방지한다. 예를 들어, 담체, 예를 들어 폴리에틸렌이민과 복합체화된 siRNA (예를 들어, 약 21개 뉴클레오티드 길이, 이는 PD-1을 코딩하는 유전자 또는 PD-1 리간드를 코딩하는 유전자에 특이적이고, 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 쉽게 구입할 수 있다) ([Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009)] 참조)는 PD-1 및 PD-1의 리간드를 발현하는 세포에 의해 쉽게 흡수되고, T 세포에서 억제 신호 전달의 감소를 달성하여, T 세포를 활성화시키기 위해 이들 수용체 및 리간드의 발현을 감소시킨다.

B. 증강제

본 발명에 따라서, PD-1 길항제의 활성은 증강제의 존재에 의해 바람직하게는 상승적으로 증가된다. 증강제는 가능하게는 하나 초과의 메카니즘에 의해 PD-1 수용체 길항제의 효율을 증가시키는 작용을 하지만, 정확한 작용 메카니즘은 본 발명의 광범위한 실시를 위해 필수적이지 않다.

바람직한 실시양태에서, 증강제는 시클로포스파미드이다. 시클로포스파미드 (CTX, 시톡산®, 또는 네소살 (Neosar)®)는 옥사자포스포린 약물이고, 유사체는 이포스파미드 (IFO, 이펙스 (Ifex)), 페르포스파미드, 트로포스파미드 (트로포스파미드 (trofosfamide); 이속텐 (Ixoten)), 및 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 전구약물 및 대사물을 포함한다 (그 전문이 포함되는 미국 특허 출원 20070202077). 이포스파미드 (미톡사나 (MITOXANA)®)는 시클로포스파미드의 구조적 유사체이고, 그의 작용 메카니즘은 시클로포스파미드와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 것으로 생각된다. 페르포스파미드 (4-히드로퍼옥시시클로포스파미드) 및 트로포스파미드는 또한 알킬화제이고, 이는 시클로포스파미드에 구조상 관련된다. 예를 들어, 페르포스파미드는 DNA를 알킬화시켜, DNA 복제 및 RNA 및 단백질 합성을 억제한다. 숙주 독성을 감소시키면서 선택성 및 반응을 개선시키기 위한 시도로 새로운 옥사자포스포린 유도체가 설계되고 평가되었다 (Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). 이들은 마포스파미드 (NSC 345842), 글루포스파미드 (D19575, 베타-D-글루코실이소포스포르아미드 머스타드), S-(-)-브로모포스파미드 (CBM-11), NSC 612567 (알도포스파미드 퍼히드로티아진) 및 NSC 613060 (알도포스파미드 티아졸리딘)를 포함한다. 마포스파미드는 4-히드록시-CPA의 화학적으로 안정한 4-티오에탄 술폰산염인 옥사자포스포린 유사체이다. 글루포스파미드는 IFO 유도체이고, 여기서 이소포스포르아미드 머스타드 (IFO의 알킬화 대사물)는 베타-D-글루코스 분자에 글리코시드 결합으로 연결되어 있다. 추가의 시클로포스파미드 유사체는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,190,929 (명칭: "Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents")에 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 증강제는 조절 T 림프구 (T-reg)의 활성 및/또는 수를 감소시키는 작용제, 바람직하게는 수니티닙 (수텐트®), 항-TGFβ 또는 이마티닙 (글리백®)이다. 언급된 치료 요법은 아주반트 (adjuvant)를 투여하는 것을 또한 포함할 수 있다.

또한, 유용한 증강제는 유사분열 억제제, 예를 들어 파클리탁솔, 아로마타제 억제제 (예를 들어 레트로졸) 및 혈관신생 억제제 (VEGF 억제제, 예를 들어 아바스틴 (Avastin), VEGF-Trap) (예를 들어, 문헌 [Li et al., Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cells and enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15;12(22):6808-16] 참조), 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제를 포함한다.

C. 제약 조성물

한 측면에서, 본 발명은 PD-1을 통한 억제 신호 전달을 방지하는 분자, 또는 CTLA4 길항제, 및 증강제를 제약상 허용되는 담체 내에 포함하는 치료 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물의 성분은 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는데 유효한 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 증강제는 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체이고, 상기 유사체의 예는 앞에서 언급된 바 있다.

다른 특정 예에서, 증강제는 조절 T 림프구 (T-reg)의 활성을 감소시키는 작용제이고, 바람직하게는 여기서 활성은 상기 T-reg의 수의 감소에 의해 감소된다. 바람직한 비-제한적인 실시양태에서, 증강제는 수니티닙 (수텐트®), 항-TGFβ 또는 이마티닙 (글리백®)이다.

또한, 본 발명의 조성물에 유용한 증강제는 유사분열 억제제, 예를 들어 파클리탁솔, 아로마타제 억제제 (예를 들어 레트로졸), 혈관신생 억제제 (VEGF 억제제, 예를 들어 아바스틴, VEGF-Trap), 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제를 포함한다.

본 발명의 치료 조성물은 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 유사분열 억제제, 아로마타제 억제제, A2a 아데노신 수용체 (A2AR) 길항제, 또는 혈관신생 억제제일 수 있는 적어도 하나의 추가의 작용제를 포함한다.

또한, 본 발명의 임의의 치료 조성물은 본원에서 설명되는 하나 이상의 아주반트를 포함할 수 있다.

본 발명의 치료 조성물의 성분으로서 유용한 PD-1 길항제는 임의의 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본원에서 언급되는 임의의 PD-1 길항제를 포함한다. 예를 들어, 상기 PD-1 길항제는 본원에서 언급되는 임의의 융합 단백질을 포함한다. 또한, 상기 길항제는 임의의 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본원에서 설명되는 임의의 융합 단백질의 제1 폴리펩티드 부분으로서 사용하기 위해 본원에서 언급되는 임의의 폴리펩티드 또는 PD-1 결합 단편일 수 있다. 상기 길항제는 추가로 항체, 예를 들어 본원에서 언급되는 임의의 공지의 항-PD-1, 항-B7-DC 또는 항-B7-H1 항체일 수 있다.

본 발명의 치료 조성물은 또한 상기 언급한 PD-1 길항제에 추가로 또는 그 대신에 항-CTLA4 항체를 포함한다. 상기 조성물은 따라서 상기 항-CTLA4 항체 및 본원에서 이미 설명한 종류의 증강제를 포함한다.

본 발명의 치료 조성물은 임의의 본원에 개시된 본 발명의 방법에서 유용하다. 상기 조성물은 질환 상태의 능동적인 치료제로서 사용하는 것이 의도되지만, 본원에서 언급되는 임의의 질환의 예방을 위한 예방 조성물로서도 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 PD-1 길항제 및 증강제를 제약상 허용되는 담체 내에 포함하는 치료 조성물을 고려하고, 여기서 PD-1 길항제 및 증강제는 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는데 유효한 양으로 함께 존재한다.

본 발명의 범위 내의 치료 조성물은 본원에 개시된 PD-1 길항제 및/또는 항체와 임의의 언급된 증강제의 임의의 모든 조합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 비-제한적인 예로서, 본 발명의 치료 조성물은 임의의 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 단편과 함께 유효량의 하나 이상의 PD-1 길항제, 예를 들어 특정 서열 번호로서 본원에서 제시되는 임의의 또는 모든 전장 폴리펩티드 또는 그의 상동체의 조합물 (여기서, 임의의 또는 모든 물질은 다른 단백질에 융합되거나, 예를 들어 본원에서 언급되는 하나 이상의 면역글로불린에 융합되거나, 또는 융합되지 않음) 및 하나 이상의 증강제를 포함하는 조성물을 포함하고, 증강제는 예를 들어 시클로포스파미드 단독, 또는 시클로포스파미드 + 그의 하나 이상의 유사체, 또는 단지 시클로포스파미드의 하나 이상의 유사체이거나, 또는 시클로포스파미드 및 조성물을 투여받는 포유동물에서 Treg 수를 감소시키는 작용제로 구성될 수 있거나, 또는 시클로포스파미드 유사체 + Treg 수를 감소시키는 작용제로 구성될 수 있거나 또는 Treg 수 또는 다른 Treg 활성을 감소시키는 하나 이상의 물질만으로 구성될 수 있다. 모든 상기 조합물은 조성물이 적어도 하나의 PD-1 길항제 및/또는 T 세포 활성을 매개하는 항체 및 적어도 하나의 증강제를 포함한다면 본 발명에서 고려된다.

또한, 본 발명의 조성물은 추가의 활성 작용제를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 조성물의 바람직한 실시양태에서, 제약 또는 치료 조성물은 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 유사분열 억제제, 예를 들어 파클리탁셀, 아로마타제 억제제, 예를 들어 레트로졸, A2AR 길항제, 혈관신생 억제제, 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 작용제를 추가로 포함한다.

PD-1 길항제 및/또는 증강제는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제 및/또는 증강제는 비경구 주사에 의해 수용액으로 투여된다. 또한, 제형은 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있다. 일반적으로, 유효량의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물이 제공되고, 임의로 제약상 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아주반트 및/또는 담체를 포함한다. 상기 조성물은 희석제, 멸균수, 다양한 버퍼 함량 (예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 완충된 염수; 및 임의로, 첨가제, 예를 들어 세제 및 가용화제 (예를 들어, TWEEN 20, TWEEN 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 및 보존제 (예를 들어, 티메르솔, 벤질 알콜) 및 충전 물질 (예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 비-수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예를 들어 올리브유 및 옥수수유, 젤라틴, 및 주사가능 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트이다. 제형은 동결건조되고, 사용 직전에 재용해/재현탁될 수 있다. 제형은 예를 들어 세균 보유 필터를 통한 여과에 의해, 멸균제를 조성물에 혼입함으로써, 조성물에 방사선을 조사함으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 비경구 (근내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 경피 (수동적으로 또는 전기이온영동 (iontophoresis) 또는 전기천공을 사용하여), 또는 경점막 (비내, 질내, 직장, 또는 설하) 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 별개의 상이한 경로 (예를 들어 국소)에 의한 PD-1 길항제 및 증강제의 투여를 배제하지 않는다.

PD-1 길항제 및 증강제는 동시에, 또는 상이한 시점에 투여될 수 있고, 이때 증강제는 PD-1 길항제 투여 전 또는 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 증강제는 PD-1 길항제 투여 전과 후 모두에 투여된다. 한 실시양태에서, 동일한 증강제가 PD-1 길항제의 투여 전과 후에 투여된다. 다른 실시양태에서, 증강제는 PD-1 길항제의 투여 전에 투여된다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 억제하거나 완화하기 위해 또는 달리 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 제공하기 위해 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 대상체-의존 변수 (예를 들어, 연령, 면역계 건강 등), 질환, 및 수행되는 치료와 같은 다양한 인자에 따라 변할 것이다. 증강제와 함께 PD-1 수용체 길항제 및/또는 항체의 치료 유효량은 면역 반응이 활성화 또는 유지되도록 한다.

선택되는 용량은 목적하는 치료 효과, 투여 경로, 및 요구되는 치료 기간에 따라 결정된다. 일반적으로 0.001 내지 50 mg/kg (체중)의 용량 수준이 포유동물에게 매일 투여된다. 바람직하게는, 상기 용량은 1 내지 50 mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 40 mg/kg, 또는 심지어 1 내지 30 mg/kg이고, 2 내지 20 mg/kg의 용량도 바람직한 용량이다. 다른 용량의 예는 2 내지 15 mg/kg, 또는 2 내지 10 mg/kg 또는 심지어 3 내지 5 mg/kg을 포함하고, 약 4 mg/kg의 용량이 구체적인 예이다.

증강제 및 항체, 예를 들어 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA4 항체를 사용하는 치료 요법을 위해, 용량은 통상적으로 0.1 내지 100 mg/kg이고, 1 내지 50 mg/kg이 바람직하고, 10 내지 20 mg/kg이 보다 바람직하다. 인간 대상체에 대한 적절한 용량은 5 내지 15 mg/kg이고, 10 mg/kg의 항체 (예를 들어, 인간 항-PD-1 항체, 예를 들어 MDX-1106)가 가장 바람직하다 (여기서, 적합한 용량의 시클로포스파미드 또는 다른 증강제가 항체를 투여하기 약 24시간 이전까지 추가로 투여된다).

일반적으로, 단지 예로서, 본 발명의 방법에 유용한 임의의 신호 전달 길항제의 체중을 기준으로 한 투여 형태는 5-300 mg/kg, 또는 5-290 mg/kg, 또는 5-280 mg/kg, 또는 5-270 mg/kg, 또는 5-260 mg/kg, 또는 5-250 mg/kg, 또는 5-240 mg/kg, 또는 5-230 mg/kg, 또는 5-220 mg/kg, 또는 5-210 mg/kg, 또는 20 내지 180 mg/kg, 또는 30 내지 170 mg/kg, 또는 40 내지 160 mg/kg, 또는 50 내지 150 mg/kg, 또는 60 내지 140 mg/kg, 또는 70 내지 130 mg/kg, 또는 80 내지 120 mg/kg, 또는 90 내지 110 mg/kg, 또는 95 내지 105 mg/kg의 용량을 포함하고, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 용량이 바람직한 용량의 구체적인 예이다. 상기 용량은 물론 반복 투여될 수 있다. 용량은 물론 그 용량을 투여받는 포유동물의 종류와 상호관련될 것이다. 상기 언급된 mg/kg 범위의 용량은 포유동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스 및 래트, 및 영장류, 특히 인간에 사용하기 좋고,약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 15 mg/kg의 용량은 인간 치료에 특히 바람직하다.

본 발명의 치료 요법에 따라서, 증강제, 예를 들어 시클로포스파미드는 동물에 따라 상이한 비독성 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 증강제는 비경구 또는 경구를 포함하는 임의의 적합한 투여 수단에 의해 투여되고, 비경구 투여는 전신 투여, 예를 들어 정맥 내 투여를 포함한다. 예를 들어, 시클로포스파미드와 같은 증강제는 통상 경구로 투여된다. 상기 투여는 증강제에 따라 임의의 편리한 용량으로 시행될 수 있다. 각각의 경우에 용량은 체중 기준으로 결정될 수 있거나 또는 단위 용량으로 투여될 수 있다.

CTX 자체는 비독성이지만, 그의 대사산물의 일부는, DNA 가교결합을 유발하고 보다 높은 용량에서는 가닥 파단을 유발하는 세포독성 알킬화제이다. 많은 세포는 CTX에 내성을 보이고, 그 이유는 세포가 높은 수준의 제독 효소 알데히드 데히드로게나제 (ALDH)를 발현하기 때문이다. CTX는, 림프구 (조혈 줄기 세포가 아니라)가 단지 낮은 수준의 ALDH만을 발현하기 때문에 증식하는 림프구를 표적으로 하고, 분열하는 세포는 DNA 알킬화제에 가장 감수성이다.

CTX의 저용량 (< 200 mg/kg)은 인간 및 마우스 암 모델에서 항-종양 면역 반응의 자극을 포함하여 면역 자극 효과를 가질 수 있다 (Brode & Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008)). 상기 저용량은 하위-치료이고, 직접적인 항-종양 활성을 갖지 않는다. 이와 달리, CTX의 높은 용량은 항-종양 반응을 억제한다. 몇가지 메카니즘이 항-종양 면역 반응의 증강에서의 CTX의 역할을 설명할 수 있다: (a) CD4+CD25+FoxP3+ Treg (및 구체적으로, 특히 억압성일 수 있는 증식 Treg)의 고갈, (b) B 림프구의 고갈; (c) 질소 산화물 (NO)의 유도, 및 이에 의한 종양 세포 성장의 억압; (d) CD11b+Gr-1+ MDSC의 이동 및 팽창. 상기 주요 효과는 많은 2차 효과를 갖는다; 예를 들어 Treg 고갈 후에 대식세포는 보다 많은 IFN-γ 및 보다 적은 IL-10을 생산한다. 또한, CTX는 타입 I IFN 발현을 유도하고 림프구의 항성성 증식을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.

Treg 고갈은 CTX가 그에 의해 항-종양 면역 반응을 증강시키는 메카니즘으로서 흔히 언급된다. 상기 결론은 부분적으로 입양 전달 실험의 결과에 기초로 한 것이다. AB1-HA 종양 모델에서, 제9일에 CTX 처리는 75% 치료율을 제시한다. 제12일에 정제된 Treg의 전달은 CTX 반응을 거의 완전히 억제하였다 (van der Most et al. Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009). 유사한 결과가 HHD2 종양 모델에서 관찰되었다: CTX 전처리 후의 CD4+CD25+ Treg의 입양 전달은 백신에 대한 치료 반응을 제거하였다 (Taieb, J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)).

많은 인간 임상 시험은 저용량 CTX가 안전하고, 허용성이 좋고, 항-종양 면역 반응의 촉진에 효과적인 물질임을 입증하였다 (Bas, & Mastrangelo Cancer Immunol. Immunother. 47:1-12 (1998)).

항-종양 면역 반응을 증강시키기 위한 CTX의 최적 용량은 Treg 수준을 정상 범위 미만으로 저하시킴으로써 전체 T 세포 계수를 감소시키지만 하위치료 용량인 양이다 (Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)).

CTX가 면역증강제로서 사용된 인간 임상 시험에서, 300 mg/m²의 용량이 대체로 사용되었다. 평균적인 수컷 (6 ft, 170 파운드 (78 kg), 체표면적 1.98 m²)의 경우, 300 mg/m² 은 8 mg/kg, 또는 624 mg의 총 단백질에 해당한다. 암의 마우스 모델에서, 효율은 15 - 150 mg/kg의 용량에서 관찰되었고, 이것은 30 g 마우스에서 0.45 - 4.5 mg의 총 단백질에 관련된다 ([Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)], [Hengst et al. Cancer Res. 41:2163-2167 (1981)], [Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980)]).

보다 큰 포유동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 인간 환자에 대해, 상기 mg/m² 용량이 사용될 수 있지만, 한정된 시간에 걸쳐 투여되는 단위 용량이 바람직할 수 있다. 상기 단위 용량은 한정된 기간, 예를 들어 3일 이하, 또는 5일 이하, 또는 7일 이하, 또는 10일 이하, 또는 15일 이하 또는 20일 이하 또는 25일 이하 동안 1일 기준으로 투여될 수 있고, 본 발명에서 모두 구체적으로 고려된다. 동일한 요법이 본원에서 언급되는 다른 증강제에 대해서 적용될 수 있다.

모든 상기 투여는 본 발명의 PD-1 결합 분자의 투여 전 또는 후에 실시될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 PD-1 결합 분자의 하나 이상의 용량의 투여는 균일 또는 비-균일 경로를 형성하도록 증강제의 투여와 일시적으로 엇갈리는 방식으로 실시될 수 있고, 이에 의해 상기 물질을 투여하는 연구자 또는 임상의에 의해 선택되거나 요구되는 투여 스케쥴에 따라 하나 이상의 용량의 증강제가 투여된 후, 하나 이상의 용량의 PD-1 결합 화합물이 투여되고, 이어서 하나 이상의 용량의 증강제가 투여된다.

다른 특정 실시양태에서, 치료 요법은 하나 이상의 PD-1 길항제의 다수 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 길항제의 그러한 다수의 투여는 동일한 또는 상이한 증강제의 다수 투여와 함께 수행된다.

본 발명의 다른 실시양태에서와 같이, 증강제는 PD-1-길항제를 투여하기 적어도 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 또는 30시간 전에 투여된다.

또한, 본원에서 유용한 제약 조성물은, 그 자체가 조성물이 투여되는 개체에게 유해한 항체의 생산을 유발하지 않고 과도한 독성이 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 작용제를 포함하는 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 임의의 적합한 희석제 또는 부형제를 함유한다. 제약상 허용되는 담체는 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올 등, 및 비내 및 다른 기도 전달 또는 눈에 대한 전달을 위한 스프레이 형성에 유용한 담체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 다른 부형제에 대한 상세한 논의는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 최신판)]에 제시되어 있다.

백신 조성물 (아래에서 논의됨)은 pH를 안정화하거나, 또는 아주반트, 습윤제, 또는 유화제로서 기능하는, 백신의 효율을 개선하는 작용을 할 수 있는 추가의 작용제를 추가로 포함할 수 있다.

백신은 일반적으로 비경구 투여를 위해 제형화되고, 피하 또는 근내 주사된다. 또한, 상기 백신은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 좌제로서 또는 경구 투여를 위해 또는 비내 또는 호흡 경로를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다.

D. 제조 방법

변이체, 상동체 및 그의 단편을 포함하는, 야생형이거나 또는 돌연변이된 단리된 PD-1 길항제 폴리펩티드, 및 임의의 상기 물질을 포함하는 융합 단백질 (모두 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다)은 예를 들어 화학 합성에 의해 또는 숙주 세포 내에서 재조합 생산에 의해 얻을 수 있다. 보조자극 폴리펩티드를 재조합 방식으로 생산하기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산은 세균 또는 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 곤충, 효모, 또는 포유동물 세포)를 형질전환시키거나 형질도입하거나 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 특정 종류의 숙주 세포에서 단백질 발현 수준을 증가시키기 위해서 코돈이 최적화될 수 있음이 이해될 것이다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 핵산 구성체는 보조자극 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 조절 서열 (본원에서 발현 제어 서열로도 칭해짐)은 일반적으로 유전자 산물을 코딩하지 않지만, 대신에 그들이 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미친다. 세포로부터 단백질을 분비하기 위해 사용되는 신호 펩티드는 내인성 신호 펩티드 또는 숙주로부터 융합 단백질의 분비를 용이하게 하는 임의의 다른 신호 펩티드일 수 있다.

본 발명을 실시하는데 유용한 일반적인 분자 생물학 절차에 대해서는, 분자 생물학 및 유전 공학 분야에 잘 알려져 있는 절차가 기재되어 있는 많은 표준 참고문헌을 이용할 수 있고, 이들 절차는 본원에서 추가로 설명할 필요가 없다. 유용한 참고문헌은 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997)], 및 [Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997)]을 포함하고, 이들 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

E. 질환 치료

본 발명에서 제공되는 치료 조합물을 투여함으로써 치료 또는 예방할 질환은 악성 종양, 또는 세균, 바이러스, 원생동물, 기생충, 또는 세포 내에 들어오는 다른 미생물 병원체에 의해 유발된 만성 감염성 질환이다. 상기 질환은 종종 세포독성 T 림프구에 의한 공격을 통해 개선된다. 본 발명은 T 세포 활성의 증가, T 세포 증식 증가 및 T 세포 억제 신호의 감소를 통해 T 세포 반응의 향상에 유용한 조합 요법을 제공하기 때문에, 본 발명의 조합 요법은 상기 질환의 치료 (또는 심지어 예방)에 있어 특유한 잇점을 갖는다.

한 실시양태에서, 바이러스 감염은 주로 T-세포에 의해 청소되기 때문에, T-세포 활성의 증가는 동물 또는 영장류, 바람직하게는 인간 대상체로부터 감염성 바이러스 물질의 청소시에 치료상 유용하다. 따라서, 증강제와 함께 PD-1 수용체 길항제 활성을 갖는 본 발명의 개시된 화합물은 국소 또는 전신 바이러스 감염의 치료를 위해 조합하여 작용한다. 본 발명의 화합물에 의해 치료되는 감염은 면역결핍 (예를 들어, HIV), 유두종 (예를 들어, HPV), 포진 (예를 들어, HSV), 뇌염, 인플루엔자 (예를 들어, 인간 인플루엔자 바이러스 A), 간염 (예를 들어 HCV, HBV), 및 감기 (예를 들어, 인간 리노바이러스) 바이러스 감염을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, PD-1 수용체 길항제 조성물의 제약 제형은 AIDS, 인플루엔자, 감기, 또는 뇌염을 포함하고 이로 제한되지 않는 전신 바이러스 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있는 비-바이러스 감염은 악티노마이세스 (Actinomyces), 아나배나 (Anabaena), 바실러스 (Bacillus), 박테로이데스 (Bacteroides), 델로비브리오 (Bdellovibrio), 보르데텔라 (Bordetella), 볼렐리아 (Borrelia), 캄필로박터 (Campylobacter), 카울로박터 (Caulobacter), 클라미디아 (Chlamydia), 클로로븀 (Chlorobium), 크로마튬 (Chromatium), 클로스트리듐 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 시토파가 (Cytophaga), 데이노코쿠스 (Deinococcus), 에스케리키아 (Escherichia), 프란시셀라 (Francisella), 할로박테리움 (Halobacterium), 헬리오박터 (Heliobacter), 해모필루스 (Haemophilus), 헤모필루스 인플루엔자 타입 B (Hemophilus influenza type B (HIB)), 히포미크로븀 (Hyphomicrobium), 레지오넬라 (Legionella), 렙트스피로시스 (Leptspirosis), 리스테리아, 메닝고코쿠스 A, B 및 C (Meningococcus A, B 및 C), 메타노박테리움 (Methanobacterium), 미크로코쿠스 (Micrococcus), 미오박테리움 (Myobacterium), 미코플라스마, 믹소코쿠스 (Myxococcus), 나이세리아 (Neisseria), 니트로박터 (Nitrobacter), 오실라토리아 (Oscillatoria), 프로클로론 (Prochloron), 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 포도스피릴룸 (Phodospirillum), 리케차 (Rickettsia), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (Shigella), 스피릴룸 (Spirillum), 스피로카에타 (Spirochaeta), 스태필로코쿠스 (Staphylococcus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 술폴로부스 (Sulfolobus), 써모플라스마 (Thermoplasma), 티오바실러스 (Thiobacillus), 트레포네마 (Treponema), 비브리오 (Vibrio), 에르시니아 (Yersinia), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 종 (Histoplasma sp .) (예를 들어 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum)), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 노카르디아 아스테로이데스 (Nocardia asteroides), 리케차 리케치이 (Rickettsia ricketsii), 리케차 티피 (Rickettsia typhi), 리슈마니아 (Leishmania), 미코플라스마 뉴모니아에 (Mycoplasma pneumoniae), 클라미디알 시타시 (Chlamydial psittaci), 클라미디알 트라코마티스 (Chlamydial trachomatis), 플라스모듐 종 (Plasmodium sp .) (예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis) 및 쉬스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni)를 포함하고 이로 제한되지 않는 미생물에 의해 야기되는 감염을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위해 숙주에서 면역 반응을 유도 또는 향상시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 제공된 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 암의 종류는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환, 및 혈액암.

치료될 수 있는 악성 종양은 종양이 그로부터 유래되는 조직의 배아 기원에 따라 본원에서 분류된다. 암종은 내배엽 또는 외배엽 조직, 예를 들어 피부 또는 내부 장기 및 분비 장기의 상피층으로부터 발생하는 종양이다. 덜 빈번하게 발생하는 육종은 내배엽 결합 조직, 예를 들어 뼈, 지방 및 연골로부터 유래한다. 백혈병 및 림프종은 골수의 조혈 세포의 악성 종양이다. 백혈병은 단일 세포로서 증식하는 반면, 림프종은 종양 덩어리로서 성장하는 경향이 있다. 악성 종양은 암을 확립하기 위해 신체의 수많은 장기 또는 조직에서 나타날 수 있다.

본 발명의 치료 요법의 가치에 대한 예시로서, B7-DC-Ig의 뮤린 유사체 (인간 단백질과 72%의 서열 동일성을 공유하는 마우스 B7-DC ECD가 마우스 IgG_2a의 Fc 도메인에 융합됨)는, 본원에서 설명되는 시클로포스파미드 (CTX) 전-처리를 포함하는, 결장암, 비만세포종, 및 다른 종양 종류에 대한 동계 (syngeneic) 마우스 종양 모델에서 시험하였다.

그 결과는 면역증강제로 작용하는 단일 하위치료 용량의 CTX, 이어서 뮤린 B7-DC-IG를 사용한 치료가 동물의 80% 이하에서 확립된 CT26 결장 암종 종양을 근절함을 보여주었다. 또한, CT26 결장 암종 종양 재접종 연구에서, CTX + 뮤린 B7-DC-Ig 치료 후에 종양을 사전에 근절한 마우스에서 종양 재-성장이 검출되지 않았다. 또한, 이들 마우스는 나이브 마우스에 비해 증가된 종양-특이적 CTL 집단을 보유함이 밝혀졌다.

한 실시양태에서, 본 발명은 조합 요법에 의해 T 세포 반응을 증가시키기 위한 의약의 제조에 있어서, 본원에서 설명된 바와 같이 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물의 사용을 고려하고, 여기서 상기 화합물은 증강제와 함께 투여된다. 또한, T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물 및 상기 증강제는 상이한 시간에 투여하기 위한 별개의 의약으로서 제공되고, 바람직하게는 여기서 증강제는 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물을 투여하기 전에, 예를 들어, 억제성 화합물 투여 전에 24시간 이내에 (또는 본원에 언급된 다른 시간 간격으로) 투여된다. 바람직하게는, 화합물 및 증강제는 감염성 질환 또는 암, 예를 들어 임의의 감염원에 의해 유발되는 질환 또는 본원에서 언급된 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 방법에 유용한 화합물은 인간 IgG₁의 Fc 도메인에 융합된 인간 B7-DC의 ECD로 구성된 재조합 단백질로서, 본원에서 B7-DC-Ig로 언급된다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물의 투여 공급물,

(b) 증강제 공급물;

(c) 제약상 허용되는 담체의 공급물; 및

(d) 상기한 바와 같은 용도로 화합물을 투여하기 위한 인쇄된 지시서

를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같이 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물을 증강제와 조합하여 투여하기 위한 의료용 키트에 관한 것이다.

F. 조합 요법

백신은 암 세포 및 감염된 세포 또는 감염원을 제거하기 위해 강한 T 세포 반응을 요구한다. 본원에 기재된 PD-1 수용체 길항제는 T 세포에 대한 보조자극 신호를 제공하기 위해 증강제와 함께 백신의 성분으로서 투여될 수 있다. 본원에 개시된 백신은 항원, PD-1 수용체 길항제 및 임의로 아주반트 및 표적화 분자를 포함한다.

그에 대한 T 세포 반응이 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 향상되는 항원은 펩티드, 단백질, 다당류, 당류, 지질, 핵산, 또는 그의 조합물을 포함한다. 질환의 경우에 항원은 질환 과정으로 인해 존재한다.

개시된 PD-1 수용체 길항제 조성물은 감염원에 노출된 후에 대상체에서 내성을 부여하는 예방 백신과 함께, 또는 기존의 항원, 예를 들어 암이 있는 대상체에서 종양 항원 또는 바이러스로 감염된 대상체에서 바이러스 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 개시 또는 향상시키기 위해 사용될 수 있는 치료 백신과 함께 투여될 수 있다.

예방, 치료 또는 탈감작된 면역 반응의 목적하는 결과는 당업계에 잘 공지된 원칙에 기초하여 질환에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 감염원에 대한 면역 반응은 감염원의 콜로니 형성 및 복제를 완전히 방지하여, "멸균 면역성" 및 임의의 질환 증상의 부재에 영향을 줄 수 있다. 그러나, 감염원에 대한 백신은 증상의 수, 심도 또는 지속시간을 감소시키거나; 증상이 있는 집단 내에서 개체의 수를 감소시키거나; 또는 감염원의 전염을 감소시키면 효과적인 것으로 간주할 수 있다. 이와 유사하게, 암, 알레르겐 또는 감염원에 대한 면역 반응은 질환을 완전히 치료할 수 있거나, 증상을 완화할 수 있거나, 질환에 대한 총 치료적 개입에서 하나의 양상일 수 있다. 예를 들어, 암에 대한 면역 반응의 자극은 치료에 영향을 주기 위해 수술, 화학치료, 방사선, 호르몬 및 다른 면역학적 방안과 결합될 수 있다.

본 발명의 방법 및 생성물은 증강제에 추가로 아주반트의 사용을 배제하지 않는다. 상기 아주반트는 예를 들어 PD-1 길항제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 아주반트는 다음 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 오일 에멀젼 (예를 들어, 프로인트 (Freund) 아주반트); 사포닌 제형; 비로좀 및 바이러스-유사 입자; 세균 및 미생물 유도체; 면역자극성 올리고뉴클레오티드; ADP-리보실화 독소 및 제독 유도체; 명반; BCG; 광물-함유 조성물 (예를 들어, 광물염, 예를 들어 알루미늄염 및 칼슘염, 수산화물, 인산염, 황산염 등); 생물접착제 및/또는 점막접착제 (mucoadhesive); 미세입자; 리포좀; 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 제형; 무라밀 펩티드; 폴리포스파젠; 이미다조퀴놀론 화합물; 및 표면 활성 물질 (예를 들어, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온 (polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 및 디니트로페놀). 유용한 아주반트는 또한 면역조정물질, 예를 들어 시토카인, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-γ), 대식세포 콜로니 자극 인자, 및 종양 괴사 인자를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 단편, 변이체, 상동체 및 융합 단백질을 포함하여 본원에 개시된 PD-1 수용체 길항제는 그를 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 추가의 치료제 (증강제에 추가로)와 조합하여 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 치료할 병태, 장애 또는 질환에 기초하여 선택된다. 예를 들어, PD-1 수용체 길항제는, 면역 반응을 향상 또는 촉진하는 기능을 하고 본원에서 활성 작용제로서 간주되는 하나 이상의 추가의 작용제와 동시-투여될 수 있다.

상기 작용제는 암사크린, 블레오마이신, 부술판, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 크리산타스파제, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시카르바미드, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 류코보린, 리포좀 독소루비신, 리포좀 다우노루비신, 로무스틴, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 사트라플라틴, 스트렙토조신, 테가푸르-우라실, 테모졸로미드, 테니포시드, 티오테파, 티오구아닌, 토포테칸, 트레오술판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 또는 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 대표적인 세포자멸 유도제 (pro-apoptotic agent)는 플루다라빈타우로스포린, 시클로헥시미드, 악티노마이신 D, 락토실세라미드, 15d-PGJ(2) 및 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 제공되는 요법은 또한 다른 종류의 치료, 예를 들어 방사선 요법, 수술 등과 함께 사용될 수 있다.

G. 길항제 활성에 대한 분석

본 발명에서는 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 많은 특이적인 구조를 언급한다. PD-1, CTLA4, 및 임의의 이들의 리간드에 결합하고 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 능력을 또한 갖는 화학적 구조를 확인하기 위한 잘 공지된 분석 절차를 참고로 하여, 길항제 활성을 갖고 본 발명의 방법에 유용한 다른 화합물이 또한 확인될 수 있다. 그러한 일부 분석은 선택된 화학 구조가 수용체에 결합하는지 결정하는데 유용한 결합 분석이고; 이들은 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에서 상세히 논의될 필요가 없다 (예를 들어, 각각 T 세포를 사용하여 PD-1 신호 전달 조정물질에 대한 분석을 제시하는, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 U.S. 2008/0274490 (2008년 11월 6일 공개) 및 U.S. 7,105,328 (2006년 9월 12일 등록) 참조). 다른 분석이 시토카인의 증식 및/또는 생산을 증가시킴으로써 T 세포를 활성화하는 본 발명의 작용제, 예를 들어 활성 단편의 효과를 결정하기 위해 사용된다. 상기 분석은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 세포의 증식 증가는 증가된 ³H-티미딘 혼입 (세포 증식에 필요한 DNA 합성의 증가에 의해), 또는 배양액에서 T 세포에 의한 시토카인의 생산 증가를 검출하기 위한 ELISA 및/또는 RIA에 의해 입증할 수 있다.

한 실험에서, 인간 B7-DC-Ig의 PD-1 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 2시간 동안 BupH 탄산염/중탄산염 pH 9.4 버퍼 (피어스 (Pierce)) 내에 희석시킨 100 ㎕의 0.75 ㎍/mL 재조합 인간 PD-1/Fc (알앤디 시스템즈)로 코팅한 후, BSA 용액 (잭슨 이뮤노리서치)으로 90-120분 동안 차단하였다. 연속 희석시킨 인간 B7-DC-Ig (야생형, 및 D111S 뮤테인, 및 PD-1에 대한 감소된 결합을 위해 선택된 K113S 돌연변이체) 및 인간 IgG1 이소형 대조군을 90분 동안 결합시켰다. 100 ㎕의 0.5 ㎍/mL 비오틴 접합된 항-인간 B7-DC 클론 MIH18 (이바이오사이언스 (eBioscience)), 이어서 1:1000으로 희석된 HRP-스트렙타비딘 (비디 바이오사이언스 (BD Bioscience)) 및 TMB 기질 (BioFX)를 사용하여, 결합된 B7-DC-Ig를 검출하였다. 450 nm에서의 흡광도는 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices))를 사용하여 판독하고, 데이타는 4-파라미터 로지스틱 피트 (logistic fit)를 이용하여 SoftMax로 분석하였다. 데이타는 인간 B7-DC-Ig (야생형)는 PD-1에 결합하지만, K113S 및 D111S 돌연변이체는 PD-1에 결합하지 않음을 보여주었다.

본 발명의 절차를 수행하는데 있어서 특정 버퍼, 배지, 시약, 세포, 배양 조건 등에 대한 언급은 그로 제한하는 것으로 의도되지 않고, 당업자가 논의가 제시되는 특정 문맥에서 관심있거나 가치있는 것으로 인식하는 모든 관련된 물질을 포함하도록 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 버퍼 시스템 또는 배양 배지를 다른 것으로 대체하고, 동일하지는 않더라도 유사한 결과를 계속 달성하는 것이 종종 가능하다. 당업자는 상기 대체가 본원에 개시된 방법 및 절차를 이용할 때 그 목적을 최적으로 달성하도록 하기 위해 과도한 실험 없이 수행할 수 있는 상기 시스템 및 방법론을 충분히 알 것이다.

본 발명은 다음 비-제한적인 실시예에서 보다 상세히 설명된다. 이들 방법 및 실시예는 결코 본 발명을 본원에 기재된 실시양태에 제한하지 않고, 다른 실시양태 및 용도가 아마 당업자에게 생각날 것임을 이해해야 한다.

실시예

실시예 1

B7- DC - Ig 는 PD01 발현 CHO 세포에 결합한다.

B7-DC-Ig를 먼저 알로피코시아닌 (APC)과 접합시킨 후, 다양한 농도에서 PD-1을 구성적으로 발현하는 CHO 세포주 또는 PD-1을 발현하지 않는 모 CHO 세포와 함께 인큐베이팅하였다. 결합을 유동 세포 측정에 의해 분석하였다. 도 1은 B7-DC-Ig-APC의 중간 형광 강도 (MFI)를 프로브의 농도 (x-축)의 함수로서 보여준다. B7-DC-Ig-APC는 CHO.PD-1 세포에 결합하지만 (속이 찬 원), 형질감염되지 않은 CHO 세포에 결합하지 않는다 (회색 삼각형).

실시예 2

B7- DC - Ig 는 PD -1에 대한 결합을 위해 B7- H1 과 경쟁한다.

B7-H1-Ig를 먼저 알로피코시아닌 (APC)과 접합시켰다. 표지되지 않은 B7-DC-Ig를 다양한 농도에서 먼저 PD-1을 구성적으로 발현하는 CHO 세포주와 함께 인큐베이팅한 후, B7-H1-Ig-APC를 프로브 및 세포 혼합물에 첨가하였다. 도 2는 B7-H1-Fc-APC의 중간 형광 강도 (MFI)를 첨가된 표지되지 않은 B7-DC-Ig 경쟁자의 농도 (x-축)의 함수로서 보여준다. 표지되지 않은 B7-DC-Ig의 농도가 증가함에 따라 CHO 세포에 결합된 B7-H1-Ig-APC의 양은 감소하고, 이것은 B7-DC-Ig가 PD-1에 대한 결합을 위해 B7-H1과 경쟁함을 입증한다.

실시예 3

CT26 종양 모델

마우스 결장직장 종양 세포주 CT26을 ATCC로부터 얻었다. 계대배양 (Passage) 4에서 마스터 (master) 세포 은행을 ATCC 지침에 따라 생성하였다. 세포를 시험하고, 미코플라스마 및 다른 병원체 오염이 없음을 확인하였다. 1개의 바이알의 종양 세포를 냉동보관 원액으로부터 해동시키고, 접종 전에 2 계대배양 동안 성장시켰다.

CT26 세포를 2일 배양을 위해 30 ml 완전 배지 (RPMI + 10% FBS, 2 mM L-Glu, 및 1 x P/S)로 1:5 희석으로 또는 3일 배양을 위해 30 ml 완전 배지로 1:10 희석으로 나누었다. CT26 세포는 배지를 흡인시키고, 플라스크를 5 mL PBS로 세정하고, 5 mL 트립신을 첨가하고, 37℃에서 2 min 동안 인큐베이팅한 후, 10 mL 완전 배지로 중화시킴으로써 수거하였다. 600 x g (약 1000 rpm)에서 5 min 동안 원심분리 후에, 배지를 흡인시키고, 세포 펠렛을 10 ml 플레인 (plain) RPMI로 피펫팅함으로써 재현탁시켰다. 상기 세척 단계를 3회 반복하였다.

접종된 세포의 세포 수 및 생활력을 적합한 희석 (예를 들어 1:5 희석, 10 μL 세포 + 40 μL 트리판 블루)으로 트리판 블루 염료 염색에 의해 분석하고, 마지막 세척 단계 동안 NOVA 세포 계수에 의해 확인하였다. 접종을 위한 세포 생활력은 일반적으로 95%보다 더 컸다.

CT26 세포를 플레인 RPMI로 초기 접종을 위해 6.7 x 10⁵ 세포/mL로 희석하고, 얼음 상에 보관하였다. 일반적으로, 각각의 마우스를 150 μL (1 x 10⁵ 세포)로 접종하였다.

제9일에, 모든 종양 보유 마우스를 먼저 래트 케이지 내로 모으고, 마우스를 실험군으로 무작위로 나누었다. CTX 용액은 1x PBS에 의해 4 mg/mL로 재구성하였다. 마우스에게 20 g 마우스에 대해 2 mg, 즉 100 mg/kg로 0.5 mL의 CTX 용액을 복강내 (IP) 주사하였다.

제10일에, 마우스에게 20 g 마우스에 대해 0.1 mg, 즉 5 mg/kg로 0.5 mL의 B7-DC-Ig (0.2 mg/mL)를 IP 주사하였다. 동일한 용량을 4주 동안 매주 2회, 총 8회 용량을 제공하였다. 종양을 디지탈 캘리퍼스 (digital calipers)를 통해 B7-DC-Ig를 제공한 날에 시작하여 매주 2회 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다:

종양 부피 = π(D_short)² x (D_long)/6 = 약 0.52 x (D_short)² x (D_long).

종양 부피가 2000 mm³에 도달하면 또는 종양 접종 부위에 피부 궤양 및 감염이 있으면 마우스를 안락사시키고 연구로부터 제외하였다.

실시예 4

시클로포스파미드 및 B7- DC - Ig 의 조합물은 확립된 종양을 근절할 수 있다.

9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 상기한 바와 같이 1.0 x 10⁵ CT26 결장직장 종양 세포를 피하 이식하였다. 종양 이식 후 제10일에, 마우스에게 100 mg/kg의 시클로포스파미드를 제공하였다. B7-DC-Ig 처리는 1일 후인 제11일에 시작하였다. 마우스를 100 ㎍의 B7-DC-Ig로 매주 2회 용량으로 4주 동안, 총 8회 용량으로 처리하였다. CTX + B7-DC-Ig 치료 요법을 받은 마우스의 75%가 제44일에 확립된 종양을 근절한 반면, 대조군 CTX 단독군 내의 모든 마우스는 종양 성장의 결과로서 죽거나, 종양이 IACUC에서 승인된 크기를 초과하였으므로 안락사시켰다 (결과를 도 3에 제시함). 이들 결과는 단순한 예방만이 아니라 확립된 종양에 대한 치료 요법의 유효성을 입증한다.

실시예 5

시클로포스파미드 및 B7- DC - Ig 의 조합물은 확립된 종양을 근절하고,

종양 재접종에 대해 보호할 수 있다.

상기한 실험으로부터 확립된 CT26 결장직장 종양을 근절시킨 마우스에게 1 x 10⁵개의 CT26 세포를 제44일 및 제70일에 재접종하였다. 재접종으로부터 종양이 성장하지 않았고, 이것은 시클로포스파미드 및 B7-DC-Ig 조합 요법으로부터 장기 항-종양 면역성을 발달시켰음을 제안한다. 비히클 대조군 내의 모든 마우스는 종양을 발생하였다 (결과를 도 4에 제시함). 이들 결과는 확립된 종양에 대한 치료 요법의 유효성, 및 시클로포스파미드 및 B7-DC-Ig 조합 요법이 종양 항원에 대해 기억 반응을 생성하였음을 보여준다.

실시예 6

시클로포스파미드 및 B7- DC - Ig 의 조합물은

종양 특이적, 기억 세포독성 T 림프구를 생성할 수 있다.

상기한 실험으로부터 확립된 CT26 결장직장 종양을 근절시킨 마우스에게 2.5 x 10⁵개의 CT26 세포를 제44일에 재접종하였다. 7일 후에, 마우스 비장을 단리하였다. 마우스 비장세포를 골지 (Golgi) 차단제 (비디 바이오사이언스)의 존재 하에 5 또는 50 ㎍/mL의 난알부민 (OVA) 또는 AH1 펩티드로 6시간 동안 펄싱하였다. CD8⁺/IFNγ⁺ T 세포를 평가함으로써, 기억 T 효과기 세포를 분석하였다. 도 5의 결과는 CT26 종양을 근절시킨 마우스 내에 유의한 양의 CT26 특이적 T 효과기 세포가 존재하였음을 보여준다.

실시예 7

종양 근절에 대한 B7- DC - Ig 용량 의존의 효과

9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1.0 x 10⁵개의 CT26 결장직장 종양 세포를 피하 이식하였다. 종양 이식 후 제9일에, 마우스에게 단일 용량의 시클로포스파미드 (100 mg/kg)를 투여하고, 제10일에 30, 100 또는 300 ㎍의 B7-DC-Ig로 매주 2회 용량으로 4주 동안 총 8회 용량으로 치료를 시작하였다. 도 6은 300 ㎍에서 70%의 마우스가 종양을 근절하였고, 100 ㎍에서 40%가 종양을 근절하였고, 30 ㎍ 용량은 10% 종양 근절을 일으켰음을 보여준다.

실시예 8

시클로포스파미드 및 항- PD -1의 조합물은 확립된 종양을 근절할 수 있다.

9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1.0 x 10⁵개의 CT26 결장직장 종양 세포를 피하 접종하였다. 종양 접종 후 제11일에, 마우스에게 단일 용량의 시클로포스파미드 (100 mg/kg)를 투여하고, 4주 동안 매주 3회 투여한 항-PD-1 항체 (250 ㎍, Clone G4, [Hirano F. et al., 2005 Cancer Research])를 사용한 치료를 시작하였다. CTX + 항-PD-1 요법을 받은 마우스의 70%가 종양 접종 후 제50일에 확립된 CT26 종양을 근절한 반면, 대조군 및 항-PD-1 단독군 내의 모든 마우스는 종양 성장의 결과로서 죽거나 종양이 IACUC에서 승인된 크기를 초과하였으므로 안락사시켰다. 이들 결과는 단순한 예방만이 아니라 확립된 종양에 대한 치료 요법의 유효성을 입증한다. 결과를 도 7에 제시한다.

실시예 9

시클로포스파미드 및 항- CTLA4 의 조합물은 확립된 종양을 근절할 수 있다.

9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1.0 x 10⁵개의 CT26 결장직장 종양 세포를 피하 접종하였다. 종양 접종 후 제11일에, 마우스에게 100 mg/kg의 시클로포스파미드를 투여하였다. 항-CTLA4 (햄스터 하이브리도마로부터의 항-마우스 CTLA4 - ATCC 기탁 UC10-4F10-11) 치료를 1일 후인 제12일에 시작하였다. 마우스를 100 ㎍의 항-CTLA4로 매주 2회 용량으로 4주 동안 처리하였다. CTX + 항-CTLA4 요법을 제공받은 마우스의 56%는 종양 접종 후 제50일에 종양이 없는 반면, 대조군 내의 모든 마우스는 종양 성장의 결과로서 죽거나 종양이 IACUC에서 승인된 크기를 초과하였으므로 안락사시켰다. 결과를 도 8에 제시한다. 이들 결과는 단순한 예방만이 아니라 확립된 종양에 대한 치료 요법의 유효성을 입증한다.

실시예 10

시클로포스파미드 및 B7- DC - Ig 요법의 조합물은

종양 미세환경에서 Treg 의 감소를 일으킨다

도 9는 9 내지 11주령의 Balb/C 마우스에게 1.0 x 10⁵개의 CT26 세포를 피하 이식한 실험의 결과를 보여준다. 제9일에, 마우스에게 100 mg/kg의 CTX를 IP 주사하였다. 24시간 후인 제10일에, 마우스를 100 ㎍의 B7-DC-Ig로 처리하였다. 5개의 군이 존재하였다: 임의의 종양 세포를 투여하지 않은 나이브 마우스, 비히클 주사, CTX 단독, CTX + B7-DC-Ig, 또는 B7-DC-Ig 단독. 2마리의 나이브 마우스 및 다른 군으로부터의 4마리의 마우스를 T 세포 분석을 위해 제11일 (CTX의 2일 후) 및 제16일 (CTX의 7일 후)에 연구로부터 제거하였다. 좌측 패널은 제11일 (CTX 주사의 2일 후)에 CTX 치료한 마우스의 비장 내의 Treg가 종양을 이식하고 비히클을 주사한 마우스에서보다 유의하게 더 낮았음을 보여준다. 우측 패널은 제16일 (CTX의 7일 후 및 B7-DC-Ig 치료의 6일 후)에 B7-DC-Ig가 높은 PD-1을 발현하는 CD4+ T 세포를 유의하게 저하시켰음을 보여준다. 이것은 B7-DC-Ig 처리된 마우스 및 CTX + B7-DC-Ig 처리된 마우스 모두에서 관찰되었다. 종양 세포를 이식한 마우스는 나이브 마우스에 비해 배수 LN 내에 보다 많은 PD-1+/CD4+ T 세포를 갖도록 의도되었다.

실시예 11

시클로포스파미드 및 B7- DC - Ig 의 조합물은 전이성 전립선 종양 모델에서

마우스 생존을 촉진할 수 있다

9 내지 11주령의 B10.D2 마우스에게 모 TRAMP 세포 주사 후 폐 전이로부터 단리된 3.0 x 10⁵개의 SP-1 세포를 정맥내 주사하였다. CTX 마우스에게 3 용량의 CTX (50 mg/kg)를 제5, 12 및 19일에 제공하였다. B7-DC-Ig 처리 마우스에게 3 용량의 B7-DC-Ig (5 mg/kg)를 제6, 13 및 20일에 제공하였다. 제100일에, 대조군, 비처리군, CTX 단독군, B7-DC-Ig 단독군 내의 마우스의 17%가 생존한 반면, CTX 및 B7-DC-Ig의 조합물을 투여한 마우스의 43%가 생존하였다. 결과를 도 10에 제시한다.

실시예 12

리스테리아 암 백신 및 B7- DC - Ig 의 조합물은 CT26 간 이식 후

마우스 생존을 향상시킬 수 있다.

11-13주령의 Balb/C 마우스에게 반비장 주사 기술 (Yoshimura K et al., 2007, Cancer Research)을 이용하여 CT26 세포를 이식하였다. 제10일에, 마우스에게 CTX를 50 mg/kg로 IP로 1회 주사하였다. 24시간 후인 제11일에, 마우스를 AH1 펩티드 (CT26의 면역우성 에피토프)를 보유하는 재조합 리스테리아로 0.1 LD₅₀ (1x10⁷ CFU)로, 이어서 제14일 및 제17일에 처리하였다. 마우스를 또한 B7-DC-Ig로 제11일, 이어서 제18일에 처리하였다. 도 11은 임의로 치료하지 않은 마우스 또는 CTX 및 리스테리아 암 백신으로 처리한 마우스가 모두 제45일 전에 죽었음을 보여준다. 3중 조합물 CTX + 리스테리아 암 백신 및 B7-DC-Ig를 투여한 마우스의 60%는 생존하였다.

1. 참조문헌 목록

SEQUENCE LISTING <110> Langermann, Solomon <120> Compositions of PD-1 Antagonists and Methods of Use <130> 21682-7 <140> <141> <150> 61/211,697 <151> 2009-04-02 <150> 61/091,692 <151> 2008-08-25 <150> 61/091,709 <151> 2008-08-25 <150> 61/091,705 <151> 2008-08-25 <160> 20 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln 1 5 10 15 Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile 20 25 30 Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser 35 40 45 His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn 50 55 60 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu 65 70 75 80 Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp 85 90 95 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr 100 105 110 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr 115 120 125 His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu 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Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 17 <211> 290 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu 1 5 10 15 Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu 35 40 45 Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val 50 55 60 Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp 130 135 140 Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly 165 170 175 Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val 180 185 190 Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys 195 200 205 Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile 210 215 220 Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp 225 230 235 240 Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val 245 250 255 Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys 260 265 270 Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 18 <211> 290 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 18 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Thr Ile Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Gly Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Ile Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Ser 260 265 270 Gly Ile Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 19 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 20 <211> 288 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 20 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 1

Claims (68)

1. 포유동물에게 T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물 및 증강제를 투여하는 것을 포함하는 효과적인 치료 요법을 포함하며, 여기서 상기 치료 요법이 상기 포유동물에서 T 세포 반응의 증가를 위해 효과적인 것인, 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 제1 및 제2 펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 제1 펩티드 부분이 PD-1 길항제 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하고, 상기 제2 펩티드 부분이 면역글로불린 (Ig)의 부분을 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 PD-1 길항제 폴리펩티드가 야생형 B7-DC 폴리펩티드인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 B7-DC가 인간 B7-DC인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 활성 단편이 상기 B7-DC 폴리펩티드의 막횡단 부분의 어떠한 실질적인 부분도 포함하지 않는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 활성 단편이 상기 B7-DC 폴리펩티드의 가용형 부분을 포함하고, 상기 제2 펩티드 부분이 항체의 Fc 영역을 포함하지만 상기 항체의 어떠한 가변 영역도 포함하지 않는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 부분이 항체의 Fc 영역을 포함하지만 상기 항체의 어떠한 가변 영역도 포함하지 않는 것인 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 제1 펩티드 부분이 서열 1의 아미노산 20-221 또는 20-121에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 방법.
9. 제4항에 있어서, 상기 제1 펩티드 부분이 서열 1의 아미노산 20-221 또는 20-121의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 방법.
10. 제5항에 있어서, 상기 PD-1 결합 단편이 서열 1의 적어도 10개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 75개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 90개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
11. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열 9, 10, 12 또는 13의 서열에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
12. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열 9, 10, 12, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 단량체인 방법.
14. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 이량체의 일부인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 이량체가 동종이량체인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 이량체가 이종이량체인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 증강제가 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 증강제가 조절 T 림프구 (T-reg)의 활성을 감소시키는 작용제인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 전에 투여되는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 적어도 X 시간 전에 투여되고, 여기서 X가 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 및 30 중에서 선택되는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 치료 요법이 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 유사분열 억제제, 아로마타제 억제제, A2AR 길항제, 및 혈관신생 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 야생형 B7-DC 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 활성 단편이 상기 폴리펩티드의 막횡단 부분의 어떠한 부분도 포함하지 않는 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 B7-DC 폴리펩티드가 인간 B7-DC 폴리펩티드인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 1의 아미노산 20-221 또는 20-121에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 1의 아미노산 20-221 또는 20-121의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 방법.
27. 제23항에 있어서, 상기 PD-1 결합 단편이 서열 1 또는 19의 적어도 10개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 75개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 90개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 야생형 B7-H1 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 활성 단편이 상기 폴리펩티드의 막횡단 부분의 어떠한 부분도 포함하지 않는 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 상기 B7-H1 폴리펩티드가 인간 B7-H1 폴리펩티드인 방법.
31. 제28항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 16의 적어도 10개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 75개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 90개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
32. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 야생형 PD-1 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 활성 단편이 상기 폴리펩티드의 막횡단 부분의 어떠한 부분도 포함하지 않는 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 PD-1 폴리펩티드가 인간 PD-1 폴리펩티드인 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 활성 단편이 서열 17 또는 18의 적어도 10개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 75개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 90개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
36. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 항-PD-1 항체 또는 그의 활성 단편인 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 증강제가 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체인 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 전에 투여되는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 적어도 X 시간 전에 투여되고, 여기서 X가 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 및 30 중에서 선택되는 것인 방법.
40. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 항-CTLA4 항체 또는 그의 활성 단편인 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 증강제가 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체인 방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 전에 투여되는 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 증강제가 상기 화합물을 투여하기 적어도 X 시간 전에 투여되고, 여기서 X가 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 및 30 중에서 선택되는 것인 방법.
44. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 B7-DC, B7-H1, PD-1, B7.1의 세포외 도메인, 또는 임의의 이들의 활성 단편으로 이루어지는 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 활성 단편이 적어도 10개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 25개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 50개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 75개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 90개의 인접하는 아미노산, 또는 적어도 100개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
46. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 증가된 T 세포-매개된 면역 반응에 의해 치료가능한 질환을 치료하기 위한 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 화합물이
    (a) PD-1 길항제 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 제1 펩티드 부분 및 면역글로불린 (Ig)의 부분을 포함하는 제2 펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질;
    (b) 그의 활성 단편을 포함하는 항-PD-1 항체;
    (c) 그의 활성 단편을 포함하는 항-CTLA4 항체;
    (d) PD-1-결합 폴리펩티드 또는 PD-1 리간드-결합 폴리펩티드; 및
    (e) (a), (b), (c) 및 (d) 중 임의의 2가지 이상의 조합물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 증강제가 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체인 방법.
49. 제47항에 있어서, 상기 증강제가 조절 T 림프구 (T-reg)의 활성을 감소시키는 작용제인 방법.
50. 제47항에 있어서, 상기 증강제가 수니티닙 (수텐트 (Sutent)®), 항-TGNFβ 또는 이마티닙 (글리백 (Gleevac)®), 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 또는 IL-18 길항제인 방법.
51. 제47항에 있어서, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 유사분열 억제제, 아로마타제 억제제, A2AR 길항제, 및 혈관신생 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
52. 제46항에 있어서, 상기 질환이 감염성 질환인 방법.
53. 제46항에 있어서, 상기 질환이 암인 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 암이 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 자궁암, 난소암, 고환암, 또는 혈액암인 방법.
55. T 세포 상에서 프로그래밍된 (Programmed) 세포 사멸-1 (PD-1)을 통한 억제 신호 전달을 방지하는 화합물 및 증강제를 제약상 허용되는 담체 내에 포함하고, 상기 화합물 및 상기 증강제가 포유동물에서 T 세포 반응을 증가시키는데 유효한 양으로 함께 존재하는 것인 치료 조성물.
56. 제55항에 있어서, 상기 화합물이
    (a) PD-1 길항제 폴리펩티드의 활성 단편을 포함하는 제1 펩티드 부분 및 면역글로불린 (Ig)의 부분을 포함하는 제2 펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질;
    (b) 그의 활성 단편을 포함하는 항-PD-1 항체;
    (c) 그의 활성 단편을 포함하는 항-CTLA4 항체;
    (d) PD-1-결합 폴리펩티드, PD-1 리간드-결합 폴리펩티드, PD-1 폴리펩티드, 또는 그의 활성 단편; 및
    (e) (a), (b), (c) 및 (d) 중 임의의 2가지 이상의 조합물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
57. 제55항에 있어서, 상기 증강제가 시클로포스파미드 또는 시클로포스파미드의 유사체인 조성물.
58. 제55항에 있어서, 상기 증강제가 수니티닙 (수텐트®), 항-TGNFβ 또는 이마티닙 (글리백®), 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제인 조성물.
59. 제47항에 있어서, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 유사분열 억제제, 아로마타제 억제제, A2AR 길항제, 및 혈관신생 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 작용제를 추가로 포함하는 조성물.
60. 조합 요법에 의해 T 세포 반응을 증가시키기 위한 의약의 제조에 있어서, 증강제와 함께 투여되는, T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물의 용도.
61. 제60항에 있어서, T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 상기 화합물 및 상기 증강제가 상이한 시간에 투여하기 위한 별개의 의약으로서 제공되는 것인 용도.
62. 제61항에 있어서, 증강제가 억제성 화합물 투여 전에 24시간 이내에 투여되는 것인 용도.
63. 감염성 질환의 치료에서 제60항에 따른 화합물 및 증강제의 용도.
64. 암의 치료에서 제60항에 따른 화합물 및 증강제의 용도.
65. 제64항에 있어서, 상기 암이 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 자궁암, 난소암, 고환암, 또는 혈액암인 용도.
66. 감염성 질환의 치료에서 제60항에 따른 화합물 및 증강제의 용도.
67. (a) T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물의 투여 공급물,
    (b) 증강제의 공급물;
    (c) 제약상 허용되는 담체의 공급물; 및
    (d) 제59 내지 64항에 따른 용도로 화합물을 투여하기 위한 인쇄된 지시서
    를 포함하는, T 세포에서 억제 신호 전달을 감소시키는 화합물을 증강제와 조합하여 투여하기 위한 의료용 키트.
68. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 B7-DC, B7-H1, PD-1, 또는 B7-1의 세포외 도메인, 또는 이들과 보존적 아미노산 치환만 상이한 폴리펩티드, 및 이들의 단편으로 이루어지는 것인 방법.

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