CN109069597A - 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗 - Google Patents

间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN109069597A
CN109069597A CN201680075326.8A CN201680075326A CN109069597A CN 109069597 A CN109069597 A CN 109069597A CN 201680075326 A CN201680075326 A CN 201680075326A CN 109069597 A CN109069597 A CN 109069597A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
acid sequence
amino acid
cell
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680075326.8A
Other languages
English (en)
Inventor
J·布罗格顿
H·W·常
B·恩格斯
G·J·弗里曼
G·J·弗雷
J·M·玛塔拉扎
R·辛格
A·H·夏普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Harvard College
Dana Farber Cancer Institute Inc
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
Novartis AG
Harvard College
Dana Farber Cancer Institute Inc
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG, Harvard College, Dana Farber Cancer Institute Inc, University of Pennsylvania Penn filed Critical Novartis AG
Publication of CN109069597A publication Critical patent/CN109069597A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule

Abstract

本发明提供用于治疗与间皮素表达相关的疾病的组合物和方法，包括组合PD‑L1抑制剂施用表达间皮素特异性的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

Description

间皮素嵌合抗原受体(CAR)和抗PD-L1抗体抑制剂联用于抗癌 治疗
相关申请
本申请要求2015年12月22日提交的美国系列No.62/270780的优先权，将其全部内容按引用并入本文中。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表并且将其全部按引用并入本文中。在2016年12月20日创建的该ASCII拷贝命名为N2067-7099WO_SL.txt并且大小为520,028个字节。
发明领域
本发明总地涉及工程化表达靶向间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，免疫效应细胞)联合PD-L1抑制剂来治疗疾病的用途。
发明背景
由于正常组织的有限表达和肿瘤上的超表达，间皮素最初由Pastan和同事鉴定为肿瘤相关抗原。Chang K等，Cancer Res.1992；52(1):181-186和Chang K,等，ProcNatlAcadSciUSA.1996；93(1):136-140。间皮素基因编码前体71-kDa蛋白，其经加工产生40-kDa蛋白间皮素(其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接被锚定在细胞膜上)和氨基末端31-kDa脱落片段，称为巨核细胞增强因子(megkaryocyte potentiating factor，MPF)。两个片段都含有N-糖基化位点。已经在胰腺导管腺癌(PDA)患者的血清中发现了称为“可溶性间皮素/MPF-相关片段)”的40-kDa羧基端片段的可溶性剪接变体。Johnston,F等，ClinicalCancer Research.2009；15(21):6511。目前正在探索间皮素作为治疗靶标以及作为疾病活性和治疗应答的生物标志物的用途。Argani P等，Clin Cancer Res.2001；7(12):3862-3868。
间皮素是也存在于正常组织上的分化抗原。使用由Pastan小组研发的小鼠抗人间皮素抗体K1，已经在排列在腹膜腔、腹腔和心包腔中的间皮细胞内证明了强烈的K1反应性，尽管水平低于通常针对恶性组织看到的。Chang K等，Cancer Res.1992；52(1):181-186。在输卵管上皮、气管基底上皮和扁桃体上皮内检测到弱的K1反应性。还在所有眼角膜层上发现了间皮素。Jirsova K等，Experimental eye research.2010；91(5):623-629。然而，在大部分正常组织中没有检测到K1反应性，包括肝、肾、脾、骨髓、淋巴结、胸腺、心肌、舌、骨骼肌、皮肤、大脑皮层、小脑、脊髓、外周神经、垂体、肾上腺、唾液腺、乳腺、甲状腺、甲状旁腺、睾丸、前列腺、附睾、宫颈上皮、肺实质、食道、小肠上皮、结肠上皮、膀胱上皮、胆囊上皮。Chang K等，Cancer Res.1992；52(1):181-186。
间皮素在绝大多数原发性胰腺癌中超表达，并且在良性胰腺组织中很少且弱表达。Argani P等，Clin Cancer Res.2001；7(12):3862-3868。上皮样恶性胸膜间皮瘤(MPM)普遍地表达间皮素，而肉瘤样MPM不表达间皮素。大部分浆液性上皮性卵巢癌和相关的原发性腹膜癌表达间皮素。
间皮素是卵巢癌中天然免疫应答的靶标，并且已经提出作为癌症免疫治疗的靶标。Bracci L等，Clin Cancer Res.2007；13(2Pt 1):644-653；Moschella F等，CancerRes.2011；71(10):3528-3539；Gross G等，FASEB J.1992；6(15):3370-3378；Sadelain M等，NatRevCancer.2003；3(1):35-45；Muul LM等，Blood.2003；101(7):2563-2569；Yee C等，Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(25):16168-16173。胰腺癌患者中间皮素特异性CTL的存在与总生存期相关。Thomas AM等，J Exp Med.2004；200:297-306。此外，Pastan和同事已经使用缀合免疫毒素的抗间皮素抗体的可溶性抗体片段来治疗患有间皮素阳性肿瘤的癌症患者。这种方法已经在胰腺癌患者中证明了充分的安全性和一定的临床活性。Hassan R等，Cancer Immun.2007；7:20和Hassan R等，Clin Cancer Res.2007；13(17):5144-5149。在卵巢癌中，这种治疗策略按照RECIPT标准产生了一个轻微应答，并且在第二名患者中产生了稳定的疾病，所述患者的腹水也完全消退。
发明概述
本发明公开至少部分涉及，通过使用包括表达特异性地结合间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，免疫效应细胞)(在本文中也称为“间皮素CAR表达细胞”)和程序化死亡配体1的抑制剂(在本文中也称为“PD-L1抑制剂”)的联合治疗，来治疗受试者中的间皮素表达相关疾病(例如，癌症)的方法和组合物。在一些实施方案中，特异性结合间皮素的CAR包括抗原结合结构域(例如间皮素结合结构域)、跨膜结构域、和胞内信号结构域(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗体分子、多肽、小分子或多核苷酸，例如，抑制性核酸。在一个实施方案中，所述PD-L1抑制剂是抗体分子，例如，本文中所述的抗体分子。不希望受到理论的束缚，认为用包括间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂的联合治疗来治疗患有间皮素表达相关疾病(例如，本文中所述的癌症)的受试者，可以导致受试者中提高的肿瘤进展抑制或降低，例如，与使用单独的间皮素CAR表达细胞或PD-L1抑制剂治疗患有所述疾病的受试者相比。
因此，在一个方面中，本公开涉及，治疗患有与间皮素表达相关的疾病(例如，本文中所述的癌症)的受试者的方法。所述方法包括将包含(例如表达)特异性地结合间皮素的CAR的细胞(例如，细胞群)和PD-L1抑制剂施用于受试者。在一个实施方案中，将CAR表达细胞和PD-L1抑制剂依次施用。在一个实施方案中，在间皮素CAR表达细胞施用前，施用PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，在间皮素CAR表达细胞施用后，施用PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂和间皮素CAR表达细胞同时或并行地(simultaneously或concurrently)施用。
在一些实施方案中，以一定的治疗间隔来施用CAR表达细胞(例如，本文中所述的间皮素CAR表达细胞)和PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，所述治疗间隔包括单剂PD-L1抑制剂和单剂CAR表达细胞。在另一个实施方案中，所述治疗间隔包括第一剂和第二剂PD-L1抑制剂和一剂CAR表达细胞。
在治疗间隔包括单剂PD-L1抑制剂和单剂CAR表达细胞的实施方案中，在该单剂CAR表达细胞前施用该单剂PD-L1抑制剂，并且所述治疗间隔在该单剂PD-L1抑制剂施用时开始并且在该单剂CAR表达细胞施用时结束。在一个实施方案中，所述治疗间隔进一步包括后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4或5或更多剂)的PD-L1抑制剂。在这样的实施方案中，所述治疗间隔包括两、三、四、五、六或更多剂PD-L1抑制剂和一剂CAR表达细胞。在一个实施方案中，在施用一剂PD-L1抑制剂后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周施用该剂CAR表达细胞。在施用一剂以上的PD-L1抑制剂的实施方案中，在施用第一剂PD-L1抑制剂后或在所述治疗间隔开始后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周施用该剂CAR表达细胞。在一个实施方案中，在该剂PD-L1抑制剂施用后约2天施用该剂CAR表达细胞。
在治疗间隔包括第一和第二剂PD-L1抑制剂和一剂CAR表达细胞的实施方案中，在第一剂PD-L1抑制剂施用后但在第二剂PD-L1抑制剂施用前，施用该剂CAR表达细胞。在这样的实施方案中，治疗间隔在施用第一剂PD-L1抑制剂时开始，并在第二剂PD-L1抑制剂施用时完成。在一个实施方案中，在第一剂PD-L1抑制剂施用后至少5天、7天、1周、2周、3周或4周，施用第二剂PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，在第一剂PD-L1抑制剂施用后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用该剂CAR表达细胞。在一个实施方案中，在该剂CAR表达细胞施用后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周或3周，施用第二剂PD-L1抑制剂。
在一个实施方案中，本文中描述的任一个治疗间隔可以重复一次或多次，例如，1、2、3、4或5次以上。在一个实施方案中，治疗间隔重复一次，形成包括两个治疗间隔的治疗方案。在一个实施方案中，在完成第一个或前一个治疗间隔后至少1天，例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用重复的治疗间隔。在一个实施方案中，在完成第一个或前一个治疗间隔后至少3天，施用重复的治疗间隔。
在一个实施方案中，本文中描述的任一个治疗间隔可以接着一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)随后的治疗间隔。所述一个或多个随后的治疗间隔不同于第一个或前一个治疗间隔。例如，由单剂PD-L1抑制剂和单剂CAR表达细胞组成第一治疗间隔，接着是由两剂PD-L1抑制剂和单剂CAR表达细胞组成的第二治疗间隔。在一个实施方案中，在完成第一个或前一个治疗间隔后至少1天，例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用所述一个或多个随后的治疗间隔。
在本文中描述的任一个方法中，在完成一个或多个治疗间隔后，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、5或更多剂)PD-L1抑制剂。在重复治疗间隔或施用两个或更多个治疗间隔的实施方案中，在完成一个治疗间隔后并且在另一个治疗间隔开始前，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、5剂)PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，在完成一个或多个或每个治疗间隔后，每5天、7天、2周、3周或4周，施用一剂PD-L1抑制剂。
在本文中的任一个方法中，在完成一个或多个治疗间隔后，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、或5或更多剂)CAR表达细胞。在重复所述治疗间隔或施用两个或更多个治疗间隔的实施方案中，在完成一个治疗间隔后并且在另一个治疗间隔开始前，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、5或更多剂)CAR表达细胞。在一个实施方案中，在完成一个或多个或每个治疗间隔后，每2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周或4周，施用一剂CAR表达细胞。
在一个实施方案中，治疗间隔包括在单剂CAR表达细胞之前施用单剂PD-L1抑制剂。在这个实施方案中，在该剂PD-L1抑制剂施用后2天施用该剂CAR表达细胞。治疗间隔重复一次，并且在完成第一个治疗间隔后(例如，在单剂CAR表达细胞施用后)3天开始第二个治疗间隔。在一个实施方案中，在完成第二个治疗间隔后，每5天施用所述PD-L1抑制剂，例如，在第二个治疗间隔后，每5天、7天、2周、3周或4周施用一剂或多剂PD-L1抑制剂。
在本文中所述的任一个方法中，给受试者施用单剂CAR表达细胞和单剂PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，在施用单剂PD-L1抑制剂后至少2天，例如，2、3、4、5、6、7天，或2周，施用单剂CAR表达细胞。
在一个实施方案中，在首剂的CAR表达细胞后，向受试者施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、5剂)CAR表达细胞。在一个实施方案中，在该前一剂CAR表达细胞后至少2天，例如，2、3、4、5、6、7天或2周，施用该后续的一剂或多剂CAR表达细胞。在一个实施方案中，在该前一剂的CAR表达细胞后至少5天，施用该后续的一剂或多剂CAR表达细胞。在一个实施方案中，受试者每周施用三剂CAR表达细胞或每2天施用一剂。
在一个实施方案中，在施用单剂PD-L1抑制剂后，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4、5剂)PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，在该前一剂PD-L1抑制剂后至少5天、7天、2周、3周或4周，施用该后续的一剂或多剂PD-L1抑制剂。
在一个实施方案中，在一剂CAR表达细胞(例如，首剂的CAR表达细胞)后至少1、2、3、4、5、6或7天，施用后续的一剂或多剂PD-L1抑制剂。
在一个实施方案中，在第一剂CAR表达细胞之前，施用一剂或多剂(例如，1、2、3、4或5剂)PD-L1抑制剂。
在一个实施方案中，重复该一剂或多剂CAR表达细胞和该一剂或多剂PD-L1抑制剂的施用，例如重复1、2、3、4或5次以上。
在本文中所述的任一个施用方案或治疗间隔中，一剂间皮素CAR表达细胞包括至少约1×107，1.5×107，2×107，2.5×107，3×107，3.5×107，4×107，5×107，1×108，1.5×108，2×108，2.5×108，3×108，3.5×108，4×108，5×108，1×109，2×109或5×109个细胞。在一些实施方案中，一剂间皮素CAR表达细胞包括至少约1-3×107至1-3×108。在一些实施方案中，给受试者施用约1-3×107个间皮素CAR表达细胞。在其他实施方案中，给受试者施用约1-3×108个间皮素CAR表达细胞。
在本文中所述的任一个施用方案中，一剂PD-L1抑制剂(例如，本文中所述的抗PD-L1抗体分子)包括约1至30mg/kg，例如，约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，约1至5mg/kg，或约3mg/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约10至20mg/kg。在一个实施方案中，所述剂量为约1至5mg/kg。在一个实施方案中，所述剂量低于5mg/kg，低于4mg/kg，低于3mg/kg，低于2mg/kg或低于1mg/kg。
在另一个方面中，本公开涉及，包含本文中所述的表达间皮素CAR的细胞和本文中所述的PD-L1抑制剂的组合物(例如，一个或多个剂量制剂、组合，或一个或多个药物组合物)。在一个实施方案中，如本文中所述的，间皮素CAR包括间皮素抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。在一个实施方案中，间皮素CAR包括表2中所列的间皮素抗原结合结构域。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如，融合蛋白)或抑制性核酸，例如，siRNA或shRNA。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括抗体分子，例如，表6中所列的抗体分子。所述CAR表达细胞和PD-L1抑制剂可以在相同或不同制剂或药物组合物中。
在另一个方面中，本公开涉及，包含本文中所述的表达间皮素CAR的细胞和本文中所述的PD-L1抑制剂的组合物(例如，一个或多个剂量制剂、组合、或一个或多个药物组合物)，用于治疗间皮素表达相关疾病(例如，本文中所述的癌症)的方法中。在一个实施方案中，如本文中所述的，间皮素CAR包括间皮素抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。在一个实施方案中，间皮素CAR包括表2中所列的间皮素抗原结合结构域。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如，融合蛋白)或抑制性核酸，例如，siRNA或shRNA。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括抗体分子，例如，表6中所列的抗体分子。所述CAR表达细胞和PD-L1抑制剂可以在相同或不同制剂或药物组合物中。
PD-L1抑制剂
本文中提供了用于本文中所述的任一个方法或组合物中的PD-L1抑制剂。在本文中所述的任一个方法或组合物中，所述PD-L1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如，融合蛋白)或抑制性核酸，例如，siRNA或shRNA。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂的特征在于以下的一个或多个：抑制或降低PD-L1表达，例如，PD-L1的转录或翻译；抑制或降低PD-L1活性，例如，抑制或降低PD-L1与其受体(例如，PD-1或CD80(B7-1)或两者)的结合；或结合PD-L1或其受体，例如，PD-1。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A(atezolizumab)、MEDI-4736、MSB-0010718C(avelumab)、MDX-1105、和表6列出的任何抗PD-L1抗体分子。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括抗PD-L1抗体分子，其包括表6中所列的任一个PD-L1抗体分子氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表6中所列的任一个PD-L1抗体分子氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括选自SEQ ID NO:287、290或195的HC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:288的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:289的HC CDR3氨基酸序列；以及SEQID NO:295的LC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:296的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:297的LC CDR3氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体包括选自SEQ ID NO:287、290或195的HC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:291的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:292的HCCDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:298的LC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:299的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:300的LC CDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链可变区，所述重链可变区包括表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链可变区，所述重链可变区包括对表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链可变区，所述重链可变区包括与表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链，所述重链包含表6中所列的任一条重链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:306、318、326、334、338、342、350、358、366、393、377或382。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链，所述重链包括对表6中所列的任一条重链(例如，SEQ ID NO:306、318、326、334、338、342、350、358、366、393、377或382)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括重链，所述重链包括与表6中所列的任一条重链的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:306、318、326、334、338、342、350、358、366、393、377或382)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链可变区，所述轻链可变区包括表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链可变区，所述轻链可变区包括对表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链，所述轻链包括表6中所列的任一条轻链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链，所述轻链包括对表6中所列的任一条轻链(例如，SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括轻链，所述轻链包括与表6中所列的任一条轻链的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括：
i)包括SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:308的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ii)包括SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iii)包括SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iv)包括SEQ ID NO:316的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:320的氨基酸序列的轻链可变结构域；
v)包括SEQ ID NO:316的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vi)包括SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vii)包括SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:360的氨基酸序列的轻链可变结构域；
viii)包括SEQ ID NO:332的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ix)包括SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
x)包括SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:308的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xi)包括SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xii)包括SEQ ID NO:340的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:344的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiii)包括SEQ ID NO:340的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiv)包括SEQ ID NO:348的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xv)包括SEQ ID NO:348的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:386的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvi)包括SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
xvii)包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链可变结构域和包括SEQ ID NO:368的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括：
i)包括SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:310的氨基酸序列的轻链；
ii)包括SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链；
iii)包括SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
iv)包括SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链；
v)包括SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
vi)包括SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
vii)包括SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:362的氨基酸序列的轻链；
viii)包括SEQ ID NO:334的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
ix)包括SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
x)包括SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:310的氨基酸序列的轻链；
xi)包括SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xii)包括SEQ ID NO:342的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:346的氨基酸序列的轻链；
xiii)包括SEQ ID NO:342的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xiv)包括SEQ ID NO:350的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
xv)包括SEQ ID NO:350的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xvi)包括SEQ ID NO:358的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
xvii)包括SEQ ID NO:366的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:370的氨基酸序列的轻链；
xviii)包括SEQ ID NO:393的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链；
xix)包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；或
xx)包括SEQ ID NO:382的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链。
间皮素CAR表达细胞
本文中提供了表达靶向(例如，特异性地结合)间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，例如，免疫效应细胞，用于本文中所述任一个方法或组合物中。特异性地结合间皮素的CAR在本文中也称为“间皮素CAR或mesoCAR”。由本文中所述的间皮素CAR表达细胞表达的间皮素CAR包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域包括共刺激结构域和/或初级信号结构域。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包括表2中所列的任一个间皮素重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表2中所列的任一个间皮素轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包括根据表4中的HC CDR氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，以及根据表5中的LC CDR氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包括选自以下的氨基酸序列(例如，由以下的氨基酸序列组成)：SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ ID NO:39，SEQ IDNO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ IDNO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含与SEQID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54，SEQ IDNO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:62中的任一个具有至少一个、两个或三个改变但不超过30、20或10个改变(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列(或由所述氨基酸序列组成)。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含与SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ IDNO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ IDNO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ IDNO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62中的任一个氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列(或由所述序列组成)。
在一个实施方案中，间皮素CAR包括跨膜结构域，其包含蛋白质(例如，本文中所述的蛋白质)的跨膜结构域，所述蛋白质例如选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列含有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码跨膜结构域的核酸序列包括SEQ ID NO:17的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域通过铰链区(例如，本文中所述的铰链区)连接跨膜结构域。在一个实施方案中，编码的铰链区包含SEQ ID NO:2，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域(例如，本文中所述的共刺激结构域)的序列。在一些实施方案中，所述胞内信号结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述胞内信号结构域包含初级信号结构域。在一些实施方案中，所述胞内信号结构域包含共刺激结构域和初级信号结构域。
在一个实施方案中，所述共同刺激结构域是来自蛋白质的功能性信号结构域，所述蛋白为例如本文中所述的蛋白，例如，选自I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性地结合CD83的配体。
在一个实施方案中，4-1BB的共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码的共刺激结构域包含相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码共刺激结构域的核酸序列包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中，CD28的共刺激结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含相对于SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码CD28的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中，CD27的共刺激结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含相对于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码CD27的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，ICOS的共刺激结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一个实施方案中，ICOS的共刺激结构域包含相对于SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码ICOS的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，初级信号结构域(primary signaling doamain)包含CD3ζ的功能性信号结构域。在一些实施方案中，所述CD3ζ的功能性信号结构域包含SEQ ID NO:9(突变CD3ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)的氨基酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含4-1BB的功能性信号结构域和/或CD3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，4-1BB的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:7的序列和/或CD3ζ的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中所述胞内信号结构域包含的序列在相同框中表达并且作为单条多肽链来表达。在一个实施方案中，编码胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列，或与其具有95-99％的序列，和/或SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的CD3ζ核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含CD27的功能性信号结构域和/或CD3ζ的功能性结构域。在一个实施方案中，编码的CD27的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:8的序列，和/或编码的CD3ζ的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含相对于SEQ ID NO:8的氨基酸序列和/或SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:8的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中所述胞内信号结构域包含的序列在相同框中表达并且作为单条多肽链来表达。在一个实施方案中，编码CD27的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列，或与其具有95-99％的序列，和/或编码CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含CD28的功能性信号结构域和/或CD3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，CD28的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列和/或CD3ζ的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含相对于SEQ ID NO:43的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:43的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中所述胞内信号结构域包含的序列在相同框中表达并且作为单条多肽链来表达。在一个实施方案中，编码CD28的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列，或与其具有95-99％的序列，和/或编码CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含ICOS的功能性信号结构域和/或CD3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，ICOS的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:45的序列和/或CD3ζ的胞内信号结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含相对于SEQ ID NO:45的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:45的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中所述胞内信号结构域包含的序列在相同框中表达并且作为单条多肽链来表达。在一个实施方案中，编码ICOS的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，或与其具有95-99％的序列，和/或编码CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，间皮素CAR进一步包含前导序列，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一个实施方案中，间皮素CAR包含SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ IDNO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ IDNO:76，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中的任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，间皮素CAR包含与SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ IDNO:76，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，间皮素CAR包含与SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:84，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中的任一个具有95-99％同一性的氨基酸序列。
在本文中的任一个方法和组合物的实施方案中，包含CAR的细胞包含编码CAR的核酸。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸是慢病毒载体。在一个实施方案中，通过慢病毒转导将编码CAR的核酸引入细胞中。在一个实施方案中，编码CAR的核酸是RNA，例如，体外转录的RNA。在一个实施方案中，通过电穿孔将编码CAR的核酸引入细胞中。
在本文中的任一个方法和组合物的实施方案中，细胞是T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，T细胞是自体或同种异体T细胞。
在一个实施方案中，方法进一步包含施用用于治疗本文中疾病的其他治疗剂，例如，抗癌治疗剂。
在本文中的任一个方法和组合物的实施方案中，与间皮素表达相关的疾病是癌症。在一个实施方案中，癌症选自间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺转移性癌、卵巢癌、或结直肠癌和膀胱癌，或其转移。
在本文中的任一个方法和组合物的实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，人。在一个实施方案中，受试者表达PD-L1和/或PD-L2。在一个实施方案中，受试者中的癌细胞或紧邻癌细胞的细胞，例如，癌相关细胞，表达PD-L1和/或PD-L2。在一个实施方案中，癌相关细胞是抗肿瘤免疫细胞，例如，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一个实施方案中，表达CAR的细胞，例如，本文中的间皮素CAR表达细胞，表达PD-L1和/或PD-L2。
除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文中的那些相似或等同的方法和材料，但以下将描述适宜的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献按引用完整地并入。此外，材料、方法和实例只是举例说明性的，并不旨在限制。标题、副标题或标数字或标字母的元素，例如，(a)、(b)、(i)等，只是为了易于阅读呈现的。在本文件中标题或标数字或标字母的元素的使用不要求这些步骤或元素以字母顺序进行，或这些步骤或元素必需彼此分开。从说明书描述和附图，以及从权利要求书，将清楚本发明的其他特征、目的和优势。
附图简述
图1A显示了CAR T细胞上PD1表达的流式细胞术分析。显示了表达PD1的CD8+CAR+细胞的百分比。在过继性转移至带有Panc02.03肿瘤的NSG小鼠后30天，分析了骨髓、脾脏和肿瘤。取自肿瘤但不是其他器官的CAR T细胞大部分是PD1表达阳性的(超过60％)。用抗-CD8a(BioLegend，RPAT8)、抗-PD1(BD Bioscience，EH12.1)、抗-PDL1(BD Bioscience，M1H1)、蛋白L-生物素和链霉亲和素-PE，染色CART。
图1B显示了Panc02.03癌细胞上的PDL1和PDL2表达的流式细胞术分析。显示了在体外和体内分析时，来自图1A中分析的相同肿瘤的Panc02.03癌细胞的PDL1和PDL2表达。用抗-PDL1(Biolegend，29E.2A3)和抗-PDL2(Biolegend，24F.10C12)，染色癌细胞。
图2显示了使用间皮素CART和PD-L1抑制剂的各种联合治疗后的肿瘤进展图，其中在CAR施用之前，施用PD-L1抑制剂。在由#表示的时间点施用PD-L1抗体。在由*表示的时间点施用所示的CAR表达细胞。收集组织的时间点由X-轴上的星形来表示。
图3是用间皮素CART和PD-L1抑制剂的各种联合治疗后的肿瘤进展图，其中在CAR施用之后，施用PD-L1抑制剂。在由#表示的时间点施用PD-L1抗体。在由*表示的时间点施用所示的CAR表达细胞。
图4是在用M5间皮素CART治疗后来自Panc异种移植物组织的免疫组织化学分析的一系列图。
图5是用M5间皮素CART治疗后来自Panc异种移植物组织的免疫组织化学分析的一系列图。
图6显示了在细胞培养系统中通过低剂量的RAD001增强了表达CAR的、转导的T细胞的增殖。在不同浓度的RAD001的存在下，将CART与Nalm-6细胞共同培养。共同培养4天后，评估CAR阳性CD3阳性T细胞(黑色)和总T细胞(灰色)的数量。
图7描绘了每日施用0.3、1、3和10mg/kg(mpk)剂量的RAD001或施用溶媒(vehicle)的NALM6-luc细胞的肿瘤生长测量。圆圈表示溶媒；方块表示10mg/kg剂量的RAD001；三角形表示3mg/kg剂量的RAD001，倒三角表示1mg/kg剂量的RAD001；而菱形表示0.3mg/kg剂量的RAD001。
图8，包含图8A和8B，显示了药物动力学曲线，该曲线显示了在带有NALM6肿瘤的NSG小鼠血液中的RAD001含量。图8A显示了第一剂RAD001后第0天的PK。图8B显示了最后一剂RAD001后第14天的PK。菱形表示110mg/kg剂量的RAD001；方块表示1mg/kg剂量的RAD001；三角形表示3mg/kg剂量的RAD001；而x表示10mg/kg剂量的RAD001。
图9，包含图9A和9B，显示了使用和未用RAD001施用的人源化CD19CART细胞的体内增殖。每日低剂量的RAD001(0.003mg/kg)导致CAR T细胞增殖的增强，高于huCAR19增殖的正常水平。图9A显示了CD4+CAR T细胞；图9B显示了CD8+CAR T细胞。圆圈表示PBS；方块表示huCTL019；三角形表示使用3mg/kg RAD001的huCTL019；倒三角表示使用0.3mg/kg RAD001的huCTL019；菱形表示使用0.03mg/kg RAD001的huCTL019；而圆圈表示使用0.003mg/kgRAD001的huCTL019。
发明详述
定义
除非另外指出，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“a”和“an”是指一个或一个以上(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“元素”(an element)表示一个元素或一个以上元素。
术语“约”涉及可测量值时，如含量、时间持续长度等，旨在涵盖偏离规定值的±20％变化，或在一些情况中±10％变化，或在一些情况中±5％变化，或在一些情况中±1％变化，或在一些情况中±0.1％变化，当这样的变化适用于实施本公开的方法时。
如本文中使用的，“联合”施用表示，两种(或更多种)不同的治疗在受试者罹患病症的过程中被递送给受试者，例如，在受试者已经被诊断为患病后并且在病症治愈或消除或出于其他原因停止治疗前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二种开始递送时仍然进行，由此就施用而言存在重叠。这有时候在本文中被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗开始递送前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，使用较少的第二种治疗看到等同的效果，或与不存在第一种治疗的情况下施用第二种治疗时看到的相比，第二种治疗更大程度地减轻症状，或使用第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状减轻，或与病症相关的其他参数高于在不存在另一种治疗的情况下使用一种治疗观察到的参数。两种治疗的效果可以是部分相加、完全相加或高于相加。递送可以使得递送的第一种治疗的效果在第二种治疗递送时仍然是可检测的。
术语“嵌合抗原受体”或可替换地“CAR”是指，至少包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和包含源自以下定义的刺激分子的功能性信号结构域的胞质信号结构域(在本文中也称为“胞内信号结构域”)的重组多肽构建体。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域不彼此邻接，例如，在不同的多肽链中，例如，在如本文中的RCAR中提供的。
在一个方面中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面中，胞质信号结构域包含初级信号结构域(例如，CD3-ζ的初级信号结构域)。在一个方面中，胞质信号结构域进一步包含源自以下定义的至少一个共刺激分子的一个或多个功能性信号结构域。在一个方面中，共刺激分子选自4-1BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和包含源自刺激分子的功能性信号结构域的胞内信号结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、以及包含源自共刺激分子的功能性信号结构域和源自刺激分子的功能性信号结构域的胞内信号结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、以及包含源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号结构域和源自刺激分子的功能性信号结构域的胞内信号结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、以及包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号结构域和源自刺激分子的功能性信号结构域的胞内信号结构域。在一个方面中，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)包含任选的前导序列。在一个方面中，CAR进一步在胞外抗原结合结构域的N-末端包含前导序列，其中前导序列任选在细胞加工和将CAR定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如，scFv)上断裂。
术语“信号结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过产生第二信使、或者通过响应该信使而作为效应物发挥作用，起着经由确定的信号传导途径将信息传递至细胞内以调节细胞活性的作用。在一些方面中，本文中的CAR的信号结构域源自本文中描述的刺激分子或共刺激分子，或是合成的或工程化的信号结构域。
在本文中，术语“间皮素”是指40-kDa蛋白质间皮素(其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接而锚定在细胞膜上)、和氨基末端31-kDa脱落片段(称为巨核细胞增强因子，MPF)。两个片段都含有N-糖基化位点。该术语还指40-kDa羧基末端片段的可溶性剪接变体，也称为“可溶性间皮素/MPF-相关片段”。优选，该术语是指GenBank登录号AAH03512.1的人间皮素，及其天然断裂的部分，例如，在细胞膜上表达的，例如，癌细胞膜上表达的间皮素。
如本文中使用的，术语“抗体”或“抗体分子”是指源自免疫球蛋白分子的特异性地与抗原结合的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链，或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方案中，抗体或抗体分子包含抗体片段(例如，由抗体片段组成)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分，或其重组变体，并且指完整抗体中足以赋予抗体片段对靶标(如抗原)的识别和特异性结合的抗原结合结构域，例如，完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、驼类VHH结构域、和从抗体片段形成的多特异性抗体，如包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，以及分离的CDR、或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段也可以并入单结构域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体、纳米抗体、intrabody、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、v-NAR和双-scFv中(参见，例如，Hollinger and Hudson，NatureBiotechnology 23:1126-1136，2005)。抗原结合片段也可以基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))嫁接至支架中(参见美国专利No.:6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区经由短的柔性多肽衔接物而连续连接，并且能够作为单链多肽表达，并且其中scFv保留衍生其的完整抗体的特异性。除非特意指出，否则如本文中的scFv可以具有任何顺序的VL和VH可变区，例如，就多肽的N-末端和C-末端而言，scFv可以包含VL-衔接物-VH或可以包含VH-衔接物-VL。
如本文中使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的氨基酸序列，其赋予抗原特异性和结合亲和性。例如，一般而言，在每个重链可变区中存在三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)，在每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定一个给定CDR的精确氨基酸序列边界，所述方案包括Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)，或其组合。在一些实施方案中，依据Kabat编号方案，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在一些实施方案中，依据Chothia编号方案，VH中的CDR氨基酸残基编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在一些实施方案中，在组合的Kabat和Chothia编号方案中，CDR对应的氨基酸残基是部分的Kabat CDR、Chothia CDR或两者。例如，在一些情况中，CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
本发明CAR中包含抗体或其抗体片段的部分可以以各种形式存在，其中抗原结合结构域作为一条连续多肽链的一部分表达，包括例如，scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、驼类VHH结构域、人源化抗体、双特异性抗体、抗体缀合物(Harlow等，1999，见：Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；Harlow等，1989，见：Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988，Science 242:423-426)。在一个方面中，本发明CAR的抗原结合结构域抗体片段。在再一个方面中，CAR包含抗体片段，该抗体片段包含scFv。
如本文中使用的，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语抗体分子涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子涵盖“结合结构域”(在本文中也称为“抗靶标(例如，间皮素)结合结构域”)。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一个免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性，而多个中的第二个免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体分子具有针对不超过两个抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指，在天然构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者，并且其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指，在天然构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者。kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为表示，通过合成编码抗体的DNA分子(该DNA分子表达抗体蛋白)、或定义该抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列使用本领域可利用的且公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有蛋白质或肽，均可以作为抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此将编码“抗原”(如本文中对该术语的使用)。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要完全由基因的全长核苷酸序列来编码。清楚地，本发明包括，但不限于，使用一个以上基因的部分核苷酸序列，其中这些核苷酸序列以各种组合排列来编码引发所需免疫应答的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”来编码。清楚地，抗原可以合成产生，或可以源自生物样品，或可以是除了多肽以外的其他大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于，组织样品、肿瘤样品、细胞或含有其他生物组分的流体。
术语“抗癌效果”是指可以通过各种方式呈现的生物效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减小、癌细胞数量的减少、转移数量的减少、预期寿命的延长、癌细胞增殖的降低、癌细胞存活的降低、或各种与癌性病症相关的生理症状的改善。“抗癌效果”还可以通过肽、多肽、细胞和抗体预防癌症在第一个位置出现的能力来呈现。术语“抗肿瘤效果”是指，可以通过各种方式呈现的生物效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、肿瘤细胞增殖的减少，或肿瘤细胞存活的降低。
术语“自体”是指，源自个体的任何材料，该材料之后将重新引入该同一个体中。
术语“同种异体”是指，源自与待引入材料的个体同一物种的不同动物的任何材料。对于两个或两个以上的个体，当一个或多个基因座的基因不同时，称这两个或两个以上个体彼此是同种异体的。在一些方面中，来自同一物种的个体的同种异体材料在遗传上足够不相似，以致会发生抗原相互作用。
术语“异种”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控生长的疾病。癌症包括所有类型的癌性生长或致癌性过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论其组织病理学类型或侵袭阶段。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文中描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于，间皮瘤、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
短语“与间皮素表达相关的疾病”包括，但不限于，与间皮素表达相关的疾病或与表达间皮素的细胞相关的病症，包括例如，增殖性疾病，如癌症或恶性或前癌性病症，如间皮细胞性增生；或与表达间皮素的细胞相关的非癌相关指征。各种表达间皮素的癌症的实例包括但不限于，间皮瘤、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“保守性序列修饰”是指没有显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守性修饰包括氨基酸置换、添加和删除。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守性氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代并且可以测试改变的CAR，例如，使用本文中的功能性试验来测试其结合间皮素的能力。
术语“刺激”是指，由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其关连配体(或在CAR的情况中，肿瘤抗原)的结合诱发的初级应答，由此介导信号传导事件，如，但不限于，经由TCR//CDR复合物的信号传导，或经由合适的NK受体或CAR的信号结构域的信号传导。刺激可以介导某些分子改变的表达，如TGF-β的下调，和/或细胞骨架结构的重组，等等。
术语“刺激分子”是指，由免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，该分子提供胞质信号序列，所述序列可以以刺激方式(对于免疫效应细胞信号途径(例如，T细胞信号途径)的至少一些方面)调控免疫效应细胞的激活。在一个方面中，信号是例如由TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合启动的初级信号，该信号导致T细胞应答的介导，包括但不限于，增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号序列(也称为“初级信号结构域”)可以含有称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号序列的实例包括，但不限于，源自CD3ζ、common FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12和CD66d的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任一个或多个CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号序列，例如，CD3ζ的初级信号序列。在本发明的特定CAR中，CD3ζ的初级信号序列是作为SEQ ID NO:18提供的序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。在本发明的特定CAR中，CD3ζ的初级信号序列是作为SEQ ID NO:20提供的序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。
术语“抗原递呈细胞”或“APC”是指，在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其递呈至T细胞。
如本文中使用的术语“胞内信号结构域”是指，分子的胞内部分。胞内信号结构域产生促进CAR表达细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的免疫效应功能的信号。例如CART细胞或表达CAR的NK细胞中，免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助(helper)活性，包括细胞因子的分泌。尽管可以使用完整的胞内信号结构域，但在许多情况中，不需要使用整条链。就使用胞内信号结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以替代完整链来使用，只要其传导效应子功能信号。术语胞内信号结构域因此旨在包括足以传导效应子功能信号的胞内信号结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，胞内信号结构域可以包含初级胞内信号结构域。示例性初级胞内信号结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号结构域包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号结构域是合成或工程化的。例如，在表达CAR的免疫效应细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的情况中，初级胞内信号结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，共刺激胞内信号结构域可以包含来自共同受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号结构域可以包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号基序。含有ITAM的初级胞质信号序列的实例包括，但不限于，源自CD3ζ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或可替换地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为GenBan登录号No.BAG36664.1提供的蛋白质，或来自非人物种的等价残基，非人物种例如为小鼠、啮齿动物、猴、猿等，并且“ζ刺激结构域”或替换地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的胞质结构域的足以功能性传递T细胞激活所需的初始信号的氨基酸残基。在一个方面中，ζ的胞质结构域包含GenBan登录号No.BAG36664.1的残基52至164，或来自非人物种的等价残基(其功能直系同源物)，非人物种例如为小鼠、啮齿动物、猴、猿等。在一个方面中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:18提供的序列。在一个方面中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:20提供的序列。本文中还涵盖相对于本文中的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:20)包含一个或多个突变的CD3ζ结构域。
术语“共刺激分子”是指T细胞上特异性地与共刺激配体结合的关连结合配偶体，由此介导通过T细胞的共刺激应答，如，但不限于，增殖。共刺激分子是除了有效免疫应答需要的抗原受体或其配体以外的其他细胞表面分子。共刺激分子包括，但不限于，I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，和特异性地与CD83结合的配体。
共刺激胞内信号结构域可以是共刺激分子的胞内部分。胞内信号结构域可以包含其来源分子的完整胞内部分，或完整的天然胞内信号结构域，或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指具有GenBank登录号No.AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基的TNFR超家族成员；而“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。在一个方面中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ IDNO:14提供的序列或来自非人物种的等价残基，非人物种例如为小鼠、啮齿动物、猴、猿等。
如本文中使用的术语“免疫效应细胞”是指，参与免疫应答(例如，促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包含T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
如本文中使用的术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指，(例如免疫效应细胞)增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指T或NK细胞促进杀灭靶细胞或抑制靶细胞的生长或增殖的特性。在T细胞的情况中，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的专化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA，或mRNA)中特定的核苷酸序列作为模板用于生物过程中合成具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的固有特性以及由其导致的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)，两者都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
除非另外指出，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。如果编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子，则短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可以包含内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文中描述能有效实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。
术语“内源性的”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源性的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
术语“表达”是指特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将该分离的核酸递送至细胞内部的组成物(a composition of matter)。各种载体是本领域已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括有助于将核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以通过宿主细胞来提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括可以并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridae)的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将相当大量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可以用于临床中的慢病毒载体的其他实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源”或“同一性”是指两个聚合分子之间的亚单位序列同一性，例如，两个核酸分子之间，如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间。当两个分子在一个亚单位位置上被相同的单体亚单位占据时，例如，如果两个DNA分子的每个在一个位置上都被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个亚单位长的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源；如果90％的位置(例如，10个中9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。
术语“人源化”是指含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如，鼠)抗体形式，其可以是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体及其抗体片段在大部分上是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)的具有所需特异性、亲和性和能力的CDR残基替代，非人物种如小鼠、大鼠或兔子。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不存在于受体抗体也不在输入的CDR或框架序列中的残基。这些修饰可以进一步精炼和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个(并且通常是两个)可变结构域的相当大部分，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于更多详细内容，参见Jones等，Nature,321:522-525,1986；Reichmann等，Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
术语“完全人的”是指，免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，的整个分子是人来源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”表示从天然状态改变的或取出的。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽是没有“分离的”，但从其天然状态共同存在的物质中部分或完全分离出来的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如，宿主细胞。
在本发明的内容中，使用以下缩写表示通常的核酸碱基。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷和“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接导致后者表达。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列可操作地连接第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接编码序列。可操作连接的DNA序列可以是彼此邻接的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。
术语免疫原性组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内(intrasternal)注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的聚合物。除非具体限制，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性并且以天然核苷酸相似的方式代谢。除非另外指出，特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，获得简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何含有通过肽键彼此连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。如本文中使用的，该术语指短链(例如，通常在本领域中也被称为肽、寡肽和寡聚物)，也指较长链(通常在本领域中被称为蛋白质)，其可以有许多类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段、实质性同源的多肽、寡肽、同型二聚物、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白，等等。多肽包括天然肽、重组肽、重组多肽，或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，其是启动多核苷酸序列的特定转录所必需的。
术语“启动子/调控序列”是指可操作地连接启动子/调控序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况中，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况中，这个序列还可以包含增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指，当可操作地连接编码或规定基因产物的多核苷酸时，引起基因产物在细胞的大部分或全部生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指，当可操作地连接编码或规定基因产物的多核苷酸时，基本上只有在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时，才会引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异型”启动子是指，当可操作地连接由基因编码或规定的多核苷酸时，基本上只有在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时，才会引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
在scFv中使用时，术语“柔性多肽衔接物”或“衔接物”是指由氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸残基，单独或组合使用)组成的肽衔接物，用于将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽衔接物是Gly/Ser衔接物并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或高于1的正数(SEQ ID NO:609)。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5以及n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:606)。在一个实施方案中，柔性多肽衔接物包括但不限于，(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施方案中，衔接物包括(Gly2Ser)、(Gly4Ser)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。本发明的范围内还包括WO2012/138475中的衔接物(该文献按引用并入本文中)。
如本文中使用的，5’帽(也称为RNA帽、RNA7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久就已经添加至真核信使RNA的“前端”或5’端的修饰鸟嘌呤核苷酸。5’帽由连接第一个转录的核苷酸的末端基团组成。其的存在对于核糖体的识别和保护免受RNase作用是重要的。帽添加与转录偶联，并且共转录地进行，从而彼此影响。转录开始后不久，正在合成的mRNA的5’端被RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步生化反应的形式进行。加帽部分可以经修饰以调节mRNA的功能性，如稳定性或翻译的效率。
如本文中使用的，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文中使用的，“poly(A)”是通过聚腺苷酸化连接到mRNA上的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polyA在50至5000之间(SEQ ID NO:30)，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。poly(A)序列可以通过化学或酶学方式修饰，以调节mRNA功能性，如定位、稳定性或翻译的效率。
如本文中使用的，“多腺苷酸化”是指多腺苷酰基部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物体中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3’末端被多腺苷酸化。3’poly(A)尾是通过酶多腺苷酸化聚合酶的作用添加至pre-mRNA上的腺苷核苷酸长序列(常常是几百个)。在高等真核生物中，poly(A)尾添加至含有特定序列(多腺苷酸化信号)的转录物上。poly(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA输出细胞核以及翻译而言也是重要的。多腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在核中进行，此外也可以之后在胞质中进行。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用被断裂。断裂位点通常的特征在于断裂位点附近碱基序列AAUAAA的存在。mRNA断裂后，腺苷残基被添加至断裂位点的游离3’末端。
如本文中使用的，“瞬时”是指，非整合的转基因的表达持续数小时、数天或数周的时间段，其中该表达时间段短于基因整合至基因组中或包含在宿主细胞的稳定质粒复制子中时的基因表达时间段。
如本文中使用的，术语治疗(“treat”、“treatment”和“treating”)是指由于施用一种或多种治疗(例如，一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)，增殖性病症的进展、严重程度和/或持续时间的降低或改善，或增殖性病症的一个或多个症状(优选，一个或多个可辨别的症状)的改善。在特定的实施方案中，术语治疗(“treat”、“treatment”和“treating”)是指增殖性病症的至少一个可测量生理参数的改善，如肿瘤的生长，但不必是患者可辨别的改善。在其他实施方案中，术语治疗(“treat”、“treatment”和“treating”)是指，在身体上通过例如稳定可辨别症状，或者在生理上通过例如稳定生理参数，或通过两者，对增殖性病症进展的抑制。在其他实施方案中，术语治疗(“treat”、“treatment”和“treating”)是指肿瘤大小或癌细胞计数的降低或稳定化。
术语“信号传导途径”是指各种信号传导分子之间的生化关系，在信号从细胞的一个部分传播至细胞的另一个部分中起作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且跨过细胞膜传递信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指，基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与通常在天然状态中与其相关的其他细胞类型中分离出来的细胞。在一些情况中，基本上纯化的细胞群是指均一的细胞群。在其他情况中，该术语仅仅是指，细胞已经与在其天然状态中与之通常相关的细胞分离。在一些方面中，细胞在体外培养。在其他方面中，细胞没有在体外培养。
如本文中使用的术语“治疗的”表示治疗。通过减轻、抑制、缓和或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文中使用的术语“预防”表示针对疾病或病况的预防或预防性治疗。
术语“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换来指，在癌细胞表面上表达，完整地或作为片段表达(例如，MHC/肽)的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其对于药剂优先靶向癌细胞是有用的。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中超表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍超表达、2倍超表达、3倍超表达或更高。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原仅仅在癌细胞的细胞表面上表达，完整地或作为片段表达(例如，MHC/肽)，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包括包含结合MHC递呈的肽的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。正常地，源自内源性蛋白的肽装在I类主要组织相容性复合物(MHC)分子的口袋中，并且由CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。I类MHC复合物由所有有核细胞组成型地表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物是独特的一类用于免疫治疗的细胞表面靶标。已经描述了TCR样抗体靶向处于人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2中的源自病毒或肿瘤抗原的肽(参见，例如，Sastry等，JVirol.201185(5):1935-1942；Sergeeva等，Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等，JImmunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等，Gene Ther 20018(21):1601-1608；Dao等，Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等，Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。TCR样抗体可以例如，从筛选文库中鉴定，如人scFv噬菌体展示文库。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指，将外源性核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“特异性地结合”是指，抗体或配体识别并结合样品中存在的结合配偶体(例如，肿瘤抗原)蛋白，但该抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文中使用的，“可调控嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽，在最简单的实施方案中，通常是两个，其在免疫效应细胞中时，赋予细胞对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有可调控的胞内信号产生。在一些实施方案中，RCAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(在本文中也称为“胞内信号结构域”)，其中所述胞质信号结构域包含源自刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号结构域(如本文在CAR分子的上下文中定义的)。在一些实施方案中，RCAR中的多肽组彼此是不连续的，例如，在不同的多肽链中。在一些实施方案中，RCAR包括二聚化开关，在存在二聚化分子时，该开关可以使多肽彼此偶联在一起，例如，可以将抗原结合结构域与胞内信号结构域偶联。在一些实施方案中，RCAR可以在本文所述的细胞(例如，免疫效应细胞)中表达，例如，RCAR表达细胞(在本文中也称为“RCARX细胞”)。在一个实施方案中，RCARX细胞是T细胞，并且称为RCART细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是NK细胞，并且称为RCARN细胞。RCAR可以赋予RCAR表达细胞对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有可调控的胞内信号产生或增殖，从而可以优化RCAR表达细胞的免疫效应特性。在一些实施方案中，RCAR细胞至少部分依赖于抗原结合结构域，以提供对靶细胞(包含由抗原结合结构域结合的抗原)的特异性。
“膜锚定物”或“膜栓系结构域”，作为本文中使用的术语，是指足以将胞外或胞内结构域锚定在质膜的多肽或部分，例如，肉豆蔻酰基基团。
“开关(switch)结构域”，作为本文中使用的术语，例如，当涉及RCAR时，是指在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合的实体，通常是基于多肽的实体。该缔合导致连接(例如，融合)第一开关结构域的第一实体和连接(例如，融合)第二开关结构域的第二实体的功能性偶联。第一和第二开关结构域总地称为二聚化开关。在一些实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此相同的，例如，它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并且总地称为同型二聚化开关。在一些实施方案中，第一和第二开关结构域彼此不同，例如，它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽，并且总地称为杂二聚化开关。在一些实施方案中，开关是胞内的。在一些实施方案中，开关是胞外的。在一些实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如，基于FKBP或FRB，并且二聚化分子是小分子，例如，rapalogue。在一些实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如，结合myc肽的scFv，并且二聚化分子是多肽、其片段或多肽的多聚体，例如，结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体多聚体。在一些实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如，myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如，myc抗体。
“二聚化分子”，作为本文中使用的术语，例如，当涉及RACR时，是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在一些实施方案中，二聚化分子不在受试者中天然地产生，或不以导致明显二聚化的浓度产生。在一些实施方案中，二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素或rapalogue，例如，RAD001。
术语“生物等价”是指，参照化合物(例如，RAD001)以外的药剂产生与参照剂量或参照量的参照化合物(例如，RAD001)等价的效应所需要的量。在一个实施方案中，效应是mTOR抑制水平，例如，通过P70S6激酶抑制测量的，例如，如在体内或体外测定中评价的，例如，通过本文中的测定试验测量的，例如，Boulay测定试验，或通过western印迹测量磷酸化S6水平而测量的。在一个实施方案中，效应是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比例的改变，如通过细胞分选测量的。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等价量或剂量是，与参照剂量或参照量的参照化合物实现相同P70S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等价量或剂量是，与参照剂量或参照量的参照化合物实现相同水平的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比例改变的量或剂量。
术语“低的,免疫增强的,剂量”，当结合mTOR抑制剂(例如，变构mTOR抑制剂，例如，RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)使用时，是指部分但不是完全抑制mTOR活性的mTOR抑制剂剂量，例如，通过P70S6激酶活性的抑制来测量的。用于评价mTOR活性的方法(例如，通过P70S6激酶的抑制)，在本文中有讨论。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数量的降低和/或PD-1阴性T细胞数量的提高，或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞比例的提高。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致幼稚T细胞数量的提高。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致以下的一种或多种：
以下一种或多种标志物的表达提高：CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2，例如在记忆T细胞上，例如在记忆T细胞前体上；
KLRG1表达的降低，例如，在记忆T细胞上，例如，在记忆T细胞前体上；和
记忆T细胞前体数量的提高，例如，具有以下任何一个或组合特征的细胞在数量上的提高：提高的CD61L高、提高的CD127高、提高的CD27+、降低的KLRG1和提高的BCL2；
其中，(例如与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地)发生上述任一个变化。
如本文中使用的“难治性”是指，疾病例如癌症对治疗没有应答。在一些实施方案中，难治性癌症可以是在治疗开始之前或治疗开始时抵抗治疗的。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗过程中变为抵抗的。难治性癌症也可以称为抵抗性癌症。
如本文中使用的，“复发的”或“复发”是指，改善或响应一段时间后，例如，在之前的治疗(例如，癌症治疗)后，疾病(例如，癌症)或疾病(如癌症)的体征和症状的回返或重新出现。响应的初始期可以涉及癌细胞水平降至某个阈值以下，例如，低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。重新出现可以涉及癌细胞水平升至某个阈值以上，例如，高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，在B-ALL的情况中，重新出现可以涉及例如，在完全响应后，在血液、骨髓(>5％)或任何髓外部位中blasts的重新出现。在此情况下中，完全应答可以涉及<5％BM blast。更一般地，在一个实施方案中，应答(例如，完全应答或部分应答)可以涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施方案中，应答的初始期持续至少1、2、3、4、5或6天；至少1、2、3或4周；至少1、2、3、4、6、8、10或12个月；或至少1、2、3、4或5年。
范围：在整个公开内容中，本发明的各个方面可以以范围的形式来呈现。应当理解以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当解释为对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应当解释为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述，如1至6，应当解释为已经具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，如95-99％同一性的范围，包括大约95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括子范围，如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。不管范围的宽度，这都适用。
详细描述
本文中提供，通过施用包含靶向间皮素的嵌合抗原受体(例如，间皮素CAR)的细胞，联合PD-L1抑制剂，用于治疗疾病(如癌症)的组合物和方法。产生间皮素CAR和间皮素CAR表达细胞的示例性组分在本文中公开。本文中还描述了示例性PD-L1抑制剂。
在一些实施方案中，本文中的间皮素CAR表达细胞和本文中的PD-L1抑制剂的联合治疗导致以下的一种或多种：间皮素CAR表达细胞的抗肿瘤活性的提高或增加；间皮素CAR表达细胞的增殖或持久性的提高；间皮素CAR表达细胞的浸润的提高的或增加；提高的肿瘤进展抑制；肿瘤进展的延迟；癌细胞增殖的抑制或降低；和/或肿瘤负荷的降低，例如，肿瘤体积或大小的降低。
如本文中提供的实施例中所证明的，在一些实施方案中，在间皮素CAR表达细胞施用之前施用PD-L1抑制剂，导致提高的治疗功效，例如，在一些癌症中，导致提高的肿瘤进展抑制和/或肿瘤生长抑制，例如，与在间皮素CAR表达细胞施用后施用PD-L1抑制剂相比，或与单独施用PD-L1抑制剂或间皮素CAR表达细胞相比。
已知PD-L1下调免疫应答，例如，抗肿瘤免疫应答。PD-L1也可以由癌细胞或癌相关细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))表达。不希望受到理论的束缚，在一些实施方案中，接受本文的联合治疗(例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂)的受试者，与没有施用该联合治疗的受试者相比，或与施用单独间皮素CAR表达细胞或PD-L1抑制剂的受试者相比，更可能具有提高的抗肿瘤活性，如果受试者具有以下的一种或多种情况：表达(例如，高表达)PD-L1的癌症；被抗肿瘤免疫细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))浸润的癌症；和/或表达(例如，高表达)PD-L1的癌相关细胞。例如，不希望受到理论的束缚，使用PD-L1抑制剂的治疗防止或降低了抗肿瘤免疫应答的下调，例如，抗肿瘤免疫细胞(例如，TIL或间皮素CAR表达免疫细胞)的耗竭，由此提高抗肿瘤功效。
间皮素嵌合抗原受体(CAR)
本公开包括免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其包含靶向(例如，特异性地结合)间皮素的CAR分子(间皮素CAR)。在一个实施方案中，将免疫效应细胞工程化来表达间皮素CAR。在一个实施方案中，免疫效应细胞包含重组核酸构建体，该构建体包含编码间皮素CAR的核酸序列。
在一些实施方案中，间皮素CAR包含特异性地结合间皮素的抗原结合结构域，例如，间皮素结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域的序列与编码胞内信号结构域的核酸序列是邻接的并且在同一阅读框中。胞内信号结构域可以包含共刺激信号结构域和/或初级信号结构域，例如，ζ链。共刺激信号结构域是指CAR中包含至少一部分的共刺激分子的胞内结构域的部分。
可以作为本文间皮素CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列列于表1中，其中“aa”表示氨基酸，“na”表示编码相应肽的核酸。
表1.CAR的各组分的序列(aa-氨基酸序列，na-核酸序列)
在一个方面中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文中的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文中的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文中的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文中的跨膜结构域)和胞内刺激结构域(例如，本文中的胞内刺激结构域)。在一个方面中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文中的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文中的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文中的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文中的跨膜结构域)、胞内共刺激信号结构域(例如，本文中的共刺激信号结构域)和/或胞内初级信号结构域(例如，本文中的初级信号结构域)。
在一个方面中，本发明的间皮素CAR包含至少一个选自CD137(4-1BB)信号结构域、CD28信号结构域、CD27信号结构域、ICOS信号结构域、CD3ζ信号结构域及其任意组合的胞内信号结构域。在一个方面中，本发明的CAR包含至少一个来自一个或多个选自CD137(4-1BB)、CD28、CD27或ICOS的共刺激分子的胞内信号结构域。
抗原结合结构域
在一个方面中，本发明的CAR包含靶特异性结合元件(另称为抗原结合结构域)。在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向(例如，特异性地结合)间皮素的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域靶向(例如，特异性地结合)人间皮素。
抗原结合结构域可以是任何结合抗原的结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和驼类衍生的纳米抗体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的可用作抗原结合结构域的可选支架，如重组纤连蛋白结构域等。在一些情况中，对于抗原结合结构域，有益的是源自CAR最终将用于的相同物种。例如，对用于人类中，对于CAR的抗原结合结构域，包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基是有益的。因此，在一个方面中，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含选自SEQ ID NO:39-62的间皮素结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和选自SEQ ID NO:39-62的间皮素结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含本文中(例如，表2)中的轻链可变区和/或本文中(例如，表2)中的重链可变区。在一个实施方案中，间皮素结合结构域是包含表2的氨基酸序列的轻链可变区和重链可变区的scFv。在一个实施方案中，间皮素结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含相对于表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列、或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含相对于表2中提供的重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)但不超过30、20或10个修饰(例如，置换)的氨基酸序列、或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含经由衔接物(例如，本文中的衔接物)连接包含本文中(例如，表2或3中)的氨基酸序列的重链可变区的、包含本文中(例如，表2或3)中的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，人源化抗间皮素结合结构域包含(Gly4-Ser)n衔接物(SEQ ID NO:26)，其中n是1、2、3、4、5或6，优选3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下方向中的任何一个：轻链可变区-衔接物-重链可变区，或重链可变区-衔接物-轻链可变区。
在另一个实施方案中，间皮素结合结构域包含本领域已知的结合间皮素的任何抗体或其抗体片段。本领域已知的其他抗间皮素抗体或其抗体片段的实例包括WO2009/120769(例如，抗体m912，其轻链和重链氨基酸序列是WO2009/120769的SEQ ID NO:1和SEQID NO:2)；美国专利No.6,083,502，美国专利公开No.US2008/0261245、WO2009/068204、WO2010/111282、WO2014/004549和美国专利申请No.US2015/0274836中描述的那些。
在一个方面中，本发明的抗体可以以各种其他形式存在，包括例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、驼类VHH结构域、从抗体片段形成的多特异性抗体，如包含两个由铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段，以及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。在一个方面中，本文中提供的抗体片段是scFv。在一些情况中，人scFv还可以源自酵母展示文库。
在一些情况中，可以根据本领域已知的方法来制备scFv(参见，例如，Bird等(1988)Science 242:423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。可以通过将VH和VL区连接在一起，例如，使用柔性多肽衔接物，来产生scFv分子。scFv分子可以包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的衔接物(例如，Ser-Gly衔接物)。衔接物长度很大程度上可以影响scFv的可变区怎样折叠和相互作用。事实上，如果使用短肽衔接物(例如，5-10个氨基酸)，将阻止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区带到一起形成功能性表位结合位点。对于衔接物方向和大小的实例，参见，例如，Hollinger等，1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，U.S.专利申请公开No.2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT申请No.WO2006/020258和WO2007/024715(按引用并入本文中)。
scFv可以在其VL和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的衔接物。衔接物序列可以包含任何天然产生的氨基酸。在一些实施方案中，衔接物序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，衔接物序列包含几组甘氨酸和丝氨酸重复，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:135)。在一个实施方案中，衔接物可以是(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。衔接物长度的变化可以保持或增强活性，从而在活性研究中导致较优的功效。
示例性间皮素抗原结合结构域和CAR构建体
本文中公开的示例性间皮素CAR构建体包含本文的表2或3中公开的scFv(例如，人scFv)，任选之前具有任选的前导序列(对于示例性前导氨基酸和核苷酸序列，分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:12)。在本文的表2中提供了scFv片段的序列(SEQ ID NO:39-62的氨基酸序列)。间皮素CAR构建体可以进一步包含任选的铰链结构域，例如，CD8铰链结构域(例如，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的核酸序列编码)；跨膜结构域，例如，CD8跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码)；胞内结构域，例如，4-1BB胞内结构域(例如，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由SEQID NO:18的核苷酸序列编码)；和功能性信号结构域，例如，CD3ζ结构域(例如，包含SEQ IDNO:9或10的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:20或21的核苷酸序列编码)。在某些实施方案中，结构域是邻接的并且在同一阅读框中，以形成单个融合蛋白。在其他实施方案中，结构域在分开的多肽中，例如，如在本文的RCAR分子中。
在某些实施方案中，全长间皮素CAR分子包括以下的氨基酸序列或由以下的核苷酸序列编码：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、M24或ss1的氨基酸序列或核苷酸序列(提供于表2或3中)，或与上述任一个序列基本上相同的序列(例如，与其95-99％同一性，或不超过20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
在某些实施方案中，间皮素CAR分子，或间皮素抗原结合结构域，包括以下的scFv氨基酸序列或由以下的核苷酸序列编码：M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、M24或ss1的scFv氨基酸序列和核苷酸序列(提供于表2或3中)，或与上述任一个序列基本上相同的序列(例如，与其95-99％同一性，或不超过20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
在某些实施方案中，间皮素CAR分子，或间皮素抗原结合结构域，包括表2中提供的M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、M24或ss1的重链可变区和/或轻链可变区，或与上述任一个序列基本上相同的序列(例如，与其95-99％同一性，或不超过20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
在某些实施方案中，间皮素CAR分子，或间皮素抗原结合结构域，包括来自表4中提供的M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、M24或ss1的重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或来自表5中提供的M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23、M24或ss1的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如，LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)；或与上述任一个序列基本上相同的序列(例如，与其95-99％同一性，或不超过5、4、3、2或1个氨基酸变化)。
scFv结构域的CDR序列的序列显示于表4中(对于重链可变结构域)，和表5中(对于轻链可变结构域)。
表4.人抗间皮素scFv的重链(HC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
表5.人抗间皮素scFv的轻链(LC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
间皮素scFv结构域和间皮素CAR分子的氨基酸和核酸序列提供于表2(氨基酸序列)和表3(核酸序列)中。在一个实施方案中，间皮素CAR分子包含本文中的前导序列，例如，表2中提供的序列中加下划线的序列。在一个实施方案中，间皮素CAR分子不包含前导序列。
表2:人scFv和CAR的氨基酸序列(粗体下划线是前导序列，而灰色框是衔接物序列)。在scFv的情况中，剩余的氨基酸是重链可变区和轻链可变区，各自具有HC CDR(HCCDR1、HC CDR2、HC CDR3)和LC CDR(LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3)(加下划线)。在CAR的情况中，其它剩余的氨基酸是CAR的剩余氨基酸。
表3：编码CAR分子的核酸序列(前导序列加下划线)
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两个抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在同一抗原上，例如，同一蛋白(或多聚体蛋白的亚基)上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同抗原上，例如，不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异的(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或杂二聚抗体分子的方案是本领域已知的；包括但不限于，例如，例如US5731168中描述的“凸起进入孔洞”(knob in a hole)方法；例如WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中描述的，静电导航Fc配对；例如WO 07/110205中描述的，链交换工程化结构域(SEED)杂二聚体形成；例如，WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中描述的，Fab臂交换；双抗体缀合物，例如US 4433059中描述的，使用具有胺反应基团和巯基反应基团的异双官能试剂，通过抗体交联来产生双特异性结构；例如，如US4444878中描述的，通过在两条重链之间的二硫键还原和氧化循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇；三功能抗体，例如，如US5273743中描述的，通过巯基反应基团交联的三个Fab’片段；生物合成的结合蛋白，例如，US5534254中描述的，通过C-末端尾交联的scFv对，优选通过二硫化物或胺反应化学交联；双功能抗体，例如，如US5582996中描述的，通过替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)，使具有不同结合特异性的Fab片段二聚化；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如，通过一个抗体的CH1区和另一个抗体的VH区(通常与轻链结合)之间的多肽间隔物连接的两个抗体的VH-CH1区(两个Fab片段)，例如US5591828中的描述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如，抗体或Fab片段通过DNA的双链片段的交联，例如，US5635602中的描述；双特异性融合蛋白，例如，含有两个在它们中间具有亲水性螺旋肽衔接物的scFv和完整恒定区的表达构建体，例如，US5637481中的描述；多价和多特异性结合蛋白，例如，具有第一结构域(其具有Ig重链可变区的结合区)和第二结构域(具有Ig轻链可变区的结合区)的多肽的二聚体，通常称为双链抗体(还涵盖针对双特异性、三特异性或四特异性分子形成的高阶结构)，例如，US5837242中的描述；具有连接的VL和VH链的微抗体构建体，进一步通过肽间隔物连接至抗体铰链区和CD3区，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，例如，US5837821中的描述；通过短肽衔接物(例如，5或10个氨基酸)或根本无衔接物以任何方向连接的VH和VL结构域，其可以形成二聚体，以形成双特异性双链抗体；三聚体和四聚体，例如，如US5844094中的描述；通过在C-末端具有可交联基团的肽连接物连接的VH结构域链(或家族成员中的VL结构域)，进一步与VL结构域结合，形成一系列FV(或scFv)，例如，US5864019中的描述；和使用scFv或双链抗体型格式，通过非共价或化学交联，将具有肽衔接物连接的VH和VL结构域的单链结合多肽，组合成多价结构，以形成例如，同型二价、杂二价、三价和四价结构，例如，US5869620中的描述。其他示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法在例如US5910573、US5932448、US5959083、US5989830、US6005079、US6239259、US6294353、US6333396、US6476198、US6511663、US6670453、US6743896、US6809185、US6833441、US7129330、US7183076、US7521056、US7527787、US7534866、US7612181、US2002004587A1、US2002076406A1、US2002103345A1、US2003207346A1、US2003211078A1、US2004219643A1、US2004220388A1、US2004242847A1、US2005003403A1、US2005004352A1、US2005069552A1、US2005079170A1、US2005100543A1、US2005136049A1、US2005136051A1、US2005163782A1、US2005266425A1、US2006083747A1、US2006120960A1、US2006204493A1、US2006263367A1、US2007004909A1、US2007087381A1、US2007128150A1、US2007141049A1、US2007154901A1、US2007274985A1、US2008050370A1、US2008069820A1、US2008152645A1、US2008171855A1、US2008241884A1、US2008254512A1、US2008260738A1、US2009130106A1、US2009148905A1、US2009155275A1、US2009162359A1、US2009162360A1、US2009175851A1、US2009175867A1、US2009232811A1、US2009234105A1、US2009263392A1、US2009274649A1、EP346087A2、WO0006605A2、WO02072635A2、WO04081051A1、WO06020258A2、WO2007044887A2、WO2007095338A2、WO2007137760A2、WO2008119353A1、WO2009021754A2、WO2009068630A1、WO9103493A1、WO9323537A1、WO9409131A1、WO9412625A2、WO9509917A1、WO9637621A2、WO9964460A1中找到。将上述申请的内容全部按引用并入本文中。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如，scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)以其VH(VH1)在其VL(VL1)上游来排列，而下游抗体或抗体片段(例如，scFv)以其VL(VL2)在其VH(VH2)上游来排列，使得整个双特异性抗体分子具有排列VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)以其VL(VL1)在其VH(VH1)上游来排列，而下游抗体或抗体片段(例如，scFv)以其VH(VH2)在其VL(VL2)上游来排列，使得整个双特异性抗体分子具有排列VL1-VH1-VH2-VL2。任选，衔接物放置在两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如，如果构建体排列为VH1-VL1-VL2-VH2，放置在VL1和VL2之间，或如果构建体排列为VL1-VH1-VH2-VL2，放置在VH1和VH2之间。衔接物可以是本文中描述的衔接物，例如，(Gly4-Ser)n衔接物，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:26)。通常，两个scFv之间的衔接物应当足够长，以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选，衔接物放置在第一个scFv的VL和VH之间。任选，衔接物放置在第二个scFv的VL和VH之间。在具有多个衔接物的构建体中，任意两个或更多个衔接物可以相同或不同。因此，在一些实施方案中，双特异性CAR包含如本文中所述排列的VL、VH、和任选地一个或多个衔接物。
在一个方面中，双特异性抗体分子的特征在于，第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如，scFv)对间皮素具有结合特异性，例如包含本文中描述的(例如表2或3中描述的)scFv，或包含来自本文中描述的间皮素scFv的轻链CDR和/或重链CDR；以及第二免疫球蛋白可变结构域序列对不同抗原上的第二表位具有结合特异性。在一些方面中，第二免疫球蛋白可变结构域序列对间皮素以外的其他抗原具有结合特异性，例如，由癌或肿瘤细胞表达的抗原。在一些方面中，第二免疫球蛋白可变结构域序列对选自以下的抗原具有结合特异性：基质细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17，例如，肺癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2。
嵌合TCR
在一个方面中，本发明的间皮素抗体和抗体片段(例如，表2或3中公开的那些)可以嫁接至T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域上，以形成特异性地结合间皮素的嵌合TCR。不受理论束缚，认为嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文中公开的间皮素scFv可以嫁接至TCR链(例如，TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域，例如至少一部分的胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域。作为另一个实例，间皮素抗体片段例如本文中公开的VL结构域可以嫁接至TCRα链的恒定结构域，而间皮素抗体片段例如本文中的VH结构域可以嫁接至TCRβ链的恒定结构域(或可替换地，VL结构域可以嫁接至TCRβ链的恒定结构域，而VH结构域可以嫁接至TCRα链)。作为另一个实例，间皮素抗体或抗体片段的CDR(例如表4或5中描述的间皮素抗体或抗体片段的CDR)可以嫁接至TCRα链和/或β链，以形成特异性地结合间皮素的嵌合TCR。例如，本文中公开的LCDR可以嫁接至TCRα链的可变结构域，而本文中公开的HCDR可以嫁接至TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。这样的嵌合TCR可以通过本领域已知的方法来生产(例如，Willemsen RA等，Gene Therapy 2000；7:1369-1377；Zhang T等，Cancer Gene Ther 2004；11:487-496；Aggen等，Gene Ther.2012Apr；19(4):365-74)。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施方案中，CAR可以设计成包含连接CAR的胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个额外的邻接跨膜区的氨基酸，例如，一个或多个与跨膜结构域来源的蛋白的胞外区相关的氨基酸(例如，胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，至不超过15个氨基酸)和/或一个或多个与跨膜结构域来源的蛋白的胞内区相关的额外氨基酸(例如，胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，至不超过15个氨基酸)。在一个方面中，跨膜结构域是与使用的CAR的其他结构域之一相关的结构域，例如，在一个实施方案中，跨膜结构域可以与信号结构域、共刺激结构域或铰链结构域来自相同蛋白。在另一个方面中，跨膜结构域与CAR的任何其他结构域都不来自相同的蛋白。在一些情况中，可以选择跨膜结构域或通过氨基酸置换来修饰，以避免这样的结构域结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，例如，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面中，跨膜结构域能够与CAR表达细胞的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同方面中，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列，从而最小化与同一CAR表达细胞中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或重组来源。在来源是天然的情况中，所述结构域可以源自任何膜结合的或跨膜的蛋白。在一个方法中，一旦CAR结合靶标后，跨膜结构域能够将信号传导至胞内结构域。本发明中尤其有用的跨膜结构域可以包括至少例如T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C的跨膜结构域。
在一些情况中，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白的铰链)连接CAR的胞外区，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、GS衔接物(例如，本文中的GS衔接物)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一个实施方案中，铰链或间隔物包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(例如，由SEQ IDNO:2的氨基酸序列组成)。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的跨膜结构域(例如，由SEQ ID NO:6的跨膜结构域组成)。
在一个方面中，铰链或间隔物包含IgG4铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的铰链。
在一个实施方案中，铰链或间隔物包含由核苷酸序列SEQ ID NO:14编码的铰链。
在一个方面中，铰链或间隔物包含IgD铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔物包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铰链。
在一些实施方案中，铰链或间隔物包含由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的铰链。
在一个方面中，跨膜结构域可以是重组的，在该情况中，其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面中，在重组跨膜结构域的每个末端，可以存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选，2至10个氨基酸长的短寡肽或多肽衔接物可以形成CAR的跨膜结构域和胞质信号区之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体可以提供特别合适的衔接物。例如，在一个方面中，衔接物包含GGGGSGGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，衔接物由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列编码。
在一个方面中，铰链或间隔物包含KIR2DS2铰链及其部分。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区包含胞内信号结构域。胞内信号结构域通常负责激活已经引入了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞毒性活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号结构域”是指传导效应子功能信号并指引细胞执行专化功能的蛋白部分。尽管通常可以使用完整的胞内信号结构域，但在许多情况中，不需要使用整条链。就使用胞内信号结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以替代完整链来使用，只要其传导效应子功能信号即可。术语胞内信号结构域因此旨在包括足以传导效应子功能信号的胞内信号结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR中的胞内信号结构域的实例包括，T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列(在抗原受体结合后，其协同作用以启动信号传导)，以及具有相同功能性能力的这些序列的任何衍生物或变体和任何重组序列。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要二级和/或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由两个截然不同类别的胞质信号序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的胞质信号序列(初级胞内信号结构域)，和以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号的胞质信号序列(二级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
初级胞质信号结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号结构域可以含有称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞内信号结构域的实例包括，源自CD3ζ、普通FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号结构域，例如，CD3-ζ(例如本文中描述的CD3ζ序列)的初级信号结构域。
在一个实施方案中，初级信号结构域包含修饰的ITAM结构域，例如突变的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比，活性已经改变(例如，提高或降低)。在一个实施方案中，初级信号结构域包含含修饰ITAM的初级胞内信号结构域，例如，含优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号结构域。在一个实施方案中，初级信号结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在本发明中特别有用的含有初级胞内信号结构域的分子的其它实例包括，DAP10、DAP12和CD32。
CAR的胞内结构域可以包含C3-ζ信号结构域自身，或可以与在本发明CAR中有用的任何其他期望的胞内信号结构域组合。例如，CAR的胞内信号结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号结构域。共刺激信号结构域是指CAR中包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞有效应答抗原所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这样的分子的实例包括，CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1(也称为PD1)、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体，等。例如，已经证明CD27共刺激能在体外增强人CART细胞的扩增、效应子功能和存活，以及在体内提升人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等，Blood.2012；119(3):696-706)。这样的共刺激分子的其它实例包括，I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地与CD83结合的配体。例如，已经证明了CD27共刺激能在体外增强人CART细胞的扩增、效应子功能和存活，以及在体内增加人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等，Blood.2012；119(3):696-706)。
本发明CAR的胞质部分中的胞内信号结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选，短寡肽或多肽衔接物，例如2至10个氨基酸长(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以在胞内信号结构域之间形成连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的衔接物。在一个实施方案中，单氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的衔接物。
在一个方面中，将胞内信号结构域设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号结构域。在一个实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号结构域被衔接物分子隔开，例如，本文中描述的衔接物分子。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含两个共刺激信号结构域。在一些实施方案中，所述衔接物分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，所述衔接物是丙氨酸残基。
在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和CD28的信号结构域。在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和4-1BB的信号结构域。在一个实施方案中，4-1BB的信号结构域是SEQ ID NO:7的信号结构域。在一个方面中，CD3-ζ的信号结构域是SEQ ID NO:9的信号结构域(突变CD3-ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3-ζ)。
在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和4-1BB的信号结构域。在一个方面中，4-1BB的信号结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个方面中，4-1BB的信号结构域由SEQ ID NO:18的核酸序列编码。
在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和CD27的信号结构域。在一个方面中，CD27的信号结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个方面中，CD27的信号结构域由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。
在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和CD28的信号结构域。在一个方面中，CD28的信号结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一个方面中，CD28的信号结构域由SEQ ID NO:45的核酸序列编码。
在一个方面中，胞内信号结构域设计成包含CD3-ζ的信号结构域和ICOS的信号结构域。在一个方面中，ICOS的信号结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一个方面中，ICOS的信号结构域由SEQ ID NO:43的核酸序列编码。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文中的CAR分子包含自然杀伤细胞受体(NKR)的一个或多个组分，由此形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下自然杀伤细胞受体中的任何一个的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白-样受体(KIR)，例如，KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；自然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；信号淋巴细胞激活分子(SLAM)家族的免疫细胞受体，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。本文中的NKR-CAR分子可以与适体分子或胞内信号结构域(例如，DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公布No.WO2014/145252(将其内容按引用并入本文中)。
拆分式CAR(split CAR)
在一些实施方案中，本文中的CAR表达细胞使用拆分式CAR。拆分式CAR方法更详细地描述于公开WO2014/055442和WO2014/055657中，所述文献按引用并入本文中。简而言之，拆分式CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR的细胞，该细胞也表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，激活共刺激结构域，细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，激活胞内信号结构域，细胞杀灭活性开始。因此，该CAR表达细胞只有在两种抗原存在下才能被完全激活。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域识别本文中描述的肿瘤抗原或B细胞抗原，例如包含本文中的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别第二抗原，例如本文中描述的第二肿瘤抗原或第二B细胞抗原。
CAR与其他分子或试剂的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面中，本文中的CAR表达细胞可以进一步包含第二CAR，例如包含不同抗原结合结构域的第二CAR，所述不同抗原结合结构域例如靶向相同靶标(间皮素)或不同靶标(例如，基质细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如FAP；前列腺癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精子蛋白17；例如肺癌细胞上除间皮素以外的其他靶标，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含：靶向第一抗原并包含具有共刺激信号结构域但不具有初级信号结构域的胞内信号结构域的第一CAR，和靶向第二不同抗原并包含具有初级信号结构域但不具有共刺激信号结构域的胞内信号结构域的第二CAR。将共刺激信号结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)放置在第一CAR上，而将初级信号结构域(例如，CD3ζ)放置在第二CAR上，可以将CAR活性限于表达两种靶标的细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一间皮素CAR(其包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)和第二CAR，其中第二CAR靶向间皮素以外的其他抗原(例如基质细胞上间皮素以外的其他靶标，例如FAP；前列腺癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17；例如肺癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号结构域。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一间皮素CAR(其包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和初级信号结构域)和第二CAR，其中所述第二CAR靶向间皮素以外的其他抗原(例如基质细胞上间皮素以外的其他靶标，例如FAP；前列腺癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17；例如肺癌细胞上间皮素以外的其他靶标，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域。
在一个实施方案中，CAR表达细胞包含本文中描述的间皮素CAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合正常细胞而非癌细胞(例如也表达间皮素的正常细胞)上的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷或TGFRβ的胞内结构域。
在一个实施方案中，在CAR表达细胞包含两个或更多个不同CAR时，对于不同CAR的抗原结合结构域，可以使得这些抗原结合结构域彼此没有相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有与第二CAR的抗原结合结构域不形成结合的第一CAR的抗原结合结构域(例如片段形式，例如scFv)，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于，重链可变结构域、天然去除轻链的结合分子、源自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域、以及非源自抗体的单结构域支架。SDAB分子可以是本领域中的任何一种、或任何将来的单结构域分子。SDAB分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲鸵、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自驼科动物和鲨鱼以外的其他物种的天然单结构域抗体分子。
在一个方面中，SDAB分子可以源自鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如源自鲨鱼血清中发现的、称为新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。制备源自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909。
根据另一个方面，SDAB分子是去除轻链的、称为重链的天然单结构域抗原结合分子。这样的单结构域分子公开于例如WO9404678和Hamers-Casterman，C.等(1993)Nature363:446-448。为了清楚起见，这种源自天然去除轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以区别于常规四链免疫球蛋白的VH。这样的VHH分子可以源自骆驼科物种，例如，骆驼、美洲鸵、单峰骆驼、羊驼和原驼。驼科以外的其他物种也可以产生天然去除轻链的重链分子；这样的VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR嫁接的、人源化的、驼源化的、去免疫化的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。
也已经发现，具有多个嵌合膜植入受体的细胞(其中这些受体包含抗原结合结构域，且这些受体的抗原结合结构域之间相互作用)是不期望的，因为例如这将抑制一个或多个抗原结合结构域结合其关连抗原的能力。因此，本文公开具有第一和第二非天然嵌合膜植入受体的细胞，其中所述受体包含可以最小化这种相互作用的抗原结合结构域。本文中还公开了编码第一和第二非天然嵌合膜植入受体(其包含可以最小化这种相互作用的抗原结合结构域)的核酸，以及制备和使用这样的细胞和核酸的方法。在一个实施方案中，第一和第二非天然嵌合膜植入受体中的一个的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含单VH结构域，例如，骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单VH结构域，或源自人或小鼠序列的单VH结构域。
在一些实施方案中，本发明包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，而另一个不是scFv。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如，驼类、鲨鱼或七鳃鳗单VH结构域，或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含单VH结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单VH结构域，或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合包含scFv，而另一个包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其关连抗原的结合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些实施方案中，在第二CAR存在下，第一CAR的抗原结合结构域与其关连抗原的结合是，不存在第二CAR时第一CAR的抗原结合结构域与其关连抗原结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域的彼此缔合低于如果两者都是scFv抗原结合结构域时。在一些实施方案中，第一和第二CAR的抗原结合结构域的彼此缔合，比如果两者都是scFv抗原结合结构域时低85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的试剂的共表达
在另一个方面中，本文中的CAR表达细胞可以进一步表达另一种试剂，例如，增强CAR表达细胞的活性或适合性的试剂。
例如，在一个实施方案中，试剂可以是对调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子造成抑制的试剂。在一些实施方案中，调节或调控T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子例如PD1可以降低CAR表达细胞引起免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷或TGFRβ。
在一些实施方案中，试剂(例如，抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白或系统，例如规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，或锌指核酸内切酶(ZFN)，如本文中描述的)，可以用于抑制调节或调控(例如，抑制)CAR表达细胞中的T细胞功能的分子的表达。在一个实施方案中，试剂是shRNA，例如本文中描述的shRNA。在一个实施方案中，调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子在CAR表达细胞内受到抑制。例如，可以将dsDNA分子连接到编码CAR组分(例如所有组分)的核酸上，其中所述dsRNA分子抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子的表达。
在一个实施方案中，对抑制性分子造成抑制的试剂包含第一多肽(例如抑制性分子)和与之结合的第二多肽，该第二多肽向细胞提供正信号(例如，本文中的胞内信号结构域)。在一个实施方案中，所述试剂包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽为例如抑制性分子，如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷或TGFRβ、或这些中任何一个的片段(例如，这些中任何一个的胞外结构域的至少一部分)，其中第二多肽是本文中描述的胞内信号结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如本文中描述的)和/或初级信号结构域(例如，本文中描述的CD3ζ信号结构域)。在一个实施方案中，试剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)和本文中描述的胞内信号结构域的第二多肽(例如，本文中描述的CD28信号结构域和/或本文中描述的CD3ζ信号结构域)。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等，1996Int.Immunol 8:765-75)。PD1的两个配体PD-L1和PD-L2已经显示出在结合PD1时下调T细胞激活(Freeman等，2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等，2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等，2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人癌症中是丰富的(Dong等，2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等，2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等，2004 Clin Cancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制。
在一个实施方案中，试剂包含抑制性分子(例如，程序化死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，其可以与跨膜结构域和胞内信号结构域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也称为PD1 CAR)。在一个实施方案中，与本文中描述的间皮素CAR组合使用时，PD1 CAR提高了T细胞的持久性。在一个实施方案中，CAR是包含SEQ ID NO:24中下划线显示的PD1胞外结构域和SEQ ID NO:24的氨基酸1-21的信号序列的PD1 CAR。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
在一个实施方案中，不含N-末端信号序列的PD1 CAR包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一个实施方案中，试剂包含编码具有N-末端信号序列的PD1 CAR(例如本文中描述的PD1 CAR)的核酸序列。在一个实施方案中，PD1 CAR的核酸序列显示于表1中，PD1ECD在SEQ ID NO:23中以下划线标出。
在另一个实例中，在一个实施方案中，增强CAR表达细胞活性的试剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括I类MHC分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激分子的更多实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，和特异性地与CD83结合的配体，例如本文中描述的。共刺激分子配体的实例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL和LIGHT。在一些实施方案中，共刺激分子配体是针对不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在一些实施方案中，共刺激分子配体是针对与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施方案中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施方案中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施方案中，共刺激分子配体是CD70。在一些实施方案中，本文中的CAR表达免疫效应细胞可以进一步工程化来表达一个或多个另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在一些实施方案中，本文中的CAR表达细胞，例如间皮素CAR表达细胞，进一步包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达可以增强向CCL2-或CXL1-分泌性实体肿瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等，JImmunother.2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等，Hum Gene Ther.2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受到理论的束缚，认为在识别肿瘤(例如实体肿瘤)分泌的趋化因子的CAR表达细胞中表达的趋化因子受体可以提高CAR表达细胞向肿瘤的归巢，促进CAR表达细胞浸润肿瘤，并增强CAR表达细胞的抗肿瘤效力。趋化因子受体分子可以包含天然的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文CAR表达细胞(例如，CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括，CXC趋化因子受体(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如，CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如，XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子来选择与本文CAR一起表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文中描述的CAR表达细胞包含例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文中的CAR和趋化因子受体分子在同一载体上或在两个不同载体上。在本文CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施方案中，CAR和趋化因子受体分子各自在两个不同启动子的控制下或在同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明提供包含编码本发明的一个或多个CAR构建体的核酸序列的CAR转基因。在一个方面中，CAR转基因作为信使RNA转录物来提供。在一个方面中，CAR转基因作为DNA构建体来提供。
因此，在一个方面中，本发明涉及分离的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含抗间皮素结合结构域(例如，人抗间皮素结合结构域)、跨膜结构域和包含刺激结构域的胞内信号结构域。在一个实施方案中，抗间皮素结合结构域是本文中描述的抗间皮素结合结构域，例如，包含选自SEQ ID NO:87-111的序列或与其具有95-99％同一性的序列的抗间皮素结合结构域。在一个实施方案中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗间皮素结合结构域通过铰链区(例如，本文中的铰链)连接跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)的蛋白的功能性信号结构域。这样的共刺激分子的更多实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76和PAG/Cbp。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含4-1BB的功能性信号结构域和CD3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列，或与其具有95-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，或与其具有95-99％同一性的序列，其中胞内信号结构域包含的这些序列在同一框中并且作为单个多肽链表达。在另一个方面中，本发明涉及分离的编码CAR构建体的核酸分子，所述CAR构建体包含SEQ ID NO:1的前导序列，具有选自SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQID NO:62的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的scFv结构域，SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区，具有SEQID NO:6的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:7的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的4-1BB共刺激结构域、或具有SEQ ID NO:8的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域，和具有SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
在另一个方面中，本发明涉及分离的由所述核酸分子编码的多肽分子。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含选自SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及分离的编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子，所述嵌合抗原受体分子包含抗间皮素结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域的胞内信号结构域，并且其中编码抗间皮素结合结构域的核酸包含选自SEQ ID NO:111；SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码的CAR分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)的蛋白的功能性信号结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ IDNO:7的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含4-1BB的功能性信号结构域和ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列，其中胞内信号结构域包含的这些序列在同一框中并且作为单个多肽链表达。在一个实施方案中，抗间皮素结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ IDNO:2。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
在另一个方面中，本发明涉及分离的CAR分子，其包含SEQ ID NO:1的前导序列，具有选自SEQ ID NO:39-62的序列或与其具有95-99％同一性的序列的scFv结构域，SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的铰链区，具有SEQ ID NO:6的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:7的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQ ID NO:8的序列的CD27共刺激结构域，和具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施方案中，编码的CAR分子包含选自SEQ ID NO:63-86的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
本发明进一步提供包含CAR转基因的载体。在一个方面中，CAR载体可以直接转导至细胞中，例如，T细胞或NK细胞。在一个方面中，载体是克隆或表达载体，例如，载体包括但不限于，一个或多个质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环(minicircle)、微载体、双微染色体(double minute chromosomes))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面中，载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面中，哺乳动物T细胞是人T细胞或人NK细胞。
本发明还包括可以直接转染至细胞(例如，T细胞或NK细胞)中的编码CAR的RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及，用特意设计的引物体外转录(IVT)模板，接着添加polyA，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的基因和polyA尾(通常50-2000个碱基长)的构建体。由此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面中，模板包含CAR的序列。
在一个方面中，间皮素CAR转基因由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面中，将编码间皮素CAR转基因的mRNA引入T细胞(用于产生CART细胞)或NK细胞中。
载体
本发明还提供，插入了本发明的DNA的载体。源自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许长期的、稳定的转基因整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体具有优于源自致癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的额外优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低致免疫原性的附加优势。
在一个实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是DNA、RNA、质粒、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包含例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复(LTR)和目标转基因，例如编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺乏病毒结构基因，如gag、pol和env。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及从其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等，“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011年6月；3(6):677-713。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子，如sleeping beauty、CRISPR、CAS9和锌指核酸酶，来完成编码CAR的核酸的表达。参见，例如，June等，2009 Nature Reviews Immunology9.10:704-716，将其全部按引用并入。
简而言之，通常可以通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接启动子并将该构建体并入表达载体中，来实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。载体可以适于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和用于调控所需核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体还可以用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，全部按引用并入本文中。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
可以将核酸克隆至各种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆至载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，可以以病毒载体的形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等，2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY，以及其他病毒学和分子生物学手册。可以用作载体的病毒包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点、和一个或多个选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利No.6,326,193)。
已经研发了各种基于病毒的系统，用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选定的基因插入载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。随后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。各种逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。各种腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
其他启动子元件，例如增强子，调控转录启动的频率。通常，这些位于起始位点的上游30-110bp区域中，但多种启动子已经显示出也含有位于起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，由此元件相对于彼此颠倒或移动时启动子功能仍可以保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp远。取决于启动子，看起来各单个元件可以协同地或独立地发挥作用来激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1α启动子(EF1a或EF1α)。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛地用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示出可以有效地从克隆在慢病毒载体中的转基因驱动CAR表达。参见，例如，Milone等，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)。在一个方面中，EF1a启动子包含作为SEQ ID NO:11提供的序列。
启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应当限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也考虑作为本发明的一部分。使用诱导型启动子可以提供分子开关，该开关能够在需要这样的表达时打开与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
另一个启动子实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，可能需要截短的PGK启动子(例如，与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如，1、2、5、10、100、200、300或400)核苷酸缺失的PGK启动子)。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(SEQ ID NO:597)
示例性截短的PGK启动子:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(SEQ ID NO:598)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(SEQ ID NO:599)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(SEQ ID NO:600)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(SEQ ID NO:601)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许分泌的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
为了评价CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从设法通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其他方面中，可以在分开的DNA片段上携带选择标记，并且用于共转染程序中。选择标记和报告基因两者都可以侧接合适的调控序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如，抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可以用于鉴定可能转染的细胞和用于评价调控序列的功能性。通常，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，并且编码的多肽可以通过一些容易检测的特性(例如，酶活性)来呈现其表达。在DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术来制备或通过商业获得。通常，将显示出报告基因的最高表达水平的具有最小5’侧翼区的构建体鉴定为启动子。这样的启动子区可以连接报告基因并且用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一个实施方案中，载体可以进一步包含编码第二CAR的核酸。在一个实施方案中，第二CAR包含针对以下靶标的抗原结合结构域，例如，基质细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17；例如，肺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2。在一个实施方案中，载体包含编码第一CAR的核酸序列(第一CAR靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号结构域而非初级信号结构域的胞内信号结构域)和编码第二CAR的核酸(第二CAR靶向第二不同抗原并且包含具有初级信号结构域而非共刺激信号结构域的胞内信号结构域)。在一个实施方案中，载体包含编码第一间皮素CAR的核酸(第一间皮素CAR包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)和编码第二CAR的核酸(第二CAR靶向间皮素以外的其他抗原(例如，基质细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17；例如，肺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号结构域)。在另一个实施方案中，载体包含编码第一间皮素CAR的核酸(第一间皮素CAR包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和初级信号结构域)和编码第二CAR的核酸(第二CAR靶向间皮素以外的其他抗原(例如，基质细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17，例如，肺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域)。
在一个实施方案中，载体包含编码本文中描述的间皮素CAR的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合正常细胞而非癌细胞(例如，也表达CLL的正常细胞)上的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ的胞内结构域。
在一些实施方案中，载体可以包含两个或更多个核酸序列，其中核酸序列中的一个编码本文中描述的CAR，例如，本文中描述的间皮素CAR。在一个实施方案中，其他核酸可以编码第二CAR，该第二CAR可以例如为抑制性CAR，或特异性地结合间皮素以外的其他抗原(例如，基质细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、LewisY、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精蛋白17，例如，肺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)，或该其他核酸可以编码可以调控本文的间皮素CAR活性的多肽。在这样的实施方案中，该两个或更多个核酸序列(例如，编码本文的间皮素CAR和第二CAR或其他多肽)，可以由单个核酸分子在同一框中作为单个多肽链编码。在一个实施方案中，该两个或更多个多肽可以由一个或多个肽断裂位点(例如，自断裂位点，或胞内蛋白酶的底物)隔开。肽断裂位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：
T2A:(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:602)
P2A:(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:603)
E2A:(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:604)
F2A:(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:605)
将基因引入细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体时，载体可以通过本领域的任一种方法容易地引入宿主细胞中，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方式，将表达载体转染至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、微粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等，2012，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，ColdSpring Harbor Press，NY)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的一个优选方法是脂转染，例如，使用Lipofectamine(Life Technologies)。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括，使用DNA和RNA载体。病毒载体并且尤其是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的用于将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)中的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利No.5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学方式包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子和基于脂质的系统，包括水包油型乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。现有技术中靶向递送核酸的其他方法是可利用的，如使用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统的多核苷酸递送。
在利用非病毒递送系统的情况中，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一个方面中，可以将核酸与脂质相连。可以将与脂质相连的核酸包裹在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由连接分子连接至脂质体(连接分子与脂质体和寡核苷酸两者相连)、截留在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物，不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以作为胶束，或与“崩塌的”结构一起，存在于双层结构中。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。脂质是脂肪物质，可以是天然的或是合成的脂质。例如，脂质包括在胞质中天然产生的脂肪滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类别，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可以获自商业来源。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma，St.Louis，MO；二鲸蜡基磷酸酯(“DCP”)可以获自K&K Laboratories(Plainview，NY)；胆固醇(“Choi”)可以获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以获自Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL.)。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储液可以储存在约-20℃。可以将氯仿用作唯一溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个上位术语，涵盖各种通过产生封闭的脂质双层或聚集物而形成的单和多层脂质载体。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成脂质体。脂质组分经历自我重排后形成闭合结构并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等，1991，Glycobiology 5:505-10)。也涵盖在溶液中结构不同于正常囊泡结构的组合物。例如，脂质可以采用胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集物存在。也考虑lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源性核酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明抑制剂的方法如何，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，都可以进行各种测定试验。这样的测定包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫方式(ELISA和Western印迹)或通过本文中描述的测定，来鉴定落入本发明范围内的试剂。
本发明进一步提供包含CAR编码核酸分子的载体。在一个方面中，CAR载体可以直接转导至细胞中，例如，T细胞或NK细胞。在一个方面中，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于一个或多个质粒(例如，表达质粒、克隆载体、minicircle、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面中，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。在一个方面中，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一个方面中，哺乳动物细胞是人NK细胞。
RNA转染
本文中公开了用于生产体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括可以直接转染至细胞中的编码CAR的RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及，使用特别设计的引物在体外转录(IVT)模板，接着添加polyA，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和polyA尾(通常50-2000个碱基长(SEQID NO:35))的构建体。由此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面中，模板包含CAR的序列。
在一个方面中，间皮素CAR可以由信使RNA(mRNA)来编码。在一个方面中，将编码间皮素CAR的mRNA引入T细胞中用于产生CART细胞。
在一个实施方案中，可以将体外转录的RNA CAR以瞬时转染的形式引入细胞中。可以使用聚合酶链式反应(PCAR)产生的模板，通过体外转录来产生RNA。可以通过PCR将来自任何来源的目标DNA直接转化成模板，使用合适的引物和RNA聚合酶用于体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的期望模板是本发明的CAR。例如，用于RNA CAR的模板可以包含胞外区(其包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域)；铰链区、跨膜结构域(例如，CD8a的跨膜结构域)；和包含胞内信号结构域(例如包含CD3ζ的信号结构域和4-1BB的信号结构域)的胞质区。
在一个实施方案中，待用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包含一些或全部的5’和/或3’非翻译区(UTR)。核酸可以包含外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是包含5’和3’UTR的人核酸序列。DNA可以可替换地是通常在天然生物体中不表达的人造DNA序列。示例性人造DNA序列可以含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的多个基因部分。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自一个以上生物体。
可以使用PCR来产生模板用于体外转录mRNA，mRNA用于转染。用于进行PCR的方法是本领域公知的。设计用于PCR中的引物，以具有与待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。术语“基本上互补”是指这样的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与计划的DNA靶标退火或杂交。引物可以设计成与DNA模板的任一部分基本上互补。例如，引物可以设计成扩增通常在细胞中转录的核酸的部分(开放阅读框)，包括5’和3’UTR。引物还可以设计成扩增编码特定目标结构域的核酸的一部分。在一个实施方案中，引物设计成扩增人cDNA的编码区，包括全部或一部分的5’和3’UTR。对于PCR有用的引物可以通过本领域公知的合成方法来产生。“正向引物”是含有与DNA模板上位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。术语“上游”是指，相对于编码链而言，位于待扩增的DNA序列的5’位置。“反向引物”是含有与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。术语“下游”是指相对于编码链而言，位于待扩增的DNA序列的3’位置。
对于PCR有用的任何DNA聚合酶可以用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可以从多个来源商业购得。
还可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5’和3’UTR。在一个实施方案中，5’UTR为一个至3000个核苷酸长。待添加至编码区的5’和3’UTR的长度可以通过不同方法来改变，包括但不限于，设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用这种方法，本领域技术人员可以改变所需要的5’和3’UTR长度，以在转录的RNA转染后获得最佳翻译效率。
5’和3’UTR可以是天然产生的、目标核酸内源性的5’和3’UTR。或者，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰，添加非目标核酸内源性的UTR序列。使用非目标核酸内源性的UTR序列，对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率是有用的。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR的性质，选择或设计3’UTR来提高转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5’UTR可以含有内源性核酸的Kozak序列。备选地，当如上通过PCR添加非目标核酸内源性的5’UTR时，可以通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但看来不是所有RNA有效翻译所必需的。许多mRNA对Kozak序列的需求是本领域已知的。在其他实施方案中，5’UTR可以是RNA病毒的5’UTR，所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可以用于3’或5’UTR中，以阻碍mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录启动子应当连接至DNA模板，位于待转录序列上游。将作为RNA聚合酶的启动子起作用的序列添加至正向引物的5’末端时，该RNA聚合酶启动子将被并入PCR产物中位于待转录的开放阅读框的上游。在一个优选实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文中别处的描述。其他有用的启动子包括但不限于，T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选实施方案中，mRNA具有5’端帽和3’poly(A)尾，其决定核糖体结合、翻译起始、和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板(例如，质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长的多联体产物，其不适用于在真核细胞中表达。在3’UTR末端线性化的质粒DNA的转录可以形成正常大小的mRNA，但是其在真核生物转染中是无效的，即使其在转录后被多腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以延伸转录物的3’末端以越过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.，13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.，270:1485-65(2003))。
polyA/T链整合至DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合至质粒DNA中的polyA/T序列可以引起质粒不稳定，这是获自细菌细胞的质粒DNA模板常常会高度污染并具有缺失和其他异常的原因。这使得克隆程序不仅费时费力，而且常常是不可靠的。这是为什么不用克隆而构建具有polyA/T 3’链的DNA模板的方法被高度期望的原因。
可以在PCR过程中通过使用含有polyT尾(如100T尾(SEQ ID NO:31))的反向引物(大小可以为50-5000T(SEQ ID NO:32)，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于，DNA连接或体外重组)，来产生转录DNA模板的polyA/T区段。poly(A)尾还给RNA提供了稳定性，并且降低了它们的降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾为100至5000个腺苷(SEQ ID NO:33)。
体外转录后，可以使用poly(A)聚合酶，如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)，进一步延伸RNA的poly(A)尾。在一个实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸延长到300至400个核苷酸(SEQ ID NO:34)，导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，不同化学基团连接在3’末端可以提高mRNA稳定性。这样的连接可以含有修饰的/人造的核苷酸、适体和其他化合物。例如，使用poly(A)聚合酶，可以将ATP类似物掺入poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5’帽也给RNA分子提供稳定性。在一个优选实施方案中，通过本文中公开的方法产生的RNA包含5’帽。可以使用本领域已知的和本文中描述的技术来提供5’帽(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等，RNA,7:1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文中公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其启动不依赖于帽的核糖体与mRNA的结合，并促进翻译的起始。可以包括任何适于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和生存力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用多种不同方法中的任何一种，将RNA引入靶细胞中，例如，商业上可购得的方法，其包括但不限于，电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，德国)，ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)、Multiporator(Eppendort，德国汉堡)、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包裹、肽介导的转染、或生物轰击(biolistic)微粒递送系统，如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些方面中，可以使用非病毒方法，将编码本文中描述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施方案中，非病毒方法包括使用转座子(也称为可转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将自身插入基因组中某个位置的DNA片段，例如，能够在我复制并将其拷贝插入基因组中的DNA片段，或可以从较长核酸剪接出来并插入基因组中的另一个位置的DNA片段。例如，转座子包含由侧接转座基因的反向重复构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包含Sleeping Beauty转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见，例如，Aronovich等，Hum.Mol.Genet.20.R1(2001):R14-20；Singh等，Cancer Res.15(2008):2961-2971；Huang等，Mol.Ther.16(2008):580-589；Grabundzija等，Mol.Ther.18(2010):1200-1209；Kebriaei等，Blood.122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16；Bell等，Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65；和Ding等，Cell.122.3(2005):473-83，全部按引用并入本文中。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转座至靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶结合载体质粒/供体DNA，从质粒上切割出转座子(包含转基因)，并将其插入宿主细胞的基因组中。参见，例如，Aronovich等，同上引文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等，Nucleic AcidsRes.41.3(2013):1829-47；和Singh等，Cancer Res.68.8(2008):2961-2971，全部按引用并入本文中。示例性转座酶包括Tc1/mariner-型转座酶，例如，SB10转座酶或SB11转座酶(超活性转座酶，其可以例如从巨细胞病毒启动子表达)。参见，例如，Aronovich等；Kebriaei等，和Grabundzija等，全部按引用并入本文中。
使用SBTS允许转基因(例如编码本文中描述的CAR的核酸)的有效整合和表达。本文中提供了产生稳定地表达本文CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，例如，使用转座子系统，如SBTS。
根据本文中的方法，在一些实施方案中，将含有SBTS组分的一个或多个核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，T细胞或NK细胞)。例如，可以通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法，例如本文中描述的方法，例如电穿孔、转染或脂转染，来递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如编码本文CAR的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文CAR的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其他实施方案中，提供了具有两个核酸的系统，例如，双重质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一和第二核酸共同递送至宿主细胞中。
在一些实施方案中，组合使用SBTS的基因插入和使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统，或工程化meganuclease再工程化归巢核酸内切酶)的基因编辑，来产生表达本文CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，使用非病毒递送方法允许细胞(例如T细胞或NK细胞)的重新编程，并且允许细胞直接输注至受试者中。非病毒载体的优势包括但不限于，容易且相对低成本地产生满足患者群需要的足够量、存储过程中的稳定性和没有免疫原性。
细胞来源
在扩增和遗传修饰以例如表达本文的CAR前，可以从受试者获得细胞来源(例如T细胞或NK细胞)。术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和及其转基因物种。T细胞可以获自各种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些方面中，可以使用本领域中可得的各种T细胞系。在本公开的某些方面中，可以使用本领域技术人员已知的各种技术(例如,FicollTM分离)，从受试者收集的血液单位，获得T细胞。在一个优选方面中，通过分离性输血(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。分离性输血产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面中，可以洗涤通过分离性输血收集的细胞，以除去血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或介质中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个方面中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替换的方面中，洗涤液不含钙并且可以不含镁或可以不含许多(如果不是全部)二价阳离子。不存在钙的初始激活步骤可以导致扩大的激活。本领域普通技术人员将容易明了，可以通过本领域已知的方法来完成洗涤步骤，例如使用半自动化“流过”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明来完成。洗涤后，将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液中，例如，无钙、无镁PBS，PlasmaLyte A或其他含有或不含缓冲剂的盐水溶液。或者，可以去除分离性输血样品中的不合需要的组分，并将细胞直接悬浮于培养基中。
可以意识到，本申请的方法可以利用包含5％或更低(例如，2％)人AB血清的培养基条件，并利用已知培养基条件和组成，例如，Smith等，“Ex vivo expansion of human Tcells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune CellSerum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
在一个方面中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度或通过逆流离心洗脱，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过正向或负向选择技术，进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个方面中，通过用抗CD3/抗CD28(例如，3×28)-缀合的珠子(如M-450CD3/CD28T)孵育足以正向选择所需T细胞的时间，来分离T细胞。在一个方面中，时间为约30分钟。在进一步的方面中，时间为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的方面中，时间为至少1、2、3、4、5或6小时。在再另一个优选方面中，时间为10至24小时。在一个方面中，孵育时间为24小时。在与其他细胞类型相比存在较少T细胞的任何情况中，例如在从肿瘤组织或从免疫缺陷个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时，可以使用较长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用较长孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠子的时间，和/或通过提高或降低珠子与T细胞的比例(如本文中进一步描述的)，可以在培养开始时或培养过程中的任何其他时间点，择优选择或选除T细胞的亚群。另外，通过提高或降低珠子或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或培养过程中的其他所需时间点，择优选择或选除T细胞的亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明中还可以使用多轮选择。在某些方面中，可能期望在激活和扩增过程中实施选择程序和使用“未被选择的”细胞。“未被选择的”细胞还可以接受更多轮的选择。
可以组合使用针对负向选择的细胞所独特的表面标志物的抗体，以通过负向选择来富集T细胞群。一种方法是，使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物，利用负磁性免疫吸附或流式细胞术，进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DA和CD8的抗体。在某些方面中，可能期望，针对通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控T细胞进行富集或正向选择。备选地，在某些方面中，可以通过抗CD25缀合的珠子或其他相似的选择方法来耗尽T调节性细胞。
本文中的方法可以包括例如选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，例如T调节性细胞耗尽群(CD25+耗尽的细胞)，其中使用例如本文中的负向选择技术。优选，T调节性细胞耗尽的细胞群含有低于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合性配体IL-2，从群中除去T调节性细胞(例如，CD25+T细胞)。在一个实施方案中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合性配体与基质(例如，珠子)缀合，或以其它方式包被在基质(例如，珠子)上。在一个实施方案中，将抗CD25抗体或其片段与本文所述的基质缀合。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗尽试剂，从群中除去T调节性细胞(例如，CD25+T细胞)。在一个实施方案中，细胞与CD25耗尽试剂的比例为1e7细胞：20uL，或1e7细胞：15uL，或1e7细胞：10uL，或1e7细胞：5uL，或1e7细胞：2.5uL，或1e7细胞：1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于T调节性细胞(例如CD25+)耗尽，使用高于500百万细胞/ml。在进一步的方面中，使用600、700、800或900百万细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待耗尽的免疫效应细胞群包括约6×109CD25+T细胞。在其他方面中，待耗尽的免疫效应细胞群包括约1×109至1×1010(以及其间的任何整数值)的CD25+T细胞。在一个实施方案中，所得到的T调节耗尽细胞群具有2×109T调节性细胞(例如，CD25+细胞)，或更少(例如，1×109、5×108、1×108、5×107、1×107或更少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用具有耗尽管设置(例如tubing 162-01)的CliniMAC系统，从群中除去T调节细胞，例如CD25+细胞。在一个实施方案中，以耗尽设置例如DEPLETION2.1，运行CliniMAC系统。
不希望受到特定理论的束缚，在分离性输血前或在制造CAR表达细胞产品的过程中，降低受试者中免疫细胞的负调节物的水平(例如，降低不合需要的免疫细胞例如TREG细胞的数量)，可以降低受试者复发的风险。例如，耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。降低TREG细胞的方法包括但不限于，环磷酰胺、抗GITR抗体(本文中描述的抗GITR抗体)、CD25耗尽、及其组合。
在一些实施方案中，制造方法包括在制造CAR表达细胞前降低TREG细胞的数量(例如，耗尽)。例如，制造方法包括将样品(例如，分离性输血样品)接触抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段，或CD25结合性配体)，以在制造CAR表达细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品前耗尽TREG细胞。
在一个实施方案中，在收集细胞用于制造CAR表达细胞产品前，用一种或多种降低TREG细胞的疗法预先治疗受试者，由此降低CAR表达细胞治疗后受试者复发的风险。在一个实施方案中，降低TREG细胞的方法包括但不限于，将环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合中的一种或多种施用于受试者。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合中的一种或多种，可以在输注CAR表达细胞产品之前、过程中或之后进行。
在一个实施方案中，在收集细胞用于制造CAR表达细胞产品前，用环磷酰胺预先治疗受试者，由此降低CAR表达细胞治疗后受试者复发的风险。在一个实施方案中，在收集细胞用于制造CAR表达细胞产品前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，由此降低CAR表达细胞治疗后受试者复发的风险。
在一个实施方案中，待去除的细胞群既不是调节性T细胞也不是肿瘤细胞，而是以其它方式负面地影响CART细胞的扩增和/或功能的细胞，例如，表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在的免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞。在一个实施方案中，设想与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行地去除这样的细胞，或在所述耗尽后去除，或以另一种顺序去除。
本文中描述的方法可以包括一个以上选择步骤，例如，一个以上耗尽步骤。例如，使用针对负向选择的细胞所独特的表面标志物的抗体组合，通过负向选择来富集T细胞群。一种方法是，使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物，通过负磁性免疫吸附或流式细胞术，进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文中的方法可以进一步包括从不包含CD25的群中去除表达肿瘤抗原的细胞，肿瘤抗原为例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b，以由此提供T调节细胞耗尽的(例如，CD25+耗尽的)和肿瘤抗原耗尽的细胞群，该细胞群适用于CAR(例如，本文中的CAR)表达。在一个实施方案中，与T调节(例如，CD25+)细胞同时去除肿瘤抗原表达细胞。例如，可以将抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段，附着在同一基质例如珠子上，可以用该珠子除去细胞；或可以将抗CD25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段附着在分开的珠子上，可以将所述珠子的混合物用于除去细胞。在其他实施方案中，T调节细胞(例如，CD25+细胞)的去除和肿瘤抗原表达细胞的去除是按序的，并且可以例如以任何顺序进行。
还提供了方法，所述方法包括从群中去除表达检查点抑制剂(例如，本文中描述的检查点抑制剂)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一种或多种，以由此提供T调节耗尽的(例如CD25+耗尽的)细胞和检查点抑制剂耗尽的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗尽的细胞)的群。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施方案中，与T调节(例如，CD25+)细胞同时去除检查点抑制剂表达细胞。例如，可以将抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段附着在相同珠子上，可以使用该珠子去除细胞；或可以将抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段附着在分开的珠子上，可以使用所述珠子的混合物去除细胞。在其他实施方案中，T调节细胞(例如，CD25+细胞)的去除和检查点抑制剂表达细胞的去除是按序的，并且可以以任何顺序进行。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶(granzyme)B和穿孔素(perforin)，或其他合适的分子(例如，其他细胞因子)中的一种或多种的T细胞群。例如，可以通过PCT公开No.:WO2013/126712中的方法，确定用于筛选细胞表达的方法。
对于通过正向或负向选择来分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒如珠子)的浓度。在某些方面中，可能期望显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(例如，提高细胞的浓度)，以确保细胞与珠子的最大接触。例如，在一个方面中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的方面中，使用高于100百万细胞/ml。在进一步的方面中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万细胞/ml的细胞浓度。在再一个方面中，使用75、80、85、90、95或100百万细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面中，可以使用125或150百万细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致提高的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞，或更有效地从存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值并将是期望获得的。例如，使用高细胞浓度允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关方面中，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠子)的混合物，最小化颗粒与细胞之间的相互作用。这允许选择表达大量期望抗原(结合至颗粒)的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个方面中，所用的细胞浓度为5×10e6/ml。在其他方面中，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml，和其间的任何整数值。
在其他方面中，可以将细胞在旋转器上在不同速度下在2-10℃或室温孵育不同长度的时间。
在洗涤步骤后也可以冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的融化步骤通过除去细胞群中的粒细胞以及一定程度地除去单核细胞，可以提供更均一的产品。除去血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本上下文中将是有用的，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的含有例如Hespan和PlasmaLyte A的细胞冷冻介质，随后以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并且存储在液氮存储罐的蒸汽相中。可以使用受控冷冻的其他方法，以及立即在-20℃或液氮中不受控冷冻。
在某些方面中，按照本文中的描述，将冷冻保存的细胞融化并洗涤，并允许在室温下静置一小时，随后使用本发明公开的方法激活。
本发明还考虑，在可能需要本文中描述的扩增细胞前的时间段，从受试者收集血样或分离性输血产品。因此，可以在需要的任何时间点收集待扩增的细胞的来源，并且分离所需的细胞(如T细胞)并冷冻，之后用于T细胞疗法中，用于将得益于T细胞疗法的许多疾病或病症(如本文描述的疾病或病症)。在一个方面中，血样或分离性输血产品获自整体健康的受试者。在某些方面中，血样或分离性输血产品获自有发生疾病风险但尚未发生疾病的整体健康受试者，并且分离目标细胞并冷冻用于之后的使用。在某些方面中，可以将T细胞扩增、冷冻并在之后的时间使用。在某些方面中，在诊断为本文中描述的特定疾病后不久但在任何治疗前，从患者收集样品。在其它方面中，在许多相关治疗形式前，从来自受试者的血样或分离性输血物分离细胞，相关治疗形式包括但不限于使用药剂的治疗，如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)，抗病毒剂，化疗，放疗，免疫抑制剂，如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射。
在本发明公开的其它方面中，治疗后从患者直接获得T细胞，给受试者留下功能性T细胞。在这点上，已经观察到某些癌症治疗后，特别是使用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久，在患者通常正从治疗恢复的时间过程中，获得的T细胞的质量可能对于其离体扩增的能力而言是最佳的或是改善的。同样，使用本文中的方法离体操作后，对于增强的移植和体内扩增，这些细胞可以是处于优选的状态中。因此，在本发明中考虑在这个恢复期过程中收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血系的其他细胞。此外，在某些方面中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案也可以用于在受试者中形成有利于特定细胞类型再繁殖(repopulation)、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在治疗后规定的时间窗中。举例说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，T细胞群是二酰甘油激酶(DGK)-缺陷型。DGK-缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白的细胞，或具有降低的或抑制的DGK活性的细胞。DGK-缺陷型细胞可以通过遗传方法来产生，例如，给予RNA干扰剂，例如，siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止DGK表达。或者，可以通过用本文中描述的DGK抑制剂处理，来产生DGK-缺陷型细胞。
在一个实施方案中，T细胞群是Ikaros-缺陷型。Ikaros-缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白的细胞，或具有降低的或抑制的Ikaros活性的细胞。Ikaros-缺陷型细胞可以通过遗传方法来产生，例如，给予RNA干扰剂，例如，siRNA、shRNA、miRNA，以降低或阻止Ikaros表达。或者，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺)处理，来产生Ikaros-缺陷型细胞。
在一些实施方案中，T细胞群是DGK-缺陷型和Ikaros-缺陷型，例如，不表达DGK和Ikaros，或具有降低的或抑制的DGK和Ikaros活性。这样的DGK和Ikaros-缺陷型细胞可以通过本文中描述的任一种方法来产生。
在一个实施方案中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体CAR免疫效应细胞
在本文中描述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺乏功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，I类HLA和/或II类HLA)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如经过工程化使得其在表面上不表达任何功能性TCR，工程化使得其不表达功能性TCR的一个或多个亚基，或工程化使得其在表面上产生非常少的功能性TCR。或者，T细胞可以表达实质性受损的TCR，例如，通过表达一个或多个TCR亚基的突变或截短形式。术语“实质性受损的TCR”表示此TCR将不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文中描述的T细胞可以例如经工程化使得其在表面上不表达功能性HLA。例如，本文中描述的T细胞可以经工程化，使得下调细胞表面表达的HLA(例如，I类HLA和/或II类HLA)。
在一些实施方案中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如，I类HLA和/或II类HLA。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰T细胞可以通过任何合适的方式来获得，包括敲除或敲低一个或多个TCR或HLA亚基。例如，使用siRNA、shRNA、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，或锌指核酸内切酶(ZFN)，T细胞可以包含TCR和/或HLA的敲低。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或低水平表达抑制性分子的细胞，例如，通过本文中描述的任一种方法。例如，细胞可以是不表达或低水平表达抑制性分子的细胞，例如，可以降低CAR表达细胞引起免疫效应子应答的能力的抑制性分子。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC II、GAL9、腺苷和TGFRβ。例如，通过在DNA、RNA或蛋白水平抑制，对抑制性分子的抑制可以优化CAR表达细胞性能。在一些实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如，dsRNA例如siRNA或shRNA、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如，如本文中描述的。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施方案中，可以在细胞(例如，T细胞)中使用siRNA或shRNA来抑制TCR表达和/或HLA表达，其中所述siRNA或shRNA靶向编码TCR和/或HLA、和/或本文中描述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC II、GAL9、腺苷和TGFRβ)的核酸。用于siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第649和650段中，将其全部按引用并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文中使用的“CRISPR”或“TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指，一组规律成簇间隔短回文重复，或包含这样的一组重复的系统。如本文中使用的，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。
“CRISPR/Cas”系统是指源自CRISPR和Cas的系统，其可以用于细胞(例如，T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因、和/或本文中描述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC II、GAL9、腺苷和TGFRβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第651-658段中，将其全部按引用并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活物样效应核酸酶(一种人工核酸酶)，其可以用于细胞(例如，T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因、和/或本文中描述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC II、GAL9、腺苷和TGFRβ)。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第659-665段中，将其全部按引用并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶(一种人造核酸酶)，其可以用于细胞(例如，T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因、和/或本文中的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC II、GAL9、腺苷和TGFRβ)。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第666-671段中，将其全部按引用并入。
端粒酶表达
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，由于在T细胞中缩短的端粒，治疗性T细胞在患者中具有短期持续性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞中的端粒并提高T细胞在患者中的持续性。参见，Carl June,“Adoptive T cell therapy forcancer in the clinic”，Journal of Clinical Investigation，117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位地表达端粒酶亚基，例如，端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面中，本公开提供一种产生CAR表达细胞的方法，包括将细胞接触编码端粒酶亚基(例如，端粒酶的催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT)的核酸。细胞可以在接触编码CAR的构建体之前、同时或之后接触所述核酸。
在一个方面中，本发明公开涉及，制备免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)群的方法。在一个实施方案中，方法包含：提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群，将免疫效应细胞群接触编码CAR的核酸；并且在允许CAR和端粒酶表达的条件下，将免疫效应细胞群接触编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在一个实施方案中，hTERT具有GenBank Protein ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等，“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue4，1997年8月22日，第785-795页)，如本文中SEQ ID NO:110中所列的。
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:110的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个实施方案中，hTERT具有SEQ ID NO:110的序列。在一个实施方案中，hTERT包含N-末端、C-末端或两端(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸)的缺失。在一个实施方案中，hTERT在N-末端、C-末端或两端包含(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸)的转基因氨基酸序列。
在一个实施方案中，hTERT由GenBank登录号No.AF018167的核酸序列编码(Meyerson等，“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue4，1997年8月22日，第785-795页)，如本文中SEQ ID NO:111中所列的。
在一个实施方案中，hTERT由具有与SEQ ID NO:111的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的核酸编码。在一个实施方案中，hTERT由SEQ IDNO:111的核酸编码。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的激活和表达
通常使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开No.20060121005中的方法来激活和扩增免疫效应细胞，如T细胞。
通常，可以通过接触已经连接了刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激免疫效应细胞(例如，T细胞)表面上的共刺激分子的配体的表面，来扩增免疫效应细胞(例如，T细胞)群。特别地，可以按照本文中所述的来刺激T细胞群，如通过接触固定于表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体，或通过接触结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如，bryostatin)，来刺激T细胞群。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，可以使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，将T细胞群接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包含9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，法国)，还可以使用本领域公知的其他方法(Berg等，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等，J.Immunol Meth.227(1-2):53-63，1999)。
在某些方面中，可以通过不同的方案来提供用于T细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的试剂可以在溶液中或偶联于表面上。与表面偶联时，试剂可以偶联在同一表面(即，以“顺式”形式)或偶联在不同表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可以偶联在表面上，而另一种试剂在溶液中，在一个方面中，提供共刺激信号的试剂结合细胞表面，而提供初级激活信号的试剂在溶液中或偶联在表面上。在某些方面中，两种试剂可以都在溶液中。在一个方面中，试剂可以是可溶形式，并且随后与表面交联，如表达Fc受体、或抗体、或可以与试剂结合的其他结合剂的细胞。在这点上，对于人工抗原递呈细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公开No.20040101519和20060034810，可以考虑将其用于本发明公开中激活和扩增T细胞。
在一个方面中，将两种试剂固定于珠子上，在同一珠子上，即，“顺式”，或在分开的珠子上，即“反式”。例如，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以等摩尔量共同固定于同一珠子上。在一个方面中，使用1:1比例的与珠子结合的各抗体，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明公开的某些方面中，使用结合珠子的抗CD3:CD28抗体的比例，使得与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的提高。在一个特定的方面中，与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的提高。在一个方面中，结合珠子的CD3:CD28抗体的比例为100:1至1:100、以及其间所有的整数值。在本发明公开的一个方面，比抗CD3抗体多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比例小于一。在本发明的某些方面中，结合珠子的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个特定方面中，使用1:100结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在一个方面中，使用1:75结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在再一个方面中，使用1:50结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在一个方面中，使用1:30结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在一个优选方面中，使用1:10结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在一个方面中，使用1:3结合珠子的CD3:CD28抗体比例。在再一个方面中，使用3:1结合珠子的CD3:CD28抗体比例。
可以使用1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比例来刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地明了，颗粒与细胞的比例取决于颗粒相对于靶细胞的大小。例如，尺寸小的珠子可能只结合很少的细胞，而较大的珠子可以结合许多。在某些方面中，细胞与颗粒的比例范围为1:100至100:1和其间任何整数值，并且在进一步的方面中，比例包含1:9至9:1和其间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的偶联抗CD3和抗CD28的颗粒与T细胞的比例可以如上所述来改变，然而，某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比例为至少1:1颗粒/T细胞。在一个方面中，使用1:1或更低的颗粒与细胞的比例。在一个特别的方面中，优选的颗粒:细胞比例为1:5。在再一个方面中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激日而改变。例如，在一个方面中，第一天颗粒与细胞的比例为1:1至10:1，此后每天或每隔一天，以1:1至1:10的最终比例(基于添加日的细胞计数)，将另外的颗粒加入细胞中，长达10天。在一个特别的方面中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1:1，并在刺激的第三天和第五天，调节至1:5。在一个方面中，以每天或每隔一天为基础添加颗粒，在第一天添加至1:1的最终比例，并且在刺激的第三天和第五天添加至1:5。在一个方面中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为2:1，在刺激的第三天和第五天，调节为1:10。在一个方面中，以每天或每隔一天为基础添加颗粒，在第一天添加至1:1的最终比例，并且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员将认识到各种其他比例适用于本发明公开中。特别地，比例将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而改变。在一个方面中，使用的最典型比例在第一天为大约1:1、2:1和3:1。
在本发明公开的其它方面中，将细胞(如T细胞)与试剂包被的珠子组合，随后将珠子和细胞分开，并且随后培养细胞。在可替换的方面中，在培养前，试剂包被的珠子和细胞不分离，而是一起培养。在再一个方面中，首先通过施加力(如磁力)，将珠子和细胞浓缩，导致细胞表面标志物提高的连接，由此诱导细胞刺激。
例如，可以通过允许连接抗CD3和抗CD28的顺磁性珠子(3×28个珠子)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠子(例如，1:1比例的M-450CD3/CD28T顺磁性珠子)在缓冲液例如PBS(不含二价阳离子，如，钙和镁)中组合。再次，本领域普通技术人员可以容易地明了，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并且仅构成0.01％的样品，或整个样品(即，100％)可能包含目标靶细胞。因此，任何细胞数量在本发明公开的范围内。在某些方面中，可能期望显著降低其中将颗粒和细胞混合在一起的体积(即，提高细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在一个方面中，使用大于100百万细胞/ml。在再一个方面中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万细胞/ml的细胞浓度。在再一个方面中，使用75、80、85、90、95或100百万细胞/ml的细胞浓度。在更多方面中，可以使用125或150百万细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致提高的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且在某些方面中期望获得。例如，使用高细胞浓度允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，例如，通过本文中的方法，来扩增用编码CAR(例如，本文中的CAR)的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，在培养中将细胞扩增几个小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21个小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，将细胞扩增4至9天。在一个实施方案中，将细胞扩增8天或更短，例如，7、6或5天。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文中的CAR表达细胞)在培养中扩增5天，并且所得到的细胞比在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞更有效。例如，可以通过各种T细胞功能，例如，增殖、靶细胞杀灭、细胞因子产生、激活、迁移或其组合来定义效力。在一个实施方案中，扩增5天的细胞(例如，本文中的CAR表达细胞)显示出，与在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，在抗原刺激时细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍提高。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文中的表达CAR的细胞)在培养中扩增5天，并且所得到的细胞呈现出，与相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，更高的促炎性细胞因子产生，例如更高的IFN-γ和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，扩增5天的细胞(例如，本文中的CAR表达细胞)，与相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，显示出以pg/ml计的促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)至少一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多的提高，如。
在本发明公开的一个方面中，可以将混合物培养几个小时(约3小时)至约14天或其间任何小时整数值。在一个方面中，将混合物培养21天。在本发明的一个方面中，将珠子和T细胞一起培养约八天。在一个方面中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能期望几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640，或X-vivo 15，(Lonza))，其可以含有增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞间介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α，或任何其他本领域技术人员已知的用于细胞生长的添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，Optimizer，以及添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充了合适量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或含量足以用于T细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素，只包括在实验培养物中，待输注至受试者的细胞培养物中没有。将靶细胞维持在支持生长需要的条件下，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在包含一种或多种白细胞间介素的合适培养基(例如，本文中描述的培养基)中扩增，导致在14天的扩增时间中细胞至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)增加，例如，通过本文中描述的方法(如流式细胞术)测量的。在一个实施方案中，在IL-15和/或IL-17(例如，IL-15和IL-17)的存在下扩增细胞。
在一些实施方案中，本文中描述的方法，例如，CAR表达细胞制造方法，包括从细胞群中除去T调节细胞例如CD25+T细胞，例如使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2来除去。本文中描述了从细胞群除去T调节细胞(例如，CD25+T细胞)的方法。在一些实施方案中，所述方法(例如，制造方法)进一步包括将细胞群(例如，其中T调节细胞(如CD25+T细胞)已经耗尽的细胞群；或之前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群)接触IL-15和/或IL-17。例如，在IL-15和/或IL-17的存在下扩增细胞群(例如，之前已经接触过抗CD25抗体其片段或CD25结合配体的细胞群)。
在一些实施方案中，在CAR表达细胞的制造过程中，例如，离体制造过程，将本文中描述的CAR表达细胞接触包含白细胞间介素(IL-15)多肽、白细胞间介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者之组合，例如，hetIL-15，的组合物。在一些实施方案中，在CAR表达细胞的制造过程中(例如，离体)，将本文中描述的CAR表达细胞接触包含IL-15多肽的组合物。在一些实施方案中，在CAR表达细胞的制造过程中(例如，离体)，将本文中的CAR表达细胞接触包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者之组合的组合物。在一些实施方案中，在CAR表达细胞的制造过程中(例如，离体)，将本文中描述的CAR表达细胞接触包含hetIL-15的组合物。
在一个实施方案中，在离体扩增过程中，将本文中的CAR表达细胞接触包含hetIL-15的组合物。在一个实施方案中，在离体扩增过程中，将本文中的CAR表达细胞接触包含IL-15多肽的组合物。在一个实施方案中，在离体扩增过程中，将本文中的CAR表达细胞接触包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物。在一个实施方案中，接触导致淋巴细胞亚群(例如，CD8+T细胞)的存活和增殖。
在一个实施方案中，在包含血清的培养基中培养(例如，扩增、刺激和/或转导)细胞。血清可以是例如人AB血清(hAB)。在一些实施方案中，hAB血清以约2％、约5％、约2-3％、约3-4％、约4-5％或约2-5％存在。2％和5％血清都是允许T细胞许多倍扩增的合适水平。此外，如Smith等，“Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapyusing the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所示的，含有2％人AB血清的培养基适用于T细胞的离体扩增。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以呈现出不同的特征。例如，典型的血液或分离性输血的外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)的辅助T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的T细胞离体扩增将产生T细胞群，该T细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天后，该T细胞群包含递增的更多TC细胞群。因此，根据治疗的目的，给受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有利的。相似地，如果TC细胞的抗原特异性子集已经分离，将这个子集扩增至更高程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物，其他表型标志物变化显著，但大部分地，在细胞扩增过程中是可重复的。因此，这样的可重复性使得能够针对特定目标定制激活T细胞产物。
在一些实施方案中，可以基于例如CCL20、GM-CSF、IFNγ、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-2、IL-21、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、TNFα的一种或多种和/或其组合的蛋白表达水平，来选择用编码CAR(例如，本文中的CAR)的核酸转导的细胞用于施用。在一些实施方案中，可以基于例如CCL20、IL-17a、IL-6及其组合的蛋白表达水平，选择用于施用的用编码CAR(例如，本文中的CAR)的核酸转化的细胞。
此外，除了CD4和CD8标志物，其他表型标志物可以变化显著，但大部分地，在细胞扩增过程中是可重复的。因此，这样的可重复性使得能够针对特定目标定制激活T细胞产物。
一旦构建间皮素CAR，可以使用各种测定来评价分子的活性，例如但不限于，抗原刺激后扩增T细胞的能力、在再刺激不存在下维持T细胞扩增的能力、以及在合适的体外和动物模型中的抗癌活性。可用于评价间皮素CAR的效果的测试试验，描述于例如2014年12月19日提交的国际公开WO2015/090230的[0417]-[00423]段中，将其全部按引用并入本文中。
CAR细胞群
在另一个方面中，本发明提供了CAR表达细胞群，例如，间皮素CAR表达细胞群。在一些实施方案中，CAR表达细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合物。
例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞群可以包括表达具有本文中描述的抗间皮素结合结构域的CAR的第一细胞，和表达具有不同的抗间皮素结合结构域(例如，不同于第一细胞表达的CAR中的抗间皮素结合结构域的本文所述的抗间皮素结合结构域)的CAR的第二细胞。
作为另一个实例，CAR表达细胞群可以包括：表达包含抗间皮素结合结构域的CAR的第一细胞(例如，如本文中描述的)，和表达包含针对间皮素以外的其他靶标(基质细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，FAP；前列腺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH，或精子蛋白17；例如，肺癌细胞上的除了间皮素以外的其他靶标，例如，VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞群包含，例如，表达包含初级胞内信号结构域的CAR的第一细胞和表达包含二级信号结构域的CAR的第二细胞。
在一个实施方案中，CAR表达细胞群可以包括：表达包含抗间皮素结合结构域的CAR的第一细胞，和表达包含靶向(例如，特异性地结合)B细胞上表达的抗原或B细胞抗原的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一个实施方案中，B细胞抗原是CD19。
在另一个方面中，本发明提供了细胞群，其中细胞群中的至少一种细胞表达具有本文中描述的抗间皮素结合结构域的CAR，和第二细胞表达另一种试剂例如，增强CAR表达细胞的活性或功能的试剂。例如，在一个实施方案中，试剂可以是调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的试剂。在一些实施方案中，调节或调控T细胞功能的分子是抑制性分子，例如，本文中所述的试剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低CAR表达细胞引起免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷或TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的试剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)和与之结合的第二多肽，所述第二多肽向细胞提供提供正信号(例如，本文中描述的胞内信号结构域)。在一个实施方案中，试剂包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽为例如抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷或TGFRβ)或这些中任何一个的片段(例如，这些中任何一个的胞外结构域的至少一部分)，其中第二多肽是本文中描述的胞内信号结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如，如本文中描述的)和/或初级信号结构域(例如，本文中描述的CD3ζ信号结构域)。在一个实施方案中，试剂包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文中描述的胞内信号结构域的第二多肽(例如，本文中的CD28信号结构域和/或本文中的CD3ζ信号结构域)。
在一个方面中，本发明提供了方法，包括组合另一种药剂(例如，PD-L1抑制剂，如本文中的PD-L1抑制剂)施用CAR表达细胞群(例如，CART细胞，例如，表达不同CAR的细胞混合物)。在另一个方面中，本发明提供了组合另一种药剂(例如PD-L1抑制剂，如本文中描述的PD-L1抑制剂)施用细胞群的方法，其中所述细胞群中的至少一种细胞表达具有本文中描述的抗间皮素结合结构域的CAR，和第二细胞表达另一种试剂，例如增强CAR表达细胞的活性或适合性的试剂。
PD-L1抑制剂
免疫系统具有识别和消除肿瘤细胞的能力；然而，肿瘤可以使用多种策略来逃避免疫。免疫检查点的阻断是激活或再激活治疗性抗肿瘤免疫的方法之一。程序性死亡配体1(PD-L1)已经被描述为免疫抑制受体程序性死亡1(PD-1)的配体。PD-L1与PD-1的结合导致T细胞受体介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的抑制(Freeman等(2000)J Exp Med 192:1027-34)。因此，PD-L1的阻断可以导致抗肿瘤免疫的增强。
几个细胞类型表达PD-L1。例如，PD-L1在激活的T细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和血管内皮细胞上表达。PD-L1在许多癌症中表达，包括人肺癌、卵巢癌和结肠癌，以及各种骨髓瘤(Iwai等(2002)PNAS 99:12293-7；Ohigashi等(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53；Okazaki等(2007)Intern.Immun.19:813-24；Thompson等(22006)Cancer Res.66:3381-5)。PD-L1表达与各种类型的癌症中的不利进展强烈相关，癌症包括肾癌、卵巢癌、膀胱癌、乳癌、胃癌和胰腺癌。
与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞相比，许多肿瘤浸润T细胞主要表达PD-1。这表明了肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调可能促使受损的抗肿瘤免疫应答(Ahmadzadeh等(2009)Blood 114:1537-44)。因此，通过PD-L1表达肿瘤细胞介导的与PD-1表达T细胞相互作用的PD-L1信号，可以导致T细胞激活的减弱和免疫监视的逃脱(Sharpe等(2002)Nat Rev Immunol.2:116-26；Keir等(2008)Annu Rev Immunol.26:677-704)。PD-1阻断可以通过增强的效应T细胞的募集，抑制免疫原性差的肿瘤细胞的血源性扩散(Iwai等(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
PD-L1抑制可以增强T细胞免疫力，例如，通过阻断其与PD-1和B7-1的抑制性相互作用。PD-L1抑制还可以允许经由PD-L2/PD-1的免疫调节。PD-1和B7-1两者都在T细胞、B细胞、DC和巨噬细胞上表达，这给这些细胞类型上B7-1和PD-L1之间的双向相互作用提供了可能性。非造血细胞上的PD-L1可以与T细胞上的B7-1以及PD-1相互作用。
术语“程序性死亡配体1”或“PD-L1”包括同种型，哺乳动物(例如人)的PD-L1，人PD-L1的物种同源物，和与PD-L1包含至少一个共同表位的类似物。PD-L1(例如，人PD-L1)的氨基酸序列是本领域已知的，例如，Dong等(1999)Nat Med.5(12):1365-9；Freeman等(2000)J Exp Med.192(7):1027-34。
本发明公开提供了用于治疗疾病(如间皮素表达相关疾病)的方法和组合物，包括施用PD-L1抑制剂。PD-L1抑制剂可以具有以下的一个或多个特性：抑制或降低PD-L1与受体(例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者)的结合；结合PD-L1或PD-L1结合性受体(例如PD-1或CD80(B7-1)，或两者)；抑制或降低PD-L1的一个或多个活性，例如，导致以下的一或多项：肿瘤浸润淋巴细胞的增加、T细胞受体介导的增殖的提高、或癌细胞的免疫逃逸的减少；或抑制或降低PD-L1表达，例如PD-L1的转录或翻译。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂降低PD-L1与受体的结合，例如，与PD-1或CD80(B7-1)或两者的结合。例如，与不存在PD-L1抑制剂的结合相比，在PD-L1抑制剂的存在下，PD-L1与受体(例如，与PD-1或CD80(B7-1)或两者)的结合降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个实施方案中，通过本领域已知的标准结合测定试验，PD-L1与受体(例如，与PD-1或CD80(B7-1)或两者)的结合是可忽略的，例如，不可检测的。配体-受体结合测定试验是本领域公知的，并且包括免疫沉淀和western印迹测试。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂降低PD-L1的一个或多个活性。例如，与不存在PD-L1抑制剂的PD-L1活性相比，PD-L1活性降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂降低PD-L1表达，例如，降低PD-L1的转录或翻译。例如，与不存在PD-L1抑制剂时的PD-L1转录相比，PD-L1转录降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另一个实例中，与不存在PD-L1抑制剂时的PD-L1翻译相比，PD-L1翻译降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。用于测定PD-L1RNA表达的试验是本领域已知的，并且包含基于PCR扩增的测定试验，例如，QPCR，以及基于核酸杂交的测定试验，例如，Northern印迹。用于测定PD-L1蛋白表达的测定试验是本领域已知的，并且包括western印迹和免疫组织化学分析。在这样的实施方案中，PD-L1抑制剂的施用导致细胞中表达的PD-L1的降低水平或量、或降低数量的PD-L1表达细胞。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂可以是小分子；多肽，例如，融合蛋白；抗体分子；或抑制性核酸；例如，siRNA或shRNA。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是小分子。在一个实施方案中，小分子抑制剂结合PD-L1。在另一个实施方案中，小分子抑制剂结合PD-L1的受体，例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者。在再另一个实施方案中，小分子抑制剂阻止或降低PD-L1与其受体(例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者)的结合。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是多肽或肽。在一个实施方案中，PD-L1的多肽或肽抑制剂结合PD-L1或其受体，例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者。在一个实施方案中，所述多肽或肽防止或降低PD-L1与其受体(例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者)的结合。在一个实施方案中，多肽包含PD-L1的一部分，例如，PD-L1的受体结合部分，或其修饰部分，所述修饰部分与野生型PD-L1相比可以呈现出提高的PD-1或CD80(B7-1)亲和性。在这样的实施方案中，多肽通过与受体竞争结合来抑制或降低PD-L1活性。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抑制性核酸，例如，RNA干扰(RNAi)试剂。抑制性核酸可以是双链或单链核酸。抑制性核酸可以是DNA、RNA或包含DNA和RNA的杂合体。抑制性核酸抑制或降低PD-L1的表达，例如，翻译。RNA干扰(RNAi)试剂通常引起靶mRNA分子的破坏，以抑制或降低靶基因(例如，PD-L1)的表达，例如翻译。RNAi试剂的实例包括长dsRNA、siRNA、shRNA和微RNA。本文中描述的抑制性核酸包括但不限于，适体、morpholino、核酶以及包含或编码长dsRNA、siRNA、shRNA和微RNA的核酸序列，例如，质粒或载体。
在一个实施方案中，抑制性核酸是与PD-L1基因或其片段具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性或互补性的RNA。
在一个实施方案中，抑制性核酸是约15至约65，约15至约40，或约15至约28个核苷酸长的siRNA或shRNA。在抑制性核酸是siRNA的实施方案中，siRNA具有约19至25个核苷酸的长度，约19、20、21或22个核苷酸。在抑制性核酸是shRNA的实施方案中，shRNA具有约42至约70个核苷酸的长度。在一个实施方案中，shRNA包含通过未配对核苷酸的环连接的配对的反义和正义RNA链。在一个实施方案中，双链茎具有约19至约29个核苷酸的长度，完全配对或具有内部错配和环。在一个实施方案中，环包含4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，例如，4或7个核苷酸。
抑制性核酸可以例如从质粒或载体合成或表达。可以使用本领域技术人员已知的各种技术来产生合成的RNAi试剂。例如，可以使用本领域已知的方法，如使用适当保护的核糖核苷亚磷酸胺和常规的DNA/RNA合成仪，来化学合成或重组产生siRNA分子(Elbashir,S.M.等(2001)Nature 411:494-498；Elbashir,S.M.,W.Lendeckel和T.Tuschl(2001)Genes&Development 15:188-200；Harborth,J.等(2001)J.Cell Science 114:4557-4565；Masters,J.R.等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8012-8017；和Tuschl,T.等(1999)Genes&Development 13:3191-3197)。或者，几个商业RNA合成供应商是可利用的，包括但不限于，Proligo(汉堡，德国)、Dharmacon Research(Lafayette,Co.,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的一部分,Rockford,Ill.,USA)、Glen Research(Sterling,Va.,USA)、ChemGenes(Ashland,Mass.,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。
用于评价表达(例如评价RNA或蛋白水平)的测定试验，是本领域公知的。例如，基于PD-L1核苷酸序列的探针可以用于检测编码相同或同源蛋白的转录物或基因组序列。在优选实施方案中，探针进一步包含与其连接的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这样的探针可以用于例如基于PCR的测定试验中，以测量PD-L1mRNA的水平。Western印迹技术是本领域公知的，并且用于测量PD-L1蛋白的水平。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一个实施方案中，抗体分子结合哺乳动物(例如，人)PD-L1。例如，抗体分子特异性地结合PD-L1上的表位，例如，线性或构象表位(例如，本文中描述的表位)。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。MEDI4736(Medimmune)是结合PDL1并抑制该配体与PD1相互作用的人单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C。MSB0010718C(也称为A09-246-2；Merck Serono或avelumab)是结合PD-L1的单克隆抗体。其他抗PD-L1抗体和抑制剂公开于WO2013/079174、WO2001/014557、WO2002/086083、WO2007005874、WO2010036959、WO2010077634和WO2011066389，并具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与描述的序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。MSB0010718C的重链和轻链氨基酸序列包含至少以下序列：
重链(如WO 2013/079174中公开的SEQ ID NO:24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:611)
轻链(如WO 2013/079174中公开的SEQ ID NO:25)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:612)
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是WO 2010/077634中的抗PD-L1抗体(重链和轻链可变区序列分别显示于SEQ ID NO:21和22中)，并具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与描述的序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105也称为BMS-936559，是WO2007/005874中的抗PD-L1抗体，并具有其中公开的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如，与描述的序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MPDL3280A(Genentech/Roche)(也称为atezoizumab)。MPDL3280A是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MPDL3280A和PD-L1的其他人单克隆抗体公开于美国专利No.:7,943,743和美国公开No.:20120039906中。
示例性PD-L1抗体分子
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包含具有一个或多个以下特性的抗体分子(例如，分离或重组的抗体分子)：
(i)以高亲和性，例如，以至少约107M-1，通常约108M-1，并且更常见地约109M-1至1010M-1或更强的亲和力常数，结合PD-L1，例如，人PD-L1；
(ii)基本上不结合CD28、CTLA-4、ICOS或BTLA；
(iii)抑制或降低PD-L1与受体(例如，PD-1或CD80(B7-1)，或两者)的结合；
(iv)特异性地结合PD-L1上的表位，例如，与鼠单克隆抗体BAP058或嵌合抗体BAP058(例如，BAP058-chi)识别的表位相同或相似的表位；
(v)显示出与BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任何一个相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；
(vi)显示出与表1中所示的抗体分子(例如，重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；
(vii)显示出与具有表1中所示的氨基酸序列的抗体分子(例如，重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；
(viii)显示出与表1中所示的核苷酸序列编码的抗体分子(例如，重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；
(ix)抑制，例如，竞争性地抑制，第二抗体分子与PD-L1的结合，其中第二抗体分子是本文中描述的抗体分子，例如，选自例如BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的抗体分子；
(x)与PD-L1的第二抗体分子结合相同或重叠的表位，其中第二抗体分子是本文中描述的抗体分子，例如，选自例如BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的抗体分子；
(xi)与第二抗体分子竞争与PD-L1结合和/或结合相同的表位，其中第二抗体分子是本文中描述的抗体分子，例如，选自例如BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的抗体分子；
(xii)具有本文中描述的抗体分子的一个或多个生物学特性，所述抗体分子为例如，选自例如BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的抗体分子；
(xiii)具有本文中描述的抗体分子的一个或多个药代动力学特性，所述抗体分子为例如，选自例如BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的抗体分子；
(xiv)抑制PD-L1的一个或多个活性，例如，导致以下的一或多项：肿瘤浸润淋巴细胞的增加、T细胞受体介导的增殖的提高、或癌细胞的免疫逃逸的降低；或
(xv)结合人PD-L1并且与猕猴PD-L1是交叉反应的。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选包含恒定区)、或两者，所述结构域包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中的任一个的氨基酸序列(如表6中提供)，或由表6中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任一个基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在再另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自如下重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，所述重链可变区和/或轻链可变区为：本文所述抗体，例如，选自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O之任一抗体的重链可变区和/或轻链可变区；或如表6中描述的、或由表6中的核苷酸序列编码的抗体重链可变区和/或轻链可变区；或与上述序列中的任一个基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在再另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：来自包含表6中所示的氨基酸序列或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总地全部CDR)。在一个实施方案中，一个或多个CDR(或总地全部CDR)，相对于表6中所示的氨基酸序列、或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸置换或缺失。
在再另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自包含表6中所示的氨基酸序列或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总地全部CDR)。在一个实施方案中，一个或多个CDR(或总地全部CDR)，相对于表6中所示的氨基酸序列或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸置换或缺失。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含轻链CDR中的置换，例如，轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个置换。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自包含表6中所示的氨基酸序列或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总地全部CDR)。在一个实施方案中，一个或多个CDR(或总地全部CDR)，相对于表6中所示的氨基酸序列或由表6中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸置换或缺失。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:290或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:288的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:289的VHCDR3氨基酸序列，各序列公开于表6中；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:295的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:296的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:297的VLCDR3氨基酸序列，各序列公开于表6中。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，包含选自SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:290或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:291的VHCDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO:292的VHCDR3氨基酸序列，各序列公开于表6中；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:298的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:299的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:300的VLCDR3氨基酸序列，各序列公开于表6中。
在上述抗体分子的实施方案中，VHCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在其他实施方案中，VHCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。再在其他实施方案中，VHCDR1包含SEQID NO:195的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述抗体分子具有包含至少一个如下框架(FW)区的重链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152或154中任一个的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152或154中任一个的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸置换、插入或缺失的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子具有包含至少一个如下框架区的重链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152或154中任一个的氨基酸序列。
再在其他实施方案中，上述抗体分子具有包含至少两个、三个或四个如下框架区的重链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152或154中任一个的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子包含SEQ ID NO:124、126、128或130的VHFW1氨基酸序列，SEQ ID NO:132、134、136、138、140或142的VHFW2氨基酸序列，和SEQ ID NO:144、146、148、150或152的VHFW3氨基酸序列，和任选，进一步包含SEQ ID NO:154的VHFW4氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子具有包含至少一个如下框架区的轻链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184或186中任一个的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184或186中任一个的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸置换、插入或缺失的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子具有包含至少一个如下框架区的轻链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184或186中任一个的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子具有包含至少两个、三个或四个如下框架区的轻链可变区，所述框架区包含SEQ ID NO:156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184或186中任一个的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子包含SEQ ID NO:156、158、160、162、164或166的VLFW1氨基酸序列，SEQ ID NO:168或170的VLFW2氨基酸序列，和SEQ ID NO:172、174、176、178、180、182或184的VLFW3氨基酸序列，和任选，进一步包含SEQ ID NO:186的VLFW4氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:18、30、38、46、50、54、62、70或78的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18、30、38、46、50、54、62、70或78的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:22、26、34、42、58、66、74、82或86的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:22、26、34、42、58、66、74、82或86的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
在其他实施方案中，上述抗体分子选自Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
在其他实施方案中，上述抗体分子包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。
在其他实施方案中，上述抗体分子能够以低于约0.2nM的解离常数(KD)结合人PD-L1。
在一些实施方案中，上述抗体分子以低于约0.2nM、0.15nM、0.1nM、0.05nM或0.02nM，例如，约0.2nM至0.1nM，例如，约0.166nM至0.176nM，例如，约0.171nM的KD结合人PD-L1，例如，通过Biacore方法测量的。
在其他实施方案中，上述抗体分子能够降低PD-1或B7-1与PD-L1或表达PD-L1的细胞的结合。在一些实施方案中，上述抗体分子降低(例如，阻断)PD-L1结合表达PD-L1的细胞，具有低于约1.5nM、1nM、0.8nM、0.6nM、0.4nM、0.2nM或0.1nM，例如约0.2nM至约0.1nM，例如约0.15nM或更低，例如约0.145nM的IC50。在一些实施方案中，上述抗体降低(例如，阻断)B7-1结合表达PD-L1的细胞(例如，人PD-L1表达细胞300.19)，具有低于约2nM、1.5nM、1nM、0.5nM或0.2nM，例如，约0.5nM至约0.01nM，或约0.2nM或更低，例如，约0.1nM的IC50。
在其他实施方案中，上述抗体分子能够增强抗原特异性T细胞应答。
在一些实施方案中，上述抗体分子以慢于5×10-4、1×10-4、5×10-5或1×10-5s-1，例如，约6.33×10-5s-1的Kd结合PD-L1，例如，如通过Biacore方法测量的。在一些实施方案中，上述抗体分子以快于1×104、5×104、1×105或5×105M-1s-1，例如，约3.07×104M-1s-1的Ka结合PD-L1，例如，如通过Biacore方法测量的。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子是单特异性抗体分子或双特异性抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体分子具有对PD-L1的第一结合特异性以及对TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、PD-1或PD-L2的第二结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子包含抗体的抗原结合片段，例如，半抗体或半抗体的抗原结合片段。
表6.鼠、嵌合和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAbBAP058、嵌合mAb BAP058-chi和人源化mAb BAP058-hum01至BAP058-hum17以及BAP058-Clone-K至BAP058-Clone-O。显示了重链和轻链CDR、重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
用于表达间皮素的疾病和病症的治疗应用
本发明提供了用于治疗与间皮素的表达相关的疾病和病症的组合物和方法。与间皮素相关的疾病或病症的实例是间皮瘤。
恶性间皮瘤是一种癌症，发生在衬在身体内部器官表面的细胞薄层(称为间皮)中。存在三种公认类型的间皮瘤。胸膜间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤，或MPM)是最常见形式的疾病，占据大约70％的病例，并且发生在称为胸膜的肺内衬中。腹膜间皮瘤发生在称为腹膜(peritoneum)的腹腔内衬中。心包间皮瘤源于衬在心脏表面的心包膜中。
如果受试者暴露于石棉，则受试者可能处于产生间皮瘤的风险中。暴露于石棉和吸入石棉颗粒可能引起间皮瘤。在大部分病例中，在暴露于石棉的受试者中，直到暴露后许多年，才会出现间皮瘤症状。
胸膜间皮瘤的症状包括，例如，腰疼或侧胸疼，以及呼吸短促。其他症状包括吞咽困难、持续咳嗽、发烧、体重减轻或疲劳。一些患者经历的其他症状有肌肉无力、失去感官能力、咳血、面部和手臂肿胀和声嘶。在疾病的早期阶段，如1期间皮瘤，症状可能是轻度的。患者通常报告胸部的一个区域中似乎从未停止的疼痛，体重减轻和发烧。
腹膜间皮瘤源于腹部，并且因此，症状常常包括腹痛、体重减轻、恶心和呕吐。腹部可能出现液体聚积以及产生癌症。腹膜间皮瘤源于腹膜并且常常将扩散至区域中的其他器官，包括肝、脾或肠。严重的腹痛是最常见的患者首先经历的症状。腹部中还可能存在不适水平的液体累积。腹膜间皮瘤的其他症状可包括肠蠕动困难、恶心和呕吐、发烧和脚肿。
心包间皮瘤是最少看到的间皮瘤形式。心包间皮瘤，如名字所示，涉及心脏。这种罕见类型的间皮瘤癌入侵心包膜(围绕心脏的囊膜)。随着癌症进展，心脏不能有效地将氧递送给身体，以逐渐加快的速率进一步引起心脏的衰竭。最常见的与心包间皮瘤相关的症状类似于心脏病发作的症状：恶心、胸痛和呼吸短促。
得益于根据本发明的治疗的受试者包括患有间皮瘤的受试者，或怀疑患有间皮瘤的受试者，例如，存在本文中描述的一个或多个症状和/或暴露于石棉。在特定实施方案中，间皮瘤是胸膜间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)。在其他方面中，可以治疗具有癌前病状的受试者，例如，胸膜蚀斑、良性间皮瘤或间皮增生。
与间皮相关的疾病或病症的另一个实例是胰腺癌。可以用本文中的方法治疗的胰腺癌包括但不限于，外分泌胰腺癌和内分泌胰腺癌。外分泌胰腺癌包括但不限于，腺癌(adenocarcinomas)、腺泡细胞癌(acinar cell carcinomas)、腺鳞癌(adenosquamouscarcinoma)、胶样癌(colloid carcinoma)、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝样癌(hepatoid carcinoma)、导管内乳头状粘液性肿瘤(intraductal papillary‐mucinousneoplasm)、粘液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm)、胰母细胞瘤(pancreatoblastomas)、浆液性囊腺瘤(serous cystadenoma)、印戒细胞癌(signet ringcell carcinoma)、实性假乳头状瘤(solid and pseuodpapillary tumor)、胰腺导管癌(pancreatic ductal carcinoma)和未分化癌。在一些实施方案中，外分泌胰腺癌是胰腺导管癌。内分泌胰腺癌包括但不限于，胰岛瘤(insulinoma)和胰高血糖素瘤(glucagonoma)。
在一些实施方案中，胰腺癌是早期胰腺癌、非转移性胰腺癌、原发性胰腺癌、切除的胰腺癌、晚期胰腺癌、局部晚期胰腺癌、转移性胰腺癌、不可切除的胰腺癌、好转期中的胰腺癌、复发的胰腺癌、辅助治疗情况(adjuvant setting)中的胰腺癌、或非辅助治疗情况中的胰腺癌中的任何一种。在一些实施方案中，胰腺癌是局部晚期胰腺癌、不可切除的胰腺癌、或转移性胰腺导管癌。在一些实施方案中，胰腺癌抵抗基于吉西他滨的治疗。在一些实施方案中，胰腺癌对基于吉西他滨的治疗是难治性的。
在其他方面中，与间皮素表达相关的病症是卵巢癌。根据肿瘤史，将卵巢癌分类。表面上皮-基质肿瘤，也称为卵巢上皮癌，是最常见类型的卵巢癌。其包括浆液性肿瘤(包含浆液性乳头状囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌。
本文中的方法可以用于各个阶段的卵巢癌，例如，I期、II期、III期或IV期。例如，去除卵巢癌时，可以进行分期。卵巢癌分期如下：
I期癌限制在一侧或两侧卵巢。如果涉及一侧或两侧卵巢并且已经扩散至子宫和/或输卵管或骨盆中的其他部位，则癌症是II期。如果涉及一侧或两侧卵巢，并且已经扩散至淋巴结或骨盆外的其他部位但仍然在腹腔内，如肠或肝的表面，则癌症是III期癌症。如果涉及一侧或两侧卵巢，并且癌症已经扩散至腹部外或肝内部，则癌症是IV期癌症。
在一些实施方案中，卵巢癌抵抗一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，卵巢癌对于一种或多种化疗剂是难治性的。
可以用本文中的联合疗法治疗的其他癌症包括，例如，脑癌、膀胱癌、乳癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、肺癌(例如，肺腺癌)、黑素瘤、转移性黑素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌，及其组合。
在一个方面中，本发明公开涉及，治疗受试者癌症的方法。方法包括给予受试者施用联合治疗，所述联合治疗包括施用间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，由此治疗受试者的癌症。通过本文中的联合疗法可治疗的癌症实例是与间皮素的表达相关的癌症。在一个方面中，与间皮素的表达相关的癌症选自间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺癌，或由上述任一种癌症产生的转移。
在一个实施方案中，本文中的间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂的联合治疗，例如与单独间皮素CAR表达细胞或PD-L1抑制剂的单一治疗相比，导致以下的一种或多种：提高或增加的间皮素CAR表达细胞的抗肿瘤活性；提高的间皮素CAR表达细胞的增殖或持久性；提高或增加的间皮素CAR表达细胞的浸润；改善的肿瘤进展抑制；肿瘤进展的延迟；癌细胞增殖的抑制或降低；和/或肿瘤负荷例如肿瘤体积或大小的降低。
本发明提供了用于抑制间皮素表达细胞群的增殖或减少间皮素表达细胞群的方法。在一个实施方案中，方法包括给予联合治疗，例如，包含间皮素CAR表达细胞或间皮素CAR表达细胞群和PD-L1抑制剂的组合。在某些实施方案中，相对于用单独的间皮素CAR表达细胞或PD-L1抑制剂治疗的受试者中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、含量或百分比，本文中的联合治疗，在患有间皮素瘤或另一种间皮素表达细胞相关癌症的受试者或动物模型中，使细胞和/或癌细胞的数量、数目、含量或百分比降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制与间皮素表达细胞相关的病症(例如，间皮瘤)的方法，方法包括将间皮素CAR表达细胞或间皮素CAR表达细胞群和PD-L1抑制剂施用于需要的受试者。在一个方面中，受试者是人。
联合治疗
本文中的任一种方法可以组合其他已知的药剂和疗法来使用。
可以同时、在同一组合物或分开的组合物中，或按序施用本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，以及至少一种其他的治疗剂。对于按序施用，本文中的CAR表达细胞和/或PD-L1抑制剂可以在其他治疗剂之后施用，或施用顺序可以颠倒，其中可以在本文中的CAR表达细胞和/或PD-L1抑制剂之后施用该其他的治疗剂。或者，可以在CAR表达细胞和PD-L1抑制剂施用之间施用该其他的治疗剂。
在其它方面中，本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，可以用于结合外科手术、化疗、放疗、免疫抑制剂(如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(immunoablative，如CAMPATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、cytoxin、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射、肽疫苗，如Izumoto等，2008J Neurosurg 108:963-971中描述的。
在一个实施方案中，本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，可以用于结合化疗剂。示例性化疗剂包括蒽环类(例如，阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(例如，长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))、烷化剂(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab))、抗代谢物(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A(aclacinomycin)、胶霉毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、免疫调节剂，如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如，来那度胺)。
考虑用于联合治疗中的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡波铂卡氮芥苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-)、阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪(DTIC-)、更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸道诺霉素柠檬酸道诺霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他米特tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌mylotarg、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、含有卡莫司汀的聚丙苯生20植入剂柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替哌、替拉扎明用于注射的盐酸拓扑替康长春花碱长春新碱和长春瑞滨
示例性烷化剂包括，不限于，氮芥类、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐类、亚硝基脲类、三氮烯类(triazene)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen )、氮芥环磷酰胺( RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三乙烯三聚氰胺三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺塞替哌白消安卡莫司汀洛莫司汀链脲霉素和达卡巴嗪(DTIC-)。其他示例性烷化剂包括，不限于，奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素D，)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，)；卡氮芥Bendamustine白消安(和)；卡泊铂洛莫司汀(也称为CCNU，)；顺铂(也称为CDDP，和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC-)；Altretamine(也称为六甲蜜胺(HMM)、)；异环磷酰胺Prednumustine；甲基苄肼二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、mustine和盐酸甲氯乙胺、)；链脲霉素塞替哌(也称为thiophosphoamide、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺( )；和盐酸苯达莫司汀
示例性mTOR抑制剂包括，例如，替西罗莫司、ridaforolimus(之前称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-戊氧-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且公开于PCT公开No.WO 03/064383中)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989、)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯丙吡喃-2-基)吗啉蓊-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸-(SEQ ID NO:613)，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。
示例性免疫调节剂包括，例如，afutuzumab(可获自)；培非司亭来那度胺(CC-5013，)；沙利度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(包含白细胞间介素1、白细胞间介素2和干扰素γ的人细胞因子混合物，CAS 951209-71-5,可获自IRX Therapeutics)。
示例性蒽环类包括，例如，阿霉素(和)；博来霉素道诺霉素(盐酸道诺霉素、柔毛霉素和盐酸红比霉素，)；道诺霉素脂质体(柠檬酸道诺霉素脂质体，)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；和脱乙酰拉维霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春花生物碱包括，例如，酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春花碱(也称为硫酸长春花碱、长春质碱(vincaleukoblastine)和VLB、Alkaban-和)；和长春瑞滨
示例性蛋白酶体抑制剂包括bortezomibcarfilzomib(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙基-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸ixazomib(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，结合brentuximab施用于受试者。Brentuximab是抗CD30抗体和单甲基auristatin E的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如，复发或难治性HL。在一些实施方案中，受试者包含CD30+HL。在一些实施方案中，受试者已经经历了自体干细胞移植(ASCT)。在一些实施方案中，受试者没有经历ASCT。在一些实施方案中，以约1-3mg/lg的剂量(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内，例如，每3周一次，施用brentuximab。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，结合brentuximab和达卡巴嗪，或结合brentuximab和苯达莫司汀施用于受试者。达卡巴嗪是具有化学名称5-(3,3-二甲基-1-三氮烯)咪唑-4-甲酰胺的烷化剂。苯达莫司汀是具有化学名称4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷化剂。在一些实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)。在一些实施方案中，受试者之前没有用癌症疗法治疗过。在一些实施方案中，受试者为至少60岁，例如，60、65、70、75、80、85或更大年龄。在一些实施方案中，以约300-450mg/m2的剂量(例如，约300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)，例如，静脉内，施用达卡巴嗪。在一些实施方案中，以约75-125mg/m2的剂量(例如，75-100或100-125mg/m2，例如，约90mg/m2)，例如，静脉内，施用苯达莫司汀。在一些实施方案中，以约1-3mg/lg的剂量(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内，例如，每3周，施用brentuximab。
在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞结合CD20抑制剂(例如，抗CD20抗体(例如，抗CD20单特异性或双特异性抗体)或其片段)施用于受试者。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥伐木单抗、ocrelizumab、veltuzumab、obinutuzumab、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、ocaratuzumab和Pro131921(Genentech)。参见，例如，Lim等，Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是结合CD20并引起CD20表达细胞溶解的嵌合鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中的描述。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞结合利妥昔单抗施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，静脉内施用利妥昔单抗，例如，作为静脉内输注。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施方案中，以150mg/m2至750mg/m2的剂量施用利妥昔单抗，例如，约150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2，其中m2表示受试者的身体表面积。在一些实施方案中，以至少4天例如，4、7、14、21、28、35天或更长时间的施用间隔来施用利妥昔单抗。例如，以至少0.5周的施用间隔来施用利妥昔单抗，例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周，或更长时间的施用间隔。在一些实施方案中，以本文中描述的剂量和施用间隔施用利妥昔单抗一段时间，例如，至少2周，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周，或更长时间。例如，以本文中的剂量和施用间隔施用利妥昔单抗，每个治疗周期总共至少4剂(例如，每个治疗周期至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多剂)。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含奥伐木单抗。奥伐木单抗是具有大约149kDa分子量的抗CD20IgG1κ人单克隆抗体。例如，奥伐木单抗使用转基因小鼠和杂交瘤技术来产生，并且从重组小鼠细胞系(NS0)表达和纯化。参见，例如，www.accessdata.fda.gov/ drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验识别号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352和NCT01397591。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞结合奥伐木单抗施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，将奥伐木单抗作为静脉内输注施用。例如，每个输注提供了约150-3000mg(例如，约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)奥伐木单抗。在一些实施方案中，以约300mg的起始剂量，接着2000mg施用奥伐木单抗，例如，持续约11剂，例如，持续24周。在一些实施方案中，以至少4天，例如，4、7、14、21、28、35天或更长时间的施用间隔来施用奥伐木单抗。例如，以至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长时间的施用间隔来施用奥伐木单抗。在一些实施方案中，以本文中的剂量和施用间隔来施用奥伐木单抗，持续一段时间，例如，至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、40、60周或更长时间，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间，或1、2、3、4、5年或更长时间。例如，以本文中的剂量和施用间隔来施用奥伐木单抗，每个治疗周期共至少2剂(例如，每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20或更多剂)。
在一些情况中，抗CD20抗体包含ocrelizumab。Ocrelizumab是人源化抗CD20单克隆抗体，例如，如临床试验识别号No.NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570，以及Kappos等，Lancet.19.378(2011)：1779-87中描述的。
在一些情况中，抗CD20抗体包含veltuzumab。Veltuzumab是人源化单克隆抗CD20抗体。参见，例如，临床试验识别号No.NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581和Goldenberg等，Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。
在一些情况中，抗CD20抗体包含GA101。GA101(也称为obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号:NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422和NCT01414205；以及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况中，抗CD20抗体包含AME-133v。AME-133v(也称为LY2469298或ocaratuzumab)是人源化抗CD20的IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，对FcγRIIIa受体具有提高的亲和性，并且具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。参见，例如，Robak等，BioDrugs25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等，Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403。
在一些情况中，抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是经工程化的人源化抗CD20单克隆抗体，与利妥昔单抗相比具有更好的FcγRIIIa结合和增强的ADCC。参见，例如，Robak等，BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Casulo等，Clin Immunol.154.1(2014):37-46；以及临床试验识别号No.NCT00452127。
在一些情况中，抗CD20抗体包含TRU-015。TRU-015是源自抗CD20抗体的结构域的抗CD20融合蛋白。TUR-015比单克隆抗体小，但保留了Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robak等，BioDrugs 25.1(2011)：13-25。TRU-015含有连接人IgG1铰链、CH2和CH3结构域的抗CD20单链可变片段(scFv)，但缺少CH1和CL结构域。
在一些实施方案中，将本文中的抗CD20抗体与治疗剂缀合或以另外方式结合，所述治疗剂例如为本文中的化疗剂(例如，cytoxan、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或抗呕吐剂)、疼痛缓解剂或低温保护剂。
在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合B-细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如，venetoclax，也称为ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗来施用。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合venetoclax和利妥昔单抗施用于受试者。Venetoclax是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子。Venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧)苯甲酰胺)的结构如下显示。
在一些实施方案中，受试者患有CLL。在一些实施方案中，受试者患有复发的CLL，例如，之前已经给予受试者癌症治疗。在一些实施方案中，以约15-600mg的剂量(例如，15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-600mg)来施用venetoclax，例如，每日施用。在一些实施方案中，以约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量来施用利妥昔单抗，例如，静脉内施用，例如，每月施用。
在一些实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，联合溶肿瘤病毒来施用。在一些实施方案中，溶肿瘤病毒能够选择性地在癌细胞中复制并且引发癌细胞的死亡或减缓癌细胞的生长。在一些情况中，溶肿瘤病毒对非癌细胞不具有影响或具有极小影响。溶肿瘤病毒包括但不限于溶肿瘤腺病毒、溶肿瘤单纯疱疹病毒、溶肿瘤逆转录病毒、溶肿瘤细小病毒、溶肿瘤痘苗病毒、溶肿瘤Sinbis病毒、溶肿瘤流感病毒或溶肿瘤RNA病毒(例如，溶肿瘤呼吸弧病毒、溶肿瘤Newcastle病病毒(NDV)、溶肿瘤麻疹病毒、或溶肿瘤水疱性口炎病毒(VSV))。
在一些实施方案中，溶肿瘤病毒是US2010/0178684 A1(将其全部按引用并入本文中)中描述的病毒，例如，重组溶肿瘤病毒。在一些实施方案中，重组溶肿瘤病毒包含编码免疫或炎性应答的抑制剂的核酸序列(例如，异源核酸序列)，例如，如US2010/0178684A1中描述的，将其全部按引用并入本文中。在一些实施方案中，重组溶肿瘤病毒，例如，溶肿瘤NDV，包含促凋亡蛋白(例如，凋亡素(apoptin))、细胞因子(例如，GM-CSF、干扰素-γ、白细胞间介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如，抗ED-B纤连蛋白的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性适体蛋白(例如，针对NDV HN蛋白和T细胞共刺激受体的双特异性抗体或抗体片段，如CD3或CD28；或针对NDV HN蛋白的单链抗体和人IL-2之间的融合蛋白)，参见，例如，Zamarin等，Future Microbiol.7.3(2012):347-67，将其全部按引用并入本文中。在一些实施方案中，溶肿瘤病毒是US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1或US 2014/0271677 A1中的嵌合溶肿瘤NDV，将每篇全部按引用并入本文中。
在一些实施方案中，溶肿瘤病毒包含条件性复制的腺病毒(CRAd)，其设计成只在癌细胞中复制。参见，例如，Alemany等，Nature Biotechnol.18(2000):723-27。在一些实施方案中，溶肿瘤腺病毒包含Alemany等的第725页表1中描述的一种，将其全部按引用并入本文中。
示例性溶肿瘤病毒包括但不限于以下：B组溶肿瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxusTherapeutics Ltd.)(参见，例如，临床试验识别号：NCT02053220)；ONCOS-102(之前称为CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒(OncosTherapeutics)(参见，例如，临床试验识别号：NCT01598129)；VCN-01，其是编码人PH20透明质酸酶的遗传修饰的溶肿瘤人腺病毒(VCN Biosciences，S.L.)(参见，例如，临床试验识别号：NCT02045602和NCT02045589)；条件性复制的腺病毒ICOVIR-5，其是源自野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，已经修饰来选择性地在具有去控制的成视网膜细胞瘤/E2F途径的癌细胞中复制(Institut Catalàd'Oncologia)(参见，例如，临床试验识别号：NCT01864759)；Celyvir，其包含感染了ICOVIR5(溶肿瘤腺病毒)的骨髓来源的自体间充质干细胞(MSC)(Hospital Infantil Universitario Jesús，Madrid，Spain/RamonAlemany)(参见，例如，临床试验识别号：NCT01844661)；GC0070，其是条件性复制的溶肿瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需E1a病毒基因的表达，由此将病毒复制和细胞毒性限于Rb途径缺陷型肿瘤细胞(Cold Genesys，Inc.)(参见，例如，临床试验识别号：NCT02143804)；或DNX-2401(之前称为δ-24-RGD)，其是已经工程化在成视网膜细胞瘤(Rb)-途径缺陷型细胞中复制并且更有效地感染表达某些RGD-结合整联蛋白的腺病毒(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.)(参见，例如，临床试验识别号：NCT01956734)。
在一些实施方案中，通过注射，例如，皮下、动脉内、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射，来施用本文中描述的溶肿瘤病毒。在一些实施方案中，通过肿瘤内、经皮、经粘膜、经口、鼻内或经由肺部施用来施用本文中描述的溶肿瘤病毒。在一个实施方案中，将本文中的表达CAR的细胞，组合降低Treg细胞群的分子，施用于受试者。降低(例如，耗尽)Treg细胞数量的方法是本领域已知的并且包括，例如，CD25耗尽、环磷酰胺施用、调节GITR功能。不希望受到理论的束缚，认为在分离性输血之前或在施用本文中的CAR表达细胞之前，降低受试者中的Treg细胞数量可以降低肿瘤微环境中不合需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量并降低受试者的复发风险。
在一个实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合靶向GITR和/或调节GITR功能的分子(如耗尽调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体)施用于受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前，施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或Treg耗尽性GIR抗体)。例如，在一个实施方案中，可以在细胞分离性输血前，施用GITR激动剂。在一个实施方案中，受试者患有CLL。示例性GITR激动剂包括，例如，GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如，美国专利No.:6,111,090、欧洲专利No.:090505B1、美国专利No.:8,568,023、PCT公开No.:WO2010/003118和2011/090754中的GITR融合蛋白，或例如美国专利No.:7,025,962、欧洲专利No.:1947183B1、美国专利No.7,812,135、美国专利No.:8,388,967、美国专利No.:8,591,886、欧洲专利No.:ep 1866339、PCT公开No.:WO 2011/028683、PCT公开No.:WO 2013/039954、PCT公开No.:WO2005/007190、PCT公开No.:WO 2007/133822、PCT公开No.:WO2005/055808、PCT公开No.:WO 99/40196、PCT公开No.:WO 2001/03720、PCT公开No.:WO99/20758、PCT公开No.:WO2006/083289、PCT公开No.:WO 2005/115451、美国专利No.:7,618,632和PCT公开No.:WO 2011/051726中描述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合mTOR抑制剂(例如，本文中的mTOR抑制剂，例如，rapalog，如依维莫司)施用于受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前，施用mTOR抑制剂。例如，在一个实施方案中，在细胞分离性输血前，施用mTOR抑制剂。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合GITR激动剂(例如，本文中的GITR激动剂)施用于受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前，施用GITR激动剂。例如，在一个实施方案中，在细胞分离性输血前，施用GITR激动剂。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，本文中描述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)施用于受试者。在一个实施方案中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如，本文中描述的SHP-1抑制剂，例如，葡萄糖酸锑钠。在一个实施方案中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在一个实施方案中，本文中的CAR表达细胞可以组合激酶抑制剂来使用。在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，本文中描述的CDK4抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，盐酸盐(也称为palbociclib或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文中的BTK抑制剂，如，例如，ibrutinib。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文中的mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文中的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是NMK抑制剂，例如，本文中描述的MNK抑制剂，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是本文中描述的双重PI3K/mTOR抑制剂，例如，PF-04695102。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔-丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲烷(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，palbociclib(PD0332991)，并且以每日约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量施用palbociclib，持续一段时间，例如，每日施用，28天周期中施用14-21天；或每日施用，21天周期中施用7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的palbociclib。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)4或6抑制剂(例如，本文中描述的CDK4抑制剂或CDK6抑制剂)施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合CDK4/6抑制剂(例如，靶向CDK4和CDK6两者的抑制剂)(例如，本文中描述的CDK4/6抑制剂)施用于受试者。在一个实施方案中，受试者患有MCL。MCL是一种对目前可得疗法响应差的侵袭性癌症，即，基本上不能治愈的。在MCL的许多病例中，在MCL细胞中表达(例如，由于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白D1基因的染色体易位)细胞周期蛋白D1(CDK4/6的调节剂)。因此，不受理论束缚，认为MCL细胞对CDK4/6抑制是高度敏感的，具有高特异性(即，对正常免疫细胞具有微小影响)。单独的CDK4/6抑制剂在治疗MCL中具有一定功效，但只获得了部分好转，具有高复发率。示例性CDK4/6抑制剂是LEE011(也称为ribociclib)，其结构显示于以下。
不受理论束缚，认为本文中的CAR表达细胞与CDK4/6抑制剂(例如，本文中描述的LEE011或其他CDK4/6抑制剂)的施用可以获得更高的响应性，例如，具有更高的好转率和/或较低的复发率，例如，与单独的CDK4/6抑制剂相比。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774和LFM-A13的BTK抑制剂。在一个优选实施方案中，BTK抑制剂没有降低或抑制白细胞间介素-2-诱导性激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，ibrutinib(PCI-32765)。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合BTK抑制剂(例如，ibrutinib)施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合ibrutinib(也称为PCI-32765)施用于受试者。以下显示了irbutinib(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构。
在本文中描述的方法、用途和组合物的一些实施方案中，BTK抑制剂是国际申请WO/2015/079417中的BTK抑制剂，将其全部按引用并入本文中。例如，在一些实施方案中，BTK抑制剂是式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐；
其中，
R1是氢、任选被羟基取代的C1-C6烷基；
R2是氢或卤素；
R3是氢或卤素；
R4是氢；
R5是氢或卤素；
或R4和R5彼此连接并且表示键、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或-CH2-CH2-CH2-；
R6和R7彼此独立地表示H、任选被羟基取代的C1-C6烷基、任选被羟基或卤素取代的C3-C6环烷基，或卤素；
R8、R9、R、R’、R10和R11彼此独立地表示H，或任选被C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；或R8、R9、R、R’、R10和R11中的任意两个与其结合的碳原子一起可以形成3-6元饱和碳环；
R12是氢或任选被卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；
或R12与R8、R9、R、R’、R10和R11中的任意一个与其结合的原子一起可以形成4、5、6或7元氮杂环，环可以任选被卤素、氰基、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；
n是0或1；和
R13是任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基氨基取代的C2-C6烯基；任选被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔基；或任选被C1-C6烷基取代的C2-C6烷撑(alkylenyl)氧化物。
在一些实施方案中，式I的BTK抑制剂选自：N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-3-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯基)吖丁啶-3-基)氧)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰基吖丁啶-3-基)氧)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吖丁啶-3-氧)氧)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-4-基)氧)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰胺)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧)乙基)-N-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(2-丙烯酰胺乙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-乙基丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰胺环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯酰胺丙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2-炔酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(3-(N-甲基丙烯酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-1-氧代-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰基吖丁啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-3-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯酰-3-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺。
除非另外提供，以上在描述式I的BTK抑制剂中使用的化学术语根据国际申请WO/2015/079417中列出的含义来使用，该文献全部按引用并入本文中。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：temsirolimus；ridaforolimus(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod；(5-{2,4-二[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉蓊-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰-L-丝氨酸-(SEQ ID NO:613)，内盐(SF1126)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且以每日约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量施用雷帕霉素，持续一段时间，例如，每日施用，持续21天周期，或每日施用，持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，以每日约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量来施用依维莫司，持续一段时间，例如，每日施用，持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，其选自2-氨基-8-[反-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯基磺酰胺(XL765)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且以每日约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量施用雷帕霉素，持续一段时间，例如，每日施用，持续21天周期，或每日施用，持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，以每日约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量来施用依维莫司，持续一段时间，例如，每日施用，持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶的MNK抑制剂。
在一些实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，本文中描述的PI3K抑制剂，例如，idelalisib或duvelisib)和/或利妥昔单抗施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中描述的CAR表达细胞组合idelalisib和利妥昔单抗施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合duvelisib和利妥昔单抗施用于受试者。Idelalisib(也称为GS-1101或CAL-101；Gilead)是阻断PI3K的δ同种型的小分子。以下显示了idelalisib(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)的结构。
Duvelisib(也称为IPI-145；Infinity Pharmaceuticals and Abbvie)是阻断PI3K-δ,γ的小分子。以下显示了duvelisib(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹唑啉酮)的结构。
在一些实施方案中，受试者患有CLL。在一些实施方案中，受试者患有复发的CLL，例如，受试者之前已经给予过癌症治疗(例如，之前已经施用过抗CD20抗体或之前已经施用过ibrutinib)。例如，受试者具有染色体17短臂中的缺失(del(17p)，例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在一些实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在一些实施方案中，受试者具有染色体11长臂中的缺失(del(11q))。在其他实施方案中，受试者不具有del(11q)。在一些实施方案中，以约100-400mg(例如，100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375或375-400mg)的剂量施用idelalisib，例如，BID。在一些实施方案中，以约15-100mg(例如，约15-25、25-50、50-75或75-100mg)的剂量来施用duvelisib，例如，一天两次。在一些实施方案中，以约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量施用利妥昔单抗。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，其选自2-氨基-8-[反-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯基磺酰胺(XL765)。
在一些实施方案中，可以将本文中的CAR表达细胞组合间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂。示例性ALK激酶抑制剂的实例包括但不限于克唑替尼(Pfizer)、色瑞替尼(Novartis)、alectinib(Chugai)、brigatinib(也称为AP26113；Ariad)、entrectinib(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(参见，例如，临床试验识别号No.NCT02048488)、CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施方案中，受试者患有实体癌症，例如，本文中的实体癌症，例如，肺癌。
克唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。Ceritinib的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。Alectinib的化学名称是9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-腈。Brigatinib的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。Entrectinib的化学名称是N-(5-(3,5-二氟苯甲基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(metheno)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并氧二氮杂环十四烯-3-腈。CEP-37440的化学结构是(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]annulen-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶calcineurin的药物(环孢霉素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的方面中，本发明公开的细胞组合物可以，结合(例如，在之前、同时或之后)骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、外部束放疗(XRT)、环磷酰胺和/或抗体(如OKT3或CMPATH)，施用于患者。在一个方面中，在B-细胞消融疗法后施用本发明公开的细胞组合物，如与CD20反应的药剂，例如，Rituxan。例如，在一个实施方案中，受试者可以经历使用高剂量化疗接着外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，移植后，受试者接受本发明公开的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在外科手术之前或之后施用扩增的细胞。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)抑制剂施用于受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解成犬尿氨酸的酶。许多癌症超表达IDO，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。pDC、巨噬细胞和树突细胞(DC)可以表达IDO。不受理论束缚，认为L-色氨酸(例如，通过IDO催化的)的降低通过诱导T-细胞无效和凋亡导致免疫抑制环境。因此，不受理论束缚，认为IDO抑制剂可以增强本文中的CAR表达细胞的效力，例如，通过降低CAR表达免疫细胞的抑制或死亡。在一些实施方案中，受试者患有实体肿瘤，例如，本文中描述的实体肿瘤，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。示例性IDO抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、indoximod(NewLink Genetics)(参见，例如，临床试验识别号No.NCT01191216；NCT01792050)，和INCB024360(Incyte Corp.)(参见，例如，临床识别号No.NCT01604889；NCT01685255)。
在一些实施方案中，将本文中描述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的调节剂施用于受试者。MDSC在许多实体肿瘤的外周和肿瘤部位累积。这些细胞抑制T细胞应答，由此阻碍CAR表达细胞治疗的功效。不受理论束缚，认为MDSC调节剂的施用增强本文中的CAR表达细胞的功效。在一个实施方案中，受试者患有实体肿瘤，例如，本文中描述的实体肿瘤，例如，成胶质细胞瘤。示例性MDSC的调节剂包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是抗巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见，例如，临床识别号No.NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见，例如，Pyonteck等，Nat.Med.19(2013):1264-72。以下显示了BLZ945的结构。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合抑制或降低免疫抑制性浆细胞的活性的药剂，施用于受试者。免疫抑制性浆细胞已经显示出阻止T细胞依赖性的致免疫化疗，如奥沙利铂(oxaliplatin)(Shalapour等，Nature2015,521:94-101)。在一个实施方案，免疫抑制性浆细胞可以表达IgA、白细胞间介素(IL)-10和PD-L1中的一种或多种。在一个实施方案中，药剂是CD19 CAR表达细胞或BCMA CAR表达细胞。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合白细胞间介素-15(IL-15)多肽、白细胞间介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合，例如hetIL-15(Admune Therapeutics，LLC)，施用于受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的杂二聚非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413和U.S.2011/0081311，按引用并入本文中。在一些实施方案中，皮下施用hetIL-15。在一些实施方案中，受试者患有癌症，例如，实体癌症，例如，黑素瘤或结肠癌。在一些实施方案中，受试者患有转移性癌症。
在一些实施方案中，将本文中的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，组合药剂例如细胞毒性或化疗剂、生物治疗(例如，抗体，例如，单克隆抗体或细胞治疗)或抑制剂(例如，激酶抑制剂)，施用于患有本文中所述疾病的受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合细胞毒性剂(例如，CPX-351(Celator Pharmaceuticals))、阿糖胞苷、道诺霉素、vosaroxin(Sunesis Pharmaceuticals)、sapacitabine(CyclacelPharmacetuticals)、伊达比星或米托蒽醌)施用于受试者。CPX-351是包含5:1摩尔比的阿糖胞苷和道诺霉素的脂质体制剂。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合低甲基化剂(例如，DNA甲基转移酶抑制剂，例如，阿扎胞苷(azacitidine)或地西他滨(decitabine))施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合生物治疗施用于受试者，生物治疗例如为抗体或细胞治疗，例如，225Ac-林妥珠单抗(lintuzumab)(Actimab-A；Actinium Pharmaceuticals)、IPH2102(Innate Pharma/Bristol MyersSquibb)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)，或吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)(Mylotarg；Pfizer)。SGN-CD33A是包含连接抗CD33抗体的吡咯并苯并二氮杂卓二聚体的抗体-药物缀合物(ADC)。Actimab-A是用锕标记的抗CD33抗体(林妥珠单抗)。IPH2102是靶向杀灭免疫球蛋白样受体(KIR)的单克隆抗体。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合FLT3抑制剂施用于受试者，FLT3抑制剂例如为索拉非尼)(Bayer)、米哚妥林(Novartis)、quizartinib(Daiichi Sankyo)、crenolanib(Arog Pharmaceuticals)、PLX3397(Daiichi Sankyo)、AKN-028(Akinion Pharmaceuticals)或ASP2215(Astellas)。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂(例如，AG-221(Celgene/Agios)或AG-120(Agios/Celgene))施用于受试者。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合细胞周期调节剂施用于受试者，细胞周期调节剂例如为polo-样激酶1(P1k1)的抑制剂，例如，volasertib(Boehringer Ingelheim)；或细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cdk9)的抑制剂，例如，alvocidib(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞组合B细胞受体信号网络抑制剂施用于受试者，所述抑制剂例如为B-细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的抑制剂，例如，venetoclax(Abbvie/Roche)；或Bruton’s酪氨酸激酶(Btk)的抑制剂，例如，ibrutinib(Pharmacyclisc/Johnson&JohnsonJanssen Pharmaceutical)。在一些实施方案中，将本文中的CAR表达细胞，组合M1氨基肽酶的抑制剂，例如，tosedostat(CTI BioPharma/Vernalis)；组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的抑制剂，例如，pracinostat(MEI Pharma)；多激酶抑制剂，例如，rigosertib(OnconovaTherapeutics/Baxter/SymBio)；或肽CXCR4反向激动剂，例如，BL-8040(BioLineRx)，施用于受试者。
一些患者可能在施用过程中或施用后经历对本发明公开的化合物和/或其他抗癌剂的过敏反应；因此，常常施用抗过敏剂来最小化变应反应的风险。合适的抗过敏剂包括皮质类固醇，如地塞米松(例如，)、倍氯米松(例如，)、氢化可的松(也称为可的松，氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷酸钠，并且以商品名Ala-销售，氢化可的松磷酸盐，Solu-Hydrocort和)、泼尼松(以商品名Delta-和销售)、强的松(以商品名Liquid和销售)、甲基泼尼松龙(也称为6-甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸盐、甲基泼尼松龙琥珀酸钠，以商品名M-和Solu-销售)；抗组胺剂，如苯海拉明(例如，)、羟嗪和二苯环庚啶；和支气管扩张剂，如β-肾上腺能受体激动剂、舒喘宁(例如，)和特布他林
一些患者在本发明的化合物和/或其他抗癌剂的施用过程中和施用后经历恶心；因此，将止吐药用于预防恶心(上胃)和呕吐。合适的止吐药包含阿瑞匹坦昂丹司琼盐酸格拉司琼劳拉西泮地塞米松普鲁氯嗪卡索匹坦(和)，及其组合。
常常开出缓解治疗过程中经历的疼痛的药物，使得患者更舒适。常常使用常见的非处方止痛药，如然而，阿片样止痛药，如氢可酮/扑热息痛或氢可酮/醋氨酚(例如，)、吗啡(例如，或)、氧可酮(例如，或)、盐酸氧吗啡酮和芬酞尼(例如，)对于中度或重度疼痛也是有用的。
在保护正常细胞免受治疗毒性和限制器官毒性的努力中，细胞保护剂(如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环溢出物中和剂、营养素等)可以用作辅助治疗。合适的细胞保护剂包含阿米福汀谷氨酰胺、双美司钠美司钠右雷佐生(或)、xaliproden和甲酰四氢叶酸(也称为甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子(citrovorum factor)和亚叶酸(folinicacid))。通过代码、通用名或商品名识别的活性化合物的结构可以获自标准一览表“TheMerck Index”的实际版本或获自数据库，例如，Patents International(例如，IMS WorldPublications)。
可以按照本领域的描述，如以上引用的文献中所述的，来制备和施用以上提及的可以组合本发明化合物施用的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含：单独或与其它抗癌剂组合的至少一种本发明化合物(例如，本发明公开的化合物)或其药物学上可接受盐、以及适用于施用于人或动物受试者的药物学上可接受载体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有细胞增生性疾病(如癌症)的人或动物受试者的方法。本发明提供了治疗需要这样的治疗的人或动物受试者的方法，包括将治疗有效量的本发明化合物(例如，本发明公开的化合物)或其药物学上可接受的盐施用于受试者，其中可以施用单独本发明化合物或其与其他抗癌剂的组合。
特别地，组合物可以作为联合治疗配制在一起或分开施用。
在联合治疗中，本发明的化合物和其他抗癌剂可以同时、并行或按序地施用，没有特定的时间限制，其中这样的施用在患者体内提供治疗有效水平的所述两种化合物。
在优选实施方案中，本发明化合物和其他抗癌剂通常可以以任何顺序按序地通过输注或口服来施用。施用方案可以根据疾病的阶段、患者的身体适合性、各单独药物的安全性特征和各单独药物的耐受性、以及施用组合的主治医生和医学从业者公知的其他标准而改变。本发明化合物和其他抗癌剂可以彼此在几分钟、几小时、几天或甚至几周内分开施用，这取决于待用于治疗的特定周期。此外，所述周期可以包括在治疗周期中一种药物的施用比另一种频繁以及每次药物施用以不同的剂量。
在本发明公开的另一个方面中，提供了药盒，其包括如本文中公开的一种或多种本发明化合物和组合伴侣。代表性的药盒包括(a)本发明化合物或其药物学上可接受的盐，(b)至少一种组合伴侣，例如，如上所述，由此这样的药盒可以包括包装说明书或其他标签，包括施用指导。
本发明化合物还可以用于有利地组合已知的治疗过程，例如，激素的施用或尤其是放疗。本发明化合物可以特别地用作放射致敏剂，尤其是用于对放疗呈现出差的敏感性的肿瘤的治疗。在一个实施方案中，受试者可以施用降低或缓解与CAR表达细胞的施用相关的副作用的药剂。与CAR表达细胞的施用相关的副作用包括，但不限于，CRS和嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)，也称为巨噬细胞激活综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、瞬时低血压、缺氧等。CRS可以包括临床体质体征和症状，如发烧、疲劳、食欲不振、肌痛、关节痛、恶心、呕吐和头疼。CRS可以包括临床皮肤体征和症状，如皮疹。CRS可以包括临床胃肠体征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。CRS可以包括临床呼吸体征和症状，如呼吸急促和血氧不足。CRS可以包括临床心血管体征和症状，如心动过速、加宽的脉压、低血压、提高的心输出量(早期)和潜在降低的心输出量(晚期)。CRS可以包括临床凝血体征和症状，如升高的d-二聚体、伴有或没有出血的低纤维蛋白原血。CRS可以包括临床肾体征和症状，如氮血症。CRS可以包括临床肝体征和症状，如transaminitis和高胆红素血症。CRS可以包括临床神经体征和症状，如头疼、精神状态变化、精神错乱、谵妄、唤词困难或弗兰克失语症(frankaphasia)、幻觉、震颤、dymetria、改变的步态、和痉挛。
因此，本文中所述的方法可以包括将本文中所述的CAR表达细胞施用于受试者并且进一步施用一种或多种药剂来控制由使用CAR表达细胞治疗引起的升高的可溶性因子水平。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一个实施方案中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，施用于治疗这种副作用的药剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的药剂。在一个实施方案中，中和这些可溶性形式中的一种或多种的药剂是抗体或其抗原结合片段。这样的药剂的实例包括，但不限于，类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFα的抑制剂和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的实例是抗-TNFα抗体分子，如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和golimumab，TNFα抑制剂的另一个实例是融合蛋白，如依那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括，但不限于，黄嘌呤衍生物(例如，己酮可可碱(pentoxifylline))和安非他酮(bupropion)。IL-6抑制剂的实例是抗IL-6抗体分子，如塔西单抗(tocilizumab)(toc)、sarilumab、elsilimomab、CNTO328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一个实施方案中，抗IL-6抗体分子是tocilizumab。基于IL-1R的抑制剂的实例是anakinka。
在一些实施方案中，受试者施用皮质类固醇，例如，甲基泼尼松龙、氢化可的松等。
在一些实施方案中，受试者施用血管加压药，例如，去甲肾上腺素、多巴胺、苯肾上腺素、肾上腺素、后叶加压素或其组合。
在一个实施方案中，受试者可以施用退热剂。在一个实施方案中，受试者可以施用止痛剂。
在一个实施方案中，受试者可以施用增强CAR表达细胞的活性或适合性的药剂。例如，在一个实施方案中，所述药剂可以是抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施方案中，调节或调控T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子，例如，程序化死亡-1(PD-1)可以降低CAR表达细胞引起免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷和TGFRβ。对调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子的抑制(例如通过DNA、RNA或蛋白水平的抑制)可以优化CAR表达细胞性能。在一些实施方案中，药剂，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA，规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)，或锌指核酸内切酶(ZFN)(例如，如本文中所述的)，可以用于抑制CAR表达细胞中的抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。
在一个实施方案中，抑制CAR表达细胞内调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的物质。在这些实施方案中，将对调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子的表达进行抑制的dsRNA连接至编码CAR组分(例如，全部组分)的核酸。在一个实施方案中，将编码对调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子的表达进行抑制的dsRNA分子的核酸分子，可操作地连接启动子，例如，H1-或U6-驱动的启动子，使得抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子表达，例如，在CAR表达细胞内表达。参见，例如，Tiscornia G.,“Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,”，第3章，见Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA(编辑，Friedmann和Rossi)，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR等，(2002)Science 296:550-553；Miyagishi M等，(2002)Nat.Biotechnol.19:497-500。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，存在于包含编码CAR组分(例如，全部组分)的核酸分子的同一载体上，例如，慢病毒载体。在这样的实施方案中，编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，在载体例如慢病毒载体上，位于编码CAR组分(例如，全部组分)的核酸的5’-或3’-。编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，与编码CAR组分(例如，全部组分)的核酸，可以以相同或不同方向来转录。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，存在于不同于包含编码CAR组分(例如，全部组分)的核酸分子的载体的载体上。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，在CAR表达细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的核酸分子，稳定地整合至CAR表达细胞的基因组中。提供用于表达CAR的组分(例如，全部组分)以及抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA的示例性载体的构造，例如在2014年12月19日提交的国际公开WO2015/090230的图47中，该文献按引用并入本文中。
对于抑制调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子表达有用的dsRNA分子的实例(其中调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的分子是PD-1)包括靶向PD-1的RNAi剂，例如2014年12月19日提交的国际公开WO2015/090230的段落[00489]以及表16和17中描述的，该文献按引用并入本文中。
在一个实施方案中，调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的药剂可以是例如，结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，药剂可以是结合PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹单抗(ipilimumab)(也称为MDX-010和MDX-101，并且作为销售；Bristol-Myers Squibb；Tremelimumab(可获自Pfizer的IgG2单克隆抗体，之前称为ticilimumab，CP-675,206))。在一个实施方案中，药剂是结合TIM3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，药剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。
PD-L1是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等，1996Int.Immunol 8:765-75)。PD-1的两种配体，PD-L1和PD-L2，已经显示出在结合PD-1时下调T细胞激活(Freeman等，2000JExp Med
192:1027-34；Latchman等，2001Nat Immunol 2:261-8；Carter等，2002Eur JImmunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中具有高丰度(Dong等,2003J Mol Med 81:281-7；Blank等,2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等,2004Clin CancerRes 10:5094)。可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制。PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以组合本发明CAR来使用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是特异性地阻断PD-1的完全人IgG4单克隆抗体。Nivolumab(克隆5C4)和特异性地结合PD-1的其他人单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO2006/121168中。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是结合PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611中。派姆单抗(Pembrolizumab)(之前称为lambrolizumab，也称为MK03475；Merck)是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体公开于US8,354,509和WO2009/114335中。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342)，是阻断PD-1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其他抗PD-1抗体包括例如，AMP 514(Amplimmune)，例如，US8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD-1抗体。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是发明名称为“PD-1的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof)”的US2015/0210769中所述的抗PD-1抗体分子，该文献全部按引用并入本文中。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总地全部CDR)，其中所述重链和轻链可变区为：来自选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E之任一的抗体，或US 2015/0210769的表1中所述的，或由表1中的核苷酸序列编码，或与上述任一序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在再另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括至少一个、两个、三个或四个如下可变区，其中所述可变区来自本文中所述抗体，例如，选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E之任一的抗体；或如US 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述任一序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负调节T细胞功能，特别是在IFN-g-分泌性CD4+T辅助1细胞和CD8+T细胞毒性1细胞，并且在T细胞耗竭中起着关键作用。对TIM3及其配体(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间相互作用的抑制可以提高免疫应答。TIM3的抗体、抗体片段和其他抑制剂及其配体是本领域可获得的并且可以结合本文中所述的CD19 CAR来使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂，结合TIM3的IgV结构域，以抑制TIM3与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽公开于WO2013/006490和US20100247521。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23的人源化形式(公开于Ngiow等，2011，Cancer Res，71:3540-3551)，和克隆8B.2C12(公开于Monney等，2002，Nature，415:536-541)。抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体公开于US20130156774。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是发明名称为“TIM3的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to TIM3and Uses Thereof)”的US2015/0218274中所述的抗TIM3抗体分子，将其全部按引用并入本文中。在一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自如下重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总地全部CDR)，其中所述可变区来自选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一个的抗体；或如US 2015/0218274中表1-4中所述，或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与上述任一个序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在再另一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个如下可变区，其中所述可变区来自本文中所述抗体，例如，选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中的任一个的抗体；或如US 2015/0218247的表1-4中所述，或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与上述任一序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在其他实施方案中，增强CAR表达细胞活性的药剂是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO2014/022332，例如，单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，例如US 2004/0047858、US7,132,255和WO 99/052552中描述的。在其他实施方案中，抗CEACAM抗体结合CEACAM-5，例如Zheng等，PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述的，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述的。
不希望受到理论的束缚，认为癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)，如CEACAM-1和CEACAM-5，至少部分介导抗肿瘤免疫应答抑制(参见，例如，Markel等，J Immunol.2002年3月15日；168(6):2803-10；Markel等，J Immunol.2006年11月1日；177(9):6062-71；Markel等，Immunology.2009年2月；126(2):186-200；Markel等，Cancer ImmunolImmunother.2010年2月；59(2):215-30；Ortenberg等，Mol Cancer Ther.2012年6月；11(6):1300-10；Stern等，J Immunol.2005年6月1日；174(11):6692-701；Zheng等，PLoSOne.2010Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM已经被描述为TIM3的异嗜性配体并且在TIM3介导的T细胞耐受和耗竭中起作用(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等，(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在一些实施方案中，CEACAM-1和TIM-3的共阻断已经显示出增强了异种移植结直肠癌模型中的抗肿瘤免疫应答(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等，(2014)，上文)。在其他实施方案中，CEACAM-1和PD-1的共阻断降低了T细胞耐受，如例如WO2014/059251中所述的。因此，CEACAM抑制剂可以组合本文中所述的其他免疫调节剂(例如，抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)来使用，以增强对抗癌症的免疫应答，所述癌症例如为黑素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌和本文中所述的其他癌症。
LAG3(淋巴细胞激活基因-3或CD223)是在激活的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其已经显示出在CD8+T细胞耗竭中起作用。LAG3的抗体、抗体片段和其他抑制剂及其配体是本领域可获得的并且可以组合本文中所述的CD19 CAR来使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗性LAG3抗体和IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗尽性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3的可溶性部分与结合II类MHC分子的Ig的重组融合蛋白，并且激活抗原递呈细胞(APC)。其他抗体公开于例如WO2010/019570中。
在一个实施方案中，抗LAG3抗体或其片段是发明名称为“(LAG3的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to LAG3and Uses Thereof)”的US2015/0259420中所述的抗LAG3抗体分子，将其全部按引用并入本文中。在一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含来自如下重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总地全部CDR)，其中所述可变区来自选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J中任一个的抗体；或如US 2015/0259420的表1中所述的；或由表1的核苷酸序列编码；或与上述任一个序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在再另一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个如下可变区，其中所述可变区来自本文中所述的抗体，例如，选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J中任一个的抗体；或如US2015/0259420的表1中所述；或由表1的核苷酸序列编码；或与上述任一个序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。在一些实施方案中，增强CAR表达细胞活性的药剂可以是例如包括第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，而第二结构域是与正信号相关的多肽，例如，包含本文中所述的胞内信号结构域的多肽。在一些实施方案中，与正信号相关的多肽可以包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如，CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号结构域，和/或初级信号结构域，例如CD3ζ的初级信号结构域，例如，本文中所述的。在一个实施方案中，通过表达CDR的相同细胞来表达融合蛋白。在另一个实施方案中，通过例如不表达本发明CAR的T细胞的细胞来表达融合蛋白。
在一个实施方案中，增强本文中所述的CAR表达细胞的活性的药剂是miR-17-92。
在一个实施方案中，增强本文中所述的CAR的活性的药剂是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活和动态平衡相关的重要功能。可以施用于接受本文中所述的CAR表达细胞的受试者的细胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21，或其组合。在优选实施方案中，施用的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21，或其组合。细胞因子可以施用一天一次或一天超过一次，例如，一天两次、一天三次或一天四次。细胞因子可以施用超过一天，例如，细胞因子施用2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，细胞因子施用一天一次，持续7天。
在一些实施方案中，结合本文中所述的组合，例如间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，来施用细胞因子。细胞因子可以与CAR表达细胞同时或并行施用，例如，在同一天施用。细胞因子可以与CAR表达细胞制备于同一药物组合物中，或可以制备于分开的药物组合物中。或者，可以在CAR表达细胞施用后不久，例如，CAR表达T细胞施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，施用细胞因子。在超过一天进行的施用方案中施用细胞因子的实施方案中，细胞因子施用方案的第一天可以是CAR表达细胞施用的同一天，或细胞因子施用方案的第一天可以是CAR表达细胞施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方案中，在第一天，将CAR表达细胞施用于受试者，并且在第二天，施用细胞因子，一天一次，持续接下来的7天。在优选实施方案中，与CAR表达细胞组合施用的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21。
在其他实施方案中，在CAR表达细胞施用后一段时间施用细胞因子，例如，CAR表达细胞施用后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年，或更长时间。在一个实施方案中，评价受试者对CAR表达细胞的应答后，施用细胞因子。例如，根据本文中所述的剂量和方案，将CAR表达细胞施用于受试者。在CAR表达细胞施用后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年，或更长时间，使用本文中所述的任一种方法，来评价受试者对CART治疗的应答，包括肿瘤生长的抑制、循环肿瘤细胞的减少或肿瘤衰退。对CAR表达细胞治疗没有呈现出足够应答的受试者可以施用细胞因子。将细胞因子施用于对CAR表达细胞治疗具有次佳应答的受试者，可以提高CAR表达细胞效力或抗肿瘤活性。在优选实施方案中，CAR表达细胞施用后施用的细胞因子是IL-7。
与低剂量的mTOR抑制剂联合
在一个实施方案中，与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合，来施用本文中所述的组合，例如，间皮素CAR表达细胞和PD-L1抑制剂。
在另一个实施方案中，低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的施用导致提高的或延长的CAR表达细胞的增殖，例如，在培养物中或在受试者中，例如，与未处理的CAR表达细胞或未治疗的受试者相比。在一些实施方案中，提高的增殖与CAR表达细胞数量的增加相关。用于测量提高的或延长的增殖的方法描述于本文中的实施例中。在另一个实施方案中，低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的施用导致CAR表达细胞对癌细胞提高的杀灭，例如，在培养物中或在受试者中，例如，与未处理的CAR表达细胞或未治疗的受试者相比。在一些实施方案中，提高的癌细胞杀灭与肿瘤体积的减小有关。
在一个实施方案中，与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如，变构mTOR抑制剂，例如RAD001，或催化mTOR抑制剂，组合施用表达CAR分子的细胞，例如，本文中所述的CAR分子。例如，低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的施用，可以在本文中所述的CAR表达细胞施用前开始；在本文中所述的CAR表达细胞施用前完成；在本文中所述的CAR表达细胞施用同时开始；与本文中所述的CAR表达细胞的施用重叠；或在本文中所述的CAR表达细胞施用后继续。
备选地或另外地，低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的施用可以优化待工程化来表达本文中所述的CAR分子的免疫效应细胞。在这样的实施方案中，可以在从受试者收集待工程化来表达本文CAR分子的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)前，开始或完成低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001，或催化mTOR抑制剂)的施用。
在另一个实施方案中，可以在低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的存在下，培养(例如从受试者收集后)待工程化来表达本文中所述的CAR分子的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)、或(例如，在施用于受试者之前)表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
如本文中使用的，术语“mTOR抑制剂”是指抑制细胞中的mTOR激酶的化合物或配体，或其药物学上可接受的盐。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是催化抑制剂。
变构mTOR抑制剂包括天然三环化合物雷帕霉素(西罗莫司)、雷帕霉素相关的化合物，即具有与雷帕霉素相似的结构和功能的化合物，例如，雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称为rapalog)和其他抑制mTOR活性的大环内酯化合物。
雷帕霉素是已知的由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯抗生素，具有式A中所示的结构。
其他合适的雷帕霉素类似物包括，但不限于，RAD001，另外称为依维莫司具有化学名称(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮，西罗莫司(雷帕霉素，AY-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称为西罗莫司或CCI-779)和ridaforolimus(AP-23573/MK-8669)。变构mTor抑制剂的其他实例包括佐他利莫司(zotarolimus(ABT578)和umirolimus，如US2005/0101624中所述的，将其内容按引用并入。其他合适的mTOR抑制剂描述于2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的段落946至964，将其全部按引用并入本文中。低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂、与低剂量的mTOR抑制剂相关的合适的mTOR抑制水平、用于检测mTOR抑制水平的方法、及其合适的药物组合物进一步描述于2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的段落936至945和965至1003中，将其全部按引用并入。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包含CAR表达细胞，例如，多个CAR表达细胞，如本文中所述的，组合一种或多种药物学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲剂，如天然缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物在一个方面中配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式来施用。施用的量和频率将由如患者状况以及患者疾病的类型和严重性等因素来决定，但可以通过临床试验确定合适的剂量。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如，不存在可检测水平的污染物，所述污染物例如选自内毒素、支原体、复制性慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残余抗CD3/抗CD28包被的珠子、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和A组酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes group A)中的至少一种。
治疗方法
当述及“免疫有效量”、“有效剂量”、“抗癌有效量”、“癌抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和患者(受试者)状况的个体差异，来确定待施用的本发明组合物的精确量。
待施用于受试者的以上治疗的剂量将根据待治疗病症和治疗接受者的确切性质而改变。可以根据本领域公认的实践，放大用于人类施用的剂量。例如，对于成人患者，用于CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围中，通常每日施用，持续1至30天的时间段。优选的日剂量是1至10mg/天，尽管在一些情况中，可以使用每天高达40mg的较大剂量(描述于美国专利No.6,120,766中)。
本文中所述组合物的施用可以以任何方便的方式来进行，包括气溶胶吸入、注射、吞咽、输血、植入或移植。本文中所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用。在一个实施方案中，本文中所述的组合物，例如，包含CAR表达细胞和/或PD-L1抑制剂的组合物，可以经皮内或皮下注射施用于患者。在一个实施方案中，本文中所述的组合物，例如，包含CAR表达细胞和/或PD-L1抑制剂的组合物，通过静脉内注射施用。本文中所述的组合物，例如，包含CAR表达细胞和/或PD-L1抑制剂的组合物，可以直接注入肿瘤、淋巴结或感染部位中。
通常认为，包含本文中所述的免疫效应细胞的药物组合物可以以104至109细胞/kg体重的剂量来施用，在一些情况中，105至106细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。免疫效应细胞组合物还可以以这些剂量施用多次。可以通过免疫治疗中公知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面中，可能期望，将激活的免疫效应细胞施用于受试者，并随后重新抽血(或进行分离性输血)，根据本发明激活由此获得的细胞，并且将这些激活的和扩增的细胞重新输注给患者。这个过程可以每几周进行多次。在某些方面中，可以从10cc至400cc抽血物中激活细胞。在某些实施方案中，可以从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血物中激活细胞。
在一个特定的示例性方面中，受试者可以接受白细胞单采(leukapheresis)，其中收集白细胞、富集、或离体耗尽，以选择和/或分离目标细胞，例如T细胞。可以通过本领域已知的方法，扩增这些T细胞分离物并处理，使得可以引入本发明的一个或多个CAR构建体，由此形成本发明的CAR T细胞。需要的受试者随后可以接受高剂量化疗接着外周血干细胞移植的标准治疗。在某些方面中，移植后或与移植并行，受试者接受扩增的本发明CAR表达细胞的输注。在另外的方面中，在外科手术前或后施用扩增的细胞。
在一个实施方案中，将CAR引入免疫效应细胞中，例如，使用体外转录，并且受试者(例如，人)接受本发明的CAR表达细胞的初始施用，以及本发明的CAR表达细胞的一个或多个随后的施用，其中所述一个或多个随后的施用在之前的施用后短于15天，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天施用。在一个实施方案中，每周受试者(例如，人)接受一次以上的本发明CAR表达细胞的施用，例如，每周施用2、3或4次本发明的CAR表达细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受一次以上的CAR表达细胞的施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称为一个周期)，接着一周无CAR表达细胞施用，并且随后将一个或多个另外的CAR表达细胞施用(例如，每周超过一次的CAR表达细胞的施用)给予受试者。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受超过一个周期的CAR表达细胞，并且每个周期之间的时间短于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用CAR表达细胞，每周3次施用。在一个实施方案中，本发明的CAR表达细胞施用至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一些实施方案中，本文中所述的CAR表达细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括约1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108或5×108细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括约1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108或5×108细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括高达约1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108或5×108细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括约1.1×106至1.8×107细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括约1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108、5×108、1×109、2×109或5×109细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括至少约1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108、5×108、1×109、2×109或5×109细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括高达约1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、3×108、5×108、1×109、2×109或5×109细胞。
在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括高达约1×107、1.5×107、2×107、2.5×107、3×107、3.5×107、4×107、4.5×107、5×107、1×108、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108、4.5×108、5×108、1×109、2×109或5×109细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，间皮素CAR表达细胞)的剂量包括高达约1-3×107至1-3×108。在一些实施方案中，受试者施用约1-3×107的间皮素CAR表达细胞。在其他实施方案中，受试者施用约1-3×108的间皮素CAR表达细胞。
在一个方面中，使用慢病毒载体，如慢病毒，产生间皮素CAR表达细胞。这种方式产生的CAR表达细胞将具有稳定的CAR表达。
在一个方面中，在转导后CAR表达细胞瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。可以通过RNA CAR载体递送来实现CAR的瞬时表达。在一个方面中，通过电穿孔将CAR RNA转导至T细胞中。
在使用瞬时表达的CAR表达细胞(特别是使用带有鼠scFv的CAR表达细胞)治疗的患者中可能产生的潜在问题是，多次治疗后的过敏反应。
不受理论的束缚，认为这样的过敏反应应答可能是由患者产生体液抗CAR应答引起的，即，具有抗IgE同种型的抗CAR抗体。认为，当存在十到十四天的抗原暴露中断时，患者的抗体产生细胞将经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转化。
如果患者在瞬时CAR疗法(如通过RNA转导产生)过程中处于产生抗CAR抗体应答的高风险中，则CAR表达细胞输注中断应当持续不超过十至十四天。
使用具有人(而非鼠)scFv的CAR可以降低患者具有抗CAR应答的可能性和强度。
可以由本领域技术人员来确定PD-L1抑制剂(例如，抗PD-L1抗体分子)的剂量和治疗方案。
在PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子的某些实施方案中，以约1至30mg/kg，例如，约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，约1至5mg/kg，或约3mg/kg的剂量，通过注射(例如，皮下或静脉内)施用抗PD-L1抗体分子。施用时间表可以变化，从例如一周一次至每2、3或4周一次。在一个实施方案中，以每隔一周约10至20mg/kg剂量来施用抗PD-L1抗体分子。在一个实施方案中，以低于或约5mg/kg；低于或约4mg/kg；低于或约3mg/kg；低于或约2mg/kg；低于或约1mg/kg的剂量，每隔一周，单独或组合(例如，组合抗LAG-3抗体分子)地，施用抗PD-L1抗体分子。在一个实施方案中，以每隔一周1至5mg/kg；每隔一周1至4mg/kg，每隔一周1至3mg/kg，或每隔一周1至2mg/kg的剂量，施用抗PD-L1抗体分子。在一个实施方案中，以每隔一周1至5mg/kg；每隔一周1至4mg/kg，每隔一周1至3mg/kg，或每隔一周1至2mg/kg的剂量，单独或组合(例如，组合抗PD-L1抗体分子)地，施用抗PD-L1抗体分子。
可以通过本领域已知的各种方法来施用抗体分子，尽管对于许多治疗应用，优选的施用途径/方式是静脉内注射或输注。例如，可以以20mg/min以上，例如，20-40mg/min的速率，并且通常高于或等于40mg/min，通过静脉内输注来施用抗体分子，以达到约35至440mg/m2的剂量，通常约70至310mg/m2，并且更常见为约110至130mg/m2。在一些实施方案中，约110至130mg/m2的输注速率获得约3mg/kg的水平。在其他实施方案中，可以以低于10mg/min的速率，例如，低于或等于5mg/min，通过静脉内输注来施用抗体分子，以达到约1至100mg/m2的剂量，例如，约5至50mg/m2，约7至25mg/m2，或约10mg/m2。在一些实施方案中，在约30分钟时间段中输注抗体。可以以低于10mg/min的速率，优选低于或等于5mg/min，通过静脉内输注来施用抗体分子，以达到约1至100mg/m2的剂量，优选约5至50mg/m2，约7至25mg/m2，并且更优选约10mg/m2。注意，剂量值可以根据待缓解症状的类型和严重程度而改变。进一步可以理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需求和施用或监管组合物施用的人员的专业判断，随着时间调整特定的剂量方案，并且本文中所列的剂量范围只是示例性的并且不旨在用于限制本发明组合物的范围或实践。
实施例
通过参照以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另外指出，提供这些实施例只是用于举例说明的目的，并且不旨在用来限制。因此，本发明绝不应当解释为限于以下的实施例，而相反，应当解释为涵盖由本文提供的教导可以显而易见的任何和所有变型方案。
实施例1：MSLN CART和PD-L1抑制剂联合治疗在胰腺癌中的功效
在胰腺癌PANC02.03的小鼠模型中评价了间皮素CART治疗组合PD-L1抗体的抗肿瘤活性。之前在PANC02.03小鼠模型中使用间皮素CAR治疗的研究表明，间皮素CAR T细胞扩增并浸润肿瘤。通过流式细胞术分析这些肿瘤浸润CAR T细胞，揭示了PD-1(参见图1A)和PD-L1的表达。另外，在体外和体内测定时，PAN02.03癌细胞表达PD-L1和PD-L2(参见图1B)。
在随后测定间皮素CAR T细胞和PDL1抑制之间的协同作用的实验中，将5×106PANC02.03胰腺肿瘤细胞皮下植入免疫受损的NSG小鼠侧腹。用单独的CART治疗、单独的PD-L1治疗、或CART和PD-L1抑制剂治疗的组合，来治疗PANC02.03小鼠。用以下描述的实验评价了，相对于CART治疗，给予PD-L1抑制剂治疗的顺序对抗肿瘤活性的影响。
抗体治疗在CART治疗前
通过慢病毒转导将T细胞工程化，以表达M5间皮素CAR构建体(例如，表2中的SEQID NO:67)。对照CAR T细胞经工程化以表达CD19 CAR。将小鼠分成9组，并根据以下的剂量和治疗时间表来治疗。在肿瘤移植后第23和28天，静脉内注射两剂的4×106CART细胞。在肿瘤移植后第21天，例如，在CART治疗前48小时，腹膜内注射PD-L1抗体。
表7
在施用治疗前每周将小鼠称重并卡钳测量两次，以监测肿瘤生长。施用后，每周将小鼠卡钳测量两次。在研究结束时，收集骨髓(BM)、肿瘤和脾，用于FACs分析。
图2中显示的结果表明，mesoCART和PD-L1抑制剂的联合治疗显示出短暂肿瘤衰退后，接着是肿瘤停滞。证实该联合治疗在抑制肿瘤进展上比使用单独的mesoCART的治疗更有效。单独地或与PD-L1抑制剂组合地，使用CD19 CART的治疗对肿瘤进展没有作用。
抗体治疗在CART治疗后
在下一个实验中，在间皮素CART治疗后给予PD-L1抑制剂治疗。在肿瘤植入后21天，施用4×106M5CART细胞。每周以10mg/kg i.v.施用PD-1或PD-L1抗体，其中在CART施用后24小时给予第一剂。
对肿瘤进展的治疗结果显示于图3中。M5CART治疗与PD-L1抗体治疗的组合只显示出微小的和短暂的抗肿瘤活性。
来自两个实验的数据一起表明，在给予CART治疗前施用PD-L1抑制剂具有更强的抗肿瘤作用。
实施例2：癌症患者中的PD-L1表达
进行进一步的分析，以更好地表征来自用4×106M5间皮素CAR阳性T细胞治疗的NSG小鼠的PANC02.03肿瘤。在第35天，从用M5间皮素CART治疗的小鼠获得了PANC02.03肿瘤样品。制备肿瘤样品，并将连续切片染色，以分析肿瘤中的间皮素和PD-L1表达、以及CART浸润和凋亡。将间皮素抗体，抗PD-L1抗体(#SP263，Ventana Medical Systems，Tuscon，AZ)、抗人CD3抗体(#2GV6，Vetana Medical Systems)和抗CC3抗体(凋亡标志物)(#9661，CellSignaling Technology，Danvers，MA)用于免疫组织化学染色，例如，使用本领域已知的免疫组织化学技术。还进行了针对间皮素mRNA的原位杂交(#413101，ACDBio，Hayward，CA)。
图4显示了肿瘤中的间皮素表达和PD-L1表达。肿瘤具有高PD-L1染色区，其显示出与间皮素蛋白表达水平逆相关。图5显示了CAR T细胞浸润(CD3染色的样品，左上图)、凋亡(CC3染色的样品，左下图)、PD-L1表达(右上图)和间皮素mRNA表达(右下图)。来自这个表达分析的结果表明，PD-L1表达在具有低间皮素蛋白和mRNA表达(图4)以及还有高CAR T细胞浸润(图5)的肿瘤区域中是高的。通过spindleloid或间充质细胞形态学来表征这些PD-L1-高间皮素-低细胞，并且很可能是通过表皮间充质细胞转化产生。这个过程在胰腺肿瘤中得到了充分描述，并且很可能促进免疫抑制性肿瘤微环境和疾病进展。因此，这些结果表明，使用间皮素CART和PD-L1抑制剂的联合治疗可以在间皮素表达细胞中产生协同作用增强功效，其中间皮素CART靶向并杀灭间皮素表达肿瘤细胞，而PD-L1抑制剂抑制来自例如癌细胞和肿瘤基质细胞的免疫抑制性信号。
实施例3：低剂量RAD001刺激细胞培养模型中的CART增殖
通过在不同浓度的RAD001的存在下，将CART表达细胞与靶细胞共同培养，在体外评价了低剂量的RAD001对CAR T细胞增殖的作用。
材料和方法
CAR转导的T细胞的产生
将人源化的、抗人CD19 CAR(huCART19)慢病毒转移载体用于产生包装至VSVg假型化慢病毒颗粒中的遗传物质。人源化抗人CD19 CAR(huCART19)的氨基酸和核苷酸序列是2014年3月15日提交的PCT公开WO2014/153270中描述的CAR1，ID 104875，并且在其中指定为SEQ ID NO 85和31。
将慢病毒转移载体DNA与三个包装组分VSVg env、gag/pol和rev以及lipofectamine试剂混合，以转染Lenti-X 293T细胞。24h后以及此后30h更换培养基，收集含病毒的培养基，过滤并储存在-80℃。通过转导新鲜或冷冻的幼稚T细胞来产生CART，所述T细胞通过对健康供体血液或leukopak的负磁性选择而获得。通过用抗CD3/抗CD28珠子孵育24h来激活T细胞，此后将病毒上清液或浓缩的病毒(分别地，MOI＝2或10)加入培养物中。使修饰的T细胞扩增约10天。在第7天和第9天之间，通过流式细胞术分析，测定了转导的细胞(在细胞表面上表达CAR)的百分比和CAR表达的水平(相对荧光强度，GeoMean)。减缓的生长速率和达到～350fL的T细胞大小的组合，确定了待低温保存用于之后分析的T细胞状态。
评价CART的增殖
为了评价CART的功能性，将T细胞融化并计数，并且通过Cellometer评价存活力。使用未转染的T细胞(UTD)，将每个培养物中的CAR阳性细胞的数量标准化。用RAD001滴定测定了RAD001对CART的影响，从50nM开始。所有共培养实验中使用的靶细胞系是Nalm-6(表达CD19的人前-B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞系)，其经转导而表达荧光素酶。
为了测量CART的增殖，用1:1比例的培养靶细胞和T细胞。当针对CD3、CD4、CD8和CAR表达对细胞进行染色时，测定试验运行4天。通过流式细胞术，使用计数珠作为参照，评估T细胞的数量。
结果
在4天共培养试验中测定了CART细胞的增殖能力。用Nalm-6培养CAR转导的和未转导的T细胞后，测定了CAR-阳性CD3-阳性T细胞(暗条)和总的CD3阳性T细胞(浅条)的数量(图6)。在低于0.016nM的RAD001存在下培养时，huCART19细胞扩增，并且在较高浓度的该化合物下，扩增程度较低。重要地，在0.0032和0.016nM RAD000下，增殖都高于没有添加RAD001观察到的。未转导的T细胞(UTD)没有显示出可检测的扩增。
实施例4：低剂量RAD001在体内刺激CART扩增
这个实施例使用不同浓度的RAD001评价了huCAR19细胞在体内增殖的能力。
材料和方法
NALM6-luc细胞：从患有复发ALL的患者的外周血，产生了NALM6人急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞系。随后用萤火虫荧光素酶标记细胞。这些悬浮细胞生长于补充了10％热灭活的胎牛血清的RPMI中。
小鼠：从Jackson实验室(储备编号005557)接收了6周龄的NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠。
肿瘤植入：将NALM6-luc细胞在补充了10％热灭活的胎牛血清的RPMI中体外生长和扩增。随后将细胞转移至15ml圆锥管中，并用冷的无菌PBS洗涤两次。随后将NALM6-luc细胞计数并以10×106细胞/ml PBS的浓度重悬浮。将细胞放置在冰上并立即(在一小时内)植入小鼠中。在100μl体积中经由尾静脉静脉内注射NALM6-luc细胞，每只小鼠总的1×106细胞。
CAR T细胞施用：在肿瘤植入后7天，给予小鼠5×106CAR T细胞。将细胞在37摄氏度水浴中部分融化，并随后通过将1ml冷的无菌PBS加入含有细胞的试管中，将细胞彻底融化。将融化的细胞转移至15ml falcon管中并用PBS调节至10ml的终体积。将细胞在1000rpm洗涤两次，每次10分钟，然后在血球计上计数。随后将T细胞以50×106CAR T细胞/ml冷PBS的浓度重悬浮，并保持在冰上直至向小鼠施用。对于每只小鼠，以5×106CAR T细胞的剂量，经由尾静脉给小鼠静脉内注射100μl的CAR T细胞。每组八只小鼠用100μl单独的PBS(PBS)，或人源化CD19 CAR T细胞处理。
RAD001施用：配制等于1mg RAD001的50mg浓缩微乳液并随后在施用时重悬浮于D5W(水中5％的葡萄糖)中。小鼠每日口服施用(经口管饲)200μl所需剂量的RAD001。
PK分析：在肿瘤植入后7天开始，每日给小鼠施用RAD001。施用组如下：0.3mg/kg，1mg/kg，3mg/kg和10mg/kg。小鼠在第0天和第14天，在第一剂和最后一剂RAD001后在以下时间点采血，用于PK分析：15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时。
结果：
在带有NALM6-luc肿瘤的NSG小鼠中测定了RAD001的扩增和药物代谢动力学。每日口服施用单独的RAD001对NALM6-luc肿瘤的生长没有影响(图7)。RAD001的药物代谢动力学分析显示出，其在带有肿瘤的小鼠的血液中相当稳定(图8A和8B)。第0天和第14天的PK分析显示出，血液中的RAD001浓度甚至在最低测试剂量(0.3mg/kg)施用后甚至24小时还高于10nm。
基于这些剂量，组合和不组合RAD001来施用huCAR19 CAR T细胞，以确定这些细胞的增殖能力。基于施用后24小时血液中的RAD001水平，使用的最高剂量为3mg/kg。因为最后一剂RAD001后24小时的RAD001浓度高于10nM，在使用CAR T细胞的体内研究中使用了几个较低剂量的RAD001。在每日口服RAD001施用开始前一天，IV施用CAR T细胞。经由FACS检测小鼠的T细胞扩增。
最低剂量的RAD001显示出CAR T细胞增强的增殖(图9A和9B)。与CD8+CAR T细胞相比，对于CD4+CAR T细胞，这种增强的增殖更明显，并且时间更长。然而，使用CD8+CAR T细胞，可以在CAR T细胞施用后的早期时间点看到增强的增殖。在一些实施方案中，还可以组合检查点抑制剂，使用RNA CART细胞。
等同方案
本文中引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容全部按引用并入本文中。尽管已经参照特定的方面公开了本发明，但显然本领域技术人员可以想到本发明的其他方面和变化形式，而不偏离本发明的精神和范围。所附权利要求旨在解释为包括所有这些方面和等同方案。

Claims (81)

1.一种治疗患有间皮素表达相关疾病的受试者的方法，包括向受试者施用：
i)包含(例如，表达)嵌合抗原受体(CAR)的细胞，例如免疫效应细胞群，其中CAR包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域；和
ii)PD-L1抑制剂，其中在施用包含CAR的细胞前施用PD-L1抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中以一定的施用间隔来施用CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，并且其中所述施用间隔包括单剂PD-L1抑制剂和单剂CAR-表达细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述治疗间隔在施用该剂的PD-L1抑制剂时开始，并且在施用该剂的CAR表达细胞时完成。
4.权利要求2或3的方法，其中所述治疗间隔进一步包括后续的一剂或多剂，例如，1、2、3、4或5或更多剂的PD-L1抑制剂。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中在该剂的PD-L1抑制剂施用后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用该剂的CAR表达细胞。
6.权利要求5的方法，其中在该剂的PD-L1抑制剂施用后2天，施用该剂的CAR表达细胞。
7.权利要求1的方法，其中以一定治疗间隔来施用CAR表达细胞和PD-L1抑制剂，其中所述治疗间隔包括第一和第二剂PD-L1抑制剂和一剂CAR表达细胞，并且其中在第一剂PD-L1抑制剂施用后但在第二剂PD-L1抑制剂施用前施用该剂的CAR-表达细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述治疗间隔在施用第一剂的PD-L1抑制剂时开始，并且在施用第二剂PD-L1抑制剂时完成。
9.权利要求7或8的方法，其中在第一剂PD-L1抑制剂施用后至少5天、7天、1周、2周或3周，施用第二剂PD-L1抑制剂。
10.权利要求7-9任一项的方法，其中在第一剂PD-L1抑制剂施用后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用该剂CAR表达细胞。
11.权利要求7-10任一项的方法，其中在施用该剂的CAR表达细胞后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周，施用第二剂PD-L1抑制剂。
12.权利要求2-11任一项的方法，其中重复所述治疗间隔，例如一次或多次，例如，1、2、3、4或5次以上。
13.权利要求2-11任一项的方法，其中所述治疗间隔后接着一个或多个(例如，1、2、3、4或5)随后的治疗间隔。
14.权利要求13的方法，其中所述一个或多个随后的治疗间隔不同于第一个或之前的治疗间隔。
15.权利要求13或14的方法，其中所述一个或多个随后的治疗间隔，在完成第一个或之前的治疗间隔后至少1天，例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周施用。
16.权利要求2-15任一项的方法，其中在完成一个或多个治疗间隔后，施用后续的一剂或多剂PD-L1抑制剂，例如，1、2、3、4，或5，或更多剂。
17.权利要求16的方法，其中在完成一个或多个治疗间隔后，每5天、7天、2周、3周或4天，施用一剂PD-L1抑制剂。
18.权利要求2-6任一项的方法，其中所述治疗间隔包括在施用该剂的PD-L1抑制剂后2天施用一剂CAR表达细胞，并且其中重复所述治疗间隔两次，并且其中所述治疗间隔在之前的治疗间隔完成后3天开始。
19.权利要求18的方法，其中在第二个治疗间隔后，每5天、7天、2周、3周或4周，施用后续一剂或多剂的PD-L1抑制剂。
20.权利要求1的方法，其中受试者施用单剂CAR表达细胞和单剂PD-L1抑制剂。
21.权利要求20的方法，其中在单剂PD-L1抑制剂施用后至少2天，例如，2、3、4、5、6、7天或2周，施用单剂CAR表达细胞。
22.权利要求21的方法，其中在首剂的CAR表达细胞后，向受试者施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4或5剂)的CAR表达细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述后续的一剂或多剂的CAR表达细胞，在前一剂的CAR表达细胞后至少2天，例如，2、3、4、5、6、7天或2周施用。
24.权利要求23的方法，其中所述后续的一剂或多剂的CAR表达细胞，在前一剂的CAR表达细胞后至少5天施用。
25.权利要求21-24任一项的方法，其中在单剂PD-L1抑制剂施用后，施用后续的一剂或多剂(例如，1、2、3、4或5剂)的PD-L1抑制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述后续的一剂或多剂PD-L1抑制剂，在前一剂的PD-L1抑制剂后至少5天、7天、2周、3周或4周施用。
27.权利要求25的方法，其中所述后续的一剂或多剂PD-L1抑制剂，在一剂CAR表达细胞(例如，首剂的CAR表达细胞)后至少1、2、3、4、5、6或7天施用。
28.权利要求25的方法，其中在第一剂CAR表达细胞前施用一剂或多剂(例如，1、2、3、4或5剂)PD-L1抑制剂。
29.权利要求20-28任一项的方法，其中重复该一剂或多剂CAR表达细胞和该一剂或多剂PD-L1抑制剂的施用。
30.之前任一项权利要求的方法，其中CAR表达细胞的剂量包括至少约1-3×107至1-3×108。
31.权利要求30的方法，其中CAR表达细胞的剂量为约1-3×108细胞。
32.权利要求30的方法，其中CAR表达细胞的剂量为约1-3×108细胞。
33.之前任一项权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂的剂量为1至30mg/kg，例如，约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，或约1至5mg/kg。
34.权利要求33的方法，其中PD-L1抑制剂的剂量为约10至20mg/kg。
35.之前任一项权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽，例如，融合蛋白，或抑制性核酸，例如，siRNA或shRNA。
36.之前任一项权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂的特征在于以下的一个或多个：
i)抑制或降低PD-L1表达，例如，PD-L1的转录或翻译；
ii)抑制或降低PD-L1活性，例如，抑制或降低PD-L1与其关连受体(例如，PD-1)的结合；或
iii)结合PD-L1或其受体，例如，PD-1。
37.之前任一项权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂是抗体分子。
38.之前权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A(atezolizumab)、MEDI-4736、MSB-0010718C(avelumab)、MDX-1105、和表6中列出的任何抗PD-L1抗体分子。
39.之前任一项权利要求的方法，其中PD-L1抑制剂包括抗PD-L1抗体分子，其包含
i)表6中所列的任一个PD-L1抗体分子氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；和
ii)表6中所列的任一个PD-L1抗体分子氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
40.权利要求39的方法，其中抗PD-L1抗体分子包含
i)a)选自SEQ ID NO:287、290或195的HC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:288的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:289的HC CDR3氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO:295的LC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:296的LC CDR2氨基酸序列和SEQID NO:297的LC CDR3氨基酸序列；或
ii)a)选自SEQ ID NO:287、290或195的HC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:291的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:292的HC CDR3氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO:298的LC CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:299的LC CDR2氨基酸序列和SEQID NO:300的LC CDR3氨基酸序列。
41.权利要求39或40的方法，其中抗PD-L1抗体分子包括重链可变区，其包含：
i)表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364；
ii)对表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:304、316、324、332、336、340、348、356或364)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
42.权利要求39-41任一项的方法，其中抗PD-L1抗体分子包括重链，其包含：
i)表6中所列的任一重链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:306、318、326、334、338、342、350、358、366、393、377或382；
ii)对表6中所列的任一重链(例如SEQ ID NO:306、318、326、334、338、342、350、358、366、393、377或382)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中所列的任一重链的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:306、318、326、334、342、350、358、366、393、377或382)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
43.权利要求39-42任一项的方法，其中抗PD-L1抗体分子包括轻链可变区，其包含：
i)表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372；
ii)对表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:308、312、320、328、344、352、360、368或372)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
44.权利要求39-43任一项的方法，其中抗PD-L1抗体分子包括轻链，其包含：
i)表6中所列的任一轻链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374；
ii)对表6中所列的任一轻链(例如SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374)具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中所列的任一轻链的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:310、314、322、330、346、354、362、370或374)具有95-99％同一性的氨基酸序列。
45.权利要求39-44任一项的方法，其中抗PD-L1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:304的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列的轻链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:360的氨基酸序列的轻链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:332的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:328的氨基酸序列的轻链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:336的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:340的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:340的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:372的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:348的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:348的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:386的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:352的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
xvii)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的轻链可变结构域。
46.权利要求39-45任一项的方法，其中抗PD-L1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的轻链；
ii)包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链；
iii)包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
iv)包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链；
v)包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
vii)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:362的氨基酸序列的轻链；
viii)包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
ix)包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；
x)包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的轻链；
xi)包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xii)包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列的轻链；
xiii)包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xiv)包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
xv)包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的轻链；
xvi)包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链；
xvii)包含SEQ ID NO:366的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:370的氨基酸序列的轻链；
xviii)包含SEQ ID NO:393的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链；
xix)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链；或
xx)包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的轻链。
47.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含表2中所列的任一个间皮素重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表2中所列的任一个间皮素轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)。
48.权利要求47的方法，其中间皮素结合结构域包含根据表4中的HC CDR氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，以及根据表5中的LC CDR氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
49.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含：
i)表2中所列的间皮素结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列；
ii)对表2中所列的间皮素结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表2中所列的间皮素结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
50.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含：
i)表2中提供的间皮素结合结构域的任何重链的氨基酸序列；
ii)对表2中提供的间皮素结合结构域的任何重链的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表2中提供的间皮素结合结构域的任何重链的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
51.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含：
i)表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列；
ii)对表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
52.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含：
i)表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链的氨基酸序列；
ii)对表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表2中提供的间皮素结合结构域的任何轻链的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
53.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含表2中所列的任一个重链可变区的氨基酸序列，和表2中所列的任一个轻链可变区的氨基酸序列。
54.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域包含：
i)选自SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
ii)对SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:275，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62中的任一个氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
55.之前任一项权利要求的方法，其中跨膜结构域包含来自选自T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。
56.之前任一项权利要求的方法，其中跨膜结构域包含
(i)SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
(ii)相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列包含至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
57.之前任一项权利要求的方法，其中间皮素结合结构域通过铰链区连接跨膜结构域。
58.之前任一项权利要求的方法，其中铰链区包含SEQ ID NO:2，或与其具有95-99％同一性的序列。
59.之前任一项权利要求的方法，其中胞内信号结构域包括共刺激信号结构域，其包含获自选自以下蛋白质的功能性信号结构域：I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A,Ly108)、SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性地结合CD83的配体。
60.权利要求59的方法，其中共刺激结构域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，相对于SEQID NO:7的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
61.之前任一项权利要求的方法，其中胞内信号结构域包括4-1BB的功能信号结构域和/或CD3ζ的功能信号结构域。
62.之前任一项权利要求的方法，其中胞内信号结构域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
63.之前任一项权利要求的方法，其中胞内信号结构域包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中胞内信号结构域包括的这些氨基酸序列在相同框中并且作为单条多肽链表达。
64.之前任一项权利要求的方法，其中CAR进一步包括前导序列，所述前导序列包括SEQID NO:1的氨基酸序列。
65.之前任一项权利要求的方法，其中CAR包括：
(i)SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78，SEQID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:84，SEQID NO:85或SEQ ID NO:86中任一个的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:84，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(iii)与SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:278，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:84，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86中的任一个具有95-99％同一性的氨基酸序列。
66.之前任一项权利要求的方法，其中包含CAR的细胞包含编码CAR的核酸。
67.权利要求66的方法，其中编码CAR的核酸是慢病毒载体。
68.权利要求66或67的方法，其中通过慢病毒转导将编码CAR的核酸引入细胞中。
69.权利要求66任一项的方法，其中编码CAR的核酸是RNA，例如体外转录的RNA。
70.权利要求69的方法，其中通过电穿孔将编码CAR的核酸引入细胞中。
71.之前任一项权利要求的方法，其中细胞是T细胞或NK细胞。
72.权利要求71的方法，其中T细胞是自体或同种异体T细胞。
73.之前任一项权利要求的方法，进一步包括施用治疗间皮素表达相关疾病的其他治疗剂，例如，抗癌剂。
74.之前任一项权利要求的方法，其中与间皮素表达相关的疾病是癌症。
75.权利要求74的方法，其中癌症选自间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺转移性癌、卵巢癌、或结直肠癌和膀胱癌，或其转移。
76.之前任一项权利要求的方法，其中受试者是哺乳动物，例如，人。
77.之前任一项权利要求的方法，其中受试者表达PD-L1和/或PD-L2。
78.权利要求74的方法，其中受试者中的癌细胞或癌细胞附近的细胞表达PD-L1和/或PD-L2。
79.之前任一项权利要求的方法，其中表达CAR的细胞表达PD-1和/或PD-L1。
80.一种组合，其包含
包含CAR的细胞，例如免疫效应细胞群，其中CAR包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域；和
选自表6的PD-L1抑制剂；
用于治疗受试者中与间皮素表达相关的疾病，例如，癌症。
81.一种组合(例如，一种或多种组合物或剂型)，其包含
包含CAR的细胞，例如免疫效应细胞群，其中CAR包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域；和
选自表6的PD-L1抑制剂。
CN201680075326.8A 2015-12-22 2016-12-21 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗 Pending CN109069597A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562270780P 2015-12-22 2015-12-22
US62/270,780 2015-12-22
PCT/US2016/067957 WO2017112741A1 (en) 2015-12-22 2016-12-21 Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109069597A true CN109069597A (zh) 2018-12-21

Family

ID=57794375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680075326.8A Pending CN109069597A (zh) 2015-12-22 2016-12-21 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11413340B2 (zh)
EP (1) EP3393504A1 (zh)
JP (2) JP7082055B2 (zh)
CN (1) CN109069597A (zh)
MA (1) MA44140A (zh)
WO (1) WO2017112741A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021223376A1 (zh) * 2020-05-08 2021-11-11 浙江大学 嵌合性抗原受体及表达其的巨噬细胞、调节巨噬细胞极化的方法和应用
CN114364702A (zh) * 2020-08-04 2022-04-15 细胞基因股份公司 与间皮素特异性结合的抗-间皮素嵌合抗原受体
CN114573709A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 复旦大学 携带趋化因子受体且靶向msln抗原的car t免疫细胞的制备及其用途
WO2023131063A1 (zh) * 2022-01-10 2023-07-13 成都科伦精准生物科技有限公司 特异性结合msln的嵌合抗原受体及其应用
CN117143825A (zh) * 2023-11-01 2023-12-01 上海兴瑞一达生物科技有限公司 一种msln嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
CN111139256A (zh) 2013-02-20 2020-05-12 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
JP6779785B2 (ja) * 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
WO2015090229A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
ES2963718T3 (es) 2014-01-21 2024-04-01 Novartis Ag Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co-estimuladoras
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN113583129A (zh) * 2014-03-14 2021-11-02 诺华股份有限公司 针对lag-3的抗体分子及其用途
KR20170037625A (ko) 2014-07-21 2017-04-04 노파르티스 아게 Cll-1 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
ES2805475T3 (es) 2014-07-21 2021-02-12 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
TW202140557A (zh) 2014-08-19 2021-11-01 瑞士商諾華公司 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
KR20170068504A (ko) 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
LT3280729T (lt) 2015-04-08 2022-08-10 Novartis Ag Terapijos cd20, terapijos cd22 ir kombinuotos terapijos su cd19 chimerinį antigeno receptorių (car) ekspresuojančia ląstele
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
PT3298033T (pt) 2015-05-18 2020-09-22 Tcr2 Therapeutics Inc Composições e utilizações médicas para reprogramação de tcr utilizando proteínas de fusão
WO2017015427A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
US11747346B2 (en) 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
EP3393504A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
US11242376B2 (en) 2016-08-02 2022-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
JP2019530704A (ja) * 2016-10-06 2019-10-24 ファイザー・インコーポレイテッド がんの処置のためのアベルマブの投与レジメン
US10525083B2 (en) 2016-10-07 2020-01-07 Novartis Ag Nucleic acid molecules encoding chimeric antigen receptors comprising a CD20 binding domain
PL3445787T3 (pl) 2016-10-07 2021-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Kompozycje i sposoby reprogramowania receptorów limfocytów t przy użyciu białek fuzyjnych
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
MX2019011272A (es) 2017-03-22 2019-10-24 Novartis Ag Composiciones y metodos para inmunooncologia.
US20210079057A1 (en) * 2017-06-13 2021-03-18 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
AU2018316694A1 (en) * 2017-08-17 2020-02-13 Nektar Therapeutics Immunotherapeutic tumor treatment method
WO2019037057A1 (zh) * 2017-08-24 2019-02-28 深圳市博奥康生物科技有限公司 靶向沉默 DD1 α的 shRNA
EP3678690A1 (en) * 2017-09-06 2020-07-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for improving adoptive cell therapy
EP3737408A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Novartis AG Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019143961A2 (en) * 2018-01-19 2019-07-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting gamma delta t cells with chimeric antigen receptors
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
WO2019200347A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for adoptive cell therapy targeting ror1
BR112020025048A2 (pt) 2018-06-13 2021-04-06 Novartis Ag Receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos
CN108864310A (zh) * 2018-07-31 2018-11-23 苏州茂行生物科技有限公司 一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用
EP3829605A4 (en) * 2018-08-01 2022-10-19 ImmunityBio, Inc. QUADRICISTRONIC SYSTEM WITH A HOMING RECEPTOR OR A CYTOKINE AND A CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR GENETIC MODIFICATION OF IMMUNOTHERAPIES
JP2021534783A (ja) 2018-08-31 2021-12-16 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
JP2022501043A (ja) * 2018-09-20 2022-01-06 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッドLentigen Technology, Inc. 抗ｃｄ１２３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法
WO2020098785A1 (zh) * 2018-11-16 2020-05-22 南京金斯瑞生物科技有限公司 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途
CN113710253A (zh) * 2019-02-04 2021-11-26 普洛迈博生物技术公司 编码嵌合抗原受体和il-6或检查点抑制剂的短发夹rna序列的核酸序列
SG11202107825WA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220241412A1 (en) 2019-05-24 2022-08-04 Pfizer Inc. Combination therapies using cdk inhibitors
EP4017965A1 (en) * 2019-08-21 2022-06-29 Université de Lausanne Idh2 inhibition for producing t-cells and b-cells with a memory phenotype
CN114599400A (zh) 2019-10-28 2022-06-07 诺伊尔免疫生物科技株式会社 用于治疗癌症的医药、组合医药、医药组合物、免疫应答细胞、核酸递送介质和制品
MX2022006391A (es) 2019-11-26 2022-06-24 Novartis Ag Receptores de antigeno quimerico que se unen a bcma y cd19 y usos de los mismos.
CA3173737A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
IL295604A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
WO2022006451A2 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and pd-1 antibodies
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
EP4330381A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Novartis AG Viral vector production system
JP2023549977A (ja) * 2021-05-26 2023-11-29 セレンジーン インコーポレイテッド 抗メソテリンｓｃＦｖを含むキメリック抗原受容体及びその用途
WO2023020472A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Mesothelin-targetting antibodies and uses thereof in cancer therapies
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
TW202327595A (zh) 2021-10-05 2023-07-16 美商輝瑞大藥廠 用於治療癌症之氮雜內醯胺化合物的組合
WO2023079428A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Pfizer Inc. Combination therapies using tlr7/8 agonist
WO2023220607A2 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cxcr3 overexpression in car-nk cells primes migration/homing into the tumor microenvironment

Family Cites Families (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
EP0090505B1 (en) 1982-03-03 1990-08-08 Genentech, Inc. Human antithrombin iii, dna sequences therefor, expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby, a process for expressing human antithrombin iii, and pharmaceutical compositions comprising it
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
WO1992010591A1 (en) 1990-12-14 1992-06-25 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
NZ241855A (en) 1991-03-07 1994-04-27 Gen Hospital Corp Use of therapeutic cells to obtain cellular response to infection, tumours or autoimmune-generated cells, cells with chimaeric receptors (with binding component and destruction signal), dna encoding the receptor, vectors and antibodies to receptor
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
DE69330523D1 (de) 1992-08-21 2001-09-06 Vrije Universiteit Brussel Bru Immunoglobuline ohne leichte ketten
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
EP0758394B1 (en) 1994-05-02 2002-11-20 Bernd Groner Bifunctional protein, preparation and use
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
RU2167676C2 (ru) 1995-02-24 2001-05-27 Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн Перенаправление клеточного иммунитета посредством химерных рецепторов
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
ATE254931T1 (de) 1996-01-05 2003-12-15 Us Gov Health & Human Serv Mesothelinantigen, verfahren und testsatz zur targetierung
US5874240A (en) 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
DK0920505T3 (da) 1996-08-16 2008-09-08 Schering Corp Pattedyrcelleoverfladeantigener og tilhörende reagenser
WO1998018809A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Cell Genesys, Inc. Targeted cytolysis of cancer cells
EP2380906A2 (en) 1997-06-12 2011-10-26 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US20030060444A1 (en) 1997-06-25 2003-03-27 Celltech Therapeutics, Ltd. Cell activation process and reagents therefor
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6509173B1 (en) 1997-10-21 2003-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1, and TR11SV2
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
JP2002502607A (ja) 1998-02-09 2002-01-29 ジェネンテク・インコーポレイテッド 新規な腫瘍壊死因子レセプター相同体及びそれをコードする核酸
WO1999052552A1 (en) 1998-04-15 1999-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. T cell inhibitory receptor compositions and uses thereof
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
AU4418900A (en) 1999-04-16 2000-11-02 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
ES2295040T3 (es) 1999-07-12 2008-04-16 Genentech, Inc. Promocion o inhibicion de la angiogenesis y cardiovascularizacion mediante homologos del ligando / receptor del factor de necrosis del tumor.
WO2001014557A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925848D0 (en) 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
IL136511A0 (en) 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
EP1392818A4 (en) 2001-04-30 2005-01-05 Hope City FOR THE TREATMENT OF CANCER DISEASES IN HUMAN CERTAIN IMMUNE RECEPTOR
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
ES2337986T3 (es) 2001-08-10 2010-05-03 Aberdeen University Dominios de union de antigenos de peces.
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
AU2003202908A1 (en) 2002-01-03 2003-07-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
MXPA04007402A (es) 2002-02-01 2005-06-17 Ariad Gene Therapeutics Inc Compuestos que contienen fosforo y usos de los mismos.
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20040047858A1 (en) 2002-09-11 2004-03-11 Blumberg Richard S. Therapeutic anti-BGP(C-CAM1) antibodies and uses thereof
US7488802B2 (en) 2002-12-23 2009-02-10 Wyeth Antibodies against PD-1
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
BRPI0410785A (pt) 2003-05-23 2006-06-20 Wyeth Corp molécula de ácido nucleico isolada, célula hospedeira, animal transgênico não humano, proteìna isolada, oligonucleotìdeo anti-sentido, molécula de sirna, anticorpo isolado, métodos de triagem quanto aos compostos de teste capazes de inibir, de intensificar ou imitar a interação do gitrl com o gitr, para diagnosticar doenças, para tratar um paciente em risco ou diagnosticado com uma doença, para induzir e para inibir a proliferação de uma população celular contendo células t efetoras, de bloquear a supressão e de supressão de uma população celular que inclua células t efetoras na presença de células t reguladoras cd4+cd25+, e para tratar uma doença, composição farmacêutica, e, adjuvante de vacina
WO2005007190A1 (en) 2003-07-11 2005-01-27 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
WO2005019429A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1692318A4 (en) 2003-12-02 2008-04-02 Genzyme Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF LUNG CANCER
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
EP3530321A1 (en) 2004-12-10 2019-08-28 Peter MacCallum Cancer Institute Methods and compositions for adoptive immunotherapy
DK2343320T3 (da) 2005-03-25 2018-01-29 Gitr Inc Anti-gitr-antistoffer og anvendelser deraf
DK2161336T4 (en) 2005-05-09 2017-04-24 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies for programmed death 1 (PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapies
NZ563263A (en) 2005-05-17 2010-04-30 Univ Connecticut Composition and methods for immunomodulation in an organism
EP1907424B1 (en) 2005-07-01 2015-07-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
CN105368841A (zh) 2006-01-13 2016-03-02 美国政府健康及人类服务部国立卫生研究院 用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因
WO2007133822A1 (en) 2006-01-19 2007-11-22 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the treatment of cancer
US20100105136A1 (en) 2006-10-09 2010-04-29 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
AU2008233051B2 (en) 2007-03-30 2014-04-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred T lymphocytes
PL2170959T3 (pl) 2007-06-18 2014-03-31 Merck Sharp & Dohme Przeciwciała przeciwko ludzkiemu receptorowi programowanej śmierci PD-1
CA2691785C (en) 2007-06-27 2017-01-10 Marine Polymer Technologies Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
PT2175884T (pt) 2007-07-12 2016-09-21 Gitr Inc Terapias de combinação empregando moléculas de ligação a gitr
JP5535074B2 (ja) 2007-10-01 2014-07-02 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー メソテリンに結合するヒト抗体およびその使用
US9416165B2 (en) 2007-10-26 2016-08-16 The Regents Of The University Of California Methods of inhibiting viral replication and improving T cell function employing soluble Tim-3 inhibitors
MY157164A (en) 2007-11-26 2016-05-13 Bayer Ip Gmbh Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
WO2009097140A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off -the -shelf tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors
RU2531758C2 (ru) 2008-02-11 2014-10-27 Куретек Лтд. Моноклональные антитела для лечения опухолей
US8379824B2 (en) 2008-03-06 2013-02-19 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
US8357783B2 (en) 2008-03-27 2013-01-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human anti-mesothelin monoclonal antibodies
WO2010003118A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
AU2009288730B2 (en) 2008-08-25 2013-06-20 Amplimmune, Inc. Compositions of PD-1 antagonists and methods of use
US20110223188A1 (en) 2008-08-25 2011-09-15 Solomon Langermann Targeted costimulatory polypeptides and methods of use to treat cancer
PL3006459T3 (pl) 2008-08-26 2022-01-17 City Of Hope Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu
CN102149820B (zh) 2008-09-12 2014-07-23 国立大学法人三重大学 能够表达外源gitr配体的细胞
KR101814408B1 (ko) 2008-09-26 2018-01-04 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인간 항-ｐｄ-１, ｐｄ-ｌ１, 및 ｐｄ-ｌ2 항체 및 그의 용도
PL2376535T3 (pl) 2008-12-09 2017-09-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała ANTY-PD-L1 i ich zastosowanie do nasilania działania limfocytów T
EP2389443B1 (en) 2009-01-23 2018-11-14 Roger Williams Hospital Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
ES2629337T3 (es) 2009-02-09 2017-08-08 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Anticuerpos contra PD-1 y anticuerpos contra PD-L1 y usos de los mismos
CA2756393C (en) 2009-03-24 2017-06-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies
CA2760385C (en) 2009-04-30 2021-04-20 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Anti ceacam1 antibodies and methods of using same
WO2011020047A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
KR101790802B1 (ko) 2009-09-03 2017-10-27 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-ｇｉｔｒ 항체
US8465743B2 (en) 2009-10-01 2013-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
SI3279215T1 (sl) 2009-11-24 2020-07-31 Medimmune Limited Usmerjena vezavna sredstva proti B7-H1
EP2519544A1 (en) 2009-12-29 2012-11-07 Emergent Product Development Seattle, LLC Polypeptide heterodimers and uses thereof
CA2791975C (en) 2010-02-04 2021-02-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
JP2013532153A (ja) 2010-06-18 2013-08-15 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 慢性免疫病に対する免疫治療のためのｔｉｍ−３およびｐｄ−１に対する二重特異性抗体
CN108424462A (zh) 2010-10-27 2018-08-21 贝勒医学院 使t细胞重定向针对cd70阳性恶性肿瘤的嵌合cd27受体
SG10201510092QA (en) 2010-12-09 2016-01-28 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9233125B2 (en) 2010-12-14 2016-01-12 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing T cells and methods of treating cancer
SG192010A1 (en) 2011-01-18 2013-08-30 Univ Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
WO2012127464A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy
CN110200997A (zh) 2011-03-23 2019-09-06 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
MX2013011363A (es) 2011-04-01 2014-04-25 Sloan Kettering Inst Cancer Anticuerpos para peptidos citosolicos.
DK2694640T3 (da) 2011-04-08 2017-11-20 Baylor College Medicine Reversion af effekterne af tumormikromiljø ved anvendelse af kimæriske cytokinreceptorer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
US9469851B2 (en) 2011-07-25 2016-10-18 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of DUX4
CN107266584B (zh) 2011-07-29 2022-05-13 宾夕法尼亚大学董事会 转换共刺激受体
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
WO2013039954A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
US20140255363A1 (en) 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
WO2013054320A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
ES2654060T3 (es) 2011-10-20 2018-02-12 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Receptores de antígenos quiméricos anti-CD22
US9272002B2 (en) 2011-10-28 2016-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
DK2785375T3 (da) 2011-11-28 2020-10-12 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1-antistoffer og anvendelser deraf
WO2013082366A1 (en) 2011-12-01 2013-06-06 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Anti-ceacam1 recombinant antibodies for cancer therapy
IN2014DN07414A (zh) 2012-02-22 2015-04-24 Univ Pennsylvania
MX2014010183A (es) 2012-02-22 2015-03-20 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para generar una poblacion persistente de celulas t utiles para el tratamiento de cancer.
ES2959443T3 (es) 2012-02-22 2024-02-26 Univ Pennsylvania Uso del dominio de señalización de CD2 en receptores de antígenos quiméricos de segunda generación
AU2013235726B2 (en) 2012-03-23 2017-04-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
US20140004121A1 (en) 2012-06-27 2014-01-02 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
MX2015000428A (es) 2012-07-13 2015-03-12 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para regular celulas t car.
AU2013289971A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhancing activity of CAR T cells by co-introducing a bispecific antibody
SI4019041T1 (sl) 2012-07-13 2023-04-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Obladovanje toksičnosti za protitumorsko delovanje CARS
KR20240000614A (ko) 2012-07-13 2024-01-02 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법
WO2014012001A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of cart19 to deplete normal b cells to induce tolerance
EP2872617A4 (en) 2012-07-13 2015-12-09 Univ Pennsylvania EXTENSION OF EPITOPES IN RELATION TO T CAR LYMPHOCYTES
CA2916638C (en) 2012-07-31 2021-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of the immune response
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
JP6307085B2 (ja) 2012-09-27 2018-04-04 ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，ａｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ メソテリン抗体および強力な抗腫瘍活性を惹起するための方法
EP2904106A4 (en) 2012-10-01 2016-05-11 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING STROMAL CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
US20150273056A1 (en) 2012-10-12 2015-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Enhancement of the immune response
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
CN111139256A (zh) 2013-02-20 2020-05-12 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9512084B2 (en) 2013-11-29 2016-12-06 Novartis Ag Amino pyrimidine derivatives
JP6779785B2 (ja) 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
WO2015090229A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
ES2963718T3 (es) 2014-01-21 2024-04-01 Novartis Ag Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co-estimuladoras
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
EP3119423B1 (en) 2014-03-15 2022-12-14 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3811970A1 (en) 2014-03-15 2021-04-28 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
RU2718542C2 (ru) 2014-04-07 2020-04-08 Новартис Аг Лечение злокачественной опухоли с использованием химерного рецептора антигена против cd19
ES2805475T3 (es) 2014-07-21 2021-02-12 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014501A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase molecules and uses thereof
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
KR20170037625A (ko) 2014-07-21 2017-04-04 노파르티스 아게 Cll-1 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US20170274014A1 (en) 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
TW202140557A (zh) 2014-08-19 2021-11-01 瑞士商諾華公司 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
KR20170068504A (ko) 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
WO2016061368A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
AU2015374296B2 (en) 2014-12-29 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016164580A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Novartis Ag Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives
LT3280729T (lt) 2015-04-08 2022-08-10 Novartis Ag Terapijos cd20, terapijos cd22 ir kombinuotos terapijos su cd19 chimerinį antigeno receptorių (car) ekspresuojančia ląstele
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
WO2017015427A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
US11747346B2 (en) 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
KR20180051625A (ko) 2015-09-17 2018-05-16 노파르티스 아게 증진된 효능을 갖는 car t 세포 요법
EP3393504A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
US10525083B2 (en) 2016-10-07 2020-01-07 Novartis Ag Nucleic acid molecules encoding chimeric antigen receptors comprising a CD20 binding domain

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AURORE MORELLO ET AL: "Mesothelin-Targeted CARs: Driving T Cells to Solid Tumors", 《CANCER DISCOVERY》 *
EDMUND K.MOON ET AL: "Multifactorial T-cell Hypofunction That Is Reversible Can Limit the Efficacy of Chimeric Antigen Receptor–Transduced Human T cells in Solid Tumors", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
TANYI JANOS L ET AL: "Safety and feasibility of chimeric antigen receptor modified T cells directed against mesothelin (CART-meso) in patients with mesothelin expressing cancers", 《CANCER RESEARCH》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021223376A1 (zh) * 2020-05-08 2021-11-11 浙江大学 嵌合性抗原受体及表达其的巨噬细胞、调节巨噬细胞极化的方法和应用
CN114364702A (zh) * 2020-08-04 2022-04-15 细胞基因股份公司 与间皮素特异性结合的抗-间皮素嵌合抗原受体
CN114364702B (zh) * 2020-08-04 2022-09-16 细胞基因股份公司 与间皮素特异性结合的抗-间皮素嵌合抗原受体
CN114573709A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 复旦大学 携带趋化因子受体且靶向msln抗原的car t免疫细胞的制备及其用途
CN114573709B (zh) * 2020-11-30 2024-03-12 复旦大学 携带趋化因子受体且靶向msln抗原的car t免疫细胞的制备及其用途
WO2023131063A1 (zh) * 2022-01-10 2023-07-13 成都科伦精准生物科技有限公司 特异性结合msln的嵌合抗原受体及其应用
CN117143825A (zh) * 2023-11-01 2023-12-01 上海兴瑞一达生物科技有限公司 一种msln嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用
CN117143825B (zh) * 2023-11-01 2024-01-23 上海兴瑞一达生物科技有限公司 一种msln嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022119900A (ja) 2022-08-17
US20230000964A1 (en) 2023-01-05
JP7082055B2 (ja) 2022-06-07
US11413340B2 (en) 2022-08-16
US20190000944A1 (en) 2019-01-03
EP3393504A1 (en) 2018-10-31
MA44140A (fr) 2021-05-19
JP2018538339A (ja) 2018-12-27
WO2017112741A1 (en) 2017-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230000964A1 (en) Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
JP6860623B2 (ja) キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
JP7219376B2 (ja) キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防
US10851166B2 (en) Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
JP7054622B2 (ja) ヒト化抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体を使用した癌の処置
JP6736540B2 (ja) Ｃｌｌ−１キメラ抗原受容体を使用した癌の処置
JP2021526814A (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
CN110214150A (zh) 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
CN109153714A (zh) 表达多重嵌合抗原受体(car)分子的细胞及其用途
CN108633287A (zh) 功效增强的car t细胞治疗
CN108473957A (zh) 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
CN107108744A (zh) 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
CN107580628A (zh) 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
JPWO2019241426A5 (zh)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination