ES2805475T3

ES2805475T3 - Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33

Info

Publication number: ES2805475T3
Application number: ES15745069T
Authority: ES
Inventors: Saad Kenderian; Jennifer Brogdon; Hilmar Ebersbach; Saar Gill; David Glass; Thomas Huber; Julia Jascur; Joan Mannick; Michael C Milone; Leon Murphy; Celeste Richardson; Reshma Singh; Huijuan Song; Qilong Wu; Jiquan Zhang
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2035-07-21
Also published as: EP3722316A1; US10851166B2; CO2017000510A2; US9777061B2; JP2017522880A; IL250138B; JP2021087430A; SG11201700416TA; US20250353916A1; MX390943B; EP3172234A1; US12338287B2; CN107109419B; ZA201700157B; TW201619379A; TWI719942B; EP3172234B1; AU2015292755B2; MX2017001008A; JP6831777B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR) que se une específicamente a CD33, donde el CAR comprende un dominio de unión a CD33 humano, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC), una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde: (a) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 93, 102, 111, 120 y 129, respectivamente; (b) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 269, 278, 287, 296, 305 y 314, respectivamente; (c) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 323, 332, 341, 350, 359 y 368, respectivamente; (d) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 85, 94, 103, 112, 121 y 130, respectivamente; (e) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 270, 279, 288, 297, 306 y 315, respectivamente; (f) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 324, 333, 342, 351, 360 y 369, respectivamente; (g) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 87, 96, 105, 114, 123 y 132, respectivamente; (h) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 272, 281, 290, 299, 308 y 317, respectivamente; (i) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 326, 335, 344, 353, 362 y 371, respectivamente; (j) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88, 97, 106, 115, 124 y 133, respectivamente; (k) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 273, 282, 291, 300, 309 y 318, respectivamente; (l) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 327, 336, 345, 354, 363 y 372, respectivamente; (m) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89, 98, 107, 116, 125 y 134, respectivamente; (n) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 274, 283, 292, 301, 310 y 319, respectivamente; (o) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 328, 337, 346, 355, 364 y 373, respectivamente; (p) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 90, 99, 108, 117, 126 y 135, respectivamente; (q) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275, 284, 293, 302, 311 y 320, respectivamente; (r) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 329, 338, 347, 356, 365 y 374, respectivamente; (s) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 92, 101, 110, 119, 128 y 137, respectivamente; (t) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 277, 286, 295, 304, 313 y 322, respectivamente; o (u) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 331, 340, 349, 358, 367 y 376, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33

Esta solicitud reivindica prioridad respecto a la Solicitud de PCT N.° PCT/CN2014/082589, presentada el 21 de julio de 2014, y la Solicitud de PCT N.° PCT/CN2014/090504, presentada el 6 de noviembre de 2014.

Listado de Secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha presentado por vía electrónica en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 15 de julio de 2015, se llama N2067-7047WO3_SL.txt y tiene un tamaño de 323686 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al uso de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) modificadas para expresar un receptor antigénico quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) para tratar una enfermedad asociada con la expresión de la proteína del grupo de diferenciación 33 (CD33, por sus siglas en inglés).

Antecedentes de la invención

La mayoría de los pacientes con leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés) no se pueden curar utilizando la terapia estándar (Mrozek et al., 2012, J Clin Oncol, 30:4515-23) y aquellos con AML recurrente o refractaria (RR-AML, por sus siglas en inglés) tienen un pronóstico especialmente malo (Kern et al., 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al., 1999, Br J Haematol, 107:69-79).

La modificación genética puede conferir a los linfocitos T especificidad respecto a una diana preferida. Los linfocitos T se pueden transducir con material genético que codifica un fragmento variable monocatenario (scFv, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo, junto con una molécula de señalización, para utilizar de esta manera la región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) con el fin de reconocer un antígeno de la superficie celular de una manera no restringida por MHC. Estas células se denominan linfocitos T con receptor antigénico quimérico (CAR). Se ha logrado cierta actividad mediante esfuerzos preclínicos y clínicos por actuar sobre al menos 20 moléculas superficiales diferentes en diversas neoplasias malignas, sin embargo, estos esfuerzos a menudo se han visto limitados por una persistencia escasa del producto de linfocitos T CAR infundido (Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol 2009, 21:215-23). El reciente éxito con linfocitos T redirigidos anti-CD19 en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés) y leucemia linfocítica aguda (ALL, por sus siglas en inglés) avanzadas (Porter et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Transl Med, 3:95ra73; Grupp y Kalos, 2013, N Engl J Med, 368:1509-18) ha demostrado que estas células pueden erradicar una carga tumoral extensa después de una única infusión con una remisión de hasta 3 años hasta la fecha, lo cual subraya el enorme potencial de la terapia con linfocitos T-CAR. Se han realizado pocos esfuerzos preclínicos por actuar sobre la AML en modelos animales (Marin et al., 2010, Haematologica, 95:2144-52; Tettamanti et al., 2013, Br J Haematol, 161:389-401). Un pequeño ensayo clínico publicado recientemente demostró que es posible producir e infundir linfocitos T en pacientes con una neoplasia maligna agresiva (Ritchie et al., 2013, Mol Ther , noviembre de 2013;21(11):2122-9). Además de la capacidad del receptor antigénico quimérico de los linfocitos T modificados genéticamente de reconocer y destruir las células diana, una terapia con linfocitos T terapéuticos exitosa necesita tener la capacidad de proliferar y persistir a lo largo del tiempo, y de además detectar células leucémicas resistentes. La calidad variable de los linfocitos T, independientemente de que sea el resultado de anergia, supresión o agotamiento, puede afectar a la actuación de los linfocitos T transformados con CAR. En la actualidad, los profesionales sanitarios expertos tienen un control limitado sobre la variabilidad en la calidad de los linfocitos T. Para que sean efectivos, los linfocitos T de pacientes transformados con CAR necesitan persistir y mantener la capacidad de proliferar en respuesta al antígeno del CAR. Se ha mostrado que los linfocitos T de pacientes con ALL realizan pueden hacer esto con CART19 que comprende un scFv murino (remítase, por ejemplo, a Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)).

O'Hear et al., Blood (2013);122(21) se refiere a la terapia con un receptor antigénico quimérico anti-CD33 para la leucemia mieloide aguda. En Pizzitola et al., Leukemia (2014);1-10, se describen receptores antigénicos quiméricos contra CD33/ CD123.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente divulgación presenta una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD33 descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado descrito en la presente), un dominio transmembrana descrito en la presente y un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria).

En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado) comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado (por ejemplo, un scFv) comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o 9; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o 9.

En otros casos, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9. En casos, el dominio de unión a CD33 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En casos, el dominio de unión a CD33 comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9.

En algunos casos, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una, dos o la totalidad de CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9, y una, dos o la totalidad de CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una secuencia de aminoácidos secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:39-47, 57-65, 66-74 o 262-268. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado (por ejemplo, un scFv) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID No :39-47, 57-65, 66-74 o 262-268, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:39-47, 57-65, 66-74 o 262-268. En otro caso, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 57-65 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En otro caso, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 66-74 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 255-261 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligeraconector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En un caso, el CAR codificado incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, una proteína descrita en la presente, por ejemplo, seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, Cd 45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 6. En un caso, el dominio transmembrana codificado comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra codificada comprende la SEQ Id NO: 2 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica la región de bisagra comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente. En casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador. En casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primaria. En casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primaria.

En un caso, el dominio coestimulador codificado es un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM, por sus siglas en inglés), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), lTb R, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83. En casos, el dominio coestimulador codificado comprende 4-1BB, CD27, CD28 o ICOS.

En un caso, el dominio coestimulador codificado de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:379. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 380 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381. En un caso, el dominio coestimulador codificado de ICOS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:381. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 382 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En casos, el dominio de señalización primaria codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En casos, el dominio de señalización funcional de CD3 zeta comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 (CD3 zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3 zeta humano natural), o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de 4-1BB comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD28 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 379 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 380, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de ICOS y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 381 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 382, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, una CDR3 de LC, una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado descrito en la Tabla 2 o 9), o una secuencia con una identidad de un 95-99% con este; una región de bisagra descrita en la presente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; un dominio transmembrana descrito en la presente, por ejemplo, que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6; y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente (por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o un dominio coestimulador de CD27 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8), y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente (por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO:10). En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el constructo CAR incluye una secuencia líder codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de CAR de la SEQ ID N^o: 48, SEQ ID NO: 49,SEQ ⁱD NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56; o un aminoácido que tiene una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56; o o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, o SEQ ID NO: 56.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 o la SEQ ID NO:83, o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% respecto a una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, o SEQ ID NO:83.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un dominio de unión a CD33, donde el dominio de unión a CD33 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC.

En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la SEQ ID NO:66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 o 74) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la SEQ ID NO:57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65). En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de en la SEQ ID NO:39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46 o 47. En un caso, el dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73 o 74, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 o 74; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65. En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por la SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, s Eq ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, o una secuencia con un 95-99% de identidad con estas. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de dominio de unión a CD33 aislado (por ejemplo, un polipéptido, anticuerpo o fragmento de este) codificada por la molécula de ácido nucleico. En un caso, el dominio de unión a CD33 aislado comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, o una secuencia con un 95-99% de identidad con estas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de receptor antigénico quimérico (CAR) aislada (por ejemplo, polipéptido) que comprende un dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado que se une específicamente a CD33), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD33 descrito en la presente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado que se une específicamente a CD33 tal como se describe en la presente), un dominio transmembrana descrito en la presente y un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria descritos en la presente).

En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y/o región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD33 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 2 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos proporcionada en la Tabla 2 o 9; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos proporcionada en la Tabla 2 o 9.

En otros casos, el dominio de unión a CD33 comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC, y una CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9. En casos, el dominio de unión a CD33 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En casos, el dominio de unión a CD33 comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC)\ de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9.

En algunos casos, el dominio de unión a CD33 comprende una, dos o la totalidad de CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9, y una, dos o la totalidad de CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57-74 o SEQ ID NO:262-268; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente; o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente. En un caso, el dominio de unión a CD33 es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2 o 9, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD33 incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende un dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, una proteína descrita en la presente, por ejemplo, seleccionada del grupo constituido por la la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En un caso, el dominio de unión a CD33 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra codificada comprende la SEQ ID NO: 2 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente.

En casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula CAR aislada comprende un dominio coestimulador. En casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula CAR aislada comprende un dominio de señalización primaria. En casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula CAR aislada comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primaria.

En un caso, el dominio coestimulador comprende un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, Cd 27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83.

En un caso, el dominio coestimulador de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En otro caso, el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:379. En otro caso, el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8. En otro caso, el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:381.

En casos, el dominio de señalización primaria comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En casos, el dominio de señalización funcional de CD3 zeta comprende la SEQ ID NO: 9 (CD3 zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3 zeta humano natural), o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO:10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD28 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 379 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO:10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO:10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 379 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de ICOS y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 381 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende además una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente. En un caso, la secuencia líder comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula CAR aislada que comprende una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente, por ejemplo, una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, una CDR3 de LC, una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 descrito en la Tabla 2, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con este, una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente, por ejemplo, una región de bisagra de la SEQ ID NO: 2, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana descrito en la presente, por ejemplo, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia que tiene un 95-99% de identidad con esta, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente, por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o que tiene una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente, por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, o SEQ ID NO:56 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20 o 30 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 60, 50 o 40 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, o SEQ ID NO:56, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, o SEQ ID NO:56.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dominio de unión a CD33 que comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC.

En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la SEQ ID NO:66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 o 74) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la SEQ ID NO:57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65). En un caso, el dominio de unión a CD33 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 47. En un caso, el dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 o 74, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 o 74; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 o 65. En un caso, el dominio de unión a CD33 comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, y SEQ ID NO:47, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD33 es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2 o 9, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD33 incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesadaconector-región variable de la cadena ligera.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En un caso, el vector se selecciona del grupo constituido por un ADN, un a Rn , un plásmido, un vector lentivírico, vector adenovírico o un vector retrovírico.

En un caso, el vector es un vector lentivírico. En un caso, el vector comprende además un promotor. En un caso, el promotor es un promotor EF-1. En un caso, el promotor EF-1 comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 11. En otro caso, el promotor es un promotor de PGK, por ejemplo, un promotor de PGK truncado tal como se describe en la presente.

En un caso, el vector es un vector transcrito in vitro, por ejemplo, un vector que transcribe ARN de una molécula de ácido nucleico descrita en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A), por ejemplo, una cola de poli A descrita en la presente, por ejemplo, que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina (SEQ ID NO: 377). En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una 3'UTR, por ejemplo, una 3 'UTR descrita en la presente, por ejemplo, que comprende al menos una repetición de una 3'UTR derivada de la beta-globulina humana. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además un promotor, por ejemplo, un promotor de T2A.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una célula que comprende un vector descrito en la presente. En un caso, la célula es una célula descrita en la presente, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T humano, por ejemplo, un linfocito T humano descrito en la presente, o un linfocito NK humano, por ejemplo, un linfocito NK humano descrito en la presente. En un caso, el linfocito T humano es un linfocito T CD8+.

En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta, por ejemplo, como los descritos en la presente. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), CTLA4, VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR beta, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TIGIT, o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de cualquiera de estos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta como los descritos en la presente).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para producir una célula que comprende transducir una célula descrita en la presente, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria descrita en la presente, por ejemplo, un linfocito T descrito en la presente o un linfocito NK, con un vector de que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente.

La presente divulgación también proporciona un método para generar una población de células modificadas con ARN, por ejemplo, células descritas en la presente, por ejemplo, células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que expresan transitoriamente ARN exógeno. El método comprende introducir un a Rn transcrito in vitro o ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica una molécula CAR descrita en la presente.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una célula que expresa una molécula CAR descrita en la presente. En un caso, la célula es una célula efectora inmunitaria autóloga, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, la célula es una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, el mamífero es un ser humano, por ejemplo, un paciente con un cáncer hematológico.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un mamífero que padece una enfermedad asociada con la expresión de CD33 (por ejemplo, una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa y una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD33) que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente. En un caso, el mamífero es un ser humano, por ejemplo, un paciente con un cáncer hematológico.

En un caso, la enfermedad es una enfermedad descrita en la presente. En un caso, la enfermedad asociada con la expresión de CD33 se selecciona de una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia maligna, o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia, o es una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD33. En un caso, la enfermedad es un cáncer hematológico seleccionado del grupo constituido por uno o más leucemias agudas que incluyen, sin carácter limitante, leucemia mieloide aguda (AML); síndrome mielodisplásico; neoplasias mieloproliferativas; leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés); neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas; y a una enfermedad asociada con la expresión de CD33 que incluye, sin carácter limitante, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas que expresan CD33; y combinaciones de estas. En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente, se administran en combinación con un agente que aumenta la eficacia de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito en la presente.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para acondicionar a un sujeto antes de un trasplante de células que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la célula de que comprende una molécula CAR que se da a conocer en la presente. En un caso, el trasplante de células es un trasplante de células madre. El trasplante de células madre es un trasplante de células madre hematopoyéticas o un trasplante de médula ósea. En un caso, el trasplante de células es alogénico o autólogo.

En un caso, el acondicionamiento de un sujeto antes del trasplante de células comprende reducir el número de células que expresan CD33 en un sujeto. Las células que expresan CD33 en el sujeto son células normales que expresan CD33 o células cancerosas que expresan CD33 y, en algunos casos, la afección en el sujeto reducirá tanto células cancerosas como normales que expresan CD33 antes de un trasplante de células.

En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en al presente, se administran en combinación con una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR. Aunque sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que el tratamiento con una dosis baja, de potenciación inmunitaria (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir por completo el sistema inmunitario pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) está acompañado por un descenso en células efectoras inmunitarias positivas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o un aumento en células negativas para PD-1. Las células efectoras inmunitarias positivas para PD-1 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), pero no las células efectoras inmunitarias negativas para PD-1 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), se pueden agotar mediante unión con células que expresan un ligando de PD-1, por ejemplo, PD-L1 o PD-L2.

En un caso, se puede utilizar esta estrategia para optimizar el rendimiento de células CAR descritas en la presente en el sujeto. Aunque sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de células efectoras inmunitarias no modificadas, endógenas, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK. Aunque sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de de una célula que expresa un CAR CD33. En otros casos, las células, por ejemplo, células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o incrementa la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos n K.

En un caso, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK). En un caso, las células CAR se administran después de un tiempo suficiente, o una dosificación suficiente, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos n K, se haya incrementado, al menos de manera transitoria. En un caso, la célula, por ejemplo, célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK), que se va a modificar para expresar un CAR, se extrae después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente con la dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, en el sujeto o extraídas del sujeto se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En un caso, la presente divulgación proporciona un inhibidor de mTOR para su uso en el tratamiento de un sujeto, donde dicho inhibidor de mTOR potencia una respuesta inmunitaria de dicho sujeto, y donde dicho sujeto ha recibido o está recibiendo o está a punto de recibir una célula efectora inmunitaria que expresa un CAR CD33 tal como se describe en la presente.

En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente, se administran en combinación con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito en la presente.

En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente, se administran en combinación con un agente que trata la enfermedad asociada con CD33, por ejemplo, un agente descrito en la presente. En ciertos casos, la enfermedad asociada con CD33 es una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia maligna, o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia, o es una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD33.

En ciertos casos, la enfermedad asociada con CD33 es un cáncer hematológico seleccionado del grupo constituido por uno o más leucemias agudas que incluyen, sin carácter limitante, leucemia mieloide aguda (AML); síndrome mielodisplásico; neoplasias mieloproliferativas; leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés); neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas; y a una enfermedad asociada con la expresión de CD33 que incluye, sin carácter limitante, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas que expresan CD33; y combinaciones de estas.

En ciertos casos, un CAR CD33 descrito en la presente se dirige a una célula que expresa CD33. En casos, el CAR CD33 descrito en la presente se dirige a un blasto de MDS. En algunos casos, el blasto de MDS comprende una deleción de 5q (del(5q)). En casos, se utiliza una célula que expresa CAR CD33 descrita en la presente para tratar a un sujeto que padece MDS. En casos, se utiliza una célula que expresa CAR CD33 descrita en la presente para tratar a un sujeto que padece MDS asociado con del(5q) aislada.

En casos, un CAR CD33 descrito en la presente se dirige a una MDSC, por ejemplo, una MDSC en un paciente que padece un cáncer (por ejemplo, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica o neoplasias malignas sólidas tales como el cáncer de ovario, cáncer de colon o cáncer de mama). En casos, la MDSC es negativa para marcadores de linaje (LIN-), es negativa para HLA-DR y positiva para CD33. En algunos casos, una célula que expresa un CAR CD33 descrita en la presente se dirige a un blasto de MDS y una MDSC. En casos, se utiliza una célula que expresa un CAR CD33 descrita en la presente para tratar el mieloma múltiple, la leucemia linfocítica crónica (CLL) o neoplasias malignas sólidas tales como el cáncer ovárico, cáncer de colon o cáncer de mama.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un CAR de la divulgación, la molécula polipeptídica aislada de un CAR de la divulgación, el vector que comprende un CAR de la divulgación, y la célula que comprende un CAR de la divulgación para su uso como un medicamento, por ejemplo, tal como se describe en la presente.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un CAR de la divulgación, la molécula polipeptídica aislada de un CAR de la divulgación, el vector que comprende un CAR de la divulgación, y la célula que comprende un CAR de la divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad que expresa CD33, por ejemplo, una enfermedad que expresa CD33 como las que se describen en la presente.

Las características y casos adicionales de las composiciones y métodos mencionados anteriormente incluyen uno o más de los siguientes:

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD33 o un polipéptido CAR CD33 tal como se describe en la presente) o el dominio de unión a CD33 tal como se describe en la presente, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 3; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD33 o un polipéptido CAR CD33 tal como se describe en la presente) o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 tal como se describe en la presente, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de Hc y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 10; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 11; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3), que se proporcionan en la Tabla 12; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, c A r 33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 13; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33, o el dominio de unión a antígeno anti-CD33, incluye

(i) una CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9, o las CDR de LC en la Tabla 4, 9, 11 o 13; y/o.

(ii) una CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD33 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9, o las CDR de HC en la Tabla 3, 9, 10 o 12.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD33 o un polipéptido CAR CD33 tal como se describe en la presente), o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 tal como se describe en la presente, incluye: (1) tres CDR de la cadena ligera (LC) elegidas de una de las siguientes:

(i) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 111, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 120 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 129 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 112, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 121 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 130 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 113, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 122 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 131 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 114, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 123 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 132 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 115, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 124 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 133 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 116, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 125 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 134 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 117, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 126 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 135 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 118, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 127 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 136 de CAR33-8; o

(x) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 119, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 128 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 137 de CAR33-9; y/o

(2) tres CDR de la cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 84, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 93 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 102 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 85, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 94 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 103 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 86, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 95 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 104 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 87, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 96 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 105 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 88, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 97 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 106 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 89, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 98 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 107 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 90, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 99 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 108 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 91, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 100 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 109 de CAR33-8; o

(ix) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 92, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 101 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 110 de CAR33-9.

(i) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 296, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 305 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 314 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 297, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 306 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 315 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 298, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 307 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 316 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 299, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 308 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 317 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 300, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 309 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 318 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 301, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 310 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 319 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 302, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 311 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 320 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 303, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 312 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 321 de CAR33-8; o

(x) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 304, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 313 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 322 de CAR33-9; y/o

(2) tres CDR de la cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 269, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 278 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 287 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 270, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 279 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 288 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 271, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 280 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 289 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 272, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 281 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 290 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 273, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 282 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 291 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 274, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 283 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 292 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 275, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 284 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 293 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 276, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 285 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 294 de CAR33-8; o

(ix) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 277, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 286 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 295 de CAR33-9.

(i) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 350, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 359 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 368 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 351, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 360 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 369 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 352, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 361 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 370 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 353, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 362 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 371 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 354, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 363 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 372 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 355, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 364 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 373 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 356, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 365 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 374 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 357, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 366 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 375 de CAR33-8; o

(x) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 358, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 367 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 376 de CAR33-9; y/o

(2) tres CDR de la cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 323, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 332 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 341 de CAR33-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 324, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 333 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 342 de CAR33-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 325, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 334 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 343 de CAR33-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 326, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 335 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 344 de CAR33-4;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 327, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 336 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 345 de CAR33-5;

(vi) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 328, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 337 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 346 de CAR33-6;

(vii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 329, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 338 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 347 de CAR33-7;

(viii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 330, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 339 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 348 de CAR33-8; o

(ix) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 331, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 340 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 349 de CAR33-9.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD33 o un polipéptido CAR CD33 tal como se describe en la presente), o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 tal como se describe en la presente, incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de 2213 (SEQ ID NO: 142) o una secuencia de nucleótidos que codifica el scFv de 2213 (SEQ ID NO: 141), o un dominio de unión a antígeno de este (por ejemplo, un VH, VL, o una o más de sus CDR).

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD33 o un polipéptido CAR CD33 tal como se describe en la presente), o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 tal como se describe en la presente, incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de my96 (SEQ ID NO: 147), o un dominio de unión a antígeno de este (por ejemplo, un VH, VL, o una o más de sus CDR).

A menos que se definan de otro modo, todas las expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la puesta en práctica o evaluación de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados.

Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Los encabezamientos, subencabezamientos o elementos con números o letras, por ejemplo, (a), (b), (i), etc., se presentan únicamente para facilitar la lectura. El uso de encabezamientos o elementos con números o letras en este documento no requiere que los pasos o elementos se realicen en orden alfabético ni que los pasos o elementos sean necesariamente discretos entre sí. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones. Ciertos casos de la presente divulgación proporcionan realizaciones de la presente invención. Más particularmente, la presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción breve de los dibujos

La siguiente descripción detallada de los casos de la divulgación, incluidas las realizaciones preferidas de la invención, se entenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Con el objetivo de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos realizaciones que se prefieren en la presente. Se ha de entender, sin embargo, que la invención no se limita a las disposiciones e instrumentalidades exactas de las realizaciones que se muestran en los dibujos.

La Figura 1 es una imagen que demuestra que CD33 se expresa en la mayoría de los blastos en muchas muestras primarias de pacientes con AML (se seleccionaron los blastos de AML utilizando las características estándar de dispersión lateralbajaCD45tenue); n=35-46 por grupo.

Las Figuras 2A, 2B y 2C son gráficas y un perfil de citometría de flujo que muestran la expresión de CD33 en la médula ósea de pacientes con síndrome mielodisplásico. La Figura 2A muestra el porcentaje de células que expresan CD33 en el compartimento de células madre hematopoyéticas CD34+ CD38- en pacientes con MDS. La Figura 2B muestra el porcentaje de células que expresan CD33 en el compartimento CD34+ CD38+ que contiene progenitoras mieloides en pacientes con MDS. La Figura 2C es un histograma que muestra la intensidad de fluorescencia media de un paciente con MDS en el compartimento CD34+ CD38-.

La Figura 3 muestra una representación esquemática de constructos CAR utilizados en el Ejemplo 1. Todos son CAR de segunda generación que utilizan señalización de 41BB y CD3zeta. El scFv de CART33 se derivaba del clon MY9-6. La Figura 4 es una imagen que demuestra la actividad in vitro de CART33. Desgranulación de linfocitos T mediada por CART33: Se incubaron linfocitos T transducidos con CAR33 y no transducidos con la línea celular CD33+ MOLM14 y una línea celular de ALL de control NALM6 durante 4 horas en presencia de CD28, CD49d y monensina. Se midió la desgranulación CD107a (desgranulación por valoración de la expresión de CD107a) mediante citometría de flujo. La expresión de constructos CART33 tanto murinos como humanizados provoca desgranulación específica en presencia de MOLM14 (P<0,001).

La Figura 5 es una imagen que demuestra la actividad in vitro de CART33. Producción de citocinas: Tanto los linfocitos T que expresan CAR33 humanizados como murinos producen citocina después de su incubación con MOLM14. Se incubaron linfocitos T con la línea celular CD33+ MOLM14 y una línea celular de control NALM6 durante 4 horas. A continuación las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para detectar el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón gamma intracelulares. Las muestras se analizaron posteriormente mediante mediante citometría de flujo. La Figura 6 es una imagen que demuestra la actividad in vitro de CART33. Proliferación de linfocitos T que expresan CAR123 y CAR33: proliferación de CART33 humanizados y CART33 murinos en respuesta a MOLM14. Se marcaron linfocitos T con CFSE y se incubaron en condiciones de control o con MOLM14 durante 120 horas y se midió la dilución de CFSE mediante citometría de flujo como marcador de la proliferación.

Las Figuras 7A y 7B son dos gráficas que demuestran la actividad in vitro de CART33. Destrucción específica de linfocitos T que expresan CAR123, CAR33 humanizado y CAR33 murino: Se incubaron linfocitos T con MOLM14 o la línea celular de ALL Jurkat de linfocitos T (control) durante 24 horas. huCART33 provocó una muerte específica significativamente mayor en comparación con CART33 murino en relaciones de E:D bajas. En la Figura 7B, CART33-Jurkat se representa mediante triángulos, CART33-MOLM14 se representa mediante triángulos invertidos y CART123-MOLM14 se representa mediante cuadrados.

La Figura 8 es una imagen que demuestra que CART33 (bisagra de IgG4) y CART33 (bisagra de CD8) tienen actividad in vitro equivalente. Ensayo de desgranulación: Se incubaron CART33 (bisagra de IgG4), CART33 (bisagra de CD8), CART123 y linfocitos T no transducidos con la línea celular CD33+ MOLM14, y se midió la desgranulación CD107a mediante citometría de flujo. Ambos constructos CART33 experimentan desgranulación específica en presencia de MOLM14.

La Figura 9 es una imagen que demuestra que CART33 (bisagra de IgG4) y CART33 (bisagra de CD8) tienen actividad in vitro equivalente. Producción de citocinas: ambos constructos CAR33 y CAR123 inducen específicamente la producción de citocinas después de su incubación con la línea celular MOLM14. Se incubaron linfocitos T con MOLM14 durante 4 horas en presencia de CD28, CD49d y monensina. A continuación se extrajeron células, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para detectar el factor de necrosis tumoral alfa, MIP1a e interferón gamma. El porcentaje de células que producen citocinas se midió posteriormente mediante citometría de flujo.

La Figura 10 es una imagen que demuestra que CART33 (bisagra de IgG4) y CART33 (bisagra de CD8) tienen actividad in vitro equivalente. Proliferación de linfocitos T no transducidos de control, que expresan CAR33 (bisagra de IgG4) (es decir, CAR33-IgG4H), CAR33 (bisagra de CD8) (es decir, CAR33-CD8H) o CAR123 en respuesta a MOLM14. Los linfocitos T se marcaron con CFSE y se incubaron con MOLM14 durante 120 horas.

La Figura 11 es un diagrama esquemático que demuestra una comparación del efecto antitumoral in vivo de CART33-CD8H, CART33-IgG4H y CART123. Se inyectó la línea celular de AML MOLM14 en una dosis de 1x106 i.v. en ratones NOD-SCID-supresión de la cadena gamma común (NSG) y se obtuvieron imágenes del prendimiento del injerto después de 6 días. El día 7, los ratones se trataron con linfocitos T que expresan CAR33 (bisagra de IgG4), CAR33 (bisagra de CD8), CAR123 o vehículo de control (células no transducidas). El número total de linfocitos T inyectados fue de 2 x 106 i.v. Los ratones se controlaron obteniendo imágenes en serie semanalmente para evaluar la carga tumoral.

La Figura 12 es una imagen que demuestra un efecto antitumoral in vivo equivalente de los linfocitos T CART33-CD8H, CART33-IgG4H y CART123. Carga tumoral a lo largo del tiempo mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI, por sus siglas en inglés); datos de un experimento (n=5 por grupo), representativos de 4 experimentos independientes de los ratones mostrados en la Figura 11.

La Figura 13 es un diagrama esquemático que demuestra una comparación de la erradicación inducida por CART33 y CART123 de AML primaria in vivo. Se inyectó una muestra de AML primaria en una dosis de 5x106 i.v. en ratones NSG transgénicos para las citocinas humanas IL3/GM-CSF/SCF (ratones NSGS). El prendimiento del injerto se confirmó mediante una extracción de sangre retroorbital después de 2-4 semanas y a continuación los ratones se trataron con CART33, CART123 o vehículo de control (células no transducidas). El número total de linfocitos T inyectados fue de 1x105 i.v. Los ratones se controlaron con extracciones de sangre retroorbitales en serie para evaluar la carga de AML.

La Figura 14 es una imagen que demuestra que CART33 y CART123 producen una erradicación equivalente de AML primaria in vivo. Análisis de sangre periférica de ratones tratados con no transducidos (UTD), CART33 o CART123 antes de iniciar el tratamiento, el día 14 y el día 70. No se detectó AML de acuerdo con la configuración experimental descrita en la Figura 13 en los ratones tratados con CART33 o CART123.

La Figura 15 es una imagen que demuestra que CART33 y CART123 producen una erradicación equivalente de AML primaria in vivo. Sumario de la carga de la enfermedad medida por los blastos/ul de extracciones de sangre retroorbitales en diferentes puntos temporales según se indica de ratones en la configuración experimental descrita en la Figura 13. La Figura 16 es una imagen que demuestra que CART33 y CART123 producen una erradicación equivalente de AML primaria in vivo. Supervivencia de ratones tratados con CART33, CART123 o UTD (p<0,001 cuando el tratamiento con ya sea CART33 o CART123 se compara con UTD) de acuerdo con la configuración experimental descrita en la Figura 13. La Figura 17 es un diagrama esquemático que demuestra una configuración para evaluar la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33. Esquema del experimento: se extrajo sangre del seno retroorbital de ratones con sistema inmunitario humanizado (HIS) 6-8 semanas después de la inyección de células CD34+ humanas derivadas del hígado fetal para confirmar el prendimiento del injerto de células humanas. Los ratones se trataron a continuación con ya sea CART33 o UTD (1x106 células cada uno) y se controlaron mediante extracciones de sangre retroorbitales en serie semanalmente. Posteriormente los ratones se sacrificaron el día 28, y sus órganos se extirparon y se analizaron.

La Figura 18 es una imagen que demuestra la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33. Análisis de la sangre periférica (a través de una extracción de sangre retroorbital) mediante citometría de flujo del día 28 al final del experimento mostrado en la Figura 17. El tratamiento con CART33 conduce a una reducción significativa en las células mieloides y los monocitos de la sangre periférica en comparación con el tratamiento con linfocitos T no transducidos. La Figura 19 es una imagen que demuestra la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33. Estadígrafos descriptivos básicos del análisis de sangre periférica del día 28 de ratones tratados con CART33, UTD o sin tratamiento (n=5) del experimento mostrado en la Figura 17. CART33 provocó una toxicidad significativa en monocitos y células de linaje mieloide CD33+ con conservación relativa de linfocitos B y plaquetas.

La Figura 20 es una imagen que demuestra la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33. Representaciones gráficas del análisis de médula ósea mediante citometría de flujo el día 28 de ratones del experimento mostrado en la Figura 17. El tratamiento con CART33 dio como resultado una reducción significativa en las progenitoras mieloides (CD34+CD38+) y en células madre hematopoyéticas (CD34+CD38-), seleccionadas en singletes, huCD45ténue, negativas para marcadores de linaje.

La Figura 21 es una imagen que demuestra la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33. Se realizaron cortes del fémur de ratones del experimento mostrado en la Figura 17 en los ratones el día 28 después del tratamiento con linfocitos T UTD o células CART33. Se realizó una tinción de huCD45 y CD34 mediante IHC. No hay diferencia en huCD45 entre los linfocitos T de control y CART33, aunque ambos de estos grupos muestran menos tinción de huCD45 posiblemente indicativo de un efecto humano-anti-humano alogénico. Hubo una reducción específica de células CD34+ en ratones tratados con CART33. Los resultados son representativos de dos experimentos.

La Figura 22 es un diagrama esquemático que demuestra una configuración para evaluar la toxicidad hematopoyética de CART33 y CART123 in vivo. Esquema del experimento: Los ratones NSGS recibieron busulfán i.p. seguido de 2x106 células de médula ósea depletadas de linfocitos T de un donante normal el día siguiente. El prendimiento del injerto se confirmó mediante análisis por citometría de flujo de sangre periférica después de 4 semanas y los ratones se trataron posteriormente con 1x106 linfocitos T autólogos, transducidos con CART33, CART123 o UTD. Los ratones se controlaron posteriormente con una extracción de sangre retroorbital el día 7 y el día 14, y se sacrificaron para su necropsia el día 14. La Figura 23 es una imagen que demuestra que CART33 y CART123 producen una toxicidad hematopoyética in vivo equivalente. Se muestra una representación gráfica representativa del análisis de médula ósea de ratones del experimento mostrado en la Figura 22 mediante citometría de flujo el día 28. El tratamiento con CART33 y CART123 dio como resultado una reducción significativa en las progenitoras mieloides (CD34+CD38+) y en células madre hematopoyéticas (CD34+CD38-), seleccionadas en huCD45ténue, Lin-. Los resultados son representativos de dos experimentos.

La Figura 24 es una imagen que demuestra que CART33 y CART123 son células de médula de síndrome mielodisplásico (MDS) citotóxicas. Se incubó BM (siglas en inglés de médula ósea) enriquecida en CD34 de pacientes con MDS con ya sea UTD, CART33 (bisagra de IgG4), CART33 (bisagra de Cd 8) o CART123. Hubo una reducción en las células CD45ténueCD34+ en las muestras tratadas con c A r T33 o CART123.

La Figura 25 es un diagrama esquemático de un vector para la expresión de un CART33 murino.

La Figura 26 es un diagrama esquemático de un vector para la expresión de un CART33 humanizado.

La Figura 27 es una imagen que representa la expresión en la superficie celular de scFv en una línea de linfocitos T Jurkat, que contiene un indicador de luciferasa dirigido por un promotor regulado por NFAT (que se denominan células JNL). Se transdujeron células JNL con un vector lentivírico que expresa un ADNc que codifica GFP, un scFv que se une a CD19, o ADNc que codifican un scFv, que se generó contra hsCD33. La expresión en la superficie celular de scFv individuales en las JNL se detectó mediante la incubación de las células con hsCD33 marcado con Fc recombinante seguida de la incubación con un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina.

Las Figuras 28A, 28B, 28C y 28D son imágenes que muestran la capacidad de scFv individuales dirigidos a hsCD33 para provocar actividad de NFAT en células JNL. Se cocultivaron células JNL que expresan scFv contra hsCD33 con líneas celulares MOLM13 o MOLP8, que expresan hsCD33 o carecen de expresión de hsCD33 en la superficie celular, respectivamente (Figura 28A; hsCD33, línea verde continua; control isotípico, línea gris discontinua y zona sombreada). La Figura 28B representa la activación de células JNL que expresan un scFv dirigido a hsCD33 en presencia de células MOLM13 (líneas continuas) o MOLP8 (líneas discontinuas). Se cultivaron en placas células JNL que expresan scFv individuales en relaciones diferentes de efectora (es decir, células JNL) respecto a diana (es decir, MOLM13 o MOLP8) y se analizaron para determinar la expresión de unidades de luciferasa relativas (RLU, por sus siglas en inglés) utilizando el ensayo de luciferasa Bright-Glo™ en el instrumento EnVision 24 horas después de la incubación. La Figura 28C es una versión de la Figura 28B, que representa la activación de células JNL en presencia de MOLM13. La Figura 28D es una versión de la Figura 28B, que representa la activación de células JNL en presencia de MOLP8.

Las Figuras 29A y 29B son paneles de imágenes que representan la actividad de scFv dirigidos a hsCD33 en linfocitos T primarios derivados de un donante. Se representa la expresión de scFv en la superficie celular de linfocitos T humanos primarios transducidos con un vector lentivírico que expresa un scFv que se dirige a hsCD33. La expresión de scFv se detectó incubando células con hsCD33 marcado con Fc recombinante y un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina tal como se describe en la Figura 27.

Las Figuras 30A y 30B son imágenes que representan la actividad proliferativa de linfocitos T que expresan scFv dirigidos a CD33. Se marcaron linfocitos T con CFSE y se cocultivaron en presencia de MOLM13 (Figura 30A, barra negra rellena), MOLP8 (Figura 30A, barra blanca vacía) o cultivados solos (Figura 30A, barra rayada) para evaluar la capacidad proliferativa de linfocitos T primarios UTD o células que expresan scFv dirigidos a hsCD33. Además, se evaluó la división celular dirigida por antígeno en linfocitos T primarios midiendo la intensidad de fluorescencia mediana (MFI, por sus siglas en inglés) de linfocitos T marcados con CFSE que expresan clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6, y -9 cocultivados con células MOLM13, MOLP8 o solos (Figura 30B).

La Figura 31 es una imagen que representa la actividad citolítica de linfocitos T que expresan scFV dirigidos a CD33. Para evaluar la actividad citolítica, se cultivaron en placas 25000 células MOLM13 con linfocitos T primarios que expresan scFv individuales en relaciones diferentes de efectora (es decir, linfocito T) respecto a diana (es decir, MOLM13) y se analizaron para determinar el grado de muerte de MOLM13 enumerando el número absoluto de células MOLM13 marcadas con CFSE después de 4 días en cultivo.

La Figura 32 es una imagen que representa la reactividad cruzada de linfocitos T que expresan scFv dirigidos a CD33 respecto a CD33 de macaco (cyCD33) mediante citometría de flujo. Se incubaron células JNL transducidas con un vector lentivírico que expresa scFv generados contra hsCD33 con ya sea hsCD33 marcado con Fc recombinante (línea de puntos) o cyCD33 (línea continua), tras lo cual se realizó una incubación con un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina.

Las Figuras 33A y 33B representan la expresión de un CAR33 de ARNm en linfocitos T de donantes normales después de la electroporación. La Figura 33A es una serie de perfiles de citometría de flujo que muestran la expresión de CAR33 en la población de linfocitos T en los puntos temporales indicados. El porcentaje de células que expresan CAR33 (en los recuadros) se cuantifica y se muestra en el perfil. La Figura 33B es una representación gráfica del porcentaje de expresión de CAR33.

Las Figuras 34A y 34B comparan la expresión de CAR33 transducido lentivíricamente con CAR33 electroporado con ARNm. La Figura 34A muestra la expresión estable de CAR33 transducido lentivíricamente (CART33LV) en los tiempos indicados, a lo largo de 4 días. La Figura 34B muestra la expresión transitoria de CAR33 electroporado con ARNm (CART33 ARN) en los tiempos indicados, a lo largo de 4 días. La expresión de CAR33 se representa mediante la intensidad de fluorescencia media (MFI) en el eje de abscisas y el número total de células se representa en el eje de ordenadas.

Las Figuras 35A, 35B, 35C y 35D son representaciones gráficas que comparan la actividad citolítica de linfocitos T que expresan CD33 después de la transducción lentivírica o la electroporación con ARNm. El experimento se repitió 1 día (Figura 35A), 2 días (Figura 35B), 3 días (Figura 35C) y 4 días (Figura 35D) después de la electroporación de los linfocitos T. Las células CART33 se incubaron con la línea celular positiva para CD33 MOLM14 y una línea celular de linfoma de células del manto de control JEKO en las relaciones de E:D (efectora respecto a diana) indicadas en el eje de abscisas. El porcentaje de muerte en cada relación se indica en el eje de ordenadas.

Las Figuras 36A y 36B son representaciones gráficas que comparan la actividad citolítica de linfocitos T que expresan CD33 después de la transducción lentivírica o la electroporación con ARNm a lo largo del tiempo. La Figura 36A muestra la muerte específica de células CAR33 transducidas lentivíricamente en comparación con células CAR33 de ARN cuando se incuban con células MOLM14 en la relación de E:D (efector:diana) de 2:1 a lo largo de 4 días. La Figura 36B muestra la muerte específica de células CAR33 transducidas lentivíricamente en comparación con células CAR33 de ARN cuando se incuban con células MOLM14 en la relación de E:D (efector:diana) de 1:1 a lo largo de 4 días.

Las Figuras 37A, 37B, 37C y 37D muestran que las células CART33 presentan funciones efectoras in vitro robustas en respuesta a la línea celular CD33+ MOLM14 o a muestras de AML primaria. Las representaciones gráficas son representativas de cuatro experimentos independientes. La Figura 37A muestra la desgranulación CD107a. Se incubaron c A r T33, CART123 y linfocitos T no transducidos (UTD) con la línea celular CD33+/CD123+ MOLM14, PMA/ionomicina como estimulante de linfocitos T no específico positivo y la línea celular de ALL de linfocitos T de control Jurkat, en presencia de las moléculas coestimuladoras CD28, CD49d y monensina. Se midió la desgranulación CD107a mediante citometría de flujo después de 4 horas de incubación. La Figura 37B muestra la muerte específica de células que expresan CD33. Se incubaron CART33, CART123 y UTD con MOLM14-luc o Jurkat-luc durante 24 h en relaciones diferentes de E:D según se indica, y a continuación se realizó la obtención de imágenes de bioluminiscencia como una medida de las células vivas residuales. La línea negra/continua (cuadrados) representa CART123 incubado con MOLM14; la línea azul/de puntos (triángulos que apuntan hacia abajo/triángulos rellenos) representa CART33 incubado con MOLM14; y la línea roja/discontinua (triángulos que apuntan hacia arriba/triángulos vacíos) representa CART33 incubado con Jurkat. Las Figuras 37C y 37D muestran la proliferación de células CART33 en respuesta a células que expresan CD33. Se marcaron linfocitos T con CFSE y se incubaron con MOLM14, PMA/IONO como estimulante de linfocitos T no específico positivo, Jurkat como control negativo o muestras de AML durante 120 horas. El número de linfocitos T proliferantes fue significativamente mayor en respuesta a MOLM14 en comparación con Jurkat y fue comparable a CART123.

Las Figuras 38A, 38B y 38C muestran la producción de citocinas por parte de células CART33 en respuesta a células MOLM14 que expresan CD33. Se incubaron células CART33, Ca Rt 123 y UTD con MOLM14, PMA/ionomicina y Jurkat durante 4 horas. Posteriormente las células se fijaron y se permeabilizaron, se tiñeron para detectar 5 citocinas diferentes (factor de necrosis tumoral alfa, interferón gamma, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, proteína inflamatoria de macrófagos 1b e interleucina-2), y se realizaron análisis de citometría de flujo. La mayoría de las células CAR T33 producen más de una citocina en respuesta a MOLM14 (Figura 38A), similar a su respuesta a PMA/ionomicina (control positivo, Figura 38B). La Figura 38C muestra que la producción de IL-2, IFN-y, GM-CSF y TNF-a en respuesta a MOLM14 fue significativamente mayor en células Ca Rt 33 que CART123. Se incubaron células CART33, CART123 y UTD con MOLM14, Jurkat y PMA/ionomicina durante 24 horas. A continuación se extrajo el sobrenadante y se realizó un ensayo Luminex 30-plex. Los niveles del resto de citocinas se presentan en la Figura 39.

La Figura 39 es una serie de gráficas que muestran la comparación de la producción de citocinas por parte de células CART33 y CART123 en respuesta a m Ol M14. Se incubaron células CART33, CART123 y UTD con m Ol M14, Jurkat y PMA/ionomicina durante 24 horas. A continuación se extrajo el sobrenadante y se realizó un ensayo Luminex 30-plex para las citocinas indicadas.

La Figura 40 muestra la muerte específica de células MOLM14 que expresan CD33 in vitro. Se incubaron CART123, CART33 (bisagra de CD8) y CART33 (bisagra de IgG4) con MOLM14 en las relaciones de E:D indicadas y se evaluó la muerte mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia. CART33 (bisagra de IgG4) dio como resultado una muerte más específica que CART33 (bisagra de CD8) en una relación de E:D menor.

Las Figuras 41A, 41B y 41C muestran la actividad antitumoral en síndromes mielodisplásicos (MDS, por sus siglas en inglés). La Figura 41A es una gráfica que muestra la desgranulación CD107a específica en respuesta a células de médula ósea de pacientes con MDS. La Figura 41B es un conjunto de imágenes que muestran la muerte específica del clon de MDS que tiene deleción de 5q. La Figura 41C es una gráfica que muestra la cuantificación de clones con deleción de 5q remanentes después del tratamiento según se determina mediante FISH. Hubo una reducción significativa en el porcentaje de clones 5q- en el grupo tratado con CART33 cuando se compara con grupos de tratamiento con UTD y sin tratamiento.

Las Figuras 42A, 42B, 42C muestran los resultados del tratamiento con CART33 y la supervivencia de xenoinjertos prendidos de MOLM14. El esquema experimental se presenta en la Figura 11. En la Figura 42A, se cuantificó la carga tumoral a lo largo del tiempo mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI); datos de un experimento (n=5 por grupo), cada ratón se representa mediante una línea. La Figura 42B muestra la supervivencia combinada de tres experimentos independientes. El tratamiento con CART33 dio como resultado unas ventajas de supervivencia significativas en comparación con el tratamiento con UTD. La Figura 42C son imágenes de bioluminiscencia representativas de un experimento.

Las Figuras 43A y 43B muestran que el tratamiento con CART33 da como resultado una reducción dependiente de la dosis la carga de leucemia en xenoinjertos prendidos de MOLM14. La Figura 43A es una representación esquemática que muestra una configuración experimental descrita en el Ejemplo 6. La Figura 43B muestra la cuantificación de la carga tumoral a lo largo del tiempo según se mide mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI) en grupos diferentes.

La Figura 44 es una gráfica que muestra la carga tumoral a lo largo del tiempo según se mide mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI) en los diferentes grupos en la configuración experimental mostrada en la Figura 11.

La Figura 45 muestra que la combinación de ARN-CART33 y quimioterapia da como resultado una reducción adicional de la carga leucémica en xenoinjertos prendidos de MOLM14.

Las Figuras 46A y 46B muestran la capacidad de unión a anticuerpos de CD33 y CD123 en muestras de AML primaria y MOLM14 utilizadas para experimentos in vivo. El ensayo se realizó utilizando el kit QUANTUM SIMPLY CELLULa R (Bangs Laboratories, Inc). Las muestras se lavaron en tampón de flujo y después se tiñen con el anticuerpo indicado (CD33 o CD123) conjugado con PE. Las cinco microesferas diferentes provistas en el kit también se tiñeron con el mismo anticuerpo. La intensidad de fluorescencia media de la diana se comparó con la de las cinco microesferas y el valor de la capacidad de unión al anticuerpo se calculó a continuación según el protocolo de fabricación. La Figura 46A muestra la capacidad de unión al anticuerpo de MOLM14 para CD33 y CD123, mientras que la Figura 46B muestra la capacidad de unión al anticuerpo de las muestras primarias utilizadas en estos experimentos para CD33 y CD123.

La Figura 47 es una gráfica que muestra la proliferación mediante el recuento celular de diferentes linfocitos T-linfocitos T CART-33 (CD33-1 a CD33-9, o Upenn), linfocitos T CART-CD19 (CD19) o linfocitos T no transducidos (Cell), al exponerlos a células diana PL21, HL-60 o Mo LP8.

La Figura 48A es una gráfica que muestra el porcentaje de lisis de células diana HL-60-Luc al exponerlas a diferentes linfocitos T CART-33 (CD33-1 a CD33-9, o Upenn), linfocitos T CART-CD19 (CD19) o linfocitos T no transducidos (Cell) en diferentes relaciones de células efectoras respecto a diana. La Figura 48B es una gráfica que muestra el porcentaje de lisis de células diana PL21/Luc al exponerlas a diferentes linfocitos T CART-33 (CD33-1 a CD33-9, o Upenn), linfocitos T CART-CD19 (CD19) o linfocitos T no transducidos (Cell) en diferentes relaciones de células efectoras respecto a diana. La Figura 48C es una gráfica que muestra el porcentaje de lisis de células diana U87/Luc al exponerlas a diferentes linfocitos T CART-33 (CD33-1 a CD33-9, o Upenn), linfocitos T CART-CD19 (CD19) o linfocitos T no transducidos (Cell) en diferentes relaciones de células efectoras respecto a diana.

La Figura 49 es una gráfica que muestra la concentración de citocinas (interferón-gamma (IFN-y) humano, interleucina-2 (IL-2) humana y factor de necrosis tumoral (TNF) humano) producidas por diferentes linfocitos T CART-33 (CD33-1 a CD33-9, o Upenn), linfocitos T CART-CD19 (CD19) o linfocitos T no transducidos (Cell) al exponerlos a células diana PL21, HL60 o MOLP8.

La Figura 50A es una gráfica de citometría de flujo que muestra la estrategia de selección para MDSC. La Figura 50B es una gráfica que muestra el porcentaje de células negativas para marcadores de linaje, negativas para HLA-DR, CD33+ (LIN-HLDR-CD33+) en médulas óseas de donantes normales (ND BM) o de pacientes con síndrome mielodisplásico (MDS) (MDS BM). La Figura 50C es una gráfica que muestra el nivel de CD33 medido por la intensidad de fluorescencia media (MFI) en la población de MDSC (MDSC) en comparación con la población de MDS (MDS) y población de donantes normales (ND-BM).

La Figura 51A es un panel de gráficas de citometría de flujo que muestran el grado de desgranulación (nivel de CD107a) y la producción de citocinas (GM-CSF, IL-2, TNF-a) de CART33. La desgranulación CD107a y la producción de citocinas se muestran en el eje de ordenadas y CAR anti-CD33 en el eje de abscisas. El control negativo se muestra a la izquierda (Jurkat) y MDSC a la derecha. La Figura 51B es una gráfica que muestra la cuantificación de la desgranulación y la producción de citocinas por parte de CART33 frente a diferentes dianas-Jurkat, PMA/ionomicina (PMA/IONO), MDS (no MDSC) y MDSC.

La Figura 52A-52D muestra las diversas configuraciones en un único vector, por ejemplo, donde el ARNhc regulado por U6 está en dirección 5' o en dirección 3' respecto a los elementos que codifican CAR regulados por EF1 alfa. En los constructos a modo de ejemplo representados en la Fig. 52A y 52B, la transcripción ocurre mediante los promotores U6 y EF1 alfa en la misma dirección. En los constructos a modo de ejemplo representados en la Fig. 52C y 52D, la transcripción ocurre mediante los promotores U6 y EF1 alfa en direcciones diferentes. En la Figura 52E, el ARNhc (y el correspondiente promotor U6) está en un primer vector y el CAR (y el correspondiente promotor EF1 alfa) está en un segundo vector.

La Figura 53 representa las estructuras de dos configuraciones RCAR a modo de ejemplo. Los miembros de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de tipo interruptor. Los miembros de unión intracelulares comprenden un dominio de tipo interruptor, un dominio de señalización coestimulador y un dominio de señalización primaria. Las dos configuraciones demuestran que el primer y el segundo dominios de tipo interruptor descritos en la presente pueden estar en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión al antígeno y el miembro de unión intracelular. En la presente se describen en más detalle otras configuraciones RCAR.

La Figura 54 muestra que la proliferación de linfocitos T transducidos, que expresan CAR se ve fomentada por dosis bajas de RAD001 en un sistema de cultivo celular. Se cocultivaron CART con células Nalm-6 en presencia de diferentes concentraciones de RAD001. El número de linfocitos T positivos para CAR y positivos para c D3 (negro) y linfocitos T totales (gris) se evaluó después de 4 días de cocultivo.

La Figura 55 muestra medidas del crecimiento tumoral de células NALM6-luc con una dosificación diaria de 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg (mpk) de RAD001 o dosificación con vehículo. Los círculos indican el vehículo; los cuadrados indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los triángulos indican la dosis de 3 mg/kg de RAD001, los triángulos invertidos indican la dosis de 1 mg/kg de RAD001; y los rombos indican la dosis de 0,3 mg/kg de RAD001.

Las Figuras 56A y 56B muestran curvas farmacocinéticas (PK) que muestran la cantidad de RAD001 en la sangre de ratones NSG con tumores NALM6. La FIG. 56A muestra la PK el día 0 tras la primera dosis de RAD001. La FIG. 56B muestra la PK el día 14 tras la dosis final de RAD001. Los rombos indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los cuadrados indican la dosis de 1 mg/kg de RAD001; los triángulos indican la dosis de 3 mg/kg de RAD001; y las x indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001.

Las Figuras 57A y 57B muestran la proliferación in vivo de linfocitos CART CD19 humanizados con y sin dosificación de RAD001. Las dosis bajas diarias de RAD001 (0,003 mg/kg) conducen a un aumento de la proliferación de linfocitos T CAR, por encima de los niveles normales de proliferación de huCAR19. La Figura 57A muestra linfocitos T CAR CD4+; la FIG. 57B muestra linfocitos T CAR CD8+. Los círculos indican PBS; los cuadrados indican huCTL019; los triángulos indican huCTL019 con 3 mg/kg de RAD001; los triángulos invertidos indican huCTL019 con 0,3 mg/kg de RAD001; los rombos indican huCTL019 con 0,03 mg/kg de RAD001; y los círculos indican huCTL019 con 0,003 mg/kg de RAD001.

La Figura 58 es una gráfica que muestra el avance de la enfermedad AML en el xenoinjerto de HL-60-luc. Círculos azules: ratones tratados con 100ul de PBS a través de la vena de la cola; cuadrados rojos: ratones tratados con linfocitos T CAR CD19; triángulos verdes: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-1; triángulos morados invertidos: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-2; rombos naranja: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-4; cuadrados negros: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-5; triángulos marrones: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-6; círculos azules oscuros: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-7; y triángulos morados oscuros invertidos: ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR CD33-9.

Descripción detallada

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

El término «un» y «uno/a» se refiere a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.

El término «aproximadamente», cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, se pretende que abarque variaciones de ±20% o en algunos casos ±10%, o en algunos casos ±5%, o en algunos casos ±1%, o en algunos casos ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

La expresión «receptor antigénico quimérico» o, como alternativa, un «CAR», se refiere a un constructo polipeptídico recombinante que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmática (también denominado en la presente «un dominio de señalización intracelular») que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora tal como se define más adelante. En algunas realizaciones, los dominios en el constructo polipeptídico CAR están en la misma cadena polipeptídica, por ejemplo, comprenden una proteína de fusión quimérica. En algunas realizaciones, los dominios en el constructo polipeptídico CAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo, tal como se proporcionan en un RCAR como los descritos en la presente.

En un aspecto, la molécula estimuladora del CAR es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de linfocitos T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización primaria de CD3-zeta). En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora tal como se define más adelante. En un aspecto, la molécula coestimuladora se elige de 4-1BB (es decir, CD137), CD27, ICOS y/o CD28. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimulante. En un aspecto, el CAR comprende una secuencia líder opcional en el extremo amino (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En un aspecto, el CAR comprende además una secuencia líder en el extremo N del dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, donde la secuencia líder se escinde opcionalmente del dominio de reconocimiento del antígeno (por ejemplo, un scFv) durante el procesamiento celular y la ubicación del CAR en la membrana celular.

Un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de dominio único o TCR (por ejemplo, un dominio de unión de TCR alfa o dominio de unión de TCR beta)) que se dirige a un marcador tumoral X específico, donde X puede ser un marcador tumoral como los descritos en la presente, también se denomina CARX. Por ejemplo, un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige a CD33 se denomina CARCD33. El CAR se puede expresar en cualquier célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria tal como se describe en la presente (por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK).

La expresión «dominio de señalización» se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de rutas de señalización definidas generando segundos mensajeros o funcionando como efectores que responden a tales mensajeros.

Tal como se utiliza en la presente, el término «CD33» se refiere a la proteína del del grupo de diferenciación 33, que es un determinante antigénico detectable en células de leucemia así como en células precursoras normales de linaje mieloide. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos humanas y murinas se pueden encontrar en una base de datos pública, tal como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CD33 humana se puede encontrar con el N.° de acceso P20138 en el UniProt/Swiss-Prot y la secuencia de nucleótidos que codifica la CD33 humana se puede encontrar con el N.° de acceso NM_001772.3. En un aspecto, la porción de unión a antígeno del CAR reconoce y se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de la proteína CD33 o fragmentos de esta. En un aspecto, la proteína CD33 se expresa en una célula cancerosa. Tal como se utiliza en la presente, «CD33» incluye proteínas que comprenden mutaciones, por ejemplo, mutaciones puntuales, fragmentos, inserciones, deleciones y variantes de corte y empalme de la CD33 de tipo natural completa.

El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, multi- o monocatenarios, o inmunoglobulinas intactas, y pueden derivarse de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.

La expresión «fragmento de anticuerpo» se refiere a al menos una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes de este, y se refiere al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a una diana, tal como un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, sin carácter limitante, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, fragmentos de anticuerpo scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH camélidos y moléculas multiespecíficas formadas a partir de fragmentos de anticuerpo tales como un fragmento bivalente que comprende dos o más, por ejemplo, dos, fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra, o dos o más, por ejemplo, dos CDR aisladas u otros fragmentos de unión al epítopo de un anticuerpo ligados. Un fragmento de anticuerpo también se puede incorporar a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (remítase, por ejemplo, a Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). También se pueden injertar fragmentos de anticuerpo en esqueletos basados en polipéptidos tales como una fibronectina de tipo III (Fn3) (remítase a la Pat. de EE. UU. N.° 6703 199, que describe minicuerpos del polipéptido fibronectina).

El término «scFv» se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, donde las regiones variable de la cadena ligera y pesada están ligadas de manera contigua a través de un conector polipeptídico flexible corto, y capaz de expresarse como una única cadena polipeptídica, y en donde el scFv mantiene la especificidad del anticuerpo intacto del cual procede. A menos que se especifique, tal como se utiliza en la presente, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-conector-VH o puede comprender VH-conector-VL.

Las expresiones «región determinante de la complementariedad» o «CDR», tal como se utilizan en la presente, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad y afinidad de unión por el antígeno. Por ejemplo, en general, hay tres CDR en cada región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H, CDR3H) y tres Cd R en cada región variable de la cadena ligera (CDR1L, CDR2L, CDR3L). Los límites exactos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a Ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (esquema de numeración de «Kabat»), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración de «Chothia») o una combinación de estos. Con el esquema de numeración de Kabat, en algunas realizaciones, los residuos aminoacídicos de CDR en el dominio variable de la cadena pesada (VH) tienen la numeración 31-35 (CDR1H), 50-65 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H); y los residuos aminoacídicos de CDR en el dominio variable de la cadena ligera (VL) tienen la numeración 24-34 (CDR1L), 50-56 (CDR2L) y 89-97 (CDR3L). Con el esquema de numeración de Chothia, en algunas realizaciones, los aminoácidos de CDR en VH tienen la numeración 26-32 (CDR1H), 52-56 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H); y los residuos aminoacídicos de CDR en VL tienen la numeración 26-32 (CDR1L), 50-52 (CDR2L) y 91-96 (CDR3L). En un esquema de numeración combinado de Kabat y Chothia, en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos aminoacídicos que son parte de una CDR Kabat, una CDR Chothia o ambas. Por ejemplo, en algunos casos, las CDR corresponden a los residuos aminoacídicos 26-35 (CDR1H), 50-65 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H) en un VH, por ejemplo, un VH de mamífero, por ejemplo, un VH humano; y los residuos aminoacídicos 24-34 (CDr 1l ), 50-56 (CDR2L) y 89-97 (CDR3L) en un VL, por ejemplo, un VL de mamífero, por ejemplo, un VL humano.

La porción de la composición de CAR de la invención que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de este puede existir en diversas formas, por ejemplo, en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv) o, por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o fragmento de esta, que comprende al menos una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina. La expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En una realización, una molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, comprende una pluralidad de secuencias del dominio variable de inmunoglobulina, donde una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.

La expresión «cadena pesada de anticuerpo» se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo. La expresión «cadena ligera de anticuerpo» se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural. Las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) se refieren a los dos isotipos principales de la cadena ligera de anticuerpo.

La expresión «anticuerpo recombinante» se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión en levaduras. También se debe entender que la expresión se refiere a un anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y donde la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN recombinante o tecnología de secuencias de aminoácidos que está disponible y es muy conocida en la técnica.

El término «antígeno» o «Ag» se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede conllevar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluidas virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto entenderá que cualquier ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifica una proteína que provoca una respuesta inmunitaria, codifica, por lo tanto, un «antígeno» tal como se utiliza ese término en la presente. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos completa de un gen. Es muy obvio que la presente divulgación incluye, sin carácter limitante, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un «gen» en absoluto. Es muy obvio que un antígeno se puede generar sintetizado o puede derivarse de una muestra biológica, o podría ser una macromolécula además de un polipéptido. Una muestra biológica de este tipo puede incluir, sin carácter limitante, una muestra de tejido, una muestra tumoral, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.

La expresión «efecto antitumoral» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células tumorales, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células tumorales, una disminución de la supervivencia de células tumorales o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto antitumoral» también se puede poner de manifiesto por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la divulgación en la prevención de la aparición del tumor en primer lugar.

La expresión «efecto anticanceroso» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células cancerosas, una disminución de la supervivencia de células cancerosas o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto anticanceroso» también se puede poner de manifiesto por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos descritos para prevenir la aparición del cáncer en primer lugar. La expresión «efecto antitumoral» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de células tumorales o una disminución de la supervivencia de células tumorales.

El término «autólogo» se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo que luego se reintroducirá en el individuo.

El término «alogénico» se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente que es de la misma especie que el individuo en el que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente desde un punto de vista genético para interactuar de manera antigénica.

El término «xenogénico» se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término «aféresis» tal como se utiliza en la presente se refiere al proceso extracorpóreo reconocido en la técnica mediante el cual la sangre de un donante o paciente se retira del donante o paciente y se pasa a través de un aparato que separa el(los) componente(s) particular(es) seleccionado(s) y devuelve el resto a la circulación del donante o paciente, por ejemplo, mediante retransfusión. Por lo tanto, en el contexto de «una muestra de aféresis» se refiere a una muestra obtenida utilizando aféresis.

El término «combinación» se refiere a una combinación fija en una forma farmacéutica unitaria o a una administración combinada donde un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación (por ejemplo, otro fármaco tal como se explica más adelante, también denominado «agente terapéutico» o «coagente») se puede administrar de manera independiente a la vez o por separado dentro de intervalos de tiempo, especialmente cuando esos intervalos permiten que los miembros de la combinación muestren un efecto cooperativo, por ejemplo, sinérgico. Los diferentes componentes se pueden empaquetar en un kit o por separado. Uno o los dos componentes (por ejemplo, polvos o líquidos) se pueden reconstituir o diluir hasta una dosis deseada antes de la administración. Los términos «coadministración» o «administración combinada» o similares, tal como se utilizan en la presente, se pretende que abarquen la administración del componente de la combinación seleccionado a un único sujeto que lo necesite (por ejemplo, un paciente), y se pretende que incluyan pautas de tratamiento en las que los agentes no se administran necesariamente por la misma vía de administración o a la vez. La expresión «combinación farmacéutica», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un producto que es el resultado de la mezcla o combinación de más de un principio activo e incluye combinaciones tanto fijas como no fijas de los principios activos. La expresión «combinación fija» significa que los principios activos, por ejemplo, un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación, se administran ambos a un paciente simultáneamente en forma de una sola entidad o dosificación. La expresión «combinación no fija» significa que los principios activos, por ejemplo, un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación, se administran ambos a un paciente como entidades separadas ya sea de manera simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos, donde dicha administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esto último también se aplica a la politerapia, por ejemplo, la administración de tres o más principios activos.

El término «cáncer» se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas se pueden diseminar localmente o a otras partes del cuerpo a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático. En la presente se describen ejemplos de diversos cánceres e incluyen, sin carácter limitante, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares. Los términos «tumor» y «cáncer» se utilizan indistintamente en la presente, por ejemplo, ambos términos abarcan tumores sólidos y neoplasias hemolinfáticas, por ejemplo, difusos o circulantes. Tal como se utiliza en la presente, el término «cáncer» o «tumor» incluye cánceres y tumores tanto premalignos como malignos.

La expresión «derivado de», tal como se utiliza en la presente, indica una relación entre una primera y una segunda molécula. Se refiere de manera general a la similitud estructural entre la primera molécula y una segunda molécula, y no connota ni incluye una limitación, en cuanto a la fuente o el proceso, de una primera molécula que se deriva de una segunda molécula. Por ejemplo, en el caso de un dominio de señalización intracelular que se deriva de una molécula CD3zeta, el dominio de señalización intracelular mantiene suficiente estructura CD3zeta para que tenga la función requerida, en concreto, la capacidad para generar una señal en las condiciones apropiadas. No connota ni incluye una limitación a un proceso particular para producir el dominio de señalización intracelular, por ejemplo, no significa que, para proporcionar el dominio de señalización intracelular, se deba comenzar con una secuencia de CD3zeta y eliminar la secuencia no deseada, o imponer mutaciones, para conseguir el dominio de señalización intracelular.

La frase «enfermedad asociada con la expresión de CD33», tal como se utiliza en la presente, incluye, sin carácter limitante, una enfermedad asociada con una célula que expresa CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante) o una afección asociada con una célula que expresa CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante) que incluye, por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna, o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con una célula que expresa CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante). Para no dar lugar a dudas, una enfermedad asociada con la expresión de CD33 puede incluir una afección asociada con una célula que no expresa en la actualidad CD33, por ejemplo, porque la expresión de CD33 ha disminuido, por ejemplo, debido al tratamiento con una molécula dirigida a CD33, por ejemplo, un inhibidor de CD33 descrito en la presente, pero la cual expresó CD33 en algún momento. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante) es un cáncer hematológico. En un aspecto, un cáncer hematológico incluye, sin carácter limitante, leucemia mieloide aguda (AML), mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, mielofibrosis y neoplasias mieloproliferativas, leucemia linfoide aguda (ALL), tricoleucemia, leucemia prolinfocítica, leucemia mieloide crónica (CML), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas y similares. Otras enfermedades asociadas con la expresión de expresión de CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante) incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante). También se pueden incluir las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión de CD33 (por ejemplo, CD33 de tipo natural o mutante). En casos, una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD33 incluye, sin carácter limitante, por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria, (por ejemplo, lupus), trastornos inflamatorios (alergia y asma) y trasplante. En algunas realizaciones, la célula que expresa el antígeno tumoral expresa, o expresó en algún momento, ARNm que codifica el antígeno tumoral. En una realización, la célula que expresa el antígeno tumoral produce la proteína antigénica tumoral (por ejemplo, de tipo natural o mutante), y la proteína antigénica tumoral puede estar presente en niveles normales o niveles reducidos. En una realización, la célula que expresa el antígeno tumoral produjo niveles detectables de una proteína antigénica tumoral en algún momento, y posteriormente no produjo sustancialmente proteína antigénica tumoral detectable.

La expresión «modificaciones de secuencia conservadoras» se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras son unas en las que el residuo aminoacídico es reemplazado por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos aminoacídicos dentro de un CAR de la invención pueden ser reemplazados por otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR alterado se puede estudiar utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

El término «estimulación» se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando afín para mediar de esta manera en un evento de transducción de señales, tal como, sin carácter limitante transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de ciertas moléculas, tales como disminución regulada de TGF-p, y/o reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

La expresión «molécula estimuladora» se refiere a una molécula expresada por un linfocito T que proporciona la(s) secuencia(s) de señalización citoplasmática primaria que regula(n) la activación primaria del complejo TCR de manera estimuladora para al menos algún aspecto de la vía de señalización de linfocitos T. En un aspecto, la señal primaria se inicia, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, y que da lugar a la mediación de una respuesta de linfocitos T, que incluye, sin carácter limitante, proliferación, activación, diferenciación y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada «dominio de señalización primaria») que actúa de manera estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de una secuencia de señalización citoplasmática primaria que contiene ITAM que es de uso particular en la invención incluyen, sin carácter limitante, aquellos derivados de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS»), FcsRI y CD66d, DAP10 y DAP12. En un CAR específico de la invención, el dominio de señalización intracelular en uno o más CAR de la invención comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta. En un CAR específico de la invención, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 9 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un CAR específico de la invención, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia tal como se proporciona en la SEQ ID NO: 10 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

La expresión «célula presentadora de antígeno» o «APC» (por sus siglas en inglés) se refiere a una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, un linfocito B, una célula dendrítica y similares) que muestra un antígeno extraño complejado con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Los linfocitos T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de los linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés). Las APC procesan antígenos y los presentan a los linfocitos T.

Un «dominio de señalización intracelular», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a una porción intracelular de una molécula. En las realizaciones, el dominio de señalización intracelular transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada. Aunque se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar la cadena completa. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede utilizar en lugar de la cadena intacta, siempre que transduzca la señal de la función efectora. Se pretende, por tanto, que la expresión dominio de señalización intracelular incluya cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora. El dominio de señalización intracelular puede generar una señal que fomenta una función efectora inmunitaria de la célula que contiene CAR, por ejemplo, un linfocito CART o linfocito Nk que expresa CAR. Los ejemplos de la función efectora inmunitaria, por ejemplo, en un linfocito CART o linfocito NK que expresa CAR, incluyen actividad citolítica y actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primaria. Los dominios de señalización intracelular primaria a modo de ejemplo incluyen los derivados de las moléculas responsables de la estimulación primaria, o simulación dependiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladores a modo de ejemplo incluyen los derivados de las moléculas responsables de las señales coestimuladoras, o la simulación independiente de antígeno. Por ejemplo, en el caso de una célula efectora inmunitaria que expresa CAR, por ejemplo, linfocito CART o linfocito NK que expresa CAR, un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender una secuencia citoplasmática de un receptor de los linfocitos T, y un dominio de señalización intracelular coestimulador puede comprender una secuencia citoplasmática de una molécula correceptora o coestimuladora.

Un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender un motivo de señalización que se conoce como un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplasmática primaria que contienen ITAM incluyen, sin carácter limitante, aquellas derivadas de CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS»), FcsRI y CD66d, DAP10 y DAP12.

El término «zeta» o, como alternativa, «cadena zeta», «CD3-zeta» o «TCR-zeta» se define como la proteína proporcionada como N.° de acceso BAG36664.1 del GenBank, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, y un «dominio estimulador zeta» o, como alternativa, un «dominio estimulador CD3-zeta» o un «dominio estimulador de TCR-zeta» se define como los residuos aminoacídicos del dominio citoplasmático de la cadena zeta que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de los linfocitos T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 del N.° de acceso BAG36664.1 del GenBank o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, que son ortólogos funcionales de estos. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 9. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 10.

La expresión «molécula coestimuladora» se refiere a compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, y de esta manera media en una respuesta coestimuladora por parte del linfocito T, tal como, sin carácter limitante, proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores del antígeno o sus ligandos que se requieren para una respuesta inmunitaria eficaz. Las moléculas coestimuladoras incluyen, sin carácter limitante, una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83.

Un dominio de señalización intracelular coestimulador se refiere a la porción intracelular de una molécula coestimuladora.

El dominio de señalización intracelular puede comprender la porción intracelular completa, o el dominio de señalización intracelular nativo completo, de la molécula de la que procede, o un fragmento funcional de esta.

El término «4-1BB» se refiere al miembro de la superfamilia de TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como el N.° de acceso AAA62478.2 del GenBank, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares; y un «dominio coestimulador de 4-1BB» se define como los residuos aminoacídicos 214-255 del N.° de acceso AAA62478.2 del GenBank, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un aspecto, el «dominio coestimulador de 4-1 BB» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 7 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

La «célula efectora inmunitaria», según se utiliza el término en la presente, se refiere a una célula que participa en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de células efectoras inmunitarias incluyen los linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T alfa/beta y linfocitos T gamma/delta, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), mastocitos y fagocitos de origen mieloide.

La «función efectora inmunitaria o respuesta efectora inmunitaria», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a una función o respuesta, por ejemplo, de una célula efectora inmunitaria, que fomenta o promueve un ataque inmunitario de una célula diana. Por ejemplo, una función o respuesta efectora inmunitaria se refiere a una propiedad de un linfocito T o NK que promueve la muerte o la inhibición del crecimiento o proliferación, de una célula diana. En el caso de un linfocito T, la estimulación primaria y coestimulación son ejemplos de función o respuesta efectora inmunitaria.

La expresión «función efectora» se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

El término «codificante» se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de estos. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN, codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto a la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listas de secuencias, como a la hebra no codificante, utilizada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc, se les puede denominar codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique lo contrario, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pueda contener, en alguna versión, un(os) intrón(intrones).

Las expresiones «cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» se utilizan indistintamente en la presente, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describen en la presente, eficaz para lograr un resultado biológico particular. El término «endógeno» se refiere a cualquier material de un organismo, célula, tejido o sistema o producido dentro de estos.

El término «exógeno» se refiere a cualquier material introducido desde fuera de un organismo, célula, tejido o sistema o producido fuera de estos.

El término «expresión» se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por un promotor.

La expresión «vector de transferencia» se refiere a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede utilizar para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, sin carácter limitante, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, la expresión «vector de transferencia» incluye un virus o un plásmido que se replica de forma autónoma. La expresión también debe interpretarse para incluir además compuestos no plasmídicos y no víricos que facilitan la transferencia de ácido nucleico al interior de las células, tales como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposoma y similares. Los ejemplos de vectores de transferencia víricos incluyen, sin carácter limitante, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.

La expresión «vector de expresión» se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión ligadas operablemente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, incluidos los cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término «lentivirus» se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus ya que son capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los métodos más eficaces de un vector de suministro de genes. El HIV, SIV y FIV son ejemplos de lentivirus.

La expresión «vector lentivírico» se refiere a un vector derivado de al menos una porción de un genoma de lentivirus, que incluye especialmente un vector lentivírico autoinactivante como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453 1464 (2009). Otros ejemplos de vectores de lentivirus que se pueden utilizar en la clínica incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, la tecnología de suministro de genes LENTIVECTOR® de Oxford BioMedica, el sistema vectorial LENTIMAX™ de Lentigen y similares. También se puede disponer de tipos no clínicos de vectores lentivíricos y estos son conocidos para el experto en la técnica.

El término «homólogo» o «identidad» se refiere a la identidad secuencial de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 50%; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 90%.

Las formas «humanizadas» de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo de estos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo o fragmento de anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón (FR, por sus siglas en inglés) Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, un anticuerpo/fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de armazón importadas. Estas modificaciones pueden refinar y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo de este comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o una parte significativa de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, remítase a Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

La expresión «completamente humano» se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en que la molécula completa es de origen humano o está constituida por una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.

El término «aislado» significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está «aislado», pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales con los que coexiste en su estado natural está «aislado». Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en una forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo, tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que se producen de manera habitual. «A» se refiere a adenosina, «C» se refiere a citosina, «G» se refiere a guanosina, «T» se refiere a timidina y «U» se refiere a uridina.

La expresión «ligado operablemente» o «control transcripcional» se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heterólogo que da como resultado la expresión de este último. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está ligada operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está ligado operablemente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN ligadas operablemente pueden ser contiguas entre sí y, por ejemplo, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

La expresión administración «parenteral» de una composición inmunógena incluye, por ejemplo, la inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, intratumoral o técnicas de infusión.

La expresión «ácido nucleico» o «polinucleótido» se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y sus polímeros, ya sea en forma mono- o bicatenaria. A menos que se limite de forma específica, la expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen unas propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también engloba de forma implícita variantes modificadas de forma conservadora de esta (por ejemplo, sustituciones del codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como también la secuencia indicada de forma explícita. Específicamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o su totalidad) se sustituya con residuos de desoxiinosina o base mixta (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos «péptido», «polipéptido» y «proteína» se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto que comprende residuos aminoacídicos unidos de forma covalente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se limita el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia proteica o peptídica. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se alude comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que generalmente se alude en la técnica como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. Los «polipéptidos» incluyen, por ejemplo, fragmentos con actividad biológica, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante o una combinación de estos.

El término «promotor» se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

La expresión «secuencia promotora/reguladora» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico ligado operablemente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica para el tejido.

El término promotor «constitutivo» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o la totalidad de condiciones fisiológicas de la célula.

La expresión promotor «inducible» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando está presente en la célula un inductor que corresponde al promotor.

La expresión promotor «específico para el tejido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especificado por un gen, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

Las expresiones «antígeno asociado al cáncer» o «antígeno tumoral» se refieren indistintamente a una molécula (normalmente una proteína, carbohidrato o lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido) y que es útil para la actuación preferencial de un agente farmacológico sobre la célula cancerosa. En algunos casos, el antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, por ejemplo, un marcador de linaje, por ejemplo, CD19 en linfocitos B. En algunos casos, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sobreexpresa en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, una sobreexpresión con un factor de 1, una sobreexpresión con un factor de 2, una sobreexpresión con un factor de 3 o más en comparación con una célula normal. En algunos casos, un antígeno tumoral es una molécula de superficie celular que se sintetiza de manera inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene deleciones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunos casos, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido) y no se sintetiza o expresa en la superficie de una célula normal. En algunos casos, los CAR de la presente divulgación incluyen CAR que comprenden un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado en MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas rellenan las cavidades de las moléculas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y son reconocidos por los receptores de los linfocitos T (TCR) en linfocitos T CD8+. Los complejos de la clase I del MHC son expresados de manera constitutiva por todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos péptido/MHC específicos del virus y/o específicos del tumor representan una clase única de dianas de la superficie celular para la inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos similares a TCR que tienen como diana péptidos derivados de antígenos víricos o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA)-A1 o HLA-A2 (véanse, por ejemplo, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21 ):1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Por ejemplo, se puede identificar un anticuerpo similar a TCR cribando una colección, tal como una colección de presentación en fagos de scFv humano.

La expresión «antígeno de refuerzo de tumor» o «antígeno de refuerzo de cáncer» se refiere indistintamente a una molécula (normalmente una proteína, carbohidrato o lípido) que se expresa en la superficie de una célula que, de por sí, no es cancerosa, pero refuerza las células cancerosas, por ejemplo, fomentando su crecimiento o supervivencia, por ejemplo, resistencia a células inmunitarias. Las células de este tipo a modo de ejemplo incluyen células estromales y células supresoras de origen mieloide (MDSC, por sus siglas en inglés). No es necesario que el propio antígeno de refuerzo de tumor desempeñe un papel en el refuerzo de las células tumorales siempre y cuando el antígeno esté presente en una célula que refuerce células cancerosas.

La expresión «conector polipeptídico flexible» o «conector», tal como se utiliza en el contexto de un scFv, se refiere a un conector peptídico constituido por aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina utilizados solos o combinados, para conectar regiones de la cadena pesada variables y de la cadena ligera variables. En una realización, el conector polipeptídico flexible es un conector Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), donde n es un número entero positivo igual a o superior a 1. Por ejemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 y n=6, n=7, n=8, n=9 y n=10. En una realización, los conectores polipeptídicos flexibles incluyen, sin carácter limitante, (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:27) o (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:28). En otra realización, los conectores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (GlyaSer) (SEQ ID NO:29). También se incluyen dentro del alcance de la invención los conectores descritos en el documento WO2012/138475.

Tal como se utiliza en la presente, una caperuza 5' (también denominada una caperuza de ARN, una caperuza de ARN 7-metilguanosina o una caperuza de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que ha sido añadido al extremo «frontal» o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. La caperuza 5' está constituida por un grupo terminal que está ligado al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crucial para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección contra las RNasas. La adición de la caperuza está acoplada a la transcripción, y se produce a la vez que la transcripción, de modo que cada una influye en la otra. Poco después del comienzo de la transcripción, se une al extremo 5' del ARNm que está siendo sintetizado un complejo de síntesis de la caperuza asociado con ARN-polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que se requieren para la generación de la caperuza del ARNm. La síntesis prosigue como una reacción bioquímica de múltiples pasos. El resto de adición de la caperuza se puede modificar para modular la funcionalidad del ARNm tal como su estabilidad o eficacia de traducción.

Tal como se utiliza en la presente, «ARN transcrito in vitro» se refiere a ARN, preferentemente ARNm, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende un molde que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

Tal como se utiliza en la presente, un «poli(A)» es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de un constructo para la expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5000 (SEQ ID NO: 30), preferentemente más de 64, más preferentemente más de 100, de la manera más preferente más de 300 o 400. Las secuencias de poli(A) se pueden modificar por medios químicos o enzimáticos para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la ubicación, estabilidad o eficacia de la traducción.

Tal como se utiliza en la presente, el término «poliadenilación» se refiere al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola de poli(A) 3' es una secuencia larga de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) añadidos al pre-ARNm a través de la acción de una enzima, la poliadenilato - polimerasa. En eucariotas superiores, la cola de poli(A) se añade a transcritos que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por parte de exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción de ADN en ARN, pero además también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Después de finalizar la transcripción, la cadena de ARNm es escindida por la acción de un complejo de endonucleasa asociado con ARN-polimerasa. El sitio de escisión generalmente se caracteriza por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Después de que se haya escindido el ARNm, se añaden residuos adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

Tal como se utiliza en la presente, «transitorio» se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, donde el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o está contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula hospedadora.

Tal como se utilizan en la presente, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la reducción o mejora de la evolución, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o a la mejora de uno o más síntomas (preferentemente, uno o más síntomas discernibles) de un trastorno proliferativo que es el resultado de la administración de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos tales como un CAR de la invención). En realizaciones específicas, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico medible de un trastorno proliferativo, tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente perceptible por el paciente. En otras realizaciones los términos «tratar», «tratamiento» o «que trata» se refieren a la inhibición de la evolución de un trastorno proliferativo, ya sea de manera física, por ejemplo, estabilización de un síntoma perceptible, fisiológica, por ejemplo, estabilización de un parámetro físico, o ambas. En otras realizaciones, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la reducción o estabilización del tamaño tumoral o recuento de células cancerosas.

La expresión «ruta de transducción de señales» se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión «receptor de la superficie celular» incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

El término «sujeto» se pretende que incluya organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, un ser humano).

La expresión célula «sustancialmente purificada» se refiere a una célula que está esencialmente exenta de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células con las que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión se refiere simplemente a la célula que ha sido separada de las células con las que está normalmente asociada en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

El término «terapéutico», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un tratamiento. Se obtiene un efecto terapéutico por reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado patológico.

El término «profilaxis», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la prevención o el tratamiento protector para una enfermedad o estado patológico.

En el contexto de la presente invención, «antígeno tumoral» o «antígeno de un trastorno hiperproliferativo» o «antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo» se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno hiperproliferativo de la presente divulgación se derivan de cánceres que incluyen, sin carácter limitante, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y similares.

El término «transfectado» o «transformado» o «transducido» se refiere a un proceso por el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o introduce en la célula hospedadora. Una célula «transfectada» o «transformada» o «transducida» es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su progenie.

La expresión «se une específicamente» se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce una proteína que es un compañero de unión afín y se une a este (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o coestimuladora presente en un linfocito T) presente en una muestra, pero donde el anticuerpo o ligando no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en la muestra.

La expresión «receptor antigénico quimérico regulable (RCAR, por sus siglas en inglés)», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de polipéptidos, normalmente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula efectora inmunitaria, proporcionan a la célula especificidad por una célula diana, normalmente una célula cancerosa, y la generación de señales intracelulares. En algunas realizaciones, un RCAR comprende al menos un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (también denominado en la presente «un dominio de señalización intracelular») que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora y/o molécula coestimuladora tal como se define en la presente en el contexto de una molécula CAR. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos en el RCAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídicas. En algunas realizaciones, el RCAR incluye un interruptor de dimerización que, cuando está presente una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno con un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el RCAR se expresa en una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) también descrita en la presente, por ejemplo, una célula que expresa un RCAR (también denominada en la presente «célula RCARX»). En una realización, la célula RCARX es un linfocito T y se denomina linfocito RCART. En una realización, la célula RCARX es un linfocito NK y se denomina célula RCARN. El RCAR puede proporcionar a la célula que expresa el RCAR especificidad por una célula diana, normalmente una célula cancerosa, y la proliferación o generación de señales intracelulares regulables, que puede optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula que expresa el RCAR. En algunas realizaciones, una célula CAR depende, al menos en parte, de un dominio de unión al antígeno para proporcionar especificidad por la célula diana que comprende el antígeno al que se une el dominio de unión al antígeno.

El «anclaje a la membrana» o «dominio de fijación a la membrana», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a un polipéptido o resto, por ejemplo, un grupo miristoílo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.

El «dominio de tipo interruptor», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una entidad, normalmente una entidad de base polipeptídica, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de tipo interruptor. La asociación da como resultado un acoplamiento funcional de una primera entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un primer dominio de tipo interruptor, y una segunda entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un segundo dominio de tipo interruptor. Un primer y segundo dominios de tipo interruptor se denominan de manera global un interruptor de dimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son idénticos entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria y se denominan de manera global un interruptor de homodimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son diferentes entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos primarias y se denominan de manera global un interruptor de heterodimerización. En algunas realizaciones, el interruptor es intracelular. En algunas realizaciones, el interruptor es extracelular. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, basado en FRB o FKBP, y la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un scFv que se une al péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento de este, o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFv para myc. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un receptor para myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmento de este, por ejemplo, un anticuerpo para myc.

La «molécula de dimerización», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiera una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de tipo interruptor con un segundo dominio de tipo interruptor. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de manera natural en el sujeto, o no se producen concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

El término «bioequivalente» se refiere una cantidad de un agente que no es el compuesto de referencia (por ejemplo, RAD001), necesaria para producir un efecto equivalente al efecto producido por la dosis de referencia o cantidad de referencia del compuesto de referencia (por ejemplo, RAD001). En una realización, el efecto es el nivel de inhibición de mTOR, por ejemplo, tal como se mide en función de la inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, tal como se evalúa en un ensayo in vivo o in vitro, por ejemplo, tal como se mide con un ensayo descrito en la presente, por ejemplo, el ensayo Boulay, o la medida de los niveles de S6 fosforilada por inmunoelectrotransferencia. En una realización, el efecto es la alteración de la relación de células efectoras positivas para PD-1/negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, según se mide mediante clasificación celular. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que consigue el mismo nivel de inhibición de la cinasa P70 S6 que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que consigue el mismo nivel de alteración de la relación de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1/negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia.

La expresión «dosis baja, de potenciación inmunitaria» cuando se utiliza junto con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor catalítico de mTOR, se refiere a una dosis de un inhibidor de mTOR que inhibe parcial, pero no totalmente, la actividad de mTOR, por ejemplo, según se mide mediante la inhibición de la actividad cinasa de P70 S6. En la presente se analizan métodos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la cinasa P70 S6. La dosis es insuficiente para dar como resultado una supresión inmunitaria completa pero es suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado un descenso del número de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, y/o un incremento en el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o un incremento en la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) /células efectoras inmunitarias positivas para PD-1 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK).

En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado un incremento en el número de linfocitos T vírgenes. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado uno o más de los siguientes:

un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;

un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; y

un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;

donde cualquiera de los cambios descritos anteriormente se produce, por ejemplo, al menos de manera transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

El término «refractario» tal como se utiliza en la presente se refiere una enfermedad, por ejemplo, cáncer, que no responde a un tratamiento. En las realizaciones, un cáncer refractario puede ser resistente a un tratamiento antes o al comienzo del tratamiento. En otras realizaciones, el cáncer refractario se puede volver resistente durante un tratamiento. Un cáncer refractario también se denomina un cáncer resistente.

«Recurrente» o una «recaída» tal como se utiliza en la presente se refiere a la reaparición de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) o las señales y síntomas de una enfermedad tal como el cáncer después de un periodo de mejora o respuesta, por ejemplo, después del tratamiento anterior de una terapia, por ejemplo, terapia contra el cáncer. Por ejemplo, el periodo inicial de respuesta puede conllevar que el nivel de células cancerosas caiga por debajo de un cierto umbral, por ejemplo, por debajo de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o un 1%. La reaparición puede conllevar que el nivel de células cancerosas se eleve por encima de un cierto umbral, por ejemplo, por encima de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o un 1 %.

Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar en un formato de intervalo diversos aspectos de la invención. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo divulga específicamente todos los posibles subintervalos, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 divulga específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como también números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Como otro ejemplo, un intervalo tal como una identidad de un 95-99%, incluye algo con una identidad de un 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, e incluye subintervalos tales como una identidad de un 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% y un 98-99%. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

En la presente se proporcionan composiciones de materia y métodos de uso para el tratamiento o prevención de una enfermedad tal como el cáncer utilizando receptores antigénicos quiméricos (CAR) CD33.

En un aspecto, la divulgación proporciona varios receptores antigénicos quiméricos (CAR) que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado para unirse de manera específica a una proteína CD33 o fragmentos de esta. En un aspecto, la divulgación proporciona una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) modificada para expresar un CAR, donde la célula (por ejemplo, «CART») exhibe una propiedad antitumoral. En un aspecto, una célula se transforma con el CAR y el o al menos una parte del CAR se expresa en la superficie celular. En algunos casos, la célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito n K) se transduce con un vector vírico que codifica un c A r . En algunos casos, el vector vírico es un vector retrovírico. En algunos casos, el vector vírico es un vector lentivírico. En tales casos, la célula puede expresar de manera estable el CAR. En otro caso, la célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se transfecta con un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADNc, ADN, que codifica un c A r . En algunos de tales casos, la célula puede expresar de manera transitoria el CAR.

En un aspecto, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, el dominio de unión a CD33 humano o humanizado, del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv. En un aspecto, tales fragmentos de anticuerpo son funcionales en el sentido de que retienen la afinidad de unión equivalente, por ejemplo, se unen al mismo antígeno con una eficacia equiparable, a la del anticuerpo IgG que tiene las mismas regiones variables de la cadena pesada y ligera. En un aspecto, tales fragmentos de anticuerpo son funcionales en el sentido de que proporcionan una respuesta biológica que puede incluir, sin carácter limitante, activación de una respuesta inmunitaria, inhibición del origen de la transducción de señales de su antígeno diana, inhibición de la actividad cinasa y similares, como entenderá un experto.

En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación se incorporan a un receptor antigénico quimérico (CAR). En un aspecto, el CAR comprende la secuencia polipeptídica proporcionada en la presente como las SEQ ID NO: 48-56.

En un aspecto, la porción que es el dominio de unión a CD33, por ejemplo, dominio de unión a CD33 humanizado o humano, de un CAR de la divulgación está codificada por un transgén cuya secuencia ha experimentado optimización de codones para la expresión en una célula de mamífero. En un aspecto, todo el constructo CAR de la invención está codificado por un transgén cuya secuencia completa ha experimentado optimización de codones para la expresión en una célula de mamífero. La optimización de codones se refiere al descubrimiento de que la frecuencia de aparición de codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido) en el ADN codificante presenta un sesgo en diferentes especies. Una degeneración de codones de este tipo permite que un polipéptido idéntico esté codificado por diversas secuencias de nucleótidos. En la técnica se conocen diversos métodos de optimización de codones e incluyen, por ejemplo, los métodos divulgados en al menos las Patentes de EE. UU. N.os 5786464 y 6114 148.

En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en las SEQ ID NO:39-47. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 41. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 42. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 45. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 47. En un aspecto, los CAR de la divulgación combinan un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular. Por ejemplo, en algunos aspectos, la molécula de señalización intracelular incluye, sin carácter limitante, la cadena CD3-zeta, los módulos de señalización 4-1BB y CD28 y combinaciones de estos. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno se une a CD33. En un aspecto, el CAR CD33 comprende un CAR seleccionado de la secuencia proporcionada en una o más de las SEQ ID NOS: 48-56. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 48. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 49. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 50. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 51. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 52. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 53. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 54. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 55. En un aspecto, el CAR CD33 comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 56.

Además, la presente divulgación proporciona composiciones de CAR CD33 y su uso en medicamentos o métodos para tratar, entre otras enfermedades, cáncer o cualquier neoplasia maligna o enfermedades autoinmunitarias vinculadas con células o tejidos que expresan CD33.

En un aspecto, el CAR de la invención se puede utilizar para erradicar células normales que expresan CD33, y de esta manera tiene aplicación en el uso como una terapia de acondicionamiento celular antes del trasplante de células u otra terapia adecuada. El trasplante de células incluye el trasplante de células madre, por ejemplo, el trasplante de células madre hematopoyéticas, y el trasplante de médula ósea. El trasplante de células es alogénico o autólogo. En realizaciones, el CAR de la invención erradica células normales que expresan CD33 o células cancerosas que expresan CD33, o ambas, antes del trasplante de células u otra terapia adecuada. En un aspecto, la célula normal que expresa CD33 es una célula progenitora mieloide que expresa que expresa CD33 y el trasplante de células es un trasplante de células madre.

En un aspecto, la invención proporciona una célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito Nk ) modificada para expresar un receptor antigénico quimérico (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito n K, por ejemplo, CART) de la presente invención, donde la célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK, por ejemplo, «CART») exhibe una propiedad antitumoral. En consecuencia, la invención proporciona un CAR-CD33 que comprende un dominio de unión a c D33 y que se introduce en una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK), y métodos de su uso para la terapia adoptiva.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD33 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD33 humanizado. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo para CD33 que comprende un scFv. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR es un scFv para CD33 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo para CD33 humanizado que comprende un scFv. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR es un scFv para CD33 humanizado.

En un aspecto, el CAR-CD33 comprende al menos un dominio intracelular, por ejemplo, descrito en la presente, por ejemplo, seleccionado del grupo de un dominio de señalización de CD137 (4-1BB), un dominio de señalización de CD28, dominio de señalización de CD3zeta y cualquier combinación de estos. En un aspecto, el CAR-CD33 comprende al menos un dominio de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras que no son un CD137 (4-1BB) o CD28.

Receptor Antigénico Quimérico (CAR)

La presente divulgación también proporciona un CAR (por ejemplo, un polipéptido CAR) que comprende un dominio de unión anti-CD33 (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 tal como se describe en la presente), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9. El dominio de unión a CD33 del CAR puede comprender además una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9.

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican el CAR tal como se describe en la presente, por ejemplo, que codifican un CAR que comprende un dominio de unión a CD33 (por ejemplo, tal como se describe en la presente), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD33 codificado del CAR puede comprender además una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión de la cadena pesada anti-BMCA enumeradas en la Tabla 2 o 9.

En aspectos específicos, un constructo CAR de la divulgación comprende un dominio scFv humano seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS:39-47, donde el scFv puede estar precedido por una secuencia líder opcional tal como se proporciona en la SEQ ID NO: 1 y seguido por una secuencia de bisagra opcional tal como se proporciona en la SEQ ID No :2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o Se Q ID NO:5, una región transmembrana tal como se proporciona en la SEQ ID NO:6, un dominio de señalización intracelular que incluye la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:8 y una secuencia CD3 zeta que incluye la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, por ejemplo, donde los dominios son contiguos y están en el mismo marco de lectura para formar una única proteína de fusión. También se incluye en la presente divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv humanos seleccionados del grupo constituido por las s Eq ID NO:39-47. También se incluye en la presente divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv humanos seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID NO: 39-47, y cada uno de los dominios de las SEQ ID NOS: 1,2 y 6-9, más el CAR CD33 codificado de la invención.

En un aspecto, un constructo CARCD33 a modo de ejemplo comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión al antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio estimulador intracelular. En un aspecto, un constructo CARCD33 a modo de ejemplo comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión al antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio estimulador intracelular. Se proporcionan constructos CAR CD33 específicos que contienen dominios scFv humanizados de la divulgación como la SEQ ID NO: 138.

En algunos casos, las secuencias CAR CD33 completas también se proporcionan en la presente como las SEQ ID NOS: 48-56, tal como se muestra en la Tabla 2.

Se proporciona una secuencia líder a modo de ejemplo como la SEQ ID NO: 1. Se proporciona una secuencia de bisagra/espaciadora a modo de ejemplo como la Se Q ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5. Se proporciona una secuencia del dominio transmembrana a modo de ejemplo como la SEQ ID NO:6. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de la proteína 4-1BB como la s Eq Id NO: 7. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de CD27 como la SEQ ID NO:8. Se proporciona una secuencia del dominio CD3zeta a modo de ejemplo como la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

En un aspecto, la presente divulgación engloba un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a CD33, por ejemplo, descrito en la presente, por ejemplo, que es contiguo a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular y está en el mismo marco de lectura que esta. En un aspecto, un dominio de unión a CD33 humano se selecciona de una o más de las SEQ ID NOS:39-47. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 40. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 41. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 42. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 43. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 44. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 45. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, el dominio de unión a CD33 humano es la SEQ ID NO: 47.

En un aspecto, la presente divulgación engloba un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a CD33, por ejemplo, donde la secuencia es contigua a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular y está en el mismo marco de lectura que esta. Un dominio de señalización intracelular a modo de ejemplo que se puede utilizar en el CAR incluye, sin carácter limitante, uno o más dominios de señalización intracelular de, por ejemplo, CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR de la divulgación se selecciona de una o más de las SEQ ID NOS:75-83. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:75. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:76. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:77. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:78. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:79. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:80. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:81. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:82. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo c A r comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:83.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cribando colecciones de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que los incluye, o aislándolo directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándar. Como alternativa, el ácido nucleico de interés se puede producir por vías sintéticas, en lugar de clonarse. La presente invención incluye constructos vectoriales retrovíricos y lentivíricos que expresan un CAR que se puede utilizar para transducir directamente una célula.

La presente invención también incluye un constructo de ARN que se puede utilizar directamente para transfectar una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección conlleva la transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) de un molde con cebadores diseñados especialmente, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contiene la secuencia no traducida 3' y 5' («UTR»), una caperuza 5' y/o un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de una longitud de 50 a 2000 bases (SEQ ID NO:35). El ARN producido de esta manera se puede utilizar para transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, el molde incluye secuencias para el CAR. En una realización, un vector de ARN de CAR se transduce en un linfocito por electroporación.

Dominio de unión al antígeno

Los CAR de la presente divulgación comprenden un elemento de unión específico para la diana. La elección del resto depende del tipo y del número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno se puede elegir para reconocer un antígeno que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un estado patológico particular.

En un aspecto, la respuesta de linfocitos T mediada por CAR se puede dirigir a un antígeno de interés modificando un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno deseado en el CAR.

En un aspecto, el CAR de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une específicamente a CD33. En un aspecto, el CAR de la presente divulgación comprende un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD33 humano.

El dominio de unión al antígeno puede ser cualquier proteína que se une al antígeno incluidos, sin carácter limitante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un fragmento funcional de estos, incluidos, sin carácter limitante, un anticuerpo de dominio único tal como un dominio variable de la cadena pesada (VH), un dominio variable de la cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de un nanocuerpo procedente de un camélido, y a un esqueleto alternativo del que se sabe en la técnica que funciona como un dominio de unión al antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR.

Por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. Por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo. En un caso, el dominio de unión a CD33 humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 humano descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 humano descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD33 humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de la HC) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 humano descrito en la presente, por ejemplo, el dominio de unión a CD33 humano tiene dos regiones variables de la cadena pesada, comprendiendo cada una una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descritas en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD33 humano comprende una región variable de la cadena ligera humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 4) y/o una región variable de la cadena pesada humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 3). En un caso, el dominio de unión a CD33 humano comprende una región variable de la cadena pesada humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 3), por ejemplo, al menos dos regiones variables de la cadena pesada humana descritas en la presente (por ejemplo, en la Tabla 3). En un caso, el dominio de unión a CD33 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de las Tablas 3-4. En un caso, el dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un scFv) comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 4, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 5; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 4, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3. En un caso, el dominio de unión a CD33 humano comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:39-47, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. CD33 En un caso, el dominio de unión a CD33 humano es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 4, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 3, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD33 humano incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesadaconector-región variable de la cadena ligera.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizados. En un caso, el dominio de unión a CD33 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD33 humanizado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En un aspecto, el CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33 humanizado comprende las SEQ ID NOS: 143. En algunos aspectos, un anticuerpo no humano se humaniza, donde las secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para incrementar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano o fragmento de este. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno está humanizado. Los ejemplos de anticuerpos de CD33 para su uso con CART descritos en la presente incluyen hp67.6 o Gemtuzumab, tal como se describe en el documento WO2012123755.

Se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, injerto de CDR (véanse, por ejemplo, la Patente Europea N.° EP 239400; Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y las Pat. de EE. UU. N.os 5225539, 5530 101 y 5585 089, rebarnizado o rechapado (véanse, por ejemplo, las Patentes Europeas N.os EP 592 106 y EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91: 969-973, reordenamiento de cadenas (remítase, por ejemplo, a la Pat. de EE. UU. N.° 5565332), y técnicas divulgadas en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.°

US2005/0048617, la Pat. de EE. UU. N.° 6407213, la Pat. de EE.UU. N.° 5766886, Publicación Internacional N.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol, 169:1119-25 (2002), Caldas et a l, Protein Eng, 13(5):353-60 (2000), Morea et a l, Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem, 272(16):10678-84 (1997), Roguska et a l, Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). A menudo, los residuos de armazón en las regiones de armazón se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar la unión al antígeno. Estas sustituciones de armazón se identifican por métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de la CDR y los residuos de armazón para identificar residuos de armazón importantes para la unión al antígeno y la comparación secuencial para identificar residuos de armazón inusuales en posiciones particulares. (Remítase, por ejemplo, a Queen et al., Pat. de EE. UU. N.° 5585089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos que permanecen en él de una fuente que no es humana. A estos residuos aminoacídicos no humanos se les denomina a menudo residuos «importados», que típicamente se toman de un dominio variable «importado». Tal como se proporcionan en la presente, los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones de armazón donde los residuos aminoacídicos que comprenden el armazón se derivan completamente o en su mayoría de la línea germinal humana. En la técnica, múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo son muy conocidas y pueden realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), colocando CDR o secuencias de CDR de roedores en lugar de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239400; Publicación de PCT N.° WO 91/09967; y Pat. de EE. UU. N.os 4816 567; 6331 415; 5225 539; 5530 101; 5 585 089; 6548 640).

En anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanizados de este tipo, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados son a menudo anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de armazón (FR) son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo también se puede lograr mediante rebarnizado o rechapado (documentos EP 592 106; EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o reordenamiento de cadenas (Pat. de EE. UU. N.° 5 565 332).

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se pueden utilizar en la producción de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado método de «mejor ajuste», la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como el armazón (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

Otro método utiliza un armazón particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede utilizar el mismo armazón para diferentes anticuerpos humanizados (véanse, por ejemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

En algunos casos, la región de armazón, por ejemplo, las cuatro regiones de armazón, de la región variable de la cadena pesada se derivan de una secuencia de la línea germinal VH4_4-59. En un caso, la región de armazón puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente (por ejemplo, de la SEQ ID NO:138). En un caso, la región de armazón, por ejemplo, las cuatro regiones de armazón, de la región variable de la cadena ligera se derivan de una secuencia de la línea germinal VK3_1.25. En un caso, la región de armazón puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente (por ejemplo, de la SEQ ID n O:138).

En algunos aspectos, la porción de una composición de CAR de la divulgación que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Se puede disponer fácilmente de modelos tridimensionales de inmunoglobulina y los expertos en la técnica están familiarizados con ellos. Se puede disponer de programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidata seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno diana. De esta forma, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar de secuencias del receptor y de importación de modo que se logre la característica deseada de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un incremento de la afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos de CDR están directamente y muy sustancialmente implicados en influenciar la unión al antígeno.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado puede que retenga una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, por ejemplo, en la presente divulgación, la capacidad de unirse a CD33 o un fragmento de este. En algunos casos, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado puede que tenga una mejor afinidad y/o especificidad de unión a CD33 humano o un fragmento de este.

En un aspecto, la porción que es el dominio de unión al antígeno comprende una o más secuencias seleccionadas de las SEQ ID NOs:39-47. En un aspecto, el CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33 humano se selecciona de una o más secuencias seleccionadas de las SEQ ID NOs: 48-56.

En un aspecto, el dominio de unión a CD33 se caracteriza por características o propiedades funcionales particulares de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en un aspecto, la porción de una composición CAR de la divulgación que comprende un dominio de unión al antígeno se une específicamente a CD33 humano o un fragmento de este. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dominio de unión al antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde el dominio de unión del anticuerpo se une específicamente a una proteína CD33 o fragmento de esta, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48-56. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de un scFv seleccionado de las SEQ ID NO: 39-47. En ciertos aspectos, el scFv es contiguo a la secuencia líder y está en el mismo marco de lectura que esta. En un aspecto, la secuencia líder es la secuencia polipeptídica proporcionada como la SEQ ID NO:1.

En un aspecto, el dominio de unión a CD33 es un fragmento, por ejemplo, un fragmento variable monocatenario (scFv). En un aspecto, el dominio de unión a CD33 es un Fv, un Fab o un (Fab')2, o un anticuerpo híbrido bifuncional (por ejemplo, biespecífico) (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de estos de la presente divulgación se unen a la proteína CD33 o un fragmento de esta con una afinidad de tipo natural o potenciada.

En algunos casos, un scFv humano también puede derivarse de una colección de presentación. Una colección de presentación es una agrupación de entidades; cada entidad incluye un componente polipeptídico accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente polipeptídico. El componente polipeptídico se hace variar de manera que están representadas las diferentes secuencias aminoacídicas. El componente polipeptídico puede tener cualquier longitud, por ejemplo, de tres aminoácidos a más de 300 aminoácidos. Una colección de presentación puede incluir más de un componente polipeptídico, por ejemplo, las dos cadenas polipeptídicas de un Fab. En un caso a modo de ejemplo, una colección de presentación se puede utilizar para identificar un dominio de unión a CD33 humano. En una selección, el componente polipeptídico de cada miembro de la colección se explora con CD33 o un fragmento de este, y si el componente polipeptídico se une a CD33, el miembro de la colección de presentación se identifica, normalmente mediante retención en un soporte.

Los miembros de la colección de presentación retenidos se recuperan del soporte y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una selección posterior en condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, se pueden alternar selecciones positivas y negativas. El análisis también puede incluir determinar la secuencia de aminoácidos del componente polipeptídico, es decir, el dominio de unión anti-CD33, y la purificación del componente polipeptídico para una caracterización detallada.

Se pueden utilizar diversidad de formatos para las colecciones de presentación. Los ejemplos incluyen la presentación en fagos. En la presentación en fagos, el componente proteico está normalmente ligado de manera covalente a una proteína del recubrimiento del bacteriófago. La unión es el resultado de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente proteico fusionado a la proteína del recubrimiento. La unión puede incluir un conector peptídico flexible, un sitio de proteasa o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de parada. La presentación en fago se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 5223 409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al.

(1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Los bacteriófagos que presentan el componente proteico se pueden cultivar y extraer utilizando métodos de preparación de fagos estándar, por ejemplo, precipitación con PEG del medio de cultivo. Después de la selección de fagos de presentación individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes proteicos seleccionados se puede aislar a partir de células infectadas con los fagos seleccionados o a partir de los propios fagos, después de la amplificación. Se pueden recoger las colonias o placas individuales y se puede aislar y secuenciar el ácido nucleico.

Otros formatos de presentación incluyen la presentación en células (remítase, por ejemplo, al documento WO 03/029456), fusiones proteína/ácido nucleico (remítase, por ejemplo, al documento US 6207446), presentación en ribosomas (véanse, por ejemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35), y presentación periplásmica en E. coli (22 de noviembre de 2005;PMID: 16337958).

En algunos casos, los scFv se pueden preparar de acuerdo con un método conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de ScFv se pueden producir ligando regiones VH y VL entre sí utilizando conectores polipeptídicos flexibles. Las moléculas de scFv comprenden un conector (por ejemplo, un conector de Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizadas. La longitud del conector puede afectar en gran medida la forma en que las regiones variables de un scFv se pliegan e interactúan. De hecho, si se emplea un conector polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos) se evita el plegamiento intracatenario. También se requiere plegamiento intercatenario para unir las dos regiones variables con el fin de formar un sitio de unión al epítopo funcional. Para consultar ejemplos de orientación del conector y tamaño, véanse, por ejemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N.os 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 y publicaciones de PCT N.os WO2006/020258 y WO2007/024715.

Un scFv puede comprender un conector de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia conectora puede comprender cualquier aminoácido que se produce de forma natural. En algunas realizaciones, la secuencia conectora comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia conectora comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o superior a 1 (SEQ ID NO:25). En una realización, el conector puede ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:27) o (Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28). La variación en la longitud del conector puede retener o potenciar la actividad, lo que da lugar a una eficacia superior en estudios de actividad.

Constructos CAR CD33 humanos a modo de ejemplo y dominios de unión al antígeno

Los constructos CAR CD33 divulgados en la presente a modo de ejemplo comprenden un scFv (por ejemplo, un scFv humano tal como se divulga en las Tablas 2 y 9 de la presente, precedido opcionalmente por una secuencia líder opcional (por ejemplo, la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:12 para las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos líder a modo de ejemplo, respectivamente). Las secuencias de los fragmentos scFv humanos (SEQ ID NOs: 39-83, incluida la secuencia líder opcional) se proporcionan en la presente en la Tabla 2. Las secuencias de fragmentos scFv humanos, sin la secuencia líder, se proporcionan en la presente en la Tabla 9 (SEQ ID NOS: 255-261 para las secuencias de nucleótidos, y las SEQ ID NOs: 262-268 para las secuencias de aminoácidos). El constructo c A r CD33 puede incluir además un dominio bisagra opcional, por ejemplo, un dominio bisagra de CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:13); un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17); un dominio intracelular, por ejemplo, un dominio intracelular de 4-1Bb (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18); y un dominio de señalización funcional, por ejemplo, un dominio de CD3 zeta (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o 10, o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20 o 21). En ciertos casos, los dominios son contiguos y están en el mismo marco de lectura para formar una proteína de fusión única. En otros casos, los dominios están en polipéptidos separados, por ejemplo, como en una molécula RCAR tal como se describe en la presente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 completa incluye la secuencia de aminoácidos de, o es codificada por la secuencia de nucleótidos de, CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente (por ejemplo, un 95-99%) idéntica a estas.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33, o el dominio de unión a antígeno anti-CD33, incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 2 (con o sin la secuencia líder); o incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de, o es codificada por la secuencia de nucleótidos de, CAR33-1, CAR33-2, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 9, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 incluye la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, c A r 33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 3; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 10; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, CAR33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 11; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD33 o el dominio de unión a antígeno anti-CD33 incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 12; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de CAR33-1, CAR33-2, CAR33-3, CAR33-4, CAR33-5, CAR33-6, CAR33-7, c A r 33-8, CAR33-9, que se proporcionan en la Tabla 13; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

Las secuencias de las secuencias CDR humanas de los dominios scFv se muestran en la Tablas 3 para los dominios variables de la cadena pesada y en la Tablas 4 para los dominios variables de la cadena ligera. «ID» representa la SEQ ID NO respectiva para cada CDR. Las CDR proporcionadas en las Tablas 3 y 4 son según una combinación del esquema de numeración de Kabat y Chothia.

T l DR l mini ri l l n

Tabla 4. CDR del dominio variable de la cadena li era

Tabla 10: CDR del dominio variable de la cadena pesada según el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a Ed. Servicio Nacional de Salud, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD

Tabla 11: CDR del dominio variable de la cadena ligera según el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a Ed. Servicio Nacional de Salud, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD

Tabla 12: CDR del dominio variable de la cadena pesada según el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948

Tabla 13: CDR del dominio variable de la cadena ligera según el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948

En ciertos casos, la molécula CAR descrita en la presente (por ejemplo, el ácido nucleico CAR o el polipéptido CAR) o un dominio de unión a CD33 incluye:

(1) una, dos o tres CDR de la cadena ligera (LC) elegidas de una de las siguientes:

(2) una, dos o tres CDR de la cadena pesada (HC) de una de las siguientes:

En ciertos casos, la molécula CAR descrita en la presente (por ejemplo, el ácido nucleico CAR o el polipéptido CAR) incluye:

(2) una, dos o tres CDR de la cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:

En casos, se generan fragmentos variables monocatenarios (scFv) anti-CD33 completamente humanos y se clonan en un vector de expresión lentivírico con la cadena CD3zeta intracelular y el dominio coestimulador intracelular de 4-1BB. Los nombres de los scFv anti-CD33 com letamente humanos se muestran en la Tabla 1.

En casos, se hace variar el orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID NO:25), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:25) (por ejemplo, (G4S)s (SEQ ID NO:28) o (G4S)4(SEQ ID NO:27)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 3.

Las secuencias de los fragmentos scFv humanos a modo de ejemplo (SEQ ID NOS: 39-83, incluida la secuencia líder opcional) se proporcionan en la presente en la Tabla 2. Cabe señalar que los fragmentos scFv de las SEQ ID NOs: 39 83, sin una secuencia líder (por ejemplo, sin la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:12), también están englobados por la presente divulgación. Las secuencias de fragmentos scFv humanos a modo de ejemplo, sin la secuencia líder, se proporcionan en la presente en la Tabla 9 (SEQ ID NOS: 255-261 para las secuencias de nucleótidos, y las SEQ ID NOS: 262-268 para las secuencias de aminoácidos).

Líder (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 1)

MALPVTALLLPLALLLHAARP

Líder (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 12)

AT GGCCCT GCCT GT GAC AGCCCT GCT GCT GCCT CT GGCTCT GCT GCT GC AT GCCGCT

AGACCC

Bisagra de CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 2) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

Bisagra de CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 13) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGC

CCCT GTCCCT GCGCCC AGAGGCGT GCCGGCC AGCGGCGGGGGGCGC AGT GC AC ACGAGGG

GGCT GGACTT CGCCT GT GAT

Transmembrana de CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 6)

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

Transmembrana de CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 17)

ATCT AC AT CT GGGCGCCCTT GGCCGGGACTT GT GGGGT CCTT CTCCT GT C ACT GGTT

ATCACCCTTTACTGC

Dominio intracelular de 4-1BB (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 7) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

Dominio intracelular de 4-1 BB (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 18)

A A ACGGGGC AGA A AGA A ACT CCT GT AT AT ATTC A A AC A ACC ATTT AT GAGACC AGT

ACA A ACT ACT C A AGAGGA AGAT GGCT GT AGCT GCCGATTTCC AGA AGA AGA AGA AGGAGG

ATGTGAACTG

Dominio intracelular de CD28 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 379) RSKRSRLLIISDYMNMTPRRPGPTRKIIYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 379)

Dominio intracelular de CD28 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 380)

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTC CCCGCCGCCCCGGGCCC ACCCGC A AGC ATT ACC AGCCCT ATGCCCC ACC ACGCG ACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 380)

Dominio intracelular de ICOS (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 381)

T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T

L (SEQ ID NO: 381)

Dominio intracelular de ICOS (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 382)

AC A A A A A AGA AGT ATTC AT CC AGT GT GC ACGACCCT A ACGGT GA AT AC AT GTT C AT GAGAGC AGT GA AC AC AGCC A A A A A ATCC AGACT C AC AGAT GT GACCCT A (SEQ ID

NO: 382)

Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 9) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GL YNELQKDKM AE A Y SEIGMKGERRRGKGHDGL Y QGLST ATKDT YD ALHMQ ALPPR CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 20) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACC AGCT CT AT A ACGAGCTC A AT CT AGGACGA AGAGAGGAGT ACGAT GTTTT GG AC A AGAGAC GTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTG T AC A AT GA ACT GC AGAA AGAT A AGAT GGCGGAGGCCT AC AGT GAGATT GGG AT GA A AGGC GAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos; secuencia de referencia de NCBI NM_000734.3) (SEQ ID NO:10) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GL YNELQKDKM AE A Y SEIGMKGERRRGKGHDGL Y QGLST ATKDT YD ALHMQ ALPPR CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico; secuencia de referencia de NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:21) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG AACC AGCTCT AT A ACGAGCTC A ATCT AGGACGA AGAGAGGAGT ACG ATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACG ATGGCCTTT ACC AGGGTCTC AGT AC AGCC ACC A AGG AC ACCT ACG ACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

Bisagra de lgG4 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:36)

ESKY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEV QFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM

Bisagra de lgG4 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO:37)

GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGG ACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCC GAGGT GACCT GT GT GGT GGT GGACGT GT CCC AGGAGGACCCCGAGGTCC AGTTC A ACT GGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATA GC ACCT ACCGGGT GGT GT CCGT GCT GACCGT GCT GC ACC AGGACT GGCT GA ACGGC A AGG A AT AC A AGT GT A AGGT GT CC A AC A AGGGCCT GCCC AGC AGC AT CGAGA A A ACC ATC AGC A AGGCC A AGGGCC AGCCT CGGGAGCCCC AGGT GT AC ACCCT GCCCCCT AGCC A AGAGGAG A T GACC A AGA ACC AGGT GT CCCT GACCT GCCT GGT GA AGGGCTT CT ACCCC AGCGAC AT CGC CGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCT GGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCA GGAGGGC A ACGT CTTT AGCTGCTCCGT GAT GC ACGAGGCCCT GC ACA ACC ACT AC ACCC AG A AGAGCCT GAGCCT GTCCCT GGGC A AGAT G

En casos, estos clones contienen un cambio de residuo Q/K en el dominio de señal del dominio coestimulador derivado de la cadena CD3zeta.

Tabla 2: Constructos CAR CD33 humanos

Tabla 9. Secuencias de scFv de CAR CD33 humano

En casos, se clonan fragmentos scFv de CAR en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y utilizando un promotor, por ejemplo, el promotor EF1 alfa, para la expresión (s Eq ID NO: 11).

La SEQ ID NO: 11 Promotor EF1 alfa CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGG GGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGC CTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG CCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCC TTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCG AGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGC GAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGC TGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGG GCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGA GAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCC CTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGG AGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGT CCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTG GAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAA GTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCA AGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA

Gly/Ser (SEQ ID NO:25)

GGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:26):

Esta secuencia puede englobar 1-6 unidades repetidas de «Gly Gly Gly Gly Ser»

GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:27)

GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:28)

GGGGSGGGGS GGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:29)

GGGS

PoliA: (A)5000 (SEQ ID NO:30)

Esta secuencia puede englobar 50-5000 adeninas.

PoliA: (T)100 (SEQ ID NO:31)

PoliA: (T)5000 (SEQ ID NO:32)

Esta secuencia puede englobar 50-5000 timinas.

PoliA: (A)5000 (SEQ ID NO:33)

Esta secuencia puede englobar 100-5000 adeninas.

PoliA: (A)400 (SEQ ID NO:34)

PoliA: (A)2000 (SEQ ID NO:35)

Gly/Ser (SEQ ID NO:38): Esta secuencia puede englobar 1-10 unidades repetidas de «Gly Gly Gly Ser» GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS

Se proporcionan ejemplos adicionales de moléculas CAR o fragmentos de anticuerpo de estas en el Ejemplo 3. Se divulgan versiones murinas y humanizadas de un anticuerpo anti-CD33, 2213. Por ejemplo, el Ejemplo 3 proporciona lo siguiente: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de IgG4 anti-CD33 murina 2213 (SEQ iD NO: 138); la secuencia de nucleótidos de CAR de 2213 (SEQ ID NO: 139); la secuencia de aminoácidos de CAR de 2213 (SEQ ID NO: 140); la secuencia de nucleótidos de scFv de 2213 (SEQ ID NO: 141); y la secuencia de aminoácidos de scFv de 2213 (s Eq ID NO: 142); la secuencia de nucleótidos de IgG4H anti-CD33 humanizada 2218 (SEQ ID NO: 143).

Otros casos divulgados en el Ejemplo 3 incluyen moléculas CAR y fragmentos de anticuerpo anti-CD33 de Gemtuzumab ozogamicina comercializada previamente como Mylotarg) (por ejemplo, la versión humanizada descrita en la presente como «my96 humanizado»). La secuencia de aminoácidos de scFv anti-CD33 de Gemtuzumab ozogamicina (un inmunoconjugado que se dirige a CD33) con dominios de señalización de 41BB y CD3 zeta se describe en el Ejemplo 3; y la SEQ ID NO: 145. La secuencia de nucleótidos correspondiente de my96 humanizado se representa como la s Eq ID NO: 144. La secuencia de nucleótidos de my96 humanizado se proporciona en la presente como la SEQ ID NO: 146, y la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 147.

En un caso, el CAR CD33 y CART CD33 descritos en la presente comprenden un dominio de unión a antígeno que comprende una o más, por ejemplo, una, dos o tres, CDR del dominio variable de la cadena pesada y/o una o más, por ejemplo, una, dos o tres, CDR del dominio variable de la cadena ligera, o el VH o VL de la secuencia de scFv codificada por el n.° de referencia AM402974.1 del GenBank (Remítase a Wang et al., Mol. Ther., tomo 23:1, págs. 184-191 (2015).

Los fragmentos de scFv de CAR se pueden clonar en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y utilizando el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

El constructo CAR puede incluir un conector de Gly/Ser que tiene una o más de las siguientes secuencias: GGGGS (SEQ ID NO:25); que engloba 1-6 unidades repetidas de «Gly Gly Gly Gly Ser», por ejemplo, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO:28); GGGS (SEQ ID NO:29); o que engloba 1-10 unidades repetidas de «Gly Gly Gly Ser», por ejemplo, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO:38). En realizaciones, el constructo CAR incluye una secuencia de poliA, por ejemplo, una secuencia que engloba 50-5000 o 100-5000 adeninas (por ejemplo, la SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, s Eq iD n O:34 o SEQ ID NO:35), o una secuencia que engloba 50-5000 timinas (por ejemplo, la SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32). Como alternativa, el constructo CAR puede incluir, por ejemplo, un conector que incluye la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 383)

CAR biespecíficos

En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, el primer y segundo epítopos están en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y segundo epítopos se superponen. En una realización, el primer y segundo epítopos no se superponen. En una realización, el primer y segundo epítopos están en antígenos diferentes, por ejemplo, proteínas diferentes (o subunidades diferentes de una proteína multimérica). En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un primer epítopo y una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.

En ciertas realizaciones, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, uno biespecífico o uno triespecífico). En la técnica existe constancia de protocolos para generar moléculas de anticuerpo biespecífico o heterodimérico; que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, la estrategia de «botón en ojal» descrita en, por ejemplo, el documento US 5731168; el apareamiento de Fc por orientación debida a interacción electrostática tal como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 09/089004, WO 06/106905 y WO 2010/129304; formación de heterodímeros de Dominios Modificados por Intercambio de Hebras (SEED, por sus siglas en inglés) tal como se describe en, por ejemplo, el documento WO 07/110205; intercambio de la rama Fab tal como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 08/119353, WO 2011/131746 y WO 2013/060867; conjugado de anticuerpo doble, por ejemplo, entrecruzando anticuerpos para generar una estructura biespecífica utilizando un reactivo heterobifuncional que tiene un grupo reactivo de tipo amina y un grupo reactivo de tipo sulfhidrilo tal como se describe en, por ejemplo, el documento US 4433059; determinantes de anticuerpos biespecíficos generados recombinando la mitad de anticuerpos (pares de cadenas pesada-ligera o Fab) de diferentes anticuerpos mediante un ciclo de reducción y oxidación de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas, tal como se describe en, por ejemplo, el documento US 4444878; anticuerpos trifuncionales, por ejemplo, tres fragmentos Fab' entrecruzados mediante grupos reactivos de tipo sulfhidrilo, tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5273743; proteínas de unión biosintéticas, por ejemplo, un par de scFv entrecruzados a través de las colas carboxiterminales preferentemente a través de entrecruzamiento químico con reactivos de tipo amina o disulfuro tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5534254; anticuerpos bifuncionales, por ejemplo, fragmentos Fab con diferentes especificidades de unión dimerizados a través de cremalleras de leucina (por ejemplo, c-fos y c-jun) que han reemplazado el dominio constante tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5582996; receptores mono- y oligovalentes biespecíficos y oligoespecíficos, por ejemplo, las regiones VH-CH1 de dos anticuerpos (dos fragmentos Fab) ligados a través de un espaciador polipeptídico entre la región CH1 de un anticuerpo y la región VH del otro anticuerpo normalmente con cadenas ligeras asociadas tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5591828; conjugados de ADN-anticuerpo biespecíficos, por ejemplo, entrecruzando anticuerpos o fragmentos Fab a través de un fragmento bicatenario de ADN tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5635602; proteínas de fusión biespecíficas, por ejemplo, un constructo de expresión que contiene dos scFv con un conector peptídico helicoidal hidrófilo entre ellos y una región constante completa tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5637481; proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, por ejemplo, un dímero de polipéptidos que tiene un primer dominio con la región de unión de la región variable de la cadena pesada de Ig, y un segundo dominio con la región de unión de la región variable de la cadena ligera de Ig, denominados generalmente diacuerpos (también están englobadas estructuras de un orden superior para crear moléculas biespecíficas, triespecíficas o tetraespecíficas tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5837242; constructos de minicuerpos con cadenas VL y VH ligadas conectadas además con espaciadores peptídicos a una región de bisagra de un anticuerpo y una región CH3, que pueden dimerizar para formar moléculas biespecíficas/multivalentes tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5837821; dominios VH y VL ligados con un conector peptídico corto (por ejemplo, 5 o 10 aminoácidos) o sin conector en cualquier orientación, que pueden formar dímeros para formar diacuerpos biespecíficos; trímeros y tetrámeros tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5844094; una secuencia de dominios VH (o dominios VL en miembros de la familia) conectados por uniones peptídicas con grupos que se pueden entrecruzar en el extremo C asociados además con dominios VL para formar una serie de FV (o scFv), tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5864019; y los polipéptidos de unión monocatenarios con tanto un dominio VH como uno Vl ligados a través de un conector peptídico se combinan para obtener estructuras multivalentes mediante entrecruzamiento no covalente o químico para formar, por ejemplo, estructuras homobivalentes, heterobivalentes, trivalentes y tetravalentes utilizando tanto un formato de tipo scFv como de diacuerpo tal como se describe en, por ejemplo, el documento US5869620. Se pueden encontrar moléculas multiespecíficas y biespecíficas a modo de ejemplo adicionales y métodos para prepararlas, por ejemplo, en los documentos US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1.

Dentro de cada anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, scFv) de una molécula de anticuerpo biespecífico, el VH puede estar en dirección 5' o en dirección 3' de VL. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 5' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH1) en dirección 5' respecto a su VL (VL1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 3' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL2) en dirección 5' respecto a su VH (VH2), de modo que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VH1-VL1-VL2-VH2. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 5' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL1) en dirección 5' respecto a su VH (VH1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 3' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH2) en dirección 5' respecto a su VL (VL2), de modo que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VL1-VH1-VH2-VL2. Opcionalmente, se dispone un conector entre dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv), por ejemplo, entre VL1 y VL2 si el constructo se dispone como VH1-VL1-VL2-VH2, o entre VH1 y VH2 si el constructo se dispone como VL1-VH1-VH2-VL2. El conector puede ser un conector tal como se describe en la presente, por ejemplo, un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). En general, el conector entre los dos scFv debería ser lo suficientemente largo para evitar emparejamientos erróneos entre los dominios de los dos scFv. Opcionalmente, se dispone un conector entre el VL y VH del primer scFv. Opcionalmente, se dispone un conector entre el VL y VH del segundo scFv. En constructos que tienen múltiples conectores, dos o más cualesquiera de los conectores pueden ser idénticos o diferentes. En consecuencia, en algunas realizaciones, un CAR biespecífico comprende VL y VH y opcionalmente uno o más conectores en una disposición tal como se describe en la presente.

En un aspecto, la molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, un scFv, que tiene especificidad de unión por CD33, por ejemplo, que comprende un scFv tal como se describe en la presente, por ejemplo, tal como se describe en la Tabla 2 o Tabla 9, o comprende las CDR de la cadena ligera y/o CDR de la cadena pesada de un scFv CD33 descrito en la presente, y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo en un antígeno diferente. En algunos aspectos, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por un antígeno expresado en células de AML, por ejemplo, un antígeno que no es CD33. Por ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CD123. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CLL-1. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CD34. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por FLT3. Por ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por el receptor de folato beta. En algunos aspectos, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por un antígeno expresado en linfocitos B, por ejemplo, CD19, CD20, CD22 o ROR1.

TCR quimérico

En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo para CD33 de la presente divulgación (por ejemplo, los divulgados en las Tablas 2 y 9) se pueden injertar en uno o más dominios constantes de una cadena de un receptor de linfocitos T («TCR»), por ejemplo, una cadena alfa de TCR o cadena beta de TCR, para crear un TCR quimérico que se une específicamente a CD33. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que los TCR quiméricos señalizarán a través del complejo TCR tras la unión del antígeno. Por ejemplo, un scFv CD33 tal como se divulga en la presente, se puede injertar en el dominio constante, por ejemplo, al menos una porción del dominio constante extracelular, el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático, de una cadena de TCR, por ejemplo, la cadena alfa de TCR y/o la cadena beta de TCR. Como otro ejemplo, un fragmento de anticuerpo para CD33, por ejemplo, un dominio VL tal como se describe en la presente, se puede injertar en el dominio constante de una cadena alfa de TCR, y un fragmento de anticuerpo para CD33, por ejemplo, un dominio VH tal como se describe en la presente, se puede injertar en el dominio constante de una cadena beta de TCR (o como alternativa, un dominio VL se puede injertar en el dominio constante de la cadena beta de TCR y un dominio VH se puede injertar en una cadena alfa de TCR). Como otro ejemplo, las CDR de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD33, por ejemplo, las CDR de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD33 tal como se describe en las Tablas 3, 4, 10, 11, 12 o 13 se pueden injertar en una cadena alfa y/o beta de TCR para crear un TCR quimérico que se une específicamente a CD33. Por ejemplo, las LCDR divulgadas en la presente se pueden injertar en el dominio variable de una cadena alfa de TCR y las HCDr divulgadas en la presente se pueden injertar en el dominio variable de una cadena beta de TCR, o viceversa. Tales TCR quiméricos se pueden producir mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al., Cáncer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther, abril de 2012;19(4):365-74).

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, un CAR se puede diseñar para que comprenda un dominio transmembrana que esté unido al dominio extracelular del CAR. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región de transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que procede el dominio transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la cual procede la proteína transmembrana (por ejemplo, 1 , 2 , 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es uno que está asociado con uno de los otros dominios del CAR que se utiliza. En algunos casos, el dominio transmembrana se puede seleccionar o modificar por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de la membrana superficial, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerizarse con otro CAR en la superficie de la célula que expresa CAR, por ejemplo, linfocito CART. En un aspecto diferente, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana se puede modificar o sustituir con el fin de minimizar las interacciones con los dominios de unión del compañero de unión nativo presente en la misma célula que expresa CAR, por ejemplo, CART.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalizar al(a los) dominio(s) intracelular(es) cada vez que el CAR se ha unido a una diana. Un dominio transmembrana de uso particular en esta invención puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C.

En algunos casos, el dominio transmembrana se puede unir a la región extracelular del CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del CAR, a través de una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana, por ejemplo, una bisagra de IgG4 o una bisagra de CD8a. En una realización, la bisagra o el espaciador comprende (por ejemplo, está constituido por) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, el dominio transmembrana comprende (por ejemplo, está constituido por) un dominio transmembrana de la SEQ ID NO: 6.

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgG4. Por ejemplo, en una realización, el espaciador o la bisagra comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO:3). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por la secuencia de nucleótidos de GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGG ACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGA CCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGG GAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGG TGT ACACCCTGCCCCCT AGCC AAG AGGAGATG ACC AAGA ACC AGGTGTCCCTGAC CTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC GGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCA GCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAA CGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGA GCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO: 14).

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgD. Por ejemplo, en una realización, el espaciador o la bisagra comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERET KTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTG GVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQA PVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPG STTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (SEQ ID NO:4). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por la secuencia de nucleótidos de

AGGTGGCCCGA A AGTCCCA AGGCCC AGGCATCT AGTGTTCCT ACTGCAC AGCCCC A GGC AG A AGGC AGCCT AGCC A A AGCT ACT ACTGC ACCTGCC ACT ACGCGC A AT ACT GGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGA GAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATC TCTTGACTCCCGC AGTAC AGGACTTGTGGCTT AG AG AT AAGGCC ACCTTT ACATGT TTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAA GGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCT CAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTC TGTC ACATGT ACTCT A AATC ATCCT AGCCTGCCCCC ACAGCGTCTG ATGGCCCTT AG AGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTG ATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCC AACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCG CTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTC TTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTC

CCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACG

TGACTGACCATT (SEQ ID NO: 15).

En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos, tales como leucina y valina. En un aspecto, se puede detectar un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada uno de los extremos de un dominio transmembrana recombinante.

Opcionalmente, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos, puede formar la unión entre el dominio transmembrana y la región citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector especialmente adecuado. Por ejemplo, en un aspecto, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:5). En algunas realizaciones, el enlazador está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO:16).

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de KIR2DS2.

Dominio citoplasmático

El dominio o región citoplasmáticos del CAR de la presente incluye un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular es capaz de activar al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha introducido el CAR.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelulares para uso en el CAR de la invención incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de linfocitos T (TCR) y correceptores que actúan concertados para iniciar la transducción de señales después de la activación del receptor del antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para una activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Por lo tanto, se puede decir que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (dominios de señalización intracelular primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio coestimulador).

Un dominio de señalización primaria regula la activación primaria del complejo TCR, ya sea de manera estimuladora o inhibidora. Los dominios de señalización intracelular primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelular primaria que contienen ITAM que son de uso particular en la invención incluyen aquellos de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta , CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS»), FcsRI, DAP10, DAP12 y CD66d. En un caso, un CAR de la divulgación comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primaria de CD3-zeta.

En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene una actividad alterada (por ejemplo, incrementada o disminuida) en comparación con el dominio ITAM nativo. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

Otros ejemplos de moléculas que contienen un dominio de señalización primaria que son de uso particular en la invención incluyen aquellos de DAP10, DAP12 y CD32.

El dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización primaria, por ejemplo, dominio de señalización de CD3-zeta, por sí mismo o se puede combinar con cualquier(cualesquiera) otro(s) dominio(s) de señalización intracelular deseado(s) útil(es) en el contexto de un CAR de la invención. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender un dominio de señalización primaria, por ejemplo, una porción de la cadena CD3-zeta, y un dominio de señalización coestimulador. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de linfocitos frente a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM), receptores de células NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, lAt , Ga Ds , SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares Por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 potencia la expansión, función efectora y supervivencia de linfocitos CART humanos in vitro y aumenta la persistencia de linfocitos T humanos y actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706).

Las secuencias de señalización intracelular dentro de la porción citoplasmática de un CAR de la invención pueden unirse entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) puede formar la unión entre secuencia de señalización intracelular. En una realización, se puede utilizar un doblete de glicina-serina como un conector adecuado. En una realización, se puede utilizar un único aminoácido, por ejemplo, una alanina, una glicina, como un conector adecuado.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más, dominios de señalización coestimuladores. En una realización, los dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más dominios de señalización coestimuladores, están separados por una molécula conectora, por ejemplo, una molécula conectora descrita en la presente. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores. En algunas realizaciones, la molécula conectora es un residuo de glicina. En algunas realizaciones, el conector es un residuo de alanina.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 7. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 9 (CD3-zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3-zeta humano de tipo natural).

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:8).

En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCC

GCCCCGGGCCC ACCCGC A AGC ATT ACC AGCCCT ATGCCCC ACC ACGCG ACTTCGC A

GCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 19).

En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 380.

En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de ICOS. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381. En un aspecto, el dominio de señalización de ICOS está codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 382.

En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión al antígeno diferente, por ejemplo, a la misma diana (CD33) o una diana diferente (por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta). En un caso, el segundo CAR incluye un dominio de unión al antígeno para una diana expresada en las células de leucemia mieloide aguda tal como, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta. En un caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR que tiene como diana un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimulador pero no un dominio de señalización primaria, y un segundo CAR que tiene como diana un segundo antígeno, diferente, e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primaria pero no un dominio de señalización coestimulador. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, la colocación de un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, de 4-1BB, CD28, CD27, ICOS u OX-40, en el primer CAR, y el dominio de señalización primaria, por ejemplo, de CD3 zeta, en el segundo CAR puede limitar la actividad CAR a las células en las que se expresan ambas dianas. En un caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD33 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria. En otro caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria y un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD33 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, la célula que expresa CAR comprende un CAR CD33 descrito en la presente y un CAR inhibidor. En un caso, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno presente en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CD33. En un caso, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta.

En un caso, cuando la célula que expresa CAR comprende dos o más CAR diferentes, los dominios de unión al antígeno de los diferentes CAR pueden ser tales que los dominios de unión al antígeno no interaccionen entre sí. Por ejemplo, una célula que expresa un primer y un segundo CAR puede tener un dominio de unión al antígeno del primer CAR, por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión al antígeno del segundo CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del segundo CAR es un VHH.

En algunos casos, el dominio de unión al antígeno comprende moléculas de unión al antígeno de dominio único (SDAB, por sus siglas en inglés) e incluye moléculas cuyas regiones determinantes de la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, sin carácter limitante, dominios variables de la cadena pesada, moléculas de unión desprovistas de manera natural de cadenas ligeras, dominios únicos derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, dominios modificados y esqueletos de dominio único diferentes de aquellos derivados de anticuerpos. Las moléculas SDAB pueden ser cualesquiera de la técnica, o cualesquiera moléculas de dominio único futuras. Las moléculas SDAB pueden derivarse de cualquier especie que incluye, sin carácter limitante, ratón, ser humano, camello, llama, lamprea, pez, tiburón, cabra, conejo y bóvidos. El término también incluye moléculas de tipo anticuerpo de dominio único de especies diferentes de los tiburones y Camelidae.

En un aspecto, una molécula SDAB puede derivarse de una región variable de la inmunoglobulina presente en peces, tal como, por ejemplo, la que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conocido como receptor de antígeno novedoso (NAR, por sus siglas en inglés) presente en el suero del tiburón. Los métodos para producir moléculas de dominio único derivadas de una región variable de NAR («IgNAR») se describen en el documento WO 03/014161 y en Streltsov (2005) Protein Sci.

14:2901-2909.

De acuerdo con otro aspecto, una molécula SDAB es una molécula de unión al antígeno de dominio único de origen natural conocida como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Tales moléculas de dominio único se divulgan en el documento WO 9404678 y en Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. A efectos de claridad, este dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada desprovista de manera natural de la cadena ligera se conoce en la presente como un VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Una molécula VHH de este tipo puede derivarse de la especie Camelidae, por ejemplo, en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además de Camelidae pueden producir moléculas de cadena pesada desprovistas de manera natural de la cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la divulgación.

Las moléculas SDAB pueden ser recombinantes, injertadas de CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas mediante presentación en fagos).

También se ha descubierto que en células que tienen una pluralidad de receptores integrados en la membrana quiméricos que comprenden un dominio de unión al antígeno las interacciones entre el dominio de unión al antígeno de los receptores pueden ser indeseables, por ejemplo, porque se inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión al antígeno para unirse a su antígeno afín. En consecuencia, en la presente se divulgan células que tienen un primer y un segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural que comprenden dominios de unión al antígeno que minimizan tales interacciones. También se divulgan en la presente ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural que comprenden dominios de unión al antígeno que minimizan tales interacciones, así como también métodos para preparar y utilizar tales células y ácidos nucleicos. En un caso, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural comprende un scFv y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana (hu) o de ratón (ms).

En algunos casos, la presente divulgación comprende un primer y segundo CAR, donde el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR es un scFv y el otro no es un scFv. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un dominio VHH de camélido.

En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR es un scFv y el otro comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un scFv y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

En algunos casos, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CAR. En algunos casos, la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín en presencia de dicho segundo CAR es un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% de la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo CAR.

En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión al antígeno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR se asocian entre sí en menor medida que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv. En algunos casos, los dominios de unión al antígeno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR se asocian entre sí un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% menos que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv.

En otro caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunos casos, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, es una molécula descrita en la presente, por ejemplo, un agente que comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de estos) y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27, ICOS o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta tal como se describe en la presente). En casos, la célula que expresa CAR descrita en la presente comprende un receptor coestimulador de tipo interruptor, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 2013/019615. PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha mostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2 reducen de manera regulada la activación de linfocitos T tras unirse a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1.

En un caso, el agente comprende el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) de una molécula inhibidora, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1, por sus siglas en inglés) se puede fusionar a un dominio transmembrana y dominios de señalización intracelular tales como 41BB y CD3 zeta (también denominado en la presente CAR PD1). En un caso, el CAR PD1, cuando se utiliza en combinaciones con un CAR CD33 descrito en la presente, mejora la persistencia de la célula que expresa CAR, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, el CAR es un CAR PD1 que comprende el dominio extracelular de p D1 indicado como la parte subrayada en la SEQ ID NO: 24. En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24.

Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwvrmspsnqtdklaafpedrsq pgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpp tpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrf peeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseig mkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:24).

En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos que se proporciona a continuación (SEQ ID NO:22). pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwvrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfh msvvrarrndsgtvlcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrp aaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsad apaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqgl statkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:22).

En un caso, el agente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR PD1, por ejemplo, el CAR PD1 descrito en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico para el CAR PD1 se muestra a continuación, con el ECD PD1 subrayado a continuación en la SEQ ID NO: 23. atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcg cccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccg aatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccggga caggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccggga cctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagag ctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgccc accgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatac ccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgta ctgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgct cctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagg gccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccga aatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccg aaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacata cgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 23).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR. En algunos casos, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. Por ejemplo, en un caso, la población de células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan c A r ) puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a CD33 diferente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 descrito en la presente que difiere del dominio de unión a CD33 en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a CD33, por ejemplo, tal como se describe en la presente, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión al antígeno que tiene una diana que no es CD33 (por ejemplo, CD123, CD34, CLL-1, FLT3 o receptor de folato beta). En un caso, la población de células que expresan c A r incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primaria, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundaria, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células donde al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio CD33 descrito en la presente, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACa M (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, se describe en la presente, por ejemplo, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-II3 (CD276), B7-II4 (VTCN1), IIVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de estos) y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27, ICOS o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta como los descritos en la presente).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una población de células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR), por ejemplo, una mezcla de células que expresan diferentes CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de cinasa, tal como un inhibidor de cinasa descrito en la presente. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una población de células donde al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión al antígeno asociado anti-canceroso tal como se describe en la presente, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de cinasa, tal como un inhibidor de cinasa descrito en la presente.

CAR con receptor de linfocitos citolíticos naturales (NKR)

En un caso, la molécula CAR descrita en la presente comprende uno o más componentes de un receptor de linfocitos citolíticos naturales (NKR) y de esta manera forma un CAR-NKR. El componente NKR puede ser un dominio transmembrana, un dominio bisagra o un dominio citoplasmático de cualquiera de los siguientes receptores de linfocitos citolíticos naturales: receptor de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR, por sus siglas en inglés), por ejemplo, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, y KIR3DP1; receptor de citotoxicidad natural (NCR), por ejemplo, NKp30, NKp44, NKp46; familia de molécula de señalización de la activación linfocitaria (SLAM) de los receptores de células inmunitarias, por ejemplo, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, y CD2F-10; receptor de Fc (FcR), por ejemplo, CD16, y CD64; y receptores de Ly49, por ejemplo, LY49A, LY49C. Las moléculas CAR-NKR descritas en la presente pueden interaccionar con una molécula adaptadora o dominio de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. Las configuraciones y secuencias a modo de ejemplo de moléculas CAR que comprenden componentes de NKR se describen en la Publicación Internacional N.° WO2014/145252.

Estrategias para regular los receptores antigénicos quiméricos

Existen muchas maneras de regular las actividades de CAR. En algunas realizaciones, un CAR regulable (RCAR) donde la actividad CAR se puede controlar es deseable para optimizar la seguridad y eficacia de una terapia con CAR. Por ejemplo, se puede utilizar la inducción de la apoptosis utilizando, por ejemplo, una caspasa fusionada a un dominio de dimerización (remítase, por ejemplo, a Di et al., N Engl. J. Med. 3 de noviembre de 2011; 365(18):1673-1683), como un interruptor de seguridad en la terapia con CAR de la presente invención. En otro ejemplo, las células que expresan CAR también pueden expresar una molécula Caspasa-9 inducible (iCaspasa-9) que, después de administrar un fármaco dimerizador (por ejemplo, rimiducid (también denominado AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals) o AP20187 (Ariad)) da lugar a la activación de la Caspasa-9 y apoptosis de las células. La molécula iCaspasa-9 contiene un dominio de unión inductor químico de la dimerización (CID, por sus siglas en inglés) que hace de mediador de la dimerización en la presencia de un CID. Esto da como resultado la depleción inducible y selectiva de células que expresan CAR. En algunos casos, la molécula iCaspasa-9 está codificada por una molécula de ácido nucleico separada del(de los) vector(es) que codifica(n) el CAR. En algunos casos, la molécula iCaspasa-9 está codificada por la misma molécula de ácido nucleico que codifica el CAR. La iCaspasa-9 puede proporcionar un interruptor de seguridad para evitar cualquier toxicidad de células que expresan CAR. Véanse, por ejemplo, Song et al. Cáncer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Id. de ensayo clínico N.° NCT02107963; y Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83.

Estrategias alternativas para regular la terapia con CAR de la presente invención incluyen utilizar moléculas de bajo peso molecular o anticuerpos que desactivan o deshabilitan la actividad CAR, por ejemplo, eliminando células que expresan CAR, por ejemplo, mediante citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC). Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un antígeno que es reconocido por moléculas capaces de inducir la muerte celular, por ejemplo, ADCC o muerte celular inducida por el complemento. Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un receptor capaz de ser la diana de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los ejemplos de tales receptores incluyen EpCAM, VEGFr , integrinas (por ejemplo, integrinas avp3, a4, aI%p3, a4p7, a5p1, avp3, av), miembros de la superfamilia del receptor de TNF (por ejemplo, TRAIL-R1, TRAIL-R2), receptor de pDGF, receptor de interferón, receptor de folato, GPNMB, lCAM-1, HLA-Dr , CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, receptor de IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/receptor de IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41 , CD44, CD51 , CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/basigina, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, y EGFR, y versiones truncadas de estos (por ejemplo, versiones que conservan uno o más epítopos extracelulares pero que carecen de una o más regiones dentro del dominio citoplasmático). Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) truncado que carece de capacidad de señalización pero mantiene el epítopo que es reconocido por moléculas capaces de inducir ADCC, por ejemplo, cetuximab (ERBITUX®), de modo que la administración de cetuximab induce ADCC y la posterior depleción de células que expresan CAR (remítase, por ejemplo, al documento WO2011/056894, y a Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860). Otra estrategia incluye expresar un gen marcador/suicida sumamente compacto que combina epítopos diana de ambos antígenos CD32 y CD20 en las células que expresan CAR descritas en la presente, que se une a rituximab, y da como resultado la depleción selectiva de las células que expresan CAR, por ejemplo, por ADCC (remítase, por ejemplo, a Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287). Otros métodos para depletar las células que expresan CAR descritas en la presente incluyen la administración de CAMPATH®, un anticuerpo anti-CD52 monoclonal que, de manera selectiva, se une y se dirige a linfocitos maduros, por ejemplo, células que expresan CAR, para su destrucción, por ejemplo, induciendo ADCC. En otras realizaciones, se puede actuar selectivamente sobre células que expresan CAR utilizando un ligando de CAR, por ejemplo, un anticuerpo antidiotípico. En algunas realizaciones, el anticuerpo antidiotípico puede provocar actividad de células efectoras, por ejemplo, actividad ADCC o ADC, y reducir de esta manera el número de células que expresan CAR. En otras realizaciones, el ligando de CAR, por ejemplo, el anticuerpo antidiotípico, se puede acoplar a un agente que induce la muerte celular, por ejemplo, un toxina, e inducir de esta manera el número de células que expresan CAR. Como alternativa, las propias moléculas CAR se pueden configurar de manera que la actividad se pueda regular, por ejemplo, activar y desactivar, tal como se describe más adelante.

En algunos casos, un RCAR comprende un conjunto de polipéptidos, normalmente dos en los casos más simples, en el cual los componentes de un CAR estándar descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular, se reparten en polipéptidos o miembros separados. En algunos casos, el conjunto de polipéptidos incluye un interruptor de dimerización que, cuando está presente una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno con un dominio de señalización intracelular. Se proporcionan una descripción y configuraciones a modo de ejemplo adicionales de tales CAR regulables en la presente y en la Publicación Internacional N.° WO 2015/090229.

En un caso, un RCAR comprende dos polipéptidos o miembros: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria descrito en la presente, y un primer dominio de tipo interruptor; 2) un miembro de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, que se dirige a un antígeno tumoral descrito en la presente, tal como se describe en la presente y un segundo dominio de tipo interruptor. Opcionalmente, el RCAR comprende un dominio transmembrana descrito en la presente. En un caso, se puede disponer un dominio transmembrana en el miembro de señalización intracelular, o el miembro de unión al antígeno, o en ambos. (A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en la presente miembros o elementos de un RCAR, el orden puede ser según se proporciona, pero también se incluyen otros órdenes. Dicho de otra manera, en un caso el orden es tal como se expone en el texto, pero en otros casos el orden puede ser diferente. Por ejemplo, el orden de los elementos en un lado de la región transmembrana puede ser diferente del ejemplo, por ejemplo, la ubicación de un dominio de tipo interruptor respecto a un dominio de señalización intracelular puede ser diferente, por ejemplo, invertido).

En un caso, el primer y segundo dominios de tipo interruptor pueden formar un interruptor de dimerización intracelular o extracelular. En un caso, el interruptor de dimerización puede ser un interruptor de homodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominio de dimerización son idénticos, o un interruptor de heterodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominios de dimerización son diferentes entre sí.

En casos, un RCAR puede comprender un «multiinterruptor». Un multiinterruptor puede comprender dominios de tipo interruptor de heterodimerización o dominios de tipo interruptor de homodimerización. Un multiinterruptor comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, dominios de tipo interruptor, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular. En un caso, el primer miembro puede comprender una pluralidad de primeros dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en FKBP, y un segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en f Rb . En un caso, el primer miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB, y el segundo miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria y uno o más dominios de señalización coestimuladores.

En un caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, uno o más dominios de señalización coestimuladores. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores descritos en la presente, por ejemplo, seleccionados entre 4-1BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y en casos, ningún dominio de señalización intracelular primaria. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores, en dirección de extracelular a intracelular: 4-1BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-4-1 BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1 BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB; o 4-1BB-CD28. En tales casos, el miembro de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta. En un caso de este tipo, el RCAR comprende (1) un miembro de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y dos dominios coestimuladores y un primer dominio de tipo interruptor; y (2) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y al menos un dominio de señalización intracelular primaria, y un segundo dominio de tipo interruptor.

Un caso proporciona RCAR donde el miembro de unión al antígeno no está fijado a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión al antígeno, sin transformar la célula con una secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno. En tales casos, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria, y un primer dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, y un segundo dominio de tipo interruptor, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el RCAR puede comprender además 3) un segundo miembro de unión al antígeno que comprende: un segundo dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un segundo dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno diferente del que se une al dominio de unión al antígeno; y un segundo dominio de tipo interruptor.

También se proporcionan en la presente RCAR donde el miembro de unión al antígeno comprende capacidad de activación y direccionamiento biespecíficas. En este caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión al antígeno, por ejemplo, scFv, donde cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana, por ejemplo, antígenos diferentes o el mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En un caso, la pluralidad de dominios de unión al antígeno están en tándem, y opcionalmente, se dispone un conector o región de bisagra entre cada uno de los dominios de unión al antígeno. En la presente se describen conectores y región de bisagra adecuados.

Un caso proporciona RCAR que tienen una configuración que permite realizar un cambio de la proliferación. En este caso, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados entre 4-1BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y un dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular primaria, por ejemplo, un dominio de CD3zeta, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de tipo interruptor, o no comprende un dominio de tipo interruptor que dimeriza con un dominio de tipo interruptor en el miembro de señalización intracelular. En un caso, el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de señalización coestimulador. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de tipo interruptor de un interruptor de homodimerización. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de tipo interruptor de un interruptor de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de tipo interruptor del interruptor de heterodimerización. En tales casos, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es extracelular.

En cualquiera de las configuraciones RCAR descritas en la presente, el primer y segundo dominios de tipo interruptor comprenden un interruptor basado en FKBP-FRB tal como se describe en la presente.

También se proporcionan en la presente células que comprenden un RCAR descrito en la presente. Se puede utilizar cualquier célula que se modifica para expresar un RCAR como una célula RCARX. En un caso, la célula RCARX es un linfocito T y se denomina linfocito RCART. En un caso, la célula RCARX es un linfocito NK y se denomina célula RCARN.

También se proporcionan en la presente ácidos nucleicos y vectores que comprenden secuencias que codifican RCAR. Las secuencias que codifican diversos elementos de un RCAR se pueden disponer en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo plásmido o vector, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. En un caso, (i) una secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno y (ii) una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector. La producción de las correspondientes proteínas se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de promotores separados, o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede dar como resultado la producción de dos proteínas mediante la escisión de un único producto de traducción o mediante la traducción de dos productos proteicos separados). En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un péptido escindible, por ejemplo, secuencia p2a o F2A. En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un iRe S, por ejemplo, un Em Cv o EV71 IRES. En estos casos, (i) y (ii) se transcriben como un ARN único. En un caso, un primer promotor está ligado operablemente a (i) y un segundo promotor está ligado operablemente a (ii), de modo que (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados.

Como alternativa, la secuencia que codifica diversos elementos de un RCAR se puede disponer en las diferentes moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, diferentes plásmidos o vectores, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. Por ejemplo, la (i) secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno puede estar presente en un primer ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, y la (ii) secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presente en el segundo ácido nucleico, por ejemplo, el segundo vector.

Interruptores de dimerización

Los interruptores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes. En un interruptor de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de tipo interruptor. En un interruptor de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de tipo interruptor.

En una realización, el RCAR comprende un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB o FKBP/FRAP. FKBP12 (FKBP o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que actúa como la diana intracelular inicial para el fármaco inmunosupresor de tipo producto natural rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al homólogo de PI3K grande FRAP (RAFT, mTOR). FRB es una porción de 93 aminoácidos de FRAP que es suficiente para unirse al complejo FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51).

En algunas realizaciones, un interruptor basado en FKBP/FRAP, por ejemplo, FKBP/FRB, puede usar una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina.

La secuencia de aminoácidos de FKBP es la siguiente:

D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 148)

En algunas realizaciones, un dominio de tipo interruptor FKBP puede comprender un fragmentos de FKBP que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, la porción subrayada de la SEQ ID NO: 148, que es:

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO:149)

La secuencia de aminoácidos de FRB es la siguiente:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRRISK (SEQ ID NO:

150)

«Interruptor basado en FKBP/FRAP, por ejemplo, FKBP/FRB», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a un interruptor de dimerización que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmentos de FKBP o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001, y que tiene una identidad de al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99% respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FKBP de la SEQ ID NO: 148 o 149; y un segundo dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmentos de FRB o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, y que tiene una identidad de al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99% respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FRB de la s Eq ID NO: 150. En un caso, un RCAR descrito en la presente comprende un dominio de tipo interruptor comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 148 (o la SEQ ID NO: 149), y un dominio de tipo interruptor comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 150.

En algunas realizaciones, el interruptor de dimerización FKBP/FRB comprende un dominio de tipo interruptor FRB modificado que muestra una formación compleja alterada, por ejemplo, potenciada, entre un dominio de tipo interruptor basado en FRB, por ejemplo, el dominio de tipo interruptor FRB modificado, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP, y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001. En una realización, el dominio de tipo interruptor FRB modificado comprende una o más mutaciones, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, seleccionadas entre mutaciones en la(s) posición(posiciones) aminoacídica(s) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y F2108, donde el aminoácido de tipo natural está mutado a otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, donde E2032 se muta a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por ejemplo, la SEQ ID NO: 151, o leucina (E2032L), por ejemplo, SEQ ID NO: 152. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en T2098, donde T2098 se muta a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), por ejemplo, la SEQ ID NO: 153. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, donde E2032 se muta a cualquier aminoácido, y donde T2098 se muta a cualquier aminoácido, por ejemplo, la SEQ ID NO: 154. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032I y una T2098L, por ejemplo, la SEQ ID NO: 155. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032L y una T2098L, por ejemplo, la SEQ ID NO: 156.

Tabla 6. FRB mutante a modo de eem lo ue tiene una ma or afinidad or una molécula de dimerización.

Otros interruptores de dimerización adecuados incluyen el interruptor de dimerización basado en GyrB-GyrB, un interruptor de dimerización basado en Giberelina, un interruptor de dimerización marcador/fijador y un interruptor de dimerización marcador-halo/marcador-SNAP. Siguiendo las directrices que se proporcionan en la presente, tales interruptores y moléculas de dimerización relevantes serán evidentes para un experto en la técnica.

Molécula de dimerización

La asociación entre los dominios de tipo interruptor está fomentada por la molécula de dimerización. En presencia de la molécula de dimerización la interacción o asociación entre dominios de tipo interruptor permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un primer dominio de tipo interruptor, y un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un segundo dominio de tipo interruptor. En presencia de niveles no limitantes de la molécula de dimerización la transducción de señales aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en la presente.

Se pueden utilizar rapamicina y análogos de rapamicina (denominados a veces rapálogos), por ejemplo, RAD001, como moléculas de dimerización en un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB descrito en la presente. En una realización, la molécula de dimerización se puede seleccionar entre rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus y AP21967. En la sección titulada «Terapias combinadas» o en la subsección titulada «Combinación con una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR» se describen adicionalmente más análogos de rapamicina adecuados para su uso con interruptores de dimerización basados en FKBP/FRB.

CAR dividido

En algunas realizaciones, la célula que expresa CAR utiliza un CAR dividido. La estrategia de CAR dividido se describe más detalladamente en las publicaciones WO2014/055442 y WO2014/055657.

Resumiendo, un sistema CAR dividido comprende una célula que expresa un primer CAR que tiene un primer dominio de unión al antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 41 Bb ) y la célula también expresa un segundo CAR que tiene un segundo dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, CD3 zeta). Cuando la célula encuentra el primer antígeno, se activa el dominio coestimulador y la célula prolifera. Cuando la célula encuentra el segundo antígeno, se activa el dominio de señalización intracelular y comienza la actividad citolítica. Por lo tanto, la célula que expresa CAR solo está totalmente activada en presencia de ambos antígenos. En algunos casos, el primer dominio de unión al antígeno reconoce CD33, por ejemplo, comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, y el segundo dominio de unión al antígeno reconoce un antígeno expresado en las células de leucemia mieloide aguda, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o receptor de folato beta. En algunos casos, el primer dominio de unión al antígeno reconoce CD33, por ejemplo, comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, y el segundo dominio de unión al antígeno reconoce un antígeno expresado en linfocitos B, por ejemplo, CD19, CD20, CD22 o ROR1.

Estabilidad y Mutaciones

La estabilidad de un dominio de unión a CD33, por ejemplo, moléculas de scFv (por ejemplo, scFv soluble), se puede evaluar haciendo referencia a las propiedades biofísicas (por ejemplo, estabilidad térmica) de un anticuerpo completo o una molécula de scFv de control convencional. En una realización, el scFv humano tiene una estabilidad térmica que es superior a aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10 grados, aproximadamente 11 grados, aproximadamente 12 grados, aproximadamente 13 grados, aproximadamente 14 grados o aproximadamente 15 grados Celsius a la de una molécula de unión de control (por ejemplo, una molécula de scFv convencional) en los ensayos descritos.

La estabilidad térmica mejorada del dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, se confiere posteriormente al constructo CAR33 completo, lo que conlleva propiedades terapéuticas mejoradas del constructo CAR33. La estabilidad térmica del dominio de unión a c D33, por ejemplo, scFv, se puede mejorar en al menos aproximadamente 2 °C o 3 °C en comparación con un

anticuerpo convencional. En una realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada en 1 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada en 2 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el scFv tiene una estabilidad térmica mejorada en 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 °C en comparación con un anticuerpo convencional. Se pueden realizar comparaciones, por ejemplo, entre las moléculas de scFv divulgadas en la presente y los anticuerpos completos. La estabilidad térmica se puede medir utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un caso, se puede medir la Tf. Más adelante se describen en más detalle métodos para medir la Tf y otros métodos para determinar la estabilidad proteica.

Las mutaciones en scFv alteran la estabilidad del scFv y mejoran la estabilidad global del scFv y el constructo CAR33. La estabilidad del scFv humanizado o humano se determina utilizando medidas tales como Tf, desnaturalización por temperatura y agregación por temperatura.

La capacidad de unión de los scFv mutantes se puede determinar utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos.

En una realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, comprende al menos una mutación tal que el scFv mutado confiere una mejora de la estabilidad al constructo CAR33. En otra realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mutaciones que surgen del proceso de humanización tales que el scFv mutado confiere una mejora de la estabilidad al constructo CAR33.

Métodos de Evaluación de la Estabilidad de la Proteína

La estabilidad de un dominio de unión al antígeno se puede evaluar utilizando, por ejemplo, los métodos descritos más adelante. Tales métodos permiten la determinación de múltiples transiciones de desplegamiento térmico donde el dominio menos estable se despliega primero o limita el umbral de estabilidad global de una unidad multidominio que se despliega cooperativamente (por ejemplo, una proteína multidominio que exhibe una única transición de desplegamiento). El dominio menos estable se puede identificar de varias maneras adicionales. La mutagénesis se puede realizar para estudiar qué dominio limita la estabilidad global. Adicionalmente, la resistencia a la proteasa de una proteína multidominio se puede realizar en condiciones en las que se sabe que el dominio menos estable está intrínsecamente desplegado a través de DSC u otros métodos espectroscópicos (Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol.

393: 672-692). Una vez que se identifica el dominio menos estable, la secuencia que codifica este dominio (o una porción de esta) se puede emplear como una secuencia de prueba en los métodos.

a) Estabilidad Térmica

La estabilidad térmica de las composiciones se puede analizar utilizando varias técnicas biofísicas o bioquímicas no limitantes conocidas en la técnica. En ciertos casos, la estabilidad térmica se evalúa mediante espectroscopía analítica.

Un método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo es la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, por sus siglas en inglés). La DSC emplea un calorímetro que es sensible a las absorbancias de calor que acompañan el desplegamiento de la mayoría de las proteínas o dominios de proteínas (remítase, por ejemplo, a Sánchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Para determinar la estabilidad térmica de una proteína, se inserta una muestra de la proteína en el calorímetro y se eleva la temperatura hasta que se despliega el Fab o scFv. La temperatura a la que se despliega la proteína es indicativa de la estabilidad global de la proteína.

Otro método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo es la espectroscopía de Dicroísmo Circular (CD, por sus siglas en inglés). La espectrometría de CD mide la actividad óptica de una composición en función de una temperatura creciente. La espectroscopía de dicroísmo circular (CD) mide las diferencias en la absorción de la luz polarizada a la izquierda frente a la luz polarizada a la derecha que surgen debido a la asimetría estructural. Una estructura desordenada o desplegada da como resultado un espectro de CD muy diferente al de una estructura ordenada o plegada. El espectro de CD refleja la sensibilidad de las proteínas a los efectos desnaturalizantes de la temperatura creciente y, por lo tanto, es indicativo de la estabilidad térmica de una proteína (remítase a van Mierlo y Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000).

Otro método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo para medir la estabilidad térmica es la Espectroscopía de Emisión de Fluorescencia (remítase a van Mierlo y Steemsma, mencionado anteriormente). Otro método más de espectroscopía analítica a modo de ejemplo para medir la estabilidad térmica es la espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (remítase, por ejemplo, a van Mierlo y Steemsma, mencionado anteriormente).

La estabilidad térmica de una composición se puede medir por medios bioquímicos. Un método bioquímico a modo de ejemplo para evaluar la estabilidad térmica es un ensayo de exposición térmica. En un «ensayo de exposición térmica», se somete una composición a un intervalo de temperaturas elevadas durante un período de tiempo establecido. Por ejemplo, en un caso, las moléculas scFv de prueba o las moléculas que comprenden moléculas de scFv se someten a un intervalo de temperaturas crecientes, por ejemplo, durante 1-1,5 horas. La actividad de la proteína se somete a ensayo a continuación con un ensayo bioquímico relevante. Por ejemplo, si la proteína es una proteína de unión (por ejemplo, un scFv o un polipéptido que contiene scFv), la actividad de unión de la proteína de unión se puede determinar mediante un ELISA funcional o cuantitativo.

Un ensayo de este tipo se puede realizar en un formato ultrarrápido y en los divulgados en los Ejemplos utilizando E. coli y cribado ultrarrápido. Se puede crear una colección de dominios de unión a CD33, por ejemplo, variantes de scFv, utilizando métodos conocidos en la técnica. Se puede inducir la expresión de dominios de unión a CD33, por ejemplo, scFv, y se pueden someter los dominios de unión a CD33, por ejemplo, scFv, a una exposición térmica. Las muestras de prueba expuestas se pueden analizar para determinar la unión y aquellos dominios de unión a CD33, por ejemplo, scFv, que son estables, se pueden aumentar y caracterizar en mayor medida.

La estabilidad térmica se evalúa midiendo la temperatura de fusión (Tf) de una composición utilizando cualquiera de las técnicas anteriores (por ejemplo, técnicas de espectroscopía analítica). La temperatura de fusión es la temperatura en el punto medio de una curva de transición térmica en la que el 50% de las moléculas de una composición están en estado plegado (remítase, por ejemplo, a Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692). En una realización, los valores de Tf para un dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, son de aproximadamente 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. En una realización, los valores de Tf para una IgG son de aproximadamente 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. En una realización, los valores de Tf para un anticuerpo multivalente son de aproximadamente 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.

La estabilidad térmica también se evalúa midiendo el calor específico o la capacidad calorífica (Cp) de una composición utilizando una técnica calorimétrica analítica (por ejemplo, DSC). El calor específico de una composición es la energía (por ejemplo, en kcal/mol) que se requiere para aumentar en 1 °C la temperatura de 1 mol de agua. Como Cp grande es un rasgo característico de una composición proteica desnaturalizada o inactiva. El cambio en la capacidad calorífica (ACp) de una composición se mide determinando el calor específico de una composición antes y después de su transición térmica. La estabilidad térmica también se puede evaluar midiendo o determinando otros parámetros de estabilidad termodinámica, incluida la energía libre de Gibbs de desplegamiento (AG), la entalpía de desplegamiento (AH) o la entropía de desplegamiento (AS). Uno o más de los ensayos bioquímicos anteriores (por ejemplo, un ensayo de exposición térmica) se utilizan para determinar la temperatura (es decir, el valor T^c) en el que el 50% de la composición mantiene su actividad (por ejemplo, actividad de unión).

Además, las mutaciones en el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, alteran la estabilidad térmica del dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, en comparación con el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, no mutado. Cuando el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, humanizado o humano se incorpora a un constructo CAR33, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv humanizado o humano confiere estabilidad térmica al constructo global CAR CD33. En una realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, comprende una única mutación que confiere estabilidad térmica al dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv. En otra realización, el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, comprende múltiples mutaciones que confieren estabilidad térmica al dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv. En una realización, las múltiples mutaciones en el dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, tienen un efecto aditivo sobre la estabilidad térmica del dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv.

b) % de Agregación

La estabilidad de una composición se puede determinar midiendo su propensión a agregarse. La agregación se puede medir mediante un número de técnicas bioquímicas o biofísicas no limitantes. Por ejemplo, la agregación de una composición se puede evaluar utilizando cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). La SEC separa moléculas en función del tamaño. Una columna se llena con perlas semisólidas de un gel polimérico que admitirá iones y moléculas pequeñas en su interior, pero no grandes. Cuando se aplica una composición proteica en la parte superior de la columna, las proteínas plegadas compactas (es decir, proteínas no agregadas) se distribuyen a través de un mayor volumen de disolvente que el que está disponible para los grandes agregados de proteínas. Por consiguiente, los agregados grandes se mueven con mayor rapidez a través de la columna, y de esta manera la mezcla se puede separar o fraccionar en sus componentes. Cada una de las fracciones se puede cuantificar por separado (por ejemplo, mediante dispersión de la luz) a medida que se eluye del gel. Por consiguiente, el % de agregación de una composición se puede determinar comparando la concentración de una fracción con la concentración total de proteína aplicada al gel. Las composiciones estables eluyen de la columna como esencialmente una fracción única y aparecen esencialmente como un pico único en el perfil de elución o cromatograma.

c) A fin idad de Unión

La estabilidad de una composición se puede evaluar determinando su afinidad de unión por la diana. En la técnica existe constancia de una amplia diversidad de métodos para determinar la afinidad de unión. Un método a modo de ejemplo para determinar la afinidad de unión emplea resonancia por plasmones superficiales. La resonancia por plasmones superficiales es un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones más detalladas, remítase a Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol.Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión al antígeno descrita en la presente, y el dominio de unión al antígeno mantiene las propiedades funcionales deseadas de los fragmentos de anticuerpo para CD33 descritos en la presente. En un aspecto específico, la composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

En diversos aspectos, el dominio de unión al antígeno del CAR se altera modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (por ejemplo, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. En un aspecto específico, la composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

Un experto ordinario en la técnica entenderá que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación se puede modificar adicionalmente de modo que varíe su secuencia de aminoácidos (por ejemplo, respecto al tipo natural), pero no la actividad deseada. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones adicionales de nucleótidos en la proteína que dan lugar a sustituciones de aminoácidos en residuos aminoacídicos «no esenciales». Por ejemplo, un residuo aminoacídico no esencial en una molécula puede ser reemplazado por otro residuo aminoacídico de la misma familia de la cadena lateral. En otro caso, una secuencia de aminoácidos puede ser reemplazada por una secuencia similar desde un punto de vista estructural que difiera en orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral, por ejemplo, se puede realizar una sustitución conservadora, en la que un residuo aminoacídico es reemplazado por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar.

En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son «sustancialmente idénticas» si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleotídicos que son iguales (por ejemplo, una identidad de un 60%, opcionalmente una identidad de un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a lo largo de una región especificada o, cuando no se especifique, a lo largo de toda la secuencia), cuando se comparan y se alinean para conseguir una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o más preferentemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos).

Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de referencia y de prueba se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, cuando proceda, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por defecto o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula los porcentajes de identidades secuenciales para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Grupo computacional de genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (remítase, por ejemplo, a Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad secuencial y similitud secuencial son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res.

25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está a disposición del público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller 1988, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) que ha sido incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En un aspecto, la presente divulgación contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, scFv) de partida que generan moléculas equivalentes desde un punto de vista funcional. Por ejemplo, el VH o VL de un dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, comprendido en el CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% respecto a la región de armazón de VH o VL del dominio de unión a CD33, por ejemplo, scFv, de partida. La presente invención contempla modificaciones de todo el constructo CAR, por ejemplo, modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios del constructo CAR con el fin de generar moléculas equivalentes desde un punto de vista funcional. El constructo CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% del constructo CAR de partida.

Transfección con ARN

En la presente se divulgan métodos para producir un ARN de CAR transcrito in vitro. La presente invención también incluye un constructo de ARN que codifica un CAR que se puede utilizar directamente para transfectar una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección puede conllevar la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores diseñados especialmente, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contiene la secuencia no traducida 3' y 5' («UTR»), una caperuza 5' y/o un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de una longitud de 50 a 2000 bases (SEQ ID NO: 35). Con el ARN producido de esta manera se pueden transfectar eficientemente diferentes tipos de células. En un aspecto, el molde incluye secuencias para el CAR.

En un aspecto, el CAR CD33 está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el CAR CD33 se introduce en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) para la producción de una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART o linfocito NK que expresa CAR).

En una realización, el ARN de CAR transcrito in vitro se puede introducir en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando un molde generado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente puede convertirse directamente por PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro utilizando cebadores apropiados y ARN- polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. El molde deseado para la transcripción in vitro es un CAR de la presente invención. Por ejemplo, el molde para el ARN de CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable monocatenario de un anticuerpo antitumoral; una región de bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplasmática que incluye un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.

En una realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN de origen natural procedente del genoma de un organismo. En una realización, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones 5' y/o 3' no traducidas (UTR). El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otra realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye las UTR 5' y 3'. Como alternativa, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo de origen natural. Una secuencia de ADN artificial a modo de ejemplo es aquella que contiene porciones de genes que están ligadas para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que están ligadas entre sí pueden proceder de un solo organismo o de más de un organismo.

La PCR se utiliza para generar un molde para la transcripción in vitro de ARNm que se utiliza para la transfección. Métodos para realizar la PCR son muy conocidos en la técnica. Los cebadores para uso en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se van a utilizar como un molde para la PCR. La expresión «sustancialmente complementarias», tal como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de nucleótidos en las que una mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o están emparejadas de manera errónea. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de asociarse o hibridarse con la diana de ADN objetivo en las condiciones de hibridación utilizadas para la PCR. Los cebadores se pueden diseñar para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción del molde de ADN. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar para amplificar la porción de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluidas las u Tr 5' y 3'. Los cebadores también se pueden diseñar para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, que incluye la totalidad o porciones de las UTR 5' y 3'. Se pueden generar cebadores útiles para la PCR mediante métodos sintéticos muy conocidos en la técnica. Los «cebadores directos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos en el molde de ADN que están en dirección 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 5'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante. Los «cebadores inversos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a un molde de ADN bicatenario que están en dirección 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 3'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante.

Se puede utilizar cualquier ADN-polimerasa útil para la PCR en los métodos descritos en la presente. Los reactivos y la polimerasa son comercializados por varios proveedores.

También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de fomentar la estabilidad y/o la eficacia de la traducción. El ARN tiene preferentemente UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene una longitud de entre uno y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' que se van a añadir a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, que incluyen, sin carácter limitante, diseño de cebadores para PCR que se hibridan a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, un experto en la técnica puede modificar la longitud de las UTR 5 'y 3' requerida para lograr una eficacia de traducción óptima después de la transfección con el ARN transcrito.

Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' que se producen de forma natural, endógenas respecto al ácido nucleico de interés. Como alternativa, las secuencias u Tr que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés se pueden añadir incorporando las secuencias UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualesquiera otras modificaciones del molde. El uso de secuencias UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que elementos ricos en AU en las secuencias UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, se pueden seleccionar o diseñar UTR 3' para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de UTR muy conocidas en la técnica.

En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Como alternativa, cuando se añade una UTR 5' que no es endógena respecto al ácido nucleico de interés por PCR, tal como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficacia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece que se necesiten en todos los ARN para posibilitar una traducción eficaz. Existe constancia del requisito de secuencias de Kozak para muchos ARNm. En otras realizaciones, la UTR 5' puede ser una UTR 5' de un virus de ARN, cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones, se pueden utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN sin la necesidad de clonación génica, se debe unir un promotor de la transcripción al molde de ADN en dirección 5' respecto a la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una ARN-polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de ARN-polimerasa se incorpora al producto de pCr en dirección 5' respecto al marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, tal como se describe en otra parte de la presente. Otros promotores útiles incluyen, sin carácter limitante, promotores de la ARN-polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

En una realización preferida, el ARNm tiene tanto una caperuza en el extremo 5' como una cola de poli(A) 3' que determina la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En un molde de ADN circular, por ejemplo, ADN plasmídico, la ARN-polimerasa produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado en el extremo de la UTR 3' da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariota, incluso si se poliadenila después de la transcripción.

En un molde de ADN lineal, la ARN-polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' del transcrito más allá de la última base del molde (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem, 270:1485-65 (2003).

El método convencional de integración de tramos de poliA/T en un molde de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia de poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede provocar inestabilidad plasmídica, que es por lo que los moldes de ADN plasmídico obtenidos de células bacterianas están a menudo muy contaminados con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no solo sean laboriosos y lentos, sino que a menudo no sean fiables. Es por eso que un método que permite la construcción de moldes de ADN con un tramo de poliA/T 3' sin clonación es sumamente deseable.

El segmento de poliA/T del molde de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR utilizando un cebador inverso que contiene una cola de poliT, tal como la cola 100T (SEQ iD NO: 31) (el tamaño puede ser 50-5000 T (SEQ ID NO: 32)), o después de la PCR por cualquier otro método, incluidos, pero sin carácter limitante, ligamiento de ADN o recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) está entre 100 y 5000 adenosinas (SEQ ID NO 33).

Las colas de poli(A) de los ARN se pueden extender aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una poli(A)--polimerasa, tal como la poliA- polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, aumentar la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos (SEQ ID NO: 34) da como resultado un aumento de aproximadamente dos veces en la eficacia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Una unión de este tipo puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP se pueden incorporar en la cola de poli(A) utilizando poli(A)-polimerasa. Los análogos de ATP pueden aumentar adicionalmente la estabilidad del ARN.

Las caperuzas 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en la presente incluyen una caperuza 5'. La caperuza 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la materia y descritas en la presente (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos por los métodos divulgados en la presente también pueden contener una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o diseñada por medios artificiales que inicie la unión del ribosoma independiente de la caperuza al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Se pueden incluir cualesquiera solutos adecuados para la electroporación celular, que puede contener factores que facilitan la permeabilidad y la viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y surfactantes.

El ARN se puede introducir en células diana utilizando cualquiera de varios métodos diferentes, por ejemplo, métodos comercializados que incluyen, sin carácter limitante, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (bTx ) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemania), la transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando lipofección, encapsulación de polímeros, transfección mediada por péptidos o sistemas de suministro biolístico de partículas, tales como «cañones de genes» (remítase, por ejemplo, a Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861 -70 (2001).

Métodos de sum inistro no víricos

En algunos aspectos, se pueden utilizar métodos no víricos para suministrar un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente a una célula o tejido en un sujeto.

En algunos casos, el método no vírico incluye el uso de un transposón (también denominado transposón). En algunos casos, un transposón es una pieza de ADN que se puede insertar en una ubicación en un genoma, por ejemplo, una pieza de ADN que es capaz de autorreplicarse e insertar su copia en un genoma, o una pieza de ADN que se puede escindir de un ácido nucleico más largo e insertarse en otro lugar en un genoma. Por ejemplo, un transposón comprende una secuencia de ADN compuesta de repeticiones invertidas que flanquean genes para la transposición.

Los métodos a modo de ejemplo de suministro de ácido nucleico utilizando un transposón incluyen el sistema transposón Bella Durmiente (SBTS, por sus siglas en inglés) y un sistema transposón piggyBac (PB). Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; y Ding et al. Cell.

122.3(2005):473-83.

El SBTS incluye dos componentes: 1) un transposón que contiene un transgén y 2) una fuente de enzima transposasa. La transposasa puede transponer el transposón de un plásmido portador (u otro ADN donante) a un ADN diana, tal como un cromosoma/genoma de la célula hospedadora. Por ejemplo, la transposasa se une al ADN donante/plásmido portador, corta el transposón (incluido(s) el(los) transgén(es)) del plásmido, y lo inserta en el genoma de la célula hospedadora. Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al., mencionado anteriormente.

Los tansposones a modo de ejemplo incluyen un transposón basado en pT2. Véanse, por ejemplo, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; y Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971.

Las transposasas a modo de ejemplo incluyen una transposasa de tipo Tc1/mariner, por ejemplo, la transposasa SB10 o la transposasa SB11 (una transposasa hiperactiva que se puede expresar, por ejemplo, a partir de un promotor de citomegalovirus). Véanse, por ejemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; y Grabundzija et al.

El uso de SBTS permite la integración y expresión eficaces de un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En la presente se proporcionan métodos para generar una célula, por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK, que expresa de manera estable un CAR descrito en la presente, por ejemplo, utilizando un sistema transposón tal como SbTs .

De acuerdo con los métodos descritos en la presente, en algunas realizaciones, se suministran a una célula (por ejemplo, linfocito T o NK) uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, plásmidos, que contienen los componentes SBTS. Por ejemplo, el(los) ácido(s) nucleico(s) se suministra(n) mediante métodos estándar de suministro de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN plasmídico), por ejemplo, métodos descritos en la presente, por ejemplo, electroporación, transfección o lipofección. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente) así como también una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. En otros casos, se proporciona un sistema con dos ácidos nucleicos, por ejemplo, un sistema plasmídico dual, por ejemplo, donde un primer plásmido contiene un transposón que comprende un transgén, y un segundo plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. Por ejemplo, el primer y el segundo ácidos nucleicos se suministran conjuntamente a la célula hospedadora.

En algunos casos, se generan células, por ejemplo, linfocitos T o NK, que expresan un CAR descrito en la presente utilizando una combinación de inserción génica utilizando SBTS y edición génica utilizando una nucleasa (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés), el sistema CRISPR/Cas o meganucleasas modificadas (endonucleasas de asentamiento rediseñadas).

En algunas realizaciones, el uso de un método no vírico de suministro permite la reprogramación de células, por ejemplo, linfocitos T o NK, e infusión directa de las células en el sujeto. Las ventajas de los vectores no víricos incluyen, sin carácter limitante, la facilidad y coste relativamente bajo de producción de cantidades suficientes para que una población de pacientes esté cubierta, la estabilidad durante el almacenamiento y la ausencia de inmunogenicidad.

Constructos de ácido nucleico que codifican un CAR

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más constructos CAR descritos en la presente. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como un transcrito de ARN mensajero. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como un constructo de ADN.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un dominio de unión a CD33 (por ejemplo, un dominio de unión a CD33 humano o humanizado), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, la cadena zeta. En un caso, el dominio de unión a CD33 es un dominio de unión a CD33 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD33 que comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:39-47, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, el dominio de unión a CD33 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra comprende las SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas, y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% estas, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una cadena polipeptídica única.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NOS:39-47 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas), una región de bisagra de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas), un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6 (o una secuencia con identidad de un 95-99% con esta), un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:7 o un dominio coestimulador de CD27 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:8 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta) o un dominio coestimulador de CD28 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:379 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta) o un dominio coestimulador de ICOS que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 381 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta), y un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En un caso, la molécula polipeptídica aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:48-56, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD33, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 75-83, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula CAR codificada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO:7. En un caso, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIR2DS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a and CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R p, IL2R g (gamma común), IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, NKG2D, NKG2C, DNAM1 (CD226), SLAMF4, (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR y PAG/Cbp.

En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO:6. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una cadena polipeptídica única. En un caso, el dominio de unión a CD33 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:2. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula CAR codificada que comprende una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:39-47, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas, una región de bisagra de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6, un dominio coestimulador de 4-1 BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:7 o un dominio coestimulador de CD27 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:8, y un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10. En un caso, la molécula CAR codificada comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:48-56, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cribando colecciones de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que los incluye, o aislándolo directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándar. Como alternativa, el gen de interés se puede producir por medios sintéticos, en lugar de clonarse.

La presente invención también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente invención. Los vectores derivados de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida frente a los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad. Un vector retrovírico también puede ser, por ejemplo, un vector gammarretrovírico. Un vector gammarretrovírico puede incluir, por ejemplo, un promotor, una señal de empaquetamiento (y ), un sitio de unión al cebador (PBS, por sus siglas en inglés), uno o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés), y un transgén de interés, por ejemplo, un gen que codifica un CAR. Un vector gammarretrovírico puede carecer de genes estructurales víricos tales como gag, pol y env. Los vectores gammarretrovíricos a modo de ejemplo incluyen el virus de la leucemia murina (MLV, por sus siglas en inglés), virus formador de focos en el bazo (SFFV, por sus siglas en inglés) y virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV, por sus siglas en inglés), y vectores derivados de estos. Otros vectores gammarretrovíricos se describen, por ejemplo, en Tobias Maetzig et al., «Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application» Viruses. junio de 2011; 3(6): 677-713.

En otra realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de la invención es un vector adenovírico (A5/35). En otra realización, la expresión de los ácidos nucleicos que codifican CAR se puede lograr utilizando transposones tales como el de la bella durmiente, crísper, CAS9 y nucleasas con dedos de zinc. Remítase a continuación a June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CAR se logra normalmente ligando operablemente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones de este a un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración en eucariotas. Los vectores típicos de clonación contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia deseada de ácido nucleico.

Los constructos de expresión de la presente invención también se pueden utilizar para la inmunización con ácidos nucleicos y la terapia génica, utilizando protocolos de suministración de genes estándar. En la técnica existe constancia de métodos para el suministro de genes. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5399 346, 5580 859, 5 589 466.

En otra realización, la invención proporciona un vector de terapia génica.

El ácido nucleico se puede clonar en un cierto número de tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, sin carácter limitante, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es muy conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, sin carácter limitante, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios para endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y Pat de EE.UU. N.° 6326 193).

Se ha desarrollado un cierto número de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado se puede insertar en un vector y empaquetar en partículas retrovíricas utilizando técnicas conocidas en la técnica. El virus recombinante se puede aislar y suministrar a las células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. En la técnica existe constancia de cierto número de sistemas retrovíricos. En algunas realizaciones, se utilizan vectores adenovíricos. En la técnica existe constancia de un cierto número de vectores adenovíricos. En una realización, se utilizan vectores lentivíricos.

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se ubican en la región de 30-110 pb en dirección 5' respecto al sitio de inicio, aunque se ha mostrado que un cierto número de promotores contienen también elementos funcionales en dirección 3' respecto al sitio de inicio. El espacio entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor de timidina-cinasa (tk), el espacio entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece ser que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. Los promotores a modo de ejemplo incluyen promotores del gen lE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o de la fosfoglicerocinasa (PGK).

Un ejemplo de un promotor que es capaz de expresar un transgén CAR en un linfocito T de mamífero es el promotor EFla. El promotor EFla nativo impulsa la expresión de la subunidad alfa del complejo del factor de elongación 1, que es responsable del suministro enzimático de los aminoacil-ARNt al ribosoma. El promotor EFla se ha utilizado exhaustivamente en los plásmidos de expresión de mamíferos y ha mostrado ser eficaz para impulsar la expresión de CAR a partir de los transgenes clonados en un vector lentivírico. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). En un aspecto, el promotor EFla comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO:11.

Otro ejemplo de un promotor es la secuencia promotora del citomegalovirus (CMV) inmediata temprana. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar niveles elevados de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica ligada operablemente a ella. Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, sin carácter limitante, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40, por sus siglas en inglés), el virus del tumor mamario de ratones (MMTV, por sus siglas en inglés), el promotor de repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de inmunodeficiencia humana (HIV, por sus siglas en inglés), el promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor inmediato temprano del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como también promotores de genes humanos, tales como, sin carácter limitante, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor del factor de elongación 1a, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina-cinasa. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica que está ligada operablemente cuando se desea tal expresión, o capaz de desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, sin carácter limitante, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclinas.

Otro ejemplo de un promotor es el promotor fosfoglicerato-cinasa (PGK, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, se puede desear un promotor PGK truncado (por ejemplo, un promotor PGK con una o más, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 o 400, deleciones de nucleótidos cuando se compara con la secuencia del promotor PGK de tipo natural). A continuación se proporcionan las secuencias de nucleótidos de promotores PGK a modo de ejemplo. Promotor PGK de tipo natural

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCG CTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGC CTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGC ACCATAAGCT

(SEQ ID NO: 384)

Promotores PGK truncados a modo de ejemplo:

PGK100:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG

(SEQ ID NO: 385)

PGK200:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CG

(SEQ ID NO: 386)

PGK300:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG

(SEQ ID NO: 387)

PGK400:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCG CTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG

(SEQ ID NO: 388)

Un vector también puede incluir, por ejemplo, una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (por ejemplo, gen de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH, por sus siglas en inglés)), un elemento que permite la replicación episómica y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y/o elementos para permitir la selección (por ejemplo, gen de resistencia a la ampicilina y/o marcador de zeocina).

Con el fin de evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones de este, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que lo expresan a partir de la población de células que se desea transfectar o infectar mediante vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable se puede transportar en una pieza de ADN separada y utilizar en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadora. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Los genes indicadores se utilizan para identificar células que pueden haber sido transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni se expresa en el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se pone de manifiesto por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol-acetiltransferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son muy conocidos y se pueden preparar utilizando técnicas conocidas u obtenerse de proveedores comerciales. En general, la construcción con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar ligadas a un gen indicador y se pueden utilizar para evaluar a los agentes según la capacidad de modular la transcripción impulsada por el promotor.

En una realización, el vector puede comprender además un ácido nucleico que codifica un segundo CAR. En una realización, el segundo CAR incluye un dominio de unión al antígeno para una diana expresada en las células de leucemia mieloide aguda tal como, por ejemplo, CD123, CD34, CLL-1, FLT3 o el receptor de folato beta. En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR que se une específicamente a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimulador pero no un dominio de señalización primaria, y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se une específicamente a un segundo antígeno, diferente, e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primaria pero no un dominio de señalización coestimulador. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se une específicamente a un antígeno que no es CD33 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD123, CD34, CLL-1, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria. En otra realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR CD33 que incluye un dominio de unión a CD33, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se une específicamente a un antígeno que no es CD33 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno para el antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador. En un caso, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un CAR CD33 descrito en la presente y un ácido nucleico que codifica un CAR inhibidor. En un caso, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno presente en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CD33. En un caso, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta.

En casos, el vector puede comprender dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR, por ejemplo, un CAR CD33 descrito en la presente y un segundo CAR, por ejemplo, un c A r inhibidor o un CAR que se une específicamente a un antígeno que no es CD33 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 o receptor de folato beta). En tales casos, las dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR están codificadas por una única molécula de ácido nucleico en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En este aspecto, los dos o más CAR pueden, por ejemplo, estar separados por uno o más sitios de escisión peptídica (por ejemplo, un sitio de autoescisión o un sustrato para una proteasa intracelular). Los ejemplos de sitios de escisión peptídica incluyen los siguientes, donde los residuos GSG son opcionales:

T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 389)

P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 390)

E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 391)

F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 392)

En la técnica existe constancia de métodos para introducir y expresar genes en una célula. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora, por ejemplo, células de mamífero, bacterianas, de levaduras o de insectos mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la transfección con fosfato de calcio.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más ampliamente utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Otros vectores víricos pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simplex I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5350674 y 5585 362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal a modo de ejemplo para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Se dispone de otros métodos de vanguardia de suministro dirigido de ácidos nucleicos tales como el suministro de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas u otro sistema de suministro adecuado para tamaños submicrométricos.

En el caso en el que se utiliza un sistema de suministro no vírico, un vehículo de suministro a modo de ejemplo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otra manera con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura «colapsada». También pueden simplemente intercalarse en una solución, posiblemente formando agregados que no tienen un tamaño o forma uniformes. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las microgotas grasas que se producen de forma natural en el citoplasma, así como también la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de proveedores comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimiristilfosfatidilcolina («DMPC») de Sigma, St. Louis, m O; se puede obtener fosfato de dicetilo («DCP») de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener colesterol («Choi») de Calbiochem-Behring; se puede obtener dimiristilfosfatidilglicerol («DMPG») y otros lípidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones de partida de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente - 20°C. El cloroformo se utiliza como el único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. «Liposoma» es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos encerrados. Los liposomas pueden estar caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos de Lipofectamine-ácido nucleico.

Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora o exponer de otra manera una célula al inhibidor de la presente divulgación, con el fin de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, se pueden realizar varios ensayos. Los ensayos de este tipo incluyen, por ejemplo, ensayos «biológicos moleculares» muy conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos «bioquímicos», tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA e inmunoelectrotransferencia) o por ensayos descritos en la presente para identificar agentes comprendidos en el alcance de la divulgación.

La presente divulgación proporciona además un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR. En un aspecto, con un vector CAR se puede transducir directamente una célula, por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o expresión, por ejemplo, un vector que incluye, sin carácter limitante, uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas diminutos dobles), constructos vectoriales retrovíricos y lentivíricos. En un aspecto, el vector es capaz de expresar la construcción CAR en células T de mamífero. En un aspecto, en linfocito T de mamífero es un linfocito T humano.

Fuentes de células

Antes de la expansión y modificación genética, se obtiene una fuente de células (por ejemplo, células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) a partir de un sujeto. El término «sujeto» se pretende que incluya organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Los linfocitos T se pueden obtener de un cierto número de fuentes, incluidas las células mononucleares de la sangre periférica, la médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.

En ciertos aspectos de la presente invención, se puede utilizar cualquier número de líneas de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos n K) disponibles en la técnica. En ciertos aspectos de la presente invención, los linfocitos T se pueden obtener de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tal como la separación con Ficoll™ . En un aspecto preferido, se obtienen células de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluidos linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En un aspecto de la invención, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no todos.

Las etapas de activación iniciales en ausencia de calcio pueden conducir a una activación magnificada. Como los expertos ordinarios en la técnica apreciarían fácilmente, una etapa de lavado se puede lograr mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como utilizando una centrífuga semiautomática de «flujo continuo» (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS exento de Ca, exento de Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden separar y las células resuspender directamente en medios de cultivo.

Se reconoce que los métodos de la solicitud pueden utilizar condiciones de medios de cultivo que comprenden un 5% o menos, por ejemplo, un 2%, de suero AB humano, y emplear composiciones y condiciones de medios de cultivo conocidas, por ejemplo, las descritas en Smith et al., «Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement» Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.

En un aspecto, los linfocitos T se aíslan de linfocitos de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y depletando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLLTM o por elutriación centrífuga de contraflujo.

Una subpoblación específica de linfocitos T, tales como los linfocitos T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, se puede aislar adicionalmente mediante técnicas de selección positivas o negativas. Por ejemplo, en un aspecto, los linfocitos T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para una selección positiva de los linfocitos T deseados. En un aspecto, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En un aspecto adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto adicional, el período de tiempo es de al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro aspecto preferido más, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En un aspecto, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL, por sus siglas en inglés) del tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficacia de captura de linfocitos T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo en que se permite que los linfocitos T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas respecto a linfocitos T (tal como se describe más adelante en la presente), se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de subpoblaciones de linfocitos T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales durante el proceso. Adicionalmente, al aumentar o disminuir la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de las subpoblaciones de linfocitos T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados. El experto reconocería que también se pueden utilizar múltiples rondas de selección en el contexto de esta invención. En determinados aspectos, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y utilizar las células «no seleccionadas» en el proceso de activación y expansión. Las células «no seleccionadas» también se pueden someter a rondas adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8. En determinados aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar de manera positiva en linfocitos T reguladores que expresan típicamente CD4+, CD25+, CD62Lelevado, GITR+ y FoxP3+. Como alternativa, en ciertos aspectos, los linfocitos T reguladores se depletan con perlas conjugadas con anticuerpo anti-C25 u otros métodos de selección similares.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir, por ejemplo, la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que son una población depletada de linfocitos T reguladores, células depletadas de CD25+, utilizando, por ejemplo, una técnica de selección negativa, por ejemplo, descrita en la presente. Preferentemente, la población de células depletadas de linfocitos T reguladores contiene menos de un 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, se eliminan de la población utilizando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o ligando de unión a CD25 se conjuga con un sustrato, por ejemplo, una perla, o de lo contrario se utiliza para recubrir un sustrato, por ejemplo, una perla. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, se conjuga con un sustrato tal como se describe en la presente.

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, se eliminan de la población utilizando un reactivo de depleción de CD25 de Miltenyi™. En una realización, la relación de células respecto al reactivo de depleción de CD25 es de 1e7 células respecto a 20 uL, o de 1e7 células respecto a 15 uL, o de 1e7 células respecto a 10 uL, o de 1e7 células respecto a 5 uL, o de 1e7 células respecto a 2,5 uL, o de 1e7 células respecto a 1,25 uL. En una realización, por ejemplo, para linfocitos T reguladores, por ejemplo, la depleción de CD25+, se utilizan más de 500 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 600, 700, 800 o 900 millones de células/mL.

En una realización, la población de células efectoras inmunitarias que se va a depletar incluye aproximadamente 6 x 109 linfocitos T CD25+. En otros aspectos, la población de células efectoras inmunitarias que va a depletar incluye de aproximadamente 1 x 109 a 1x 1010 linfocitos T CD25+, y cualquier valor entero intermedio. En una realización, la población resultante de células depletadas de linfocitos T tiene 2 x 109 linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, o menos (por ejemplo, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107, o menos células CD25+).

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, se eliminan de la población utilizando el sistema CliniMAC con un conjunto de tubos de depleción tales como, por ejemplo, los tubos 162-01. En una realización, el sistema CliniMAC se ejecuta en una configuración de depleción tal como, por ejemplo, DEPLETION2.1.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, la reducción del nivel de reguladores negativos de las células inmunitarias (por ejemplo, disminución del número de células inmunitarias no deseadas, por ejemplo, linfocitos T^{r e g}), en un sujeto antes de la aféresis o durante la producción de un producto de tipo célula que expresa CAR puede reducir el riesgo de recaídas del sujeto. Por ejemplo, en la técnica existe constancia de métodos para depletar linfocitos T^{r e g}. Los métodos de disminución de linfocitos T^{r e g}incluyen, sin carácter limitante, ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR (un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente), depleción de CD25, y combinaciones de estos.

En algunas realizaciones, los métodos de producción comprenden reducir el número de (por ejemplo, depletar) linfocitos T^{r e g}antes de la producción de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, los métodos de producción comprenden poner en contacto la muestra, por ejemplo, la muestra de aféresis, con un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-CD25 (o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25), por ejemplo, para depletar linfocitos T^{r e g}antes de producir el producto de tipo célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T, linfocito NK).

En una realización, se pretrata un sujeto con una o más terapias que reducen los linfocitos T^{r e g}antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR. En una realización, los métodos para disminuir los linfocitos T^{r e g}incluyen, sin carácter limitante, la administración al sujeto de uno o más de: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, depleción de CD25 o una combinación de estos. La administración de uno o más de: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, depleción de CD25 o una combinación de estos puede ocurrir antes, durante o después de una infusión del producto de tipo célula que expresa CAR.

En una realización, se pretrata un sujeto con ciclofosfamida antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR. En una realización, se pretrata un sujeto con un anticuerpo anti-GITR antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR.

En una realización, la población de células que se van a eliminar no son linfocitos T reguladores ni células tumorales, sino células que afectan negativamente de otra manera la expansión y/o función de los linfocitos CART, por ejemplo, células que expresan CD14, CD11b, CD33, CD15 u otros marcadores expresados por células potencialmente inmunosupresoras. En una realización, se contempla que tales células se eliminen a la vez que los linfocitos T reguladores y/o células tumorales, o tras dicha depleción, o en otro orden.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir más de un paso de selección, por ejemplo, más de un paso de depleción. El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr, por ejemplo, con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales puede incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir además la eliminación de células de la población que expresa un tumor antigénico, por ejemplo, un tumor antigénico que no comprende CD25, por ejemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 o CD11b, para proporcionar de esta manera una población de células depletadas de linfocitos T reguladores, por ejemplo, depletadas de CD25+, y depletadas de antígenos tumorales que son adecuadas para la expresión de un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente. En una realización, las células que expresan antígenos tumorales se eliminan simultáneamente con los linfocitos T reguladores, por ejemplo, CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir al mismo sustrato, por ejemplo, perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, o el anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral es secuencial y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

También se proporcionan métodos que incluyen eliminar células de la población que expresan un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descritos en la presente, por ejemplo, una o más células PD1+, células LAG3+, y células TIM3+, para proporcionar de esta manera una población de células depletadas de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células depletadas de CD25+, y depletadas de inhibidores de puntos de control, por ejemplo, células depletadas de PD1+, LAG3+ y/o TIM3+. Los inhibidores de puntos de control a modo de ejemplo incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta. En una realización, las células que expresan un inhibidor de puntos de control se eliminan simultáneamente con los linfocitos T reguladores, por ejemplo, CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a la misma perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y el anticuerpo anti-inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el inhibidor de puntos de control es secuencial y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

En una realización, se puede seleccionar una población de linfocitos T que expresa uno o más de: IFN-Y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citoquinas. Se pueden determinar métodos para el cribado de la expresión celular, por ejemplo, según los métodos descritos en la Publicación de PCT N.°: WO 2013/126712.

Para el aislamiento de una población de células deseada mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las perlas y las células (por ejemplo, aumento de la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 2 billones de células/mL. En un aspecto, se utiliza una concentración de 1 billón de células/mL. En un aspecto adicional, se utilizan más de 100 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/mL. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/mL. En aspectos adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/mL.

El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como linfocitos T negativos para CD28, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y serían deseables de obtener. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona las células que expresan cantidades elevadas de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles más elevados de CD28 y se capturan de manera más eficaz que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizada es 5 X 10e6/mL. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 X 105/ml a 1 X 106/ml, y cualquier valor entero entremedias.

En otros aspectos, las células se pueden incubar en un dispositivo rotatorio durante períodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Los linfocitos T para estimulación también se pueden congelar después de un paso de lavado. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, el paso de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al separar granulocitos y, en cierta medida, monocitos en la población celular. Después del paso de lavado que separa el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en la técnica y serán útiles en este contexto, un método conlleva el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO, o un 31,25% de Plasmalyte-A, un 31,25% de Dextrosa 5%, un 0,45% de NaCl, un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO u otros medios de congelación celular adecuados que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan después a -80°C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En ciertos aspectos, las células crioconservadas se descongelan y se lavan tal como se describe en la presente y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación utilizando los métodos de la presente invención.

También se contempla en el contexto de la invención la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior al momento en que se podrían necesitar las células expandidas tal como se describen en la presente. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir se puede recoger en cualquier punto temporal necesario, y las células deseadas, tales como células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, aislar y congelar para su uso posterior en terapia con células, por ejemplo, la terapia con linfocitos T para cualquier número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con células, por ejemplo, terapia con linfocitos T, tales como las descritas en la presente. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertos aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En ciertos aspectos, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, se pueden expandir, congelar y utilizar en un momento posterior. En ciertos aspectos, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular tal como se describe en la presente, pero antes de cualesquiera tratamientos. En un aspecto adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o de una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, sin carácter limitante, tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación.

En un aspecto adicional de la presente invención, los linfocitos T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento que deja al sujeto con linfocitos T funcionales. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular los tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en que los pacientes normalmente se recuperarían del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada en lo que respecta a su capacidad de expandirse ex vivo. Del mismo modo, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos descritos en la presente, estas células pueden estar en un estado preferido para un mejor prendimiento del injerto y expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recoger células de la sangre, incluidos linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertos aspectos, los regímenes de movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y acondicionamiento pueden utilizarse para crear una condición en un sujeto en el que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos de células particulares, especialmente durante un intervalo de tiempo definido después de la terapia. Los tipos ilustrativos de células incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

En un caso, las células efectoras inmunitarias que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en al presente, se obtienen de un sujeto que ha recibido una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR. En una realización, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que se va a modificar para expresar un CAR, se extrae después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente con la dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, en el sujeto o extraídas del sujeto se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En otras realizaciones, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o incrementa la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T.

En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en diaglicerol-cinasa (DGK, por sus siglas en inglés). Las células deficientes en d Gk incluyen células que no expresan ARN o proteína de DGK, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de DGK. Las células deficientes en DGK se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administración de agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, miARN, para reducir o prevenir el expresión de DGK. Como alternativa, las células deficientes en DGK se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de DGK descritos en la presente.

En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan el ARN o la proteína de Ikaros, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de Ikaros, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administrando agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, miARN, para reducir o evitar la expresión de Ikaros. Como alternativa, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.

En algunas realizaciones, una población de linfocitos T es deficiente en DGK y deficiente en Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK ni Ikaros, o tiene una reducción o inhibición de la actividad de DGK e Ikaros. Tales células deficientes en DGK e Ikaros se pueden generar mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En una realización, los linfocitos NK se obtienen del sujeto. En otra realización, los linfocitos NK son una línea de linfocitos NK, por ejemplo, línea de linfocitos NK-92 (Conkewest).

CAR aloaénico

En las realizaciones descritas en la presente, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. Por ejemplo, la célula puede ser un linfocito T alogénico, por ejemplo, un linfocito T alogénico que carece de la expresión de un receptor de linfocitos T (TCR) y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA de clase I y/o h La de clase II, funcionales.

Un linfocito T que carece de un TCR funcional se puede, por ejemplo, modificar de manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, modificar de manera que no exprese una o más subunidades que comprenden un TCR funcional (por ejemplo, modificar de manera que no exprese (o muestre una expresión reducida) de TCR alfa, TCR beta, TCR gamma, TCR delta, TCR épsilon y/o TCR zeta) o modificar de manera que produzca muy poco TCR funcional en su superficie. Como alternativa, el linfocito T puede expresar un TCR sustancialmente alterado, por ejemplo, por expresión de formas mutadas o truncadas de una o más subunidades del TCR. La expresión «TCR sustancialmente alterado» significa que este TCR no suscita una reacción inmunitaria adversa en un hospedador.

Un linfocito T descrito en la presente se puede, por ejemplo, modificar de manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, un linfocito T descrito en la presente, se puede modificar de modo que la expresión en la superficie celular de HLA, por ejemplo, HLA de clase 1 y/o HLA de clase II, experimente una disminución regulada. En algunos aspectos, se puede lograr una disminución regulada de HLA reduciendo o eliminando la expresión de la microglobulina beta-2 (B2M, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones, el linfocito T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

Los linfocitos T modificados que carecen de un TCR y/o HLA funcionales se pueden obtener mediante cualquier medio adecuado, incluida la supresión o disminución de una o más subunidades de t Cr o HLA. Por ejemplo, el linfocito T puede incluir una disminución de TCR y/o HLA utilizando ARNip, ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasa con dedos de zinc (ZFN).

En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa en niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, una célula modificada por cualquier método descrito en la presente. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no expresa o expresa con niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que puede reducir la capacidad de una célula que expresa CAR para organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEAC^aM (por ejemplo, CEACAM-1, CEAC^aM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, por inhibición al nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el comportamiento de la célula que expresa CAR. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en la presente.

ARNip y ARNhc para inhibir TCR o HLA

En algunas realizaciones, se puede inhibir la expresión de TCR y/o la expresión de HLA utilizando ARNip o ARNhc que tiene como diana un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta), en un linfocito T.

La expresión de ARNip o ARNhc en linfocitos T se puede lograr utilizando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de expresión lentivírico.

Los ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de componentes del TCR se describen, por ejemplo, en la Publicación de EE. UU. N.°: 2012/0321667. Los ARNip y ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de los genes de HLA de clase I y/o HLA de clase II se describen, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. N.°: US 2007/0036773.

CRISPR para inhibir TCR o HLA

El término «CRISPR» o «CRISPR contra TCR y/o HLA» o «CRISPR para inhibir TCR y/o HLA», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares, o un sistema que comprende un conjunto de repeticiones de este tipo. El término «Cas», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema «CRISPR/Cas» se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que se puede utilizar para silenciar o mutar un gen de TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta).

Se observan sistemas CRISPR/Cas de origen natural en aproximadamente un 40% de los genomas eubacterianos secuenciados y en un 90% de las arqueas secuenciadas. Grissa et al., (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al., (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al., (2008) Science 322: 1843-1845.

El sistema CRISPR/Cas ha sido modificado para su uso en la edición génica (silenciar, potenciar o cambiar genes específicos) en eucariotas tales como ratones o primates. Wiedenheft et al., (2012) Nature 482: 331-8. Esto se logra introduciendo en la célula eucariota un plásmido que contiene un CRISPR diseñado específicamente y una o más Cas apropiadas.

La secuencia CRISPR, a veces denominada locus CRISPR, comprende repeticiones y espaciadores que se alternan. En un CRISPR de origen natural, los espaciadores comprenden normalmente secuencias exógenas respecto a la bacteria tal como una secuencia de fago o plásmido; en el sistema CRISPR/Cas TCR y/o HLA, los espaciadores se derivan de la secuencia del gen TCR o HLA.

El ARN del locus CRISPR es expresado de manera constitutiva y procesado por proteínas Cas para obtener ARN pequeños. Estos comprenden un espaciador flanqueado por una secuencia repetida. Los ARN guían otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos a nivel de ARN o ADN. Horvath et al., (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al., (2006) Biology Direct 1: 7. Los espaciadores sirven de este modo como moldes para moléculas de ARN, de manera análoga a los ARNip. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

Ya que estos ocurren de manera natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas de los CRISPR y la estructura, función y número de genes Cas y su producto difieren un tanto de unas especies a otras. Haft et al., (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al., (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al., (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al., (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al., (2005) Microbiol. 151: 653-663; y Stern et al., (2010) Trends. Genet.

28: 335-340. Por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de ARN CRISPR para obtener unidades de espaciador-repetición que retiene Cascade. Brouns et al., (2008) Science 321: 960-964. En otras procariotas, Cas6 procesa el transcrito CRISPR. La inactivación de fagos basada en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. La proteína Cmr (módulo Cas RAMP) en Pyrococcus furiosus y otras procariotas forman un complejo funcional con ARN CRISPR pequeños que reconoce y escinde ARN diana complementarios. Un sistema CRISPR más simple depende de la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada hebra de la doble hélice. La combinación de Cas9 y ARN del locus CRISPR modificado se puede utilizar en un sistema para la edición génica. Pennisi (2013) Science 341: 833 836.

El sistema CRISPR/Cas se puede utilizar, por lo tanto, para editar un gen de TCR y/o HLA (añadiendo o eliminando un par de bases) o introducir una parada prematura que disminuya de esta manera la expresión de TCR y/o HLA. Como alternativa, el sistema CRISPR/Cas se puede utilizar como un ARN de interferencia, desactivando el gen de TCR y/o HLA de manera reversible. En una célula de mamífero, por ejemplo, el ARN puede guiar la proteína Cas a un promotor de TCR y/o HLA, y bloquear estéricamente las ARN-polimerasas.

Se pueden generar sistemas CRISPR/Cas artificiales que inhiben TCR y/o HLA, utilizando tecnología conocida en la técnica, por ejemplo, la descrita en la Publicación de EE. UU. N.° 20140068797 y Cong (2013) Science 339: 819-823. También se pueden generar otros sistemas CRISPR/Cas que se conocen en la técnica que inhiben TCR y/o HLA, por ejemplo, el descrito en Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patente de EE. UU. N.°: 8 871 445; 8865 406; 8 795 965; 8771 945; y 8697 359.

TALEN para inhibir TCR o HLA

El término «TALEN» o «TALEN contra HLA y/o TCR» o «TALEN para inhibir HLA y/o TCR» se refiere a una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, una nucleasa artificial que se puede utilizar para editar el gen de HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGFR beta).

Los TALEN se producen de manera artificial fusionando un dominio de unión a ADN del efector TAL con un dominio de escisión de ADN. Los efectos de tipo activación de la transcripción (TALE) se pueden modificar para que se unan a cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una porción del gen de HLA o TCR. Al combinar un TALE modificado con un dominio de escisión de ADN, se puede producir una enzima de restricción que es específica para cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una secuencia HLA o TCR. Estas se pueden introducir posteriormente en una célula, donde se pueden utilizar para la edición genómica. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; y Boch et al., (2009) Science 326: 1509 12; Moscou et al., (2009) Science 326: 3501.

Los TALE son proteínas secretadas por bacterias Xanthomonas. El dominio de unión a ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos muy conservados con excepción de los aminoácidos 12.° y 13.°. Estas dos posiciones son muy variables y muestran una sólida correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. Por lo tanto, se pueden modificar para unirse a una secuencia de ADN deseada.

Para producir un TALEN, se fusiona una proteína TALE a una nucleasa (N), que es una endonucleasa Fokl de tipo natural o mutada. Se han realizado varias mutaciones en Fokl para su uso en TALEN; estas, por ejemplo, mejoran la especificidad o actividad de escisión. Cermak et al., (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al., (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al., (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al., (2011) Science 333: 307; Doyon et al., (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al., (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.

El dominio Fokl funciona como un dímero, que requiere dos constructos con dominios de unión a ADN únicos para sitios en el genoma diana con una orientación y separación adecuadas. Tanto el número de residuos aminoacídicos entre el dominio de unión a ADN de TALE y el dominio de escisión Fokl como el número de bases entre dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr niveles elevados de actividad. Miller et al., (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.

Se puede utilizar una TALEN para HLA o TCR dentro de una célula para producir una rotura bicatenaria (DSB, por sus siglas en inglés). Se puede introducir una mutación en el sitio de rotura si los mecanismos de reparación reparan de manera incorrecta la ruta mediante unión de extremos no homólogos. Por ejemplo, la reparación incorrecta puede introducir una mutación del marco de lectura. Como alternativa, se puede introducir ADN exógeno en la célula junto con la TALEN; dependiendo de las secuencias del ADN exógeno y la secuencia cromosómica, este proceso se puede utilizar para corregir un defecto en el gen de HLA o TCR o introducir un defecto de este tipo en un gen de HLA o TCR de tipo natural, y reducir de este modo la expresión de HLA o TCR.

Se pueden construir TALEN específicas para secuencias en HLA o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluidos varios esquemas que utilizan componentes modulares. Zhang et al., (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.

Nucleasa con dedos de zinc para inhibir HLA y/o TCR

El término «ZFN» o «Nucleasa con dedos de zinc» o «ZFN contra HLA y/o TCR» o «ZFN para inhibir HLA y/o TCR» se refiere a una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa artificial que se puede utilizar para editar el gen de HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGFR beta).

Como una TALEN, una ZFN comprende un dominio nucleasa Fokl (o derivado de este) fusionado con un dominio de unión a ADN. En el caso de una ZFN, el dominio de unión a ADN comprende uno o más dedos de zinc. Carroll et al., (2011) Genetics Society o f America 188: 773-782; y Kim et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico estabilizado por uno o más iones de zinc. Un dedo de zinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2, y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Se pueden combinar diversos dedos de zinc de especificidad conocida para producir polipéptidos con múltiples dedos que reconocen secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb. Se puede disponer de diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de zinc (y combinaciones de estos) que reconocen secuencias específicas, incluidos la presentación en fagos, sistemas de único híbrido en levaduras, sistemas de único híbrido y de doble híbrido bacterianos, y células de mamífero.

Como una TALEN, una ZFN debe dimerizar para escindir ADN. Por lo tanto, se necesita un par de ZFN para tener como diana sitios de ADN no palindrómicos. Las dos ZFN individuales deben unirse a hebras opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente separadas. Bitinaite et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.

También al igual que una TALEN, una ZFN puede crear una rotura bicatenaria en el ADN, que puede crear una mutación del marco de lectura si se repara de forma incorrecta, lo que conlleva un descenso en la expresión y cantidad de HLA y/o TCR en una célula. Las ZFN también se pueden utilizar con recombinación homóloga para mutar en el gen de HLA o TCR.

Se pueden construir ZFN específicas para secuencias en HLA y/o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al., (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al., (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; Publicación de Patente de EE. UU. 2011/0158957; y Publicación de Patente de EE. UU. 2012/0060230.

Expresión de telomerasa

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, en algunas realizaciones, un linfocito T terapéutico tiene una persistencia poco prolongada en un paciente, debido a telómeros acortados en el linfocito T; en consecuencia, la transfección con un gen de telomerasa puede alargar los telómeros del linfocito T y mejorar la persistencia del linfocito T en el paciente. Remítase a Carl June, «Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic», Journal o f Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Por lo tanto, en una realización, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T, expresa de manera ectópica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. En algunos aspectos, esta divulgación proporciona un método para producir una célula que expresa CAR, que comprende poner en contacto una célula con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. La célula se puede poner en contacto con el ácido nucleico antes, a la vez o después de ponerse en contacto con un constructo que codifica un CAR.

En un aspecto, la divulgación presenta un método para generar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos Nk ). En un caso, el método comprende: proporcionar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica un CAR; y poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, hTERT, en condiciones que permiten la expresión de CAR y la telomerasa.

En un caso, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa es ADN. En un caso, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa comprende un promotor capaz de impulsar la expresión de la subunidad de telomerasa.

En un caso, hTERT tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de la ID de proteína AAC51724.1 del GenBank (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization» Ce//tomo 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795):

MPRAPRCRA VRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLV QRGDP AAFR ALV A QCFVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCFKEFVARVFQRFCERGAKNYFAFGFAFFDGARG GPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRYGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCA YQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRR GGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEA TSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQL RPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNH AQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSP WQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVR GCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRL FFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPI VNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAW RTFVLRVRAQDPPPELYFVKVD VTG A YDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTY C VRRY A VV QK AAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFD VFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRL VDDFLLVTPHLTH AKTFLRTLVRG VPE Y GC V VNLRKTV VNFP VEDE ALGGT AF V QMP AHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLK CHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTA SLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLR TAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 157)

En un caso, la hTERT tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la secuencia de la SEQ ID NO: 157. En un caso, la hTERT tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 157. En un caso, la hTERT comprende una deleción (por ejemplo, como máximo 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N, el extremo C o ambos. En un caso, la hTERT comprende una secuencia de aminoácidos transgénica (por ejemplo, de como máximo 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N, el extremo C o ambos.

En un caso, la hTERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico con el N.° de acceso AF018167 del GenBank (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization» Cell tomo 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795):

1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1 Q A 1 rW * r 5 r5 r rC ct k.C nt. r5 rW r » C nt. r5 rC nt. 5 r r r 5 r L r » W n U r . r5 r 5 r W r * a C I r 5 r r W , o U t . rL , W r v 5 r 5 r 5 m U o .U r . v5 W W U r r . r5 r 5 / - W * r W * r * W r r 5 r W * W W L 5 W L 5 o U. /W■»!■ 5*■ LWWU.5U.WLWW 1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg

3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc

3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct

3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc

3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc

3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc

3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc

3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt

3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg

3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa

4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 158)

En un caso, la hTERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98% o un 99% a la secuencia de la SEQ ID NO: 158. En un caso, hTERT está codificada por un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 158.

Activación y expansión de linfocitos T

Los linfocitos T se pueden activar y expandir generalmente utilizando métodos como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU.6352 694; 6534 055; 6905 680; 6692 964; 5858 358; 6887 466; 6905 681; 7 144575; 7067 318; 7 172869; 7232 566; 7 175843; 5883 223; 6905 874; 6797 514; 6867 041; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 20060121005.

Por lo general, los linfocitos T de la invención se pueden expandir por contacto con una superficie que tiene unido a ella un agente que estimula una señal asociada con el complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T. En particular, las poblaciones de linfocitos T se pueden estimular tal como se describe en la presente, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión al antígeno de este, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, se pueden utilizar un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 que se puede utilizar incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besanqon, Francia), al igual que otros métodos de uso común en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

En ciertos aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para el linfocito T se pueden proporcionar mediante diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada una de las señales pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando están acoplados a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación «cis») o a superficies separadas (es decir, en formación «trans»). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En determinados aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble y después entrecruzarse con una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, remítase, por ejemplo, a las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. u U. N.os 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC, por sus siglas en inglés) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de linfocitos T en la presente invención.

En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan sobre perlas, ya sea en la misma perla, es decir, «cis» o en perlas separadas, es decir, «trans». A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno de este y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno de este; y ambos agentes se coinmovilizan en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una relación de 1:1 de cada uno de los anticuerpos unidos a las perlas para la expansión de linfocitos T CD4+ y el crecimiento de linfocitos T. En ciertos aspectos de la presente invención, se utiliza una relación de anticuerpos anti-CD3:CD28 unidos a las perlas tal que se observa un aumento en la expansión de linfocitos T en comparación con la expansión observada utilizando una relación de 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una relación de 1:1. En un aspecto, la relación de anticuerpo para CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto de la presente invención, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es inferior a uno. En ciertos aspectos de la invención, la relación de anticuerpo anti-CD28 respecto a anticuerpo anti-CD3 unido a las perlas es superior a 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:100 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:75 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto adicional, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:50 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:30 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto preferido, se utiliza relación de CD3:CD28 de 1:10 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza relación de CD3:CD28 de 1:3 del anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto más, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 3:1 de anticuerpo unido a las perlas.

Se pueden utilizar relaciones de partículas respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero entre ellos para estimular linfocitos T u otras células diana. Como los expertos en la técnica apreciarán fácilmente, la relación de partículas respecto a células puede depender del tamaño de partícula con relación a la célula diana. Por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño solo se pueden unir a unas pocas células, mientras que las perlas más grandes se pueden a unir muchas. En ciertos aspectos, la relación de células respecto a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio, y en aspectos adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, que también se pueden utilizar para estimular los linfocitos T. Las relaciones de partículas anti-CD3 y anti-CD28 acopladas respecto a los linfocitos T que da como resultado la estimulación de los linfocitos T puede variar tal como se ha señalado anteriormente, sin embargo ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, y 15:1 siendo una relación preferida al menos 1:1 partículas por linfocito T. En un aspecto, se utiliza una relación de partículas respecto a células de 1:1 o inferior. En un aspecto particular, una relación de partículas:células preferida es 1:5. En aspectos adicionales, la relación de partículas respecto a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la relación de partículas respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o en días alternos a partir de entonces durante hasta 10 días, con relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basadas en recuentos de células el día de la adición). En un aspecto particular, la relación de partículas respecto a células es 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden a diario o en días alternos con una relación final de 1:1 el primer día y de 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, la relación de partículas respecto a células es 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden sobre una base diaria o día por medio a una relación final de 1:1 el primer día y de 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que pueden ser adecuadas diversas relaciones diferentes para su uso en la presente invención. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula. En un aspecto, las relaciones más típicas para su uso son próximas a 1:1, 2:1 y 3:1 el primer día.

En aspectos adicionales de la presente invención, las células, tales como los linfocitos T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y entonces se cultivan las células. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En un aspecto adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que da como resultado un incremento del ligamiento de los marcadores de la superficie celular, y con ello se induce la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular se pueden ligar permitiendo que perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con los linfocitos T. En un aspecto, las células (por ejemplo, de 104 a 109 linfocitos T) y perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T con una relación de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo, p Bs (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). Nuevamente, los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender solo un 0,01% de la muestra o toda la muestra (es decir, un 100%) puede comprender la célula diana de interés. En consecuencia, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente invención. En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 10 000 millones de células/mL, 9000 millones/mL, 8000 millones/mL, 7000 millones/mL, 6000 millones/mL, 5000 millones/mL o 2000 millones de células/mL. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/mL. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/mL. En aspectos adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/mL. El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares elevadas permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como linfocitos T negativos para CD28. Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en ciertos aspectos. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un caso, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente, se expanden, por ejemplo, mediante un método descrito en la presente. En un caso, las células se expanden en cultivo durante un periodo de varias horas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) a aproximadamente 14 días (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días). En un caso, las células se expanden durante un periodo de 4 a 9 días. En un caso, las células se expanden durante un periodo de 8 días o menos, por ejemplo, 7, 6 o 5 días. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD33 descrita en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes son más potentes que las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. La potencia se puede definir, por ejemplo, mediante diversas funciones de los linfocitos T, por ejemplo, proliferación, muerte de células diana, producción de citocinas, activación, migración o combinaciones de estas. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD33 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres o cuatro veces en duplicaciones de células tras la estimulación del antígeno, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, las células que expresan un CAR CD33 descrito en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes muestran una producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, superior en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD33 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, diez veces o más en pg/mL de producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo.

En un aspecto de la presente invención, la mezcla se puede cultivar durante de varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero por hora entre ellos. En un aspecto, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En un aspecto de la invención, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante aproximadamente ocho días. En un aspecto, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante 2-3 días. También pueden ser deseables varios ciclos de estimulación, de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más. Las condiciones apropiadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Mínimo Esencial o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluido suero (por ejemplo, suero humano o bovino fetal), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocidos por el experto. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, sin carácter limitante, un tensioactivo, Plasmanate y agentes reductores, tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, Dm Em , MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o con un suplemento de una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de linfocitos T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para propiciar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más un 5% de CO2) apropiadas.

En una realización, las células se expanden en un medio apropiado (por ejemplo, medio descrito en la presente) que incluye una o más interleucinas lo que da como resultado un incremento de al menos 200 veces (por ejemplo, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces) de células a lo largo de un periodo de expansión de 14 días, por ejemplo, según se mide mediante un método descrito en la presente tal como citometría de flujo. En una realización, las células se expanden en presencia de IL-15 y/o IL-7 (por ejemplo, IL-15 e IL-7).

En casos, los métodos descritos en la presente, por ejemplo, métodos de producción de células que expresan CAR, comprenden eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población celular, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En la presente se describen métodos para eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población de células. En casos, los métodos, por ejemplo, métodos de producción, comprenden además poner en contacto una población de células (por ejemplo, una población de células en las que se han depletado los linfocitos T reguladores, tales como linfocitos T CD25+; o una población de células que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, o ligando de unión a CD25) con IL-15 y/o IL-7. Por ejemplo, la población de células (por ejemplo, que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento de este o ligando de unión a CD25) se expande en presencia de IL-15 y/o IL-7.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo interleucina-15 (IL-15), un polipéptido de tipo receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15, durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende una combinación de un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15 Ra durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo.

En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra durante la expansión ex vivo. En un caso, la puesta en contacto da como resultado la supervivencia y proliferación de una subpoblación de linfocitos, por ejemplo, linfocitos T CD8+.

Los linfocitos T que han sido expuestos a tiempos de estimulación variados pueden exhibir características diferentes. Por ejemplo, productos de tipo células mononucleares de la sangre o de la sangre periférica sometida a aféresis típicos tienen una población de linfocitos T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (TC, CD8+). La expansión ex vivo de linfocitos T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población cada vez mayor de linfocitos TC. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos TH. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de linfocitos TC específicos para el antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto hasta un grado mayor.

Además, aparte de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de adaptar un producto de tipo linfocitos T activados para fines específicos.

Una vez que se construye un CAR CD33, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tales como, sin carácter limitante, la capacidad de expandir las células T después de la estimulación con antígeno, mantener la expansión de linfocitos T en ausencia de reestimulación y actividades anticancerosas en modelos in vitro y en animales apropiados. Los ensayos para evaluar los efectos de un CAR CD33 se describen con más detalle más adelante.

Se puede utilizar el análisis por inmunoelectrotransferencia de la expresión de CAR en linfocitos T primarios para detectar la presencia de monómeros y dímeros. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, los linfocitos T (mezcla 1:1 de linfocitos T CD4+ y CD8+) que expresan los CAR se expanden in vitro durante más de 10 días, lo cual va seguido de lisis y SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los CAR que contienen el dominio citoplasmático TCR-Z completo y la cadena TCR-Z endógena se detectan mediante inmunoelectrotransferencia utilizando un anticuerpo para la cadena TCR-Z. Los mismos subconjuntos de linfocitos T se utilizan para el análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras para permitir la evaluación de la formación de dímeros covalentes.

La expansión in vitro de linfocitos T CAR+ después de la estimulación con antígeno se puede medir mediante citometría de flujo. Por ejemplo, se estimula una mezcla de células T CD4+ y CD8+ con aAPC aCD3/aCD28, lo cual va seguido de transducción con vectores lentivíricos que expresan GFP bajo el control de los promotores a analizar. Los promotores a modo de ejemplo incluyen promotores del gen IE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o de la fosfoglicerocinasa (PGK). La fluorescencia de GFP se evalúa el día 6 de cultivo en los subconjuntos de células T CD4+ y/o CD8+ mediante citometría de flujo. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Como alternativa, una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ se estimulan con perlas magnéticas recubiertas con aCD3/aCD28 el día 0, y se transducen con CAR el día 1 utilizando un vector lentivírico bicistrónico que expresa CAR junto con eGFP utilizando una secuencia de omisión ribosómica 2A. Los cultivos se reestimulan con células K562 CD19+ (K562-CD19), células K562 de tipo natural (K562 de tipo natural) o células K562 que expresan hCD32 y 4-1BBL en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (K562-BBL-3/28) después del lavado. Se añaden 100 U/mL de IL-2 exógena a los cultivos en días alternos. Los linfocitos T GFP+ se enumeran por citometría de flujo utilizando un recuento basado en las perlas. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Se pueden realizar ensayos similares utilizando linfocitos T anti-CD123 (remítase, por ejemplo, a Gill et al. Blood 2014;123:2343) o con linfocitos T CAR anti-CD33.

También se puede medir la expansión sostenida de linfocitos T CAR+ en ausencia de reestimulación. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, el volumen medio para linfocitos T (fl) se mide el día 8 de cultivo utilizando un contador de partículas Multisizer III de Coulter, un Cellometer Vision de Nexcelom o Scepter de Millipore, después de la estimulación con perlas magnéticas recubiertas con aCD3/aCD28 el día 0, y la transducción con el CAR indicado el día 1.

También se pueden utilizar modelos en animales para medir la actividad de un CART. Por ejemplo, se puede utilizar un modelo de xenoinjerto utilizando linfocitos T CAR+ específicos para CD19 para tratar una pre-B ALL humana primaria en ratones inmunodeficientes. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, después del establecimiento de ALL, los ratones se distribuyen aleatoriamente en grupos de tratamiento. Se coinyectan diferentes números de linfocitos T modificados aCD19-Z y aCD19-BB-Z en una relación de 1:1 en ratones NOD-SCID-y'7' portadores de B-ALL. El número de copias del vector aCD19-Z y aCD19-BB-Z en ADN del bazo de ratones se evalúa en diversos momentos tras la inyección con linfocitos T. Se evalúa la leucemia en los animales en intervalos semanales. Se miden los recuentos de blastos de B-ALL CD19+ de la sangre periférica en ratones a los que se inyectan linfocitos T CAR+ aCD19-Z o linfocitos T con una transducción simulada. Las curvas de supervivencia de los grupos se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico. Además, también se pueden analizar los recuentos de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre periférica 4 semanas después de la inyección de linfocitos T en ratones NOD-SCID-y-/'. Se inyectan en ratones células leucémicas y 3 semanas más tarde se les inyectan linfocitos T modificados para expresar CAR mediante un vector lentivírico bicistrónico que codifica el CAR ligado a eGFP. Los linfocitos T se normalizan respecto a un 45-50% de linfocitos T GFP+ de entrada mezclando células que han experimentado una transducción simulada antes de la inyección, y se confirma mediante citometría de flujo. Se evalúa la leucemia en los animales en intervalos de 1 semana. Las curvas de supervivencia de los grupos de linfocitos T CAR+ se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico. Se pueden realizar experimentos similares con los CART CD33.

Se puede evaluar la respuesta al tratamiento con CAR dependiente de la dosis. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Por ejemplo, se obtiene sangre periférica 35-70 días después de establecer la leucemia en ratones inyectados el día 21 con linfocitos T CAR, un número equivalente de linfocitos T sometidos a una transducción simulada, o sin linfocitos T. Se extrae sangre de manera aleatoria de ratones de cada grupo para determinar los recuentos de blastos de ALL CD19+ en la sangre periférica y posteriormente se sacrifican los días 35 y 49. Los animales restantes se evalúan los días 57 y 70. Se pueden realizar experimentos similares con los CART CD33.

La evaluación de la proliferación celular y la producción de citocinas se ha descrito previamente, por ejemplo, en Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, la evaluación de la proliferación mediada por CAR se realiza en placas de microvaloración mezclando linfocitos T lavados con células K562 que expresan CD19 (K19) o CD32 y CD137 (KT32-BBL) para obtener una relación final de linfocito T:K562 de 2:1. Las células K562 se irradian con radiación gamma antes de su uso. Se añaden anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) a cultivos con células KT32-BBL para que actúen de control positivo para estimular la proliferación de linfocitos T, dado que estas señales propician la expansión a largo plazo de linfocitos T CD8+ ex vivo. Se enumeran los linfocitos T en los cultivos utilizando perlas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y citometría de flujo tal como lo describe el fabricante. Los linfocitos T CAR+ se identifican mediante la expresión de GFP utilizando linfocitos T que han sido modificados con vectores lentivíricos que expresan CAR ligado a eGFP-2A. Para los linfocitos T CAR+ que no expresan GFP, los linfocitos T CAR+ se detectan con proteína CD33 recombinante biotinilada y un conjugado secundario de avidina-PE. La expresión de CD4+ y CD8+ en células T también se detecta simultáneamente con anticuerpos monoclonales específicos (BD Biosciences). Las medidas de citocinas se realizan en sobrenadantes recogidos 24 horas después de la reestimulación utilizando el kit de matriz de perlas citométrico para citocinas de TH1/TH2 humanas (BD Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o utilizando un kit Luminex 30-plex (Invitrogen). La fluorescencia se evalúa utilizando un citómetro de flujo BD Fortessa, y los datos se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se pueden realizar experimentos similares con CART CD33.

La citotoxicidad se puede evaluar mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, las células diana (líneas K562 y células de pro-B-ALL primaria) se cargan con 51Cr (como NaCr04, New England Nuclear, Boston, MA) a 37 °C durante 2 horas con agitación frecuente, se lavan dos veces en RPMI completo y se colocan en placas de microvaloración. Los linfocitos T efectores se mezclan con las células diana en los pocillos en Rp MI completo con relaciones variables de célula efectora:célula diana (E:D). También se preparan pocillos adicionales que contienen solo medio (liberación espontánea, SR, por sus siglas en inglés) o una solución al 1% de detergente triton-X 100 (liberación total, TR, por sus siglas en inglés). Después de 4 horas de incubación a 37 °C, se extrae el sobrenadante de cada uno de los pocillos. El 51Cr liberado se mide a continuación utilizando un contador de partículas gamma (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condición se realiza al menos por triplicado, y el porcentaje de lisis se calcula utilizando la fórmula: % de lisis = (ER-SR) / (TR - SR), donde ER representa el 51Cr medio liberado para cada condición experimental.

Se pueden utilizar tecnologías de obtención de imágenes para evaluar el tráfico y proliferación específicos de los CAR en modelos en animales portadores de tumores. Tales ensayos se han descrito, por ejemplo, en Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Resumiendo, los ratones NOD/SCID/yc-7' (NSG) son inyectados IV con células Nalm-6 y 7 días después con linfocitos T 4 horas después de electroporación con los constructos CAR. Los linfocitos T están transfectados de manera estable con un constructo lentivírico para expresar luciferasa de luciérnaga, y se obtienen imágenes de los ratones por bioluminiscencia. Como alternativa, se pueden medir la eficacia terapéutica y especificidad de una única inyección de linfocitos T CAR+ en un modelo de xenoinjerto con Nalm-6 de la siguiente manera: Se inyectan Nalm-6 transducidas para expresar de manera estable luciferasa de luciérnaga en ratones NSG, seguidas de una única inyección en la vena de la cola de linfocitos T electroporados con CAR CD337 días más tarde. Se obtienen imágenes de los animales en diferentes puntos temporales después de la inyección. Por ejemplo, se pueden generar mapas cromáticos de densidad fotónica de leucemia positiva para la luciferasa de luciérnaga en ratones representativos el día 5 (2 días antes del tratamiento) y el día 8 (24 h después de PBL CAR+) También se pueden utilizar otros ensayos, incluidos los descritos en la sección de Ejemplos de la presente, así como los que se conocen en la técnica, para evaluar los constructos CAR CD33 de la invención.

Como alternativa, o en combinación con los métodos divulgados en la presente, se divulgan métodos y composiciones para uno o más de: detección y/o cuantificación de células que expresan CAR (por ejemplo, in vitro o in vivo (por ejemplo, seguimiento clínico)); expansión y/o activación de células inmunitarias; y/o selección específica de CAR, que conllevan el uso de un ligando de CAR. En un caso a modo de ejemplo, el ligando de CAR es un anticuerpo que se une a la molécula CAR, por ejemplo, se une al dominio de unión al antígeno extracelular de CAR (por ejemplo, un anticuerpo que se une al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo antidiotípico; o un anticuerpo que se une a una región constante del dominio de unión extracelular). En otros casos, el ligando de CAR es una molécula para el antígeno CAR (por ejemplo, una molécula para el antígeno CAR como se describe en la presente).

En un aspecto, se divulga un método para detectar y/o cuantificar células que expresan CAR. Por ejemplo, se puede utilizar el ligando CAR para detectar y/o cuantificar células que expresan CAR in vitro o in vivo (por ejemplo, monitorización clínica de células que expresan CAR en un paciente, o dosificación a un paciente). El método incluye: proporcionar el ligando de CAR (opcionalmente, un ligando de CAR marcado, por ejemplo, un ligando de CAR que incluye un marcador biológico, una perla, un marcador radioactivo o fluorescente);

adquirir la célula que expresa CAR (por ejemplo, adquirir una muestra que contiene células que expresan CAR, tal como una muestra de producción o una muestra clínica);

poner en contacto la célula que expresa CAR con el ligando de CAR en condiciones donde tiene lugar la unión, y detectar de esta manera el nivel (por ejemplo, cantidad) de las células que expresan CAR presentes. La unión de la célula que expresa CAR con el ligando de CAR se puede detectar utilizando técnicas estándar tales como FACS, ELISA y similares.

En otro aspecto, se divulga un método para expandir y/o activar células (por ejemplo, células efectoras inmunitarias). El método incluye:

proporcionar una célula que expresa CAR (por ejemplo, una primera célula que expresa CAR o una célula que expresa CAR de manera transitoria);

poner en contacto dicha célula que expresa CAR con un ligando de CAR, por ejemplo, un ligando de CAR tal como se describe en la presente), en condiciones en las que tiene lugar la expansión y/o proliferación de células inmunitarias, y producir de esta manera la población de células activadas y/o expandidas.

En ciertos casos, el ligando de CAR está presente en (por ejemplo, está inmovilizado o unido a un sustrato, por ejemplo, un sustrato que no tiene origen natural). En algunos casos, el sustrato es un sustrato no celular. El sustrato no celular puede ser un soporte sólido elegido de, por ejemplo, una placa (por ejemplo, una placa de microvaloración), una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa), una matriz, un chip o una perla. En casos, el ligando de CAR está presente en el sustrato (por ejemplo, en la superficie del sustrato). El ligando de CAR se puede inmovilizar, unir o asociar covalente o no covalentemente (por ejemplo, entrecruzar) al sustrato. En un caso, el ligando de CAR se une (por ejemplo, se une covalentemente) a una perla. En los casos mencionados anteriormente, la población de células inmunitarias se puede expandir in vitro o ex vivo. El método puede incluir además cultivar la población de células inmunitarias en presencia del ligando de la molécula CAR, por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En otros casos, el método para expandir y/o activar las células comprende además la adición de una segunda molécula estimuladora, por ejemplo, CD28. Por ejemplo, el ligando de CAR y la segunda molécula estimuladora se pueden inmovilizar en un sustrato, por ejemplo, una o más perlas, y proporcionar de esta manera un incremento de la expansión y/o activación celulares.

En otro aspecto más, se proporciona un método para seleccionar una célula que expresa CAR o para enriquecer en esta. El método incluye poner en contacto la célula que expresa CAR con un ligando de c A r tal como se describe en la presente; y seleccionar la célula en función de la unión del ligando de CAR.

En otros aspectos más, se proporciona un método para depletar, reducir y/o provocar la muerte de una célula que expresa CAR. El método incluye poner en contacto la célula que expresa CAR con un ligando de CAR tal como se describe en la presente; y actuar sobre la célula en función de la unión del ligando de CAR, y reducir de esta manera el número, y/o provocar la muerte, de la célula que expresa CAR. En un caso, el ligando de CAR se acopla a un agente tóxico (por ejemplo, una toxina o un fármaco citoablativo). En otro caso, el anticuerpo antidiotípico puede provocar la actividad de células efectoras, por ejemplo, actividad ADCC o ADC.

Los anticuerpos anti-CAR a modo de ejemplo que se pueden utilizar en los métodos divulgados en la presente se describen, por ejemplo, en el documento WO 2014/190273 y en Jena et al., «Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials», PLOS marzo de 2013 8:3 e57838. En un caso, la molécula de anticuerpo antidiotípico reconoce una molécula de anticuerpo anti-CD19, por ejemplo, un scFv anti-CD19. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo antidiotípico puede competir por la unión con el clon n.° 136.20.1 de mAb contra CAR específico para CD19 descrito en Jena et al., PLOS marzo 2013 8:3 e57838; puede tener las mismas CDR (por ejemplo, una o más de, por ejemplo, la totalidad de, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL, utilizando la definición de Kabat, la definición de Chothia, o una combinación de las definiciones de Kabat y Chothia) que el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico de CD19; puede tener una o más (por ejemplo, 2) regiones variables que el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico para CD19, o puede comprender el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico para CD19. En algunos casos, se generó el anticuerpo antidiotípico de acuerdo con un método descrito en Jena et al. En otro caso, la molécula de anticuerpo antidiotípico es una molécula de anticuerpo antidiotípico descrita en el documento WO 2014/190273. En algunos casos, la molécula de anticuerpo antidiotípico tiene las mismas CDR (por ejemplo, una o más, por ejemplo, la totalidad, de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de Vl y CDR3 de VL) que una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273 tal como 136.20.1; puede tener una o más (por ejemplo, 2) regiones variables de una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273, o puede comprender una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273 tal como 136.20.1. En otros casos, el anticuerpo anti-CAR se une a una región constante del dominio de unión extracelular de la molécula CAR, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 2014/190273. En algunos casos, el anticuerpo anti-CAR se une a la región constante del dominio de unión extracelular de la molécula CAR, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una región de bisagra CH2-CH3) o la región constante de la cadena ligera. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti-CAR compite por la unión con el anticuerpo monoclonal 2D3 descrito en el documento WO 2014/190273, tiene las mismas CDR (por ejemplo, una o más, por ejemplo, la totalidad, de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL) que 2D3, o tiene una o más (por ejemplo, 2) regiones variables de 2D3, o comprende 2D3 tal como se describe en el documento WO 2014/190273.

En algunos aspectos y realizaciones, las composiciones y métodos de la presente se optimizan para un subconjunto específico de linfocitos T, por ejemplo, tal como se describe en el documento de EE. UU. con N.° de serie 62/031 699, presentado el 31 de julio de 2014. En algunas realizaciones, los subconjuntos optimizados de linfocitos T muestran una persistencia mejorada en comparación con un linfocito T de control, por ejemplo, un linfocito T de un tipo diferente (por ejemplo, CD8+ o CD4+) que expresa el mismo constructo.

En algunos casos, un linfocito T CD4+ comprende un CAR descrito en la presente, donde el CAR comprende un dominio de señalización intracelular adecuado para (por ejemplo, optimizado para, por ejemplo, que da lugar a una persistencia mejorada en) un linfocito T CD4+, por ejemplo, un dominio de ICOS. En algunos casos, un linfocito T CD8+ comprende un CAR descrito en la presente, donde el CAR comprende un dominio de señalización intracelular adecuado para (por ejemplo, optimizado para, por ejemplo, que da lugar a una persistencia mejorada de) un linfocito T CD8+, por ejemplo, un dominio de 4-1BB, un dominio de CD28, u otro dominio coestimulador que no sea un dominio de ICOS. En algunos casos, el CAR descrito en la presente comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno que se dirige a CD33, por ejemplo, un c Ar de la Tabla 2 o un CAR que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140, o un domino de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147).

En un aspecto, se describe en la presente un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que padece cáncer. El método incluye administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de:

1. 1) un linfocito T CD4+ que comprende un CAR (el CARCD4+)

que comprende:

un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno que se dirige a CD33], por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de la Tabla 2 o 9, o un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140 o 147;

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un primer dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de ICOS; y

2. 2) un linfocito T CD8+ que comprende un CAR (el CARCD8+) que comprende:

un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno que se dirige a CD33, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de la Tabla 2 o 9, o un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140 o 147;

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un segundo dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de 4 1BB, un dominio de CD28, u otro dominio coestimulador que no es un dominio de ICOS;

donde el CARCD4+ y el CARCD8+ difieren el uno del otro.

Opcionalmente, el método incluye además administrar:

3. 3) un segundo linfocito T CD8+ que comprende un CAR (el segundo CARCD8+) que comprende:

un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD33, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de la Tabla 2 o 9, o un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 140 o 147;

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, donde el segundo CARCD8+ comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, no presente en el CARCD8+ y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización de ICOS.

Aplicación terapéutica

Enferm edades y/o trastornos asociados con CD33

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de CD33 o una afección asociada con células que expresan CD33 incluidos, por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan CD33. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de CD33 es un cáncer hematológico. En un aspecto, un cáncer hematológico incluye, sin carácter limitante, AML, síndrome mielodisplásico, ALL, leucemia mieloide crónica, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, neoplasias mieloproliferativas y similares. Otras enfermedades asociadas con la expresión de expresión de CD33 incluyen, sin carácter limitante, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de CD33. También se pueden incluir las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión de CD33.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de CD33. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad donde parte del tumor es negativo para CD33 y parte del tumor es positivo para CD33. Por ejemplo, el CAR de la invención es útil para tratar sujetos que han recibido tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión elevada de CD33, donde el sujeto que ha recibido tratamiento para los niveles elevados de CD33 presenta una enfermedad asociada con niveles elevados de CD33. En casos, el CAR de la invención es útil para tratar sujetos que han recibido tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión de CD33, donde el sujeto que ha recibido tratamiento relacionado con la expresión de CD33 presenta una enfermedad asociada con la expresión de CD33.

En un aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende CAR CD33 ligado operablemente a un promotor para la expresión en células efectoras inmunitarias de mamífero, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK. En un aspecto, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) recombinante que expresa el CAR c D33 para su uso en el tratamiento de tumores que expresan CD33, donde la célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) recombinante que expresa el CAR CD33 se denomina célula que expresa CAR c D33 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33). En un aspecto, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33) de la invención es capaz de poner en contacto una célula tumoral con al menos un CAR CD33 de la invención expresado en su superficie de tal manera que la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33) actúa sobre la célula tumoral y se inhibe el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa CD33, que comprende poner en contacto la célula tumoral con una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33) de la presente invención de modo que la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito n K que expresa CAR CD33 o CART CD33) se activa en respuesta al antígeno y actúa sobre la célula cancerosa, donde se inhibe el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar cáncer en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33) de la presente invención de tal modo que se trata el cáncer en el sujeto. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar con la célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR c D33 o CART CD33) de la invención es un cáncer asociado con la expresión de c D33. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar mediante la célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito que expresa CAR CD33 o CART c D33) de la invención incluye, sin carácter limitante, AML, síndrome mielodisplásico,, leucemia mieloide crónica y otras neoplasias mieloproliferativas, o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, y similares.

La invención incluye un tipo de terapia celular donde las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, están modificadas genéticamente para expresar un receptor antigénico quimérico (CAR) y la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD33 o CART CD33) se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos Nk ) son capaces de replicarse in vivo lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conllevar un control tumoral sostenido. En diversos aspectos, las células (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) que se administran al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración de la célula (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) al paciente.

La invención también incluye un tipo de terapia celular donde las células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) están modificadas, por ejemplo, mediante ARN transcrito in vitro, para expresar de manera transitoria un receptor antigénico quimérico (CAR) y la célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. Por lo tanto, en diversos aspectos, las células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) administradas al paciente, están presentes durante menos de un mes, por ejemplo, tres semanas, dos semanas, una semana, después de la administración de la célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) al paciente.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, la respuesta de inmunidad antitumoral provocada por las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva, o como alternativa puede ser debida a una respuesta inmunitaria directa vs indirecta. En un aspecto, las células efectoras inmunitarias transducidas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) muestran una secreción de citocinas proinflamatorias específicas y una actividad citolítica potente en respuesta a células cancerosas humanas que expresan CD33, resisten la inhibición de CD33 soluble, median en la muerte de células cercanas (bystander killing) y median en la regresión de un tumor humano establecido. Por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumor que expresa CD33 pueden ser susceptibles de muerte indirecta por parte de células efectoras inmunitarias redirigidas a c D33 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) que han reaccionado previamente contra células cancerosas positivas para el antígeno adyacentes.

En un aspecto, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR totalmente humanas (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, ocurre al menos una de las siguientes in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR en las células o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son muy conocidos en la técnica y se analizan en más detalle más adelante. En síntesis, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (por ejemplo, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR divulgado en la presente. La célula modificada con CAR se puede administrar a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas y células progenitoras se describe en la Pat. de EE. UU. N.° 5199942, se puede aplicar a las células de la presente invención. En la técnica existe constancia de otros métodos adecuados, por lo tanto, la presente invención no se limita a ningún método particular de expansión ex vivo de las células. En síntesis, el cultivo y la expansión ex vivo de linfocitos T comprende: (1) obtener células progenitoras y células madre hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de la extracción de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir tales células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 5 199942, se pueden utilizar otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.

Además de utilizar una vacuna basada en células en lo que se refiere a la inmunización ex vivo, la presente divulgación también proporciona composiciones y métodos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Por lo general, las células activadas y expandidas tal como se describe en la presente se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD33. En ciertos aspectos, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD33. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD33, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención.

En un aspecto, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de las invenciones se pueden utilizar para tratar una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna o es una afección precancerosa tal como mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD33 es una preleucemia cancerosa hematológica, trastorno hiperproliferativo, hiperplasia o una displasia, que se caracteriza por un crecimiento anómalo de las células.

En un aspecto, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se utilizan para tratar un cáncer, donde el cáncer es un cáncer hematológico. Las afecciones de tipo cáncer hematológico son los tipos de cáncer tales como leucemia y afecciones linfoproliferativas malignas que afectan a la sangre, médula ósea y el sistema linfático.

En un aspecto, las composiciones y células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la presente invención son particularmente útiles para tratar leucemias mieloides, AML y sus subtipos, leucemia mieloide crónica (CML) y síndrome mielodisplásico (MDS).

La leucemia se puede clasificar como leucemia aguda y leucemia crónica. La leucemia aguda se puede clasificar además como leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia linfoide aguda (ALL). La leucemia crónica incluye leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfoide crónica (CLL). Otras afecciones relacionadas incluyen síndromes mielodisplásicos (MDS, conocidos previamente como «preleucemia») que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y riesgo de transformación en AML.

El linfoma es un grupo de tumores de células de la sangre que se desarrollan a partir de linfocitos. Los linfomas a modo de ejemplo incluyen el linfoma no hodgkiniano y el linfoma de Hodgkin.

En AML, la transformación maligna y la proliferación descontrolada de una célula progenitora mieloide de larga vida, diferenciada de manera anómala da como resultado números circulantes elevados de formas sanguíneas inmaduras y el reemplazo de médula ósea normal por células malignas. Los síntomas incluyen fatiga, palidez, facilidad para que aparezcan hematomas y de sufrir hemorragias, fiebre e infección; los síntomas de infiltración leucémica están presentes en tan solo aproximadamente un 5% de los pacientes (a menudo como manifestaciones de la piel). El examen de un frotis de la sangre periférica y de la médula ósea es una prueba diagnóstica. El tratamiento existente incluye quimioterapia de inducción para lograr remisión y quimioterapia después de la remisión (con o sin trasplante de células madre) para evitar recaídas.

AML tiene varios subtipos que se distinguen entre sí por la morfología, inmunofenotipo y citoquímica. Se describen cinco clases, en función del tipo celular predominante, incluida la mieloide, mieloide-monocítica, monocítica, eritroide y megacariocítica.

Las tasas de inducción de la remisión varían entre un 50 y un 85%. La supervivencia sin enfermedad a largo plazo ocurre supuestamente entre un 20 y un 40% de los pacientes y aumenta hasta entre un 40 y un 50% en los pacientes más jóvenes tratados con un trasplante de células madre.

Ciertos factores pronósticos ayudan a determinar la intensidad y protocolo del tratamiento; los pacientes con características diagnósticas muy negativas reciben normalmente las formas más intensas de terapia, debido a que se cree que los posibles beneficios justifican la mayor toxicidad del tratamiento. El factor pronóstico más importante es el cariotipo celular de la leucemia; los cariotipos favorables incluyen t(15;17), t(8;21), e inv16 (p13;q22). Los factores negativos incluyen el aumento de edad, una fase mielodisplásica precedente, leucemia secundaria, recuento de WBC elevado y ausencia de cuerpos de Auer.

La terapia inicial intenta inducir la remisión y difiere en mayor grado de la ALL en que la AML responde a menos fármacos. La pauta básica de inducción incluye citarabina mediante infusión IV continua o dosis elevadas durante de 5 a 7 días; se administra IV daunorrubicina o idarrubicina durante 3 días durante este tiempo. Algunas pautas incluyen 6-tioguanina, etopósido, vincristina y prednisona, pero su contribución no está clara. El tratamiento normalmente da como resultado una mielosupresión significativa, con infección o hemorragia; hay una latencia significativa antes de la recuperación de la médula ósea. Durante este tiempo, es vital un cuidado preventivo y asistencial meticuloso.

La leucemia mielógena (o mieloide) crónica (CML) también se conoce como leucemia granulocítica crónica, y está caracterizada como un cáncer de los glóbulos blancos sanguíneos. Las pautas de tratamiento habituales para CML incluyen inhibidores de la tirosina-cinasa Bcr-Alb, imatinib (Gleevec®), dasatinib y nilotinib. Los inhibidores de la tirosina-cinasa Bcr-Abl son específicamente útiles para pacientes de CML con la translocación del cromosoma de Filadelfia.

Los síndromes mielodisplásicos (MDS) son afecciones médicas hematológicas caracterizadas por una hematopoyesis, o producción de sangre, desordenada e ineficaz. Por lo tanto, el número y calidad de las células formadoras de sangre declinan de manera irreversible. Algunos pacientes con MDS pueden desarrollar anemia grave, mientras que otros son asintomáticos. En la técnica se conoce el esquema de clasificación para MDS, con criterios que designan la relación o frecuencia de los tipos particulares de células sanguíneas, por ejemplo, mieloblastos, monocitos y precursores de glóbulos rojos. MDS incluye anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos anulares, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, leucemia mielomonocítica crónica (CML).

Los tratamientos para los MDS varían según la gravedad de los síntomas. Las formas agresivas de tratamiento para los pacientes que experimentan síntomas graves incluyen trasplantes de médula ósea y cuidados asistenciales con ayuda en forma de productos sanguíneos (por ejemplo, transfusiones de sangre) y factores de crecimiento hematopoyético (por ejemplo, eritropoyetina). Se utilizan otros agentes frecuentemente para tratar MDS: 5-azacitidina, decitabina y lenalidomida. En algunos casos también se pueden administrar los quelantes de hierro deferoxamina (Desferal®) y deferasirox (Exjade®).

En otra realización, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se utilizan para tratar un cánceres o leucemias con células madre leucémicas. Por ejemplo, las células madre leucémicas son células leucémicas CD34+/CD38-.

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar el cáncer. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico que incluye, sin carácter limitante, leucemia (tal como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, que incluyen el linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular microcítico y macrocítico).

En un aspecto, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se pueden utilizar para tratar otros cánceres y neoplasias malignas tales como, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemias agudas que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia linfoide aguda de linfocitos B («BALL»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («TALL»), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, tricoleucemia, linfoma folicular microcítico o macrocítico, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zonas marginales, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no hodgkiniano, linfoma plasmoblástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemia» que es una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por una producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y similares. Las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la presente invención se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/u otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares.

La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan CD33, comprendiendo los métodos poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CD33 con una célula que expresa CAR CAD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa c A r CD33) de la invención que se une a la célula que expresa CD33. En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD33, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD33 con una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa CAR CD33) de la invención que se une a la célula que expresa CD33. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD33, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD33 con una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa c A r CD33) de la invención que se une a la célula que expresa CD33. En ciertos aspectos, la célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito n K que expresa CAR CD33) de la invención reduce la cifra, número, cantidad o porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 65%, al menos un 75%, al menos un 85%, al menos un 95% o al menos un 99% en un sujeto con o modelo en animales de leucemia mieloide u otro cáncer asociado con células que expresan CD33 respecto a un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CD33 (por ejemplo, un cáncer hematológico o cáncer atípico que expresa CD33), comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa CAR CD33) de la invención que se une a la célula que expresa CD33. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan CD33 incluyen trastornos autoinmunitarios (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos o cánceres atípicos que expresan CD33).

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CD33, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa CAR CD33) de la invención que se une a la célula que expresa c D33. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación proporciona métodos para prevenir la recaída de un cáncer asociado con células que expresan CD33, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa CAR CD33) de la invención que se une a la célula que expresa CD33. En un aspecto, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una célula que expresa CAR CD33 (por ejemplo, linfocito CARTCD33 o linfocito NK que expresa CAR CD33) descrito en la presente que se une a la célula que expresa CD33 combinada con una cantidad eficaz de otra terapia.

Terapias combinadas

Se puede utilizar una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con otros agentes y terapias conocidos. La expresión administrado «en combinación», tal como se utiliza en la presente, significa que se suministran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el curso de la aflicción del sujeto con el trastorno, por ejemplo, se suministran los dos o más tratamientos después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, el suministro de un tratamiento todavía está ocurriendo cuando comienza el suministro del segundo, de modo que hay una superposición en lo que se refiere a la administración. Esto a veces se denomina en la presente «suministro simultáneo» o «suministro concurrente». En otras realizaciones, el suministro de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquier caso, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más efectivo, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida, de lo que se observaría si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o se observa una situación análoga con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, el suministro es tal que la reducción en un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor de lo que se observaría cuando se suministra un tratamiento en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o más que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado aún sea detectable cuando se suministra el segundo.

Una célula que expresa CAR descrita en la presente y el al menos un agente terapéutico adicional se pueden administrar simultáneamente, en las mismas composiciones o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula que expresa el CAR descrita en la presente se puede administrar primero, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración se puede invertir.

La terapia con CAR y/u otros agentes, procedimientos o modalidades terapéuticos se pueden administrar durante periodos en los que el trastorno está activo o durante un periodo de remisión o menor actividad de la enfermedad. La terapia con CAR se puede administrar antes del otro tratamiento, a la vez que el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión del trastorno.

Cuando se administran combinados, la terapia con CAR y el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, se pueden administrar en una cantidad o dosis que es superior, inferior o igual a la cantidad o dosificación de cada agente que se utiliza de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia. En ciertas realizaciones, la cantidad o dosificación administrada de la terapia con CAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, es inferior (por ejemplo, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50%) a la cantidad o dosificación de cada agente utilizado de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia requerida para lograr el mismo efecto terapéutico. En otras realizaciones, la cantidad o dosificación de la terapia con CAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, el tratamiento del cáncer) es inferior (por ejemplo, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50% inferior) a la cantidad o dosificación de cada agente utilizado de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.

En aspectos adicionales, una célula que expresa CAR descrita en la presente puede utilizarse en una pauta de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al., 2008 J Neurosurg 108:963-971.

En ciertos casos, los compuestos de la presente invención se combinan con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes anticancerosos, agentes antialérgicos, agentes contra las náuseas (o antieméticos), analgésicos, agentes citoprotectores y combinaciones de estos.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se puede utilizar combinada con un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos a modo de ejemplo incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)), un alcaloide de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), una célula inmunitaria de tipo anticuerpo (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab), un antimetabolito (incluidos, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina-desaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR, por sus siglas en inglés) TNFR, un inhibidor de proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador tal como talidomida o un derivado de talidomida (por ejemplo, lenalidomida).

Los agentes quimioterápicos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen busulfán (Myleran®), inyección de busulfán (Busulfex®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®),, clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, , clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), hidroxiurea (Hydrea®), Idarrubicina (Idamycin®), mitoxantrona (Novantrone®), Gemtuzumab Ozogamicina (mylotarg®).

En realizaciones, los agentes quimioterápicos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfán (Myleran®), inyección de busulfán (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), Idarrubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), fénix (Itrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), tenipósido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), clorhidrato de topotecán para inyección (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y vinorelbina (Navelbine®).

Los agentes anticancerosos de interés particular para combinaciones con los compuestos de la presente invención incluyen: antraciclinas; agentes alquilantes; antimetabolitos; fármacos que inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina o la cinasa p70S6 FK506) o inhiben la cinasa p70S6; inhibidores de mTOR; inmunomoduladores; antraciclinas; alcaloides de la vinca; inhibidores del proteasoma; agonistas de GITR; inhibidores de la proteína-tirosinafosfatasa; un inhibidor de la cinasa CDK4; un inhibidor de BTK; un inhibidor de la cinasa MKN; un inhibidor de la cinasa DGK; o un virus oncolítico.

Los antimetabolitos a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina-desaminasa): metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®, Fluoroplex®), floxuridina (FUDF®), citarabina (Cytosar-U®, Tarabina PFS), 6-mercaptopurina (Puri-Nethol®)), 6-tioguanina (Tioguanina Tabloid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), pentostatina (Nipent®), pemetrexed (Alimta®), raltitrexed (Tomudex®), cladribina (Leustatin®), clofarabina (Clofarex®, Clolar®), azacitidina (Vidaza®), decitabina y gemcitabina (Gemzar®). Los antimetabolitos preferidos incluyen citarabina, clofarabina y fludarabina.

Los agentes alquilantes a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™) , ifosfamida (Mitoxana®), melfalán (Alkeran®), clorambucilo (Leukeran®), pipobromano (Amedel®, Vercyte®), trietilenomelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilentiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), busulfán (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) y Dacarbazina (DTIC-Dome®). Los agentes alquilantes a modo de ejemplo adicionales incluyen, sin carácter limitante, Oxaliplatino (Eloxatin®); Temozolomida (Temodar® y Temodal®); Dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen®); Melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolisina y mostaza de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Busulfán (Busulfex® y Myleran®); Carboplatino (Paraplatin®); Lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU®); Cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol® y Platinol®-AQ); Clorambucilo (Leukeran®); Ciclofosfamida (Cytoxan® y Neosar®); Dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC e imidazolcarboxamida, DTIC-Dome®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustina; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, muarin y clorhidrato de mecloroetamina, Mustargen®); Estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Thioplex®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); y bendamustina HCl (Treanda®).

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con fludarabina, ciclofosfamida y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con fludarabina, ciclofosfamida y rituximab (FCR). En casos, el sujeto padece CLL. Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En casos, la fludarabina se administra con una dosificación de aproximadamente 10-50 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, o 45-50 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, la ciclofosfamida se administra con una dosificación de aproximadamente 200-300 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 200-225, 225-250, 250-275 o 275-300 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, el rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 400-600 mg/m2 (por ejemplo, de 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con bendamustina y rituximab. En casos, el sujeto padece CLL. Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En casos, la bendamustina se administra con una dosificación de aproximadamente 70-110 mg/m2 (por ejemplo, de 70-80, 80-90, 90-100 o 100-110 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, el rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 400-600 mg/m2 (por ejemplo, de 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y/o un corticosteroide (por ejemplo, prednisona). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y/o prednisona (R CHOP). En casos, el sujeto padece un linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto padece DLBCL en estadio limitado no voluminoso (por ejemplo, comprende un tumor que tiene un tamaño/diámetro de menos de 7 cm). En casos, el sujeto se trata con radiación combinada con R-CHOP. Por ejemplo, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP), seguido de radiación. En algunos casos, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, I, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP) después de la radiación.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina y rituximab (EPOCH-R). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con EPOCH-R de dosis ajustada (DA-EPOCH-R). En casos, el sujeto padece un linfoma de linfocitos B, por ejemplo, un linfoma de linfocitos B agresivo con reordenación de Myc.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab y/o lenalidomida. Lenalidomida ((RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidino-2,6-diona) es un inmunomodulador. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab y lenalidomida. En casos, el sujeto padece linfoma folicular (FL, por sus siglas en inglés) o linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto padece FL y no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En casos, lenalidomida se administra con una dosificación de aproximadamente 10-20 mg (por ejemplo, de 10-15 o 15-20 mg), por ejemplo, a diario. En casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

Los inhibidores de mTOR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, temsirolimus; ridaforolimus (conocido formalmente como deferolimus, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-I I , 36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en la Publicación PCT N.° WO 03/064383); everolimus (Afinitor® o RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus®); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y W2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina- (SEQ ID NO: 378), sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1), y XL765.

Los inmunomoduladores a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, afutuzumab (se puede adquirir de Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (c C-5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citocinas humanas que incluyen interleucina 1, interleucina 2 e interferón y, CAS 951209-71-5, que se puede adquirir de IRX Therapeutics).

Las antraciclinas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, doxorrubicina (Adriamycin® y Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorrubicina (clorhidrato de dauorrubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorrubicina liposomal (liposoma de citrato de daunorrubicina, DaunoXome®); mitoxantrona (DHAD, Novantrone®); epirrubicina (Ellence™); idarrubicina (Idamycin®, Idamicina PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina.

Los alcaloides de la vinca a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine®), Vincristina (Oncovin®) y Vindesina (Eldisine®)); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ® y Velban®); y vinorelbina (Navelbine®).

Los inhibidores del proteasoma a modo de ejemplo incluyen bortezomib (Velcade®); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-metil-W-((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); y 0-metil-N-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-0-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con brentuximab. Brentuximab es un conjugado anticuerpo-fármaco de un anticuerpo anti-CD30 y monometil-auristatina E. En casos, el sujeto padece linfoma de Hodgkin (HL, por sus siglas en inglés), por ejemplo, Hl recurrente o refractario. En casos, el sujeto comprende HL CD30+. En casos, el sujeto se ha sometido a un trasplante de células madre autólogo (ASCT, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto no se ha sometido a un ASCT. En casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con brentuximab y dacarbazina o combinada con brentuximab y bendamustina. Dacarbazina es un agente alquilante con el nombre químico 5-(3,3-dimetil-1-triazenil)imidazol-4-carboxamida. Bendamustina es un agente alquilante con el nombre químico ácido 4-[5-[bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbencimidazol-2-il]butanoico. En casos, el sujeto padece linfoma de Hodgkin (HL). En casos, el sujeto no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En casos, el sujeto tiene una edad de al menos 60 años, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o mayor. En casos, dacarbazina se administra con una dosificación de aproximadamente 300-450 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, o 425-450 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, bendamustina se administra con una dosificación de aproximadamente 75-125 mg/m2 (por ejemplo, de 75-100 o 100-125 mg/m2, por ejemplo, de aproximadamente 90 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de CD20, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo mono- o biespecífico anti-CD20) o un fragmento de este. Los anticuerpos anti-CD20 a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, veltuzumab, obinutuzumab, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumab y Pro131921 (Genentech). Remítase, por ejemplo, a Lim et al. Haematologica. 95,1(2010):135-43.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende rituximab. Rituximab es un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa quimérico de ratón/humano que se une a CD20 y provoca la citólisis de una célula que expresa CD20, por ejemplo, tal como se describe en www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab. En casos, el sujeto padece CLL o SLL.

En algunos casos, rituximab se administra por vía intravenosa, por ejemplo, como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 500-2000 mg (por ejemplo, aproximadamente 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400 1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, o 1900-2000 mg) de rituximab. En algunos casos, rituximab se administra en una dosis de 150 mg/m2 a 750 mg/m2, por ejemplo, aproximadamente 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400 425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, o 675-700 mg/m2, donde m2 indica el área de superficie corporal del sujeto. En algunos casos, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días o más. Por ejemplo, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 0,5 semanas, por ejemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas o más. En algunos casos, rituximab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, al menos 2 semanas, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas, o más. Por ejemplo, rituximab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un total de al menos 4 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más dosis por ciclo de tratamiento).

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ofatumumab. Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal humano IgG1K anti-CD20 con un peso molecular de aproximadamente 149 kDa. Por ejemplo, ofatumumab se genera utilizando un ratón transgénico y tecnología de hibridoma y se expresa y purifica a partir de una línea celular murina (NS0). Remítase, por ejemplo, a www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; y los números de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 y NCT01397591. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con ofatumumab. En casos, el sujeto padece CLL o SLL.

En algunos casos, ofatumumab se administra como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 150-3000 mg (por ejemplo, aproximadamente 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800 o 2800-3000 mg) de ofatumumab. En casos, ofatumumab se administra con una dosificación inicial de aproximadamente 300 mg, seguida de 2000 mg, por ejemplo, durante aproximadamente 11 dosis, por ejemplo, 24 semanas. En algunos casos, rituximab se administra en un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra en un intervalo posológico de al menos 1 semana, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas o más. En algunos casos, ofatumumab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, al menos 1 semana, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas o más, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, o 1,2, 3, 4, 5 años o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un total de al menos 2 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 o más dosis por ciclo de tratamiento).

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ocrelizumab. Ocrelizumab es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado, por ejemplo, tal como se describe en los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, y Kappos et al. Lancet. 19,378(2011):1779-87.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende veltuzumab. Veltuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD20. Remítase, por ejemplo, a los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, y Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende GA101. GA101 (también denominado obinutuzumab o RO5072759) es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado y glucomodificado. Remítase, por ejemplo, a Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Números de Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 y NCTO1414205; y www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende AME-133v. AME-133v (también denominado LY2469298 u ocaratuzumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado contra CD20 con un aumento de la afinidad por el receptor FcYRIIIa y una potenciación de la actividad de tipo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1 (2011):13-25; y Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende PRO131921. PRO131921 es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado modificado para tener una mejor unión a FcYRIIIa y una potenciación de ADCC en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1 (2011):13-25; y Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46; y el N.° de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00452127.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende TRU-015. TRU-015 es una proteína de fusión anti-CD20 derivada de dominios de un anticuerpo contra CD20. TRU-015 es más pequeña que los anticuerpos monoclonales, pero mantiene las funciones efectoras mediadas por Fc. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1 (2011):13-25. TRU-015 contiene un fragmento variable monocatenario (scFv) anti-CD20 ligado a los dominios CH2, CH3 y bisagra de IgG1 humana pero que carece de los dominios CHI y CL.

En algunos casos, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la presente se conjuga o une de otra manera al agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterápico (por ejemplo, citoxano, fludarabina, inhibidor de la histona-desacetilasa, agente desmetilante, vacuna peptídica, antibiótico antitumoral, inhibidor de la tirosina- cinasa, agente alquilante, agente antimitótico o antimicrotubular), agente antialérgico, agente contra las náuseas (o antiemético), analgésico o agente citoprotector descrito en la presente.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor del linfoma de linfocitos B 2 (Bc L-2) (por ejemplo, venetoclax, también denominado ABT-199 o GDC-0199;) y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con venetoclax y rituximab. Venetoclax es una molécula de bajo peso molecular que inhibe la proteína antiapoptótica BCL-2. La estructura de venetoclax (4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-W-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1 /-/-pirrolo[2,3-/?]piridin-5-iloxi)benzamida) se muestra a continuación.

En casos, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer. En casos, venetoclax se administra con una dosificación de aproximadamente 15-600 mg (por ejemplo, de 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, o 500-600 mg), por ejemplo, a diario. En casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, mensualmente.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra combinada con un virus oncolítico. En casos, los virus oncolíticos son capaces de replicarse de manera selectiva en una célula cancerosa y de desencadenar su muerte o de ralentizar su crecimiento. En algunos casos, los virus oncolíticos no tienen efecto, o un efecto mínimo, sobre las células no cancerosas. Un virus oncolítico incluye, sin carácter limitante, un adenovirus oncolítico, virus del herpes simple oncolíticos, retrovirus oncolítico, parvovirus oncolítico, virus de la variolovacuna oncolítico, virus Sinbis oncolítico, virus de la gripe oncolítico, o virus de ARN oncolítico (por ejemplo, reovirus oncolítico, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés), virus del sarampión oncolítico o virus de la estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) oncolítico).

En algunos casos, el virus oncolítico es un virus, por ejemplo, virus oncolítico recombinante, descrito en el documento US2010/0178684 A1. En algunos casos, un virus oncolítico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico heterólogo) que codifica un inhibidor de una respuesta inmunitaria o inflamatoria, por ejemplo, como se describe en el documento US2010/0178684 A1.

En casos, el virus oncolítico recombinante, por ejemplo, NDV oncolítico, comprende una proteína proapoptótica (por ejemplo, apoptina), una citocina (por ejemplo, GM-CSF, interferón-gamma, interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis tumoral alfa), una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo contra ED-B de fibronectina), antígeno asociado a un tumor, una proteína adaptadora biespecífica (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo dirigido contra la proteína HN de NDV y un receptor coestimulador de linfocitos T, tal como CD3 o CD28; o una proteína de fusión entre IL-2 humana y un anticuerpo monocatenario dirigido contra la proteína HN de NDV). Remítase, por ejemplo, a Zamarin et al. Future Microbiol. 7,3(2012):347-67.

En algunos casos, el virus oncolítico es un NDV oncolítico quimérico descrito en los documentos US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1, o US 2014/0271677 A1.

En algunos casos, el virus oncolítico comprende un adenovirus de replicación condicionada (CRAd) que está diseñado para replicarse exclusivamente en células cancerosas. Remítase, por ejemplo, a Alemany et al., Nature Biotechnol.

18(2000):723-27. En algunos casos, un adenovirus oncolítico comprende uno descrito en la Tabla 1 en la página 725 de Alemany et al.

Los virus oncolíticos a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, los siguientes:

Grupo B de adenovirus oncolíticos (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (remítase al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT02053220);

ONCOS-102 (denominado previamente CGTG-102), que es un adenovirus que comprende el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) (Oncos Therapeutics) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: n Ct 01598129);

VCN-01, que es un adenovirus humano oncolítico modificado genéticamente que codifica la hialuronidasa PH20 humana (VCN Biosciences, S.L.) (remítase, por ejemplo, a los Identificadores de Ensayos Clínicos: NCT02045602 y NCT02045589);

Adenovirus de replicación condicionada ICOVIR-5, que es un virus derivado del serotipo 5 del adenovirus humano de tipo natural (Had5) que se ha modificado para que se replique de manera selectiva en células cancerosas con una ruta de retinoblastoma/E2F desregulada (Instituto Catalán de Oncología) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01864759);

Celyvir, que comprende células madre mesenquimatosas (MSC, por sus siglas en inglés) autólogas derivadas de médula ósea infectadas con ICOVIR5, un adenovirus oncolítico (Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Madrid, España/Ramón Alemany) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01844661);

CG0070, que es un adenovirus con serotipo 5 (Ad5) oncolítico con replicación condicionada en el que el promotor E2F-1 humano impulsa la expresión de los genes víricos E1a esenciales, y se restringe de esta manera la replicación vírica y citotoxicidad a las células tumorales defectuosas en la ruta Rb (Cold Genesys, Inc.) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT02143804); o

DXN-2401 (denominado anteriormente Delta-24-RGD), que es un adenovirus que se ha modificado para replicarse de manera selectiva en células deficientes en la ruta de retinoblastoma (Rb) y para infectar células que expresan ciertas integrinas de unión a RGD de manera más eficaz (Clínica de la Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/DNAtrix, Inc.) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01956734).

En algunos casos, un virus oncolítico descrito en la presente se administra por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intraarterial, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. En casos, un virus oncolítico descrito en la presente se administra por vía intratumoral, transdérmica, transmucosa, oral, intranasal o mediante administración por vía pulmonar.

En un caso, las células que expresan un CAR descrito en la presente se administran a un sujeto combinadas con una molécula que reduce la población de linfocitos Treg. En la técnica existe constancia de métodos que disminuyen el número de (por ejemplo, depletan) linfocitos Treg y estos incluyen, por ejemplo, la depleción de CD25, administración de ciclofosfamida, modulación de la función de GITR. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la reducción del número de linfocitos Treg en un sujeto antes de la aféresis o antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente reduce el número de células inmunitarias no deseadas (por ejemplo, Treg) en el microentorno del tumor y reduce el riesgo de que el sujeto recaiga. En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con una molécula que tiene como diana GITR y/o que modula las funciones de GITR, tal como un agonista de GITR y/o un anticuerpo para GITR que depleta los linfocitos T reguladores (Treg). En casos, las células que expresan un CAR descritas en la presente se administran a un sujeto combinadas con ciclofosfamida. En un caso, las moléculas de unión a GITR y/o moléculas que modulan las funciones de GITR (por ejemplo, agonista de GITR y/o anticuerpos GITR que depletan Treg) se administran antes de la administración de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agonista de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células. En casos, la ciclofosfamida se administra al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En casos, la ciclofosfamida y un anticuerpo anti-GITR se administran al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En un caso, el sujeto padece cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido o un cáncer hematológico tal como ALL o CLL). En un caso, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece ALL. En casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente. Los agonistas de GITR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión con GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR bivalentes) tales como, por ejemplo, una proteína de fusión con GITR descrita en la Patente de EE. UU. N.°: 6 111 090, Patente europea N.°: 090505B1, Patente de EE. UU. N.°: 8586023, Publicación de PCT N.°s: WO 2010/003118 y 2011/090754, o un anticuerpo anti-GITR descrito, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.°: 7 025 962, Patente europea N.°: 1947183B1, Patente de EE. UU. N.°: 7812 135, Patente de EE. UU. N.°: 8388 967, Patente de EE. UU. N.°: 8591 886, Patente europea N.°: EP 1866339, Publicación de PCT N.°: WO 2011/028683, Publicación de PCT N.°: WO 2013/039954, Publicación de PCT N.°: W02005/007190, Publicación de PCT N.°: WO 2007/133822, Publicación de PCT N.°: WO2005/055808, Publicación de PCT N.°: WO 99/40196, Publicación de PCT N.°: WO 2001/03720, Publicación de PCT N.°: WO99/20758, Publicación de PCT N.°: WO2006/083289, Publicación de PCT N.°: WO 2005/115451, Patente de EE. UU. N.°: 7618632 y Publicación de PCT N.°: WO 2011/051726.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, por ejemplo, un rapálogo tal como everolimus. En un caso, el inhibidor de mTOR se administra antes que la célula que expresa c A r . Por ejemplo, en un caso, el inhibidor de mTOR se puede administrar antes de la aféresis de las células.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un agonista de GITR, por ejemplo, un agonista de GITR descrito en la presente. En un caso, el agonista de GITR se administra antes que la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agonista de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de una proteína-tirosina-fosfatasa, por ejemplo, un inhibidor de una proteína-tirosina-fosfatasa descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de la proteína-tirosina-fosfatasa es un inhibidor de SHP-1, por ejemplo, un inhibidor de SHP-1 descrito en la presente, tal como, por ejemplo, estibogluconato de sodio. En un caso, el inhibidor de la proteína-tirosina-fosfatasa es un inhibidor de SHP-2.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se puede utilizar combinada con un inhibidor de cinasa. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de c DK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en la presente, por ejemplo, un inhibidor de CD4/6, tal como, por ejemplo, clorhidrato de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (también denominado palbociclib o PD0332991). En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, o SI-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de mT0RC1 y/o un inhibidor de mT0RC2, por ejemplo, un inhibidor de mT0RC1 y/o inhibidor de mT0RC2 descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo[3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1 b, MNK2a y/o MNK2b. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor dual de PI3K/mT0R descrito en la presente, tal como, por ejemplo, PF-04695102. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de DGK, por ejemplo, un inhibidor de DGK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, DGKinh1 (D5919) o DGKinh2 (D5794).

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado de aloisina A; flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066; clorhidrato de 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1-benzopiran-4-ona (P276-00); 1 -metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4-piridinil]oxi]-N-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-bencimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-terf-butiloxazol-2-il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidino-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-pirimido[5,4-d][2]benzazepin-2-il]amino]benzoico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1 H-bencimidazol-2-il)-1 H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinometanamina (AG-024322); N-(piperidin-4-il)amida del ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico (AT7519); 4-[2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N-[4-(metilsulfonil)fenil]2-pirimidinamina (AZD5438); y XL281 (BMS908662).

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra con una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o a diario durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclinas (CDK, por sus siglas en inglés) 4 o 6, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 o un inhibidor de CDK6 descrito en la presente. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, un inhibidor que tiene como diana tanto CDK4 como CDK6), por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6 descrito en la presente. En un caso, el sujeto padece MCL. MCL es un cáncer agresivo con una repuesta muy deficiente a las terapias de las que se dispone en la actualidad, es decir, esencialmente incurable. En muchos casos de MCL, la ciclina D1 (un regulador de CDK4/6) se expresa (por ejemplo, debido a la translocación cromosómica que implica los genes de la inmunoglobulina y ciclina D1) en células de m Cl . Por lo tanto, sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que las células de MCL son sumamente sensibles a la inhibición de CDK4/6 con una especificidad elevada (es decir, efecto mínimo en células inmunitarias normales). Los inhibidores de CDK4/6 solos han tenido una cierta eficacia para tratar MCL, pero solo han logrado una remisión parcial con una tasa de recaídas elevada. Un inhibidor de CDK4/6 a modo de ejemplo es LEE011 (también denominado ribociclib), cuya estructura se muestra a continuación.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, LEE011 u otro inhibidor de CDK4/6 descrito en la presente) puede logar una respuesta elevada, por ejemplo, con tasas de remisión más elevadas y/o tasas de recaídas menores, por ejemplo, en comparación con un inhibidor de CDK4/6 solo.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK seleccionado de ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En un caso preferido, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad cinasa de la cinasa inducible por interleucina 2 (ITK) y se selecciona de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con ibrutinib (también denominado PCI-32765). La estructura de ibrutinib (1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1 -il]prop-2-en-1 -ona) se muestra a continuación.

En casos, el sujeto padece CLL, linfoma de las células del manto (MCL) o linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto padece CLL o SLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le han administrado previamente una, dos, tres o cuatro terapias contra el cáncer anteriores). En casos, el sujeto padece CLL o SLL refractaria. En otros casos, el sujeto padece linfoma folicular, por ejemplo, linfoma folicular refractario o recurrente. En algunos casos, se administra ibrutinib en una dosificación de aproximadamente 300-600 mg/día (por ejemplo, aproximadamente 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/día, por ejemplo, aproximadamente 420 mg/día o aproximadamente 560 mg/día), por ejemplo, por vía oral. En casos, el ibrutinib se administra en una dosis de aproximadamente 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por ejemplo, 250 mg, 420 mg o 560 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días, o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de ibrutinib. En algunos casos, ibrutinib se administra combinado con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results O f a Phase II Trial In 40 Patients, Resumen 675 presentado en la 55.a Reunión y Exposición Anual de ASH, Nueva Orleans, LA 7-10 de diciembre. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la adición de ibrutinib potencia la respuesta proliferativa de linfocitos T y puede hacer que los linfocitos cambien de un fenotipo T-auxiliar-2 (Th2) a T-auxiliar-1 (Th1). Th1 y Th2 son fenotipos de los linfocitos T auxiliares, donde Th1 versus Th2 dirigen diferentes rutas de respuesta inmunitaria. Un fenotipo Th1 se asocia con respuestas proinflamatorias, por ejemplo, para provocar la muerte de células, tales como virus/patógenos intracelulares o células cancerosas, o en la perpetuación de respuestas autoinmunitarias. Un fenotipo Th2 se asocia con respuestas antiinflamatorias y de acumulación de eosinófilos.

En algunos casos de los métodos, usos y composiciones de la presente, el inhibidor de BTK es un inhibidor de BTK descrito en la Solitud Internacional WO/2015/079417.

Por ejemplo, en algunos casos, el inhibidor de BTK es un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de este;

R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con hidroxi;

R2 es hidrógeno o halógeno;

R3 es hidrógeno o halógeno;

R4 es hidrógeno;

R5 es hidrógeno o halógeno;

o R4 y R5 están unidos entre sí y representan un enlace, -CH2-, -CH2-CH2- , - CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; o -CH2-CH2-CH2-;

R6 y R7 representan independientemente el uno del otro H, alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con hidroxilo, cicloalquilo C3-C6 sustituido opcionalmente con halógeno o hidroxi, o halógeno;

R8, R9, R, R', R10 y R11 independientemente los unos de los otros representan H o alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con alcoxi C1-C6; o dos cualesquiera de R8, R9, R, R', R10 y R11 junto con el átomo de carbono al que se encuentran unidos pueden formar un anillo carbocíclico saturado de 3-6 miembros;

R12 es hidrógeno o alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con halógeno o alcoxi C1-C6;

o R12 y cualquiera de R8, R9, R, R', R10 o r 11 junto con los átomos a los que se encuentran unidos pueden formar un anillo azacíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros, anillo que puede estar opcionalmente sustituido con halógeno, ciano, hidroxilo, alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;

n es 0 o 1; y

R13 es alquenilo C2-C6 sustituido opcionalmente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6 o N,N-di-alquilamino C1-C6; alquinilo C2-C6 sustituido opcionalmente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6; u óxido de alquenilo C2-C6 sustituido opcionalmente con alquilo C1-C6.

En algunos casos, el inhibidor de BTK de Fórmula I se escoge entre: N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-3-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-enoil)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-((1-propioloilazetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-inoil)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-acryloilpiperidin-4-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilpropiolamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-(2-(4-metoxi-N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-inamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(2-((4-amino-6-(3-(4-ciclopropil-2-fluorobenzamido)-5-fluoro-2-metilfenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metiloxirano-2-carboxamide; N-(2-((4-amino-6-(3-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(2-acrilamidoetoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-etilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-(2-fluoroetil)acrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-acrilamidociclopropil)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-(2-acrilamidopropoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(but-2-inamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-inamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(3-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-inoil)pirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-((1-acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(2-((4-amino-6-(3-(6-ciclopropil-1-oxo-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)pi rimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4S)-1-(but-2-inoil)-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acryloil-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-propioloilazetidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-((1-acriloilazetidi n-2-il)metoxi)-6-aminopirimidi n-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; (R)-N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (R)-N-(3-(5-((1-acriloilpiperidin-3-il)metoxi)-6-aminopi rimidi n-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-acriloil-3-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; o N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida.

A menos que se diga lo contrario, los términos químicos utilizados anteriormente para describir el inhibidor de BTK de Fórmula I se utilizan de acuerdo con su significado tal como se expone en la Solicitud Internacional WO/2015/079417.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado de temsirolimus; ridaforolimus dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); simapimod; (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-c(]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-mmino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-aaspartil-L-serina-(SEQ ID NO: 378), sal interna (SF1126); y XL765.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra con una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días, o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra con una dosis de aproximadamente 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK seleccionado de CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)-pirazolo[3,4-d]pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo[3,4-d]pirimidina.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de fosfoinositol-3-cinasa (PI3K) (por ejemplo, un inhibidor de PI3K descrito en la presente, por ejemplo, idelalisib o duvelisib) y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con idelalisib y rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con duvelisib y rituximab. Idelalisib (también denominado GS-1101 o Ca L-101; Gilead) es una molécula de bajo peso molecular que bloquea la isoforma delta de PI3K. La estructura de idelalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)prop¡l]-4(3/-/)-qu¡nazol¡nona) se muestra a continuación.

Duvelisib (también denominado IPI-145; Infinity Pharmaceuticals y Abbvie) es una molécula de bajo peso molecular que bloquea PI3K-5,y. La estructura de duvelisib (8-cloro-2-fenil-3-[(1s)-1-(9H-purin-6-ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) se muestra a continuación.

En casos, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le ha administrado previamente un anticuerpo anti-CD20 o se le ha administrado previamente ibrutinib). Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVn). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En casos, el sujeto tiene una deleción en el brazo largo del cromosoma 11 (del(11q). En otros casos, el sujeto no tiene una del(11q). En casos, se administra idelalisib en una dosificación de aproximadamente 100-400 mg (por ejemplo, de 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, o 375-400 mg), por ejemplo, dos veces al día. En casos, se administra duvelisib en una dosificación de aproximadamente 15-100 mg (por ejemplo, de aproximadamente 15-25, 25-50, 50-75, o 75-100 mg), por ejemplo, dos veces al día. En casos, se administra rituximab en una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor dual de fosfatidillinositol-3-cinasa (PI3K) y mTOR seleccionado de 2-amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502); N-[4-[[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil}propanenitrilo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-difluoro-N-{2-(metiloxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenesulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-morfolinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-tí]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (v S-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK). Las cinasas A l K a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, crizotinib (Pfizer), ceritinib (Novartis), alectinib (Chugai), brigatinib (también denominado AP26113; Ariad), entrectinib (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (remítase, por ejemplo, al N.° de Identificador de Ensayos Clínicos NCT02048488), CEP-37440 (Teva) y X-396 (Xcovery). En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer de pulmón.

El nombre químico de crizotinib es 3-[(1R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi]-5-(1-piperidin-4-ilpirazol-4-il)piridin-2-amina. El nombre químico de ceritinib es 5-cloro-N2-[2-isopropoxi-5-metil-4-(4-piperidinil)fenil]-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. El nombre químico de alectinib es 9-etil-6,6-dimetil-8-(4-morfolinopiperidin-1-il)-11 -oxo-6,11-dihidro-5Hbenzo[ó]carbazol-3-carbonitrilo. El nombre químico de brigatinib es 5-cloro-N2-{4-[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2-metoxifenil}-N4-[2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. El nombre químico de entrectinib es N-(5-(3,5-difluorobencil)-1 H-indazol-3-il)-4-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. El nombre químico de PF-06463922 es (10R)-7-amino-12-fluoro-2,10,16-trimetil-15-oxo-10,15,16,17-tetrahidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecino-3-carbonitrilo. La estructura química de CEP-37440 es (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)-1-metoxi-6,7,8,9-tetrahidro-5H-benzo[7]anulen-2-il)amino)pirimidin-4-il)amino)-N-metilbenzamida. El nombre químico de X-396 es (R)-6-amino-5-(1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi)-N-(4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)fenil)piridazino-3-carboxamida.

También se pueden utilizar fármacos que inhiben ya sea la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., C ell66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En un aspecto adicional, las composiciones celulares de la presente invención se pueden administrar a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) el trasplante de médula ósea, terapia ablativa con linfocitos T utilizando agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia externa (XRT), ciclofosfamida y/o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de linfocitos B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia seguida del trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO). IDO es una enzima que cataliza la degradación del aminoácido L-triptófano en kinurenina. Muchos cánceres expresan IDO, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza y de pulmón. Las pDC, macrófagos y células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) pueden expresar IDO. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que un descenso en L-triptófano (por ejemplo, catalizado por IDO) da como resultado un medio inmunosupresor al inducir la anergia y apoptosis de linfocitos T. Por lo tanto, sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que un inhibidor de IDO puede potenciar la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, al reducir la supresión o muerte de una célula inmunitaria que expresa c A r . En casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza o de pulmón. Los inhibidores de IDO a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, 1 -metiltriptófano, indoximod (NewLink Genetics) (remítase, por ejemplo, a los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01191216; NCT01792050) y INCB024360 (Incyte Corp.) (remítase, por ejemplo, a los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01604889; NCT01685255).

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un modulador de células supresoras de origen mieloide (MDSC, por sus siglas en inglés). Las MDSC se acumulan en la periferia y en el sitio tumoral de muchos tumores sólidos. Estas células suprimen las respuestas de linfocitos T, y de esta manera obstaculizan la eficacia de la terapia con células que expresan CAR. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la administración de un modulador de MDSC potencia la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente. En un caso, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, glioblastoma. Los moduladores de MDSC a modo de ejemplo, incluyen, sin carácter limitante, MCS110 y BLZ945. MCS110 es un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF). Remítase, por ejemplo, al N.° de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00757757. BLZ945 es una molécula de bajo peso molecular inhibidora del receptor del factor 1 estimulador de colonias (CSF1R, por sus siglas en inglés). Remítase, por ejemplo, a Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013): 1264-72. La estructura de BLZ945 se muestra a continuación.

En casos, se administra una célula que expresa CAR descrita en la presente a un sujeto en combinación con un linfocito CART CD19 (por ejemplo, CTL019, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2012/079000.

En casos, el sujeto padece leucemia mieloide aguda (AML), por ejemplo, AML positiva para CD19 o AML negativa para CD19. En casos, el sujeto padece un linfoma CD19+, por ejemplo, un linfoma no hodgkiniano (NHL, por sus siglas en inglés) CD19+, un FL CD19+ o un DLBCL CD19+. En casos, el sujeto padece un linfoma CD19+ recurrente o refractario. En casos, se administra quimioterapia linfodepletante al sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de linfocitos c A r T CD19. En un ejemplo, se administra quimioterapia linfodepletante al sujeto antes de la administración de linfocitos CART CD19. Por ejemplo, la quimioterapia linfodepletante finaliza 1-4 días (por ejemplo, 1,2, 3 o 4 días) antes de la infusión de linfocitos CART CD19. En casos, se administran múltiples dosis de linfocitos CART CD19, por ejemplo, tal como se describe en la presente. Por ejemplo, una única dosis comprende aproximadamente 5 x 108 linfocitos c A rT CD19. En casos, se administra quimioterapia linfodepletante a un sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, una célula que expresa c A r sin CD19. En casos, se administra CART CD19 a un sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR sin CD19, por ejemplo, una célula que expresa CAR sin CD19 descrita en la presente.

En algunos casos, se administra a un sujeto una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con una célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, CTL019, por ejemplo, como se describe en el documento WO2012/079000, para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD33, por ejemplo, un cáncer descrito en la presente. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR CD19 combinada con una célula que expresa CAR mejora la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente actuando sobre células cancerosas de linaje temprano, por ejemplo, células madre cancerosas, modulando la respuesta inmunitaria, depletando los linfocitos B reguladores y/o mejorando el microentorno del tumor. Por ejemplo, una célula que expresa CAR CD19 tiene como diana células cancerosas que expresan marcadores del linaje temprano, por ejemplo, células madre cancerosas y células que expresan CD19, mientras que la célula que expresa CAR descrita en la presente tiene como diana células que expresan marcadores del linaje tardío, por ejemplo, CD33. Esta estrategia de preacondicionamiento puede mejorar la eficacia de la célula que expresa c A r descrita en la presente. En tales casos, la célula que expresa CAR CD19 se administra antes, a la vez o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR descrita en la presente.

En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente también expresa un CAR que tiene como diana CD19, por ejemplo, un CAR CD19. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente y un CAR CD19 se administra a un sujeto para el tratamiento de un cáncer descrito en la presente, por ejemplo, AML. En un caso, las configuraciones de una o ambas moléculas CAR comprende un dominio de señalización intracelular primaria y un dominio de señalización coestimulador. En otro caso, las configuraciones de una o ambas moléculas CAR comprende un dominio de señalización intracelular primaria y dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 o más, dominios de señalización coestimuladores. En tales casos, la molécula CAR descrita en la presente y el CAR CD19 pueden tener un domino de señalización intracelular primaria idéntico o diferente, dominios de señalización coestimuladores idénticos o diferentes o el mismo número o un número diferente de dominios de señalización coestimuladores. Como alternativa, el CAR descrito en la presente y el CAR CD19 se configuran como un CAR dividido, en el que una de las moléculas CAR comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 4-1BB), mientras que la otra molécula CAR comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular primaria (por ejemplo, CD3 zeta).

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un polipéptido de tipo interleucina-15 (IL)-15, polipéptido de tipo receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 es un complejo no covalente heterodimérico de IL-15 e IL-15Ra. hetIL-15 se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 8124 084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, y U.S. 2011/0081311.

En casos, het-IL-15 se administra por vía subcutánea. En casos, el sujeto padece un cáncer, por ejemplo, un cáncer sólido, por ejemplo, melanoma o cáncer de colon. En casos, el sujeto tiene un cáncer metastásico.

En casos, al sujeto que padece una enfermedad descrita en la presente, por ejemplo, un trastorno hematológico, por ejemplo, AML o MSD, se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente, por ejemplo, un agente citotóxico o quimioterápico, una terapia biológica (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo monoclonal o terapia celular) o un inhibidor (por ejemplo, inhibidor de una cinasa). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente citotóxico, por ejemplo, CPX-351 (Celator Pharmaceuticals), citarabina, daunorrubicina, vosaroxin (Sunesis Pharmaceuticals), sapacitabina (Cyclacel Pharmaceuticals), idarrubicina, o mitoxantrona. CPX-351 es una formulación liposomal que comprende citarabina y daunorrubicina con una relación molar de 5:1. En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente hipermetilante, por ejemplo, un inhibidor de la ADN-metiltransferasa, por ejemplo, azacitidina o decitabina. En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con una terapia biológica, por ejemplo, un anticuerpo o terapia celular, por ejemplo, 225Ac-lintuzumab (Actimab-A; Actinium Pharmaceuticals), IPH2102 (Innate Pharma/Bristol Myers Squibb), SGN-CD33A (Seattle Genetics), o gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg; Pfizer). SGN-CD33A es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) que comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina que se une a un anticuerpo anti-CD33. Actimab-A es un anticuerpo anti-CD33 (lintuzumab) marcado con actinio. IPH2102 es un anticuerpo monoclonal que tiene como diana receptores de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos naturales (KIR, por sus siglas en inglés). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de FLT3, por ejemplo, sorafenib (Bayer), midostaurin (Novartis), quizartinib (Daiichi Sankyo), crenolanib (Arog Pharmaceuticals), PLX3397 (Daiichi Sankyo), AKN-028 (Akinion Pharmaceuticals), o ASP2215 (Astellas). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la isocitrato-deshidrogenasa (IDH), por ejemplo, AG-221 (Celgene/Agios) o AG-120 (Agios/Celgene). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un regulador del ciclo celular, por ejemplo, inhibidor de la cinasa tipo polo 1 (Plk1, por sus siglas en inglés), por ejemplo, volasertib (Boehringer Ingelheim); o un inhibidor de la cinasa 9 dependiente de ciclinas (Cdk9), por ejemplo, alvocidib (Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la red de señalización del receptor de linfocitos B, por ejemplo, un inhibidor del linfoma de linfocitos B 2 (Bcl-2), por ejemplo, venetoclax (Abbvie/Roche); o un inhibidor de la tirosina-cinasa de Bruton (Btk, por sus siglas en inglés), por ejemplo, ibrutinib (Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la aminopeptidasa M1, por ejemplo, tosedostat (CTI BioPharma/Vernalis); un inhibidor de la histona-desacetilasa (HDAC, por sus siglas en inglés), por ejemplo, pracinostat (MEI Pharma); un inhibidor de múltiples cinasas, por ejemplo, rigosertib (Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio); o un agonista inverso de CXCR4 peptídico, por ejemplo, BL-8040 (BioLineRx). En casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR que tiene como diana CD33 combinada con una célula que expresa cA r que tiene como diana un antígeno que no es CD33, por ejemplo, CLL, BCMA, CD123, CD19, FLT-3 o el receptor de folato beta.

En otra realización, los sujetos reciben una infusión de las composiciones con células CART33 de la presente invención antes del trasplante de células, por ejemplo, trasplante de células madre alogénicas. En una realización preferida, las células CART33 expresan CAR33 de manera transitoria, por ejemplo, mediante electroporación de un ARNm de CAR anti-CD33, conforme a lo cual la expresión de CAR33 finaliza antes de la infusión de células madre del donante para evitar el fracaso del prendimiento del injerto.

Algunos pacientes pueden experimentar reacciones alérgicas a los compuestos de la presente invención y/o otro(s) agente(s) anticanceroso(s) durante o después de la administración; por lo tanto, a menudo se administran agentes antialérgicos para minimizar el riesgo de una reacción alérgica. Los agentes antialérgicos incluyen corticosteroides, tales como dexametasona (por ejemplo, Decadron®), beclometasona (por ejemplo, Beclovent®), hidrocortisona (también conocida como cortisona, succinato de hidrocortisona sódica, fosfato de hidrocortisona sódica, que se comercializa con los nombres comerciales Ala-Cort®, fosfato de hidrocortisona, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® y Lanacort®), prednisolona (que se comercializa con los nombres comerciales Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® y Prelone®), prednisona (que se comercializa con las denominaciones comerciales Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® y Orasone®), metilprednisolona (también conocida como 6-metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato de metilprednisolona sódica, que se comercializa con las denominaciones comerciales Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® y Solu-Medrol®); antihistamínicos, tales como difenhidramina (por ejemplo, Benadryl®), hidroxizina, y ciproheptadina; y broncodilatadores, tales como los agonistas del receptor beta-adrenérgico, albuterol (por ejemplo, Proventil®), y terbutalina (Brethine®).

Algunos pacientes pueden experimentar náuseas durante y después de la administración del compuesto de la presente invención y/u otro(s) agente(s) anticanceroso(s); por lo tanto, se utilizan antieméticos para prevenir las náuseas (estómago superior) y vómitos. Los antieméticos adecuados incluyen aprepitant (Emend®), ondansetrón (Zofran®), granisetrón HCl (Kytril®), lorazepam (Ativan®, dexametasona (Decadron®), proclorperazina (Compazine®), casopitant (Rezonic® y Zunrisa®), y combinaciones de estos.

A menudo se prescribe medicación para aliviar el dolor experimentado durante el periodo de tratamiento para hacer que el paciente esté más cómodo. A menudo se utilizan analgésicos sin receta médica tales como Tylenol®. Sin embargo, los analgésicos opioides tales como hidrocodona/paracetamol o hidrocodona/acetaminofeno (por ejemplo, Vicodin®), morfina (por ejemplo, Astramorph® o Avinza®), oxicodona (por ejemplo, OxyContin® o Percocet®), clorhidrato de oximorfona (Opana®), y fentanilo (por ejemplo, Duragesic®) también son útiles para el dolor moderado o grave.

En un intento de proteger las células normales de la toxicidad del tratamiento y de limitar la toxicidad a los órganos, se pueden utilizar como una terapia complementaria agentes citoprotectores (tales como neuroprotectores, antioxidantes, cardioprotectores, neutralizadores de la extravasación de antraciclina, nutrientes y similares). Los agentes citoprotectores adecuados incluyen amifostina (Ethyol®), glutamina, dimesna (Tavocept®), mesna (Mesnex®), dexrazoxano (Zinecard® o Totect®), xaliprodeno (Xaprila®), y leucovorina (tambien conocida como laucovorina cálcica, ácido folínico y ácido folínico).

La estructura de los compuestos activos identificados con números de código, denominaciones comerciales o genéricas se puede consultar en la edición actual del compendio estándar «The Merck Index» o en bases de datos, por ejemplo, Patents International (por ejemplo, IMS World Publications).

Los compuestos mencionados anteriormente, que se pueden utilizar combinados con un compuesto de la presente invención, se pueden preparar y administrar tal como se describe en la técnica, tal como en los documentos citados anteriormente.

En un caso, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o una sal farmacéuticamente aceptable de este junto con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración a un sujeto humano o animal, ya sea solo o junto con otros agentes anticancerosos.

En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a sujetos humanos y animales que padecen una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer. La presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal que necesita un tratamiento de este tipo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o un sal farmacéuticamente aceptable de este, ya sea solo o combinado con otros agentes anticancerosos.

En particular, las composiciones se formularán juntas como un agente terapéutico combinado o se administrarán por separado.

En la terapia combinada, el compuesto de la presente invención y otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se pueden administrar de manera simultánea, a la vez o de manera secuencial sin límites de tiempo específicos, donde una administración de este tipo proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente.

En una realización preferida, el compuesto de la presente invención y el(los) otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se administran generalmente de manera secuencial en cualquier orden por infusión o vía oral. La pauta posológica puede variar dependiendo del estadio de la enfermedad, forma física del paciente, perfiles de seguridad de los fármacos individuales y tolerancia de los fármacos individuales, así como también otros criterios muy conocidos por el médico especialista y médico(s) general(es) que administran la combinación. El compuesto de la presente invención y otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se pueden administrar con una separación entre ellos de como máximo minutos, horas, días o incluso semanas dependiendo del ciclo particular que se está utilizando para el tratamiento. Además, el ciclo podría incluir la administración de un fármaco más a menudo que el otro durante el ciclo de tratamiento y con dosis diferentes por administración del fármaco.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan kits que incluyen uno o más compuestos de la presente divulgación y un miembro de la combinación tal como se divulgan en la presente. Los kits representativos incluyen (a) un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable de este, (b) al menos un miembro de la combinación, por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente, conforme a lo cual un kit de este tipo puede comprender un prospecto u otra ficha técnica que incluye directrices para la administración.

Un compuesto de la presente invención también se puede utilizar para conseguir una mejora en combinación con procesos terapéuticos conocidos, por ejemplo, la administración de hormonas o radiación especialmente. Un compuesto de la presente invención se puede utilizar en particular como un radiosensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que muestran poca sensibilidad a la radioterapia.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR. Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa CAR incluyen, sin carácter limitante, CRS y la linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH, por sus siglas en inglés), también denominada Síndrome de Activación de Macrófagos (MAS, por sus siglas en inglés). Los síntomas de CRS incluyen fiebre alta, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos inespecíficos tales como fiebre, fatiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vómitos y cefaleas. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos cutáneos tales como sarpullido. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos gastrointestinales tales como náuseas, vómitos y diarrea. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos respiratorios tales como taquipnea e hipoxemia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos cardiovasculares tales como taquicardia, presión arterial diferencial amplia, hipotensión, aumento del gasto cardiaco (temprano) y potencialmente disminución del gasto cardiaco (tardío). CRS puede incluir señales y síntomas clínicos de coagulación tales como dímero D elevado, hipofibrinogenemia con o sin hemorragia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos renales tales como azotemia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos hepáticos tales como la elevación (inespecífica) de las transaminasas e hiperbilirrubinemia. CRS puede incluir señales y síntomas neurológicos tales como cefaleas, cambios del estado mental, confusión, delirio, dificultad para encontrar palabras o afasia clara, alucinaciones, temblores, dismetría, marcha alterada y convulsiones.

En consecuencia, los métodos descritos en la presente pueden comprender administrar una célula que expresa CAR descrita en la presente a un sujeto y administrar adicionalmente uno o más agentes para gestionar niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En un caso, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-y, TNPa, IL-2 e IL-6. En un caso, el factor elevado en el sujeto es uno o más de IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 y fraktalkina. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. En un caso, el agente que neutraliza uno o más de estas formas solubles es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los ejemplos de agentes de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un esteroide (por ejemplo, corticosteroide), un inhibidor de TNFa y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de un inhibidor de TNFa es una molécula de anticuerpo anti-TNFa tal como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión tal como entanercept. La molécula de bajo peso molecular inhibidora de TNFa incluye, sin carácter limitante, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de iL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 tal como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, y FM101. En un caso, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un corticosteroide, tal como, por ejemplo, metilprednisolona, hidrocortisona, entre otros.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un vasopresor, tal como, por ejemplo, norepinefrina, dopamina, fenilefrina, epinefrina, vasopresina o una combinación de estas.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente antipirético. En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente analgésico.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que potencie la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, el agente es un inhibidor de puntos de control. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1), pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, por inhibición al nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el comportamiento de la célula que expresa CAR. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en la presente para inhibir la expresión de una molécula inhibidora en la célula que expresa CAR. En una realización, el inhibidor es un ARNhc. En una realización, la molécula inhibidora es inhibida dentro de una célula que expresa CAR. En estas realizaciones, una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula inhibidora está enlazada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del CAR.

En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está ligada operablemente a un promotor, por ejemplo, un promotor obtenido a partir de H1 o U6, de modo que la molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se expresa, por ejemplo, se expresa dentro de una célula que expresa CAR. Remítase, por ejemplo, a Tiscornia G., «Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA», capítulo 3, en Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann y Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU., 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está presente en el mismo vector, por ejemplo, un vector lentivírico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización de este tipo, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está ubicada en el vector, por ejemplo, el vector lentivírico, en 5' o 3' respecto al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se puede transcribir en la misma dirección o en una dirección diferente al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está presente en un vector diferente al vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del c A r . En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se expresa de manera transitoria dentro de una célula que expresa CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está integrada de manera estable en el genoma de una célula que expresa CAR. Las Figuras 52A-52E muestran ejemplos de vectores para expresar un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR con una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe la función de los linfocitos T.

A continuación se proporcionan ejemplos de moléculas de ARNbc útiles para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T, donde la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T es PD-1.

A continuación en la Tabla 7 se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi para PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia génica de PDCD1 de ratón NM_008798.2), junto con las s Eq ID NOs: 159-206 que representan la secuencia de ADN. En esta tabla están presentes tanto las secuencias sentido (S) como antisentido (AS) como secuencias de 19-mer y 21-mer. También cabe señalar que la posición (PoS, por ejemplo, 176) se deriva del número de la posición en la secuencia génica de PDCD1 de ratón Nm_008798.2. Las s Eq ID Nos se indican en grupos de 12 que corresponden a las secuencias «sentido 19» SEQ ID NOs: 159-170; «sentido 21» SEQ ID NOs: 171-182; «antisentido 21» SEQ ID NOs: 183-194; «antisentido 19» SEQ ID NOs: 195-206.

Tabl n i AR h r PD D1 PD1 r n

A continuación en la Tabla 8 se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi para PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia génica de PDCD1 humana, junto con las SEQ ID NOs. 207-254 que representan la secuencia de ADN. Están presentes tanto las secuencias sentido (S) como antisentido (AS) como secuencias de 19-mer y 21-mer.

Las SEQ ID Nos se indican en grupos de 12 que corresponden a las secuencias «sentido 19» SEQ ID NOs: 207-218; «sentido 21» SEQ ID NOs: 219-230; «antisentido 21» SEQ ID NOs: 231-242; «antisentido 19» SEQ ID NOs: 243-254. Tabla 8. Secuencias de ARNhc ara PDCD1 PD1 humano

En una realización, el inhibidor de una señal inhibidora puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (también denominado MDX-010 y MDX-101, y comercializado como Yervoy®; Bristol -Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible de Pfizer, conocido anteriormente como ticilimumab, c P-675,206). ). En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3. En casos, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, inhibidor de una molécula inhibidora, se administra combinado con un CAR alogénico, por ejemplo, un CAR alogénico descrito en la presente (por ejemplo, descrito en la sección de CAR alogénico de la presente).

PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha mostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2 reducen de manera regulada la activación de linfocitos T tras unirse a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al.

2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros inhibidores de PD-1, PD-L1 y PD-L2, y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD33 descrito en la presente. Por ejemplo, nivolumab (también denominado BMS-936558 o MDX1106; Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano que bloquea de manera específica PD1. Nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen de manera específica a PD1 se divulgan en los documentos US 8008 449 y WO2006/121168. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal IgGlk humanizado que se une a PDIPidilizumab, y en el documento WO2009/101611 se divulgan otros anticuerpos monoclonales anti-PDl humanizados. Lambrolizumab (también conocido como MK03475; Merck) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une a PD1. Lambrolizumab y otros anticuerpos anti-PD-1 humanizados se divulgan en los documentos US 8354 509 y WO2009/114335. MDPL3280a (Genentech / Roche) es un anticuerpo monoclonal IgG1 optimizado para Fc humano que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 se divulgan en la Patente de EE. UU. N.°: 7943743 y la Publicación de EE. UU. N.°: 20120039906. Otros agentes de unión anti-PD-Ll incluyen YW243.55.S70 (regiones variables de la cadena pesada y ligera se muestran en las SEQ ID NOs 20 y 21 en el documento WO2010/077634) y MDX-1 105 (también denominado BMS-936559, y, por ejemplo, agentes de unión anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por ejemplo, divulgado en el documento WO2010/027827 y WO2011/066342), es un receptor soluble de fusión PD-L2 Fc que bloquea la interacción entre PD1 y B7-H1. Otros anticuerpos anti-PDl incluyen AMP 514 (Amplimmune), entre otros, por ejemplo, anticuerpos anti-PDl divulgados en los documentos US 8609 089, US 2010028330 y/o US 20120114649.

TIM3 (linfocito T inmunoglobulina-3) también regula de manera negativa la función de los linfocitos T, especialmente en linfocitos T1 citotóxicos CD8+ y linfocitos auxiliares T1 CD4+ que segregan IFN-g, y desempeña una función crucial en el agotamiento de los linfocitos T. La inhibición de la interacción entre TIM3 y sus ligandos, por ejemplo, galectina-9 (Gal9), fosfatidilserina (PS) y HMGB1, puede incrementar la respuesta inmunitaria. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros inhibidores de TIM3 y sus ligandos, y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas de bajo peso molecular o inhibidores peptídicos que tienen como diana TIM3 se unen al dominio IgV de TIM3 para inhibir la interacción con sus ligandos. En los documentos WO2013/006490 y US20100247521 se divulgan anticuerpos y péptidos que inhiben TIM3. Otros anticuerpos anti-TIM3 incluyen versiones humanizadas de RMT3-23 (divulgado en Ngiow et al., 2011, Cáncer Res, 71:3540-3551), y el clon 8B.2C12 (divulgado en Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). En el documento US20130156774 se divulgan anticuerpos biespecíficos que inhiben TIM3 y PD-1.

En otras realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR es un inhibidor de CEACAM (por ejemplo, inhibidor de CEACa M-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5). En una realización, el inhibidor de CEACAM es una molécula de anticuerpo anti-CEACAM. Se describen anticuerpos anti-CEACAM-1 a modo de ejemplo en los documentos WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 y WO 2014/022332, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal 34B1, 26H7, y 5F4; o una forma recombinante de estos tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 2004/0047858, US 7 132255 y WO 99/052552. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM se une a CEACAM-5 tal como se describe en, por ejemplo, Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), o presenta reactividad cruzada con CEa Ca M-1 y CEACAM-5 tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2013/054331 y US 2014/0271618.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que las moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM), tales como CEACAM-1 y CEACAM-5, median, al menos en parte, en la inhibición de la respuesta inmunitaria antitumoral (remítase, por ejemplo, a Markel et al. J Immunol. 15 de marzo de 2002;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 1 de noviembre de 2006;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. febrero de 2009;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. febrero de 2010;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. junio de 2012;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 1 de junio de 2005;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529). Por ejemplo, se ha descrito CEACAM-1 como un ligando heterófilo para TIM-3 y como una molécula que desempeña una función en la tolerancia de los linfocitos T y agotamiento de estos mediados por TIM-3 (remítase, por ejemplo, al documento WO 2014/022332; Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). En algunas realizaciones, se ha mostrado que el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y TIM-3 potencia una respuesta inmunitaria antitumoral en modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal (remítase, por ejemplo, al documento WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), mencionado anteriormente). En otras realizaciones, el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y PD-1 reduce la tolerancia de los linfocitos T tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2014/059251. Por lo tanto, se pueden utilizar inhibidores de CEACAM con los otros inmunomoduladores descritos en la presente (por ejemplo, inhibidores anti-PD-1 y/o anti-TIM-3) para potenciar la respuesta inmunitaria contra un cáncer, por ejemplo, melanoma, un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC), un cáncer de vejiga, un cáncer de colon, un cáncer ovárico y otros cánceres tal como se describe en la presente.

LAG3 (gen-3 de activación de linfocitos o CD223) es una molécula de la superficie de las células expresada en linfocitos T y linfocitos B activados que ha mostrado que desempeña una función en el agotamiento de los linfocitos T CD8+. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros inhibidores de LAG3 y sus ligandos, y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. Por ejemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) es un anticuerpo monoclonal que tiene como diana LAG3. IMP701 (Immutep) es un anticuerpo antagonista contra lAG3 e IMP731 (Immutep y GlaxoSmithKline) es un anticuerpo contra LAG3 depletante. Otros inhibidores de LAG3 incluyen IMP321 (Immutep), que es una proteína de fusión recombinante de una porción soluble de LAG3 e Ig que se une a moléculas MHC de clase II y activa las células presentadoras de antígeno (APC). Se divulgan otros anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO2010/019570.

En algunas realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, donde el primer dominio es una molécula inhibidora, o fragmento de esta, y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido que se asocia con una señal positiva puede incluir un dominio coestimulador de CD28, CD27, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, como se describe en la presente. En una realización, la proteína de fusión es expresada por la misma célula que expresó el CAR. En otra realización, la proteína de fusión es expresada por una célula, por ejemplo, un linfocito T que no expresa un CAR CD33.

En una realización, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR descrita en la presente es miR-17-92.

En un caso, el agente que potencia la actividad de un CAR descrito en la presente es una citocina. Las citocinas tienen importantes funciones relacionadas con la expansión, diferenciación, supervivencia y homeostasis de linfocitos T. Las citocinas que se pueden administrar al sujeto que recibe una célula que expresa CAR descrita en la presente incluyen: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 e IL-21, o una combinación de estas. En casos preferidos, la citocina administrada es IL-7, IL-15 o IL-21, o una combinación de estas. La citocina se puede administrar una vez al día o más de una vez al día, por ejemplo, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. La citocina se puede administrar durante más de un día, por ejemplo, la citocina se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. Por ejemplo, la citocina se administra una vez al día durante 7 días.

En casos, la citocina se administra combinada con linfocitos T que expresan CAR. La citocina se puede administrar de manera simultánea o a la vez que los linfocitos T que expresan CAR, por ejemplo, administrarse en el mismo día. La citocina se puede preparar en la misma composición farmacéutica que los linfocitos T que expresan CAR, o se puede preparar en una composición farmacéutica separada. Como alternativa, la citocina se puede administrar poco después de la administración de los linfocitos T que expresan CAR, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de los linfocitos T que expresan c A r . En los casos donde la citocina se administra en una pauta posológica que se produce a lo largo de más de un día, el primer día de la pauta posológica de la citocina puede ser el mismo día de la administración de los linfocitos T que expresan CAR, o el primer día de la pauta posológica de la citocina puede ser 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de los linfocitos T que expresan CAR. En un caso, en el primer día, los linfocitos T que expresan CAR se administran al sujeto, y en el segundo día, se administra una citocina una vez al día durante los siguientes 7 días. En un caso preferido, la citocina que se va a administrar combinada con linfocitos T que expresan CAR es IL-7, IL-15 o IL-21.

En otros casos, la citocina se administra un periodo de tiempo después de la administración de células que expresan CAR, por ejemplo, al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de las células que expresan CAR. En un caso, la citocina se administra después de evaluar la respuesta del sujeto a las células que expresan CAR. Por ejemplo, al sujeto se le administran células que expresan CAR de acuerdo con la dosificación y pautas descritas en la presente. La respuesta del sujeto a la terapia con células que expresan CAR se evalúa 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de células que expresan CAR, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente, incluidas la inhibición del crecimiento tumoral, reducción de las células tumorales circulantes o regresión tumoral. A los sujetos que no muestran una respuesta suficiente a la terapia con células que expresan CAR se les puede administrar una citocina. La administración de la citocina al sujeto que tiene una respuesta subóptima a la terapia con células que expresan CAR mejora la eficacia de las células que expresan CAR o la actividad anticancerosa. En un caso preferido, la citocina administrada después de la administración de las células que expresan CAR es IL-7.

COMBINACIÓN CON UNA DOSIS BAJA, DE POTENCIACIÓN INMUNITARIA, DE UN INHIBIDOR DE MTOR

Los métodos descritos en la presente utilizan dosis bajas, de potenciación inmunitaria, de inhibidores de mTOR, por ejemplo, inhibidores de mTOR alostéricos, incluidos rapálogos tales como RAD001. La administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir completamente el sistema inmunitario, pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) puede optimizar el funcionamiento de las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o células que expresan CAR, en el sujeto. En la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2015/01240036 se describen métodos para medir la inhibición de mTOR, dosificaciones, pautas de tratamiento y composiciones farmacéuticas adecuadas.

En una realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR puede dar como resultado uno o más de los siguientes:

i) un descenso en el número de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1;

ii) un incremento en el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1;

iii) un incremento en la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1/células efectoras inmunitarias positivas para PD-1;

iv) un incremento en el número de linfocitos T vírgenes;

v) un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;

vi) un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; o

vii) un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;

y donde cualquiera de los anteriores, por ejemplo, i), ii), iii), iv), v), vi), o vii), ocurre, por ejemplo, al menos de manera transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

En otra realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR da como resultado una proliferación o persistencia prolongada o mayor de células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, la mayor proliferación o persistencia se asocia con un incremento en el número de células que expresan

CAR. Los métodos para medir la proliferación prolongada o mayor se describen en los Ejemplos 8 y 9. En otra realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR da como resultado una muerte mayor de células cancerosas por parte de células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, una muerte de células cancerosas mayor se asocia con un descenso en el volumen tumoral. Los métodos para medir la muerte de células cancerosas mayor se describen en el Ejemplos 6.

En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente, se administra combinada con una dosis baja, de potenciación inmunitaria de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor de mTOR catalítico. Por ejemplo, la administración de la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR se puede iniciar antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; completar antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; iniciar a la vez que la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; superponer con la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; o continuar después de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente.

Como alternativa, o además, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR puede optimizar las células efectoras inmunitarias que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente. En tales casos, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia o completa antes de extraer células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente, de un sujeto.

En otro caso, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente, por ejemplo, después de extraerlas de un sujeto, o células efectoras inmunitarias que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, por ejemplo, antes de administrarlas a un sujeto, se pueden cultivar en presencia de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR.

En una realización, la administración al sujeto de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR comprende administrar, por ejemplo, una vez a la semana, por ejemplo, en una forma farmacéutica de liberación inmediata, de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6 o aproximadamente 5 mg de RAD001, o una dosis bioequivalente de este.

En una realización, la administración al sujeto de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR comprende administrar, por ejemplo, una vez a la semana, por ejemplo, en una forma farmacéutica de liberación sostenida, de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001, o una dosis bioequivalente de este.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos un 5 pero no más de un 90%, al menos un 10 pero no más de un 90%, al menos un 15, pero no más de un 90%, al menos un 20 pero no más de un 90%, al menos un 30 pero no más de un 90%, al menos un 40 pero no más de un 90% un 50 pero no más de un 90%, al menos un 60 pero no más de un 90%, al menos un 70 pero no más de un 90% un 5 pero no más de un 80%, al menos un 10 pero no más de un 80%, al menos un 15, pero no más de un 80%, al menos un 20 pero no más de un 80%, al menos un 30 pero no más de un 80%, al menos un 40 pero no más de un 80% un 50 pero no más de un 80%, al menos un 60 pero no más de un 80%, al menos un 5 pero no más de un 70%, al men un 10 pero no más de un 70%, al menos un 15, pero no más de un 70%, al menos un 20 pero no más de un 70%, al menos un 30 pero no más de un 70%, al menos un 40 pero no más de un 70%, al menos un 50 pero no más de un 70%, al menos un 5 pero no más de un 60%, al menos un 10 pero no más de un 60%, al menos un 15, pero no más de un 60%, al menos un 20 pero no más de un 60%, al menos un 30 pero no más de un 60%, al menos un 40 pero no más de un

60%, al menos un 5 pero no más de un 50%, al menos un 10 pero no más de un 50%, al menos un 15, pero no más de un 50%, al menos un 20 pero no más de un 50%, al menos un 30 pero no más de un 50%, al menos un 40 pero no más de un 50%, al menos un 5 pero no más de un 40%, al menos un 10 pero no más de un 40%, al menos un 15, pero no más de un 40%, al menos un 20 pero no más de un 40%, al menos un 30 pero no más de un 40%, al menos un 35 pero

no más de un 40%, al menos un 5 pero no más de un 30%, al menos un 10 pero no más de un 30%, al menos un 15, pero no más de un 30%, al menos un 20 pero no más de un 30%, o al menos un 25 pero no más de un 30%.

El grado de inhibición de mTOR se puede expresar como, o corresponde al, grado de inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, el grado de inhibición de mTOR se puede determinar mediante el nivel de descenso en la actividad de cinasa P70 S6, por ejemplo, mediante el descenso en la fosforilación de un sustrato de la cinasa P70 S6. El nivel de inhibición de mTOR se puede evaluar mediante varios métodos, tales como medir la actividad de la cinasa P70 S6 mediante el ensayo Boulay, como se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2015/01240036, o como se describe en la Patente de e E. UU. N.° 7727 950; medir el nivel de S6 fosforilado mediante inmunoelectrotransferencia; o evaluar un cambio en la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1 respecto a células efectoras inmunitarias positivas para PD1.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «inhibidor de mTOR» se refiere a un compuesto o ligando, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que inhibe la cinasa mTOR en una célula. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor alostérico. Los inhibidores de mTOR alostéricos incluyen el compuesto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compuestos relacionados con rapamicina, es decir, compuestos que tienen una similitud funcional y estructural con rapamicina que incluyen, por ejemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (también denominados rapálogos) y otros compuestos macrólidos que inhiben la actividad de mTOR. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor catalítico.

La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus que tiene la estructura que se muestra en la Fórmula A.

Remítase, por ejemplo, a McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente de e E. UU. N.° 3929992. Existen varios esquemas de numeración propuestos para rapamicina. Para evitar confusión, cuando se nombran análogos de rapamicina específicos en la presente, los nombres se proporcionan haciendo referencia a rapamicina utilizando el esquema de numeración de la fórmula A.

Los análogos de rapamicina útiles en la invención son, por ejemplo, análogos O-sustituidos en los que el grupo hidroxilo del anillo de ciclohexilo de rapamicina es reemplazado por OR1 en el cual R1 es hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo o aminoalquilo; por ejemplo, RAD001, también conocido como everolimus, tal como se describe en los documentos US 5665 772 y WO94/09010.

Otros análogos de rapamicina adecuados incluyen los sustituidos en la posición 26 o 28. El análogo de rapamicina puede ser un epímero de un análogo mencionado anteriormente, particularmente un epímero de un análogo sustituido en la posición 40, 28 o 26, y opcionalmente se puede hidrogenar adicionalmente, por ejemplo, como se describe en los documentos US 6015 815, WO95/14023 y WO99/15530,

por ejemplo, ABT578 también conocido como zotarolimus o un análogo de rapamicina descrito en los documentos US 7 091 213, WO98/02441 y WO01/14387,

por ejemplo, AP23573 también conocido como ridaforolimus.

Los ejemplos de análogos de rapamicina adecuados para su uso en la presente invención del documento US 5665 772 incluyen, sin carácter limitante, 40-O-bencilrapamicina, 40-O-(4'-hidroximetil)bencilrapamicina, 40-O-[4'-(1,2-dihidorxietil)]bencilrapamicina, 40-O-alilrapamicina, 40-O-[3'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)il)prop-2'-en-1'-il]rapamicina, (2'£,4'S)-40-0-(4',5'-dihidroxipent-2'-en-1'-il)rapamicina, 40-0-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetilrapamicina, 40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina, 40-0-(3-hidroxi)propilrapamicina, 40-0-(6-hidroxi)hexilrapamicina, 40-0-[2-(2-hidroxi)etoxi]etilrapamicina, 40-0-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metilrapamicina, 40-0-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]rapamicina, 40-0-(2-acetoxi)etilrapamicina, 40-0-(2-nicotinoiloxi)etilrapamicina, 40-0-[2-(N-morfolino)acetoxi]etilrapamicina, 40-0-(2-N-imidazolilacetoxi)etilrapamicina, 40-0-[2-(N-metil-N'-piperazinil)acetoxi]etilrapamicina, 39-0-desmetil-39,40-0,0-etilenerapamicina, (26R)-26-dihidro-40-0-(2-hidroxi)etilrapamicina, 40-0-(2-aminoetil)rapamicina, 40-0-(2-acetaminoetil)rapamicina, 40-0-(2-nicotinamidoetil)rapamicina, 40-0-(2-(N-metilimidazo-2'-ilcarbetoxamido)etil)rapamicina, 40-0-(2-etoxicarbonilaminoetil)rapamicina, 40-0-(2-tolilsulfonamidoetil)rapamicina y 40-0-[2-(4',5'-dicarboetoxi-1',2',3'-triazol-1-il)etil]rapamicina.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención son análogos donde el grupo hidroxilo del anillo ciclohexilo de rapamicina y/o el grupo hidroxi en la posición 28 es reemplazado por un grupo hidroxiéster se describen, por ejemplo, análogos de rapamicina en el documento US RE44768, por ejemplo, temsirolimus.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención incluyen aquellos donde el grupo metoxi en la posición 16 es reemplazado por otro sustituyente, preferentemente alquiniloxi, bencilo, ortometoxibencilo o clorobencilo (opcionalmente hidroxi-sustituido) y/o donde el grupo mextoxi en la posición 39 se elimina junto con el carbono 39 de manera que el anillo ciclohexilo de la rapamicina se convierte en un anillo ciclopentilo que carece del grupo metioxi de la posición 39; por ejemplo, como se describe en los documentos WO95/16691 y WO96/41807.

Los análogos se pueden modificar adicionalmente de modo que el hidroxi en la posición 40 de rapamicina esté alquilado y/o el carbonilo-32 esté reducido.

Los análogos de rapamicina del documento WO95/16691 incluyen, sin carácter limitante, 16-desmetoxi-16-(pent-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-(but-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmtoxi-16-(propargil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-(4-hidroxibut-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxi-40-0(2-hidroxietil)rapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-orto-metoxibencilrapamicina, 16-desmetoxi-40-0-(2-metoxietil)-16-pent-2-inil)oxirrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-hidroximetil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-carboxi-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(4-metilpiperazin-1-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(morfolin-4-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-[N-metil, N-(2-piridin-2-iletil)]carbamoil-42-norrapamicina y 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(ptoluenosulfonilhidrazonometil)-42-norrapamicina.

Los análogos de rapamicina del documento WO96/41807 incluyen, sin carácter limitante, 32-desoxorrapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-desoxorrapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-desoxo-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-(S)-dihidro-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina, 32(S)-dihidro-40-0-(2-metoxi)etilrapamicina y 32(S)-dihidro-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina.

Otro análogo de rapamicina adecuado es umirolimus como se describe en el documento US2005/0101624.

RAD001, conocido de otra forma como everolimus (Afinitor®), tiene el nombre químico (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1,04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona, tal como se describe en los documentos US 5665 772 y WO94/09010.

Otros ejemplos de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]rapamicina (también denominado temsirolimus o CCI-779) y ridaforolimus (AP-23573/MK-8669). Otros ejemplos de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen zotarolimus (ABT578) y umirolimus.

Como alternativa o de manera adicional, se ha observado que los inhibidores de mTOR competitivos con ATP, catalíticos tienen como diana directamente el dominio cinasa de mTOR y tienen como diana tanto mTORC1 como mTORC2. Existen inhibidores de mTORC1 más eficaces que estos inhibidores de mTOR alostéricos como rapamicina, debido a que modulan respuestas de mTORC1 resistentes a rapamicina tales como la fosforilación de 4EBP1-T37/46 y traducción dependiente de la caperuza.

Los inhibidores catalíticos incluyen: BEZ235 o 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo, o la forma salina de monotosilato (la síntesis de BEZ235 se describe en el documento WO2006/122806); CCG168 (conocido de otro modo como Az D-8055, Chresta, C.M., et al., Cáncer Res, 2010, 70(1), 288 298) que tiene el nombre químico {5-[2,4-bis-((S)-3-metilmorfolin-4-il)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-2-metoxifenil}metanol; 3-[2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida (WO09104019); 3-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (WO10051043 y WO2013023184); una N-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalino-2-il)sulfamoil)fenil)-3-metoxi-4-metilbenzamida (WO07044729 y WO12006552); PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645) que tiene el nombre químico 1-[4-[4-(dimetilamino)piperidino-1carbonil]fenil]-3-[4-(4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43) que tiene el nombre químico 2,4-difluoro-N-{2-metoxi-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenesulfonamida; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (WO10114484); y (£)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1-(6-(2-cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)ilideno)cianamida (documento WO12007926).

Los ejemplos adicionales de inhibidores de mTOR catalíticos incluyen 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometilfenil)-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (WO2006/122806) y Ku-0063794 (García-Martínez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42. Ku-0063794 es un inhibidor específico de la diana en mamíferos de rapamicina (mTOR). WYE-354 es otro ejemplo de un inhibidor de mTOR catalítico (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cáncer Res.

69(15): 6232-6240).

Los inhibidores de mTOR útiles de acuerdo con la presente invención también incluyen profármacos, derivados, sales farmacéuticamente aceptables o análogos de estos de cualquiera de los anteriores.

Los inhibidores de mTOR, tales como RAD001, se pueden formular para el suministro basándose en métodos muy consolidados en la técnica en función de las dosificaciones particulares descritas en la presente. En particular, la Patente de EE. UU. N.o 6004 973 proporciona ejemplos de formulaciones que se pueden utilizar con los inhibidores de mTOR descritos en la presente.

Métodos y biomarcadores para evaluar la eficacia de CAR o la idoneidad de la muestra

En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método para evaluar o monitorizar la eficacia de una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CARCD33), en un sujeto (por ejemplo, un sujeto que padece cáncer, por ejemplo, un cáncer hematológico), o la idoneidad de una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis) para una terapia con CAR (por ejemplo, una terapia con CARCD33). El método incluye adquirir un valor de eficacia para la terapia CAR, o idoneidad de la muestra, donde dicho valor es indicativo de la eficacia o idoneidad de la terapia con células que expresan CAR.

En casos, el valor de la eficacia de la terapia con CAR, o idoneidad de la muestra, comprende una medida de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más (la totalidad) de los siguientes:

(i) el nivel o actividad de uno, dos, tres o más (por ejemplo, la totalidad) de los linfocitos T^{e f f}en reposo, linfocitos T^{r e g}en reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8, o linfocitos T gamma/delta más jóvenes), o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(ii) el nivel o actividad de uno, dos, tres o más (por ejemplo, la totalidad) de los linfocitos T^{e f f}activados, linfocitos T^{r e g}activados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células c D4 o CD8 más viejas), o linfocitos T de memoria tardíos, o una combinación de estos, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(iii) el nivel o actividad de un marcador del agotamiento de células inmunitarias, por ejemplo, uno, dos o más inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1, PD-L1, TIM-3 y/o LAG-3) en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado); En un caso, una célula inmunitaria tiene un fenotipo agotado, por ejemplo, coexpresa al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresa PD-1 y TIM-3. En otros casos, una célula inmunitaria tiene un fenotipo agotado, por ejemplo, coexpresa al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresa PD-1 y LAG-3;

(iv) el nivel de actividad de las células efectoras inmunitarias CD27 y/o CD45RO- (por ejemplo, CD27+ CD45RO-), por ejemplo, en una población de linfocitos T CD4+ o CD8+, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(v) el nivel o actividad de uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte o más de los biomarcadores elegidos de CCL20, IL-17a y/o IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1;

(vi) un nivel o actividad de citocinas (por ejemplo, calidad del conjunto de citocinas) en una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR, por ejemplo, muestra de producto de tipo célula que expresa CAR33; o

(vii) una eficacia de transducción de una célula que expresa CAR en un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la terapia con células que expresan CAR comprende una pluralidad (por ejemplo, una población) de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, por ejemplo, una pluralidad (por ejemplo, una población) de linfocitos T o linfocitos NK, o una combinación de estos. En un caso, la terapia con células que expresan CAR es una terapia con CARCD33.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de uno o más de (i)-(vii) se obtiene de una muestra de aféresis adquirida del sujeto. La muestra de aféresis se puede evaluar antes de la infusión o reinfusión.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de uno o más de (i)-(vii) se obtiene de una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado, por ejemplo, una muestra de un producto de tipo célula que expresa CARCD33. El producto de tipo célula que expresa CAR elaborado se puede evaluar antes de la infusión o reinfusión.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, se evalúa el sujeto antes de recibir, durante, o después de recibir la terapia con células que expresan CAR.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de uno o más de (i)-(vii) evalúa el perfil de uno o más de expresión génica, citometría de flujo o expresión de proteínas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el método comprende además identificar el sujeto como uno que responde al tratamiento, uno que no responde al tratamiento, uno con recaídas o uno sin recaídas, en función de la medida de uno o más de (i)-(vii).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento) tiene, o se ha identificado que tiene, un nivel o actividad más elevados de uno, dos o más (la totalidad) de GZMK, PPF1BP2 o linfocitos T vírgenes en comparación con un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un nivel o actividad más elevados de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más (por ejemplo, la totalidad) de IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, linfocitos T efectores o linfocitos T reguladores, en comparación con un sujeto que responde al tratamiento.

En un caso, un sujeto con recaídas es un paciente que tiene, o que se ha identificado que tiene, un nivel mayor de expresión de uno o más de (por ejemplo, 2, 3, 4 o todos) los siguientes genes, en comparación con sujetos sin recaídas: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITm 2c , y HLA-DQB1 y/o niveles reducidos de expresión de uno o más de (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o todos) los siguientes genes, en comparación con los sujetos sin recaídas: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1 y EIF1AY.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado, por ejemplo, más elevado estadísticamente significativo, de linfocitos T CD8+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un porcentaje de linfocitos T CD8+ de un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células efectoras inmunitarias CD27+ CD45RO-, por ejemplo, en la población CD8+, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células efectoras inmunitarias CD27+ CD45RO-.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado, por ejemplo, más elevado estadísticamente significativo, de linfocitos T CD4+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un porcentaje de linfocitos T CD4+ de un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de uno, dos, tres o más de (por ejemplo, todos) linfocitos T^{e f f}en reposo, linfocitos T^{r e g}en reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8, o linfocitos T gamma/delta más jóvenes), o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos T^{e f f}en reposo, linfocitos T^{r e g}en reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8 más jóvenes) o linfocitos T de memoria tempranos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de uno, dos, tres o más de (por ejemplo, todos) linfocitos T^{e f f}activados, linfocitos T^{r e g}activados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células CD4 o CD8 más viejas), o linfocitos T de memoria tardíos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que responde al tratamiento de linfocitos T^{e f f}activados, linfocitos T^{r e g}activados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células CD4 o CD8 más viejas) o linfocitos T de memoria tardíos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado del marcador de agotamiento de células inmunitarias, por ejemplo, uno, dos o más inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1, PD-L1, TIM-3 y/o LAG-3). En un caso, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células efectoras inmunitarias que expresan PD-1, PD-L1 o LAG-3 (por ejemplo, linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+) (por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o células CD4+ que expresan CAR) en comparación con el porcentaje de células efectoras inmunitarias que expresan PD-1 o LAG-3 de un sujeto que responde al tratamiento.

En un caso, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células inmunitarias que tienen un fenotipo agotado, por ejemplo, células inmunitarias que coexpresan al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresan PD-1, PD-L1 y/o TIM-3. En otros casos, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células inmunitarias que tienen un fenotipo agotado, por ejemplo, células inmunitarias que coexpresan al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresan PD-1 y LAG-3.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células positivas para CARCD33) en comparación con un sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento) en forma de terapia con células que expresan CAR.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ que un sujeto que responde al tratamiento, en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, población de células positivas para CARCD33).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un fenotipo agotado de PD1/PD-L1+ CAR+ y coexpresión de LAG3 en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células positivas para CARCD33).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células positivas para CARCD33) en comparación con el sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ que los sujetos que responden al tratamiento, en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, población de células positivas para CARCD33).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la presencia de linfocitos T CD8+ CD27+ CD45RO- en la muestra de aféresis es un factor pronóstico positivo de la respuesta del sujeto a una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CARCD33).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un porcentaje elevado de linfocitos T PD1 CAR+ y LAG3+ o TIM3- en una muestra de aféresis es un factor pronóstico deficiente de la respuesta del sujeto a una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CARCD33).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, el sujeto con una repuesta completa o parcial al tratamiento) tiene uno, dos, tres o más (o la totalidad) del siguiente perfil:

i) tiene un número mayor de células efectoras inmunitarias CD27+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células efectoras inmunitarias CD27+;

(ii) tiene un número mayor de linfocitos T CD8+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos T CD8+;

(iii) tiene un número menor de células inmunitarias que expresan uno o más inhibidores de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control elegidos de PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 o KLRG-1, o una combinación, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células que expresan uno o más inhibidores de puntos de control; o

(iv) tiene un número mayor de uno, dos, tres, cuatro o más (la totalidad) de linfocitos T^{e f f}en reposo, linfocitos T^{r e g}en reposo, células CD4 vírgenes, linfocitos de memoria no estimulados o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos T^{e f f}en reposo, linfocitos T^{r e g}en reposo, células CD4 vírgenes, linfocitos de memoria no estimulados o linfocitos T de memoria tempranos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el nivel o actividad de citocinas de (vi) se escoge entre una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (o la totalidad) de la citocina CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNy, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 o TNFa, o una combinación de estas. La citocina se puede escoger entre una, dos, tres, cuatro o más (la totalidad) de IL-17a, CCL20, IL2, IL6, o TNFa. En un caso, un mayor nivel o actividad de una citocina se escoge entre una o más de IL-17a y CCL20, es indicativo de una mayor respuesta o menos recaídas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, una eficacia de transducción de un 15% o superior en (vii) es indicativa de una mayor respuesta o menos recaídas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, una eficacia de transducción inferior a un 15% en (vii) es indicativa de una menor respuesta o más recaídas.

En casos, el sujeto que responde al tratamiento, un sujeto que no responde al tratamiento, un sujeto con recaídas o un sujeto sin recaídas identificado mediante los métodos de la presente se puede evaluar adicionalmente de acuerdo con criterios clínicos. Por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer que muestra una respuesta completa, por ejemplo, una remisión completa, al tratamiento. Se puede identificar una respuesta completa, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) y Cheson et al., «Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma», J Clin Oncol 25:579-586 (2007), como se describe en la presente. Un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer que muestra una respuesta parcial, por ejemplo, una remisión parcial, al tratamiento. Se puede identificar una respuesta parcial, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o los criterios Cheson como se describe en la presente. Un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, que no muestra una respuesta a un tratamiento, por ejemplo, el paciente padece una enfermedad estable o enfermedad progresiva. Se puede identificar un sujeto que no responde al tratamiento, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o los criterios Cheson como se describe en la presente.

Como alternativa, o en combinación con los métodos divulgados en la presente, responsivo a dicho valor, realizando uno, dos, tres, cuatro o más de:

administrar, por ejemplo, a un sujeto que responde al tratamiento o un sujeto sin recaídas, una terapia con células que expresan CAR;

administrar una dosificación alterada de una terapia con células que expresan CAR;

alterar la programación o evolución temporal de una terapia con células que expresan CAR;

administrar, por ejemplo, a un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento, un agente adicional combinado con una terapia con células que expresan CAR, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descrito en la presente;

administrar a un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento una terapia que aumenta el número de linfocitos T más jóvenes en el sujeto antes del tratamiento con una terapia con células que expresan CAR;

modificar el proceso de elaboración de una terapia con células que expresan CAR, por ejemplo, enriqueciendo en linfocitos T más jóvenes antes de introducir un ácido nucleico que codifica un CAR, o aumentar la eficacia de transducción, por ejemplo, para un sujeto identificado como un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento;

administrar una terapia alternativa, por ejemplo, para un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento o un sujeto con recaídas; o

si el sujeto es, o se ha identificado como, un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con recaídas, reducir la población de linfocitos T^{r e g}y/o característica génica de T^{r e g}, por ejemplo, mediante uno o más de la depleción de CD25, administración de ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR o una combinación de estos.

En ciertos casos, el sujeto se trata previamente con un anticuerpo anti-GITR. En ciertos casos, el sujeto se trata con un anticuerpo anti-GITR antes de la infusión o reinfusión.

Métodos de sum inistro de biopolímeros

En algunos casos, una o más células que expresan CAR como se divulgan en la presente se pueden administrar o suministrar al sujeto mediante un esqueleto biopolimérico, por ejemplo, un implante biopolimérico. Los esqueletos biopoliméricos pueden reforzar o potenciar el suministro, expansión y/o dispersión de las células que expresan CAR descritas en la presente. Un esqueleto biopolimérico comprende un polímero biocompatible (por ejemplo, no induce sustancialmente una respuesta inflamatoria o inmunitaria) y/o biodegradable que puede ser de origen natural o sintético.

Los ejemplos de biopolímeros adecuados incluyen, sin carácter limitante, agar, agarosa, alginato, alginato/cemento de fosfato de calcio (CPC, por sus siglas en inglés), beta-galactosidasa (p-GAL), (1,2,3,4,6-pentaacetil-a-D-galactosa), celulosa, quitina, quitosano, colágeno, elastina, gelatina, ácido hialurónico y colágeno, hidroxiapatita, poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBHHx), poli(lactida), poli(caprolactona) (PCL), poli(lactida-co-glicólido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), alcohol polivinílico (PVA), seda, proteína de soja, y aislado de proteína de soja, solo o combinado con cualquier otra composición polimérica, en cualquier concentración y en cualquier relación. El biopolímero se puede aumentar o modificar con moléculas que fomentan la adhesión o migración, por ejemplo, péptidos que mimetizan colágeno que se unen al receptor de colágeno de los linfocitos, y/o moléculas estimuladoras para potenciar el suministro, expansión o función, por ejemplo, actividad anticancerosa, de las células que se van a suministrar. El esqueleto biopolimérico puede ser inyectable, por ejemplo, una composición en gel, o semisólida o sólida.

En algunos casos, las células que expresan CAR descritas en la presente se siembran en el esqueleto biopolimérico antes del suministro al sujeto. En casos, el esqueleto biopolimérico comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales descritos en la presente (por ejemplo, otra célula que expresa CAR, un anticuerpo o una molécula de bajo peso molecular) o agentes que potencian la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, incorporada a los biopolímeros del esqueleto o conjugada con estos. En casos, el esqueleto biopolimérico se inyecta, por ejemplo, por vía intratumoral, o se implanta quirúrgicamente en el tumor o a una distancia del tumor lo suficientemente próxima para mediar en un efecto antitumoral. Se describen ejemplos adicionales de composiciones biopoliméricas y métodos para su suministro en Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; y el documento WO2014/110591.

Composiciones farmacéuticas y tratamientos

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una célula que expresa CAR, por ejemplo, una pluralidad de células que expresan CAR, tal como se describe en la presente, combinada con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones, tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención están formuladas en un aspecto para la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar las dosificaciones apropiadas mediante ensayos clínicos.

En una realización, la composición farmacéutica está sustancialmente exenta de, por ejemplo, no hay niveles detectables de un contaminante, por ejemplo, seleccionado del grupo constituido por endotoxina, micoplasma, lentivirus competente para la replicación (RCL), p24, ácido nucleico de VSV-G, gag de HIV, perlas residuales recubiertas anti-CD3/anti-CD28, anticuerpos de ratón, suero humano combinado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, componentes de plásmidos o células de empaquetamiento de vectores, una bacteria y un hongo. En una realización, la bacteria es al menos una seleccionada del grupo constituido por Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia y grupo A de Streptococcus pyogenes.

Cuando se indica «una cantidad inmunológicamente eficaz», «una cantidad antitumoral eficaz», «una cantidad inhibidora de tumores eficaz» o «cantidad terapéutica», la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se va a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). Generalmente se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en la presente se puede administrar con una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos T también se pueden administrar múltiples veces con estas dosificaciones. Las células se pueden administrar utilizando técnicas de infusión de uso común en inmunoterapia (remítase, por ejemplo, a Rosenberg et al., New Eng. J. o f Med. 319:1676, 1988).

En ciertos aspectos, puede resultar deseable administrar linfocitos T activados a un sujeto y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar linfocitos T de esta de acuerdo con la presente invención, y reinfundir al paciente estos linfocitos T activados y expandidos. Este proceso se puede llevar a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertos aspectos, los linfocitos T se pueden activar a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc o 100cc.

La administración de las composiciones objeto se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, que incluye la inhalación por aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranasal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal. En un aspecto, las composiciones de células T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En un aspecto, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) de la presente invención se administra mediante inyección i.v. Las composiciones de células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) se pueden inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

En un aspecto a modo de ejemplo particular, los sujetos se pueden someter a leucocitaféresis, donde los leucocitos se extraen, enriquecen o depletan ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK). Estos aislados de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se pueden expandir mediante métodos conocidos en la técnica y tratar de tal manera que se puedan introducir uno o más constructos CAR de la invención para crear así una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención. Los sujetos que lo necesiten se pueden someter posteriormente a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertos aspectos, después o a la vez del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células que expresan CAR expandidas (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la presente invención. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

En casos, se realiza una linfodepleción en un sujeto, por ejemplo, antes de administrar una o más células que expresan un CAR descrito en la presente, por ejemplo, un CAR de unión a CD33 descrito en la presente. En casos, la linfodepleción comprende administrar uno o más de melfalán, citoxano, ciclofosfamida y fludarabina.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosificaciones para la administración a seres humanos se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente administrada a diario durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día aunque en algunos casos se pueden utilizar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descritas en la Patente de EE. UU. N.° 6 120766).

En una realización, el CAR se introduce en células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), por ejemplo, utilizando transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, ser humano) recibe una administración inicial de células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) de la invención, y una o más administraciones posteriores de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) de la invención, donde la una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración previa. En una realización, se administra más de una administración de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) de la invención al sujeto (por ejemplo, ser humano) a la semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) de la invención a la semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, sujeto humano) recibe más de una administración de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) a la semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones a la semana) (también denominadas en la presente un ciclo), seguidas de una semana sin administraciones de células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK), y después se administran al sujeto una o más administraciones adicionales de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) (por ejemplo, más de una administración de las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) a la semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, sujeto humano) recibe más de un ciclo de células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) y el tiempo entre cada ciclo es inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, o 3 días. En una realización, las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) se administran en días alternos para tener 3 administraciones a la semana. En una realización, las células efectoras inmunitarias CAR (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NK) de la invención se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

En un aspecto, se generan células que expresan CAR CD33 (por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR CD33 o CART CD33) utilizando vectores víricos lentivíricos, tales como lentivirus. Las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR o CART) generadas de esta manera tendrán una expresión estable de CAR.

En un aspecto, se generan células que expresan CAR, por ejemplo, CART, utilizando un vector vírico tal como un vector gammarretrovírico, por ejemplo, un vector gammarretrovírico descrito en la presente. Los CART generados utilizando estos vectores pueden tener una expresión de CAR estable.

En un aspecto, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR o CART) expresan de manera transitoria vectores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de CAR se puede efectuar mediante suministro del vector de ARN de CAR. En un aspecto, el ARN de CAR se transduce en la célula, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK, mediante electroporación.

Un posible problema que puede surgir en pacientes que están siendo tratados utilizando células que expresan CAR con expresión transitoria (por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR o CART) (particularmente con células que expresan c A r portadoras de scFv murino (por ejemplo, linfocitos NK que expresan c A r o CART)) es la anafilaxis después de múltiples tratamientos.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que una respuesta anafiláctica de este tipo puede estar causada porque el paciente desarrolla una respuesta anti-CAR humoral, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos del paciente experimentan un cambio de clase desde un isotipo IgG (que no provoca anafilaxis) a un isotipo IgE cuando hay un descanso en la exposición al antígeno de diez a catorce días.

Si un paciente corre un alto riesgo de generar una respuesta de anticuerpos anti-CAR durante el curso de la terapia con CAR transitoria (tal como las generadas por las transducciones de ARN), los descansos de infusión de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR o CART) no deberían durar más de diez a catorce días.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente en más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan a efectos únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, no se debe considerar que la invención se limite de ningún modo a los siguientes ejemplos, sino que más bien, se debe considerar que abarca todas y cada una de las variaciones que resultan evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en la presente.

Sin una descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente invención y llevar a la práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos prácticos señalan específicamente diversos aspectos de la presente invención, y no se han de considerar limitantes de modo alguno del resto de la divulgación.

Ejemplo 1: Constructos CAR humanizados

Se midieron los niveles de CD33 en muestras patentes primarias de pacientes que padecían AML mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo comercializado (clon HIM3-4, eBioscience; o clon WM53, Biolegend). Los resultados presentados en la presente demuestran que CD33 se expresaba en muchas muestras primarias de pacientes con AML (se seleccionaron los blastos de AML utilizando las características estándar de dispersión lateralbajaCD45ténue); n=35-46 por grupo).

Se muestra una representación esquemática de los constructos CAR utilizados en este Ejemplo en la Figura 3. Todos son CAR de segunda generación que utilizan señalización de 41BB y CD3zeta. El scFv de CART33 se derivaba del clon MY9-6.

Actividad in vitro de CART33

El experimento descrito en la presente midió la desgranulación de linfocitos T mediada por CART33. Se incubaron linfocitos T transducidos con CART33 y no transducidos con la línea celular CD33+ MOLM14 y una línea celular de ALL de control NALM6, y se midió la desgranulación CD107a mediante citometría de flujo. La expresión de constructos CART33 tanto murinos como humanizados provocó desgranulación específica en presencia de MOLM14 (P<0,001). (Fig. 4).

El experimento descrito en la presente midió la producción de citocinas en respuesta a CART33. Los linfocitos T que expresan CART33 tanto humanizado como murino produjeron citocina después de su incubación con MOLM14 (Fig. 5) Se midieron el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón gamma intracelulares mediante citometría de flujo.

El experimento descrito en la presente midió la proliferación de linfocitos T que expresan CART123 y CART33. Se midió la proliferación de CART33 murino y CART33 humanizado en respuesta a MOLM14. Los resultados se muestran en la Figura 6. Los linfocitos T se marcaron con CFSE y se incubaron en condiciones de control o con MOLM14 durante 120 horas. Los linfocitos T sin proliferar retuvieron un único pico intenso de expresión de CFSE (por fluorescencia verde en el canal FITC), mientras que los linfocitos CART proliferantes tuvieron más de un pico de CFSE y una expresión que era inferior que el valor inicial.

El experimento descrito en la presente midió la muerte específica de linfocitos T que expresan CART123, CART33 humanizado y CART33 murino. Los linfocitos T se incubaron con MOLM14 o NALM6 (control) durante 24 horas. La expresión de huCART33 dio como resultado una muerte específica significativamente mayor en comparación con CART33 murino en relaciones de E:D bajas (Fig. 7). La muerte se midió utilizando un ensayo basado en citometría de flujo después de marcar con CFSE las células tumorales (por ejemplo, Cao et al., Cytometry Part A 2010;7&A:534-545) o incubando los linfocitos CART con células diana que expresan luciferasa en diferentes relaciones de efector respecto a diana durante hasta 20 horas, tras lo cual se obtienen imágenes ópticas para fotones emitidos por las células diana. En este último ensayo, el número de células diana vivas se correlaciona positivamente con el número de fotones emitidos.

Se determinó el perfil citocínico de los linfocitos T que expresan CART33 humanizado, CART33 murino y CART123 después de la incubación durante 24 horas con ya sea medio para linfocitos T solo, PMA/Ionomicina, MOLM14 o NALM6 (línea celular de control) (Fig. 8), utilizando un kit 30-plex Luminex (Invitrogen).

CART33 (bisagra de IgG4) y CART33 (bisagra de CD8) tienen actividad in vitro equivalente

El experimento descrito en la presente midió la desgranulación. Se incubaron CART33 (bisagra de IgG4), CART33 (bisagra de CD8), CART123 y linfocitos T no transducidos con la línea celular CD33+ MOLM14, y se midió la desgranulación CD107a mediante citometría de flujo. Los resultados presentados en la presente demuestran que ambos constructos CART33 experimentaron desgranulación específica en presencia de MOLM14 (Fig. 8).

El experimento descrito en la presente midió la producción de citocinas. Ambos constructos CART33 y CART123 indujeron específicamente la producción de citocinas después de la incubación con la línea celular MOLM14 (Fig. 9). Se midieron el factor de necrosis tumoral alfa, MIPla y el interferón gamma intracelulares mediante citometría de flujo.

El experimento descrito en la presente midió la proliferación de linfocitos no transducidos de control, que expresan CAr T33 (bisagra de IgG4), Ca Rt 33 (bisagra de CD8) o CART123 en respuesta a MOLM14 (Fig. 10). Los linfocitos T se marcaron con CFSE y se incubaron con MOLM14 durante 120 horas. Se midió la proliferación mediante la dilución de CFSE. Los linfocitos T sin proliferar se tiñen intensamente con CFSE y muestran un único pico. Una división celular se observa como dos picos, dos divisiones celulares como tres picos, etc.

Efecto antitumoral in vivo equivalente de CART33-CD8H, CART33-IgG4H y CART123

Para comparar el efecto antitumoral in vivo de CART33-CD8H, CART33-IgG4H y CART123, se inyectó la línea celular de AML MOLM14 en una dosis de 1x106 i.v. en ratones NOD-SCID-supresión de la cadena gamma común (NSG) y se obtuvieron imágenes del prendimiento del injerto después de 6 días. El día 7, los ratones se trataron con linfocitos T que expresan CART33 (bisagra de IgG4), CART33 (bisagra de CD8), CART123 o vehículo de control (células no transducidas). El número total de linfocitos T inyectados fue de 2 x 106 IV. Los ratones se controlaron obteniendo imágenes en serie semanalmente para evaluar la carga tumoral (Fig. 11).

Los datos de la carga tumoral a lo largo del tiempo se obtuvieron mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI). Los datos de un experimento (n=5 por grupo), representativos de 4 experimentos independientes de los ratones se muestran en la Figura 12. Los resultados presentados en la presente demuestran un efecto antitumoral in vivo equivalente de los linfocitos T CART33-CD8H, CART33-IgG4H y CART123.

CART33 y CART123 producen una erradicación equivalente de AML primaria in vivo

Para comparar la erradicación por parte de CART33 y CART123 de AML primaria in vivo, se inyectó una muestra de AML primaria en una dosis de 5x106 i.v. en ratones NSG transgénicos para las citocinas humanas IL3/GM-CSF/SCF (ratones NSGS). El prendimiento del injerto se confirmó mediante una extracción de sangre retroorbital después de 2-4 semanas y a continuación los ratones se trataron con CART33, CART123 o vehículo de control (células no transducidas). El número total de linfocitos T inyectados fue de 1x105 i.v. Los ratones se controlaron con extracciones de sangre retroorbitales en serie para evaluar la carga tumoral de AML (Fig. 13).

Se realizó un análisis de sangre periférica de ratones tratados con UTD, CART33 o CART123 antes de iniciar el tratamiento, el día 14 y el día 70 (Fig. 14). Se obtuvo sangre del seno retroorbital de ratones anestesiados utilizando técnicas estándar. A continuación se lisó un volumen estándar de 50-60ul de sangre en 1ml de tampón de lisis ACK. La sangre se tiñó posteriormente utilizando anticuerpos marcados fluorescentemente y se detectó la presencia de AML o linfocitos CART utilizando citometría de flujo. No se detectó AML en los ratones tratados con CART33 o CART123.

La carga de la enfermedad se midió por los blastos/ul de extracciones de sangre retroorbitales en puntos temporales diferentes (Fig. 15).

Se midió la supervivencia de los ratones tratados con CART33, CART123 o UTD (p<0,001 cuando se compara ya sea CART33 o Ca Rt 123 con UTD) (Fig. 16). Los resultados presentados en la presente demuestran que CART33 y CART123 producen una erradicación equivalente de AML primaria in vivo.

Toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33

Para determinar la toxicidad en células madre hematopoyéticas de células CART33, se extrajo sangre del seno retroorbital de ratones con sistema inmunitario humanizado (HIS) 6-8 semanas después de la inyección de células CD34+ humanas derivadas del hígado fetal para confirmar el prendimiento del injerto de células humanas. Los ratones se trataron a continuación con ya sea CART33 o UTD (1x106 células cada uno) y se controlaron mediante extracciones de sangre retroorbitales en serie semanalmente. Posteriormente los ratones se sacrificaron el día 28, y sus órganos se extirparon y se analizaron (Fig. 17).

Se realizó un análisis de la sangre periférica (a través de una extracción de sangre retroorbital) mediante citometría de flujo del día 28 al final del experimento (Fig. 18). El análisis estadístico del análisis de sangre periférica del día 28 de ratones tratados con CART33, UTD o sin tratamiento (n=5) mostró que CART33 provocó una toxicidad significativa en monocitos y células de linaje mieloide CD33+ con conservación relativa de linfocitos B y plaquetas (Fig. 19). En análisis de la médula ósea mediante citometría de flujo el día 28 mostró que el tratamiento con CART33 dio como resultado una reducción significativa en progenitoras mieloides (CD34+CD38+) y en células madre hematopoyéticas (CD34+CD38-), seleccionadas en singletes, huCD45ténue, negativas para marcadores de linaje (Fig. 20).

Se realizaron cortes del fémur en los ratones el día 28 después del tratamiento con linfocitos T UTD o células CART33. Se realizó una tinción de huCD45 y CD34 por IHC (Fig. 21). No hay diferencia en huCD45 entre los linfocitos T de control y CART33, aunque ambos de estos grupos muestran menos tinción de huCD45 posiblemente indicativo de un efecto humano-anti-humano alogénico. Hubo una reducción específica de células CD34+ en ratones tratados con CART33. Los resultados son representativos de dos experimentos.

CART33 y CART123 producen una toxicidad hematopoyética in vivo equivalente

Para determinar la toxicidad hematopoyética in vivo de CART33 y CART123, los ratones NSGS recibieron busulfán i.p. seguido de 2x106 células de médula ósea depletadas de linfocitos T de un donante normal el día siguiente. El prendimiento del injerto se confirmó mediante análisis por citometría de flujo de sangre periférica después de 4 semanas y los ratones se trataron entonces con 1x10(6) linfocitos T autólogos, transducidos con CART33, CART123 o UTD. Los ratones se controlaron posteriormente con una extracción de sangre retroorbital el día 7 y el día 14, y se sacrificaron para su necropsia el día 14 (Fig. 22).

Se realizó un análisis de la médula ósea mediante citometría de flujo el día 28. El tratamiento con CART33 y CART123 dio como resultado una reducción significativa en las progenitoras mieloides (CD34+CD38+) y en células madre hematopoyéticas (CD34+CD38-), seleccionadas en huCD45ténue, Lin-. Los resultados son representativos de dos experimentos (Fig. 23). Los resultados presentados en la presente sugieren que CART33 y CART123 producen una toxicidad hematopoyética in vivo equivalente.

Se incubó BM (siglas en inglés de médula ósea) enriquecida en CD34 de pacientes con MDS con ya sea UTD, CART33 (bisagra de IgG4), CART33 (bisagra de CD8) o CART123. Hubo una reducción significativa en células CD45ténueCD34+ en muestras tratadas con CART33 o CART123 (Fig. 24). Los resultados presentados en la presente demuestran que CART33 y CART123 son células de médula de síndrome mielodisplásico (MDS) citotóxicas.

Se describen experimentos adicionales que examinan la actividad de CART33 humanizadas en los Ejemplos 5-6.

Ejemplo 2: Constructos CAR

Se generaron fragmentos variables monocatenarios (scFv) anti-CD33 completamente humanos y se clonaron en un vector de expresión lentivírico con la cadena CD3zeta intracelular y el dominio coestimulador intracelular de 4-1BB, y se les dieron los nombres expuestos en la Tabla 1 (que se proporciona en la Descripción detallada).

Se hizo variar el orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID NO:25), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:25) (por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:28) o (G4S)4(SEQ ID NO:27)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 3.

Las secuencias de los fragmentos scFv humanos (SEQ ID NOS: 39-83, incluida la secuencia líder opcional) se proporcionan en la presente en la Tabla 2 (en la Descripción detallada). Las secuencias de fragmentos scFv humanos, sin la secuencia líder, se proporcionan en la presente en la Tabla 9 (SEQ ID NOS: 255-261 para las secuencias de nucleótidos, y las SEQ ID No S: 262-268 para las secuencias de aminoácidos) en la Descripción detallada.

Todos estos clones contenían un cambio de residuo Q/K en el dominio señal del dominio coestimulador derivado de la cadena CD3zeta. Los fragmentos de scFv CAR se clonaron a continuación en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y se utilizó el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

Las secuencias de los constructos CAR y sus secuencias de dominio se enumeran en la Descripción detallada. Se llevó a cabo un análisis de los constructos CAR humanos tal como se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 3: Secuencias de CART humanizados

secuencia de nucleótidos de IgG4 anti-CD33 murina 2213 138)

GT GC ACGAGT GGGTT AC AT CGA ACT GGAT CTC A AC AGCGGT A AGAT CCTT G AGAGT TTT CGCCCC GA AGA ACGTTTTCC A AT GAT GAGC ACTTTT A A AGTT CT GCT AT GT GGCGCGGT ATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAAT GACTT GGTT GAGT ACTC ACC AGT C AC AGA A A AGC AT CTT ACGGAT GGC AT G AC AGT A AGA GA ATT AT GC AGT GCT GCC AT A ACC AT GAGT GAT A AC ACT GCGGCC A ACTT ACTTCT CACA A CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCG CCTT GAT CGTT GGGA ACCGGAGCT GA AT GA AGCC AT ACC A A ACGACGAGCGT GAC ACC AC GAT GCCT GT AGC A AT GGC A AC A ACGTT GCGC A A ACT ATT A ACT GGC GA ACT ACTT ACTCT A GCTT CCCGGC A AC A ATT A AT AGACT GGAT GGAGGCGGAT A A AGTT GCAGG ACC ACTTCT GC GCT CGGCCCTTCCGGCT GGCT GGTTT ATT GCT GAT A A ATCT GGAGCCGGT G AGCGT GGGT C T CGCGGT AT C ATT GC AGC ACT GGGGCC AGAT GGT A AGCCCT CCCGT ATCGT AGTT AT CT AC ACGACGGGGAGT C AGGC A ACT AT GGAT GA ACGA A AT AGAC AGAT CGCT GAGAT AGGT GCC T C ACT GATT A AGC ATT GGT A ACT GT C AGACC A AGTTT ACT C AT AT AT ACTTT AGATT GATTT

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GCGACGCTTTTTTTCT GGC A AGAT AGT CTT GT A A AT GCGGGCC A AG AT CT GC AC ACT GGT A TTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCG GCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGG AGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAG GAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCG TCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGG GTTTT ATGCGAT GGAGTTT CCCC AC ACT GAGT GGGT GGAGACT GA AGTT AGGCC AGCTT GG C ACTT GAT GT A ATTCTCCTT GGA ATTT GCCCTTTTT GAGTTT GGAT CTT GGTTC ATTCT C A AG CCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCTAGCTCTAGAGC C ACC AT GGCCCT GCCT GT GAC AGCCCT GCT GCT GCCTCT GGCT CT GCT GCT GC AT GCCGCT A GACCCGGAT CC A AC ATC AT GCT GACCC AGAGCCCT AGC AGCCT GGCCGT GTCT GCCGGCGA GAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAA CT ACCT GGCCT GGT ATC AGC AGAT CCCCGGCC AGAGCCCC A AGCT GCT GAT CT ACT GGGCC AGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTC ACCCT GAC A AT C AGC AGCGT GC AGAGCGAGGACCT GGCC ATCT ACT ACT GCC ACC AGT ACC T GAGC AGCCGGACCTTT GGCGGAGGC ACC AAGCT GGAAATC A AGAGAGGCGGCGGAGGCT CAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCCG AGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC C AGCT ACT AC ATCC ACT GGATC A AGC AGACCCCTGGAC AGGGCCT GGA AT GGGT GGGAGT GATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCT GACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGA CAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGCC GGCACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTT GCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGA C ACCCT GAT GATC AGCCGGACCCCCGAGGT GACCT GT GT GGT GGT GGACGT GT CCC AGGAG GACCCCGAGGT CC AGTT C A ACT GGT ACGT GGACGGCGT GGAGGT GC AC A ACGCC A AGACC A AGCCCCGGGAGG AGC AGTT C A AT AGC ACCT ACC GGGT GGT GTCCGT GCT GACCGT GCT GC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCA GCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACA CCCT GCCCCCT AGCC A AGAGGAGAT GACC A AGA ACC AGGT GT CCCT GACCT GCCT GGT GA AGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACA ACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCT

GGCCCT GC ACA ACC ACT AC ACCC AGA AGAGCCT GAGCCT GT CCCT GGGC A AGAT GAT CT AC AT CT GGGCGCCCTT GGCCGGGACTT GT GGGGTCCTTCT CCT GTC ACT GGTT AT C ACCCTTT A CT GC A A ACGGGGC AGA A AGA A ACT CCT GT AT AT ATTC A A AC A ACC ATTT AT GAGACCAGT A CAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGA T GT GA ACT GAGAGT GAAGTT C AGC AGGAGCGC AGACGCCCCCGCGT AC A AGC AGGGCC AG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGG CCT GT AC A AT GA ACTGC AGA A AG AT A AGAT GGCGGAGGCCT AC AGT GAGATT GGGAT GA A AGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCAC CAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACAATCAA CCTCT GGATT ACA A A ATTT GT GA A AGATT GACT GGT ATTCTT A ACT AT GTT GC TCCTTTT AC GCT AT GT GGAT ACGCT GCTTT A AT GCCTTT GT AT C AT GCT ATT GCTT CCCGT AT GGCTTT C AT TTT CT CCT CCTT GT AT A A ATCCT GGTT GCT GT CTCTTT AT GAGGAGTT GT GGCCCGTT GT C AG GCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCC ACC ACCT GT C AGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTT CCCCCT CCCT ATT GCC ACGGCGGA ACT C AT CGCCGCCT GCCTT GCCCGCT GCT GGAC AGGGGCTC GGCT GTT GGGC ACT GAC A ATTCC GT GGT GTT GTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCTT GGCT GCTCGCCTGT GTTGCCACCT GGAT TCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCC GCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGG ATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACT T AC A AGGC AGCT GT AGAT CTT AGCC ACTTTTT A A A AGA A A AGGGGGGACT GGA AGGGCT A ATTC ACT CCC A ACGA AGAC A AGAT CT GCTTTTT GCTT GT ACT GGGT CTCT CT GGTT AGACC A GATCT GAGCCT GGGAGCTCT CT GGCT A ACT AGGGA ACCC ACT GCTT A AGCCTC A AT A A AGC TTGCCTTGAGT GCTTC A AGT AGT GT GT GCCCGT CT GTT GT GT GACT CT GGT A ACT AGAGATC CCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTA TT C AGT ATTT AT A ACTT GC A A AGA A AT GA AT AT C AGAGAGT GAGAGGA ACTT GTTT ATT GC AGCTT AT A AT GGTT AC A A AT A A AGC A AT AGC AT C AC A A ATTTC AC A A AT A A AGC ATTTTTT TCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTA GCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTT TTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGA GGCTTTTTT GGAGGCCT AGCT AGGGACGT ACCC A ATT CGCCCT AT AGT GAGT CGT ATT ACG CGCGCT C ACT GGCCGTCGTTTT AC A ACGT CGT GACT GGGA A A ACCCT GGCGTT ACCC A ACT TAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACC GATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCG CATT AAGCGCGGCGGGT GT GGTGGTTACGCGC AGCGT GACCGCT ACACTT GCC AGCGCCCT AGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCA AGCT CT A A AT CGGGGGCTCCCTTT AGGGTTCCG ATTT AGT GCTTT ACGGC ACCTCGACCCC A A A A A ACTT GATT AGGGT GAT GGTTC ACGT AGT GGGCC AT CGCCCT GAT AGACGGTTTTT CG CCCTTT GACGTT GGAGTCCACGTTCTTT AAT AGTGGACTCTT GTTCC AAACTGGAACAAC AC T C A ACCCT AT CTCGGTCT ATT CTTTT GATTT AT A AGGGATTTT GCCGATTT CGCCCT ATT GGT T A AA A A AT GAGCT GATTT A ACA A A A ATTT A ACGCGA ATTTT A ACA A AAT ATT A ACGCTT AC

AC ATTC A AAT AT GT ATCCGCT C AT GAGAC A AT A ACCCTGAT A AAT GCTT C A AT AAT ATT GA A A A AGGA AGAGT AT GAGT ATTC A AC ATTT CCGT GT CGCCCTT ATTCCCTTTTTT GCGGC ATT TTGCCTTCCT GTTTTT GCTC ACCCAGAAACGCT GGTGAAAGT AAAAGAT GCT GAAGATCAG TTGG

secuencia de nucleótidos de CAR de 2213 (SEQ ID NO: 139)

AT CGCCCT GCCT GT GAC AGCCCT GCT GCT GCCT CT GGCTCT GCT GCT GC AT GCC GCT AGACCCGG ATCC A AC AT C AT GCT GACCC AGAGCCCT AGC ACCCT GGCCGT GT CT GCCGGCG AGA A AGT GACC AT GAGCT GC A AGAGC AGCC AGAGCGT GTT CTT C AGC AGCT CCC AGA AGA ACT ACCT GGCCT GGT AT C AGC AGATCCCCGGCC AGAGCCCC A AGCT GCT GAT CT ACT GGGC CAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTT CACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTAC CT GAGCAGCCGGACCTTT GGCGGAGGC ACC AAGCT GGAAATC AAGAGAGGCGGCGGAGGC TCAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCC GAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCA CC AGCT ACT AC AT CC ACT GGAT C A AGC AGACCCCT GGAC AGGGCCT GGA AT GGGT GGGAG T GATCT ACCCCGGC A ACGACGAC AT C AGCT AC A ACC AGA AGTT C A AGGGC A AGGCC ACCC T GACCGCCGAC AAGTCT AGCACCACCGCCT ACAT GCAGCTGTCCAGCCT GACC AGCGAGG ACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGC CGGCACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCT TGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGG AC ACCCT GAT GATC AGCCGGACCCCCGAGGT GACCT GT GT GGT GGT GGACGT GT CCC AGGA GGACCCCGAGGT CC AGTT C A ACT GGT ACGT GGACGGCGT GGAGGT GC AC A ACGCC A AGAC CAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTG C ACC AGGACT GGCT GA ACGGC A AGGA AT AC A AGT GT A AGGT GTCC A ACA AGGGCCT GCCC AGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTAC ACCCT GCCCCCT AGCC A AGAGGAGAT GACC A AGA ACC AGGT GT CCCT GACCT GCCT GGT G AAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGC T GACCGT GGACAAGAGCCGGT GGCAGGAGGGC AACGT CTTT AGCT GCTCCGTGAT GCACG AGGCCCT GC ACA ACC ACT AC ACCC AGA AGAGCCT GAGCCT GT CCCT GGGC A AGAT GAT CT ACATC

T GGGCGCCCTT GGCCGGGACTT GT GGGGT CCTT CTCCT GT C ACT GGTT ATC ACCCTT T ACT GC A A ACGGGGC AGA A AGA A ACT CCT GT AT AT ATTC A A AC A ACC ATTT AT GAGACC AG T AC AAACT ACTC AAGAGGAAGATGGCTGT AGCT GCCGATTTCCAGAAGAAGAAGA AGGAG GAT GT GA ACT GAGAGT GA AGTTC AGC AGGAGCGC AGACGCCCCCGCGT AC A AGC AGGGCC

AGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAA GGCCT GT AC A AT GA ACT GC AGA A AGAT A AGAT GGCGGAGGCCT AC AGT GAGATT GGGAT G AAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCC ACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

secuencia de aminoácidos de CAR de 2213 (SEQ ID NO: 140)

MALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQK NYFAWYQQIPGQSPKFFIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQSEDFAIYYCHQYFSSR TFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYY1H WIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDVW GAGTTYTV SSSGESKY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMIY IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELR VKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGFY QGFST ATKDTYDAFHMQAFPPR

secuencia de nucleótidos de scFv de 2213 (SEQ ID NO: 141)

AT GGCCCT GCCT GT GAC AGCCCT GCT GCT GCCT CT GGCTCT GCT GCT GC AT GCCGCT AGACCCGG ATCC A AC AT C AT GCT GACCC AGAGCCCT AGC AGCCT GGCC GT GT CT GCCGGCG AGA A AGT GACC AT GAGCTGC A AGAGC AGCC AGAGCGT GTT CTT C AGC AGCT CCC AGA AGA ACT ACCT GGCCT GGT AT C AGC AGATCCCCGGCC AGAGCCCC A AGCT GCT GAT CT ACT GGGC CAGC ACC AGAGAA AGCGGCGT GCCCGAT AGATTCACCGGC AGCGGCTCT GGCACCGACTT CACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTAC CT GAGCAGCCGGACCTTT GGCGGAGGC ACC AAGCT GGAAATC AAGAGAGGCGGCGGAGGC TCAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCC GAGGTCGT GA A ACCT GGCGCCTCT GT GA AGAT GT CCT GC A AGGCC AGC GGCT AC ACCTT C A CC AGCT ACT AC AT CC ACT GGAT C A AGC AGACCCCT GGAC AGGGCCT GGA AT GGGT GGGAG TGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCC T GACCGCCGAC AAGTCT AGCACCACCGCCT ACAT GCAGCTGTCCAGCCT GACC AGCGAGG ACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGC CGGC ACC ACCGT GACCGT GT C AT CT

secuencia de aminoácidos de scFv de 2213 (SEQ ID NO: 142) MALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQK NYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSR TFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYY1H WIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDVW GAGTTVTY SS

secuencia de nucleótidos de lgG4H anti-CD33 humanizada 2218 143)

CGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTT GCTGGCCTTTT GCT CAC AT GTTCTTTCCT GCGTT AT CCCCT GATT CT GT GGAT A ACCGT ATT ACCGCCTTT GAGT GAGCT GAT ACCGCT CGCCGC AGC CGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAA ACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGAC T GGA A AGCGGGC AGT GAGCGC A ACGC A ATT A AT GT GAGTT AGCT C ACT C ATT AGGC ACCCC AGGCTTT AC ACTTT AT GCTTCCGGCTC GT AT GTT GT GT GGA ATT GT GAGCGGAT A AC AATTT C AC AC AGG A A AC AGCT AT GACC AT GATT ACGCC A AGC GC GC A ATT A ACCCT C ACT A A AGG GA ACA A A AGCT GGAGCT GC A AGCTT A AT GT AGTCTT AT GC A AT ACT CTT GT AGT CTT GC A A C AT GGT A ACGAT GAGTT AGC A AC AT GCCTT AC A AGGAGAGA A A A AGC ACCGT GC AT GCCG ATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGAC AT GGATT GGACGA ACC ACT GA ATT GCCGC ATT GC AGAGAT ATT GT ATTT A AGT GCCT AGCT CGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAAC T AGGGA ACCC ACT GCTT A AGCCTC A AT A A AGCTT GCCTT GAGT GCTT C A AGT AGT GT GT GC CCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAA TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTC TCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGT

C AGT ATT A AGCGGGGGAGA ATT AGATCGCGAT GGGA A A A A ATT CGGTT A AGGCC AGGGGG A A AGA A A A A AT AT A A ATT A A A AC AT AT AGT AT GGGC A AGC AGGG AGCT AGA ACGATT CGC AGTT A AT CCT GGCCT GTT AGA A AC ATC AGA AGGCT GT AGAC A A AT ACT GGGAC AGCT ACA ACC ATCCCTTC AGAC AGGAT CAGA AGA ACTT AGATC ATT AT AT A AT AC AGT AGC A ACCCT C T ATT GT GT GC ATC A A AGGAT AGAGAT A A A AGAC ACC A AGGA AGCTTT AGAC A AGAT AGAG GAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGG AGGAGGAGAT AT GAGGGAC A ATT GGAGA AGT GA ATT AT AT A A AT AT A A AGT AGT A A A A AT T GA ACC ATT AGGAGT AGC ACCC ACC A AGGC A A AGAGA AGAGT GGT GC AGAGAGA A A A A A GAGC AGT GGGA AT AGGAGCTTT GTTCCTT GGGTT CTT GGGAGC AGC AGGA AGC ACT AT GGG

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my96 humanizado (L2H) lgG4H BBz NT (SEQ ID NO: 144) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCG GATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGA GCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGA

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my96 humanizado (L2H) lgG4H BBz AA (SEQ ID NO: 145)

M ALPVTALLLPLALLLHAARPGSEIVLTQSPGSLAVSPGERVTM SCKSSQSVFFSSSQKNYLAW YQQIPG Q SPR LLIYW ASTR ESG VPDR FTG SG SG TDFTLTISSVQPEDLAIYYCH Q YLSSRTFGQ G TKLE IKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYY1HWIKQTPGQGLEWVGVI YPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSSG ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

my96 humanizado (L2H) scFv nt (SEQ ID NO: 146) GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGA GCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGA TCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGAT TCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCA TCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAG GCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCG CCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCT ACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCA ACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCA CCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGC GGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCT

my96 humanizado (L2H) scFv AA (SEQ ID NO: 147)

E IVLTQSPGSLAVSPGERVTM SCKSSQ SVFFSSSQ KNYLAW YQ Q IPGQ SPRLLIYW ASTRESGV

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Ejemplo 4: Constructos CAR humanos

Para representar la expresión en la superficie celular de scFv en una línea de linfocitos T Jurkat, que contiene un indicador de luciferasa dirigido por un promotor regulado por NFAT (que se denominan células JNL), se transdujeron células JNL con un vector lentivírico que expresa un ADNc que codifica GFP, un scFv que se une a CD19 o ADNc que codifican un scFv, que se generó contra hsCD33 (Fig. 27). La expresión en la superficie celular de scFv individuales en las JNL se detectó mediante la incubación de las células con hsCD33 marcado con Fc recombinante seguida de la incubación con un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina. Se observó que los clones CD33-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -9 se unían a hsCD33 en niveles apreciables en relación con las células JNL que expresan GFP o un scFv que tiene como diana CD19, que servían de controles negativos para este ensayo. Se observó también que CD33-8 carecía de unión apreciable a ya sea hsCD33 o la proteína L (datos no mostrados), una proteína de la superficie bacteriana que se une a cadenas ligeras de inmunoglobulina. Los datos presentados en la presente demuestran que los clones CD33-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -9 codifican scFv que se unen a hsCD33.

Se evaluaron scFv individuales dirigidos a hsCD33 para determinar su capacidad de provocar actividad de NFAT en células JNL (Figura 28). Se cocultivaron células JNL que expresan scFv contra hsCD33 con líneas celulares MOLM13 o MOLP8, que expresan hsCD33 o carecen de expresión de hsCD33 en la superficie celular, respectivamente (Figura 28A; hsCD33, línea verde continua; control isotípico, línea gris discontinua y zona sombreada). La Figura 28B representa la activación de células JNL que expresan un scFv dirigido a hsCD33 en presencia de células MOLM13 (líneas continuas) o MOLP8 (líneas discontinuas). Se cultivaron en placas células JNL que expresan scFv individuales en relaciones diferentes de efectora (es decir, células JNL) respecto a diana (es decir, MOLM13 o MOLP8) y se analizaron para determinar la expresión de unidades de luciferasa relativas (RLU, por sus siglas en inglés) utilizando el ensayo de luciferasa Bright-G lo™ en el instrumento EnVision 24 horas después de la incubación. Se observó que que los clones de scFv CD33-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -9 y un scFv basado en la secuencia de Mylotarg, un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno CD33 humano (CD33-UPenn), fueron capaces de desencadenar actividad de luciferasa dependiente de NFAT, aunque en diferentes grados, en presencia de MOLM13 en relación con células MOLP8 o JNL que expresan GFP.

La actividad de scFv dirigidos a hsCD33 se evaluó además en linfocitos T primarios derivados de donantes (Figuras 29A y 29B). Se aislaron linfocitos T vírgenes a partir de PBMC de donantes sanos por selección negativa utilizando protocolos estándar y se activaron utilizando el kit Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28 de Invitrogen. 24 horas después de la estimulación, los linfocitos T se transdujeron con lentivirus que expresaban scFv individuales dirigidos a hsCD33 y se expandieron en cultivo durante 9 días más. Los cultivos de linfocitos T se analizaron para determinar su capacidad para experimentar expansión celular y provocar actividad citolítica de un modo dependiente del antígeno e independiente del antígeno. Se representa la expresión de scFv en la superficie celular de linfocitos T humanos primarios transducidos con un vector lentivírico que expresa un scFv que tiene como diana hsCD33 en las Figuras 29A y 29B. La expresión de scFv se detectó incubando células con hsCD33 marcado con Fc recombinante y un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina tal como se describe en la Figura 27. En consonancia con los hallazgos mencionados anteriormente en la Figura 27, los clones de scFv CD33-1, -2, -3, -4, -5, - 6, -7 y -9 expresados en linfocitos T primarios se unieron a hsCD33 en niveles apreciables en relación con linfocitos T que expresan GFP, que carecen de la capacidad para unirse a hsCD33. Por tanto, los clones de scFv CD33-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -9 se pueden utilizar para modificar linfocitos T primarios para dirigirlos al antígeno CD33 humano.

Se marcaron linfocitos T con CFSE y se cocultivaron en presencia de MOLM13 (Figura 30A, barra negra rellena), MOLP8 (Figura 30A, barra blanca vacía) o cultivados solos (Figura 30A, barra rayada) para evaluar la capacidad proliferativa de linfocitos T primarios UTD o células que expresan scFv dirigidos a hsCD33. Se observó que los linfocitos T que expresan los clones de scFv CD33-2, -3, -4, - 5, -6 y -9 eran capaces de expandirse de un modo dependiente del antígeno, tal como demuestra un aumento en el número absoluto de linfocitos T en presencia de células MOLM13 que expresan CD33 en comparación con células MOLP8 negativas para CD33 o UTD (Figura 30A). Además, se evaluó la división celular dirigida por antígeno en linfocitos T primarios midiendo la intensidad de fluorescencia mediana (MFI, por sus siglas en inglés) de linfocitos T marcados con c Fs E que expresan clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6, y -9 cocultivados con células MOLM13, MOLP8 o solos (Figura 30B). En consonancia con el incremento mencionado anteriormente en la expansión de linfocitos T (Figura 30A), se observó una disminución en los niveles de CFSE en linfocitos T cocultivados con MOLM13 en comparación con células MOLP8 o UTD (Figura 30B). Al seleccionar linfocitos T que eran bien scFv+ o scfv, se descubrió que los linfocitos T que expresan scFv tenían niveles de CFSE menores en relación con sus homólogos scFv- cuando se cocultivaban con MOLM13. Sin embargo, los niveles de CFSE eran similares entre linfocitos T scFv+ o scFv cocultivados en células MOLP8 (Figura 30B), lo cual es indicativo de una mayor proliferación en respuesta al reconocimiento del antígeno. Los resultados presentados en la presente también concuerdan con la capacidad de los clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6 y -9 de provocar la activación dependiente de scFv de células JNL en presencia de CD33 (Figura 28B).

Por tanto, los clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6 y -9 se pueden utilizar para activar la proliferación de linfocitos T primarios de un modo dependiente de CD33.

Adicionalmente, los linfocitos T CART-CD33 se evaluaron para determinar su capacidad de proliferar en respuesta a la exposición al antígeno en células diana. Las células diana incluían células PL-21, HL60 y Molp8. El día del ensayo (Día 0), se realizó un recuento de las células diana y se transfirieron a un tubo de 50ml en 6 mL de medio para linfocitos T a razón de 3e6 células/ml. Las células diana se irradiaron en hielo a 10 000 rad. Tras la irradiación, las células diana se lavaron dos veces en medio para linfocitos T, se realizó un recuento y se resuspendieron a razón de 5e5 células/ml en medio para linfocitos T en hielo. Los linfocitos T transducidos congelados se descongelaron, se lavaron en 10mL de medio para linfocitos T completo, se centrifugaron a 300g durante 10min y se resuspendieron cuidadosamente en 3mL de medio para linfocitos T completo a TA. A continuación se realizó un recuento de los linfocitos T en un citómetro Cellometer y se resuspendieron a razón de 2,5e6/mL en 10 mL de medio. En una placa de 96 pocillos con fondo en U, se combinaron 25 000 células diana irradiadas y 25000 linfocitos T CAR transducidos (relación de 1:1) en pocillos duplicados. En un pocillo separado, se añadieron 75 000 perlas anti-CD3/CD28 en 100pl de medio a 25 000 linfocitos T transducidos para crear una relación de 1:3 de células respecto a perlas como control positivo; en otro pocillo, se añadieron 100pl de medio a 25 000 linfocitos T transducidos solos como control de medio solo. Las células se incubaron durante 4 días a 37 °C, 5% de CO2. El día 4, se extrajeron células y los duplicados se combinaron pipeteando y transfiriéndolos al mismo pocillo en la placa con fondo en U para su tinción para FACS de CD4, CD8 y CAR utilizando la proteína L o proteína ^cD33 humana recombinante. Tras la tinción, las células se resuspendieron en 120pl de MACS+0,5% de tampón BSA y se añadieron 20pl/pocillo de perlas Countbright a cada pocillo. La proliferación se midió como el número de células positivas para FACS detectadas en el periodo de tiempo utilizado para el recuento de 2500 perlas (Figura 47). Los linfocitos T CART-CD33 evaluados (por ejemplo, derivados de los clones de scFv CD33-1, -2, -4, -5, -6, -7, -9 y My96 humanizado (denominados «Upenn») proliferaron en mayor grado que las células no transducidas o linfocitos T CART-CD19 al exponerlos a células diana HL-60. Los linfocitos T CART-CD33 (por ejemplo, derivados de los clones de scFv CD33-1, -2, -4, -5, -6, -7, -9 y My96 humanizado (denominados Upenn) proliferaron en mayor grado que las células no transducidas y en un grado aproximadamente igual o mayor que los linfocitos T CART-CD19 al exponerlos a células diana PL21. Los linfocitos T CART-CD33 proliferaron en aproximadamente el mismo grado o un grado ligeramente mayor que las células no transducidas o linfocitos T CART-CD19 al exponerlos a células MOLP8 que no expresan la diana CD33.

Para evaluar la actividad citolítica, se cultivaron en placas 25000 células MOLM13 con linfocitos T primarios que expresan scFv individuales en relaciones diferentes de efector (es decir, linfocito T) respecto a diana (es decir, MOLM13) y se analizaron para determinar el grado de muerte de MOLM13 enumerando el número absoluto de células MOLM13 marcadas con CFSE después de 4 días en cultivo (Figura 31). Se observó que los clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6 y -9 eran capaces de inducir la lisis de células diana, aunque en diferentes grados. Por tanto, los clones de scFv CD33-2, -3, -4, -5, -6 y -9 se pueden utilizar para modificar linfocitos T primarios para dirigirlos directamente a y provocar la muerte de células diana que expresan CD33.

La muerte por linfocitos T se dirigió a líneas celulares de leucemia mielógena aguda HL-60 y PL21 que expresan CD33 que expresan luciferasa de forma estable. Se utilizaron células U87 que no expresan CD33 como un control y se utilizaron linfocitos T no transducidos (UTD) para determinar los niveles de muerte de fondo inespecífica. Se midieron las actividades citolíticas de CART-CD33 como una valoración de relaciones de efector:célula diana de 10:1 y diluciones decrecientes con un factor de 2 de linfocitos T donde se definieron los efectores como linfocitos T que expresan el receptor quimérico anti-CD33. Los ensayos se iniciaron mezclando un número apropiado de linfocitos T con un número constante de células diana. Se midió la señal de la luciferasa después de 20 horas utilizando el ensayo de luciferasa Bright-Glo™ en el instrumento EnVision. Comparando estas curvas de muerte, la valoración de la cantidad de células efectoras muestra que se destruyeron aquellas células que expresan CD33 (Figuras 48A, 48B y 48C). Los linfocitos T del mismo donante que se transdujeron con cualquiera de las células CAR-CD33 portadoras de scFv humanos fueron capaces de provocar la muerte selectiva de dianas CD33+, aunque se observaron diferencias en la actividad que se podrían traducir en diferencias en la actividad clínica.

Se evaluaron células CART-CD33 para determinar su capacidad para producir citocina en respuesta al antígeno. Las células se descongelaron y se dejó que se recuperaran durante la noche. Se utilizaron linfocitos T no transducidos (UTD) como control inespecífico para los efectos de linfocitos T de fondo. Los linfocitos T fueron dirigidos a células HL-60, PL21 o MOLP8. El ensayo estudió una relación de efector:diana de 2,5:1 donde los efectores se definieron como linfocitos T que expresan el c A r anti-CD33. El ensayo se realizó 16 horas después de mezclar las células, cuando se retira el medio para el análisis de las citocinas IFN-gamma, TNF-alfa y IL-2 utilizando el kit CBA-Flex para la detección de citocinas humanas. Cuando los linfocitos T CART-CD33 se cultivaron con células cancerosas que expresan endógenamente CD33, todos los CART-CD33 produjeron citocinas en respuesta a células que expresan la diana (Figura 49). La diferencia en reactividad de los diferentes clones de CD33-CART hacia células diana con una expresión baja de CD33 se puede traducir en una mejor eficacia clínica de los linfocitos CART transducidos con estos constructos.

Por último, se evaluó la reactividad cruzada de scFv con CD33 de macaco (cyCD33) por citometría de flujo tal como se representa en la Figura 32. Se incubaron células JNL transducidas con un vector lentivírico que expresa scFv generados contra hsCD33 con ya sea hsCD33 marcado con Fc recombinante (línea roja) o cyCD33 (línea azul), tras lo cual se realizó una incubación con un anticuerpo secundario específico para Fc conjugado con ficoeritrina. Aunque los clones de scFv CD33-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -9 y CD33-UPenn fueron capaces de unirse a hsCD33, se observa que solamente el clon de scFv CD33-5 parecía presentar reactividad cruzada con tanto hsCD33 como cyCD33 (Figura 32).

Ejemplo 5: Caracterización de células CART33 electroporadas con ARN

Comparación de la expresión de CAR33 en linfocitos T transducidos lentivíricamente o electroporados con ARN

Un ARNm de CAR anti-CD33 que comprendía un scFv anti-CD33 humanizado y una bisagra de IgG4, por ejemplo, la SEQ ID NO: 145, se generó mediante transcripción in vitro. Se aislaron linfocitos T de un donante normal y se electroporaron con el ARNm de CAR33. Tras la electroporación, las células se estimularon con perlas CD3/CD28 y se expandieron en cultivo. Se midió y se cuantificó la expresión de CAR33 mediante citometría de flujo 8 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la electroporación (Fig. 33A). Los resultados de este experimento demuestran que la electroporación con ARN de CAR33 da como resultado la expresión de CAR33 en linfocitos T de donantes durante al menos 7 días. La expresión fue más alta (por ejemplo, mayor del 60%) hasta el día 4, inclusive, después de la electroporación (Fig. 33B). La expresión de CAR33 disminuyó a partir de los días 5-7 después de la electroporación.

La expresión de CAR33 debida a la electroporación con ARN se comparó con la expresión de CAR33 estable debida a la transducción lentivírica. Se transdujeron linfocitos T de donantes con un constructo lentivírico que comprende un CAR33, tal como el vector de la Figura 26, utilizando métodos estándar. Se midió la expresión de CAR33 mediante un análisis por citometría de flujo y se cuantificó por la intensidad de fluorescencia media (MFI). La expresión de CAR33 se evaluó 8 horas, 1 día, 2 días, 3 días y 4 días después de la electroporación o transducción para células CART33 transducidas lentivíricamente (Fig. 34A) y para células CART33 transfectadas con ARN (Fig. 34B). Los picos grises en el lado izquierdo de los histogramas de la Figura 34 representan la falta de expresión de CAR33, mientras que una mayor expresión de CAR33 aumenta hacia el lado derecho de las gráficas. La transducción lentivírica da como resultado una expresión estable de CAR33 en linfocitos T, donde el nivel de expresión de CAR33 permanece invariable de 8 horas a 4 días después de la transducción. En cambio, la electroporación con ARN da como resultado una expresión transitoria de CAR33 en linfocitos T. Específicamente, la expresión de CAR33 es más alta de 8 horas a 1 día después de la electroporación, y la expresión de CAR33 disminuye de 2 a 4 días después de la electroporación.

Actividad citotóxica in vitro

Para evaluar la actividad de muerte específica de células CART33 transducidas lentivíricamente y electroporadas con ARN, se incubaron células CART33 con células diana que expresan CD33, tales como la línea celular de leucemia mieloide aguda MOLM14, o células de control negativas para c D33, tales como la línea celular de linfoma de células del manto JEKO en diferentes relaciones de efector (células CART33) respecto a diana (células positivas o negativas para CD33) durante 24 horas. Las relaciones de efector respecto a diana variaban entre 0:1, 0,125:1, 0,25:1, 0,5:1, 1:1 y 2:1. El experimento se repitió en diferentes puntos temporales después de 1 día, 2 días, 3 días y 4 días tras la electroporación/transducción de los linfocitos T. Un día después de la electroporación, las células CART33 electroporadas con ARN presentaron muerte específica a partir de la relación de E:D de 0,125:1 (Fig. 35A). Se observó la muerte específica de células MOLM14 positivas para CAR33, 2 (Fig. 35B), 3 (Fig. 35C) y 4 (Fig. 35D) días después de la electroporación de las células CART33, sin embargo, las relaciones de E:D para la muerte específica aumentaron con el tiempo, lo cual indica la naturaleza transitoria de la muerte específica. Las células CART33 transducidas lentivíricamente presentaron una actividad de muerte específica potente los días de 1 a 4 incluso en las relaciones de E:D más bajas.

Cuando los resultados se presentaron de un modo diferente, con la actividad específica de una relación de E:D particular comparada entre los días 1 a 4 después de la electroporación, los datos muestran que la muerte específica de células CART33 electroporadas con ARN disminuía a lo largo del tiempo después de la electroporación cuando las relaciones de E:D eran de 2:1 (Fig. 36A) o 1:1 (Fig. 36B). Estos resultados demuestran la naturaleza transitoria de la muerte específica de células CART33 electroporadas con ARN. En cambio, las células CART33 transducidas lentivíricamente presentaron niveles estables de muerte específica de los días 1-4 después de la transducción.

Ejemplo 6: Los CART33 humanizados presentan actividad preclínica potente contra AML y MDS humanos

Se construyó un CAR de segunda generación a partir del scFv anti-CD33 de Gemtuzumab ozogamicina (un inmunoconjugado dirigido a CD33) con dominios de señalización de 4-1BB y CD3 zeta (descritos en el Ejemplo 3; y la SEQ ID NO: 145). Aquí, se describe la actividad preclínica del CAR33 de segunda generación, y se compara con el CAR desarrollado previamente dirigido a CD123 (CAR123). Los resultados muestran que CART33 fue capaz de erradicar células CD34+ de linfoma mieloide agudo y síndrome mielodisplásico humanos, al tiempo que provoca mielotoxicidad significativa en xenoinjertos de ratón. Por tanto, también se generaron CART33 modificados con ARNm expresados de forma transitoria para utilizarlos en estudios y ensayos clínicos futuros.

Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en este ejemplo:

Generación de linfocitos CART

El ADN plasmídico pTRPE anti-CD33-41BB-CD3 zeta (CAR33) se generó clonando las orientaciones de cadena ligera a pesada del scFv anti-CD33 humano humanizado derivado de gemtuzumab ozogamicina (clon my96) en el vector plasmídico CART19 murino descrito previamente. Se seleccionaron positivamente 25 linfocitos T de donantes normales a partir de packs de leucocitaféresis utilizando microperlas anti-CD4 y anti-CD8 (Miltenyi), mezcladas en una relación de 1:1 y expandidas in vitro utilizando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Invitrogen, añadidas el primer día del cultivo) con una dosis baja de IL-2. Los linfocitos T se transdujeron con sobrenadante lentivírico de linfocitos 293T transfectados con el plásmido pTRPE my96-CD33-41BB-CD3zeta el día después de la estimulación con una multiplicidad de infección (MDI) de 3. Las Dynabeads antiCD3/CD28 se eliminaron el día 6, y se expandieron los linfocitos T en cultivo en medio para linfocitos T (medio X-vivo 15, complementado con 5% de suero humano, penicilina, estreptomicina y glutamax) durante hasta 15 días y después se crioconservaron para experimentos futuros. Antes de todos los experimentos, los linfocitos T se descongelaron y se dejaron reposar durante una noche a 37 grados. La producción de linfocitos CART123 se describió previamente (Gill et al., 2014, Blood, 123:2343-54).

Células

La línea celular MOLM14 se obtuvo de la ATCC y se mantuvo en medio R10 (medio RPMI complementado con un 10% de suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina). Se utilizaron células MOLM14-luciferasa-GFP en algunos experimentos. Se obtuvieron muestras no identificadas de médula ósea de AML y MDS humanos primarios del Centro de Células Madre y Xenoinjertos de la Universidad de Pensilvania. Para todos los estudios funcionales, las células de AML se descongelaron al menos 12 horas antes del análisis y se dejaron reposar durante la noche a 37 grados. Se enriquecieron muestras de médula ósea de MDS en células CD34+ mediante selección positiva utilizando columnas MACSQuant (Miltenyi).

Análisis de citometría de flujo

Se compraron anticuerpos contra anticuerpos humanos de Biolegend, eBioscience o Becton Dickinson. Las células se aislaron a partir de un cultivo in vitro o a partir de animales, se lavaron una vez con PBS complementado con un 2% de suero bovino fetal, y se tiñeron en hielo después del bloqueo de receptores de Fc. Para la cuantificación del número de células, se utilizaron perlas Countbright de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). En todos los análisis, la población de interés se seleccionó en función de las características de dispersión frontal vs. lateral y después se realizó una selección en singletes, y las células vivas se seleccionaron utilizando Live Dead Aqua (Invitrogen). La expresión en la superficie de CAR anti-CD33 se detectó mediante tinción con un anticuerpo contra F(ab')2 de ratón producido en cabra conjugado con Alexa Fluor 647 de Jackson Immunoresearch. Se realizó citometría de flujo en un analizador Fortessa de cuatro láser (Becton-Dickinson).

Ensayos de función de linfocitos T

1. Ensayos de desaranulación de linfocitos T.

Se realizaron ensayos de desgranulación tal como se ha descrito previamente. Se incubaron 26 linfocitos T con células diana en una relación de 1:5. Se añadieron CD107a, CD28, CD49d y monensina en el momento de la incubación. Después de 4 horas, las células se extrajeron y se tiñeron para detectar la expresión de CAR, CD3 y tinción con Live Dead. Las células se fijaron y se permeabilizaron, y a continuación se realizó una tinción intracelular de citocinas.

2. Ensayos de proliferación:

Los linfocitos T se lavaron y se resuspendieron a razón de 1x107/ml en 100 ul de PBS y se tiñeron con 100 ul de CFSE 2,5pM (Life Technologies) durante 5 minutos a 37 Celsius. La reacción se desactivó entonces con R10 frío, y las células se lavaron tres veces. Las dianas se irradiaron con una dosis de 100 Gy. Los linfocitos T se incubaron en una relación de 1:1 con células diana irradiadas durante 120 horas. A continuación, las células se extrajeron, se tiñeron para detectar CD3, CAR y Live Dead aqua, y se añadieron perlas Countbright (Invitrogen) antes del análisis por citometría de flujo.

3. Ensayos de citotoxicidad:

Se utilizaron células MOLM14 luciferasa+ o muestras de AML primaria marcadas con CFSE para el ensayo de citotoxicidad tal como se ha descrito previamente (Cao et al., 2010, Cytometry A, 77:534-545). Resumiendo, las dianas se incubaron en las relaciones indicadas con linfocitos T efectores durante 4 o 16 horas. La muerte se calculó bien mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia en una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen o bien mediante citometría de flujo. Para esto última, las células se extrajeron, y se añadieron perlas Countbright y 7-AAD antes del análisis. Las células diana vivas residuales eran CFSE+ 7-AAD-. Para MDS, se incubaron linfocitos T con médula ósea enriquecida en CD34 en una relación de 1:1 durante 4 o 24 horas según se indique y a continuación se midió la citotoxicidad mediante citometría de flujo o por hibridación fluorescente in situ (utilizando una sonda para una anomalía cromosómica específica en la muestra de MDS).

4. Medidas de citocinas:

Las células efectoras y diana se incubaron en una relación de 1:1 en medio para linfocitos T durante 24 o 72 horas según se indique. El sobrenadante se extrajo y se analizó mediante una matriz 30-plex Luminex de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Experimentos in vivo

Ratones NOD-SCID-y cadena-/-(NSG) y NSG transgénicos para IL-3 humana, factor de células madre y GM-CSF (NSG-S) obtenidos originalmente de Jackson Labs. Todos los experimentos se realizaron conforme a protocolos autorizados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania. Los esquemas de los modelos de xenoinjerto utilizados se analizan en detalle en las figuras relevantes y la sección de los resultados. Las células (MOLM 14, células primarias o linfocitos T) se inyectaron en 200 pl de PBS en la concentración indicada en las venas de las colas de los ratones. La obtención de imágenes de bioluminiscencia se realizó utilizando una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen. Se crearon ratones con sistema inmunitario humanizado (HIS) mediante la inyección de células CD34+ de hígado fetal en ratones NSG recién nacidos y se utilizaron cuando tenían aproximadamente 8 semanas de edad.

Generación de CART33 modificados con ARNm

El constructo CAR del plásmido pTRPE anti-CD33-41BB-CD3z se subclonó en el vector pDA 28 según se publicó previamente. La transcripción in vitro se realizó utilizando un kit de transcripción mMESSAGE mMachine ®T7 ULTRA (Ambion). El ARN se purificó utilizando el minikit RNeasy (Qiagen). Se electroporó ARN-CAR33 en linfocitos T tal como se ha descrito previamente. La electroporación se realizó utilizando un ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX).

Histología e inmunohistoquímica

Se tiñeron cortes fijados en formalina e incluidos en parafina de fémur de ratón con hematoxilina y eosina, sometidos a contratinción con mAb para CD45 humano y CD34 humano, y adquiridos con un microscopio de Nikon.

RESULTADOS:

CD33 como una diana en AML y constructos CART33

Para verificar la relevancia clínica de CD33 como una diana para la inmunoterapia en AML, se evaluó primero el nivel de expresión de CD33 en AML y se comprobó que se expresaba en la mayoría de blastos de AML en casi todas las muestras de AML primaria (Figura 1) así como en las médulas óseas de pacientes con MDS (Figuras 2A, 2B y 2C). Para evaluar la potencial toxicidad colateral de CART33, se realizó un análisis inmunohistoquímico tisular de 30 tejidos normales teñidos con anticuerpo anti-CD33 (LSBio). Se expresó CD33 en linajes mieloides en la médula ósea y en macrófagos residentes en el hígado, pulmón y riñones (Figura 21). Para evaluar la eficacia de CAR33, se diseñaron cuatro constructos derivados del scFv humanizado y murino del clon my96 de Gemtuzumab Ozogamicina. Dos constructos utilizaron la bisagra de IgG4 y dos constructos utilizaron la bisagra de CD8 (Figura 3).

Los CART33 muestran actividad in vitro potente contra líneas celulares de AML, muestras de AML primara y MDS

La actividad de los cuatro constructos CART33 diferentes se evaluó in vitro y se comparó con la de CART123 (Gill et al., 2014, Blood, 123:2343-2354). El CART33 humanizado fue sistemáticamente superior al CART33 murino (remítase al Ejemplo 1) y, por lo tanto, todos los estudios posteriores se realizaron en los dos constructos CAR33 humanizados. Se empleó la línea celular MOLM14 como un tumor modelo (MOLM14 expresa CD33 y CD123). La incubación de CART33 con MOLM14 dio como resultado una desgranulación significativa (Figura 37A), citotoxicidad potente en relaciones bajas de efector:diana (Figura 37B), proliferación considerable (Figuras 37C y 37D) y producción de citocinas robusta (Figuras 38A, 38B, 38C y 39) que fue significativamente más alta que la incubación con la línea celular de leucemia de linfocitos T de control Jurkat. La mayoría de CART33 produjeron dos o más citocinas por célula después de la incubación con MOLM14, en un patrón similar a la estimulación inespecífica potente con PMA/Ionomicina (Figuras 38A y 38B). Esta función se ha asociado con una actividad in vivo superior (Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106:3360-3365). Además, las células CART33 produjeron más citocinas que las células CART123 (Figura 38C) y también dieron como resultado una actividad in vitro significativa frente a muestras de AML primaria. CART33 con bisagra de IgG4 provocó una mayor citotoxicidad en comparación con CART33 con bisagra de CD8 (Figuras 8, 9, 10 y 40).

También se examinó la actividad in vitro de CART33 en MDS. Se enriquecieron en CD34 muestras de médula ósea de pacientes con MDS (-85% de pureza) y después se incubaron con CART33, CART123 o linfocitos T de control no transducidos (UTD) en una relación de E:D de 1:5 durante 4 horas, en presencia de CD49d, coestimulación con CD28 y monensina. La desgranulación CD107a se midió a continuación mediante citometría de flujo y se cuantificó el porcentaje de desgranulación. La Figura 41B y 41C muestra la muerte específica del clon de MDS que tiene una deleción de 5q. Una muestra de médula ósea enriquecida en CD34 de un paciente con MDS y deleción de 5q se incubó con CART33, células UTD o sin tratamiento en una relación de E:D de 1:1 durante 4 horas. Posteriormente se extrajo una muestra y se realizó FISH para 5q-(Figura 41B). CART33 presentó actividad in vitro significativa en MDS. Prueba de ello fue la desgranulación específica de CART33 en respuesta a muestras de MDS enriquecidas en CD34 (Figura 41A), la muerte específica después de una incubación de 24 horas de CART33 con muestras de MDS enriquecidas en CD34 (relación de efector:diana de 1:1, Figura 24) y la reducción específica del clon maligno (medida por FISH) después de 4 horas de incubación (Figuras 41B y 41C).

Los resultados de los ensayos in vitro descritos anteriormente se resumen en la siguiente Tabla.

Tabla 5. Actividad in v itro de CART33, en com aración con CART123 linfocitos T no transducidos de control

Los CART33 provocan reducción de la carga de leucemia y ventajas de supervivencia en xenoinjertos prendidos de MOLM14

Para evaluar la actividad in vivo de CART33, se inyectó MOLM14 luciferasa+ en ratones NSG (Figura 11). Tras confirmar el prendimiento del injerto mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia, los ratones recibieron una única inyección de CART33 o linfocitos T no transducidos (UTD) de control en niveles de dosis diferentes. Los ratones se controlaron posteriormente con la obtención de imágenes en serie y la carga de la enfermedad se cuantificó utilizando bioluminiscencia. Los ratones tratados con linfocitos T de control sucumbieron rápidamente a la enfermedad, mientras que los ratones tratados con CART33 mostraron una reducción significativa de la enfermedad y una ventaja de supervivencia (Figura 42A, 42B y 42C). Además, se examinó la respuesta a la dosis en ratones tratados con CART33. Tal como se muestra en el esquema de la Figura 43A, se inyectó la línea celular de AML MOLM14 en una dosis de 1x106 i.v. en ratones NOD-SCID-supresión de la cadena gamma (NSG) y se obtuvieron imágenes del prendimiento del injerto después de 6 días. Los ratones se trataron con 5x106 de CART33, 2x106 de CART33, 1x106 de CART33 o 5x106 de linfocitos T no transducidos de control. Los ratones se controlaron obteniendo imágenes en serie semanalmente para evaluar la carga de AML. Se observó una respuesta dependiente de la dosis (Figuras 43A y 43B) en ratones tratados con CART33 y una actividad antileucémica superior de CART33 con la bisagra de IgG4 en comparación con la de CAR33 con la bisagra de CD8 (Figura 44). Para todos los experimentos posteriores, solamente se utilizaron CART33 con una bisagra de IgG4.

Los CART33 provocan erradicación de la leucemia en xenoinjertos de AML primaria y supervivencia sin enfermedad a largo plazo

Las células de leucemia primaria es probable que sean más heterogéneas clonalmente que las líneas celulares propagadas a largo plazo y son más representativas de la enfermedad humana. Por lo tanto, la eficacia de CART33 se evaluó en xenoinjertos de AML primaria. Se inyectaron muestras de AML primaria que expresaban CD33 y CD123 en ratones NSG-S. La carga de la enfermedad se cuantificó en la sangre periférica y mediante el análisis de la supervivencia (Figura 13). El prendimiento del injerto se definió como >1% de células huCD45+ circulantes y normalmente se consiguió 2-4 semanas después la inyección de células leucémicas. Estos ratones se trataron a continuación con una única inyección de CART33, CART123 o células UTD (1x105 a través de inyección en la vena de la cola). La leucemia se erradicó en menos de 4 semanas desde la inyección de CART33 o CART123 (Figuras 14 y 15), y se demostró la supervivencia sin enfermedad a largo plazo (Figura 16).

Los CART33 provocan la toxicidad esperada en células madre hematopoyéticas y progenitoras mieloides

Dado que se sabe que CD33 se expresa en progenitoras mieloides, aunque en niveles menores en comparación con células leucémicas, se investigó el impacto de CART33 en la hematopoyesis normal. Se utilizaron dos modelos diferentes para evaluar la toxicidad hematopoyética de CART33. Se extrajo sangre de ratones con sistema inmunitario humanizado (HIS) implantados posnatalmente con células CD34+ fetales humanas para confirmar el prendimiento del injerto y a continuación se trataron con CART33, CART123 o linfocitos T no transducidos (Figura 17). Se extrajo sangre de los ratones semanalmente durante 4 semanas. Los ratones se sacrificaron posteriormente, y se extirparon la médula ósea y el bazo de estos ratones para su análisis. Como cabe esperar basándose en la expresión de CD33 en el linaje mieloide, estos ratones desarrollaron una reducción en las células mieloides de sangre periférica que incluían monocitos en comparación con ratones tratados con linfocitos T no transducidos (Figura 22). El análisis de la médula ósea 4 semanas después del tratamiento mostró una reducción de las células madre hematopoyéticas CD34+CD38- y las progenitoras mieloides CD34+CD38+ por citometría de flujo (Figura 20) o inmunohistoquímica (Figura 21). El modelo HIS está sesgado hacia el linaje de linfocitos B y así que se empleó un segundo modelo con un sesgo más mieloide. En este, la médula ósea de donantes adultos normales se depletó de linfocitos T y se inyectó en ratones NSG-S acondicionados con busulfán. Se generaron CART33, CART123 o UTD autólogos mediante la transducción de linfocitos T de la sangre periférica del donante de médula con el lentivirus relevante. Tras confirmar el prendimiento del injerto de estos ratones, se trataron con CART33, CART123 o UTD autólogos y se controlaron con extracciones de sangre retroorbitales semanalmente durante un total de 4 semanas (Figura 22). Posteriormente los ratones se sacrificaron, y sus tejidos se extirparon y se analizaron. De forma similar a los xenoinjertos HIS, se observa una reducción en las células mieloides y monocitos de sangre periférica y en los compartimentos medulares CD34+.

Los CART33 «biodegradables» modificados con ARN transitorios provocan actividad antileucémica potente pero transitoria

Dado que CD33 se expresa en células hematopoyéticas normales y macrófagos residentes en tejido (Figuras 1 y 2), es importante validar un mecanismo de seguridad antes de la aplicación clínica. Por lo tanto, se desarrolló CART33 modificado con ARN. La electroporación de linfocitos T con CAR-33 modificado con ARN dio como resultado un alto nivel de expresión de CAR que disminuía gradualmente en siete días (Figuras 33A, 33B, y 34, y tal como se describe en el Ejemplo 9). Cuando se compara con CART33 transducido lentivíricamente (LV-CART33), el CART33 modificado con ARN tiene actividad in-vitro similar, pero transitoria. La incubación de MOLM14 con ARN-CART33 provocó citotoxicidad específica comparable a LV-CART33 en relaciones de E:D de 1:1 y 2:1, y que disminuía con el tiempo después de la electroporación (Figura 35, y tal como se describe en el Ejemplo 9).

Se evaluó la combinación de ARN-CART33 con quimioterapia in vivo. Se trataron ratones NSG implantados con MOLM14 con ya sea la combinación de tres dosis de ciclofosfamida (60 mg/kg I.P) junto con ARN-CART33 o ciclofosfamida junto con UTD. Se administraron 10x106 linfocitos T IV en tres dosis (Figura 45). Específicamente, se inyectó MOLM14-luc (1x106 I.V) en ratones NSG y se obtuvieron imágenes para confirmar el prendimiento del injerto cuatro días después. A continuación los ratones se distribuyeron aleatoriamente para recibir ARN-CART33 con ciclofosfamida o linfocitos T no transducidos con ciclofosfamida (60 mg/kg I.P). Los linfocitos T se administraron en una dosis de 10x106 I.V. en tres dosis diferentes, los días 5,9,16. Se administró ciclofosfamida los días 8 y 14. La combinación de ciclofosfamida y CART33 modificado con ARN ofreció un mejor control de la leucemia en comparación con los ratones de control.

DISCUSIÓN

En este ejemplo, se detectó la seguridad y la actividad preclínicas de CART33 en AML, y se desarrolló CART33 expresado de forma transitoria y se validó como un modo de evitar la toxicidad cuando se utilizaba en pacientes con AML refractaria. Este es el primer informe preclínico exhaustivo de la actividad de CART33 que incluye datos de toxicidad y supervivencia detallados que incorporan múltiples modelos en ratones así como la actividad antileucémica de CART33 modificado con ARN. Los CART33 presentaron funciones efectoras potentes contra muestras de AML primaria y línea celular de AML, que incluyen la muerte específica en relaciones bajas de E:D, desgranulación, proliferación elevada y producción de citocinas robusta, y también fueron activos en la reducción de un clon de MDS después de solamente 4 horas de incubación en una relación de 1:1.

El tratamiento con CART33 también dio como resultado la erradicación de AML y ventajas de supervivencia en xenoinjertos de tanto MOLM14 como AML primaria después de una única infusión. Se observó la toxicidad hematopoyética mieloide esperada con CART33 en dos modelos de ratón humanizados diferentes. Debido a la potencial mielotoxicidad y problemas para la expresión de CD33 en macrófagos residentes en tejido, se desarrolló un CART33 modificado con ARN y se presentó actividad in vitro potente, pero transitoria. También se demostró un efecto antileucémico al combinar ARN-CART33 y quimioterapia.

Los experimentos descritos en la presente y en el Ejemplo 1 también mostraron que el uso de una bisagra de IgG4 fue superior al uso de una bisagra de CD8 en CART33. La molécula de IgG4 es significativamente diferente de la molécula de CD8. Contiene tres veces más aminoácidos lo cual podría dar lugar a una bisagra más flexible.

Cabe esperar la toxicidad hematopoyética y la reducción en las progenitoras mieloides así como la citopenia en sangre periférica observada con CART33 en estos estudios preclínicos basándose en la expresión de CD33 en progenitoras leucémicas así como mieloides.

El potencial de toxicidad colateral con el uso de CART33 requiere la incorporación de terapia con anti-CD33 expresados de forma transitoria, en lugar de permanente, en ensayos clínicos. Los CAR modificados con ARN se han utilizado en modelos preclínicos (Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther, 24:717-727; y Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586), y un ensayo de fase I de linfocitos T CAR anti-mesotelina modificados con ARN en pacientes con tumores sólidos ha mostrado que esta estrategia es segura y viable (Beatty et al., 2014, Cáncer Immunol Res, 2:112-120). Por ende, se desarrolló CART33 modificado con ARN como un modo para que los CAR «biodegradables» expresados de forma transitoria mitiguen la posible toxicidad colateral de CART33.

Dado que unos ensayos clínicos más amplios recientes mostraron ventajas de supervivencia cuando GO se combinó con quimioterapia en enfermedad de riesgo bajo e intermedio (Hills et al., 2014, Lancet Oncol., 15:986-996), se evaluó la eficacia de la combinación de múltiples infusiones de CART33 modificado con ARN con quimioterapia en xenoinjertos de AML en ratón (Figura 45). Esta combinación generó respuestas más pronunciadas y prolongadas y ventajas de supervivencia para estos ratones.

Estas observaciones evidencian varias aplicaciones traduccionales potenciales para CART33 modificado con ARN. Se puede utilizar solo o en combinación con quimioterapia en pacientes con AML refractaria recurrente que no pueden someterse a trasplante de células madre alogénicas para convertirlos en idóneos. Además, se pueden incorporar CART33 modificados con ARN en pautas de acondicionamiento antes del trasplante de células madre alogénicas. Una vez que se han demostrado la seguridad y la vialidad de esta estrategia en pacientes, las estrategias futuras podrían incluir CART33 lentivírico con un interruptor de «apagado». Además, estos descubrimientos de que tanto CART33 como

CART123 son eficaces contra AML abren nuevos horizontes terapéuticos en la terapia celular dirigida combinatoria.

Ejemplo 7: Uso de terapia con linfocitos T con receptor antigénico quimérico contra células supresoras de origen mieloide (MDSC) en el cáncer

Los datos recientes muestran que el medio de médula con síndrome mielodisplásico (MDS) contiene una población de células supresoras de origen mieloide (MDSC) que expresan CD33 que desempeñan un papel importante en la patogénesis de MDS al secretar citocinas que fomentan la hematopoyesis inefectiva así como inmunosupresión (Chen et al. J. Clin. Investig. 23(2013): 21-223). Chen et al. Describió que MDSC desempeñan un papel en la inducción de mielodisplasia por una interacción CD33-S100A9. Este ejemplo describe experimentos para determinar si se puede actuar sobre MDSC utilizando terapia con linfocitos T CAR anti-CD33. Los resultados descritos en la presente muestran que se puede actuar sobre tanto los clones de MDS anómalos como su población de MDSC complementaria de forma simultánea con un único producto de tipo linfocito T CAR anti-CD33.

Las MDSC se fenotiparon en 4 muestras de médula con MDS y 3 de médula normal (Figuras 50A, 50B y 50C). Para el fenotipado, se realizó citometría de flujo utilizando la siguiente estrategia de selección: Las MDSC se definieron como células negativas para marcadores de linaje (LIN-), negativas para HLA-DR y positivas para CD33 en muestras de médula ósea con MDS (Figura 50A). Las MDSC eran más abundantes en la médula ósea displásica (MDS-BM) en comparación con la médula ósea normal (ND-BM) (Figura 50B). Además, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CD33 en la población de MDSC era comparable a la MFI de CD33 en la población de MDS maligno y era significativamente más alta que la MFI de CD33 en la población huCD45+LIN- de ND-BM (Figura 50C). Por tanto, la expresión de CD33 en MDSC era comparable a su expresión en la población de MDS maligno y era significativamente más alta que su expresión en médulas óseas normales. La capacidad de CART33 para organizar una respuesta a blastos de MDS y a MDSC de médula con MDS se evaluó cuantificando el grado de desgranulación CD107a y la producción de citocinas de células CART33. Se incubaron CART33 durante cuatro horas con control negativo (células Jurkat), controles positivos (PMA e ionomicina), CD34+ de MDS seleccionadas o MDSC seleccionadas de médula con MDS. Utilizando el el constructo CAR33-UPenn (derivado del scFv anti-CD33 de gemtuzumab ozogamicina), se descubrió que las células CD34 y MDSC de MDS inducían respuestas por lo general equivalentes en CART33 (Figuras 51A y 51B). Estos resultados indican que CART-33 con afinidad menor pueden tener actividad diferencial contra MDSC.

Las MDSC también desempeñan un papel en la resistencia al ataque inmunitario de muchas otras neoplasias malignas, que incluyen la leucemia linfocítica crónica (CLL) (donde se conocen como células de tipo nodriza), así como neoplasias malignas sólidas tales como cáncer de ovario, mama y colon (Di Mitri et al., Nature 515.7525(2014):134-137; ; Gabrilovich et al., Nat. Reviews Immunol. 12.4(2012):253-68; y Kim et al., Proc. Acad. Sci. U.S.A. 111.32(2014): 1-6). Estos resultados demuestran que se puede actuar sobre MDSC con CART33 ya sea en solitario o en combinación con otras inmunoterapias.

Ejemplo 8: Una dosis baja de RAD001 estimula la proliferación de CART en un modelo de cultivo celular

Se evaluó el efecto de dosis bajas de RAD001 en la proliferación de linfocitos T CAR in vitro cocultivando células que expresan CART con células diana en presencia de diferentes concentraciones de RAD001.

Materiales y métodos

Generación de linfocitos T transducidos con CAR

Se utilizó un vector de transferencia lentivírico CAR anti-CD19 humano (huCART19) humanizado para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivíricas pseudotipadas VSVg. La secuencia de aminoácidos y nucleótidos del CAR anti-CD19 humanizado (huCART19) humanizado es CAR 1, ID 104875 que se describe en la publicación de PCT, WO2014/153270, presentada el 15 de marzo de 2014, y se designa SEQ ID NOs. 85 y 31 en ella.

El ADN del vector de transferencia lentivírico se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg env, gag/pol y rev en combinación con el reactivo de Lipofectamine para transfectar células Lenti-X 293T. El medio se cambia tras 24 h y 30 h después, el medio que contiene virus se recoge, se filtra y se almacena a -80 °C. Los CART se generan mediante transducción de linfocitos T vírgenes frescos o congelados obtenidos mediante selección magnética negativa de sangre de donantes sanos o leukopak. Los linfocitos T se activan por incubación con perlas anti-CD3/anti-CD28 durante 24 h, tras lo cual se añade sobrenadante vírico o virus concentrado (MOI = 2 o 10, respectivamente) a los cultivos. Se permite que los linfocitos T modificados se expandan durante aproximadamente 10 días. El porcentaje de células transducidas (que expresan CAR en la superficie celular) y el nivel de expresión de CAR (intensidad de fluorescencia relativa, Geo Mean) se determinan mediante análisis por citometría de flujo entre los días 7 y 9. La combinación de la ralentización del ritmo de crecimiento y un tamaño de linfocitos T próximo a -350 fL determina el estado para que los linfocitos T se crioconserven para su análisis posterior.

Evaluación de la p ro life ración de CART

Para evaluar la funcionalidad de los CART, los linfocitos T se descongelan y se cuentan y la viabilidad se evalúa mediante Cellometer. El número de células positivas para CAR en cada cultivo se normaliza utilizando linfocitos T no transducidos (UTD). Se estudió el impacto de RAD001 en CART en valoraciones con RAD001, comenzando con 50 nM. La línea celular diana utilizada en todos los experimentos de cocultivo es Nalm-6, una línea celular de leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linfocitos pre-B humana que expresa CD19 y transducida para expresar luciferasa.

Para medir la proliferación de CART, los linfocitos T se cultivan con células diana en una relación de 1:1. El ensayo se desarrolla durante 4 días, momento en que las células se tiñen para detectar la expresión de CD3, CD4, CD8 y CAR. Se evalúa el número de linfocitos T mediante citometría de flujo contando las perlas como referencia.

R esultados

Se estudió la capacidad proliferativa de linfocitos CART en un ensayo de cocultivo de 4 días. Se evaluó el número de linfocitos T positivos para CAR y positivos para CD3 (barras oscuras) y linfocitos T positivos para CD3 totales (barras claras) después de cultivar los linfocitos T transducidos con CAR y no transducidos con Nalm-6 (Fig. 54). Los linfocitos huCART19 se expandieron cuando se cultivaron en presencia de menos de 0,016 nM de RAD001, y en menor grado a concentraciones más elevadas del compuesto. De manera importante, tanto a 0,0032 como 0,016 nM de RAD001 la proliferación fue mayor que la observada sin la adición de RAD001. Los linfocitos T no transducidos (UTD) no mostraron una expansión detectable.

Ejemplo 9: Una dosis baja de RAD001 estimula la expansión de CART in vivo

Este ejemplo evalúa la capacidad de los linfocitos huCAR19 para proliferar ^{i n v i v o}con diferentes concentraciones de RAD001.

M ateriales y m étodos:

^{C é l u l a s N A L M 6 - l u c :}Se desarrolló la línea celular de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana NALM6 a partir de sangre periférica de un paciente con ALL recurrente. Las células se marcaron a continuación con luciferasa de luciérnaga. Estas células en suspensión se cultivaron en RPMI complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente.

^{R a t o n e s :}Se recibieron ratones NSG ^{( N O D . C g - P r k d c scidI l 2 r g tm1wJl/ S z J )}de 6 semanas de edad de Jackson Laboratory (número de lote 005557).

^{I m p l a n t e d e l t u m o r :}Las células NALM6-luc se cultivaron y expandieron ^{i n v i t r o}en RPMI complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado. Las células se transfirieron a continuación a un tubo cónico de 15 mL y se lavaron dos veces con PBS estéril frío. A continuación, se contaron las células NALM6-luc y se resuspendieron con una concentración de 10x106 células por mililitro de PBS. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente (en una hora o menos) en los ratones. Las células NALM6-luc se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola en un volumen de 100 pL, para conseguir un total de 1x106 células por ratón.

^{D o s i f i c a c i ó n d e l i n f o c i t o s T C A R :}Se administraron a los ratones 5x106 linfocitos T CAR 7 días después de implantar el tumor. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y a continuación se descongelaron completamente añadiendo 1 mL de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL y el volumen final se ajustó a 10 mL con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1000 rpm durante 10 minutos cada vez y a continuación, se contaron en un hemocitómetro. Los linfocitos T se resuspendieron a continuación con una concentración de 50x106 linfocitos T CAR por mL de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se administraron las dosis a los ratones. A los ratones se le inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola 100 |jl de los linfocitos T CAR para conseguir una dosis de 5x106 linfocitos T CAR por ratón. Se trataron ocho ratones por grupo con 100 jL de PBS solo (PBS) o linfocitos T CAR CD19 humanizados.

^{D o s i f i c a c i ó n d e R A D 0 0 1 :}Se formuló una microemulsión concentrada de 50 mg equivalente a 1 mg de RAD001 y a continuación se resuspendió en D5W (dextrosa al 5% en agua) en el momento de la dosificación. A los ratones se les administraron las dosis por vía oral a diario (vía oral forzada) con 200 jL de las dosis deseadas de RAD001.

^{A n á l i s i s P K :}A los ratones se les administraron las dosis de RAD001 a diario comenzando 7 días después del implante del tumor. Los grupos de dosificación fueron de la siguiente manera: 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg. Se extrajo sangre de los ratones en los días 0 y 14 tras la primera y última dosis de RAD001, en los siguientes puntos temporales para el análisis PK: 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas.

R esultados:

Se estudió la expansión y farmacocinética de RAD001 en ratones NSG con tumores NALM6-luc. La dosificación oral diaria de RAD001 solo no tuvo un impacto en el crecimiento de los tumores NALM6-luc (Figura 55). El análisis farmacocinético de RAD001 mostró que es bastante estable en la sangre de los ratones que portan el tumor (Figura 56A y 56B). Tanto el día 0 como el día 14 los análisis PK muestran que las concentraciones de RAD001 en la muestra son superiores a 10 nM incluso 24 horas después de la dosificación con la dosis más baja estudiada (0,3 mg/kg).

Basándose en estas dosis, se administraron dosis de los linfocitos T CAR huCAR19 con y sin RAD001 para determinar la capacidad proliferativa de estas células. La dosis más elevada utilizada fue de 3 mg/kg basada en los niveles de RAD001 en la sangre 24 horas después de la dosificación. Como la concentración de RAD001 fue superior a 10 nM 24 horas después de la dosis final de RAD001, se utilizaron varias dosis más bajas de RAD001 en el estudio ^{i n v i v o}con los linfocitos T CAR. Se administraron dosis de los linfocitos T CAR IV un día antes de comenzar la dosificación oral diaria de RAD001. Se monitorizaron los ratones mediante FACS para determinar la expansión de linfocitos T.

Las dosis más bajas de RAD001 muestran una proliferación potenciada de los linfocitos T CAR (Figura 57). Esta proliferación potenciada es más evidente y prolongada con linfocitos T CAR CD4+ que con los linfocitos T CAR CD8+. Sin embargo, con los linfocitos T CAR CD8+, la proliferación potenciada se puede observar en puntos temporales tempranos tras la dosis con linfocitos T CAR.

Ejemplo 10: Actividad antitumoral de linfocitos T transducidos con CAR CD33 in vivo

HL-60 es una línea celular de leucemia promielocítica aguda humana aislada a partir de la sangre periférica de una paciente caucásica de 36 años con AML, y se puede hacer crecer como un xenoinjerto en ratones inmunodeprimidos. Este xenoinjerto simula enfermedad en la médula ósea tal como se observa en los seres humanos, constituyendo un modelo con el que evaluar la eficacia de terapias sobre AML en el hueso. Estos ratones se pueden utilizar para evaluar la eficacia de linfocitos T con receptor antigénico quimérico (CAR) específicos para marcadores celulares presentes en células de leucemia mieloide (o promielocítica) aguda, tales como CD33 (Siglec-3).

Las células HL-60 se marcaron con un gen indicador de la luciferasa de luciérnaga y se utilizaron en un modelo ortotópico de leucemia mieloide aguda (AML) en ratones ^{N O D . C g - P r k d c scidI l 2 r g tm1Wjl/ S z J}(NSG) para evaluar la eficacia de linfocitos T CAR específicos para CD33.

Se evaluó la expresión de CD33 en células HL-60, y estas células se utilizaron en ensayos ^{i n v i t r o}para examinar la capacidad de linfocitos T CAR específicos para CD33 de reconocer y responder a la diana. Las células HL-60 ^{i n v i v o}crecieron cuando se implantaron por vía intravenosa en la vena de la cola, y el crecimiento se limitó principalmente a la médula ósea. Una semana después de que se implantaran las células tumorales, la enfermedad se había trasladado por completo a los huesos y comenzó a crecer a un ritmo exponencial. En ausencia de tratamiento, los ratones comenzarían a presentar síntomas clínicos y parálisis de las patas de atrás 4-6 semanas después del implante del tumor. Se estudiaron varios clones de scFv CD33 de una criba ^{i n v i t r o}en este modelo ^{i n v iv o .}

Materiales y métodos:

^{L í n e a c e l u l a r H L - 6 0 :}La línea celular de AML humana HL-60 se desarrolló a partir de la sangre periférica de un paciente con leucemia promielocítica aguda. Las células se marcaron a continuación con luciferasa de luciérnaga. Estas células en suspensión crecen en RPMI complementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado térmicamente.

^{I m p l a n t e d e l t u m o r :}Las células HL-60-luc se cultivaron y expandieron ^{i n v i t r o}en RPMI complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado. Las células se transfirieron a continuación a un tubo cónico de 50 mL y se lavaron dos veces con PBS estéril frío. A continuación, se contaron las células HL-60-luc y se resuspendieron con una concentración de 10x106 células por mililitro de PBS. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente (en una hora o menos) en los ratones. Las células HL-60-luc se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola en un volumen de 100 pL, para conseguir un total de 1x106 células por ratón.

Dosificación de linfocitos T CAR: Se administraron a los ratones 5x106 linfocitos T CAR+ 14 días después de implantar el tumor. Las células implantadas crecían lentamente en los ratones; en 14 días habían comenzado a aumentar el ritmo de crecimiento tumoral. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y a continuación se descongelaron completamente añadiendo 1 mL de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL y el volumen final se ajustó a 10 mL con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1000 rpm durante 10 minutos cada vez y a continuación, se contaron en un hemocitómetro. Los linfocitos T CAR se normalizaron para la transducción de CAR de modo que cada grupo tiene el mismo porcentaje de linfocitos T CAR+. Los 5x106 linfocitos T CAR+ se resuspendieron a continuación en una concentración de 50x106 linfocitos T CAR+ por ml de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se administraron las dosis a los ratones. A los ratones se le inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola 100 pL de los linfocitos T CAR para conseguir una dosis de 5x106 linfocitos T CAR+ por ratón.

Se trataron ocho ratones por grupo con ya sea 100 pl de PBS solo (PBS), linfocitos T de control CAR-CD19 (CD19), linfocitos T CAR CD33-1 (clon 1), linfocitos T CAR CD33-2 (clon 2), linfocitos T CAR CD33-4 (clone 4), linfocitos T Ca R CD33-5 (clon 5), linfocitos T Ca R CD33-6 (clon 6), linfocitos T Ca R CD33-7 (clon 7) y linfocitos T Ca R CD33-9 (clon 9). Los linfocitos T se prepararon todos a partir del mismo donante humano en paralelo.

Control de los animales: Se realizó un seguimiento del estado de salud de los ratones a diario, que incluía mediciones del peso corporal dos veces por semana. El porcentaje de cambio en el peso corporal se calculó como (BWactual -BWinicial)/(BWinicial) x 100%. La carga tumoral se controló dos veces por semana mediante la obtención de imágenes de bioluminiscencia. Se inyectó D-luciferina en los ratones por vía intraperitoneal 10 minutos antes de anestesiarlos y obtener imágenes de los ratones con un Xenogen. La carga de la enfermedad se calculó calculando la bioluminiscencia de las células tumorales (fotones/segundo).

Resultados:

La actividad antitumoral de los sietes CAR CD33 se evaluó y se comparó directamente frente a linfocitos T CAR dirigidos a CD19 en el modelo HL-60 de leucemia mielógena aguda (AML) humana. Tras el implante del tumor el día 0, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se trataron con 5x106 linfocitos T CAR+ por vía intravenosa el día 7. La carga de la enfermedad AML y la salud de los animales se controlaron hasta que los animales alcanzaron el punto final. Los ratones en los grupos de linfocitos T CAR CD19 y PBS de control se sacrificaron el día 22 después de la dosificación de linfocitos T CAR (29 días después del implante del tumor) cuando la carga de la enfermedad en los grupos de control se aproximaba a la luminiscencia máxima a través de la obtención de imágenes. Los ratones en los grupos tratados con linfocitos T CAR CD33-1, CD33-2, CD33-7 y CD33-9 se sacrificaron el día 29 después de la dosificación de linfocitos T CAR (36 días después del implante del tumor) cuando la carga de la enfermedad en estos grupos había alcanzado la luminiscencia con la cual los grupos de control se sacrificaron. Los ratones en los grupos tratados con linfocitos T CAR CD33-4, CD33-5 y CD33-6 mostraron una disminución tardía en la carga de la enfermedad.

El resultado de la obtención de imágenes de bioluminiscencia de este estudio se muestra en la Figura 58. La bioluminiscencia media (+/- SEM) de las células tumorales mostró carga de la enfermedad en todo el animal. Esta se mostró como fotones/segundo (f/s) de la ROI (siglas en inglés de región de interés), que era el ratón entero. El grupo de tratamiento con PBS, que no recibió ningún linfocito T, demostró la cinética de crecimiento tumora1HL-60 basal en ratones NSG implantados por vía intravenosa. El grupo de tratamiento con CD19 recibió linfocitos T CAR de control, no específicos para células HL-60, que experimentaron el mismo proceso de expansión in vitro que los linfocitos T CAR CD33. Estas células sirvieron como un control de los linfocitos T para mostrar la respuesta inespecífica de los linfocitos T en este modelo tumoral. Tanto los grupos de tratamiento con PBS como con linfocitos T CAR CD19 demostraron un avance tumoral continuo a lo largo de todo el experimento. Todos los linfocitos T CAR CD33 retrasaron el avance de la enfermedad después de las inyecciones con 5x106 linfocitos T CAR, aunque apareció una separación de los clones en dos grupos con una respuesta diferencial.

La actividad antitumoral de linfocitos T transducidos con CAR CD33 se evaluó en este estudio de eficacia en ratones NSG portadores de un modelo de xenoinjerto de AML humana. Estos estudios muestran que el modelo HL-60-luc recapituló la AML humana en el ratón NSG y fue capaz de ser la diana de linfocitos T CAR CD33 (Figura 58). El crecimiento del xenoinjerto de HL-60-luc de AML humana en ratones NSG después de su tratamiento con linfocitos T CAR específicos para CD33 demuestra un retraso en el avance de la enfermedad (Figura 58). Este estudio demostró que siete c A r CD33 fueron capaces de organizar una respuesta antitumoral en un modelo de xenoinjerto de AML (Figura 58).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR) que se une específicamente a CD33, donde el CAR comprende un dominio de unión a CD33 humano, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC), una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde:

(a) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 93, 102, 111, 120 y 129, respectivamente;

(b) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 269, 278, 287, 296, 305 y 314, respectivamente;

(c) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 323, 332, 341, 350, 359 y 368, respectivamente;

(d) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 85, 94, 103, 112, 121 y 130, respectivamente;

(e) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 270, 279, 288, 297, 306 y 315, respectivamente;

(f) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 324, 333, 342, 351, 360 y 369, respectivamente;

(g) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 87, 96, 105, 114, 123 y 132, respectivamente;

(h) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 272, 281, 290, 299, 308 y 317, respectivamente;

(i) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 326, 335, 344, 353, 362 y 371, respectivamente;

(j) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 88, 97, 106, 115, 124 y 133, respectivamente;

(k) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 273, 282, 291, 300, 309 y 318, respectivamente;

(l) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 327, 336, 345, 354, 363 y 372, respectivamente;

(m) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 89, 98, 107, 116, 125 y 134, respectivamente;

(n) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 274, 283, 292, 301, 310 y 319, respectivamente;

(o) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 328, 337, 346, 355, 364 y 373, respectivamente;

(p) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 90, 99, 108, 117, 126 y 135, respectivamente;

(q) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275, 284, 293, 302, 311 y 320, respectivamente;

(r) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 329, 338, 347, 356, 365 y 374, respectivamente;

(s) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 92, 101, 110, 119, 128 y 137, respectivamente;

(t) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 277, 286, 295, 304, 313 y 322, respectivamente; o

(u) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 331, 340, 349, 358, 367 y 376, respectivamente.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que codifica un CAR que comprende:

(a)

(i) la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 66, 67, 69, 70, 71, 72 o 74; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 66, 67, 69, 70, 71, 72 o 74; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 66, 67, 69, 70, 71, 72 o 74; y/o

(b)

(i) la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61,62, 63 o 65; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 62, 63 o 65; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 62, 63 o 65.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de las reivindicaciones 1 o 2, donde:

(i) el dominio de unión a CD33 codificado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 39, 40, 42-45, 47, 57, 58, 60-63, 65, 66, 67, 69-72, 74 o 262-268;

(ii) el dominio de unión a CD33 codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 40, 42-45, 47, 57, 58, 60-63, 65, 66, 67, 69-72, 74 o 262-268;

(iii) el dominio de unión a CD33 codificado comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 40, 42-45, 47, 57, 58, 60-63, 65, 66, 67, 69-72, 74 o 262-268; o

(iv) la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 255-261, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde:

(i) el CAR codificado incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, opcionalmente donde: (a) el dominio transmembrana codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o

(b) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO:17, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta; y/o

(ii) el dominio de unión a CD33 codificado está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, opcionalmente donde:

(a) la región de bisagra codificada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta; o

(b) la secuencia de ácido nucleico que codifica la región de bisagra comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio coestimulador codificado es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína seleccionada del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, C^d27, CD28, C^d30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83, opcionalmente donde:

(i) el dominio coestimulador codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; o

(ii) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

6. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde:

(i) el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta;

(ii) el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(iii) el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica;

(iv) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta; y/o

(v) la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia líder que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

7. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde

(a) la molécula de ácido nucleico aislada codifica un CAR que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 49, 51-54 o 56;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones respecto a cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 49, 51-54 o 56; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 49, 51 54 o 56; y/o

(b) la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 75, 76, 78, 79, 80, 81 u 83, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las SEQ ID NOs: 75, 76, 78, 79, 80, 81 u 83.

8. Un polipéptido de receptor antigénico quimérico (CAR) aislado que se une específicamente a CD33, donde el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD33 humano, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, y donde dicho dominio de unión a CD33 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde

9. El polipéptido CAR aislado de la reivindicación 8, que comprende:

(a)

(b)

10. El polipéptido CAR aislado de la reivindicación 8 o 9, donde:

(a) el polipéptido CAR aislado comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 39, 40, 42-45, 47, 57, 58, 60 63, 65, 66, 67, 69-72, 74 y 262-268;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 40, 42-45, 47, 57, 58, 60-63, 65, 66, 67, 69-72, 74 o 262-268; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las SEQ ID NO: 39, 40, 42 45, 47, 57, 58, 60-63, 65, 66, 67, 69-72, 74 o 262-268;

(b) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

(c) el dominio transmembrana comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6,

(ii) una secuencia de aminoácidos comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o

(iii) una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y/o (d) el dominio de unión a CD33 está conectado al domino transmembrana por una región de bisagra opcionalmente, donde la región de bisagra comprende la SEQ ID NO: 2, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

11. El polipéptido CAR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde:

(i) el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína seleccionada del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas activadoras de señales en los linfocitos (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, Cd27, CD28, Cd 30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83;

(ii) el dominio coestimulador comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;

(iii) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta;

(iv) el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(v) el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica; y/o

(vi) el polipéptido CAR aislado comprende además una secuencia líder que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

12. El polipéptido CAR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende:

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 49, 51 54 o 56.

13. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el vector se selecciona del grupo constituido por un vector de ADN, un vector de ARN, un plásmido, un vector lentivírico, vector adenovírico o un vector retrovírico, opcionalmente donde el vector comprende además un promotor EF-1 que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 11.

14. Una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 8-12 o el vector de la reivindicación 13.

15. Un método para producir una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, que comprende transducir la célula con un vector de la reivindicación 13.

16. Un método para generar una población de células modificadas con ARN, que comprende introducir un ARN transcrito ^{in v itro} o ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

17. Una población de células efectoras inmunitarias que comprende el ácido nucleico CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, para su uso en un método para: (i) proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la población de células, opcionalmente donde las células son linfocitos T autólogos o linfocitos T alogénicos; o

(ii) tratar un mamífero que padece una enfermedad asociada con la expresión de CD33, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la población de células, donde la enfermedad asociada con la expresión de CD33 es: (a) un cáncer o neoplasia maligna, o una afección precancerosa elegida de una o más de una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia;

(b) una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD33 seleccionada del grupo constituido por enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, lupus) y trastornos inflamatorios (alergia y asma);

(c) un cáncer hematológico; y/o

(d) una leucemia aguda elegida de una o más de leucemia mieloide aguda (AML); síndrome mielodisplásico; neoplasias mieloproliferativas; leucemia mieloide crónica (CML); o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, o una combinación de estos.

18. La población de células efectoras inmunitarias, para el uso de la reivindicación 17, donde las células se administran en combinación con uno o más de:

(a) un agente quimioterápico;

(b) un trasplante de médula ósea;

(c) una terapia linfodepletante;

(d) un agente que inhibe PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160 o 2B4;

(e) una terapia para CRS (siglas en inglés del síndrome de liberación de citocinas); o

(f) un inhibidor de mTOR, donde al sujeto se le administra una dosis del inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, que inhibe parcialmente la actividad de mTOR según se mide por la inhibición de la actividad de la cinasa P70 S6.

19. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la molécula de polipéptido CAR aislada de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, el vector de la reivindicación 13 o la célula de la reivindicación 14 para su uso como un medicamento.

20. La célula efectora inmunitaria de la reivindicación 14, donde la célula expresa además un agente que inhibe una molécula que inhibe la actividad de la célula que expresa CAR, donde el agente comprende:

(i) un primer polipéptido que comprende PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta, o un fragmento de este; y

(ii) un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, donde el segundo polipéptido es un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador de 41BB, CD27 o CD28, y/o un dominio de señalización primario de CD3 zeta).