JP3490437B2

JP3490437B2 - 単量体および二量体抗体フラグメント融合タンパク質

Info

Publication number: JP3490437B2
Application number: JP51288993A
Authority: JP
Inventors: プリュクトゥーン、アンドレアス; パク、ペーター
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1992-01-23
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2004-01-26
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: NO942750L; KR100254759B1; WO1993015210A1; HU215180B; CA2128511C; AU676150B2; CZ287296B6; ATE151113T1; JPH07503366A; RU2128709C1; CA2128511A1; DE69309472D1; HUT68798A; ES2102007T3; KR950700419A; CZ175794A3; HU9402167D0; JP2004041221A; RU94045249A; DE69309472T2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗体のFv−フラグメントを含むが定常抗体
ドメインを用いない新クラスの抗原結合分子に関する。
これらはまた、他の抗体フラグメント分子または非抗体
フラグメント分子と二量体を形成して、二または多官能
基抗体フラグメント融合タンパク質およびいわゆるミニ
抗体をそれぞれ形成することができる。新規の融合タン
パク質は、診断および治療薬の広範な分野において使用
することができる。

発明の背景ニ、三年前から、より特異的でより特定の抗体型を得
るために天然に生じる抗体を修飾するバイオテクノロジ
ー分野に大きな関心が向けられている。したがって、
（修飾された）抗体フラグメントを生産する試みがなさ
れてきた。

全クラスの天然に生じる抗体はすべて、少なくとも二
つの結合部位を有する。これによって、抗体はFabフラ
グメントのような一価のフラグメントよりもより多様な
親和性で表面と結合することができる。この二、三年の
間に記述された方法には、官能基を有する抗体フラグメ
ントを大腸菌（Escherichia coli）中で産生させ得る
方法（SkerraおよびPlueckthun、1988、Science、240、
1038〜1040、Betterら、1988、Science、240、1041〜10
43）がある。これらにはFvフラグメント（V_HおよびV_Lか
らなるヘテロ二量体）およびFabフラグメント（V_Lおよ
びC_Lドメインを含む完全なＬ鎖およびＨ鎖の最初の二ド
メインのV_HおよびC_H1からなる）が含まれる。

しかし、FvフラグメントはV_HおよびV_Lに解離する傾向
にあり、したがって、二つのドメインを共有結合させる
ことが有利である。これらを結合する一つの特別な方法
は、これらの間にペプチドリンカーをV_H−リンカー−V_L
またはV_L−リンカー−V_Hのいずれかの配列でデザインす
ることによる（Birdら、1988、Science、242、423、Hus
tonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85、5879）。
得られるフラグメントは一本鎖Fvフラグメントと呼ばれ
る。

しかし、これらフラグメントはすべて、一価である。
本発明において、われわれはペプチド形成両親媒性ヘリ
ックスに基づいて小さい二量体形成ドメインを作出する
方法を記述する。これらのペプチドを「挿入」と称する
が、これはターゲットにした会合ができるという意味を
表すものであって、二量体形成相接部の特定構造を表し
て限定するものではない。

ここに記述される方法は、原則的にはFab、Fvまたはs
cFvフラグメントのいずれにも適用できるが、後者にも
っとも有利に用いられる。この場合、二価フラグメント
はきわめて小サイズに構築することができて、かつV_Lお
よびV_Hへの解離およびフラグメント鎖のミスマッチ、例
えばV_L−V_Lを妨げることができる。

小サイズの抗体フラグメントは多くの適用にとくに有
利である。診断的適用（例えば、ELISA、RIAなど）にお
いて、より小さい分子表面によって、定常部が多くは関
与することが知られている非特異的相互反応の問題が軽
減される。抗体フラグメントをアフィニティークロマト
グラフィーにおいてリーガンドとして用いる場合にも同
様である。腫瘍の診断または治療において、注射した抗
体のかなりの量が組織に入り込んで腫瘍に集積されるこ
とが重要であり、これは分子の大きさに依存している
（Colcherら、1990、J.Natl.Cancer Inst.82、1191〜1
197）。組み換えタンパク質の発現率と分泌効率もま
た、鎖サイズによって異なり（SkerraおよびPlueckthu
n、1991、Protein Eng.４、971）、より小さいタンパ
ク質がこの理由で好ましい。したがって、小サイズの分
子が種々の理由から有利である。

従来、抗体の分子サイズを小さくするということはタ
ンパク質加水分解フラグメントの調製を意味する。最小
の二価のフラグメントである（Fab）′_２フラグメント
は本発明のフラグメントのそれでもまだ約２倍の大きさ
である。したがって、これらの新規フラグメントは三つ
の特性を合わせ持つ。すなわち、（ａ）小サイズ、
（ｂ）二価性および二官能基性および（ｃ）大腸菌にお
ける機能発現能を有する。

二官能基抗体には多くの分野で大きな関心が向けられ
ている。二官能基性抗体は、二つの異なる抗原あるいは
同じ抗原の二つのエピトープのいずれかのための二つの
異なる特異性を有すると定義することができる。

今日、二官能基性抗体を産生する方法が多数ある。し
かし、現在ある方法のいずれも、選択的に二官能基性抗
体だけをインビボで産生させることはできず、むしろ分
子型の混合が常におきて、複雑で高価な分離工程を必要
とする。

主たる四つの方法が認められる。第一は化学的架橋結
合が用いられ、これには異種二官能基性クロスリンカー
が有利に用いられる。この方法によって、全抗体（Stae
rzら、1985、Nature、314、628、Perezら、1985、Natur
e、316、354〜356）、Fabフラグメント（Carterら、199
2、Biotechnology、10、163）およびscFvフラグメント
（Cumberら、1992、J.Immunol.、149、120）が精製後に
化学的に架橋された。

第二の従来法では、二つのハイブリドーマの融合が関
与し、いわゆるヘテロハイブリドーマまたは「クアドロ
ーマ」が得られる。この方法では、いずれのＬ鎖がいず
れのＨ鎖と対になってもよく、二つのＨ鎖はホモ二量体
またはヘテロ二量体を形成することができ、その結果、
きわめて複雑な産生物の混合物が得られる（Milsteinお
よびCuello、1983、Nature、305、537）。

第三の方法は第二の方法に関連しており、第二の抗体
のＨ鎖およびＬ鎖をコードする二つの発現プラスミドを
ハイブリドーマ細胞へ（LenzおよびWeidle、1990、Gen
e、87、213）またはレトロウイルスベクター（De Mont
eら、1990、Acad.Sci.87、2941〜2945）中にトランスフ
ェクトさせることからなる。しかし、いったん導入され
ると、産生物混合物は第二の方法におけるものと同一で
ある。

最後の方法では、抗体は還元されて、混合されて、再
び酸化される（StaerzおよびBevan、1986、Immunology
Today、７）。ここでも、きわめて複雑な産生物混合
物が得られ、高度の分離操作および品質管理工程が要求
される。

このように、化学的架橋から要求される複雑な調製を
行うことなく直接にヘテロ二量体抗体を選択的に分離で
きる方法が未だ求められている。本発明において、この
問題を（ｉ）scFvフラグメント中の対応するV_HおよびV_L
ドメインを共有結合させることおよび（ii）二量体形成
ドメインを用いることによってある種のロイシンジッパ
ーおよび誘導体などのヘテロ二量体しか形成されないよ
うにすることによって解決する。

本発明の他の重要な考慮点は、詳細に上記に説明した
ような理由から、二特異性抗体の分子量をできるだけ小
さくしたいということであった。これはscFvフラグメン
トを用いることによって達成された。

二特異性抗体の使用についてはこれまで多くの記述が
あるが、この新技術はそのほとんどに利益をもたらす。
例えば、二特異性抗体は腫瘍治療においてきわめて興味
深い。抗体の一方の腕を腫瘍マーカーに結合させて、も
う一方をＴ細胞エピトープ、トキシンまたは放射性核種
結合ペプチドまたはタンパク質に結合させて、傷害機能
因子を腫瘍細胞に接近させることができる。診断におい
ては、一方の腕を分析対象と結合させて、もう一方を酵
素などの容易に定量できるものと結合させる。最後に、
細胞への適用においては、二つの異なるエピトープまた
は同じタンパク質複合体が認識され得る場合または二つ
の異なるタンパク質が同一の細胞表面に認識され得る場
合には、高度の結合選択性を得ることが有利である。

このように、本発明の目的は、二官能基またはさらに
多官能基結合部位を有する新規のそれぞれの安定した抗
体フラグメント融合タンパク質を作出することであっ
た。

Fvフラグメントを含む抗体フラグメント融合タンパク
質が特異的が改善された性質を示す遺伝子工学的手法に
よって産生されることが見出だされた。

したがって、本発明の目的は、抗体のFvフラグメント
および非共有相互作用によって他のペプチドと二量体を
形成することができるペプチドから本質的になる単量体
抗体フラグメント融合タンパク質である。

用語「非共有相互作用」とは、通常の条件下で安定し
ている共有結合に関係しないあらゆる結合であって、例
えばファン・デル・ワールズ力、両親媒性ペプチド、と
くにペプチドヘリックスの（立体）結合、またはアミノ
酸残基の反対の電荷を有するペプチドなどである。

両親媒性ペプチドは、50個までのアミノ酸からなる。
好ましくは、これらは10〜30個のアミノ酸からなる。本
発明の好ましい実施態様では、相互作用性ペプチドはペ
プチドヘリックス団（ヘリックス、ターンおよび別のヘ
リックスからなる。上記を参照されたい）である。他の
実施態様では、相互作用性ペプチドはいくつかの反復ア
ミノ酸を有するペプチドからなるロイシンジッパーであ
り、ここで７個毎のアミノ酸はロイシンである。本発明
の他の例では、ペプチドは正または負に荷電した残基、
例えばリジン（正に荷電）またはグルタミン酸（負に荷
電）を、このペプチドが反対に荷電した他のペプチド
（第二の単量体ユニットの）と結合できるように有して
いる。

Fvフラグメントと挿入ペプチドは直接にまたはリンカ
ーペプチドによって、好ましくはリンカーペプチドによ
って一緒に連結している。好ましい実施態様において
は、リンカーペプチドは抗体のヒンジ領域配列物であ
る。

定義のように、Fvフラグメントは抗体のV_LおよびV_H領
域からなる。本発明によるFvフラグメントは、好ましく
は一本鎖フラグメントである。一本鎖フラグメントは、
標準リンカー分子を用いて標準手法によって得ることが
できる。

さらに、本発明の目的は二つの単量体融合タンパク質
から本質的になる二量体融合タンパク質であって、ここ
で単量体ユニットの連結は同一または異なるペプチドの
非共有相互作用に基づき、少なくとも一つの単量体ユニ
ットが上記に定義された抗体−Fvフラグメント融合タン
パク質であることを特徴とする。

二量体が二つのFvフラグメントを含む場合は、Fvフラ
グメントは同じ（同一の抗原結合部位）でもまたは異な
って（異なる抗原結合部位）いてもよい。これらの場合
には、単および二特異性（Fv）−ミニ抗体を得ることが
できる。本発明によると、二特異性ミニ抗体が好まし
い。

相互作用性ペプチドは、同一でも異なっていてもよい
が、好ましくは同一である。挿入ペプチドは平行または
逆平行の状態で会合する。

したがって、本発明の目的は、とりわけ、異なる特異
性（抗原結合部位）を有する二つのFvフラグメントおよ
び同一の挿入ヘリックスペプチドからなる二量体融合タ
ンパク質であって、抗体フラグメントとペプチドはヒン
ジ領域配列によって連結している。

さらに、本発明の目的は、Fvフラグメントを含む単量
体およびFvフラグメントが非抗体ペプチドによって置換
されたもう一つの単量体ユニットからなる二量体であ
る。非抗体ペプチドは、リシンなどのトキシン、キレー
ト化剤または金属結合ペプチド、または酵素（例えばマ
ーカー酵素）、または検出可能な標識（例えば放射性同
位元素）を有するペプチドなどである。

非抗体ペプチドはまた、該基のための対応する結合部
位を有することができ、これにはＴ細胞またはＴ細胞フ
ラグメントに対する結合部位が含まれる。

さらに、本発明は、相互作用性ペプチドがＣ末端にお
いて標的タンパク質／ペプチドと上記したようにさらに
融合している上記に定義した単量体および二量体に関
し、対応する結合部位が含まれる。したがって、得られ
る融合タンパク質およびミニ抗体は、それぞれ多価性で
ある。

本発明はまた、上記に定義した単量体抗体融合タンパ
ク質の調製法に関し、これはFvフラグメントをコードす
る遺伝子、相互作用性ペプチドおよび、必要であれば連
結ペプチドを一つの発現プラスミドにクローニングし
て、宿主細胞を該発現プラスミドで形質変換して栄養溶
液中で培養して、単量体融合タンパク質を細胞中で発現
させるか培地中に分泌させることを特徴とする。

本発明の目的は、最後に、上記に定義した二量体融合
タンパク質の調製法であって、これは完全な単量体融合
タンパク質またはその部分をコードする遺伝子を少なく
とも一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細
胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養し
て、完全な二量体融合タンパク質を細胞中でまたは培地
中に発現させるか、単量体融合タンパク質を別々に発現
させてから二つの単量体ユニット間の非共有結合を培地
中またはインビトロで行わせること、さらに融合タンパ
ク質の部分のみがクローニングされた場合にはタンパク
質工学的工程を標準手法によって追加して実施すること
を特徴とする。

本発明による融合タンパク質を含む二量体Fvフラグメ
ントは、対応する抗原に対する高度の親和性および十分
な安定性を示す。これらの新規の二価または二官能基分
子は大腸菌中で折りたたまれて組み立てられた分子とし
て調製することができる。これらのミニ抗体は、分泌に
よる機能発現と適合性を示す。

発明の詳細な説明オリゴマー形成ドメインは相当に小さな分子量であっ
て、かつ融合タンパク質の膜を通しての輸送と適合する
ものが選択された。これらは二つの異なる型の両親媒性
ヘリックスに基づいている。

両親媒性ヘリックスは、占有的ではないが優勢に、二
つの異なる分子構造に会合していることが知られてい
る。すなわち、四ヘリックス団と二重コイルである。ヘ
リックス団の形態と形成については既に研究されている
（Eisenbergら、1986、Proteins １、16〜22、Hoおよ
びdeGrado、1987、J.Am.Chem.Soc.109、6751〜6758、Re
ganおよびdeGrado、1988、Science 241、976〜978、Hi
llら、1990、Science 249、543〜546）。この分子会合
はまた、天然タンパク質からも公知である（Richardso
n、1981、Adv.Prot.Chem.34、167）。

四ヘリックス団は、四つの別々の分子から（それぞれ
一つのヘリックスに関与している）、各二つのヘリック
スを含む二分子（ヘリックス−ターン−ヘリックスとし
て連結されている）またはヘリックス−ターン−ヘリッ
クス−ターン−ヘリックス−ターン−ヘリックス構造を
含む一分子のいずれかから形成することができる。二量
体形成または多量体形成のためには、最初の二つだけが
適している。

後者の三タイプが試験された。第一のタイプでは、Ei
senbergら（1986、Proteins １、16〜22）によって示
された配列の一つのヘリックスを用いた。第二タイプで
は、この配列をシステインで終わる親水性小ペプチドに
よって伸長した。いったんヘリックスが会合すると、親
水性ペプチドは互いに衝突するほどに十分に接近して、
大腸菌のペリプラズム中などの酸化条件下でジスルフィ
ド結合が形成され得る。第三のタイプでは、二つのヘリ
ックスが縦列に用いられ、短いターンコードペプチドに
よって分離される。

第二のデザインでは、いわゆる二重コイル構造を形成
できるようなペプチドが用いられる。そのようなペプチ
ドは、酵母からのGCN4などの転写因子中に認められ、ロ
イシンジッパーと呼ばれている（Landschulzら、1988、
Science 240、1754〜1764）。最近、この結晶構造が解
明され（Ｏ′Sheaら、1991、Science 254、539〜54
4）、ヘリックスの平行構造が示された。

ヘリックスの共有結合は、ここでもシステインを含む
小ペプチド延長物によって可能である。ヘリックスが平
行であることから、距離はずっと近くなるのでペプチド
延長物はずっと短くてよい。

しかし、種々の二量体形成手段物（挿入ヘリックス）
が抗体ドメインに直接には融合されなかった。scFvフラ
グメントとヘリックス開始部との間に可動性のペプチド
を導入することは有利である。例えば、マウスIgG3の上
部ヒンジ部が使われてきた。しかし、種々のヒンジを用
いることができる。これは二量体形成自体には要求され
ないが、全抗体の抗原結合部位と同様の二つのscFvドメ
インの空間を提供する。このようにして、二つの結合部
位は空間的により大きい距離を保つことができ、したが
って、隣接する抗原に確実な面で到達することができ
る。

抗体の天然に認められるヒンジは、二価ミニ抗体にお
けるヒンジの好ましい例である。二官能基性ミニ抗体の
場合、異なる表面からの分子はしばしば可能な限り近接
して架橋されていることからヒンジはより短くてよく、
二量体の可動性は必要ではない。ヒンジの選択は所望の
残基配列、長さ（Argos、1990、J.Mol.Biol.211、943〜
958）、折りたたみとの適合性、両親媒性ヘリックスの
安定性（RichardsonおよびRichardson、1988、Science
240、1648〜1652）、分泌およびプロテアーゼに対す
る抵抗性によって決定される。

本発明ではペプチドを二量体形成手段物として扱う
が、これはできるだけ小さくなければならない。一つの
好ましい実施態様は、両親媒性ヘリックスを形成できる
ようなペプチドの使用である。そのようなヘリックスは
疎水性表面を二量体形成またはさらに多量体形成によっ
て覆う。この型のヘリックスは、ヘリックスの表面に疎
水性小区分を有することおよび充分数のヘリックス形成
残基を含むことによって特徴づけられる。そのようなペ
プチドの特徴については、Ensenbergら（1986）、Ｏ′S
heaら（1991、Science 254、539〜544、1992、Cell 6
8、699〜708）で考察されている。

この型の天然ペプチドはいわゆるロイシンジッパーと
して見出だされており、これらは周期的間隔で存在する
ロイシン（７残基毎）およびその他のやはり７残基毎の
親水性残基（例えばバリン）によって特徴づけられる。
これらの本質は今明らかにされている（Ｏ′Sheaら、19
91、1992、前出）ので、配列をホモ二量体の会合に不都
合であるがヘテロ二量体の会合には好ましくなるような
残基を導入するように変えることができる。そのような
配列変更には例えば荷電架橋の導入などが関与すること
ができ、例えばホモ二量体においては互いに反発しあう
荷電が、ヘテロ二量体においては互いに引き合う荷電の
導入が考えられる（下記を参照されたい）。

本発明はまた、二官能基ミニ抗体にも及ぶことができ
る。この場合、二量体形成手段物（挿入ペプチド）はヘ
テロ二量体の形成するのみでホモ二量体は形成しないよ
うなものを用いなければならない。本発明のこの部分の
好ましい実施態様は、天然に認められるロイシンジッパ
ーにおけるような二つの異なる二重コイルヘリックス
で、例えば、転写因子タンパク質のjunおよびfosなどか
らのものがある（Ｏ′Sheaら、1989、Science 245、64
6〜648）。

本発明のさらなる実施例において、定常scFv−ヒンジ
−ヘリックスはＣ末端において伸長させて融合タンパク
質にすることができる。例えば、酵素と融合させてその
ような二価構成体を診断に利用してもよい。そのような
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ルシフ
ェラーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼな
どがある。そのような抗体−酵素融合タンパク質の利点
としては、抗体の二価性が表面結合抗原との結合を促進
することが考えられる。従来の手法（すなわち、選択酵
素への抗体の化学的カップリング）によって調製された
融合タンパク質と比較しての利点としては、バッチ間の
差異がずっと小さいことがあげられる。すなわち、産生
物が均一で、調製が大腸菌からの単一工程によるのでよ
り簡単である。

同様にして、ミニ抗体をＣ末端で伸長してトキシンを
導入するすることができる。そのようなイムノトキシン
は二価またはさらに二特異性であることが可能であり、
これは上記のような抗体フラグメントの利点と組み合わ
せて腫瘍治療においてイムノトキシンとして利用されて
いる。同様に、金属結合ペプチドまたはタンパク質を遺
伝子的に結合させて、放射線免疫療法または腫瘍画像に
おいて用いることができる。抗体−酵素融合で示したの
と同様の利点が遺伝的にコードされたハイブリドタンパ
ク質においても認められる。

本発明の他の実施態様において、上記した二特異性ミ
ニ抗体の形成とまったく同様にしてscFv−ヒンジ−ヘリ
ックス型構成体を二量体形成ドメインに融合した他のタ
ンパク質と二量体形成させることができる。このように
して、scFvフラグメントは、例えばfosタンパク質のヘ
リックスに適する。ヘテロ二量体をscFvフラグメントと
形成させることができるような外来性タンパク質として
は、診断に有用な酵素、トキシン、金属結合ペプチドま
たは放射線免疫療法または放射線画像において有用なタ
ンパク質などがある。

本発明の原理を用いて、ここで提示された二量体形成
ドメインはまた精製目的にも適用できる。いかなる種類
の組み替えタンパク質でも二量体形成ドメイン、例えば
ヒンジ−fos−ジッパーに融合することができる。scFv
−ヒンジ−junとの共発現の後、ヘテロ二量体をscFv−
特異性のためのアフィニティーカラムを用いる一工程で
精製することができる。別のアプローチにおいては、粗
細胞抽出物としてカラムを通過する際にカラム支持体に
結合した「反対側の」ジッパーがタンパク質−ヒンジ−
ジッパーを「捕らえる」。

カラムからの精製融合タンパク質の溶出は、ジッパー
の展開温度を用いることで可能である。二量体形成ドメ
インからの続いての分離は、タンパク質加水分解部位の
導入、例えば血液凝固因子X aのヒンジへの導入などに
よって達成できる（NagaiおよびThogerson、1987、Met
h.Enzymol.152、461〜481）。

本発明において記述するミニ抗体のとくに優れている
点は、大腸菌内で機能的に組み立てられることである。
ホモ二価構成体の場合、二量体形成原則が用いられ、こ
れによってホモ二量体が形成される。上記された例に
は、酵母タンパク質GCN4の二重コイルヘリックス（ロイ
シンジッパー）または逆平行四ヘリックス団からのヘリ
ックスが含まれる。この場合、scFvフラグメントは細菌
性シグナル配列の存在下で発現され、scFvフラグメント
の遺伝子の末端にヒンジおよび二量体形成ヘリックスま
たはヘリックス−ターン−ヘリックスのためのコドンを
有している。ヘリックスは、タンパク質の折りたたみ、
ジスルフィド形成およびアセンブリーが行われる大腸菌
のペリプラズム空間への分泌と適合性を示す。これらの
条件下で、ホモ二量体タンパク質は自然に形成され、二
量体のかたちで直接に単離することができる。

ヘテロ二価構成体が望ましければ、二つの異なるscFv
フラグメントまたは異なるタンパク質と会合している一
つのscFvフラグメントが会合に必要である。本発明の好
ましい実施態様においては、組み立てられる両タンパク
質は同じ細胞中で、好ましくは同じプラスミド上で、好
ましくは二シストロンオペロンとして発現される。人工
的二シストロンオペロンのデザインは、例えばSkerraら
（1991、Protein Eng.４、971）に説明されている。組
立はペリプラズム中で起きなければならないことから、
scFvフラグメントは酸化的環境中でしか折りたたまれな
いので、両タンパク質は輸送されて両方ともシグナル配
列とうまく適合せねばならない。二量体形成タンパク質
は、二つの異なるタンパク質の会合は促進するがそれぞ
れのホモ二量体の会合は妨げるように選択せねばならな
い。そのようなタンパク質の例としては、タンパク質fo
sおよびjunのロイシンジッパーペプチドがある（上記を
参照されたい）。

同一の細胞で発現されない場合は、異なるscFv−ヒン
ジ−ジッパー構成体は粗細胞抽出物または精製タンパク
質として一緒に混合されて、温度を上げて処理されねば
ならない。「反対側の」ジッパーが存在しない状態で、
例えばscFv−ヒンジ−jun−ジッパー構成体はホモ二量
体を形成することができる。約40℃の融解温度まで短時
間加熱した後、不要なホモ二量体のジッパーがはずれ
て、ずっと安定したヘテロ二量体が形成される（Ｏ′Sh
eaら、1992、Cell、68、699〜708）。実験で示されたよ
うに、温度を上げることなしにはインビトロでのヘテロ
二量体の形成は不可能である。

図面および配列表の簡単な説明第１図は、scFvフラグメントを含むscFv発現ベクター
pLISC−SEの模式図である。

第２図は、二シストロンscFv−ヒンジ−ジッパー発現
ベクターpACKxFyJの模式図である。

第３図は、官能基を有するELISAの説明図である。

OD₂₈₀で測定した（縦軸）アフィニティー精製タンパ
ク質の濃度はウェル当たりの結合部位モル数（横軸）に
関連する。ELISAプレートをホスホコリン−BSAで被覆し
て、精製されたホスホコリン−特異性ミニ抗体−タンパ
ク質を結合させて、抗McPC603抗血清によって検出し
た。

（ａ）種々のミニ抗体の比較（ｂ）ミニ抗体scHLXcのScFVおよび全IgAとの比較第４図は、官能基を有する抗リゾチームELISAの説明
図である。

共発現された抗PC−抗リゾチーム二特異性ミニ抗体の
PCアフィニティー精製サンプル。横軸上の＋および−は
インヒビターをプラスした場合（＋）およびインヒビタ
ーなしの場合（−）を意味する。

添付の配列表は、配列ID番号（S.I.N.）に対応する。

S.I.N.1:pLISC−SEベクターの全ヌクレオチドおよび
アミノ酸配列 S.I.N.2:挿入GCN4−ロイシンジッパーの遺伝子断片
（カセット）（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列） S.I.N.3:挿入逆平行ヘリックス−ターン−ヘリックス
をコードする遺伝子カセット（ヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列） S.I.N.4:挿入jun−ジッパーおよびIgG3−ヒンジ領域
をコードする遺伝子カセット S.I.N.5:挿入fos−ジッパーおよびIgG3−ヒンジ領域
をコードする遺伝子カセット S.I.N.6:挿入jun−ジッパーおよびデザインされたリ
ンカーをコードする遺伝子カセット S.I.N.7:挿入fos−ジッパーおよびデザインされたリ
ンカーをコードする遺伝子カセット［実施例１］：挿入ペプチドのための遺伝子を導入する
ための制限部位を含む分泌一本鎖フラグメントのための
ベクターの構築組み替えDNA手法はSambrookら（1989、Molecular Cl
oning:実験室マニュアル、第二版、Cold Spring Harb
or Laboratory、New York）に基づいた。一本鎖Fvフ
ラグメントおよびミニ抗体の大腸菌JM83中での機能発現
はpASK−lisc（Skerraら、1991、Protein Eng.４、97
1）と同様のベクターを用いて行った。部位特異性突然
変異はこれらベクター中でKunkelら（1987、Meth.Enzym
ol.154、367〜382）およびGeisselsoderら（1987、Biot
echniques ５、786〜791）の方法によってヘルパーフ
ァージM13K07（VieiraおよびMessing、1987、Meth.Enzy
mol.153、３〜11）を用いて直接に行った。SDS−PAGEは
FlingおよびGregerson（1986、Anal.Biochem.155、83〜
88）によって記述されたようにして行った。アフィニテ
ィー精製タンパク質の濃度は計算された吸収係数を用い
てOD₂₈₀によって測定した（Gillおよびvon Hippel、19
89、Anal.Biochem.182、319〜326）。ベクターとして
は、複製起点、調節可プロモーター、細菌性シグナル配
列、それに続く多重クローニング部位、転写ターミネー
ターおよび一本鎖ファージのための起点を含むpASK40
（Skerraら、1991、Protein Eng.４、971）などが用い
られる。一本鎖Fvフラグメントの遺伝子は次のようにデ
ザインされる。すなわち、V_Hドメインのヌクレオチド配
列の後に、好ましくは約15残基、好ましくは配列（Gly₄
Ser）_３をコードするリンカー配列が直接に続き、それ
にV_Lドメインの配列が直接に続く。別法として、V_Lドメ
インの配列にリンカー配列が直接に続いて、それにV_Hド
メインの配列が続いてもよい。

抗体の配列が公知であれば、scFvフラグメントの完全
な遺伝子は合成オリゴヌクレオチドから組み立てられ
る。抗体遺伝子のそのような遺伝子合成のための詳細な
実験工程はPlueckthunら（1987、Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.52、105〜112）に記述されている。

V_HおよびV_Lドメインの遺伝子が他のベクター中に存在
している場合には、scFvフラグメントの遺伝子を制限フ
ラグメントから組み立てることもできる。例えば、V_Hド
メインのほとんどをコードする制限フラグメントをプラ
スミドから切り出し、V_Lドメインのほとんどをコードす
るフラグメントを別のプラスミドから切り出す。V_Lおよ
びV_Hの残りの片およびscFvフラグメントのためのリンカ
ーは合成オリゴヌクレオチドのカセットによって得るこ
とができ、これらは標準法（Sambrookら、1989、前出）
によって連結する必要がある。フラグメントの混合物を
ベクターpASK40または適当な制限部位の一対を含む同様
のプラスミド中に連結する。

抗体の遺伝子が前もってクローニングされている場合
には、これらは抗体を産生するハイブリドーマ細胞から
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR:PCR法はMcPhersonら、199
1、PCR−Ａ Practical Approach Oxford Universit
y Press、New Yorkに記述されている）によって直接
に得ることもできる。V_HおよびV_Lドメインの増幅に適す
るプライマーは、Orlandiら（1989、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 86、3833〜3837）、Huseら（1989、Science 24
6、1275〜1281）およびLarrickら（1989、Biotechnolog
y ７、934〜938）によって記述されている。ハイブリ
ドーマからmRNAを得る方法については、これらの参考文
献に記述されている。別々のV_HおよびV_L遺伝子を別々の
ベクターにクローニングして、scFV遺伝子を上記に説明
した原則によって組み立てることもできる。

連結されたフラグメントがscFvフラグメントの正しい
読み枠を構成しない場合には、プラスミド上のシグナル
配列コドンとの正確な融合を部位特異性突然変異によっ
て生じさせてもよい。オリゴヌクレオチドのデザインと
構成は、いかなる当業者にも可能である。

このようにして得られるscFv発現プラスミドは細菌性
シグナル配列のコドンを含み、これに直接に第一の可変
領域（V_HまたはV_L）、リンカーおよび第二の可変領域
（V_LまたはV_H）が調節可プロモーターのコントロールの
下に続く。

scFvタンパク質のＣ−末端に対応するこの遺伝子の
３′末端、において、単一制限部位を発現プラスミドに
導入して、挿入ペプチドをコードする遺伝子カセットの
挿入を可能にする。制限部位をKunkel（1987、Meth.Enz
ymol.154、367〜382）の方法を用いて部位特異性突然変
異によって導入する。

挿入ペプチドを受けるための適当な一本鎖Fv発現プラ
スミドpLISC−SEの完全な配列の例を第１図および配列I
D番号（S.I.N.）１ならびに配列ID番号（S.I.N.）２
（配列表を参照されたい）に示す。

［実施例２］：ロイシンジッパーの挿入ペプチドをコー
ドする遺伝子カセットのデザインおよび構築 scFvフラグメント遺伝子の３′末端における制限部位
と適合するように制限部位を備えた遺伝子カセットは、
ヒンジ（scFvフラグメントの挿入タンパク質との結合
部）の配列および挿入ペプチド自体をコードしなければ
ならない。しかし、ヒンジ領域は省略してもよい。

例えば、マウスIgG3の上部ヒンジ領域の配列（Dangl
ら、1988、EMBO J.７、1989〜1994）とこれに続く酵母
タンパク質GCN4のロイシンジッパーの配列（Oasら、199
0、Biochemistry T29、2891〜2894）を、頻用される大
腸菌コドン中に戻し翻訳（back−translation）する
（配列ID番号（S.I.N.）３ならびに配列ID番号（S.I.
N.）４）。オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめ
EcoR IおよびHind IIIで消化しておいたベクターpLISC
−SE中に連結する。

［実施例３］：四ヘリックス団の挿入ペプチドをコード
する遺伝子カセットのデザインおよび構築実施例２と同様にして、マウスIgG3の上部ヒンジ領域
の配列とこれに続く四ヘリックス団のヘリックス−ター
ン−ヘリックスの配列（Eisenbergら、1986、前出）
を、頻用される大腸菌コドン中に戻し翻訳する（配列ID
番号（S.I.N.）５ならびに配列ID番号（S.I.N.）６）。
オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめEcoR Iおよ
びHind IIIで消化しておいたベクターpLISC−SE中に連
結する。

［実施例４］：ロイシンジッパーの挿入ペプチドをコー
ドする二つの遺伝子カセットのデザインおよび構築、お
よびそれらの共発現実施例２と同様にして、マウスIgG3の上部ヒンジ領域
の配列とこれに続くjunタンパク質のジッパー配列の配
列（Ｏ′Sheaら、1992、前出）を、頻用される大腸菌コ
ドン中に戻し翻訳する（配列ID番号（S.I.N.）７ならび
に配列ID番号（S.I.N.）８）。オリゴヌクレオチドを合
成して、あらかじめEcoR IおよびHind IIIで消化してお
いたベクターpLISC−SE中に連結する。

これと平行して、マウスIgG3の上部ヒンジ領域の配列
とこれに続くfosタンパク質のジッパー配列の配列
（Ｏ′Sheaら、1992、Cell 68、699〜708）を、頻用さ
れる大腸菌コドン中に戻し翻訳する（配列ID番号（S.I.
N.）９ならびに配列ID番号（S.I.N.）10）。オリゴヌク
レオチドを合成して、あらかじめEcoR IおよびHind III
で消化しておいたベクターpLISC−SE中に連結する。こ
のようにして、二つのベクターはそれぞれ異なる抗体sc
Fvフラグメントとそれに続くヒンジペプチドおよび異な
るロイシンジッパーペプチドをコードする。二つのscFv
フラグメントを共発現するために、fosを含む産生物の
全scFv−ヒンジ−ジッパー遺伝子をベクターからXba I
−Hind IIIフラグメントとして切り出して、既に他方の
抗体のscFv遺伝子を含んでいるベクターpLISC−SE−scF
v−jun中に連結する。

次いで、新たに得られたベクターによってscFv₁−リ
ンカー_１−fos−ジッパーおよびscFv₂−リンカー_２−ju
n−ジッパーが二シストロンオペロンとして単一のプロ
モーターから発現される。

fosおよびjunジッパーに関してヒンジ領域が改善され
た配列を（配列ID番号（S.I.N.）11と配列ID番号（S.I.
N.）12および配列ID番号（S.I.N.）13と配列ID番号（S.
I.N.）14に示す。このヒンジはより短くて、したがって
タンパク質加水分解を受けにくい。二つの結合部位間の
距離があまり重要ではない場合には、そのように短くな
ったヒンジは有利である。この場合には、scFvフラグメ
ントの「尾」が短くなり、挿入ペプチドのための遺伝子
を受けるEcoR I部位は４残基分上流に移動している。

［実施例５］：二価ミニ抗体の大腸菌からの精製実施例２および３のようにして構築されたプラスミド
を取り込んだ大腸菌JM83を0.5のOD₅₅₀にまで増殖させ
て、最終濃度1mMのIPTGを用いて誘導する。細胞を遠心
分離して、BBS緩衝液（200mMホウ酸ナトリウム、160mM
NaCl、pH8.0）に再懸濁させて、懸濁液をフレンチプレ
スに通す。これらの例においては、ホスホリルコリン結
合ミニ抗体を用いる。ミニ抗体をホスホリルコリンアフ
ィニティークロマトグラフィーを通して記述されたよう
にして精製する（ChesebroおよびMetzger、1972、Bioch
emistry 11、766〜771）。

［実施例６］：二特異性ミニ抗体の大腸菌からの精製実施例２および３のようにして構築されて、二つの異
なるscFvのための二シストロン構造遺伝子を含むプラス
ミド（第２図）を取り込んだ大腸菌JM83を0.5のOD₅₅₀に
まで増殖させて、最終濃度1mMのIPTGを用いて誘導す
る。細胞を遠心分離して、BBS緩衝液（200mMホウ酸ナト
リウム、160mM NaCl、pH8.0）に再懸濁させて、懸濁液
をフレンチプレスに通す。これらの例において、ホスホ
リルコリンに対する特異性およびベンゾイル−アンピシ
リンの両者を含む二特異性ミニ抗体を用いる。ミニ抗体
をホスホリルコリンアフィニティークロマトグラフィー
を通して記述されたようにして精製する（Chesebroおよ
びMetzger、1972、前出）。

［実施例７］：二価ミニ抗体の表面結合 ELISA−プレート（Nunc、Macrosorp社製）を400ng/ml
のホスホコリン−BSAのPBS緩衝液（20mM燐酸塩、pH7.
2、115mM NaCl）溶液で被覆した。ハプテン試薬をニト
ロフェニルホスホコリン（シグマ製）から調製したが、
これは還元されて、本質的には記述（ChesebroおよびMe
tzger、1972、前出）のようにしてジアゾ化して、ホウ
酸塩−生理食塩緩衝液（52.5mMホウ酸ナトリウム、pH
9、120mM NaCl）中で４℃で48時間BSA（シグマ社製）と
アゾ−カップリング反応させた後、PBSに対して透析し
た。非被覆プレート表面を５％の脱脂乳（ネッスル社
製）PBS緩衝液溶液で少なくとも２時間ブロックした
後、ペリプラズム抽出物または精製タンパク質をBBS緩
衝液中でプレート上で90分間室温でインキュベートし
た。徹底的に洗浄（３回）した後、残存する官能基抗体
フラグメントを標準法（HarlowおよびLane、1988、「An
tibodies、Ａ Laboratory Manual」、Cold Spring
Harbor Laboratory、555〜592）によってGallati（197
9、Clin.Chem.Clin.Biochem.17、１〜４）によってペル
オキシダーゼ（シグマ社製）に結合したウサギ抗McPC60
3血清および抗ウサギ免疫グロブリンを用いて検出し
た。

全てのミニ抗体構成体に関して、単量体scFvフラグメ
ントと比較して、結合性したがって感受性の著しい向上
が認められる。これは二つまたはより以上の結合部位の
同じ表面への同時結合と一致する。融合タンパク質scGH
xcのこれらの親和性は、天然の抗体McPC603に匹敵し、
抗原−被覆ELISAで検出された。一方、単量体scFvフラ
グメントはそれより100倍高い濃度でしか検出されなか
った（第3aおよびｂ図）。全ての結合は，単量体scFvフ
ラグメントを除いては、可溶性ハプテンでほぼ全面的に
抑制された。天然の抗体の可溶性ホスホコリンへの熱力
学的親和性は、約1.6×10⁵M^-1であって、比較的弱く（M
etzerら、1971、Proceedings of the 1^st Congress
of Immunology、Academic Press、New York、253
〜267）、これは明らかに単量体フラグメント−ハプテ
ン複合体が官能基ELISAの繰り返しの洗浄工程に耐える
には充分ではない（KemenyおよびChallacombe、1988、
「ELISAおよび他の固相イムノアッセイ」、Wiley ＆
Sons、New York）。

［実施例８］：二官能基ミニ抗体の表面結合ホスホコリンを一方の腕でリゾチームを他方の腕で認
識する共発現された二官能基ミニ抗体を、ホスホコリン
（PC）アフィニティークロマトグラフィーによって精製
して、リゾチーム特異性を調べた。ELISA−プレートを
リゾチームで被覆して、ELISAを実施例７と同様に行っ
た。三つの異なる調製物が抗原表面への結合を示した
が、これは可溶性リゾチームで完全に阻害された（第４
図）。

［配列表］（１）一般的情報（ｉ）出願者（Ａ）名称：メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミッ
ト・ベシュレンクテル・ハフトング（Ｂ）町名：フランクフルター・シュトラーセ250 （Ｃ）都市：デー−6100ダルムシュタット１（Ｅ）国名：ドイツ（Ｆ）郵便番号（ZIP）:4119 （Ｇ）電話:06151 72 7022 （Ｈ）テレファックス:06151 72 7191 （ii）発明の名称：単量体および二量体抗体フラグメン
ト融合タンパク質（iii）配列の数:14 （iv）コンピュータ解読方式（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ:IBM・PCコンパティブル（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PetentIn Release ＃1.0、バー
ジョン＃1.25（EPO）（Ｖ）現在の出願データ：出願番号:WO 93−00082 （２）配列ID番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:4515塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：環状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成、大腸菌およびネズミ起源（vii）材料：（Ｂ）クローン:pLISC−SE （ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1328..2158 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「一本鎖Fvフラグメント
（抗体）」／記＝「pLISC−SEベクターの完全配列」（ｘ）文献情報：（Ａ）著者:Plack、Peter Pleuckthun、Andreas （Ｂ）表題:Minantibodies:Use of Amphiphatic Helice
s to Produce Functional,Flexibly Linked Dimeric Fv
Fragment with High Avidity in E.coli （Ｃ）雑誌:Biochemistry （Ｄ）巻:31 （Ｅ）号:6 （Ｆ）頁:1579〜1584 （Ｇ）時:1992 （xi）配列：配列ID番号1: （２）配列ID番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:277アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号2: （２）配列ID番号３に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:151塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成（酵母＋マウス配列から推定）（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..138 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「挿入GCN4−ロイシンジッパーの遺伝子カセッ
ト」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:10..39 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「免疫グロブリン接合領
域」／記＝「IgG3−ヒンジ」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:40..138 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「GCN4−ジッパー」（xi）配列：配列ID番号3: （２）配列ID番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:46アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号4: （２）配列ID番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:181塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..150 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「挿入逆平行ヘリックス−ターン−ヘリックスを
コードする遺伝子カセット」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:10..39 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「免疫グロブリン接合領
域」／記＝「IgG3−ヒンジ」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:40..87 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「ヘリックスペプチド」／記＝「団−ヘリックスＡ」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:88..150 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「ヘリックスペプチド」／記＝「団−ヘリックスＢ」（xi）配列：配列ID番号5: （２）配列ID番号６に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:50アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号6: （２）配列ID番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:181塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成、ヒトおよびネズミ配列から推定（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..159 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「jun−ジッパーおよびIgG3−ヒンジ領域...をコ
ードする遺伝子カセット」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:40..159 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「jun−ジッパー」（xi）配列：配列ID番号7: （２）配列ID番号８に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:53アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号8: （２）配列ID番号９に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:180塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成、ヒトおよびネズミ配列から推定（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..159 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「挿入fos−ジッパーおよびIgG3−ヒンジをコー
ドする遺伝子カセット」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:10..39 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「免疫グロブリン接合領
域」／記＝「IgG3−ヒンジ（マウス）」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:40..159 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「fos−ジッパー」（xi）配列：配列ID番号9: （２）配列ID番号10に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:53アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号10: （２）配列ID番号11に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:180塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成、ヒト配列から推定（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..147 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「挿入jun−ジッパーおよびリンカーをコードす
る遺伝子カセット」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:10..27 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「合成リンカー」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:28..147 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「jun−ジッパー」（xi）配列：配列ID番号11: （２）配列ID番号12に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:49アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号12: （２）配列ID番号13に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:180塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類:DNA（ゲノム）（iii）仮定：無（iii）アンチセンス：無（ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生体：合成、ヒト配列から推定（ix）性質：（Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..147 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「挿入ペプチド」／記＝「挿入fos−ジッパーおよびリンカーをコードす
る遺伝子カセット」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:10..27 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「合成リンカー」（ix）性質：（Ａ）名称／キー：その他（Ｂ）位置:28..147 （Ｄ）その他の情報:/産生物＝「fos−ジッパー」（xi）配列：配列ID番号13: （２）配列ID番号14に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ:49アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列：配列ID番号214:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者プリュクトゥーン、アンドレアスドイツ連邦共和国デー―8000 ミュンヒェン 70 イェーガーヴィルトシュトラーセ３ (72)発明者パク、ペータードイツ連邦共和国 81925 ミユンヒエンフランツ―ウォルターシュトラーセ４／３ (56)参考文献ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，1991，Ｖｏｌ．９，ｐ. 132−137 ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，1991，Ｖｏｌ４，Ｎｏ．４，ｐ. 457−461 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，1986，Ｖｏｌ. １，Ｎｏ．１，ｐ．16−22 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 16/46 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】互いに非共有相互作用をしている単量体融
合タンパク質二つから構成される二量体タンパク質であ
って、（ｉ）前記単量体融合タンパク質二つの夫々は、（ａ）抗体の一本鎖Fv（scFv）フラグメント、（ｂ）リンカー・ペプチド、ならびに（ｃ）50個以下のアミノ酸を含む両親媒性ヘリックス・
ペプチドを含んでなり、その両親媒性ヘリックス・ペプ
チドは、非共有相互作用を介して、他の両親媒性ヘリッ
クス・ペプチドと二量体形成が可能である、相互作用性
のペプチドを、該（ａ）一本鎖Fv（scFv）フラグメントのＣ末に、該
（ｂ）リンカー・ペプチドのＮ末が融合し、また、該
（ｂ）リンカー・ペプチドのＣ末に、該（ｃ）相互作用
性のペプチドのＮ末が融合する形態で含んでなる単量体
抗体フラグメント融合タンパク質であり、（ii）前記単量体融合タンパク質間の非共有相互作用
は、各単量体融合タンパク質上の相互作用性のペプチド
間においてなされており、（iii）該二量体中における、前記二つの単量体融合
タンパク質の配向は、そのＮ末からＣ末への方向に関し
て、同一の配向であることを特徴とする二量体タンパク質。
【請求項２】少なくとも、前記二量体タンパク質を構成
している一つの単量体融合タンパク質中の相互作用性ペ
プチドは、一つのヘリックス、ターン、ならびに、もう
一つのヘリックスを含んでなることを特徴とする請求項１に記載の二量体タンパク質。
【請求項３】少なくとも、前記二量体タンパク質を構成
している一つの単量体融合タンパク質中の相互作用性ペ
プチドは、７アミノ酸毎にロイシンが存在する、反復し
たアミノ酸幾つかを有する、ロイシン・ジッパー分子を
含んでいることを特徴とする請求項１に記載の二量体タンパク質。
【請求項４】少なくとも、前記二量体タンパク質を構成
している一つの単量体融合タンパク質中の相互作用性ペ
プチドは、荷電残基複数を有していることを特徴とする請求項１に記載の二量体タンパク質。
【請求項５】各単量体融合タンパク質上の該相互作用性
ペプチドは、同一ではないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の
二量体タンパク質。
【請求項６】一方の単量体融合タンパク質上の該相互作
用性ペプチドは、jun−ジッパーを含んでおり、かつ、
他方の単量体融合タンパク質上の該相互作用性ペプチド
は、fos−ジッパーを含んでいることを特徴とする請求項５に記載の二量体タンパク質。
【請求項７】少なくとも、前記二量体タンパク質を構成
している一つの単量体融合タンパク質中の該リンカー・
ペプチドは、抗体のヒンジ領域配列、またはその断片で
あることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の
二量体タンパク質。
【請求項８】前記抗体のヒンジ領域配列、またはその断
片は、配列番号:9〜14中に開示されるヒンジ領域配列か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７に記載の二量体タンパク質。
【請求項９】前記二量体タンパク質を構成している単量
体融合タンパク質中の相互作用性ペプチドの一方、また
は双方に対して、そのＣ末にもう一つタンパク質が融合
されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の
二量体タンパク質。
【請求項１０】請求項１に記載される二量体タンパク質
の調製方法であって、単量体融合タンパク質、あるいはその一部に対するコー
ド配列を有するDNA分子複数を、少なくとも一つの発現
プラスミド中にクローニングし、宿主細胞を、前記発現プラスミドの一つまたは複数で形
質転換し、前記形質転換された宿主細胞を栄養培地中で培養し、（ａ）該二量体タンパク質を、該細胞中で発現させる、
または、（ｂ）該単量体融合タンパク質、あるいはその一部を個
々に発現させ、そして、該単量体融合タンパク質二つの
間の非共有的連結を、培地内、または、インビトロにお
いて形成する、なお、融合タンパク質の一部分のみが一
つの発現プラスミド中にクローニングされている場合に
は、該非共有結合的な連結の前あるいは後で、該融合タ
ンパク質の他の一つまたは複数の部分は、該クローニン
グされている部分と、組み合せて、融合させて、該融合
タンパク質を形成する工程を付加的に実施することを特徴とする調製方法。
【請求項１１】前記二量体タンパク質に含まれる、第一
の単量体融合タンパク質をコードするDNA配列は、第一
の発現プラスミド中にクローニングされており、第二の単量体融合タンパク質をコードするDNA配列は、
第二の発現プラスミド中にクローニングされていることを特徴とする請求項10に記載の調製方法。
【請求項１２】該二量体タンパク質を形成する、該単量
体融合タンパク質二つの間の非共有的連結は、インビト
ロにおいて形成されることを特徴とする請求項10に記載の調製方法。
【請求項１３】該宿主細胞は、大腸菌であることを特徴とする請求項10〜12のいずれか一項に記載の
調製方法。